Bio FM 70160 Bio FM V.C.A. 70161MiLiEU D’iSoLEMENT RAPiDE DES MYCoBACTéRiES / SUPPLéMENT SéLECTiF

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1- APPLICATIONLes mycobactéries sont des Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants (BAAR) dont la culture sur milieux solides traditionnels (Lowenstein-Jensen, Coletsos, Middlebrook 7H10 et 7H11) est assez lente : l’isolement de Mycobacterium tuberculosis peut nécessiter 2 à 8 semaines.Bio FM est un milieu de culture liquide enrichi, conçu pour diminuer signifi-cativement le délai de croissance des mycobactéries (1, 2). Les cultures obtenues en milieu Bio FM sont tout à fait adaptées à la réali-sation de l’identification (tests biochimiques traditionnels ou sondes) et de l’antibiogramme.

2- PRINCIPEBio FM est un milieu de Middlebrook 7H9, enrichi en OADC (acide Oléique, Albumine, Dextrose, Catalase), non sélectif, optimisé pour la croissance des mycobactéries.Bio FM permet l’isolement des mycobactéries à partir de tous types de prélèvements biologiques.La sélectivité du milieu Bio FM est obtenue par l’addition du supplément sélectif Bio FM V.C.A. (Vancomycine, Colimycine, Amphotéricine B) inhi-bant la croissance des principaux micro-organismes Gram positif et Gram négatif, ainsi que les levures composant les flores associées aux principaux prélèvements pathologiques.La croissance des souches de mycobactéries est détectée par un indica-teur de positivité qui entraîne une coloration des cultures en bleu foncé pouvant aller jusqu’au violet.

3- PRéSENTATION• Milieuprêtàl’emploi:BioFM

- 24 tubes à vis de 5 ml de bouillon code 70160

• Supplémentprêtàl’emploi:BioFMV.C.A.- 1 flacon compte-gouttes de 3 ml code 70161

4- COMPOSITION

• BioFMbouillon- KH2PO4 - Biotine- Na2HPO4 - Citrate de sodium- NH4SO4 - Acides aminés- MgSO4 - Hydrolysat de caséine- ZnSO4 - Albumine bovine

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- CuSO4 - Glycérol- CaCl2 - Glucose- NaCl - Acide gras- Citrate de fer ammoniacal - Catalase- Pyridoxine - Indicateur de croissance- Eau distillée

• BioFMV.C.A.- Vancomycine- Colimycine- Amphotéricine B

5- CONSERVATION• Milieuprêtàl’emploi:à+2-8°C,àl’obscurité.• Supplémentprêtà l’emploi :à+2-8°C,à l’obscurité.Aprèsouverture,

lesupplémentdevraêtreutilisédansundélaide45jours.Aprèschaqueutilisation, remettre rapidement le flacon au réfrigérateur.

La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le condition-nement.

6- UTILISATION

Matériel:• Matérielfourni:BioFM,BioFMV.C.A.

Précautionsd’utilisation/Consignesd’hygièneetdesécuritéLa manipulation d’échantillons biologiques susceptibles de contenir des mycobactéries nécessite la prise de mesures techniques de prévention (3, 4) et le respect des normes de sécurité en vigueur pour les germes de classe III.• Tous lesprélèvementsbiologiquespourrontêtreensemencésdansce

milieu à conditon d’avoir effectué une fluidification et une décontamination préalables. Pour la conservation des échantillons biologiques, se référer aux recommandations en vigueur (5).

• Laquantitédegermesdansleprélèvementpouvantêtrefaible,l’échantillon est concentré par centrifugation pour augmenter la sensibilité de la détection.

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InoculationdumilieuBioFMDans des conditions aseptiques, ajouter à 5 ml de bouillon Bio FM* :• 0,5 ml d’échantillon décontaminé ; homogénéiser,• 100µl(2gouttes)desupplémentsélectifBioFMV.C.A.Si suspicion de M. haemophilum,unesourced’héminedoitêtreadditionnée au milieu.*LemilieuBioFMestprêtàl’emploietcontientlesupplémentOADC.Après disparition de l’inoculum (3 ou 4 jours), les tubes seront fermés hermétiquement soit par vissage, soit par pose d’un capuchon plastique

Incubation:Incuber pendant 5 à 6 semaines à 37°C.

Lecture-Interprétation• Cycledelecture : effectuer 2 à 4 lectures hebdomadaires pendant 3 à

4 semaines, puis 2 fois par semaine au cours des 2 semaines suivantes.• Modelecture-interprétationLa lecture du milieu Bio FM comporte généralement 2 phases :

1ère phase : examen du sédiment et du milieu liquide sans agiter le tube• Bienobserverlefonddestubesetlemilieuliquide:

- Si absence de signe de culture (absence de trouble, voile, grains ou flocons colorés en bleu foncé/violet) : procéder à la 2ème phase de lecture.

- Si présence de signes de culture : . grains ou petits flocons colorés en bleu foncé/violet, ayant sédi-

menté au fond du tube : présomption de M. tuberculosis. . trouble ou voile, prenant une teinte qui peut s’étendre du bleu foncé

au violet, et susceptible de sédimenter en partie au fond du tube : suspicion de mycobactéries atypiques.

Confirmer éventuellement par la 2ème phase de lecture.

2ème phase : examen du sédiment après agitation du tube• Placerletubeàlahauteurdesyeux(liredepréférenceàlalumièredu

jour) et remettre en suspension le culot de sédimentation situé au fond du tube en effectuant un léger mouvement du tube de l’avant vers l’arrière :

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- Si absence de signe de culture (absence de trouble, voile, grains ou flocons colorés en bleu foncé/violet) : culture négative, remettre le milieu à incuber.

- Si présence de signes de culture : . grains ou petitsflocons colorés en bleu foncé/violet : présomption

de M. tuberculosis. . trouble ou voile, prenant une teinte bleu foncé/violet : suspicion de

mycobactéries atypiques.

- Si un trouble homogène (pouvant entraîner une très légère coloration bleue du milieu) est observé après 3 jours d’incubation, il faut suspec-ter une contamination.

NB : La coloration bleu foncé, signe de croissance de mycobactéries, est visiblemêmeenprésencededébriscellulairesoudeparticulesinsolubles.Il est recommandé de faire une numération ainsi qu’une étude morphologique des colonies entre la 2ème et la 8ème semaine suivant l’ensemencement.

Identification,antibiogramme.Lorsqu’une croissance bactérienne est détectée en milieu Bio FM, prélever des particules colorées avec une pipette Pasteur et rechercher la présence de bacilles acido-alcoolo résistants (BAAR).Les cultures obtenues en milieu Bio FM sont tout à fait adaptées à la réali-sation de l’identification (tests biochimiques traditionnels ou sondes) et de l’antibiogramme.

7- PERFORMANCES DU TESTIl a été démontré en étude clinique prospective, sur 34 prélèvements posi-tifs à mycobactéries, qu’il n’y avait pas de différence significative (p>>0,05 - χ2 de Mac Nemard sur données appariées) entre le taux d’isolement d’un milieu traditionnel de référence (Lowenstein-Jensen) et celui du milieu Bio FM.En revanche, il a été démontré que le délai de positivité était en Bio FM (temps moyen de détection en Bio FM = 18,4 jours) significativement plus court (p = 0,000129 < 0,05 - Wilcoxon matched pairs test) qu’en Lowenstein-Jensen (Temps moyen de détection en LJ = 24,0 jours).

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8- CONTRÔLE QUALITé DU TEST

• BioFMLes performances culturales de Bio FM sont contrôlées sur les souches suivantes :

• BioFMV.C.A.La sélectivité du supplément V.C.A. est testée sur différentes souches bactériennes Gram positif et Gram négatif et fongique : l’inhibition de la croissance démontre la conformité du supplément sélectif.

9- LIMITES D’UTILISATIONEn cas de trouble important du milieu, vérifier par un examen direct la présence éventuelle d’une contamination pouvant être associée à unemycobactérie. Dans ce cas, il est préférable, si possible, de repartir de l’échantillon de départ conservé à +4°C. Toute croissance (trouble, voile, grains, flocons, de couleur bleu foncé/violet) confirmée par une coloration de Ziehl comme pouvant être caractéristique d’une mycobactérie, devrafaire l’objet de tests complémentaires pour une identification d’espèce. Une absence de croissance ne signifie pas obligatoirement l’absence d’infectionmycobactérienne.Certainsfacteurspeuventempêcherledéve-loppement des mycobactéries.

SOUCHESRéSULTATDELACULTUREAPRÈS21jOURSà37°CENANAéROBIOSE

Mycobacterium bovis BCG Croissance, grains bleus

Mycobacterium tuberculosis CIP 64.31 Croissance, grains bleus

Mycobacterium avium CIP 104244 Croissance, trouble, grains bleus

Mycobacterium gordonae Croissance, trouble bleuté

SOUCHES RESULTATDELASELECTIVITE

Mycobacterium tuberculosis CIP 64.31 Croissance

Mycobacterium avium CIP 104244 Croissance

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Inhibition

Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 Inhibition

Candida albicans ATCC 10231 Inhibition

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10- CONTRÔLE QUALITé DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d’assurance qualité de la réception des matières premières jusqu’à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l’objet d’un contrôle de qualité et n’est commercialisé que s’il est conforme aux critères d’acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

11- RéFéRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. SAVAGE C., FACON J.P., VERMEULEN M. : Comparaison du milieu

liquide Bio FM et de son supplément sélectif par rapport à la méthode de référence sur milieux solides. 1998. 5ème Congrès de la SFM, Lille, France.

2. TOUZARD M., PERELLO M., FOSSE T. : Bilan d’utilisation du BioArgos (V2) en parallèle avec la technique classique pour la culture des Mycobactéries en routine. Vème journées de Mycobactériologie Novembre 1996, Nice, France.

3. Mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les industries et les laboratoires de recherche et d’enseignement où les travailleurs sont susceptibles d’être exposés àdesagentsbiologiquespathogènes-Arrêtédu13août1996-JournalOfficiel de la République Française.

4. Kent P.T., and KUBICA G.P. 1995. Public health mycobacteriology a guide for the level III laboratory. USDHMS, Centers for Disease Control, Atlanta.

5. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva.1991. 1st edition.

6. Annual Meeting of the International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases (IUATLD), October 1997, Paris, France.

7. CERNOCH P.L., ENNS R.K., SAUBOLLE M.A., and WALLACE R.J., JR. : Laboratory Diagnosis of the Mycobacterioses. Oct. 1994, CUMITECH 16A.

8. SALFINGER M., PFYFFER G.E. : The New Diagnostic Mycobacteriology Laboratory. 1994. 13 : 961-979.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 12/2011 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881089 www.bio-rad.com

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