mycobactéries et eau

MICRO-ORGANISMES PATHOGÈNES DE L’EAU

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - MARS 2014 - N°460 // 69

article reçu le 5 novembre 2013, accepté le 13 décembre 2013.© 2014 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

RÉSUMÉ

Le genre mycobactéries regroupe un grand nombre d’espèces, non seu-lement Mycobacterium tuberculosis et M. leprae, qui sont strictement pathogènes, mais aussi des mycobactéries dites non tuberculeuses (MNT) ou atypiques qui sont, elles, reconnues comme pathogènes émergents. Certaines espèces sont responsables d’infections respiratoires ou d’infec-tions iatrogènes, en particulier chez les personnes immunodéprimées. La contamination humaine se fait par contact avec un réservoir environ-nemental (sol, eau, animaux). Elles sont trouvées dans les eaux, en par-ticulier les eaux de surface et les réseaux de distribution, ainsi que chez des insectes et des animaux aquatiques divers, et dans les sols environ-nants. Elles résistent particulièrement aux détergents et aux antibiotiques. Leur recherche dans l’eau n’est pas standardisée et est difficile en raison de leur culture difficile et lente. Si le développement de techniques molé-culaires a permis de court-circuiter cette étape de culture, ces méthodes ne répondent pas à tous les problèmes de quantification.

Mycobactérie non tuberculeuse – eau de surface – réseau de distribution – pathogène émergent – résistance aux détergents.

Faiza Mougaria,b,c, Emmanuelle Cambaua,b,c,*

Mycobactéries et eau

a Université Paris-Diderot – EA 3964 (Émergence de la résistance bactérienne)UFR de médecine – Site Xavier Bichat16, rue Henri-Huchard – P.O. Box 41975870 Paris cedex 18 b Laboratoire de bactériologieGroupe hospitalier Saint-Louis – Lariboisière – Fernand Widal (AP-HP)2, rue Ambroise-Paré75475 Paris cedex 10 c Centre national de référence des mycobactéries et de la résistance aux antituberculeux (laboratoire associé).

* Correspondanceemmanuelle.cambau@lrb.aphp.fr

du pouvoir pathogène de ces mycobactéries et en raison du nombre croissant de patients immunodéprimés (syn-drome d’immunodéficience acquise, transplantations, traitements immunosuppresseurs, chimiothérapies) atteints d’infections opportunistes [1, 2].Les mycobactéries dites non tuberculeuses ou atypiques sont naturellement présentes dans l’environnement (eaux, sols et faune aquatique) et peuvent subsister dans les eaux de surface, voire proliférer ou infecter des insectes, animaux aquatiques ou des protozoaires.Nous développerons dans cette revue les interactions entre l’eau et les mycobactéries non tuberculeuses.

2. Que sont les mycobactéries non tuberculeuses ?

Les mycobactéries « atypiques » ou « non tuberculeuses » (MNT) sont des bactéries présentes dans l’environnement et habituellement non pathogènes. Certaines d’entre elles peuvent être responsables d’infections opportunistes, simu-lant ou non la tuberculose, appelées mycobactérioses [2].

1. Introduction

Au début du XXe siècle, les mycobactéries responsables de la tuberculose et de la lèpre, mycobactéries stricte-ment pathogènes pour l’homme et les animaux, étaient au premier plan des préoccupations de santé publique. Les autres mycobactéries étaient reléguées au rang de saprophytes et les infections qu’elles pouvaient occa-sionner étaient largement méconnues. Ce n’est qu’après la seconde moitié du XXe siècle que de plus en plus de cas de mycobactérioses ont été rapportés grâce aux progrès de l’identification microbiologique, à la meilleure connaissance

SUMMARY

Mycobacteria and waterThe Mycobacterium genus comprises Mycobacte-rium tuberculosis complex, M. leprae and nontuber-culous mycobacteria (NTM), i.e. all the other rapid-growing and slow-growing mycobacterial species. NTM are emerging pathogens causing infections in immunocompromised patients, in respiratory diseases and in iatrogenic infections. These bac-teria are living in the environment (water and soils) and remain in the surface waters. They also infect insects, aquatic animals and protozoa. Outbreaks are due to contamination from a common reservoir and human to human transmission usually does not occur. Because mycobacteria harbor a thick lipid rich cell wall and many resistance genes in their genome, they are surviving even in water containing detergents or antibiotics. This can be one reason for their emergence in human infections. Detection of mycobacteria from water is not standardized and is difficult because it needs first to remove the other bacteria and cultivate mycobacteria in rich medium. Molecular detection can be used to circumvent this problem but have other drawbacks.

Nontuberculous mycobacteria – surface waters – water distribution system – emerging pathogen –

detergent resistance.

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Figure 1 – Classification de Runyon [49], représentant les principales mycobactéries isolées en laboratoire.

Figure 2 – Aspects microscopiques et macroscopiques des cultures de différentes mycobactéries.

A. M. kansasii colonies sur milieu LowesteinB. M. kansasii coloration de ZiehlC. M. chelonae milieu LowesteinD. M. fortuitum, sur gélose au sang

A B C E

F G H I

D

E. M. xenopi : aspect de grains sur milieu liquide (MGIT)F et G. M. abscessus colonies lisses sur milieu Lowestein (F) et gélose au sang (G)H et I. M. abscessus colonies rugueuses sur milieu Lowestein (H) et gélose au sang (I)

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La classification des mycobactéries s’est d’abord faite sur les critères de vitesse de croissance (≥ 7 jours ou < 7 jours sur milieu solide) et de pigmentation des colonies en présence ou non de lumière (figure 1 et figure 2). Puis, grâce aux approches moléculaires, de nombreuses nouvelles espèces de mycobactéries ont été identifiées et la classification au sein des MNT est en constant remaniement. Les mycobactéries à croissance rapide (MCR) sont aussi différenciées des myco-bactéries à croissance lente (MCL) sur la base des séquences des ARN ribosomiques et du gène hsp65 (figure 3) [4]. La majorité des infections à MNT observées chez l’Homme concerne une vingtaine d’espèces citées dans la figure 1.

Ces infections ne sont pas liées à une transmission inte-rhumaine, les cas épidémiques étant liés à une conta-mination à partir d’un réservoir commun, exclusivement environnemental, qui est le plus souvent l’eau.Les infections à MNT ont augmenté ces dernières années avec l’épidémie de sida, l’augmentation du nombre de malades immunodéprimés et la multiplication de tech-niques invasives. Le diagnostic de ces infections est sou-vent difficile et le traitement est encore au stade de la recherche clinique du fait de la multirésistance naturelle à de nombreuses familles d’antibiotiques en général, et aux antituberculeux en particulier [3].

Figure 3 – Phylogénie du genre Mycobacterium basé sur le séquençage du gène hsp65 [4].

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considérée plutôt comme un vecteur qu’une source de MNT, en plus du fait que seules de très rares MNT peuvent se multiplier à des températures basses.

4. Le vecteur tellurique

Les MNT peuvent survivre dans les sols, qui sont donc considérés comme un vecteur majeur de contamination dans les bassins versants [24].Les MNT se multiplient particulièrement dans les sols riches en acides humiques présentant un pH faible [25], par exemple M. avium et M. fortuitum. Les marécages et le sol de certaines forêts présentant des valeurs de pH faibles et de fortes teneurs en acide humique, seraient de la même manière propices à la présence des MNT. Par exemple, la croissance de M. avium est stimulée par l’acide humique et l’acide fulvique [26]. Quantitativement, certains sols peuvent contenir jusqu’à 107-108 mycobactéries/g [27, 28].Indirectement liés au sol, il a été démontré que des végétaux destinés à la consommation humaine (salades, poireaux, brocolis, etc.) pouvaient être contaminés par des MNT, d’autant plus que la température extérieure est propice à leur multiplication, par exemple en Floride [29].

5. Les vecteurs vivants dans l’eau

Beaucoup d’espèces de poisson, en eau douce comme en eau salée, peuvent être des sources de différentes espèces de MNT. M. marinum est responsable d’une infection, très semblable à la tuberculose, chez les animaux à sang froid et chez les poissons sauvages ou d’aquaculture [15, 16, 30].Certains poissons congelés destinés à la consommation humaine peuvent contenir dans leurs tissus et dans l’eau de décongélation des MNT, en particulier les espèces M. terrae, M. peregrinum, M. nonchromogenicum, M. gor-donae, M. fortuitum, et M. chelone [31]. Néanmoins, aucune mycobactériose humaine d’origine alimentaire n’a à ce jour été démontrée.Le protozoaire aquatique du genre Acanthamoeba sem-blerait être un hôte environnemental des MNT, notamment dans les eaux d’utilisations domestiques [32-35]. La pré-sence de M. avium dans le protozoaire Acanthamoeba castellanii permettrait à la bactérie de résister à des trai-tements antiseptiques ou antibiotiques. Les MNT ont la capacité d’entrer dans les trophozoïtes et les kystes du protozoaire aquatique Acanthamoeba polyphaga, et d’y survivre plusieurs heures ou jours même sous l’effet d’une forte concentration de chlore [32]. Par exemple, M. avium survivrait à l’extérieur de la double membrane du kyste du protozoaire Acanthamoeba polyphaga, et utiliserait les nutriments excrétés par ce dernier pour se multiplier de façon saprophyte [35, 36].Des études plus récentes proposent aussi que les MNT puissent résister aux enzymes lysosomales. La résistance intracellulaire des mycobactéries leur permettrait aussi de se protéger des conditions défavorables de l’environnement lorsque l’amibe est sous forme de kyste [37]. Ceci pour-rait expliquer que l’isolement de MNT soit non seulement dépendant du climat tempéré mais aussi de la présence saisonnière de certaines amibes.

3. Présence des mycobactéries dans l’eau

Les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) sont recon-nues comme pathogènes émergents depuis 2004 par l’Organisation mondiale de la santé. Sans transmission interhumaine démontrée, il est généralement accepté que l’exposition environnementale, particulièrement par l’eau, est une origine majeure de la plupart des infections humaines à MNT. Des cas de mycobactérioses d’origine hydrique sont décrits de plus en plus fréquemment dans la littérature, en particulier des infections cutanées de personnes immunocompétentes [5, 6] et des infections pulmonaires causées par l’inhalation d’aérosols [7].Les MNT sont ubiquitaires et peuvent être isolées d’une grande variété d’écosystèmes aquatiques, incluant l’eau de l’environnement, l’eau potable, l’eau récréative et l’eau d’origine industrielle [8, 9]. Par exemple, les MNT peuvent persister et proliférer dans les fleuves et le réseau d’eau potable [10]. Les réservoirs naturels incluent des plantes aquatiques, des amibes, des vertébrés et des insectes aquatiques [11-14]. Les MNT vivent dans les eaux froides ou chaudes, salées ou douces, en fonction des espèces [15, 16].De nombreuses espèces de MNT à croissance rapide (M. aurum, M. gadium, M. fortuitum, M. peregrinum, M. chelonae, M. frederiksbergense) et à croissance lente (M. gordonae, M. nonchromogenicum, et M. avium- intracellulare complex) sont trouvées dans les réseaux d’eau. Ces bactéries peuvent provenir d’eaux souterraines ou d’eaux de surface, se maintenir dans les stations de traitement de potabilisation, coloniser les granulés de charbon actif de ces stations, puis entrer dans le réseau de distribution d’eau, ce qui a été rapporté notamment pour la ville de Paris [17]. Un de leurs atouts est d’être plus résistantes au chlore que les autres bactéries. Par exemple, les espèces M. fortuitum et M. chelonae sont 100 à 330 fois plus résistantes que Escherichia coli [18]. Cette résistance au chlore est encore plus importante lorsque les bactéries forment des biofilms [19]. La crois-sance des mycobactéries est probablement favorisée par cet environnement non compétitif, ainsi que par la présence de matières organiques [20].Les mycobactéries sont parmi les bactéries les plus hydro-phobes en raison de la composition lipidique importante de leur paroi, ce qui les conduit à s’adsorber facilement à la surface des bulles d’air dans l’eau, à la surface des bulles d’eau dans l’air, ou bien à la surface des plans d’eau [21, 22]. Néanmoins, en raison du temps de génération long des mycobactéries de l’environnement, comme par exemple 2,5 h pour M. smegmatis et 7 h pour M. marinum [16], les MNT ne peuvent pas coloniser efficacement les environnements aquatiques naturels (autre que les réseaux de distribution d’eau potable) car elles sont en compétition avec les Enterobacteriaceae, qui comme Escherichia coli ont des temps de génération de l’ordre de 20 min. Elles sont aussi moins bien adaptées à l’environnement aqua-tique marin que d’autres espèces car elles ne résistent pas à des concentrations salines supérieures à 3 g/L [23]. Ce sont les raisons pour lesquelles l’eau de surface doit être

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Certains insectes aquatiques pourraient être des réservoirs de MNT. Effectivement, Mycobacterium ulcerans, respon-sable de l’ulcère de Buruli, est transmis par l’eau dans les pays de l’hémisphère sud [38-41] et semblerait atteindre l’homme via certains insectes aquatiques. En particulier, la puce d’eau Naucoris cimicoides serait un vecteur de M. ulcerans, qui survivrait et se multiplierait dans ses glandes salivaires sans dommage [42, 43]. M. ulcerans pourrait aussi survivre, voire se multiplier, sur les algues [44].

6. Détection et mesure des mycobactéries dans l’eau

Il n’existe pas pour l’instant de norme ou de protocole standardisé pour effectuer la détection et la mesure de leur concentration dans l’eau, même si de nombreuses méthodes ont été néanmoins décrites et utilisées. Les méthodes sont d’une part basées sur la culture des mycobactéries et d’autre part sur la détection molécu-laire par amplification génique spécifique de l’ADN des mycobactéries.Afin de cultiver les mycobactéries présentes dans l’eau, il est nécessaire d’éliminer les autres bactéries et les éléments fongiques qui gêneraient la culture des mycobactéries ou contamineraient le milieu de culture. Les possibilités sont de faire agir un décontaminant chimique tels que le cetylpyridinium, le SDS, la soude, ou l’acide sulfurique. Cette décontamination est basée sur la propriété des mycobactéries de résister plus que les autres bactéries aux acides et aux bases. Si la décontamination du culot de filtration permet d’isoler des mycobactéries en culture pure à partir de l’eau, ceci diminue considérablement la quantité de bactéries viables car la résistance des myco-bactéries aux détergents, acides et bases, n’est que rela-tive. Une perte de plus de 90 % des mycobactéries viables peut être observée si on applique ces protocoles à des échantillons artificiels d’eau dans laquelle on ajoute une quantité connue de mycobactéries [45]. Par conséquent, il est raisonnable de relativiser les quantités de myco-bactéries cultivées rapportées dans la littérature, ou alors de les multiplier par un facteur d’au moins 10 à 100 [10].

De plus, les mycobactéries à croissance rapide peuvent aussi gêner la culture des mycobactéries à croissance lente. Par conséquent, il est plus facile d’isoler M. chelo-nae que M. avium ou M. xenopi de l’eau et les données de la littérature sur la fréquence d’isolement des espèces de mycobactéries doit tenir compte des limites dues aux problèmes techniques des cultures. Une des façons de contourner ces problèmes est de recourir à une méthode moléculaire pour la détection, la quantification et l’identi-fication des mycobactéries présentes dans l’eau.Les méthodes moléculaires de détection des mycobactéries dans l’eau sont le plus souvent qualitatives, c’est-à-dire qu’elles visent à démontrer la présence de mycobactéries, voire d’une espèce spécifique (M. avium ou M. chelonae par exemple). Elles sont basées sur l’amplification d’un gène ou d’une séquence d’ADN spécifique des mycobac-téries (hsp65, gènes ribosomiques). Plus récemment des techniques de PCR en temps réel ont permis de quantifier les génomes microbiens, permettant une estimation du nombre de mycobactéries (d’équivalents génomes) pré-sentes [46]. Néanmoins la difficulté d’extraction de l’ADN des cellules mycobactériennes limite aussi l’interprétation des données quantitatives avec une sous-estimation pro-bable de 1 ou 2 Log [47].

7. Conclusions

De très nombreuses espèces de mycobactéries non tuber-culeuses sont présentes dans l’eau à des concentrations variables selon les lieux. Elles y survivent facilement du fait de leur résistance intrinsèque aux agents physiques et chimiques, qui est conférée par leur paroi bactérienne riche en lipides et particulièrement imperméable, et leurs nombreux gènes de résistance aux antibiotiques et anti-septiques [48]. Leur présence ubiquitaire induit un risque d’infection lors de toute activité humaine entraînant un contact étroit des muqueuses avec de l’eau dont la qualité bactériologique ne serait pas maîtrisée.

Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

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