southern blot exposé1

SOUTHERN BLOT

Présenté par:

La technique de Southern blot est une méthode d’hybridation moléculaire.

Baptisée du nom de son inventeur, le biologiste britannique Edwin Southern.

Permet de visualiser n’importe quelle fraction du génome à condition d’avoir une sonde «séquence » hybridant spécifiquement avec la séquence à analyser.

OBJECTIF

Visualiser un fragment du génome (ADN) dont on possède une sonde.

PRINCIPE DE LA TECHNIQUE

1-Préparation de l'ADN à étudier - Digestion ou fragmentation de l’ADN. - Séparation des fragments. - Dénaturation et neutralisation de l'ADN - Transfert de l'ADN sur une membrane

- Fixation covalente de l'ADN sur la membrane

2- Préhybridation 3- Hybridation 4- Lavages 5- Autoradiographie

1- Digestion ou fragmentation de l’ADNDigestion ou fragmentation de l’ADN Couper l'ADN en fragments de différents

tailles enzymes de restrictions environ 106

fragments Ceci facilite l’identification des séquences

spécifiques Les fragments sont maintenant facilement

séparés par l'électrophorèse sur gel.

2-Séparation des fragments par 2-Séparation des fragments par électrophorèse sur gelélectrophorèse sur gel

Agarose ou polyacrylamide Séparation des fragments en fonction de

leur tailles La coloration au B.E.T permet - contrôler la qualité de l’ADN - contrôler la migration - contrôler la digestion enzymatique Visualisation sous UV.

2-Séparation des fragments par électrophorèse sur 2-Séparation des fragments par électrophorèse sur gelgel

3-Dénaturation et neutralisation de l'ADN3-Dénaturation et neutralisation de l'ADN1- Dénaturation Le gel d‘électrophorèse est trempé dans une

solution alcaline (NaOH) permettre la dénaturation de l’ADN bicaténaire.

2- Neutralisation Le gel est immergé dans une solution

neutralisante empêcher la renaturation de l’ADN avant

d’ajouter la sonde.

4-Transfert de l'ADN sur une membrane4-Transfert de l'ADN sur une membrane Une feuille de membrane en nitrocellulose (ou en

nylon) est placée sur le gel. Une pression est appliquée au gel (une pile de

serviettes de papier et par un poids) permettre le déplacement de l'ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité

TRANSFERT DE L'ADN SUR UNE TRANSFERT DE L'ADN SUR UNE MEMBRANEMEMBRANE

PRÉPARATION DE L'ADN À ÉTUDIER

5- Fixation covalente de l'ADN sur la 5- Fixation covalente de l'ADN sur la membranemembrane

fixation de l'ADN sur la membrane par : - Cuisson ou chauffage à 80°C (mb. nitrocellulose).

- Exposition au UV (mb. nylon) fixer de manière permanente l'ADN sur la

membrane.

2- PRÉHYBRIDATION

Saturer les sites de fixation de la membrane restées libres.

- Pré incuber la membrane avec un ADN hétérologue ( ADN de sperme de saumon).

3- HYBRIDATION

La membrane est mise en contact avec une sonde spécifique de la séquence d'ADN recherchée.

La sonde doit être marquée (incorporation de radio-isotopes, par "étiquetage" de la molécule avec un fluorophore ) et dénaturée.

La température d'hybridation soit ~65°C.

4- LAVAGES

la sonde en excès est éliminée de la membrane par une série lavages.

5- AUTORADIOGRAPHIE

L'hybridation est visualisée sur un film autoradiographique.

Après développement, il y aura les taches foncées sur le film partout où la sonde liée.  

5- AUTORADIOGRAPHIE

Schéma général de la technique

UTILISATIONS DU SOUTHERN BLOT

Identification des mutation, délétions, et réarrangements des gènes.

Prévision de certains cancers. Diagnostic de HIV-1 et des maladies

infectieuses Tests paternité et en médecine légale.

RÉFÉRENCES

http://www.univ-rouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/southernblot.html

http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbioch/POLY.Chp.9.9.html

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Southern%20Blot

Biochimie génétique, biologie moléculaireBiochimie génétique, biologie moléculaire

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