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Azay - Mycobactéries

MODE OPERATOIRE

Identification des mycobactéries

MO-MYC-005

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SOMMAIRE

I - Objet ........................................................................................................................... 2 II - Méthodologie ............................................................................................................... 2 III - Annexes........................................................................................................................ 13


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I - Objet Cette procédure envisage les modalités d'identification des mycobactéries. Celles ci reposent sur un ensemble de caractères associant des critères morphologiques, culturaux, biochimiques, de sensibilité aux antibiotiques (MO-MYC-006), et de réponse aux épreuves d'hybridation moléculaire avec des sondes nucléiques spécifiques (PR-MYC-002). L'organigramme en page 2 résume la démarche à suivre pour identifier une mycobactérie.

II - Méthodologie A partir des colonies qui se sont développées sur milieux solides ou à partir d'une

culture en milieu liquide : 1 - Vérifier la pureté de la souche Effectuer une coloration de Ziehl-Neelsen (MO-MYC-004). S'il s'agit bien de

bacilles acido-alcoolo-résistants, noter la morphologie des bacilles (longueur, épaisseur, coloration homogène ou non, aspects, caractéristiques.

En cas de suspicion de contamination, effectuer une coloration de Gram et ensemencer une gélose au sang. Si des bactéries non acido-alcoolo résistantes sont présentes, refaire une décontamination (MO-MYC-002).

2 - Rechercher s'il existe plusieurs types de colonies Dans le cas de culture en milieu solide, si l'examen de la culture permet d'évoquer

l'existence de plusieurs types de colonies (l'observation des colonies est facilitée par l'utilisation d'une loupe), repiquer chacune des colonies observées pour disposer de subcultures pures à partir desquelles l'identification sera effectuée.

NB : Les souches de Mycobacterium avium (bacilles acido-alcoolo résistants cocco-bacillaires) donnent souvent deux types de colonies qui, au premier abord, peuvent faire penser à deux espèces différentes.

3 - Noter les caractéristiques de la culture - Le délai d'apparition des colonies ou le délai de détection si la culture est

effectuée en milieu liquide. - L'aspect des colonies (taille, caractère rugueux ou lisse, pigment avant et après

exposition à la lumière). - Leur nombre sur les différents milieux ensemencés, et aux différentes températures d'incubation (MO-MYC-003). La pigmentation des souches, l'aspect des colonies en culture, l'aspect des bacilles après coloration de Ziehl Neelsen, sont des éléments d'orientation importants.


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Organigramme d'identification des souches de mycobactéries

Vérifier la pureté de la souche (Ziehl;Gram;GS)

Culture positive

Milieu solide Milieu liquide

Noter le temps de croissance,

le nombre et l'aspect des colonies

Noter le délai de détection

de la culture Subculture

Un seul type de colonies ?

M. atypiques ?Colonies

pigmentées ?

Hybridation avec sonde spécifique du

complexe tuberculosis

Etude de la sensibilité aux antibiotiques

Réisoler

OUIOUI

NON

MO-MYC-003

Rendu du résultat

Hybridation avec sondes spécifiques de mycobactéries

atypiques (avium / kansasii

gordonae)

GI >= 300

NON

NON

NON

OUI

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MO-MYC-006

MO-MYC-004

Identification Biochimique

PR-MYC-002


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èSuspicion d'une mycobactérie du complexe tuberculosis Sur les cultures en milieu solide : Les colonies du complexe tuberculosis ne sont pas pigmentées même

après exposition à la lumière (cf. page 7). Si la primo-culture est trop peu abondante, procéder à une subculture sur

laquelle on fera les tests d'identification. � On effectue soit une épreuve d'hybridation avec la sonde spécifique du

complexe tuberculosis (PR-MYC-002) : - Hybridation positive : colonies de bacilles du complexe tuberculosis. - Hybridation négative : colonies de mycobactéries non tuberculeuses. � Ou on fait une galerie d'identification biochimique des mycobactéries.

(cf. annexes du document). - Niacin-test : test de Konno. - Nitrate réductase selon la méthode de Virtanen. - Activité catalasique à 22°C, après chauffage à 68°C pendant 15 mn. - Epreuves de sensibilité aux antibiotiques (Pyrazinamide à 200 mg/l, Cyclosérine à 30 mg/l et TCH à 2 mg/l (cf. page 8). Sur les cultures en milieu liquide : Procéder à une épreuve d'hybridation avec la sonde spécifique du

complexe tuberculosis dès que le GI atteint ou dépasse 300. Interprétation des résultats

Utiliser le tableau n°1 pour identifier la culture, sinon adresser la souche au Centre National de Référence.


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èSuspicion d'une mycobactéries non tuberculeuse � Les colonies sont évocatrices de M. avium-intracellulare, de M. kansasii ou de M. gordonae : Þ Identification par épreuve d'hybridation

(PR-MYC-002). 1 - Les colonies ne sont pas pigmentées M. avium : colonies souvent de deux types : lisses, transparentes

et opaques à tendance plutôt rugueuse, constituées de coccobacilles acido alcoolo résistants.

2 - Les colonies sont photochromogènes M. kansasii : grosses colonies, eugoniques, rugueuses formées

de gros bacilles à coloration en échelle. 3 - Les colonies sont pigmentées à l'obscurité M. gordonae : grosses colonies lisses constituées de bacilles

acido alcoolo résistants, de taille moyenne. S'il s'agit de colonies de petite taille à croissance lente, favorisées par le pyruvate et constituées de bacilles longs et chevelus, penser à M. xenopi.

Si l' hybridation est positive avec l'une des sondes spécifiques, soit de

M. avium-intracellulare, soit de M. kansaii, soit de M. gordonae Þ rendre le résultat.

� Les colonies ne sont évocatrices ni de M. avium-intracellulare, ni de

M. kansasii, ni de M. gordonae ou l'hybridation avec les sondes spécifiques de ces bacilles a été négative Þ Identification par galerie biochimique (selon l'organigramme en page 6).

A partir d'une culture en milieu solide, réaliser une suspension en eau

distillée et l'ajuster par opacimétrie à 1 mg /ml. Effectuer les dilutions de 10 en 10 jusqu'à 10-3 mg /ml.

A partir de la suspension à 10-3 mg/ml è Rechercher la présence d'un pigment. - Inoculer 0,05 ml sur la tranche de 2 tubes de milieu de Löwenstein-

Jensen (LJ), les entourer d'un papier aluminium. - Placer à l'étuve à 37°C. - Interpréter selon l'organigramme en page 7.


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A partir de la suspension à 1 mg/ml è Etudier la sensibilité aux antibiotiques sur milieu

Löwenstein-Jensen, les propriétés culturales de la souche à différentes températures, la culture sur gélose ordinaire et sur milieu de Löwenstein Jensen enrichi de pyruvate de sodium.

- Ensemencer 0,05 ml sur chacun des 9 tubes de milieux suivants : Numéro du

tube Milieux de culture Températures

d'incubation 1 Löwenstein-Jensen 37°C 2 Löwenstein-Jensen + PAS 37°C 3 Löwenstein-Jensen + Tb1 37°C 4 Löwenstein-Jensen + EMB 37°C 5 Löwenstein-Jensen + pyruvate de sodium 37°C 6 Löwenstein-Jensen 30°C 7 Gélose ordinaire 30°C 8 Löwenstein-Jensen 42°C 9 Löwenstein-Jensen 22°C

PAS : Acide para-aminosalicylique (0,5 mg/l). EMB : Ethambutol (2 mg/l). Pyruvate de sodium à 0,4%. Tb1 : Thiosemicarbazone (10 mg/l). - Observer la croissance sur les différents tubes aux 3è, 7è, 14è, 21è,

28è et 42è jours de culture (voire 56è jour). - Noter le délai d'apparition des colonies. Interprétation globale des résultats Identifier les espèces de mycobactéries au sein des groupes de Runyon

selon les tableaux 2, 3, 4, et 5. Remarque Générale w Les tests biochimiques sont des tests de réalisation et d'interprétation

délicates, qui nécessitent d'être contrôlés par des témoins, ce qui oblige à entretenir des souches de référence. Compte tenu du poids de la démarche, ces épreuves ne devraient être réalisées que par quelques laboratoires trés spécialisés ou par le Centre National de Référence qui regroupant un nombre


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suffisant de souches peuvent dans des délais raisonnables réaliser des séries.


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pas de pigmentpigment

Groupe II de Runyon

Groupe I de Runyon

Galerie d'identification Nitrate réductase

Hydrolyse du tween Uréase

Niacin-test Epreuves de sensibilité

aux antibiotiques

Exposition à la lumière vive pendant 2 h

Pigment ?

Groupe III de Runyon

2 tubes LJ entourés de

papier aluminium



Phosphatase acide Epreuves de sensibilité

aux antibiotiques



Phosphatase acide Catalase

Epreuves de sensibilité aux antibiotiques

OUI

Enlever le papier sur un des tubes

souche scotochromogène

souche photochromogène

souche nonchromogène

NON

24h à 37°C

Le Groupe IV de Runyon correspond aux mycobactéries à croissance rapide

(colonies qui poussent en moins de 7 jours).

Galerie d'identification Nitrate réductase Citrate de sodium

Mannitol Inositol


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Tableau 1 : Caractères d'identification des bacilles du complexe

tuberculosis

Espèces de mycobactéries

Aspect des colonies

Croissance favorisée / pyruvate

TCH 2mg/l

PZA 200mg/l

CS 30 mg/l

Nitrate * réductase

Niacin Test

tuberculosis eugonique rugueux

- R S S + +

africanum dysgonique rugueux

+ S(v) S S -(v) (v)

bovis dysgonique lisse

+ S R S - -

bovis var BCG eugonique rugueux

- S R R - -

*Méthode de Virtanen TCH : Hydrazide de l'acide Thiophène 2 Carboxylique. PZA : Pyrazinamide CS : Cyclosérine v : variable R : Résistant ; S : Sensible.


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Tableau 2 : Identification des principales espèces de mycobactéries appartenant au Groupe I de Runyon (pigment photochromogène)

Espèces Morphologie Vitesse / Lj

Aspect / Lj

LJ 30°C

LJ 37°C

LJ 42°C

LJ Tb1 10mg/l

Nitrate réd.

Hyd tween (10 j)

Uréase

Niacin test

kansasii bacilles trapus

en échelle 14 j E,R ou S + + - - + + + -

marinum bacilles trapus 3 à 5 j E, S ++ - - + - + + - asiaticum* courts 21 j d, S + + - - + - - simiae* courts 21 j d, S + + + - - + +a

a : > 50 % mais < 80 % souches + : ≥ 85 % des souches - : ≤ 15 % des souches R : Rugueux d : dysgonique LJ : Löwenstein-Jensen S : lisse E : Eugonique *faiblement photochromogène


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Tableau 3 : Identification des principales espèces de mycobactéries appartenant au Groupe II de Runyon (pigment scotochromogène)

Espèces

morpho -logie

vitesse / LJ

aspect / LJ

GO LJ 42°C

LJ 30°C

LJ Tb1 10mg/l

LJ CS 30mg/l

Nitrate réd.

Pase acide

Hyd tween (10 j)

Uréase

gordonae id.BK 14 j E, S - - + + - - V + V szulgai * id. BK 14 j E, S - - + + + + + V + flavescens courts 7 j E, R ± ± + + - + - + + scrofulaceum

courts ≥ 28 j S - - + - - - - - V

+ : ≥ 85 % des souches - : ≤ 15 % des souches R : Rugueux d : dysgonique S : lisse E : Eugonique LJ : Löwenstein-Jensen V : Variable * : photochromogène à 22°C


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Tableau 4 : Identification des principales espèces de mycobactéries appartenant au Groupe III de Runyon

Espèces de mycobactérie

Complexe terrae

gastri xenopi malmoënse himoïdei avium haemophilum

ulcerans

morphologie id. BK gros

bacilles zébrés

longs et fins

courts courts courts courts id. BK ("globi" dans lésions)

aspect /LJ E, R ou S E, R ou S

d, S d, S d, R d, S dissociation ±

d, S ou R d, R

pigment - - + (scoto.)

- - - ( ±) - -

vitesse de croissance /LJ

14 j 14 j ≥28 j (37°C)

≥21 j ≥21 j ≥21 j ≥21 j ≥42 j

LJ 30°C LJ 37°C LJ 42°C LJ+EMB (2mg/l) LJ Tb1 (10mg/l)

+ + V - V

+ + - - S

± + + V V

+ + - - R

+ + + - R

+ + V + V

+ (CFA 15mg/l) - -

+ - -

nitrate réductase

V - - - - - - -

catalase à 22° catalase à 68°

+++ +

+ -

± ±

+ -

+ V

- -

- -

uréase - V - V - - - - hyd tween 80 + (1-3 j) +(1-3 j) - + (10 j) + (10 j) - - - phosphatase acide

+ - - - - -

+ : ≥ 85 % des souches - : ≤ 15 % des souches


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R : rugueux S : lisse d : dysgonique E : eugonique LJ : Löwenstein-Jensen V : variable Tableau 5 : Identification des différentes espèces appartenant au Groupe IV de Runyon (croissance rapide 3 à 7 j sur gélose ordinaire)

Espèces de mycobactérie

Pigment Nitrate réductase

42°C Citrate Na

Mannitol Inositol

fortuitum 0 + + - - - fortuitum biovar 3 0 + + - + + peregrinum 0 + + - + - chelonae 0 - + - - abscessus 0 - - - - MCLO 0 - + + - smegmatis 0* + V V + + Complexe vaccae** + (jaune) V

*pigmentation tardive **M. aurum, M. neoaurum, M. parafortuitum, ainsi que M. thermoresistible et M. phlei qui se développent à 52°C, le premier est β galactosidase +, le second est β galactosidase -


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III - ANNEXES

Epreuve de photo induction

A partir de colonies suffisamment développées, mais non vieillies (donc en phase logarithmique de croissance), un tube de Löwenstein-Jensen est exposé à la lumière (lampe de 60 watts placée à 25 cm de la culture) pendant au moins une heure. Un autre tube, habillé de papier aluminium, est observé comme témoin. Les deux tubes sont remis à l'étuve pendant 24 heures. Si les colonies soumises à la lumière ont pris, lors de la remise en végétation, une pigmentation jaune, orangée ou rouge, par rapport au témoin, la souche est dite photochromogène. Si la culture est pigmentée dans les deux tubes, la souche est dite scotochromogène. Si aucune pigmentation n'apparaît dans le tube entouré de papier aluminium, ou dans le tube exposé à la lumière, la souche est dite non chromogène.

Remarques : w La réaction peut être compromise par l'âge de la culture (trop jeune ou tvieille), et par une insuffisance d'oxygénation (tube trop hermétique).

M. szulgai est une souche photochromogène à 25°C, scotochromogène à 37°C.

Témoins - Témoin souche photochromogène : culture de M. kansasii - Témoin souche scotochromogène : culture de M. gordonae


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Recherche de l'uréase

Réactifs Milieu urée-indole (Sanofi Pasteur, réf. 63715) Se conserve à +4°C. Technique - Introduire dans un tube à hémolyse 2 gouttes d'eau distillée stérile. Y disperser une grosse spatule de culture. - Ajouter 1 ml de milieu urée indole. - Fermer le tube stérilement. - Incuber à l'étuve à 37°C pendant 3 jours. - Après 2 heures, 1 à 3 jours d'incubation, comparer la coloration avec celle des témoins. Réaction + = virage au rouge frambroise Réaction - = pas de virage de couleur dans les 3 jours Réaction ± = : virage au légèrement rosé, répéter le test Témoins - Témoin positif : virage au rouge framboise franc = réaction avec culture de M. kansasii souche type. - Témoin négatif : pas de virage de couleur = réaction sans culture.


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Recherche de l'activité catalasique

Réactifs Eau oxygénée à 30 volumes. Tween 80, à 10 % dans l'eau. Mélanger à parties égales au moment de l'emploi. Technique Activité catalasique à 22°C - 1 ml de réactif est déposé à la surface d'une culture sur milieu de Löwenstein en position inclinée, ou en position verticale. Après 5 mn de contact, on observe: Réaction + = dégagement gazeux. Réaction - = pas de dégagement gazeux. Activité catalasique à 68°C (inhibition de l'activité catalasique par la chaleur). - Faire une suspension des bactéries à étudier (culture jeune) dans 2 tubes à hémolyse : 1 anse pleine dans 2 à 3 gouttes d'eau distillée stérile. - Porter l'un des tubes pendant 1/4 h au bain marie à 68°C. - Laisser refroidir; ajouter dans les 2 tubes, 1 ml de réactif. - Laisser 15 mn en contact et apprécier le dégagement gazeux. NB : La hauteur du dégagement gazeux est proportionnelle à l'intensité de l'activité catalasique de la souche.


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Recherche de l'acide nicotinique

(Niacin Test de Konno) Réactifs Aniline pure ou PAS en poudre. Bromure de cyanogène. Technique - Déposer à la surface d'une culture sur milieu de Löwenstein, 1 ml d'eau distillée stérile (si possible additionnée de 1 % de Tween 80) - Laisser le tube incliné pendant 20 mn et recueillir l'eau dans un tube à hémolyse. - Ajouter une goutte d'aniline ou 0,03 g de PAS en poudre; agiter. - Laisser agir pendant 5 à 15 mn. - Ajouter à la seringue, 1 ml de bromure de cyanogène à 10 %. Méthode par strip (bandelette imprégnée de réactif) - Déposer à la surface d'une culture sur milieu de Löwenstein, 1 ml d'eau distillée stérile (si possible additionnée de 1 % de Tween 80) - Laisser le tube incliné pendant 20 mn et recueillir l'eau dans un tube à hémolyse. - Tremper la bandelette imprégnée de réactif dans le tube à hémolyse. - Laisser à température ambiante pendant 15 à 20 mn en agitant de temps en temps. Niacin Test positif = Coloration jaune. Niacin Test négatif = Incolore. Témoins - Témoin positif : Coloration jaune avec culture de M. tuberculosis.


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Réduction des nitrates (Epreuve de Virtanen)

Réactifs Solution de nitrate de sodium : Nitrate de sodium ..................................................... 0,085 g Eau distillée.............. ................................................. 100 ml Réactif A de Griess : Acide sulfanilique......... ............................................ 0,80 g Acide acétique............. .............................................. 30 ml Eau distillée................. .............................................. 100 ml Réactif B de Griess : Acide naphtylamine................................................... 0,50 g Acide acétique............. .............................................. 30 ml Eau distillée................. .............................................. 100 ml Ces réactifs se conservent plusieurs mois à l'obscurité. Technique - Une anse de mycobactéries à étudier est émulsionnée dans 2 gouttes d'eau distillée stérile dans un tube à hémolyse. - Ajouter 2 ml d'une solution à 0,085 % de nitrate de sodium. - Incuber 2 h à 37°C. - Ajouter 0,2 ml du réactif A et 0,2 ml du réactif B. Réaction + = Coloration rose à rouge résultat de la réduction des nitrates en nitrites par la nitrate réductase. Si pas de coloration, ajouter une pincée de poudre de zinc: le zinc réduit les nitrates encore présent en nitrites, une coloration rose apparaît; la réaction est négative (bactéries sans nitrate réductase). Si au contraire, la teinte du milieu reste inchangée, le stade nitrite a été dépassé (bactéries ayant une nitrate réductase très active). Témoins - Témoin positif : culture de M. tuberculosis. - Témoin négatif : culture de M. bovis.


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Recherche de la phosphatase acide

Réactifs Substrat Solution de phosphate de colamine phénol phtaléine, à 1 mg/ml dans tampon pH 5,4 (acide phénol phtaléine diphosphorique sel tétracolaminique - pour le dosage de la phosphatase - C28 H44 M4 O14 P2 MERK réf n° 24533). Se conserve 6 semaines à +4°C. Tampon pH = 5,4 : • Solution 1 = solution 0,2 M d'acide acétique, soit 6,005 g ou 5,8 ml d'acide acétique (d : 1,05) dans 500 ml d'eau distillée (acide acétique 100 % RP Normapur. Prolabo 20.104.298). • Solution 2 = solution 0,2 M d'acétate de sodium, soit 13,60 g d'acétate de sodium dans 500 ml (acétate de sodium à 3 molécules d'eau. RP Normapur. Prolabo 27.652.298). - Ajouter 14,5 ml de la solution 1 à 85 ml de la solution 2 pour obtenir la solution tampon à pH = 5,4. - Autoclaver 30 mn à 120°C. - Se conserve 6 mois à +4°C. Réactif révélateur Carbonate de sodium en solution aqueuse à 10 % : peser 10 g, y ajouter 100 ml d'eau distillée stérile. Autoclaver 30 mn à 120°C (carbonate de sodium, Prolabo RP Normapur 27.771.290). Se conserve 6 semaines à +4°C. Technique - Dans un tube à hémolyse stérile, introduire 2 gouttes d'eau distillée stérile. Y disperser une grosse spatule de la culture. - Ajouter stérilement 0,5 ml de solution de phosphate de colamine phénol phtaléine. - Incuber 2 heures à 37°C. - Ajouter 0,5 ml de carbonate de sodium, observer la couleur et la comparer à celle des témoins. Réaction + = coloration rose framboise Réaction - = absence de coloration Témoins - Témoin positif = coloration rose rouge framboise : avec culture de M. terrae souche type - Témoin négatif = pas de coloration : réaction sans culture.


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Recherche de l'hydrolyse du tween 80

Réactifs Bacto TB hydrolysis Reagent (Difco réf. 3192-56-5) A conserver à l'abri de la lumière à +4°C. Technique - Dans un tube à hémolyse stérile ajouter 2 gouttes d'eau distillée stérile et y mettre en suspension une grosse spatule de la culture. - Ajouter stérilement 2 ml d'eau distillée stérile puis 2 gouttes de Bacto TB hydrolysis reagent. - Fermer le tube stérilement avec bouchon caoutchouc et incuber à l'étuve à 37°C. - Après 1, 5 et 10 jours d'incubation : comparer la couleur du mélange à celle des témoins. Réaction + = virage au rose rouge du liquide* Réaction - = pas de virage de couleur du substrat. Témoins - Témoin négatif = pas de virage de couleur du liquide : dans un tube à hémolyse, verser stérilement 2 ml d'eau distillée et ajouter 2 gouttes de substrat. - Témoin fortement positif = virage au rose rouge du liquide en moins de 5 jours : réaction avec culture de M. kansasii souche type. *le virage au rose rouge de la culture n'indique pas que le test est positif.


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Produits Hydrazide de l’acide thiophène-2-carboxylique Sigma T-1388 Milieu de Löwenstein-Jensen non coagulé préparé extemporanément ou milieu SDP Préparation des réactifs Solution d’hydrazide de l’acide thiophène-2-carboxylique (TCH) à 100 µg par ml. - Dissoudre 10 mg de TCH dans 100 ml d’éthanol à 50%. - Stériliser par filtration. - Répartir la solution par aliquots de 10 ml dans des tubes stériles. - Conserver à -20°C jusqu’à un an. Milieu de Löwenstein-Jensen contenant 2 µg de TCH par ml. - Ajouter 10 ml de solution de TCH à 100 µg par ml à 500 ml de milieu de Löwenstein-Jensen avant coagulation. - Répartir 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes. - Coaguler le milieu 40 mn à 85°C. - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Technique Préparation de la suspension bacillaire. A partir d’une suspension bacillaire calibrée à 1 mg/ml (cf. page 6), préparer des dilutions à 10-1 et 10-3 en eau distillée stérile. Ensemencement des tubes avec et sans TCH. - Inoculer 0,2 ml de la dilution 10-1 sur un tube de Löwenstein-Jensen contenant 2 µg de TCH par ml et 0,2 ml des dilutions 10-1 et 10-3 sur des tubes de Löwenstein-Jensen témoin ou ensemencer chacune des dilutions à l’anse calibrée. - Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche étudiée.

Croissance en présence de TCH (Hydrazide de l'acide thiophène-2-carboxylique)


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Lecture des résultats et interprétation Examiner les tubes contenant le TCH quand la croissance est visible sur les tubes témoins. Si la croissance sur le tube TCH est inférieure à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “sensible”. Si la croissance sur le tube TCH est égale à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “résistante”. La croissance sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-1 doit être confluente ou présenter plus de 100 colonies. Si la numération des colonies du tube témoin est inférieure à 100, le test n’est pas interprétable. Contrôle de qualité Pour chaque lot de milieu de Löwenstein-Jensen contenant du TCH, il faut réaliser un test avec un souche de M. tuberculosis et une souche de M. bovis. Le milieu est de bonne qualité si la souche de M. tuberculosis pousse et celle de M. bovis ne pousse pas. Si les résultats du contrôle de qualité ne sont pas satisfaisants, tous les tests réalisés avec le même lot de milieu ne sont pas interprétables. Eliminer le lot de milieu. Répéter le test avec un nouveau lot de milieu de Löwenstein-Jensen contenant du TCH pour chacune des souches préalablement testées.


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Croissance en présence de CS (D-Cyclosérine)

Produits D-cyclosérine Sigma C6880. Milieu de Löwenstein-Jensen non coagulé préparé extemporanément. Préparation des réactifs Solution de D-cyclosérine (CS) à 3 mg par ml. - Dissoudre 300 mg de CS dans 100 ml d’eau distillée. - Stériliser par filtration. - Répartir la solution par aliquots de 5 ml dans des tubes stériles. - Conserver à -20°C jusqu’à un an. Milieu de Löwenstein-Jensen contenant 30 µg de CS par ml. - Ajouter 5 ml de solution de CS à 3 mg par ml à 500 ml de milieu de Löwenstein-Jensen avant coagulation. - Répartir 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes. - Coaguler le milieu 40 mn à 85°C. - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Technique Préparation de la suspension bacillaire. A partir d’une suspension bacillaire calibrée au 1 mg/ml (cf page 6), préparer des dilutions à 10-1 et 10-3 en eau distillée stérile. Ensemencement des tubes avec et sans CS. - Inoculer 0,2 ml de la dilution 10-1 sur un tube de Löwenstein-Jensen contenant 30 µg de CS par ml et 0,2 ml des dilutions 10-1 et 10-3 sur des tubes de Löwenstein-Jensen témoin ou ensemencer chacune des dilutions à l’anse calibrée. - Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche étudiée.


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Rév A

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Lecture des résultats et interprétation Examiner les tubes avec CS quand la croissance est visible sur les tubes témoins. Si la croissance sur le tube CS est inférieure à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “sensible”. Si la croissance sur le tube CS est égale à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “résistante”. La croissance sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-1 doit être confluente ou présenter plus de 100 colonies. Si la numération des colonies du tube témoin est inférieure à 100, le test n’est pas interprétable. Contrôle de qualité Pour chaque lot de milieu de Löwenstein-Jensen avec CS, il faut réaliser un test avec un souche de M. fortuitum et une souche de M. smegmatis. Le milieu est de bonne qualité si la souche de M. fortuitum est résistante et celle de M. smegmatis est sensible. Si les résultats du contrôle de qualité ne sont pas satisfaisants, tous les tests réalisés avec le même lot de milieu ne sont pas interprétables. Eliminer le lot de milieu. Répéter le test avec un nouveau lot de milieu de Löwenstein-Jensen avec la Cyclosérine pour chacune des souches préalablement testées.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 25 /33

Croissance en présence de EMB (Ethambutol)

Produits Ethambutol Sigma E-4630 Milieu de Löwenstein-Jensen non coagulé préparé extemporanément. Préparation des réactifs Solution d’éthambutol (EMB) à 0,1 mg par ml. - Dissoudre 10 mg de EMB dans 100 ml d’eau distillée. - Stériliser par filtration. - Répartir la solution par aliquots de 10 ml dans des tubes stériles. - Conserver à -20°C jusqu’à un an. Milieu de Löwenstein-Jensen contenant 2 µg de EMB par ml. - Ajouter 10 ml de solution de EMB à 0,1 mg par ml à 500 ml de milieu de Löwenstein-Jensen avant coagulation. - Répartir 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes. - Coaguler le milieu 40 mn à 85°C. - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Technique Préparation de la suspension bacillaire. A partir d’une suspension bacillaire calibrée à 1 mg /ml (cf. page 6), préparer des dilutions à 10-1 et 10-3 en eau distillée stérile. Ensemencement des tubes avec et sans EMB. Inoculer 0,2 ml de la dilution 10-1 sur un tube de Löwenstein-Jensen contenant 2 µg de EMB par ml et 0,2 ml des dilutions 10-1 et 10-3 sur des tubes de Löwenstein-Jensen témoin ou ensemencer chacune des dilutions à l’anse calibrée. Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche étudiée.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 26 /33

Lecture des résultats et interprétation Examiner les tubes avec EMB quand la croissance est visible sur les tubes témoins. Si la croissance sur le tube EMB est inférieure à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “sensible”. Si la croissance sur le tube EMB est égale à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “résistante”. La croissance sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-1 doit être confluente ou présenter plus de 100 colonies. Si la numération des colonies du tube témoin est inférieure à 100, le test n’est pas interprétable. Contrôle de qualité Pour chaque lot de milieu de Löwenstein-Jensen avec EMB, il faut réaliser un test avec un souche de M. fortuitum et une souche de M. smegmatis. Le milieu est de bonne qualité si la souche de M. fortuitum est résistante et celle de M. smegmatis est sensible. Si les résultats du contrôle de qualité ne sont pas satisfaisants, tous les tests réalisés avec le même lot de milieu ne sont pas interprétables. Eliminer le lot de milieu. Répéter le test avec un nouveau lot de milieu de Löwenstein-Jensen avec EMB pour chacune des souches préalablement testées.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 27 /33

Croissance en présence de Tb1 (Thiosemicarbazone)

Produits Thiosemicarbazone Sigma T8900 Milieu de Löwenstein-Jensen non coagulé préparé extemporanément. Préparation des réactifs Solution de thiosemicarbazone (Tb1) à 1 mg par ml. - Dissoudre 100 mg de Tb1 dans 100 ml de diméthyl sulfoxide. - Stériliser par filtration. - Répartir la solution par aliquots de 5 ml dans des tubes stériles. - Conserver à -20°C jusqu’à un an. Milieu de Löwenstein-Jensen contenant 10 µg de Tb1 par ml. - Ajouter 5 ml de solution de Tb1 à 1 mg par ml à 500 ml de milieu de Löwenstein-Jensen avant coagulation. - Répartir 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes. - Coaguler le milieu 40 mn à 85°C. - - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Technique Préparation de la suspension bacillaire. - A partir d’une suspension bacillaire calibrée au 1mg/ml (cf. page 6), préparer des dilutions à 10-1 et 10-3 en eau distillée stérile. Ensemencement des tubes avec et sans Tb1. - Inoculer 0,2 ml de la dilution 10-1 sur un tube de Löwenstein-Jensen contenant 10 µg de Tb1 par ml et 0,2 ml des dilutions 10-1 et 10-3 sur des tubes de Löwenstein-Jensen témoin ou ensemencer chacune des dilutions à l’anse calibrée. - Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche étudiée.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 28 /33

Lecture des résultats et interprétation Examiner les tubes avec Tb1 quand la croissance est visible sur les tubes témoins. Si la croissance sur le tube Tb1 est inférieure à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “sensible”. Si la croissance sur le tube Tb1 est égale à la croissance notée sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-3, la culture est notée “résistante”. La croissance sur le tube témoin ensemencé avec la dilution 10-1 doit être confluente ou présenter plus de 100 colonies. Si la numération des colonies du tube témoin est inférieure à 100, le test n’est pas interprétable. Contrôle de qualité Pour chaque lot de milieu de Löwenstein-Jensen avec Tb1, il faut réaliser un test avec un souche de M. fortuitum et une souche de M. smegmatis. Le milieu est de bonne qualité si la souche de M. fortuitum est résistante et celle de M. smegmatis est sensible. Si les résultats du contrôle de qualité ne sont pas satisfaisants, tous les tests réalisés avec le même lot de milieu ne sont pas interprétables. Eliminer le lot de milieu. Répéter le test avec un nouveau lot de milieu de Löwenstein-Jensen avec Tb1 pour chacune des souches préalablement testées.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 29 /33

Utilisation du Mannitol comme unique source de carbone

Produits Mannitol Prolabo 25313.237 Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 Phosphate monopotassique KH2PO4 Sulfate de magnésium MgSO4, 7H2O Gélose purifiée. Préparation des réactifs Solution de mannitol à 10%. - Dissoudre 5 g de mannitol dans 50 ml d’eau distillée. - Stériliser par filtration. Milieu de base. - Peser 2, 4 g de sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 - Peser 0,5 g de phosphate monopotassique KH2PO4

- Peser 0,5 g de sulfate de magnésium MgSO4, 7H2O - Dissoudre les sels dans 950 ml d’eau distillée. - Ajuster le pH à 7,2. - Ajouter 20 g de gélose purifiée. - Autoclaver à 121°C pendant 20 mn. Milieu Mannitol. - Préchauffer le milieu de base à 56°C dans un bain-marie. - Ajouter stérilement 25 ml de solution de mannitol à 475 ml de milieu de base. - Répartir stérilement 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes et laisser solidifier le milieu. - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Milieu témoin. - Préchauffer le milieu de base à 56°C dans un bain-marie. - Répartir stérilement 5 ml de milieu de base dans des tubes à vis - Répartir ainsi 450 ml de milieu de base. - Incliner les tubes et laisser solidifier le milieu. - Conserver à 4°C pendant 3 mois.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 30 /33

Technique - Inoculer un tube de milieu de base et un tube de milieu de culture avec 0,2 ml de la dilution 10-3 de la suspension de culture calibrée au 1 mg/ml (cf page 6). - Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche. - Inoculer un tube de milieu de culture avec 0,2 ml de la dilution 10-3 d’une suspension de M. peregrinum calibrée au 1mg/ml (cf page 6). - Incuber le tube à 37°C. Lecture des résultats et interprétation Quand la croissance est visible sur le tube ensemencé avec la suspension de M. peregrinum, examiner la croissance sur les tubes de milieu de base et de milieu de culture ensemencés avec la souche à étudier. Si une croissance est visible sur le milieu de culture et en l’absence de croissance sur le milieu de base, le test est positif. En l’absence de croissance sur les 2 tubes, de milieu de base et de milieu de culture, le test est négatif. Si une croissance est visible sur le milieu de base, répéter le test. Contrôle de qualité Le tube de milieu de culture ensemencé avec la souche de M. peregrinum constitue le contrôle positif. Le tube de milieu de base ensemencé avec la souche à étudier constitue le contrôle négatif. Si aucune croissance n’est visible sur le tube de milieu de culture ensemencé avec M. peregrinum, jeter le lot de milieu. Répéter le test sur un nouveau lot. Si une croissance est visible sur le milieu de base, répéter le test avec une dilution à 10-3 de la suspension au mg de la souche à étudier.


MODE OPERATOIRE


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Rév A

P 31 /33

Utilisation de l'Inositol comme unique source de carbone

Produits Inositol Prolabo 24746.236 Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 Phosphate monopotassique KH2PO4 Sulfate de magnésium MgSO4, 7H2O Gélose purifiée. Préparation des réactifs et conservation Solution d'inositol à 10%. - Dissoudre 5 g d'inositol dans 50 ml d’eau distillée. - Stériliser par filtration. Milieu de base. - Peser 2, 4 g de sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 - Peser 0,5 g de phosphate monopotassique KH2PO4 - Peser 0,5 g de sulfate de magnésium MgSO4, 7H2O - Dissoudre les sels dans 950 ml d’eau distillée. - Ajuster le pH à 7,2. - Ajouter 20 g de gélose purifiée. - Autoclaver à 121°C pendant 20 mn. Milieu Inositol . - Préchauffer le milieu de base à 56°C dans un bain-marie. - Ajouter stérilement 25 ml de solution d'inositol à 475 ml de milieu de base. - Répartir stérilement 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes et laisser solidifier le milieu. - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Milieu témoin. - Préchauffer le milieu de base à 56°C dans un bain-marie. - Répartir stérilement 5 ml de milieu de base dans des tubes à vis - Répartir ainsi 450 ml de milieu de base. - Incliner les tubes et laisser solidifier le milieu. - Conserver à 4°C pendant 3 mois.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 32 /33

Technique - Inoculer un tube de milieu de base et un tube de milieu de culture avec 0,2 ml de la dilution 10-3 de la suspension de culture calibrée au 1mg /ml (cf page 6). - Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche. - Inoculer un tube de milieu de culture avec 0,2 ml de la dilution 10-3 d’une suspension de M. peregrinum calibrée au mg (cf page 6). - Incuber le tube à 37°C. Lecture des résultats et interprétation Quand la croissance est visible sur le tube ensemencé avec la suspension de M. peregrinum, examiner la croissance sur les tubes de milieu de base et de milieu de culture ensemencés avec la souche à étudier. Si une croissance est visible sur le milieu de culture et en l’absence de croissance sur le milieu de base, le test est positif. En l’absence de croissance sur les 2 tubes, de milieu de base et de milieu de culture, le test est négatif. Si une croissance est visible sur le milieu de base, répéter le test. Contrôle de qualité Le tube de milieu de culture ensemencé avec la souche de M. peregrinum constitue le contrôle positif. Le tube de milieu de base ensemencé avec la souche à étudier constitue le contrôle négatif. Si aucune croissance n’est visible sur le tube de milieu de culture ensemencé avec M. peregrinum, jeter le lot de milieu. Répéter le test sur un nouveau lot. Si une croissance est visible sur le milieu de base, répéter le test avec une dilution à 10-3 de la suspension au mg de la souche à étudier.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 33 /33

Utilisation du Citrate de sodium comme unique source de carbone

Produits Citrate trisodique Prolabo 27833.294 Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 Phosphate monopotassique KH2PO4 Sulfate de magnésium MgSO4, 7H2O Gélose purifiée. Préparation des réactifs Solution de citrate de sodium. - Dissoudre 5,6 g de citrate de sodium dans 50 ml d’eau distillée. - Stériliser par filtration. Milieu de base. - Peser 2, 4 g de sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 - Peser 0,5 g de phosphate monopotassique KH2PO4 - Peser 0,5 g de sulfate de magnésium MgSO4, 7H2O - Dissoudre les sels dans 950 ml d’eau distillée. - Ajuster le pH à 7. - Ajouter 20 g de gélose purifiée. - Autoclaver à 121°C pendant 20 mn. Milieu témoin. - Préchauffer le milieu de base à 56°C dans un bain-marie. - Répartir stérilement 5 ml de milieu de base dans des tubes à vis - Répartir ainsi 450 ml de milieu de base - Incliner les tubes et laisser solidifier le milieu. - Conserver à 4°C pendant 3 mois. Milieu de culture. - Préchauffer le milieu de base à 56°C dans un bain-marie. - Ajouter stérilement 25 ml de solution de citrate de sodium à 475 ml de milieu de base. - Répartir stérilement 5 ml de milieu dans des tubes à vis - Incliner les tubes et laisser solidifier le milieu. - Conserver à 4°C pendant 3 mois.


MODE OPERATOIRE


MO-MYC-005

Rév A

P 34 /33

Technique - Inoculer un tube de milieu de base et un tube de milieu de culture avec 0,2 ml de la dilution 10-3 de la suspension de culture calibrée au 1 mg/ml (cf.page 6). - Incuber les tubes à la température optimale de croissance de la souche. - Inoculer un tube de milieu de culture avec 0,2 ml de la dilution 10-3 d’une suspension de M. chelonei calibrée au 1 mg /ml (cf.page 6). - Incuber le tube à 37°C. Lecture des résultats et interprétation Quand la croissance est visible sur le tube ensemencé avec la suspension de M. chelonei, examiner la croissance sur les tubes de milieu de base et de milieu de culture ensemencés avec la souche à étudier. Si une croissance est visible sur le milieu de culture et en l’absence de croissance sur le milieu de base, le test est positif. En l’absence de croissance sur les 2 tubes, de milieu de base et de milieu de culture, le test est négatif. Si une croissance est visible sur le milieu de base, répéter le test. Contrôle de qualité Le tube de milieu de culture ensemencé avec la souche de M. chelonei constitue le contrôle positif. Le tube de milieu de base ensemencé avec la souche à étudier constitue le contrôle négatif. Si aucune croissance n’est visible sur le tube de milieu de culture ensemencé avec M. chelonei, jeter le lot de milieu. Répéter le test sur un nouveau lot. Si une croissance est visible sur le milieu de base, répéter le test avec une dilution à 10-3 de la suspension au mg de la souche à étudier.

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