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TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (n°9) (S. Delbecq) N. Boulle Année 2012-2013 Caractères généraux et enveloppe nucléaire NOYAU Caractéristique des cellules eucaryotes +++ - Limité par l’enveloppe nucléaire - Contient presque la totalité information génétique (le génome nucléaire) QCM 1 Noyau contient presque la totalité information génétique ADN mitochondrial: ADN circulaire - 5 à 10 copies Code pour - des ARN ribosomaux spécifiques (2) (mitoribosomes) - des ARNt - des protéines mitochondriales (13) (ex: sous unité de l’ATP synthase) - Code génétique spécifique - Importation de l’ADN polymérase, des ARN polymérases, protéines ribosomales … Hérédité « cytoplasmique », maternelle QCM 1

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Page 1: TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (n°9 ... · L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique:

TD Noyau, Chromatine,

Chromosome, Caryotype (n°9)

(S. Delbecq)

N. Boulle Année 2012-2013

Caractères généraux et enveloppe nucléaire

NOYAU

Caractéristique des cellules eucaryotes +++

- Limité par l’enveloppe nucléaire

- Contient presque la totalité information génétique (le génome nucléaire)

QCM 1

Noyau → contient presque la totalité information génétique

ADN mitochondrial: ADN circulaire - 5 à 10 copies

Code pour - des ARN ribosomaux spécifiques (2) (mitoribosomes)

- des ARNt

- des protéines mitochondriales (13) (ex: sous unité de l’ATP synthase)

- Code génétique spécifique

- Importation de l’ADN polymérase, des ARN polymérases, protéinesribosomales …

Hérédité « cytoplasmique », maternelle

QCM 1

Page 2: TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (n°9 ... · L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique:

L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau

Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950

chromatine

QCM 1 L’enveloppe nucléaire

Description:

Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RE- membrane interne- espace périnucléaire

Membrane externe

Membrane interne

Enveloppe nucléaire Réticulum

Endoplasmique

Lumière du RE

Espace périnucléaire

Lamina nucléaire

Pore nucléaire

ribosome

L’espace périnucléaire

Espace en continuité avec la lumière du RER:- contenu similaire- stockage du calcium

Récepteur des lamines

La membrane nucléaire

Récepteur pour histones ou protéines associées

Membrane externe,cytosolique = région spécialisée de REG

Membrane interne nucléocytoplasmique

→→→→ composition ≠≠≠≠

Ca++

QCM 1 L’enveloppe nucléaire se dissocie à chaque mitose, puis se reconstitue Rôle des complexes

cyclines / Cdks (voir cours sur le cycle cellulaire)

QCM 1

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- Position centrale en général

Relation avec centrosome (→ fuseau mitotique)

NoyauQCM 1

- Nombre : en général, 1 par celluleExceptions - plusieurs : ex.fibres musculaires (syncitium)

- aucun : GR, plaquettes

- Forme : ronde ou ovaleExceptions : polynucléaires

-Taille : - 5 à 6 µm - 6% du volume cellulaire- rapport nucléo/protoplasmique selon activité / type cellulaire

N/P = Vol. Noyau / Vol. cellule

http://www.physique.univ-paris-diderot.fr/IMG/jpg/image4.jpg

Exemple de syncytium: fibres musculaires

(muscles striés)

Coupe longitudinale

Coupe transversale

Myofibrille

Sarcoplasme

Noyauxpériphériques

Sarcolemme

Planche donnée pour information

Le muscle strié :la fibre musculaire

Le syncytium contient plusieurs noyaux dans un cytoplasme unique

Exemple de cellules multinucléesQCM 1

Mise en évidence en microscopie:

- fluorescence: agents intercalants de l’ADN (DAPI, BET…)

- colorants basiques : hématoxyline, bleu de méthylène…

- réaction de Feulgen : hydrolyse acide de l’ADN et révélation avec le réactif de Schiff (détecte les aldéhydes)

DAPI (Hoescht)

(Fluorescence)FeulgenHématoxyline

PAS FEULGENCH2OH

O

OH

OH

HO O OH

O

OH

OH

CH2OH

HIO4

HO

OOCH2 A / G

PO

OHOCH2 C / T

H

HCl, 60°C

HO

OOCH2 H

OHO

CH2OH

O

OO

HO

OH

OCH2

OXYDATION

1

2 FUSCHINEFUSCHINE

HYDROLYSE

Polysaccharides (amidon,

glycogène, amidon…)

Polysaccharides ADN

Desoxyribose (ADN)

Base purique

OH du désoxyribose

QCM 1

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Les pores nucléaires

- Seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme

- Passage de petites molécules, ions

Protéines

ARNm, ARNt, ARNr

ribonucléoprotéines, particules ribosomales…

- Passage dans les 2 sens

- Symétrie radiale d’ordre 8 (nucléoporines)

- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)

Symétrie d’ordre 8

QCM 2

Molécules de taille variable!

Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable

Les pores nucléairesQCM 2

16 bras radiaires (2x8)

16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)

Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757

Structure 3D des pores nucléaires

Microscopie electronique, cryofracture

QCM 2 Nucléoporines (Nup)

Unité d’organisation x 8Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues

~ 450 protéines en tout (par pore)

Origine

REProtéines transmb. N-glycosyléesAncrage des pores à l’enveloppe nucléaire

CytosolAutoassemblage protéines solublesCertaines sont O-glycosylées

(! O-glycosyl transférases dans le cytosol et le Golgi)

QCM 2

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Les Nucléoporines - Fonctions

Plusieurs groupes de nucléoporines:

1- Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):

Domaine FG

Ex: motif FXFG

Séquences de reconnaissance pour les Importines / Exportines

Interviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!

2- Nucléoporines (sans FG): ∼ nucléoporines structurales

3- Protéines membranaires: ancrent le pore dans la membrane nucléaire

Remarque : Certaines nucléoporines sont liées à l’ADN

QCM 2

Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153

Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG

Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757

Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 153

Extrémité flexible

Fixe importine / exportine

QCM 2

QCM 2

Cytosquelette

Nucléosquelette: pas de microtubules dans le nucléoplasme !

→ Continuité cytosquelette / nucléosquelette

Microtubules

Microfilaments

Filaments intermédiaires

Filaments intermédiaires (lamines)

Microfilaments d’actineNesprines: protéines transmembranaires

→ relie le cytosquelette (filaments intermédiaires , microfilaments d’actine, microtubules) avec l’enveloppe nucléaire

→ Interagit avec des protéines ancrées dans la face nucléoplasmique

→ Continuité cytosquelette / nucléosquelette

QCM 2

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NesprineFilaments

intermédiaires

QCM 3

GEF

GTPGDP

PiGAP

GDPGTP

RanRan

GAP: GTPase-activating protéin

GEF: Guanine –nucleotide

Exchange Factor

Le système RanQCM 3

Ran = GTPase

Echange

Hydrolyse

QCM 3

• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:

GEF / GAP

noyau / cytosol

• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme

Le système Ran

RanGDP Cytosol

RanGTP

NoyauRanGDP

RanGTP

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Diffusion de Ran à travers l’enveloppe nucléaire

GEF

GAP

Importine

Exportine

QCM 3

GAP

cytosolique

GEF

nucléaire

QCM 3 Filaments intermédiaires

Lamines A, B et C: → spécifiques du noyau

→ formation de la lamina nucléaire

- Lamine B fixée à la face nucléocytoplasmique de l’enveloppe nucléaire par un groupement farnésyl ≠≠≠≠ Lamines A et C

- Lamines A et C: lamina + nucléoplasme

- Récepteurs des lamines: prot. transmembranaires

Lamina: Interagit avec les pores nucléaires

lamina

QCM 3 QCM 3La lamina nucléaire

- Organisation :Face nucléoplasmique de la membrane interne: formation de l’enveloppe nucléaire

- rôle dans la régulation de l’expression des gènes + ++

- Liaison avec les pores nucléaires

- au cours du cycle cellulaire (cf cours Mitose):

- désorganisation en prométaphase (phosphorylation des lamines …): rupture de l’enveloppe en prométaphase- réassemblage en début de télophase

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Mutations de la lamine A :

observées dans le syndrome de Hutchinson-Gilford = progeria

Patient muté

Mère non

mutée

Eriksson et al; 2003, Nature 423: 293-298

L’enveloppe nucléaireQCM 3 Diffusion de Ran à travers l’enveloppe nucléaire

GEF

GAP

Importine

Exportine

QCM 3- 4

GAPcytosolique

GEFnucléaire

- Imp. ββββ

- Imp. αααα / exportine

Importines et exportines: récepteurs à double affinité-Liaison à la charge (cargo)-Liaison aux motifs FG des Nup

Signaux d’adressage:-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)

Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)

Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction

QCM 4 Le transport nucléocytoplasmique

L’importation:

Le transport nucléo-cytoplasmique:

cytosol

nucléoplasme

Imp. αα αα

cargo

Imp. ββ ββ

1: interactionsimp. ββββ – motifs FG

2: translocation par transporteur

central

3: interaction RanGTP- imp. ββββinduit dissociation imp. αααα-cargo

RanGTP

Imp. αααα

cargo

Imp. ββββ

Imp. αααα

cargo

Imp. ββββ

RanGTP

QCM 4 Le transport nucléocytoplasmique

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ADN: 5%

ARN: 10%

Protéines: 85%

QCM 5 Le nucléole QCM 5 Le nucléole

Région intranucléaire bien individualisée:- Biogénèse des ribosomes- présent à l’interphase- contient des portions de chromosomes: régions NOR

Cellule eucaryote fabrique 2000-3000 ribosomes par minute

Constituant granulairePré-ribosomes

Constituant fibrillaire dense Constituant

fibrillaire clair

ChromosomeUn seul représenté

ADN en cours de transcription -> 45S

Microscopie électronique (MET):

-Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)

- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR

Le nucléole – Régions NORQCM 5

Remarque : les chromosomes acrocentriques peuvent être répartis sur plusieurs nucléoles

N = 5 x2

NOR = - Constrictions secondaires au niveau des chro mosomes acrocentriques

- Coloration au nitrate d’argent (caryotype)

- Translocation robertsonienne

ADNr ADNr ADNr ADNr

Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies)

ARNr 45S

Grande sous-unitéribosomale (60S)

Petite sous-unitéribosomale (40S)

Clivage / maturation de l’ARN

(Polymérase III)

NOR (organisateur nucléolaire)

QCM 5

ARN Polymérase I

Cf cours sur la transcription (UE1)

Le nucléole – Régions NOR

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RibosomesQCM 6

Uniquement au moment de la traduction

Biogénèse des ribosomes:

- Action des 3 ARN polymérases (pol I, II et III)

- Transfert des sous -unités par le pore nucléaire vers le cytosol

- Assemblage des sous-unités dans le cytosol sur l’ARNm (cf UE1)

QCM 6 Le noyau

Le recyclage des importines

Le transport nucléo-cytoplasmique:

cytosol

nucléoplasme

RanGTP

exportine

Imp. αααα

RanGTP

exportine

Imp. αααα

RanGAPRanGDP

exportine

Imp. αααα

! Imp. αααα a un signal NES

2: hydrolyse du GTP: libération de imp. αααα

Exercice 1:

Transport nucléo-cytoplasmique, signaux NLS et NES

Le transport nucléo-cytoplasmique: export

cytosol

nucléoplasme

RanGTP

NES

exportineRanGTP

exportine

NES

RanGTP

exportine

NES

RanGAP

RanGDP

exportine

NES

exportine leptomycine

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Exercice 1:

Transport nucléo-cytoplasmique, signaux NLS et NES

Figure 1

A l’équilibre

Exercice 1:

Transport nucléo-cytoplasmique, signaux NLS et NES

Figure 2

A l’équilibre

Chromosomes - Caryotype

Organisation de l’ADN dans le noyau:

génome haploïde = 3.2 109 pb => Noyau = 6,4 109 pb

23 paires de chromosomes: ADN réparti en 46 molécules

- 1 chromosome = 50.106 à 250. 106 pb

1,7 cm à 8.5 cm si l’ADN était déroulé

=> noyau cellule humaine ≈ 2 m d’ADN

=> nécessité d’un compactage

Exemple du génome humain:

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Principaux niveaux de repliement de l’ADN

Facteur de compaction ∼ x50 000

Interphase

Chromatine décondensée

Mitose

Chromatine condensée

Forme condenséeSpirale

interphasique

Double hélice d’ADN

Collier de perles

Fibre de 30 nm

Repliementen boucles

Chromosome mitotique:

Chromosome métaphasique

Chrom.

- Écouvillons

- Polyténiques

Dans les chromosomes interphasiques

Interphase: chromosomes décondenséspas d’enchevêtrement aléatoire: Territoires chromosomiques

Territoires chromosomiques

Organisation de l’ADN dans le noyau:

Chromosomes: de 50 à 250 x 106 pb

Répétition 5’ TTAGGG 3’

sur 5-10 kpb

Se raccourcit à chaque division

Structure d’un chromosome métaphasiqueQCM 7

Observation après coloration

Classement des chromosomes ?

- Taille

- Position du centromère (Ic= p/(p+q)

- Bandes G, R, C

Classement en 7 groupes (A à G)

Accumulation de cellules

Synchronisation / blocage

Culture cellulaire: cellules somatiques

Prométaphase ou métaphase

Solution hypotonique

Obtention d’un caryotype

Dispersion chromosomique

Fixation, coloration

Division cellulaire

QCM 7

Colchicine

lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)

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Obtention d’un caryotypeQCM 7

Caryotypes:

A B

C

D E

F G C G

métacentriques

submétacentriques

acrocentriques

Classement d’après la longueur et l’index centromér ique :7 groupes de A–>G

acrocentriques

13 14 15

21 22

Obtention d’un caryotypeQCM 7

Région pseudo-autosomique 1PAR 1

Crossing-over obligatoiredes chromatides non-sœurs

pendant la méïose

Région pseudo-autosomique 2PAR 2

Centre d’inactivation en Xq13

SRY

X Y

Les gonosomes

Y: Contient 10 fois moins de

gènes que le X

Coloration des chromosomes

Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine

• Bandes: Caractéristiques d’une paire chromosomique

Reproductible d’une mitose à l’autre

Caractéristique d’une espèce donnée

• Métaphase: 200 – 500 bandes résolution 5-10 Mpb

QCM 7

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Riches en AT

Réplication tardive

Bandes G (sombres)Digestion enzymatique

ménagéeColoration Giemsa

(≈ bandes Q)

Hétérochromatine

- Centromères et constrictions IIaires (1, 9, 16)

- Satellites des Chromosomes acrocentriques

- Bras long du chromosome Y

Bandes C

Coloration Baryte + Giemsa

Bandes R (sombres)Digestion thermique

ménagéeColoration Giemsa

Riches en GC

Réplication précoce

Coloration des chromosomes

Scan résultat caryotype avec résolution

FISH: Hybridation In Situ Fluorescente

Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)

+Ne nécessite pas de cellules en division (métaphase ou interphase)

Bonne résolution

Outil de recherche

-Etude ciblée (sonde spécifique)

Les différents types de sonde

Cytogénétique moléculaire:

FISH: Fluorescent in situ hybridization:

Sondes télomériques

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- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise

- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée

- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)

• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX

• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3

Les anomalies chromosomiques

Remarque: Mosaïque physiologique ?Inactivation du chromosome X

• Respect du dosage génique entre homme (XY) / femme (XX) : Inactivation quasi-complète d’un chromosome X chez la femme

• Cependant certains gènes échappent à l’inactivation.

• L’inactivation se fait au hasard puis se transmet aux cellules filles= Mosaïque de cellules

• X inactivé forme le corpuscule de Barr

• se met en place pendant l’embryogenèse mais réversible durant l’ovogenèse (hétérochromatine facultative ) Mosaïque chez les femelles

Inactivation du chromosome X

Corpsucule de Barr

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Les anomalies chromosomiques

Translocation robertsonienne

Translocation réciproque équilibrée

Chromosomes acrocentriques (NOR):

13, 14, 15, 21 et 22

Ex: 45, XY, der(14,21)(q10; q10)

Ex: 46, XX, t(7,8)(q11.1; q21.2)

A connaître!

Les anomalies chromosomiquesAnomalies de structure

délétion inversion duplication isochromosome

Exercice 2

46, XX, del(9)(p22.1)

46, XX, der(9)t(5;9)(p13.3; p22.1)

Exercice 2

Coloration conventionnelle (bande G)

46, XX, del(9)(p22.1) 46, XX, der(9)t(5;9)(p13.3; p22.1)

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Exercice 2

del (9) der (9)der (9)sondes

sondes

sondes

sondes

der (9)der (9)

Exercice 2 Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization

Exercice 2

Aspect « quantitatif » du CGH array:

- Normal:

2 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin : ln(2/2) = ln (1) = 0

- Trisomie complète:

3 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (3/2) = ln (1,5) = + 0,4

- Monosomie complète:

1 allèle sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (1/2) = ln (0,5) = - 0,7

Mosaïcisme: entre les 2….

Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization

Exercice 2

Mb Mb

Mb