modulation par l'oestradiol et l'aldostérone du contrôle ... · resume modulation par...
Post on 15-Sep-2018
214 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DE MEDECINE Section Médecine clinique Département de Médecine Interne Division d’Endocrinologie
Thèse préparée sous la direction de la Dresse Ursula Lang P.D.
MODULATION PAR L’OESTRADIOL ET L’ALDOSTERONE DU CONTRÔLE HORMONAL DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS
LES CARDIOMYOCYTES
Thèse Présentée à la Faculté de Médecine
de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur en médecine
par
Romina Claudia CAPOCCIA
de
Neuchâtel
Thèse n° 10294
2002
Remerciements Un grand Merci tout d'abord à la Dresse Ursula Lang, pour m'avoir accueillie dans son équipe, ainsi que pour ses encouragements, sa disponibilité et son enthousiasme. Je remercie également sincèrement Christine Gerber-Wicht ainsi que Manuella Rey pour leur précieuse aide technique, leur soutien et le temps qu'elles m'ont accordé toujours avec le sourire. Je tiens à remercier Le Professeur Jacques Philippe pour m'avoir permis de réaliser ce travail au sein de la Division d'Endocrinologie et de Diabétologie. Enfin, merci à tout le laboratoire pour son accueil et son aide dans ce monde nouveau de recherche fondamentale
RESUME
MODULATION PAR L’OESTRADIOL ET L’ALDOSTERONE DU CONTRÔLE
HORMONAL DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES
CARDIOMYOCYTES
Selon un nombre croissant d’études, la COX-2, isoenzyme inductible, exprimée
de manière transitoire en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines,
ou des promoteurs de tumeurs et prédominant dans des conditions
inflammatoires, aurait un effet protecteur sur les cardiomyocytes.
Plusieurs études rapportent une expression augmentée de COX-2 dans
différents tissus (le muscle lisse, les cellules mésangiales, les cellules
endothéliales), en présence de certaines hormones, tel que l’endothéline-1 et
l’angiotensine II. En revanche, il existe très peu d'informations au niveau du
cœur dans ce domaine.
Les objectifs de travail étaient les suivants:
1) Déterminer la cinétique de l'effet de l'AngII et de l'ET-1 sur
l'expression de la COX-2 au niveau des cardiomyocytes ventriculaires du rat
nouveau-né.
2) Etudier les effets de l'aldostérone et de l'oestradiol sur l'expression
de la COX-2 dans des cardiomyocytes stimulés avec de l'Ang-II et de l'ET-1.
Les résultats obtenus montrent que l'Ang-II et l'ET-1 induisent la COX-2 en
fonction du temps. Ces deux hormones induisent une augmentation rapide de
l'expression de la COX-2 qui atteint des valeurs maximales après 1 h de
stimulation. Quant à l'aldostérone et l'oestradiol, nos observations montrent
que ces deux stéroïdes exercent un effet modulateur négatif sur l'expression
de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires.
MODULATION PAR L’OESTRADIOL ET L’ALDOSTERONE DU CONTRÔLE HORMONAL DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES
CARDIOMYOCYTES TABLE DES MATIERES
I. INTRODUCTION p.1 1) CARDIOMYOCYTES p.1 2) PROSTAGLANDINES p.3
2.1) Sécrétion de PGI2 dans des cultures de cardiomyocytes p.3 2.2) Phospholipase A2 p.3 2.3) Cyclooxygénase p.4
3) ANGIOTENSINE II (AngII) p.9 4) ENDOTHELINE-1 (ET-1) p.11
5) ALDOSTERONE (aldo) p.13
6) OESTRADIOL (E2) p.15
7) Régulation du système cardio-vasculaire par l'AngII p.16bis et l'ET-1 et influence de l'ostradiol et de l'aldostérone
II. MATERIEL ET METHODES p.18 1) COMPOSITION DES MILIEUX ET DES TAMPONS p.18
2) METHODES p.19
2.1) Mise en culture des cardiomyocytes ventriculaires de rats nouveau-nés p.19
2.2) Stimulation des cardiomyocytes ventricualires p.21 2.3) Analyse des protéines par électrophorèse et imunodétection (western blot) p.21
III. RESULTATS p.23
1) EFFETS DE L’ANGIOTENSINE II ET DE L’ENDOTHELINE-1 SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 p.23
2) EFFETS DE L’ALDOSTERONE SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES CARDIOMYOCYTES VENTRICULAIRES p.26
2.1) stimulation avec l’ET-1 p.26 2.2) stimulation avec l’AngII p.28
2.3) stimulation des cellules avec l’AngII et expression de la COX-2 en fonction de la variation de concentration d’aldostérone p.30
3) EFFETS DE L’OESTRADIOL SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES CARDIOMYOCYTES VENTRICULAIRES p.33
3.1) stimulation avec de l’ET-1 p.33 3.2) stimulation avec de l’AngII p.34 3.3) stimulation des cellules avec l’AngII et expression de la COX-2 en fonction de la variation de concentration de p.36 l’oestradiol
IV. DISCUSSION p.38
1) INDUCTION DE LA COX-2 PAR L’ANGIOTENSINE II ET L’ENDOTHELINE-1 p.38
2)MODULATION DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 PAR
DES HORMONES STEROÏDIENNES : ALDOSTERONE ET OESTRADIOL p.39
I. INTRODUCTION
1) CARDIOMYOCYTES
Le muscle cardiaque est constitué de cellules, les cardiomyocytes, liés les uns
aux autres par des disques intercalaires. Les embranchements des
cardiomyocytes forment un réseau complexe tridimentionnel. Tous les
cardiomyocytes sont capables de dépolarisations rythmiques spontanées. Mais,
c’est un groupe de myocytes de l’atrium qui constitue le pacemaker et propage
les stimulations électriques à travers le myocarde par des gap junctions situées
entre les myocytes. C’est pourquoi, malgré le fait qu’il soit constitué par des
cellules séparées, le myocarde se comporte comme un syncytium [1]. Le
cardiomyocyte, en plus de sa fonction contractile propre, possède des propriétés
endocrines en ce sens qu’il est capable de synthétiser et libérer dans son
environnement immédiat et dans la circulation générale des facteurs autacoïdes
tels que certaines prostaglandines, comme la prostaglandine E2 et la
prostacycline, des dérivés de phospholipides membranaires et des hormones
peptidiques, les peptide natriurétique auriculaire ou ANP et le BNP (Brain
natriuretic peptide).
Le cardiomyocyte possède dans sa membrane cellulaire des récepteurs à
plusieures hormones : les catécholamines, l’endothéline, l’angiotensine ll et la
vasopressine, l’aldostérone, des hormones thyroïdiennes, l’insuline entre autres.
L’activation des récepteurs à l’angiotensine ll (Ang II) et à la vasopressine
aboutit à des effets variés, comprenant des effets inotropes et chronotropes,
des effets de croissance par l’intermédiaire de la stimulation d’oncogènes ainsi
qu’à la stimulation de la fonction endocrine des cardiomyocytes. L’angiotensine ll
et l’endothéline-1 peuvent provoquer une réponse hypertrophique chez le rat [2],
1
une réponse qu’on observe également in vivo durant le développement du coeur.
En effet, dans la période post-natale, les cellules musculaires cardiaques perdent
leur capacité à se diviser et dès ce moment, la croissance du coeur se fait par
hypertrophie : phénomène caractérisé par une augmentation de la quantité de
protéine par cellule [3].
2
3
2) PROSTAGLANDINES :
2.1) Sécrétion de prostacyclines dans des cultures de cardiomyocytes
L’augmentation de la sécrétion de prostacycline (PGI2) dans le cœur après des
lésions ischémiques peut résulter de la production de PGI2 par différents types
de cellules, notamment les cellules endothéliales. Des expériences effectuées
dans des cellules soumises d’abord à l’ischémie puis à une réoxygénation ont
montré une libération de prostacycline plus grande lors de la réoxygénation [4],
[5]. Des travaux effectués par notre laboratoire ont montré une augmentation
de la sécrétion de prostacycline par l’Ang ll et la vasopressine (AVP) dans les
cardiomyocytes ventriculaires, par la voie de l’activation de la PKC et la
phospholipase A2 [6, 7]
La synthèse de prostacycline est régulée par deux étapes limitantes : la
libération d’acide arachidonique des phospholipides membranaires par la
phospholipase A2 (PLA2) et la conversion de cet acide arachidonique en
précurseurs de prostanoïdes (PGH2) par la cyclooxygénase.
2.2) Phospholipase A2 :
La phospholipase A2 est impliquée dans différentes réponses cellulaires, dont la
défense de l’hôte, la coagulation, la digestion. De nombreuses études effectuées
dans différents types cellulaires ont montré que la PLA2 joue un rôle clé dans la
régulation des voies de transduction des signaux médié par les lipides.
Il existe trois types de cet enzyme :
4
1. La PLA2 sécrétoire qui demande du Ca++ en concentration millimolaire pour
accomplir sa fonction enzymatique. Elle est elle-même subdivisée en deux
sous-groupes basés sur sa sélectivité tissulaire. On trouve le groupe 1
principalement dans le pancréas. Et le groupe dans les tissus non
pancréatiques [8].
2. La PLA2 cytosolique qui requiert du Ca++ en concentration submicromolaire
pour une activité cytosolique optimale. On la trouve dans le compartiment
cytosolique de la plupart des cellules [9].
3. La PLA2 qui est indépendante du Ca++.
2.3) Cyclooxygénase :
Le Prostaglandine endoperoxyde H synthase ou cyclooxygénase catalyse une
étape de la formation des prostaglandines et du thromboxane. Elle possède deux
fonctions enzymatiques : une fonction dite cyclooxygénase, reponsable de
l’oxydation de l’acide arachidonique en PGG2 suite à l’insertion de deux molécules
d’O2 et une fonction peroxydase qui réduit les PGG2 en PGH2 [10]. Il existe 2
types de PGHS : PGHS-1 et PGHS-2 ou COX-1 et COX-2 qui catalysent toutes les
deux la formation des PGH2 à partir de l’acide arachidonique.
5
PLA2 : phospholipase A2 AA : acide arachidonique
COX : cyclooxygénase PG : prostaglandine
TX : Thromboxane
Schéma de la synthèse d’éicosanoïdes
La PLA2 et la COX transforment les phospholipides membranaires en PGH2, qui est ensuite
converti par des enzymes spécifiques des tissus en prostacycline, prostaglandines et
thromboxane. La PGH2, après avoir été synthétisé par les COX, est transformé par des
synthases différentes en PGD2, PGE2, PGF2a ou Txa2
Les deux isoenzymes de la cyclooxygénase possèdent essentiellement la même
structure primaire avec 60% d’identité ainsi qu’une structure cristallographique
semblable [11, 12] et elles possèdent des propriétés cinétiques très proches. Les
deux sont inhibées par des antiinflammatoires non stéroïdiens (AINS) bien que
des inhibiteurs spécifiques de chacune aient été développés. COX-1 et –2 se
trouvent dans les cellules sous forme d’homodimères attachés par leur domaines
hydrophobes aux membranes du réticulum endoplasmique et du noyau [13, 14].
Phospholipides membranaires
AA
PGG2
PGH2
PGD2 PGE2 PGF2 PG2 TXA2 TXB2
PLA2
COX-1 COX-2
DIFFERENTES SYNTHASES
6
Malgré leurs points communs structuraux et fonctionnels, les deux isoformes
possèdent des fonctions biologiques différentes.
COX-1 et COX-2 sont codées par des gènes distincts [15].
La COX-1 est considérée comme l’enzyme constitutive ; et son expression est
régulée tout au long de son développement ; elle est responsable de la production
physiologique, constitutive de prostaglandines. Une fois que l’enzyme a formé les
prostanoïdes dans le réticulum endoplasmique, ces derniers agissent par des
récepteurs de surface, pour effectuer des tâches d’entretien de l’organisme ;
par exemple, l’équilibre hydrosodé par le rein, ou la protection gastrique contre
l’acidité, ou encore l’hémostase.
La COX-2 au contraire est l’enzyme dite inductible, qui dans des condition
standards est habituellement absente des cellules et qui est exprimée de
manière transitoire en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines (Il-1,
IL-6, PDGF, TNF-α) ou des promoteurs de tumeur ; elle prédomine dans les
conditions inflammatoires. La COX-2 synthétise les prostanoïdes sur l’enveloppe
nucléaire et ces derniers semblent agir au niveau nucléaire durant la réplication
ou la différenciation nucléaire [16].
Les éicosanoïdes ont des effets biologiques variés malgré leur structures
semblables. Ils sont impliqués dans les fonctions respiratoires, puisqu’ils
provoquent une bronchoconstriction. Les PGE2 stimulent la production de mucus
gastrique qui avec les bicarbonates inhibent la rétrodiffusion des H+. En outre ils
tempèrent la sécrétion acide de l’estomac par une action directe sur les cellules
pariétales. Les PGE2 et les PGI2 permettent une vasodilatation rénale. Les PGI2
permettent une relaxation des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC),
mais provoquent une contraction des cellules musculaires lisses du tractus
digestif. Ils sont en outre connus pour leur effet proinflammatoire. On utilise
7
depuis le début du siècle les antiinflammatoires non stéroïdiens, qui inhibent les
deux isoenzymes et empêchent ainsi la production de prostaglandines et de
thromboxanes proinflammatoires [16]. Mais cette supression complète
d’eicosanoïdes est à l’origine de nombreux effets indésirables de ces
médicaments, notamment l’insuffisance rénale et l’ulcère gastrique. C’est
pourquoi on développe de plus en plus des inhibiteurs spécifiques de la COX-2.
Ainsi, l’inflammation est diminuée, mais la production basale d’eicosanoïdes
nécessaire au maintien de l’homéostasie gastrique et rénale est conservée [17,
18].
Les COX ont en outre un intérêt thérapeuthique certain au vu de leur implication
dans les thromboses coronaires , dans l’inflammation, dans le cancer du côlon et
dans la maladie d’Alzheimer [19].
Les premières études considéraient la COX-2 comme délétère tandis
que la COX-1 était vue comme protectrice, mais actuellement, la
distinction n’est plus aussi claire.
Plusieurs études récentes ont montré des effets variés de la COX-2
au niveau du cœur.
Adderley et al. (1999) [20] ont montré que les lésions des
cardiomyocytes dues au H2O2 et à la doxorubicine sont limitées par
la formation de prostacycline, qui reflète l ’ induction de COX-2.
De même, Noreen P. Dowd ont montré que le degré de lésion cardiaque chez un
animal traité avec de la doxorubicine et du SC236 était diminué par
l’administration préalable d’iloprost, un analogue de la PGI2 [21].
Une étude canadienne [22] a démontré l ’ induction de la COX-2, en
association au processus inflammatoire et à la cicatrisation, dans le
myocarde lors de l ’ infarctus du myocarde . En revanche, le rôle
exact de cet enzyme dans cette maladie fatale n’a pas été déterminé
[22].
8
Une étude menée chez le lapin a montré que l ’augmentation de la
COX-2 joue un rôle essentiel dans la protection du coeur lors de la
phase tardive du préconditionnement ischémique (cycle
d’occlusion/reperfusion coronaire de 4 minutes). En effet, dans
cette expérience, le préconditionnement ischémique montre une
augmentation rapide de l ’ARMm de la COX-2, une induction
importante de la COX-2 dans les 24 heures et une augmentation du
contenu cardiaque en prostaglandines, produits enzymatiques de la
COX-2. Dans cette expérience, l ’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de
la COX-2 (NS-398 et celecoxib) bloquent totalement l ’effet
cardioprotecteur, tant pour les lésions ischémiques réversibles
(ischémie), que pour les lésions irréversibles (infarctus) Cette étude
semble donc définir la COX-2 comme un enzyme cardioprotecteur
[23].
Une augmentation de l ’enzyme COX-2 ainsi que de son mRNA a été
démontré lors d’un rejet d’allogreffe cardiaque. Néanmoins,
l ’ inflammation et l ’apoptose des cardiomyocytes n’ont pas été réduits
de manière significative par un traitement d’inhibiteurs de la COX-2
[24].
Une fibrose cardiaque a été rapporté par Wong et al (1988) [25]
chez la souris dont le gène de la COX-2 a été inactivé, suggérant que
la COX-2 aurait des propriétés cardioprotectrices.
3) ANGIOTENSINE II (Ang ll)
L’Ang ll est un octapeptide et le composant actif principal du système rénine-
angiotensine. Ce système est important pour le contrôle de la pression artérielle
et l’équilibre ionique, par l’effet direct de l’Ang ll et par l’intermédiaire de la
sécrétion d’aldostérone. La diminution de la pression artérielle moyenne de même
qu’une augmentation du K+ plasmatique ou une restriction sodée stimule
respectivement les barorécepteurs ou les chémorécepteurs de l’appareil
juxtaglomérulaire du rein, ce qui provoque la sécrétion de la rénine, un enzyme de
la zone de la Macula Densa, qui agit pendant 30 minutes à une heure en
transformant l’angiotensinogène en angiotensine l au niveau du foie. Ensuite,
l’enzyme de conversion de l’angiotensine convertit l’angiotensine l en angiotensine
ll au niveau des poumons ; cet enzyme est détruit en quelques minutes dans le
sang par l’action d’angiotensinogénases. L’Ang ll permet une constriction
artérielle directe, la réabsorption rénale de Na+, une augmentation de la
précharge cardiaque, de l’inotropisme et du chronotropisme ainsi qu’une
stimulation de la soif. L’effet final est une augmentation du volume plasmatique
et de la résistance vasculaire périphérique, donc une augmentation de la pression
artérielle. L’Ang ll permet également une augmentation de la sécrétion
d’aldostérone par la zone glomérulaire du cortex surrénalien. L’aldostérone, un
minéralocorticoïde, qui au niveau rénal augmente la réabsorption du sodium,
entraîne donc une rétention d’eau, mécanisme qui permet également une
augmentation de la pression artérielle par augmentation de la précharge
cardiaque, mais de manière moins importante que l’angiotensine elle-même. En
outre, l’aldostérone provoque une augmentation de l’excrétion du K+. Ensuite, un
rétrocontrôle négatif permet un arrêt de la sécrétion de rénine, ce qui permet
une stabilisation de la pression artérielle et de l’équilibre ionique [26].
9
Le rôle de l’Ang ll a été étudié dans plusieurs pathologies cardiaques en utilisant
des inhibiteurs du système rénine-angiotensine (RA). Dans nombre de ces études
cliniques, l’efficacité des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine
dans l’hypertension artérielle et l’insuffisance cardiaque a été démontrée [27,
28]. Habituellement, ce système rénine-angiotensine est décrit comme un
système général avec une Ang ll distribuée dans tout le corps. Pourtant, il
existerait d’après plusieurs auteurs [29]., des systèmes RA localisés dans des
organes spécifiques comme par exemple le cœur qui fonctionne par voie
autocrine ou paracrine.
L’Ang ll se lie à deux types de récepteurs AT1 et AT2 qui sont exprimés dans de
nombreux tissus dont le cœur [30]. Ces récepteurs appartiennent à une famille
de récepteurs à 7 domaines transmemembranaires et se distinguent les uns des
autres par leur affinité pour les antagonistes non peptidiques [31]. Ces
récepteurs sont augmentés après un infarctus du myocarde [32] et une
hypertrophie [33]. Dans le cœur, ce sont les récepteurs AT1 qui sont
responsables de la plupart des effets physiologiques de l’hormone [34]. D’après
une étude menée aux Pays-bas [35]., il semble que lors d’hypertrophie cardiaque
due à des stress physiques, l’Ang ll, ainsi que l’endothéline-1 et le TGF-β libérés
par les cellules cardiaques et vasculaires participeraient à ce phénomène par une
action autocrine et paracrine.
10
4) ENDOTHELINE-1 (ET-1)
La famille des endothélines comporte trois membres : ET-1, ET-2, ET-3, qui ont
été identifiés par clonage [36]. Une préproendothéline est clivée par des
endopeptidases spécifiques en grande endothéline, puis l’enzyme de conversion
de l’endothéline la convertit en endothéline
L’ET-1 est un grand peptide qui compte 21 acides aminés. La transcription de son
gène peut être régulée dans la cellule endothéliale au niveau de l’ARNm par la
thrombine, l’adrénaline, l’Ang ll, l’ADH, le TGF-β, l’ester de phorbol ; sa libération
peut être inhibée par le NO et l’ANP [37]. On la trouve à la surface des cellules
endothéliales de la plupart des vaisseaux. Le stimulus nécessaire à sa sécrétion
est la lésion de l’endothélium vasculaire. Le rôle physiologique de cette hormone
n’est pas encore élucidé, mais on la trouve augmentée dans certaines pathologies,
comme la toxémie gravidique, l’insuffisance rénale aiguë ou chronique [38].
L’endothéline administrée de manière exogène a montré une augmentation de la
résistance vasculaire périphérique. Mais durant les premières minutes
d’administration intraveineuse, l’endothéline diminue la résistance vasculaire
périphérique ; probablement dû à une libération de composés vasodilatateurs
comme le NO, le PGH2 ou l’ANP [37].
On a découvert que l’ET-1 possédait un rôle de facteur de croissance dans
certaines cellules de mammifères, comme les VSMC et les fibroblastes [39, 40].
En ce qui concerne le cœur, Kojima et al., 1995 [41] ont démontré qu’un
antagoniste non spécifique du récepteur à l’endothéline diminuait la taille de
l’infarctus chez le rat, le lapin, le chien, quand on l’administre avant ou après un
infarctus aigu du myocarde. L’ET-1 a également un effet inotrope positif dans
des cardiomyocytes ventriculaires en culture [41], en outre, l’ET-1 induit une
hypertrophie des cardiomyocytes [42, 43, 44]. L’ET-1 est également produite par
11
des cellules non endothéliales comme les VSMC, les cellules épithéliales rénales,
les cellules mésangiales glomérulaires et certaines lignées de cellules
cancéreuses [45, 46, 47, 48]. Ces observations ont mené à l’hypothèse que
l’endothéline endogène produite par les cardiomyocytes pourrait être impliquée
dans la pathogenèse de l’hypertrophie cardiaque par un mécanisme autocrine et
paracrine. Dans ce contexte, Ito et al. (1996) [49] ont rapporté une
augmentation de l’ARNm de la préproendothéline-1 et de la libération de l’ET-1
et ils ont suggéré que cette activation endogène peut, au moins en partie, médier
la réponse hypertrophique induite par l’hypoxie. La synthèse myocardique
accélérée d’ET-1 contribue également à la dysfonction du ventricule gauche
durant la transition de la phase d’hypertrophie du ventricule gauche à celle
d’insuffisance cardiaque congestive chez le rat hypertendu [50]. En outre,
Kobayashi et al., (1999) [51] ont rapporté que le niveau de l’ARNm de la
préproendothéline, celui de l’ET-1 ainsi que celui du récepteur étaient
significativement plus hauts chez les rats en insuffisance cardiaque chronique
que chez les rats contrôles.
12
5) ALDOSTERONE :
L’aldostérone est un minéralocorticoïde très puissant qui est responsable du le
90% de l’activité de tous les minéralocorticoïdes. L’absence de sa sécrétion par
le cortex surrénalien entraînerait la mort en jours à deux semaines. Sans
minéralocorticoïdes, la concentration plasmatique de K+ augmenterait à l’inverse
du Na+ et du volume liquidien extracellulaire. En effet, l’aldostérone agit sur
l’échangeur Na+/K+ des cellules épithéliales tubulaires rénales.
La sécrétion d’aldostérone est stimulée par : 1) L’augmentation du K+
extracellulaire ; 2) L’activation du système RA ; 3) la sécrétion basale d’ACTH,
indispensable, mais qui ne provoque que peu de variation dans le taux sécrété
d’aldostérone. La sécrétion d’aldostérone est diminuée en présence d’une
hypernatrémie.
L’aldostérone permet par son action d’augmenter la tension artérielle et de
diminuer le K+, d’effectuer un rétrocontrôle négatif pour atteindre un équilibre
tensionnel et ionique [52].
Comme d’autres hormones stéroïdes, l’aldostérone commence son action en se
liant à ses récepteurs intracellulaires qui ensuite sont capables de contrôler la
transcription de plusieurs gènes. Dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés et
adultes, des concentrations physiologiques d’aldostérone ont montré une
augmentation de trois fois des isoformes principales des pompes Na+/K+- ATPase
[52b]. En outre, dans les cellules cardiaques de rats nouveau-nés, un traitement
de 24 heures d’aldostérone stimule l’activité de l’antiport Na+/H+ et de
l’échangeur Cl-/HCO3- [53]. Récemment, il a été rapporté dans les
cardiomyocytes de rats adultes, que l’aldostérone induisait une expression
augmentée du courant de Ca2+ [54]. L’événement initial de l’action de
l’aldostérone est sa liaison à son récepteur. Ce récepteur a la même affinité pour
l’aldostérone et pour les glucocorticoïdes. C’est pourquoi la sélectivité in vivo de
13
ce récepteur requiert la présence d’un enzyme, le 11β-hydrostéroïde
déshydrogénase, qui métabolise les glucocorticoïdes en dérivés inactifs. Lombès
et al (1995) [55] ont montré une coexpression de cet enzyme et du récepteur à
l’aldostérone dans le cœur, qui contient donc les outils cellulaires nécessaires à
l’action de l’aldostérone.
Un excès chronique d’aldostérone est associé à un dépôt de collagène interstitiel
cardiaque et périvasculaire marqués [56, 57, 58]. La spironolactone, antagoniste
de l’aldostérone, prévient cette fibrose cardiaque, ce qui indique qu’un récepteur
aux minéralocorticoïdes est impliqué dans cette réponse [56]. Une étude récente
nous montre l’implication de l’angiotensine-2 et de son récepteur dans le
mécanisme de la fibrose cardiaque, suggérant que le récepteur cardiaque AT1
serait une cible pour l’aldostérone [59].
14
6) OESTRADIOL :
Le 17β-oestradiol est le plus puissant et le plus important des oestrogènes. Sa
source principale est la conversion extraglandulaire de l’androstènedione, au
niveau des tissus périphériques.
Les oestrogènes permettent le développement des caractères sexuels
secondaires chez la femme, la croissance utérine, l’épaississement de la
muqueuse vaginale, la fluidification du mucus cervical et le développement du
système canalaire des seins.
Toutes les hormones stéroïdiennes sont dérivées du cholestérol provenant de
trois sources : les lipoprotéines circulantes (surtout les LDL), le cholestérol
synthétisé de novo dans l’ovaire et le cholestérol libéré des esters stockés dans
les gouttelettes lipidiques.
La conversion du cholestérol en prégnénolone est l’étape limitante de la
stéroïdogenèse ovarienne, qui à lieu au niveau des cellules de la granulosa, des
cellules thécales et surtout au niveau du corps jaune.
Pour être transporté dans le sang, l’oestradiol est lié à l’albumine à 60%, à la
globuline liant la testostérone à 38% et 2-3% est libre.
Les hormones stéroïdiennes ont un faible poids moléculaire et pénètrent
facilement dans la cellule en diffusant à travers la membrane, bien qu’il puisse y
avoir un transporteur qui participe à ce transport ; elles entrent dans le noyau et
se lient à un récepteur nucléaire. L’affinité, la spécificité et la grande
concentration des récepteurs aux stéroïdes permettent à une petite quantité
d’hormone de produire un effet biologique. La spécificité des récepteurs aux
oestrogènes est partiellement déterminée par le nombre de récepteurs dans la
cellule. Par exemple, dans l’utérus, l’action biologique des oestrogènes est grande
grâce à la concentration élevée des récepteurs dans une cellule. Il se produit une
transformation active du complexe de l’hormone-récepteur après la liaison de
15
l’hormone au noyau. Cette liaison implique un changement de la conformation qui,
soit rend accessible des sites DNA, qu’on appelle steroid response elements
(SREs), soit altère des complexes de la régulation de la transcription, pour leur
permettre d’interagir avec des SREs pour activer ou réprimer des gènes [60].
Aucune étude n’a été publiée sur l’effet de l’oestradiol sur l’expression de la
COX-2 dans les cardiomyocytes. Mais nous savons qu’il existe sur les
cardiomyocytes des récepteurs aux oestrogènes.
En effet, la différence qu’il existe dans les maladies cardiovasculaires entre les
deux sexes a suggéré que les oestrogènes agissaient directement sur le tissu
cardiaque. C’est pourquoi Grohe et al. (1997) [61] ont cherché à savoir si les
cardiomyocytes et les fibroblastes possédaient des récepteurs aux oestrogènes.
Ils ont découvert par une méthodes d’immunofluorescence que le récepteur
protéique aux oestrogènes était exprimé dans les cardiomyocytes et les
fibroblastes cardiaques. La translocation nucléaire du récepteur protéique aux
oestrogènes a été démontrée après stimulation des cardiomyocytes avec du 17-
β-oestradiol (E2) [61].
Dans d’autres cellules que les cellules cardiaques, par exemple, les cellules
musculaires lisses vasculaires, l’E2 stimule l’activité de la COX-2 et de la PGI2
synthase [62].
Ghanam K. et al. (2000) [63] ont vu avec l’aorte du lapin hypercholestérolémique
que l’E2 restore l’effet relaxant de l’Acétylcholine (Ach) qui était inhibé par
l’hypercholestérolémie.
Dans l’endomètre également, on a constaté que le pic de l’expression de la COX-
2, exprimé durant les trois phases du cycle menstruel, correspond à la phase
diestrus, qui correspond au niveau maximal d’E2, ce qui suggère une induction de
la COX-2 dépendant de l’E2 [64].
16
7) REGULATION DU SYSTEME CARDIO-VASCULAIRE PAR L’ANGIOTENSINE-II ET L’ENDOTHELINE-I ET INFLUENCE DE L’OESTRADIOL ET DE L’ALDOSTERONE
-Infarctus-hypertrophie ALDOALDO Augmentation:
Stress oxydatif:-Doxorubicine -H2O2
lésions
-Infarctus-inflammation -lésions ischémniques-AngII-Et-1
Augmentation:-COX-2-PGI2 (réduit également les extrasystoles ventriculaires lors d’une ischémie)
ETET--11-Inotrope positif-Hypertrophie >> insuffisance cardiaque-augmentation taille infarctusCroissance des
cellules musculaires lisses vasculaires et des fibroblastes
VAISSEAUXVAISSEAUXBaisse de la résistance vasculaire dans les premières minutes
ANGIIANGII
-réabsorption Na+
-excrétion K+
Augmentation :-Fluide extracellulaire-Volume sanguin-Précharge cardiaque-Baisse Pression
Artérielle-Restriction Na+
RAA
RAA
vasoconstriction
Lésion vasculaire
E2E2
COX-2 / PGE2,PGI2
COEURCOEUR
Inotrope +
Augmentation:
Augmentationdu débit
-Résistance vasculaire périphérique
-Pression artérielle
16bis
II) MATERIEL ET METHODES:
1) COMPOSITION DES MILIEUX ET DES TAMPONS :
ENZYMES:
Dnase Type IV ou I: pointe de spatule (Sigma D 4138) (dessicateur -20°C)
Trypsine 1:250: 125mg/50ml (invitrogen 27250-042)
filtration de la solution avec filtre type milipore 0.22 µ
ANTICORPS : COX-2 murine Polyclonal Antiserum, Cayman
Anticorps anti-rabbit , Covalab
MILIEU DE CULTURE:
FCS: Fœtal calf serum (seromed N°SO115, chez Fakola)
Hanks, sans Mg++, sans Ca++:( invitrogen 14175-073)
Antibiotiques: Pénicilline/streptomycine (invitrogen 15140-122)
Antimycotique: Fungizone conc. finale 250µg/500 ml(Pharmacie HCUG)
Facteur de croissance ITS (Insulin-Transferin-Sodium Selenite) Sigma I 1884,
conc. finale: 1%
Milieu de culture: Milieu Mc Coys 5A (modifié) (Gibco 21500-046= poudre
pour 5l de milieu)
Mc Coys complet= 500 ml de milieu + 1ml de solution de Fungizone + 5ml de
Pénicilline/Streptomycine + 5 mlITS + 50 ml de FCS
Mc Coy’s sans rouge de phénol : Cell culture technologies GmbH
TAMPON DE PHOSPHATE (PBS) :
NaCl 137mM, KH2PO4 1,47mM, Na2HPO4.2H2O; pH: 7,4
17
TAMPON DE LYSE:
50 mM de Tris-base, 150mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de Triton X-100, 2
mM d'EDTA Triple, 2 mM d'EGTA, 40 mM de β-glycérophosphate, 50 mM de
fluorure de sodium, 10 mM de pyrophosphate de sodium, 200 µM
d'orthovanadate de sodium (ajouté au dernier moment), 10µg/ml de leupeptine,
0,3 TIU/ml de trasylol, 1µM de pepstatine A, 1mM de PMSF (ajouté au dernier
moment), 100 nM de calyculine.
TAMPON DE TRANSFERT:
25 mM de Tris-base, 190 mM de glycine, méthanol 20%
TAMPON DE LAVAGE:
50 mM detris-base, 200 mM de NaCl, Tween 20 (0,2%), ajuster à pH 7.5
TAMPON DE BLOCAGE:
Tampon de lavage et lait maigre en poudre 5%
TAMPON D'INCUBATION:
Tampon de lavage et lait maigre en poudre 1%
2) METHODES :
2.1.) Mise en culture des cardiomyocytes ventriculaires:
18
Chez des rats Winstar de 24-48h, prélévement du ventricule in situ, placé dans
du tampon Hanks, sans Mg++ et sans Ca++, à température ambiante. Contrôle sous
binoculaire du prélévement des ventricules pour déceler la présence
d'oreillettes. Le prélévement est réalisé rapidement et la dispersion
enzymatique est réalisée le plus précocément possible. Les ventricules sont
rincés pour éliminer les globules rouges dans du Hanks sans Mg++ et sans Ca++.
Aspiration de la solution saline. Emincer aux ciseaux les ventricules de la manière
la plus fine, pendant environ 5 minutes et commencer la dispersion enzymatique.
1ère dispersion: mettre les morceaux de tissu dans 10 ml de solution d'enzymes,
dans un tube conique, dans le bain-marie, sur l'agitateur. Le barreau doit tourner
réguliérement, pour éviter d'abîmer les cellules. Durée: 8 minutes
Retirer du bain-marie, laisser décanter quelques secondes, prélever le
surnageant avec une pipette en veillant à ne pas aspirer de gros morceaux et
jeter cette première dispersion (globules rouges, déchets cellulaires).
Ajouter 8 à 13 ml de solution d'enzyme dans le tube contenant les ventricules et
remettre dans le bain-marie sur l'agitateur. A la fin des 8 minutes, laisser
décanter quelques secondes, aspirer le surnageant au moyen d'une pipette,
mettre dans un tube conique de 15 ml avant de centrifuger 4 minutes à 1200 rpm
(la dispersion se répète 10 à 12 fois jusqu'à ce que tous les morceaux de tissus
soient dispersés.)
Pendant ce temps, préparer un tube de 50 ml avec environ 20 ml de Mc Coy's
complet dans lequel on gardera les cellules centrifugées après chaque étape de la
dispersion.
Lorsque la centrifugation est terminée, aspirer le surnageant, récolter le pellet
dans le milieu Mc Coy's complet du tube préparé à cet effet et garder au bain
marie à 37°C.
Lorsque la totalité des cellules a été récoltée, on centrifuge le tout 5 minutes à
1200 rpm. On aspire le surnageant et on resuspend le pellet dans le milieu de
19
culture Mc Coy's complet + FCS 10%, puis on répartit les cellules dans les pétris.
Les cardiomyocytes commencent à se contracter spontanément 24 à 48h après
la mise en culture. Pour effectuer nos expériences, nous avons utilisé les cellules
3 jours après la mise en culture.
2.2.) Stimulation des cardiomyocytes ventriculaires:
24 heures avant la stimulation par des hormones, les cardiomyocytes sont
déprivés en étant mis dans du milieu Mc Coy's dépourvu de FCS. Dans le même
temps, les stéroïdes sont ajoutés dans les pétris déstinés aux longues
incubations, c'est-à-dire 20-24 heures. 20 heures après, le milieu est changé et
les hormones sont ajoutées pour une durée de trois heures.
2.3.) Analyse des protéines par électrophorèse et immunodétection (Western
blot) :
Les cardiomyocytes, cultivés dans des boîtes de Pétris de 6 cm de diamètre
contenant 2,5 ml de Mc Coy's sans FCS, sont lavées avec 5 ml de tampon
phosphate froid (PBS) et lysées avec 100µl de tampon de lyse conservé à 4°C.
Après avoir gratté les boîtes de Pétris, le lysat est récolté dans des tubes
Eppendorfs, vortexé et déposé 10 minutes sur le la glace (4°C). Ces deux
dernières étapes sont répétées une seconde fois. Les tubes sont ensuite
centrifugés 10 minutes à 4°C à 10'000 rpm et le surnageant, contenant le lysat
total, est récupéré. La quantité de protéines présente dans chaque tube est
déterminée par spectrophotométrie à 595 nm grâce à la méthode de Bradford
(Kit BIORAD Protein Assay). Après avoir ajouté la solution stop dénaturante de
20
Laemmli (Tris 60mM pH 6.8; SDS 2% ; β-mercapto 5% ; glycérol 10% ;
bromophénol blue 0.01%) et après avoir porté les échantillons 5 minutes à
ébulition, les protéines, chargées à quantité égale (25µg/puit), sont séparées
selon leur poids moléculaire par électrophorèse sur un gel de sodium de
dodecylsulfate polyacrylamide de 8%. Après une heure de migration à 150 mV les
protéines du gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose pendant 2
heures à 100 mV, à 4°C. Pour éviter des liaisons non spécifiques, ces membranes
sont incubées 1 heure à température ambiante dans du tampon de blocage. Elles
sont ensuite lavées 3x10 minutes dans du tampon de lavage, puis incubées avec un
anticorps polyclonal anti-COX-2 spécifique (stock:0.5 mg/ml) dilué (1:1000) dans
du tampon d'incubation pendant 2 heures. Les membranes sont à nouveau lavées
et incubées 1 heure avec un anticorps secondaire anti-lapin couplé à une
perroxydase (HRPeroxydase) et dilué (1:2000). Avant de révéler les bandes
immunoréactives par chemioluminescence (ECL), une étape de 6 fois 10 minutes
de lavages est nécessaire.
2.4.) Statistiques :
Les tests statistiques suivants ont été utilisés : test de T de Student-Fisher,
pour paires non-appariées, le “one-way analysis of variance” (ANOVA). Une
probabilité p<0.05 est acceptée comme statistiquement significative.
21
III. RESULTATS
1) EFFET DE L’ANGIOTENSINE II ET DE L’ENDOTHELINE SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2
L’angiotensine et l’endothéline sont deux hormones qui stimulent la production de
prostacyclines dans les cardiomyocytes ventriculaires [65, 66]. Les analyses de
notre laboratoire par électrophorèse et immunodétection (Western blot) de
l’expression de la COX-2 montrent que ces deux hormones augmentent
l’expression de la COX-2 dans ces cellules cardiaques. Ces résultats sont
illustrés dans les figures 1a et 1b qui présentent la cinétique de l’induction de la
COX-2 par l’AngII (2x10-7 M) et par l’ET-1 (10-7 M).
Cette induction est dépendante du temps. Après une heure d’incubation avec
l’ET-1 et l’AngII, on observe une augmentation de l’expression de la COX-2 de
208 ± 21% du contrôle et de 171 ± 12% du contrôle respectivement, par rapport
aux cellules non stimulées. Dans le cas de la stimulation par l’ET-1, la stimulation
descend légérement dès deux heures. En ce qui concerne l’AngII, l’effet
stimulant qu’elle exerce sur l’expression de la COX-2 atteint un plateau dès une
heure de stimulation.
22
100
150
200
CO
X-2
(% d
u co
ntrô
le)
temps (h)
*
*
*
*
***
0 4321
AngII
Et-1
Contrôle
Fig. 1a et 1b : Cinétiques de l’expression de la COX-2 induite par l’AngII et l’ET-1 dans les
cardiomyocytes ventriculaires. Analyse des Western blots par densitométrie
Les cellules cardiaques ont été incubées pendant 30 min, 1h, 2h et 4h avec de l’AngII (2x10-7M)
ou avec de l’ET-1 (10-7M). La quantité de COX-2 présente dans les cellules a été déterminée par
l’analyse densitométrique du western blot. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et
représentent les moyennes + sem de 4 expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport au
contrôle.
23
COX-2 ET-1
COX-2 AngII
0 1 2 4 0.5
Fig. 1c : Western blot illustrant la cinéti
(2x10-7 M) et l’ET-1 (10-7 M) dans les
représentative de 3 expériences indépendan
temps
que de l’expression de la COX-2 induite par l’AngII
cardiomyocytes ventriculaires. Cette figure est
tes.
24
2) EFFETS DE L’ALDOSTERONE SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2:
2.1) Stimulation des cellules avec de l’ET-1 (Fig.2)
Dans les cardiomyocytes ventriculaires, nous avons observé une expression
basale de la COX-2 (Fig 1b et 2b). L’analyse densitométrique des western blots
démontre que cette expression est légèrement, mais pas significativement
réduite après 3h d’incubation avec de l’aldostérone (10-6M). En revanche, après
20h d’exposition à l’aldostérone, l’expression de la COX-2 est réduite à 35 ± 5%
des valeurs contrôles. Lorsque les cellules sont stimulées avec de l’ET-1, la
préincubation avec de l’aldostérone pendant 3h abolit l’expression de la COX-2
induite par l’ET-1. Un prétraitement de 20h avec l’aldostérone n’abolit pas
seulement l’effet de l’ET-1, mais réduit l’expression de la COX-2 à 36 ± 13% des
valeurs contrôles, un résultat très semblable à celui obtenu avec des cellules non
stimulées.
25
ctrl Et-10
100
200basalaldo 3haldo 20h
CO
X-2
(% d
u co
ntrô
le)
*
*
+
*+
Fig.2a : Effet de l’aldostérone sur l’expression de la COX-2 dans des cardiomyocytes
ventriculaires stimulées avec de l’ET- (101 t-7 M). Analyse des Western blot par densitomé rie
Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans ET-1 (10-7M) pour une durée de 3h, en présence
ou en absence d’aldostérone (10-6 M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h ou 20-24h
avec de l’aldostérone (10-6 M). Les colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM de 4-5
expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport aux valeurs basales, dans des cellules non
stimulées. t=p<0.05 par rapport à la COX-2, dans des cellules stimulées par l’ET-1
26
COX-2
Ctrl ET-1 aldo 3h aldo 20h aldo 3h aldo 20h + ET-1 + ET-1
Fig 2b : Western blot représentant l’effet de l’aldostérone sur l’expression de COX-2 dans les
cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’ET-1 10-7 M
2.2) Stimulation des cellules avec de l’angiotensine II (Fig.3)
L’analyse densitométrique des Western blots démontre que l’expression de la
COX-2 est légèrement, mais pas significativement réduite après 3h d’incubation
avec l’aldostérone (10-6M). Par contre, après 20h d’exposition à l’aldostérone,
l’expression de la COX-2 est réduite à 35 ± 5 % des valeurs contrôles. Lorsque
les cellules sont stimulées avec de l’AngII, la préincubation avec l’aldostérone
pendant 3h abolit l’expression de la COX-2 induite par l’AngII. Un prétraitement
de 20h avec l’aldostérone n’abolit pas seulement l’effet de l’AngII, mais réduit
l’expression de la COX-2 à 38 ± 8% des valeurs contrôles, un résultat très
semblable à celui obtenu avec des cellules non stimulées.
27
ctrl Ang II0
100
200
basalaldo 3haldo 20h
CO
X-2
(% d
u co
ntrô
le)
+
+
*
* *
Fig.3a : Effet de l’aldostérone sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes
ventriculaires stimulés avec de l’AngII (2x10-7 M).
Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans AngII (2x10-7M) pour une durée de 3h, en
présence ou en absence d’aldostérone (10-6 M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h
ou 20-24h avec de l’aldostérone (10-6 M). Les colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM
de 4-5 expériences indépendantes. Analyse des Western blots par densitométrie. *=p<0.05 par
rapport aux valeurs basales dans des cellules non stimulées. +=p<0.05 par rapport à la COX-2 dans
des cellules stimulées par l‘AngII.
28
ctrl AngII aldo 3h aldo 20 aldo 3h aldo 20h +AngII +AngII
COX-2
Fig 3b: Western blot représentant l’effet de l’aldostérone (10-6 M sur l’expression de la COX
2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’Angiotensine II (2x10
) --7 M).
2.3) Stimulation des cellules avec de l’angiotensine II et expression de la
COX-2 en fonction de la variation de la concentration d’aldostérone (Fig.4)
Les résultats exprimés dans la Fig. 4 montrent que l’expression de la COX-2 sous
l’effet de l’aldostérone dépend de la concentration d’aldostérone utilisée. L’effet
inhibiteur que l’aldostérone exerce sur l’expression de cet enzyme induit par
l’AngII augmente de manière linéaire entre des concentration qui passent de 1 à
100 nM. L’aldostérone inhibe également l’expression de la COX-2 basale, mais de
manière non linéaire.
29
0 1 10 1000
100
200
aldoaldo + Ang II
aldostérone (nM)
CO
X-2
(% d
u co
ntrô
le)
Fig.4a : Variation de la concentration d’aldostérone et son effet sur l’expression de la COX-2
dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’AngII (2x10-7 M). Les cellules ont été
incubées soit avec, soit sans AngII (2x10-7 M) pour une durée de 3h, en présence ou en absence
de différentes concentrations d’aldostérone. Les cardiomyocytes ont été incubés pour une durée
de 20-24h avec l’aldostérone, à des concentrations variant de 1 à 100 nM. La COX-2 a été
révélée par électrophorèse et immunodétection (western blot).
30
COX-2
ctrl AngII aldo aldo aldo aldo aldo aldo 10-7 10-7 10-8 10-8 10-9 10-9
+AngII +AngII +AngII
Fig. 4b : Western blot représentant l’effet de l’aldostérone sur l’expression de la COX-2 en
fonction de la variation de concentration d’aldostérone.
31
3) EFFETS DE L’OESTRADIOL SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES
CARDIOMYOCYTES VENTRICULAIRES:
3.1)Stimulation des cellules avec de l'ET-1 (Fig.5)
Contrairement à l'aldostérone, l'oestradiol (E2) ne produit aucun effet sur l'expression basale de la COX-2. Toutefois, l’induction de la COX-2 par l’ET-1 est légèrement, mais pas significativement inhibée par l’oestradiol. Cet effet inhibiteur est le même pour 20h et 3h de traitement à l’oestradiol.
Fig. 5a : Effets de l'oestradiol sur l'expression de la COX-2 dans des cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l'ET-1 (10-7 M).
33
Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans ET-1 (10-7M) pour une durée de 3h en présence ou en absence d’oestradiol (10-6M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h ou 20-24h avec l’oestradiol (10-6M). Ces colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM de 5 expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport aux valeurs basales dans des cellules non stimulées.
Fig 5b : Western blot représentant l’effet de l’oestradiol sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’ET-1.
3.2) Stimulation des cellules avec de l'Angiotensine II (Fig.6) Les résultats illustrés dans cette figure sont très semblables à ceux illustrés dans la figure 5: en absence de stimulation avec l'hormone, une incubation de 3h ou de 20h avec de l’E2 10-6M ne provoque pas de changement statistiquement significatif dans l'expression de la COX-2. En revanche, dans des cellules stimulées avec de l'AngII (2x10-7M), un prétraitement de 3h ou de 20h avec de l’E2 (10-6M) abolit l’expression de la COX-2 induite par l’AngII.
34
Fig.6a : Effets de l'oestradiol sur l'expression de la COX-2 dans des cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l'AngII (2x10-7 M). Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans AngII (2x10-7M) pour une durée de 3h en présence ou en absence d’oestradiol (10-6M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h ou 20-24h avec l’oestradiol (10-6M). Les colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM de 6 expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport aux valeurs basales dans des cellules non stimulées. +=p<0.05 par rapport à la COX-2 dans des cellules stimulées avec de l’AngII.
Fig 6b : Western blot représentant l’effet de l’oestradiol sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’Ang II.
35
3.3) Stimulation des cellules avec de l'AngII et expression de la COX-2 en fonction de la variation de la concentration de l'oestradiol Une expérience dans laquelle nous avons utilisé des concentrations de 1 à 1000nM indique que des concentrations de 10 à 100nM ont des effets similaires à la concentration utilisée dans les expériences décrites dans ce travail (10-6 M); cette concentration n'est donc pas toxique pour les cellules musculaires cardiaques ventriculaires. En revanche, une concentration de 1 nM ne semble provoquer aucun effet; elle est donc insuffisante.
Fig.7 : Variation de la concentration d’oestradiol et son effet sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’AngII (2x10-7M). Les cellules ont été incubées soit avec, soit sans AngII (2x10-7M) pour une durée de 3h, en présence ou en absence de différentes concentrations d’oestradiol (1-1000 nM). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 20-24h avec les différentes concentrations d’oestradiol.
36
IV. DISCUSSION :
1) INDUCTION DE LA COX-2 PAR L’ANGIOTENSINE ET L’ENDOTHELINE
Pour la première fois, nous avons démontré dans les cardiomyocytes
ventriculaires que l’AngII et l’ET-1 induisaient la COX-2 de manière dépendante
du temps. Les premières expériences concernant l’induction de la COX-2 étaient
réalisées avant tout avec des cytokines. Récemment, il a été découvert que des
hormones telles que l’AngII et l’ET-1 pouvaient induire l’expression de la COX-2
dans certaines cellules. En effet, il a été démontré dans le muscle lisse
vasculaire que l’AngII induisait la COX-2 [67].
Young et al (2000) ont montré dans ces mêmes cellules une cinétique de
l’induction de la COX-2 semblable à celle vue dans des cellules stimulées avec une
cytokine, comme le TNF-α, ou avec de l’AngII. [68].
L’AngII était déjà connue pour augmenter la production de PG dans les cellules
mésangiales et les cellules endothéliales [69, 70].
Il a été démontré récemment par une équipe allemande qu’après un infarctus du
myocarde, une activation des fibroblastes cardiaques par l’AngII entraînait une
forte expression de la protéine COX-2, dépendante du temps [71].
En revanche, chez le rat, Cheng et al (1999) [72] ont observé qu’au niveau des
cellules de la macula densa du rein, l’AngII inhibe l’expression de la COX-2
stimulée par l’ester de phorbol ; le mécanisme d’action n’a pas encore été élucidé
En ce qui concerne l’ET-1, plusieurs groupes ont étudié l’effet de l’ET-1 sur
l’expression de la COX-2 dans les cellules mésangiales [73, 74, 75]. Hughes et al
(1995) [73] ont notamment démontré par une étude récente que l’ET-1 induisait
de manière prolongée la production de PGE2 dans les cellules mésangiales et
augmentait l’action de la COX-2 avec un net effet à une heure et un plateau d’une
37
durée d’environ 6 heures. Une étude japonaise [76] rapporte que l'endothéline
active l'expression de la COX-2 dans les astrocytes en culture, ce qui suggère
que l'ET est impliquée dans la régulation des fonctions des astrocytes.
2) LA MODULATION DE L'’EXPRESSION DE LA COX-2 PAR DES
HORMONES STEROÏDIENNES : ALDOSTERONE ET OESTRADIOL :
Notre étude montre que dans les cardiomyocytes, la COX-2 n’est pas seulement
induite, mais est également exprimée à l’état basal, dans des cellules qui durant
24 heures ont été déprivées de sérum. Cette observation est en accord avec
deux autres études. Sorli et al (1998) [77] ont démontré que dans les îlots
pancréatiques, la COX-2 est exprimée à l’état basal et après stimulation avec
l’interleukine-1. De même, Cheng et al (1999) [72] ont observé que dans les
cellules cTALH dans la région de la macula densa, la COX-2 est exprimée à l’état
basal en absence de stimuli externes.
Dans cette étude, nous avons également démontré que des hormones
stéroïdiennes telles que l’aldostérone et l’oestradiol entraînaient une modulation
de l’expression de la COX-2.
Nous avons constaté que l’aldostérone exerçait un effet négatif sur l’expression
de la COX-2 dans des cardiomyocytes ventriculaires. Un traitement de 3h avec
de l’aldostérone n’a pas d’effet sur la COX-2 basale, tandis qu’il abolit la COX-2
induite par l’ET-1 et l’AngII. Des incubations à long terme (20-24h) avec de
l’aldostérone réduisent à 35% l’expression de la COX-2 dans des cellules
contrôles et stimulées.
38
A notre connaissance, aucune étude n’a été publiée sur l’effet de l’aldostérone
sur la COX-2 dans le cœur, ni dans d’autres cellules.
Dans ce travail, nous avons également constaté que l’effet inhibiteur de
l’aldostérone dépendait le la concentration de l’hormone. Une concentration de
10-8 M provoque un effet inhibiteur significatif, ce qui indique que cet effet est
spécifique du récepteur aux minéralocorticoïdes. En effet, l’aldostérone active le
récepteur aux glucocorticoïdes uniquement à des concentrations > 10-7 M [78].
Néanmoins, d’autres expériences utilisant des inhibiteurs spécifiques aux
récepteurs corticoïdes seront nécessaires pour confirmer cette voie de
signalisation.
Quant à l’oestradiol, il abolit uniquement la COX-2 induite par l’AngII, mais n’a
pas d’effet significatif sur la COX-2 induite par l’ET-1. De même, l’oestradiol n’a
pas d’effet sur l’expression basale de la COX-2.
L’effet de l’oestradiol sur l’expression de la COX-2 a déjà été étudié dans
différents types cellulaires. Engstrom et al (2001) [79] ont démontré dans le
myomètre du rat non gravide une augmentation de la production d’ARNm de la
COX-2 sous l’influence de l’oestradiol. Par contre, dans l’utérus gravide de lapin,
l’oestradiol semble inhiber la production de prostaglandines E2 après suppression
de l’expression de la COX-2 stimulée par l’IL-1, ce phénomène permettrait donc
d’inhiber le déclenchement du travail, par inhibition de la production de PGE2
[80]. L’effet de l’oestradiol semble donc être dépendant des conditions
physiologiques d’un tissu spécifique.
Des études plus approfondies sont nécessaires pour déterminer à quel niveau
l’aldostérone et l’oestradiol interviennent. Il s’agirait de voir si elles inhibent
l’activité du promoteur de la COX-2 et/ou si elles accélèrent la dégradation de
l’ARNm de la COX-2.
39
En conclusion, notre étude montre que dans le cardiomyocyte ventriculaire, la
COX-2 est exprimée à l’état basal. L’AngII et l’ET-1 augmentent cette
expression de manière dépendante du temps. Quant à l’aldostérone et à
l’oestradiol, ils ont un effet modulateur négatif sur l’expression de la COX-2.
40
REFERENCES 1) Bloom and Fawcett: a textbook of histology. 12ème édition, (1994); chap 10, p 294-308 2) Thorburn J., McMahon M., Thorburn A. (1994) Raf-1 kinase activity is necessary and sufficient for gene expression changes but not sufficient for cellular morphology changes associated with cardiac myocytes hypertrophy. J. Biol. Chem., 269, 30580-30586. 3) Chien K.R., Knowlton K.U., Zhu H., Chien S. (1991) Regulation of cardiac gene expression during myocardial growth and hypertrophy: molecular studies of an adaptative physiologic response. The FASEB Journal, 5, 3037-3046. 4) Pinson A., Tirosh R., Tremblover V., and Shoshami E., (1996) Oxygen deprivation and reoxygenation augment prostacyclin synthesis in cultured ventricular myocytes. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 54: 211-215. 5) Oudot F., Grynberg A., and Sergiel J.P. (1995) Eicosanoid synthesis in cardiomyocytes: influence of hypoxia, reoxygenation. And polyunsaturated fatty acids. Am J. Physiol 268: H308-315 6) Church D.J., Braconi S., Van der Bent V., Vallotton M. B., and U. Lang. (1994) Protein kinase C-dependent prostaglandin production mediates angiotensin II-induced atrial-natriuretic peptide release. Biochem. J. 298: 451-456 7) Van der Bent V., Church D.J., Vallotton M.B., Meda P., Kem D.C., Capponi A.M., and U. Lang (1994) [Ca++]I and protein kinas C in vasopressin-induced prostacyclin and ANP release in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. 266: H57-H605 8) Dennis E.a. (1994) Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A2. J. Biol. Chem. 269: 13057-13060. 9) Kramer R.M. and Sharp J.D. (1997) Structure, function and regulation ok Ca++
-sensitive cytosolic phosphlipase A2 (cPLA2 ). FEBS Lett. 410: 49-53. 10) Smith W.L. (1991) The aspirin and heme binding sites of PGG/H synthase. Adv. Prostaglandin. Thromboxane. Leukot. Res. 21A: 77-80
11) Picot D. (1994) Prostaglandin h synthase: implications for membrane structure: FEBS Lett., 346: 21-25 12) Luong C. (1996) Flexibility of the NSAID binding site in the structure of human cyclooxygenase-2: Nat. Struct. Biol., 3: 927-933 13) Morita I. (1995) Different and intracellular locations for prostaglandinsendoperoxyde H synthase-1 and –2. J. Biol. Chem. 270: 10902-10908 14) Spencer A.G. (1998) Subcellular localisation of prostaglandin endoperoxyde H synthase-1 and –2 by immunoelectron microscopy: J. Biol. Chem 273: 9886-9893 15) Hia T., (1992), Human cyclooxygenase-2 cDNA: Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 89: 7384-7388 16) Mitchell J.A. (1995) cycloxygenase-2: regulation and relevance in inflammation: biochem Pharmacol. 50: 1535-1542 17) Masferrer JL, (1994) Selective inhibition of inducible cyclooxygenase-2 in vivo is anti-inflammatory and nonulcerogenic. Proc. Natl. Acad Sci U.S.A. 91: 3228-3232 18) Seibert K. (1994) Role of inducible cyclooxygenase (COX-2) in inflammation 4: 17-23 19) Smith W.L., Dewitt, D.L.(1996) Prostaglandin Endoperoxide H Synthase-1 and –2. Advances in immunology, vol 62: 167-215. Review 20) Adderley SR, Fitzgerald DJ., (1999) Oxidative damage of cardiomyocytes is limited by extracellular regulated kinases ½-mediated induction of cyclooxygenase-2. J.Biol. Chem 274(8):5038-46 21) Dowd NP, Scully M, Adderley SR, Cunningham AJ, Fitzgerald DJ. (2001) Inhibition of cyclooxygenase-2 aggravates doxorubicin-mediated cardiac injury in vivo. J. Clin. Invest. 108(4): 585-590 22) Wong SCY, Fukuchi M., Melnyk P, Rodger I. (1998) Induction of cyclooxygenase-2 and activation of nuclear factor-κB in myocardium of patients with congestive heart failure. Circulation 98: 100-103
23) Shinmura K., Tang XL., Wang Y., Xuan YT., Liu SQ., Takano H., Bhatnagar A., Bolli R. (2000) Cyclooxygenase-2 mediates the cardioprotective effects of the late phase of preconditioning in conscious rabbits. Proc. Natl. Acad. SCI., USA, 97(18): 10197-10202 24) Yang X. Ma N. Szaboles MJ, Zhong J, Athan E Sciacca RR Michler R Anderson GD Wiese JF, Leahy K, Gregory S, Cannon PJ. (2000) Upregulation of COX-2 during allograft rejection. Circulation 1001(4): 430 25) Wong SCY. Fukuchi M. Melnik P. Rodger I. Giaid A. (1998). Induction of cyclooxygenase-2 and activation of nuclear factor κB in myocardium of patients with congestive heart failure. Circulation 98: 100-103 26) Guyton and Hall: Textbook of medical physiology, 9ème edition, (1996), unites IV. V, XIV. 27) Teerlink J.R. (1994) The evolving role of angiotensin-converting enzyme inhibition in heart failure: expanding the protective envelope. J. Cardiovasc. Pharmacol. 24:S32-7 28) Fouad-Tarazi F.M. (1994) Hemodynamic effects of inhibitors of the rennin-angiotensin system. J. Hypertens.12: S25-9 29) Baker K.M. , Booz G. W., and Dostal D.E. (1992) Cardiac actions of angiotesin II: role of an intracardiac renin-angiotensin system. Annu. Rev. Physiol. 54 : 227-241 30) Sechi L.A., Griffin C.A., Grady E.F., Kalinyak J.E., and Schambelan M., (1992) Characterization of angiotensin II receptor subtypes in rat heart. Circ. Res. 71: 1482-1489. 31) Timmerans P.B. Wong P.C., Chiu A.T. and Heberlin W.F. (1991) Nonpeptide angiotensin II receptors antagonists. Trends Pharmacol. Sci. 12: 55-62 32) Meggs L.G., Coupet J., Huang H., Li W.C.P., Capasso J.M., Homcy C.J., and Anversa P., (1993) Regulation of angiotensin II receptors on ventricular myocytes after myocardial infarction in rats. Circ. Res. 72: 1149-1162
33) Suzuki J., Matsubara H., Urakami M., and Inada M., (1993) Rat angiotensin II (type 1A) receptor mRNA regulation and subtype expression in myocardial growth and hypertrophy. Circ. Res. 73: 439-447 34) Timmerans P.B., Wong P., Chiu A.T., Herblin W.F., Benfield P., Carini D.J., Lee R.J., Wexler R.R., Saye J.M., and Smith RD. (1993) Angiotensin II receptors and angiotensin II receptors antagonists. Pharmacol. Rev. 45: 205-251. 35) Pönicke K., Heinroth-Hoffmann I., Brodde OE. Becker K. (1997) Trophic effect of angiotensin II in neonatal rat cardiomyocytes: role of endothelin-1 and non-myocyte cells. British journal of pharmacology 121: 118-124 36) Inoue A., Yanagisawa M., Kimura S., Kasuya Y., and Myauchi T. (1989) The human endothelin family – 3 structurally and pharmaologycally distinct isopeptides predicted by 3 separate genes. Proc. Natl acad. Sci. USA 86: 2863-2867 37) Krämer B.K. Ackermann M., Kohler S.M., and Riegger G.A.J. (1994) Role of endothelin in hypertension. Clin. Investig. 72: 88-93 38) Guyton and Hall, textbook of medical physiology, 9ème édition, 1996, p. 39) Hirata Y., Takagi Y., Fukuda Y., and Marumo F. (1989) endothelin is a potent mitogen for rat vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis 78: 225-228 40) Takuwa N., Takuwa Y., Yanagisawa K., Yamashita K., and Masaki T. (1989 A novel vasoactive peptide endothelin stimulates mitogenesis through inositol lipid turnover in Swiss 3T3 fibroblasts. J. Biol. Chem. 264: 7856-7861 41) Krämer B.K., Nishida M., Kelly R.A., and Smith T.W. (1992) Endothelins. Myocardial action of a new class of cytokines. Circulation 85: 350-356. 42) Ito H., Hirata Y., Hiroe M., Tsujino M., Adachi S., Takamoto T., Nitta M., Taniguchi K., and Marumo F., (1991) Endothelin-1 induces hypertrophy with enhanced expression of muscle-specific genes in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Circ. Res. 69: 209-215 43) Shubeita H.E., McDonough P.M., Harris A.N., Knowlton K.U., Glembotski C.C., Brown J.H., and Chien K.R. (1990) Endothelin induction of inositol phospholipid hydrolysis, sarcomere assembly, and cardiac gene expression in ventricular
myocytes. A paracrine mechanism for myocardial cell hypertrophy. J. Biol. Chem. 265: 20555-20562 44) Suzuki T., Hoshi H., and Mitsui Y. (1990) Endothelin stimulates hypertrophy and contractility of neonatal rat cardiac myocytes in a serum-free medium. FEBS Lett. 268: 149-151 45) Hahn A.W., Resink T.J., Scott B.T., Powell J., Dohi Y., and Buhler F.R. (1990) Stimulation of endothelin mRNA and secretion in rat vascular smooth muscle cells: a novel autocrine function. Cell Regul. 1: 649-659 46)Ohta K., Hirata Y., Imai T., Kanno K., Emori T., Shichiri M., and Marumo F. (1990) Cytokine-induced release of endothelin-1 from porcine renal epithelial cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun. 169: 578-584 47) Sakamoto H., sasaki S., Hirata Y., Imai T., Ando K., Ida T., Sakurai M., Yanagisawa T., Masaki T., and Marumo F., (1990) Production of endothelin-1 by rat cultured mesangial cells. Biochem Biophys. Res., Commun. 169: 462-468 48) Shichiri M., Hirata Y., Nakajima T., Ando K., Imai., Yanagisawa M., Masaki T., and Marumo F. (1991) endothelin-1 is an autocrine-paracrine growth factor for human cancer cell lines. J. Clin. Invest. 87: 1867-1871 49) Ito h., Adachi S., Tamamori M., Fujisaki H., Tanaka M., Lin M., Akimoto H., Marumo F., and Hiroe M. (1996) Mild hypoxia induces hypertrophy of cultured neonatal rat cardiomyocytes: a possible endogenous endothelin-1-mediated mechanism. J. Mol. Cell. Cardiol.28: 1271-1277 50) Iwanaga Y., Kihara Y., Hasegawa K., Inagaki K., Yoneda T., Kaburagi S., Araki M., and Sasayama S., (1998) Cardiac endothelin-1 plays a critical role in the functional deterioration of left ventricles during the transition from the compensatory hypertrophy to congestive heart failure in salt-sensitive hypertensive rats. Circulation 98: 2065-2073. 51) Kobayashi T., Miyauchi T., Sakai S., Kobayashi M., Yamaguchi I., Goto K., and Sugishita Y., (1999) Expression of endothelin-1, ETA and ETB receptors, and ECE and distribution of endothelin-1 in failling rat heart. Am. J. Physiol. 276: H1197-11206 52) Guyton and Hall: Textbook of medical physiology, 9ème edition, (1996), unité XIV.
52b) Ikeda U, Hyman R, Smith TW, Medford RM, Aldosterone-mediated regulation of Na+, K+-ATPase gene expression in adult and neonatal rat cardiomyocytes. J Biol Chem. 1991, 266: 12058-12066 53) Korichneva I., Puceat M., Millanvoye-Van Brussel E., Geraud G., Vassort G.(1995) Aldosterone modulates both the Na+/H+ antiport and Cl-/HCO3- exchanger in cultured neonatal rat cardiac cells. J. Mol. Cell. Cardiol. 27: 2521-2528 54) Benitah J.P. Vassort G. (1999) Aldosterone upregulates Ca++ current in adult rat cardiomyocytes. Circ. Res. 1999; 85: 1139-1145 55) Lombes M., Alfaidy N., Eugene E., Lessana A., Farman N., Bonvalet J.P. (1995). Prerequisite for cardiac aldosterone action. Mineralocorticoid receptor and 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase in the human heart. Circulation. 92: 175-182 56) Brilla C.G., Matsubara L.S., Weber K.T (1993) Anti-aldosterone treatment and the prevention of myocardial fibrosis in primary an secondary hyperaldosteronism. J. Mol. Cell Cardiol. 25: 563-574 57) Robert V., Thiem N.V., Cheav S.L., Mouas C., Swynghdauw B., Decayre C., (1994) Increased cardiac types I and II collagen mRNAs in aldosterone-salt hypertension. Hypertension 24: 30-36 58) Young M., Fullerton M., Dilley R., Funder J.W., (1994) Mineralocorticoids, hypertension and cardiac fibrosis. J. Clin. Invest. 93: 2578-2583 59) Robert V., Heymes C., Silvestre J.S., Sabri A., Swynghdauw B., Decayre C. (1999) Angiotensin AT1 receptor subtype as a cardiac target of aldosterone. Hypertension 33:981-986 60) Williams Textbook of endocrinology, 9ème edition, chapitre 15, p. 761-768 61) Grohe C. Kahlert S. Lobbert K. Stimpel M. Karas RH. Vetter H. Neyses L. (1997) Cardiac myocytes and fibroblasts contain functional estrogen receptors. FEBS Lett 416(1): 107-112 62) Chang WC, Nakao J, Orimo H, Murota SI. (1980) Stimulation of prostaglandin cyclooxygenase and prostacyclin synthase activities by estradiol in rat aortic smooth muscle cells. Biochim Biophys Acta 620(3): 472-482
63) Ghanam K, Lavagna C, Burgaud JL, Javellaud J, Ea-Kim L, Oudart N. (2000) Involvement of cyclooxygenase-2 in the protective effect of 17β-estradiol on hypercholesterolemic rabbit aorta. Biochem. Biophys. Res. Commun. 275(2): 696-703 64) Shoda T. Hatanaka K. Saito M. Majima M. Ogino M. Harada Y. Nishijima M. Katori M. Yamamoto S. (1995). Induction of cyclooxygenase type 2 (COX-2) in rat endometrium at the peak of serum estradiol during the estrus cycle. Jpn. J. Pharmacol. 69(3) : 289-291 65) Rebsamen MC, Church DJ, Morabito D, Vallotton MB, Lang U. (1997), Role of cAMP and calcium influx in endothelin-1-induced ANP release in rat cardiomyocytes. Am j Physiol. 273 : E922-931 66) Church DJ, Braconi-Quintaje S, van der Bent V, Vallotton MB, Lang U. (1994) Protein kinase c-dependent prostaglandin production mediates angiotensin II-induced atrial natriuretic peptide release. Biochem J. 298 :451-456 67) Ohnaka K, Numaguchi K, Yamakawa T, Inagami T. (2000) Induction of cyclooxygenase-2 by angiotensin II in cultured rat vascular smooth muscle cells. Hypertension 35: 68-75 68) Young W. Mahboubi K. Haider A. Li I Ferreri NR. (2000) Cyclooxygenase-2 is required for tumor necrosis factor-alpha- and angiotensin II-mediated proliferation of vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 86(8): 906-914 69) Schlondorff D, DeCandido S. Satriano JA. (1987) Angiotensin II stimulates phospholipases C and A2 in cultured rat mesangial cells. Am. J. Physiol. 253:C113-C120 70) Gimbrone MAJr. Alexander RW. (1975) Angiotensin II stimulation of prostaglandin production in cultured human vascular endothelium. Science 189: 219-220 71) Scheuren N. Jacobs N. Ertl G. Schorb W. (2002) Cyclooxygenase-2 in myocardium stimulation by angiotensin-II in cultured cardiac fibroblasts and role at acute myocardial infarction. Journal of molecular and cellular cardiology. 34:29-37
72) Cheng HF, Wang JL, Zhang MZ, Miyazaki, Ichikawa I, McKanna, Harris RC, (1999), Angiotensin II attenuates renal cortical cyclooxygenase-2 expression J.Clin. Invest. 103: 953-961 73) Hughes AK. Padilla E. Kutchera WA. Michael JR. Kohan DE. (1995) Endothelin-1 induction of cyclooxygenase-2 expression in rat mesangial cells. Kidney int. 47(1): 53-61 74) Coroneos E. Kester M. Thomas P. Dunn MJ. (1995) Endothelin regulates PGE2 formation in rat mesangial cells through induction of prostaglandin endoperoxide synthase-2. Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 23: 117-119 75) Kester M. Coroneos E. Thomas PJ. Dunn MJ. (1994) Endothelin stimulates prostaglandin endoperoxyde synthase-2 mRNA expression and protein synthesis through a tyrosine kinase-signaling pathway in rat mesangial cells. J. Biol. Chem. 269(36): 22574-80 76) Koyama Y. Mizobata T. Yamamoto N. Hashimoto H. Matsuda T. Baba A. (1999) Endothelins stimulate expression of cyclooxygenase-2 in rat cultured astrocytes. Neurochem. 73(3): 1004-1011 77) Sorli CH, Zhang HJ, Armstrong MB, Rajotte RV, Maclouf J, Robertson RP, (1998), Basal expression of cyclooxygenase-2 and nuclear factor-interleukin 6 are dominant and co-ordinately regulated by interleukin-1 in the pancreatic islet. Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 95: 1788-1793 78) Casal AJ. Silvestre JS. Delcayre C. Capponi AM. (2002) submitted 79) Engstrom T. (2001) The regulation by ovarian steroids of prostaglandin synthesis and prostaglandin-induced contractility in non-pregnant rat myometrium. Modulating effects of isoproterenol. Journal of endocrinology. 169: 33-41 80) Sato T. Michizu H. Hashizume K. Ito A. (2001) Hormonal regulation of PGE2 and COX-2 production in rabbit uterine cervical fibroblasts. J. Appl. Physiol 90(4): 1227-1231
top related