UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DE MEDECINE Section Médecine clinique Département de Médecine Interne Division d’Endocrinologie

Thèse préparée sous la direction de la Dresse Ursula Lang P.D.

MODULATION PAR L’OESTRADIOL ET L’ALDOSTERONE DU CONTRÔLE HORMONAL DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS

LES CARDIOMYOCYTES

Thèse Présentée à la Faculté de Médecine

de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur en médecine

par

Romina Claudia CAPOCCIA

de

Neuchâtel

Thèse n° 10294

2002

Remerciements Un grand Merci tout d'abord à la Dresse Ursula Lang, pour m'avoir accueillie dans son équipe, ainsi que pour ses encouragements, sa disponibilité et son enthousiasme. Je remercie également sincèrement Christine Gerber-Wicht ainsi que Manuella Rey pour leur précieuse aide technique, leur soutien et le temps qu'elles m'ont accordé toujours avec le sourire. Je tiens à remercier Le Professeur Jacques Philippe pour m'avoir permis de réaliser ce travail au sein de la Division d'Endocrinologie et de Diabétologie. Enfin, merci à tout le laboratoire pour son accueil et son aide dans ce monde nouveau de recherche fondamentale

RESUME

MODULATION PAR L’OESTRADIOL ET L’ALDOSTERONE DU CONTRÔLE

HORMONAL DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES

CARDIOMYOCYTES

Selon un nombre croissant d’études, la COX-2, isoenzyme inductible, exprimée

de manière transitoire en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines,

ou des promoteurs de tumeurs et prédominant dans des conditions

inflammatoires, aurait un effet protecteur sur les cardiomyocytes.

Plusieurs études rapportent une expression augmentée de COX-2 dans

différents tissus (le muscle lisse, les cellules mésangiales, les cellules

endothéliales), en présence de certaines hormones, tel que l’endothéline-1 et

l’angiotensine II. En revanche, il existe très peu d'informations au niveau du

cœur dans ce domaine.

Les objectifs de travail étaient les suivants:

1) Déterminer la cinétique de l'effet de l'AngII et de l'ET-1 sur

l'expression de la COX-2 au niveau des cardiomyocytes ventriculaires du rat

nouveau-né.

2) Etudier les effets de l'aldostérone et de l'oestradiol sur l'expression

de la COX-2 dans des cardiomyocytes stimulés avec de l'Ang-II et de l'ET-1.

Les résultats obtenus montrent que l'Ang-II et l'ET-1 induisent la COX-2 en

fonction du temps. Ces deux hormones induisent une augmentation rapide de

l'expression de la COX-2 qui atteint des valeurs maximales après 1 h de

stimulation. Quant à l'aldostérone et l'oestradiol, nos observations montrent

que ces deux stéroïdes exercent un effet modulateur négatif sur l'expression

de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires.

MODULATION PAR L’OESTRADIOL ET L’ALDOSTERONE DU CONTRÔLE HORMONAL DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES

CARDIOMYOCYTES TABLE DES MATIERES

I. INTRODUCTION p.1 1) CARDIOMYOCYTES p.1 2) PROSTAGLANDINES p.3

2.1) Sécrétion de PGI2 dans des cultures de cardiomyocytes p.3 2.2) Phospholipase A2 p.3 2.3) Cyclooxygénase p.4

3) ANGIOTENSINE II (AngII) p.9 4) ENDOTHELINE-1 (ET-1) p.11

5) ALDOSTERONE (aldo) p.13

6) OESTRADIOL (E2) p.15

7) Régulation du système cardio-vasculaire par l'AngII p.16bis et l'ET-1 et influence de l'ostradiol et de l'aldostérone

II. MATERIEL ET METHODES p.18 1) COMPOSITION DES MILIEUX ET DES TAMPONS p.18

2) METHODES p.19

2.1) Mise en culture des cardiomyocytes ventriculaires de rats nouveau-nés p.19

2.2) Stimulation des cardiomyocytes ventricualires p.21 2.3) Analyse des protéines par électrophorèse et imunodétection (western blot) p.21

III. RESULTATS p.23

1) EFFETS DE L’ANGIOTENSINE II ET DE L’ENDOTHELINE-1 SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 p.23

2) EFFETS DE L’ALDOSTERONE SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES CARDIOMYOCYTES VENTRICULAIRES p.26

2.1) stimulation avec l’ET-1 p.26 2.2) stimulation avec l’AngII p.28

2.3) stimulation des cellules avec l’AngII et expression de la COX-2 en fonction de la variation de concentration d’aldostérone p.30

3) EFFETS DE L’OESTRADIOL SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES CARDIOMYOCYTES VENTRICULAIRES p.33

3.1) stimulation avec de l’ET-1 p.33 3.2) stimulation avec de l’AngII p.34 3.3) stimulation des cellules avec l’AngII et expression de la COX-2 en fonction de la variation de concentration de p.36 l’oestradiol

IV. DISCUSSION p.38

1) INDUCTION DE LA COX-2 PAR L’ANGIOTENSINE II ET L’ENDOTHELINE-1 p.38

2)MODULATION DE L’EXPRESSION DE LA COX-2 PAR

DES HORMONES STEROÏDIENNES : ALDOSTERONE ET OESTRADIOL p.39

I. INTRODUCTION

1) CARDIOMYOCYTES

Le muscle cardiaque est constitué de cellules, les cardiomyocytes, liés les uns

aux autres par des disques intercalaires. Les embranchements des

cardiomyocytes forment un réseau complexe tridimentionnel. Tous les

cardiomyocytes sont capables de dépolarisations rythmiques spontanées. Mais,

c’est un groupe de myocytes de l’atrium qui constitue le pacemaker et propage

les stimulations électriques à travers le myocarde par des gap junctions situées

entre les myocytes. C’est pourquoi, malgré le fait qu’il soit constitué par des

cellules séparées, le myocarde se comporte comme un syncytium [1]. Le

cardiomyocyte, en plus de sa fonction contractile propre, possède des propriétés

endocrines en ce sens qu’il est capable de synthétiser et libérer dans son

environnement immédiat et dans la circulation générale des facteurs autacoïdes

tels que certaines prostaglandines, comme la prostaglandine E2 et la

prostacycline, des dérivés de phospholipides membranaires et des hormones

peptidiques, les peptide natriurétique auriculaire ou ANP et le BNP (Brain

natriuretic peptide).

Le cardiomyocyte possède dans sa membrane cellulaire des récepteurs à

plusieures hormones : les catécholamines, l’endothéline, l’angiotensine ll et la

vasopressine, l’aldostérone, des hormones thyroïdiennes, l’insuline entre autres.

L’activation des récepteurs à l’angiotensine ll (Ang II) et à la vasopressine

aboutit à des effets variés, comprenant des effets inotropes et chronotropes,

des effets de croissance par l’intermédiaire de la stimulation d’oncogènes ainsi

qu’à la stimulation de la fonction endocrine des cardiomyocytes. L’angiotensine ll

et l’endothéline-1 peuvent provoquer une réponse hypertrophique chez le rat [2],

1

une réponse qu’on observe également in vivo durant le développement du coeur.

En effet, dans la période post-natale, les cellules musculaires cardiaques perdent

leur capacité à se diviser et dès ce moment, la croissance du coeur se fait par

hypertrophie : phénomène caractérisé par une augmentation de la quantité de

protéine par cellule [3].

2

3

2) PROSTAGLANDINES :

2.1) Sécrétion de prostacyclines dans des cultures de cardiomyocytes

L’augmentation de la sécrétion de prostacycline (PGI2) dans le cœur après des

lésions ischémiques peut résulter de la production de PGI2 par différents types

de cellules, notamment les cellules endothéliales. Des expériences effectuées

dans des cellules soumises d’abord à l’ischémie puis à une réoxygénation ont

montré une libération de prostacycline plus grande lors de la réoxygénation [4],

[5]. Des travaux effectués par notre laboratoire ont montré une augmentation

de la sécrétion de prostacycline par l’Ang ll et la vasopressine (AVP) dans les

cardiomyocytes ventriculaires, par la voie de l’activation de la PKC et la

phospholipase A2 [6, 7]

La synthèse de prostacycline est régulée par deux étapes limitantes : la

libération d’acide arachidonique des phospholipides membranaires par la

phospholipase A2 (PLA2) et la conversion de cet acide arachidonique en

précurseurs de prostanoïdes (PGH2) par la cyclooxygénase.

2.2) Phospholipase A2 :

La phospholipase A2 est impliquée dans différentes réponses cellulaires, dont la

défense de l’hôte, la coagulation, la digestion. De nombreuses études effectuées

dans différents types cellulaires ont montré que la PLA2 joue un rôle clé dans la

régulation des voies de transduction des signaux médié par les lipides.

Il existe trois types de cet enzyme :

4

1. La PLA2 sécrétoire qui demande du Ca++ en concentration millimolaire pour

accomplir sa fonction enzymatique. Elle est elle-même subdivisée en deux

sous-groupes basés sur sa sélectivité tissulaire. On trouve le groupe 1

principalement dans le pancréas. Et le groupe dans les tissus non

pancréatiques [8].

2. La PLA2 cytosolique qui requiert du Ca++ en concentration submicromolaire

pour une activité cytosolique optimale. On la trouve dans le compartiment

cytosolique de la plupart des cellules [9].

3. La PLA2 qui est indépendante du Ca++.

2.3) Cyclooxygénase :

Le Prostaglandine endoperoxyde H synthase ou cyclooxygénase catalyse une

étape de la formation des prostaglandines et du thromboxane. Elle possède deux

fonctions enzymatiques : une fonction dite cyclooxygénase, reponsable de

l’oxydation de l’acide arachidonique en PGG2 suite à l’insertion de deux molécules

d’O2 et une fonction peroxydase qui réduit les PGG2 en PGH2 [10]. Il existe 2

types de PGHS : PGHS-1 et PGHS-2 ou COX-1 et COX-2 qui catalysent toutes les

deux la formation des PGH2 à partir de l’acide arachidonique.

5

PLA2 : phospholipase A2 AA : acide arachidonique

COX : cyclooxygénase PG : prostaglandine

TX : Thromboxane

Schéma de la synthèse d’éicosanoïdes

La PLA2 et la COX transforment les phospholipides membranaires en PGH2, qui est ensuite

converti par des enzymes spécifiques des tissus en prostacycline, prostaglandines et

thromboxane. La PGH2, après avoir été synthétisé par les COX, est transformé par des

synthases différentes en PGD2, PGE2, PGF2a ou Txa2

Les deux isoenzymes de la cyclooxygénase possèdent essentiellement la même

structure primaire avec 60% d’identité ainsi qu’une structure cristallographique

semblable [11, 12] et elles possèdent des propriétés cinétiques très proches. Les

deux sont inhibées par des antiinflammatoires non stéroïdiens (AINS) bien que

des inhibiteurs spécifiques de chacune aient été développés. COX-1 et –2 se

trouvent dans les cellules sous forme d’homodimères attachés par leur domaines

hydrophobes aux membranes du réticulum endoplasmique et du noyau [13, 14].

Phospholipides membranaires

AA

PGG2

PGH2

PGD2 PGE2 PGF2 PG2 TXA2 TXB2

PLA2

COX-1 COX-2

DIFFERENTES SYNTHASES

6

Malgré leurs points communs structuraux et fonctionnels, les deux isoformes

possèdent des fonctions biologiques différentes.

COX-1 et COX-2 sont codées par des gènes distincts [15].

La COX-1 est considérée comme l’enzyme constitutive ; et son expression est

régulée tout au long de son développement ; elle est responsable de la production

physiologique, constitutive de prostaglandines. Une fois que l’enzyme a formé les

prostanoïdes dans le réticulum endoplasmique, ces derniers agissent par des

récepteurs de surface, pour effectuer des tâches d’entretien de l’organisme ;

par exemple, l’équilibre hydrosodé par le rein, ou la protection gastrique contre

l’acidité, ou encore l’hémostase.

La COX-2 au contraire est l’enzyme dite inductible, qui dans des condition

standards est habituellement absente des cellules et qui est exprimée de

manière transitoire en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines (Il-1,

IL-6, PDGF, TNF-α) ou des promoteurs de tumeur ; elle prédomine dans les

conditions inflammatoires. La COX-2 synthétise les prostanoïdes sur l’enveloppe

nucléaire et ces derniers semblent agir au niveau nucléaire durant la réplication

ou la différenciation nucléaire [16].

Les éicosanoïdes ont des effets biologiques variés malgré leur structures

semblables. Ils sont impliqués dans les fonctions respiratoires, puisqu’ils

provoquent une bronchoconstriction. Les PGE2 stimulent la production de mucus

gastrique qui avec les bicarbonates inhibent la rétrodiffusion des H+. En outre ils

tempèrent la sécrétion acide de l’estomac par une action directe sur les cellules

pariétales. Les PGE2 et les PGI2 permettent une vasodilatation rénale. Les PGI2

permettent une relaxation des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC),

mais provoquent une contraction des cellules musculaires lisses du tractus

digestif. Ils sont en outre connus pour leur effet proinflammatoire. On utilise

7

depuis le début du siècle les antiinflammatoires non stéroïdiens, qui inhibent les

deux isoenzymes et empêchent ainsi la production de prostaglandines et de

thromboxanes proinflammatoires [16]. Mais cette supression complète

d’eicosanoïdes est à l’origine de nombreux effets indésirables de ces

médicaments, notamment l’insuffisance rénale et l’ulcère gastrique. C’est

pourquoi on développe de plus en plus des inhibiteurs spécifiques de la COX-2.

Ainsi, l’inflammation est diminuée, mais la production basale d’eicosanoïdes

nécessaire au maintien de l’homéostasie gastrique et rénale est conservée [17,

18].

Les COX ont en outre un intérêt thérapeuthique certain au vu de leur implication

dans les thromboses coronaires , dans l’inflammation, dans le cancer du côlon et

dans la maladie d’Alzheimer [19].

Les premières études considéraient la COX-2 comme délétère tandis

que la COX-1 était vue comme protectrice, mais actuellement, la

distinction n’est plus aussi claire.

Plusieurs études récentes ont montré des effets variés de la COX-2

au niveau du cœur.

Adderley et al. (1999) [20] ont montré que les lésions des

cardiomyocytes dues au H2O2 et à la doxorubicine sont limitées par

la formation de prostacycline, qui reflète l ’ induction de COX-2.

De même, Noreen P. Dowd ont montré que le degré de lésion cardiaque chez un

animal traité avec de la doxorubicine et du SC236 était diminué par

l’administration préalable d’iloprost, un analogue de la PGI2 [21].

Une étude canadienne [22] a démontré l ’ induction de la COX-2, en

association au processus inflammatoire et à la cicatrisation, dans le

myocarde lors de l ’ infarctus du myocarde . En revanche, le rôle

exact de cet enzyme dans cette maladie fatale n’a pas été déterminé

[22].

8

Une étude menée chez le lapin a montré que l ’augmentation de la

COX-2 joue un rôle essentiel dans la protection du coeur lors de la

phase tardive du préconditionnement ischémique (cycle

d’occlusion/reperfusion coronaire de 4 minutes). En effet, dans

cette expérience, le préconditionnement ischémique montre une

augmentation rapide de l ’ARMm de la COX-2, une induction

importante de la COX-2 dans les 24 heures et une augmentation du

contenu cardiaque en prostaglandines, produits enzymatiques de la

COX-2. Dans cette expérience, l ’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de

la COX-2 (NS-398 et celecoxib) bloquent totalement l ’effet

cardioprotecteur, tant pour les lésions ischémiques réversibles

(ischémie), que pour les lésions irréversibles (infarctus) Cette étude

semble donc définir la COX-2 comme un enzyme cardioprotecteur

[23].

Une augmentation de l ’enzyme COX-2 ainsi que de son mRNA a été

démontré lors d’un rejet d’allogreffe cardiaque. Néanmoins,

l ’ inflammation et l ’apoptose des cardiomyocytes n’ont pas été réduits

de manière significative par un traitement d’inhibiteurs de la COX-2

[24].

Une fibrose cardiaque a été rapporté par Wong et al (1988) [25]

chez la souris dont le gène de la COX-2 a été inactivé, suggérant que

la COX-2 aurait des propriétés cardioprotectrices.

3) ANGIOTENSINE II (Ang ll)

L’Ang ll est un octapeptide et le composant actif principal du système rénine-

angiotensine. Ce système est important pour le contrôle de la pression artérielle

et l’équilibre ionique, par l’effet direct de l’Ang ll et par l’intermédiaire de la

sécrétion d’aldostérone. La diminution de la pression artérielle moyenne de même

qu’une augmentation du K+ plasmatique ou une restriction sodée stimule

respectivement les barorécepteurs ou les chémorécepteurs de l’appareil

juxtaglomérulaire du rein, ce qui provoque la sécrétion de la rénine, un enzyme de

la zone de la Macula Densa, qui agit pendant 30 minutes à une heure en

transformant l’angiotensinogène en angiotensine l au niveau du foie. Ensuite,

l’enzyme de conversion de l’angiotensine convertit l’angiotensine l en angiotensine

ll au niveau des poumons ; cet enzyme est détruit en quelques minutes dans le

sang par l’action d’angiotensinogénases. L’Ang ll permet une constriction

artérielle directe, la réabsorption rénale de Na+, une augmentation de la

précharge cardiaque, de l’inotropisme et du chronotropisme ainsi qu’une

stimulation de la soif. L’effet final est une augmentation du volume plasmatique

et de la résistance vasculaire périphérique, donc une augmentation de la pression

artérielle. L’Ang ll permet également une augmentation de la sécrétion

d’aldostérone par la zone glomérulaire du cortex surrénalien. L’aldostérone, un

minéralocorticoïde, qui au niveau rénal augmente la réabsorption du sodium,

entraîne donc une rétention d’eau, mécanisme qui permet également une

augmentation de la pression artérielle par augmentation de la précharge

cardiaque, mais de manière moins importante que l’angiotensine elle-même. En

outre, l’aldostérone provoque une augmentation de l’excrétion du K+. Ensuite, un

rétrocontrôle négatif permet un arrêt de la sécrétion de rénine, ce qui permet

une stabilisation de la pression artérielle et de l’équilibre ionique [26].

9

Le rôle de l’Ang ll a été étudié dans plusieurs pathologies cardiaques en utilisant

des inhibiteurs du système rénine-angiotensine (RA). Dans nombre de ces études

cliniques, l’efficacité des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine

dans l’hypertension artérielle et l’insuffisance cardiaque a été démontrée [27,

28]. Habituellement, ce système rénine-angiotensine est décrit comme un

système général avec une Ang ll distribuée dans tout le corps. Pourtant, il

existerait d’après plusieurs auteurs [29]., des systèmes RA localisés dans des

organes spécifiques comme par exemple le cœur qui fonctionne par voie

autocrine ou paracrine.

L’Ang ll se lie à deux types de récepteurs AT1 et AT2 qui sont exprimés dans de

nombreux tissus dont le cœur [30]. Ces récepteurs appartiennent à une famille

de récepteurs à 7 domaines transmemembranaires et se distinguent les uns des

autres par leur affinité pour les antagonistes non peptidiques [31]. Ces

récepteurs sont augmentés après un infarctus du myocarde [32] et une

hypertrophie [33]. Dans le cœur, ce sont les récepteurs AT1 qui sont

responsables de la plupart des effets physiologiques de l’hormone [34]. D’après

une étude menée aux Pays-bas [35]., il semble que lors d’hypertrophie cardiaque

due à des stress physiques, l’Ang ll, ainsi que l’endothéline-1 et le TGF-β libérés

par les cellules cardiaques et vasculaires participeraient à ce phénomène par une

action autocrine et paracrine.

10

4) ENDOTHELINE-1 (ET-1)

La famille des endothélines comporte trois membres : ET-1, ET-2, ET-3, qui ont

été identifiés par clonage [36]. Une préproendothéline est clivée par des

endopeptidases spécifiques en grande endothéline, puis l’enzyme de conversion

de l’endothéline la convertit en endothéline

L’ET-1 est un grand peptide qui compte 21 acides aminés. La transcription de son

gène peut être régulée dans la cellule endothéliale au niveau de l’ARNm par la

thrombine, l’adrénaline, l’Ang ll, l’ADH, le TGF-β, l’ester de phorbol ; sa libération

peut être inhibée par le NO et l’ANP [37]. On la trouve à la surface des cellules

endothéliales de la plupart des vaisseaux. Le stimulus nécessaire à sa sécrétion

est la lésion de l’endothélium vasculaire. Le rôle physiologique de cette hormone

n’est pas encore élucidé, mais on la trouve augmentée dans certaines pathologies,

comme la toxémie gravidique, l’insuffisance rénale aiguë ou chronique [38].

L’endothéline administrée de manière exogène a montré une augmentation de la

résistance vasculaire périphérique. Mais durant les premières minutes

d’administration intraveineuse, l’endothéline diminue la résistance vasculaire

périphérique ; probablement dû à une libération de composés vasodilatateurs

comme le NO, le PGH2 ou l’ANP [37].

On a découvert que l’ET-1 possédait un rôle de facteur de croissance dans

certaines cellules de mammifères, comme les VSMC et les fibroblastes [39, 40].

En ce qui concerne le cœur, Kojima et al., 1995 [41] ont démontré qu’un

antagoniste non spécifique du récepteur à l’endothéline diminuait la taille de

l’infarctus chez le rat, le lapin, le chien, quand on l’administre avant ou après un

infarctus aigu du myocarde. L’ET-1 a également un effet inotrope positif dans

des cardiomyocytes ventriculaires en culture [41], en outre, l’ET-1 induit une

hypertrophie des cardiomyocytes [42, 43, 44]. L’ET-1 est également produite par

11

des cellules non endothéliales comme les VSMC, les cellules épithéliales rénales,

les cellules mésangiales glomérulaires et certaines lignées de cellules

cancéreuses [45, 46, 47, 48]. Ces observations ont mené à l’hypothèse que

l’endothéline endogène produite par les cardiomyocytes pourrait être impliquée

dans la pathogenèse de l’hypertrophie cardiaque par un mécanisme autocrine et

paracrine. Dans ce contexte, Ito et al. (1996) [49] ont rapporté une

augmentation de l’ARNm de la préproendothéline-1 et de la libération de l’ET-1

et ils ont suggéré que cette activation endogène peut, au moins en partie, médier

la réponse hypertrophique induite par l’hypoxie. La synthèse myocardique

accélérée d’ET-1 contribue également à la dysfonction du ventricule gauche

durant la transition de la phase d’hypertrophie du ventricule gauche à celle

d’insuffisance cardiaque congestive chez le rat hypertendu [50]. En outre,

Kobayashi et al., (1999) [51] ont rapporté que le niveau de l’ARNm de la

préproendothéline, celui de l’ET-1 ainsi que celui du récepteur étaient

significativement plus hauts chez les rats en insuffisance cardiaque chronique

que chez les rats contrôles.

12

5) ALDOSTERONE :

L’aldostérone est un minéralocorticoïde très puissant qui est responsable du le

90% de l’activité de tous les minéralocorticoïdes. L’absence de sa sécrétion par

le cortex surrénalien entraînerait la mort en jours à deux semaines. Sans

minéralocorticoïdes, la concentration plasmatique de K+ augmenterait à l’inverse

du Na+ et du volume liquidien extracellulaire. En effet, l’aldostérone agit sur

l’échangeur Na+/K+ des cellules épithéliales tubulaires rénales.

La sécrétion d’aldostérone est stimulée par : 1) L’augmentation du K+

extracellulaire ; 2) L’activation du système RA ; 3) la sécrétion basale d’ACTH,

indispensable, mais qui ne provoque que peu de variation dans le taux sécrété

d’aldostérone. La sécrétion d’aldostérone est diminuée en présence d’une

hypernatrémie.

L’aldostérone permet par son action d’augmenter la tension artérielle et de

diminuer le K+, d’effectuer un rétrocontrôle négatif pour atteindre un équilibre

tensionnel et ionique [52].

Comme d’autres hormones stéroïdes, l’aldostérone commence son action en se

liant à ses récepteurs intracellulaires qui ensuite sont capables de contrôler la

transcription de plusieurs gènes. Dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés et

adultes, des concentrations physiologiques d’aldostérone ont montré une

augmentation de trois fois des isoformes principales des pompes Na+/K+- ATPase

[52b]. En outre, dans les cellules cardiaques de rats nouveau-nés, un traitement

de 24 heures d’aldostérone stimule l’activité de l’antiport Na+/H+ et de

l’échangeur Cl-/HCO3- [53]. Récemment, il a été rapporté dans les

cardiomyocytes de rats adultes, que l’aldostérone induisait une expression

augmentée du courant de Ca2+ [54]. L’événement initial de l’action de

l’aldostérone est sa liaison à son récepteur. Ce récepteur a la même affinité pour

l’aldostérone et pour les glucocorticoïdes. C’est pourquoi la sélectivité in vivo de

13

ce récepteur requiert la présence d’un enzyme, le 11β-hydrostéroïde

déshydrogénase, qui métabolise les glucocorticoïdes en dérivés inactifs. Lombès

et al (1995) [55] ont montré une coexpression de cet enzyme et du récepteur à

l’aldostérone dans le cœur, qui contient donc les outils cellulaires nécessaires à

l’action de l’aldostérone.

Un excès chronique d’aldostérone est associé à un dépôt de collagène interstitiel

cardiaque et périvasculaire marqués [56, 57, 58]. La spironolactone, antagoniste

de l’aldostérone, prévient cette fibrose cardiaque, ce qui indique qu’un récepteur

aux minéralocorticoïdes est impliqué dans cette réponse [56]. Une étude récente

nous montre l’implication de l’angiotensine-2 et de son récepteur dans le

mécanisme de la fibrose cardiaque, suggérant que le récepteur cardiaque AT1

serait une cible pour l’aldostérone [59].

14

6) OESTRADIOL :

Le 17β-oestradiol est le plus puissant et le plus important des oestrogènes. Sa

source principale est la conversion extraglandulaire de l’androstènedione, au

niveau des tissus périphériques.

Les oestrogènes permettent le développement des caractères sexuels

secondaires chez la femme, la croissance utérine, l’épaississement de la

muqueuse vaginale, la fluidification du mucus cervical et le développement du

système canalaire des seins.

Toutes les hormones stéroïdiennes sont dérivées du cholestérol provenant de

trois sources : les lipoprotéines circulantes (surtout les LDL), le cholestérol

synthétisé de novo dans l’ovaire et le cholestérol libéré des esters stockés dans

les gouttelettes lipidiques.

La conversion du cholestérol en prégnénolone est l’étape limitante de la

stéroïdogenèse ovarienne, qui à lieu au niveau des cellules de la granulosa, des

cellules thécales et surtout au niveau du corps jaune.

Pour être transporté dans le sang, l’oestradiol est lié à l’albumine à 60%, à la

globuline liant la testostérone à 38% et 2-3% est libre.

Les hormones stéroïdiennes ont un faible poids moléculaire et pénètrent

facilement dans la cellule en diffusant à travers la membrane, bien qu’il puisse y

avoir un transporteur qui participe à ce transport ; elles entrent dans le noyau et

se lient à un récepteur nucléaire. L’affinité, la spécificité et la grande

concentration des récepteurs aux stéroïdes permettent à une petite quantité

d’hormone de produire un effet biologique. La spécificité des récepteurs aux

oestrogènes est partiellement déterminée par le nombre de récepteurs dans la

cellule. Par exemple, dans l’utérus, l’action biologique des oestrogènes est grande

grâce à la concentration élevée des récepteurs dans une cellule. Il se produit une

transformation active du complexe de l’hormone-récepteur après la liaison de

15

l’hormone au noyau. Cette liaison implique un changement de la conformation qui,

soit rend accessible des sites DNA, qu’on appelle steroid response elements

(SREs), soit altère des complexes de la régulation de la transcription, pour leur

permettre d’interagir avec des SREs pour activer ou réprimer des gènes [60].

Aucune étude n’a été publiée sur l’effet de l’oestradiol sur l’expression de la

COX-2 dans les cardiomyocytes. Mais nous savons qu’il existe sur les

cardiomyocytes des récepteurs aux oestrogènes.

En effet, la différence qu’il existe dans les maladies cardiovasculaires entre les

deux sexes a suggéré que les oestrogènes agissaient directement sur le tissu

cardiaque. C’est pourquoi Grohe et al. (1997) [61] ont cherché à savoir si les

cardiomyocytes et les fibroblastes possédaient des récepteurs aux oestrogènes.

Ils ont découvert par une méthodes d’immunofluorescence que le récepteur

protéique aux oestrogènes était exprimé dans les cardiomyocytes et les

fibroblastes cardiaques. La translocation nucléaire du récepteur protéique aux

oestrogènes a été démontrée après stimulation des cardiomyocytes avec du 17-

β-oestradiol (E2) [61].

Dans d’autres cellules que les cellules cardiaques, par exemple, les cellules

musculaires lisses vasculaires, l’E2 stimule l’activité de la COX-2 et de la PGI2

synthase [62].

Ghanam K. et al. (2000) [63] ont vu avec l’aorte du lapin hypercholestérolémique

que l’E2 restore l’effet relaxant de l’Acétylcholine (Ach) qui était inhibé par

l’hypercholestérolémie.

Dans l’endomètre également, on a constaté que le pic de l’expression de la COX-

2, exprimé durant les trois phases du cycle menstruel, correspond à la phase

diestrus, qui correspond au niveau maximal d’E2, ce qui suggère une induction de

la COX-2 dépendant de l’E2 [64].

16

7) REGULATION DU SYSTEME CARDIO-VASCULAIRE PAR L’ANGIOTENSINE-II ET L’ENDOTHELINE-I ET INFLUENCE DE L’OESTRADIOL ET DE L’ALDOSTERONE

-Infarctus-hypertrophie ALDOALDO Augmentation:

Stress oxydatif:-Doxorubicine -H2O2

lésions

-Infarctus-inflammation -lésions ischémniques-AngII-Et-1

Augmentation:-COX-2-PGI2 (réduit également les extrasystoles ventriculaires lors d’une ischémie)

ETET--11-Inotrope positif-Hypertrophie >> insuffisance cardiaque-augmentation taille infarctusCroissance des

cellules musculaires lisses vasculaires et des fibroblastes

VAISSEAUXVAISSEAUXBaisse de la résistance vasculaire dans les premières minutes

ANGIIANGII

-réabsorption Na+

-excrétion K+

Augmentation :-Fluide extracellulaire-Volume sanguin-Précharge cardiaque-Baisse Pression

Artérielle-Restriction Na+

RAA

RAA

vasoconstriction

Lésion vasculaire

E2E2

COX-2 / PGE2,PGI2

COEURCOEUR

Inotrope +

Augmentation:

Augmentationdu débit

-Résistance vasculaire périphérique

-Pression artérielle

16bis

II) MATERIEL ET METHODES:

1) COMPOSITION DES MILIEUX ET DES TAMPONS :

ENZYMES:

Dnase Type IV ou I: pointe de spatule (Sigma D 4138) (dessicateur -20°C)

Trypsine 1:250: 125mg/50ml (invitrogen 27250-042)

filtration de la solution avec filtre type milipore 0.22 µ

ANTICORPS : COX-2 murine Polyclonal Antiserum, Cayman

Anticorps anti-rabbit , Covalab

MILIEU DE CULTURE:

FCS: Fœtal calf serum (seromed N°SO115, chez Fakola)

Hanks, sans Mg++, sans Ca++:( invitrogen 14175-073)

Antibiotiques: Pénicilline/streptomycine (invitrogen 15140-122)

Antimycotique: Fungizone conc. finale 250µg/500 ml(Pharmacie HCUG)

Facteur de croissance ITS (Insulin-Transferin-Sodium Selenite) Sigma I 1884,

conc. finale: 1%

Milieu de culture: Milieu Mc Coys 5A (modifié) (Gibco 21500-046= poudre

pour 5l de milieu)

Mc Coys complet= 500 ml de milieu + 1ml de solution de Fungizone + 5ml de

Pénicilline/Streptomycine + 5 mlITS + 50 ml de FCS

Mc Coy’s sans rouge de phénol : Cell culture technologies GmbH

TAMPON DE PHOSPHATE (PBS) :

NaCl 137mM, KH2PO4 1,47mM, Na2HPO4.2H2O; pH: 7,4

17

TAMPON DE LYSE:

50 mM de Tris-base, 150mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de Triton X-100, 2

mM d'EDTA Triple, 2 mM d'EGTA, 40 mM de β-glycérophosphate, 50 mM de

fluorure de sodium, 10 mM de pyrophosphate de sodium, 200 µM

d'orthovanadate de sodium (ajouté au dernier moment), 10µg/ml de leupeptine,

0,3 TIU/ml de trasylol, 1µM de pepstatine A, 1mM de PMSF (ajouté au dernier

moment), 100 nM de calyculine.

TAMPON DE TRANSFERT:

25 mM de Tris-base, 190 mM de glycine, méthanol 20%

TAMPON DE LAVAGE:

50 mM detris-base, 200 mM de NaCl, Tween 20 (0,2%), ajuster à pH 7.5

TAMPON DE BLOCAGE:

Tampon de lavage et lait maigre en poudre 5%

TAMPON D'INCUBATION:

Tampon de lavage et lait maigre en poudre 1%

2) METHODES :

2.1.) Mise en culture des cardiomyocytes ventriculaires:

18

Chez des rats Winstar de 24-48h, prélévement du ventricule in situ, placé dans

du tampon Hanks, sans Mg++ et sans Ca++, à température ambiante. Contrôle sous

binoculaire du prélévement des ventricules pour déceler la présence

d'oreillettes. Le prélévement est réalisé rapidement et la dispersion

enzymatique est réalisée le plus précocément possible. Les ventricules sont

rincés pour éliminer les globules rouges dans du Hanks sans Mg++ et sans Ca++.

Aspiration de la solution saline. Emincer aux ciseaux les ventricules de la manière

la plus fine, pendant environ 5 minutes et commencer la dispersion enzymatique.

1ère dispersion: mettre les morceaux de tissu dans 10 ml de solution d'enzymes,

dans un tube conique, dans le bain-marie, sur l'agitateur. Le barreau doit tourner

réguliérement, pour éviter d'abîmer les cellules. Durée: 8 minutes

Retirer du bain-marie, laisser décanter quelques secondes, prélever le

surnageant avec une pipette en veillant à ne pas aspirer de gros morceaux et

jeter cette première dispersion (globules rouges, déchets cellulaires).

Ajouter 8 à 13 ml de solution d'enzyme dans le tube contenant les ventricules et

remettre dans le bain-marie sur l'agitateur. A la fin des 8 minutes, laisser

décanter quelques secondes, aspirer le surnageant au moyen d'une pipette,

mettre dans un tube conique de 15 ml avant de centrifuger 4 minutes à 1200 rpm

(la dispersion se répète 10 à 12 fois jusqu'à ce que tous les morceaux de tissus

soient dispersés.)

Pendant ce temps, préparer un tube de 50 ml avec environ 20 ml de Mc Coy's

complet dans lequel on gardera les cellules centrifugées après chaque étape de la

dispersion.

Lorsque la centrifugation est terminée, aspirer le surnageant, récolter le pellet

dans le milieu Mc Coy's complet du tube préparé à cet effet et garder au bain

marie à 37°C.

Lorsque la totalité des cellules a été récoltée, on centrifuge le tout 5 minutes à

1200 rpm. On aspire le surnageant et on resuspend le pellet dans le milieu de

19

culture Mc Coy's complet + FCS 10%, puis on répartit les cellules dans les pétris.

Les cardiomyocytes commencent à se contracter spontanément 24 à 48h après

la mise en culture. Pour effectuer nos expériences, nous avons utilisé les cellules

3 jours après la mise en culture.

2.2.) Stimulation des cardiomyocytes ventriculaires:

24 heures avant la stimulation par des hormones, les cardiomyocytes sont

déprivés en étant mis dans du milieu Mc Coy's dépourvu de FCS. Dans le même

temps, les stéroïdes sont ajoutés dans les pétris déstinés aux longues

incubations, c'est-à-dire 20-24 heures. 20 heures après, le milieu est changé et

les hormones sont ajoutées pour une durée de trois heures.

2.3.) Analyse des protéines par électrophorèse et immunodétection (Western

blot) :

Les cardiomyocytes, cultivés dans des boîtes de Pétris de 6 cm de diamètre

contenant 2,5 ml de Mc Coy's sans FCS, sont lavées avec 5 ml de tampon

phosphate froid (PBS) et lysées avec 100µl de tampon de lyse conservé à 4°C.

Après avoir gratté les boîtes de Pétris, le lysat est récolté dans des tubes

Eppendorfs, vortexé et déposé 10 minutes sur le la glace (4°C). Ces deux

dernières étapes sont répétées une seconde fois. Les tubes sont ensuite

centrifugés 10 minutes à 4°C à 10'000 rpm et le surnageant, contenant le lysat

total, est récupéré. La quantité de protéines présente dans chaque tube est

déterminée par spectrophotométrie à 595 nm grâce à la méthode de Bradford

(Kit BIORAD Protein Assay). Après avoir ajouté la solution stop dénaturante de

20

Laemmli (Tris 60mM pH 6.8; SDS 2% ; β-mercapto 5% ; glycérol 10% ;

bromophénol blue 0.01%) et après avoir porté les échantillons 5 minutes à

ébulition, les protéines, chargées à quantité égale (25µg/puit), sont séparées

selon leur poids moléculaire par électrophorèse sur un gel de sodium de

dodecylsulfate polyacrylamide de 8%. Après une heure de migration à 150 mV les

protéines du gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose pendant 2

heures à 100 mV, à 4°C. Pour éviter des liaisons non spécifiques, ces membranes

sont incubées 1 heure à température ambiante dans du tampon de blocage. Elles

sont ensuite lavées 3x10 minutes dans du tampon de lavage, puis incubées avec un

anticorps polyclonal anti-COX-2 spécifique (stock:0.5 mg/ml) dilué (1:1000) dans

du tampon d'incubation pendant 2 heures. Les membranes sont à nouveau lavées

et incubées 1 heure avec un anticorps secondaire anti-lapin couplé à une

perroxydase (HRPeroxydase) et dilué (1:2000). Avant de révéler les bandes

immunoréactives par chemioluminescence (ECL), une étape de 6 fois 10 minutes

de lavages est nécessaire.

2.4.) Statistiques :

Les tests statistiques suivants ont été utilisés : test de T de Student-Fisher,

pour paires non-appariées, le “one-way analysis of variance” (ANOVA). Une

probabilité p<0.05 est acceptée comme statistiquement significative.

21

III. RESULTATS

1) EFFET DE L’ANGIOTENSINE II ET DE L’ENDOTHELINE SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2

L’angiotensine et l’endothéline sont deux hormones qui stimulent la production de

prostacyclines dans les cardiomyocytes ventriculaires [65, 66]. Les analyses de

notre laboratoire par électrophorèse et immunodétection (Western blot) de

l’expression de la COX-2 montrent que ces deux hormones augmentent

l’expression de la COX-2 dans ces cellules cardiaques. Ces résultats sont

illustrés dans les figures 1a et 1b qui présentent la cinétique de l’induction de la

COX-2 par l’AngII (2x10-7 M) et par l’ET-1 (10-7 M).

Cette induction est dépendante du temps. Après une heure d’incubation avec

l’ET-1 et l’AngII, on observe une augmentation de l’expression de la COX-2 de

208 ± 21% du contrôle et de 171 ± 12% du contrôle respectivement, par rapport

aux cellules non stimulées. Dans le cas de la stimulation par l’ET-1, la stimulation

descend légérement dès deux heures. En ce qui concerne l’AngII, l’effet

stimulant qu’elle exerce sur l’expression de la COX-2 atteint un plateau dès une

heure de stimulation.

22

100

150

200

CO

X-2

(% d

u co

ntrô

le)

temps (h)

*

*

*

*

***

0 4321

AngII

Et-1

Contrôle

Fig. 1a et 1b : Cinétiques de l’expression de la COX-2 induite par l’AngII et l’ET-1 dans les

cardiomyocytes ventriculaires. Analyse des Western blots par densitométrie

Les cellules cardiaques ont été incubées pendant 30 min, 1h, 2h et 4h avec de l’AngII (2x10-7M)

ou avec de l’ET-1 (10-7M). La quantité de COX-2 présente dans les cellules a été déterminée par

l’analyse densitométrique du western blot. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et

représentent les moyennes + sem de 4 expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport au

contrôle.

23

COX-2 ET-1

COX-2 AngII

0 1 2 4 0.5

Fig. 1c : Western blot illustrant la cinéti

(2x10-7 M) et l’ET-1 (10-7 M) dans les

représentative de 3 expériences indépendan

temps

que de l’expression de la COX-2 induite par l’AngII

cardiomyocytes ventriculaires. Cette figure est

tes.

24

2) EFFETS DE L’ALDOSTERONE SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2:

2.1) Stimulation des cellules avec de l’ET-1 (Fig.2)

Dans les cardiomyocytes ventriculaires, nous avons observé une expression

basale de la COX-2 (Fig 1b et 2b). L’analyse densitométrique des western blots

démontre que cette expression est légèrement, mais pas significativement

réduite après 3h d’incubation avec de l’aldostérone (10-6M). En revanche, après

20h d’exposition à l’aldostérone, l’expression de la COX-2 est réduite à 35 ± 5%

des valeurs contrôles. Lorsque les cellules sont stimulées avec de l’ET-1, la

préincubation avec de l’aldostérone pendant 3h abolit l’expression de la COX-2

induite par l’ET-1. Un prétraitement de 20h avec l’aldostérone n’abolit pas

seulement l’effet de l’ET-1, mais réduit l’expression de la COX-2 à 36 ± 13% des

valeurs contrôles, un résultat très semblable à celui obtenu avec des cellules non

stimulées.

25

ctrl Et-10

100

200basalaldo 3haldo 20h

CO

X-2

(% d

u co

ntrô

le)

*

*

+

*+

Fig.2a : Effet de l’aldostérone sur l’expression de la COX-2 dans des cardiomyocytes

ventriculaires stimulées avec de l’ET- (101 t-7 M). Analyse des Western blot par densitomé rie

Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans ET-1 (10-7M) pour une durée de 3h, en présence

ou en absence d’aldostérone (10-6 M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h ou 20-24h

avec de l’aldostérone (10-6 M). Les colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM de 4-5

expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport aux valeurs basales, dans des cellules non

stimulées. t=p<0.05 par rapport à la COX-2, dans des cellules stimulées par l’ET-1

26

COX-2

Ctrl ET-1 aldo 3h aldo 20h aldo 3h aldo 20h + ET-1 + ET-1

Fig 2b : Western blot représentant l’effet de l’aldostérone sur l’expression de COX-2 dans les

cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’ET-1 10-7 M

2.2) Stimulation des cellules avec de l’angiotensine II (Fig.3)

L’analyse densitométrique des Western blots démontre que l’expression de la

COX-2 est légèrement, mais pas significativement réduite après 3h d’incubation

avec l’aldostérone (10-6M). Par contre, après 20h d’exposition à l’aldostérone,

l’expression de la COX-2 est réduite à 35 ± 5 % des valeurs contrôles. Lorsque

les cellules sont stimulées avec de l’AngII, la préincubation avec l’aldostérone

pendant 3h abolit l’expression de la COX-2 induite par l’AngII. Un prétraitement

de 20h avec l’aldostérone n’abolit pas seulement l’effet de l’AngII, mais réduit

l’expression de la COX-2 à 38 ± 8% des valeurs contrôles, un résultat très

semblable à celui obtenu avec des cellules non stimulées.

27

ctrl Ang II0

100

200

basalaldo 3haldo 20h

CO

X-2

(% d

u co

ntrô

le)

+

+

*

* *

Fig.3a : Effet de l’aldostérone sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes

ventriculaires stimulés avec de l’AngII (2x10-7 M).

Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans AngII (2x10-7M) pour une durée de 3h, en

présence ou en absence d’aldostérone (10-6 M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h

ou 20-24h avec de l’aldostérone (10-6 M). Les colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM

de 4-5 expériences indépendantes. Analyse des Western blots par densitométrie. *=p<0.05 par

rapport aux valeurs basales dans des cellules non stimulées. +=p<0.05 par rapport à la COX-2 dans

des cellules stimulées par l‘AngII.

28

ctrl AngII aldo 3h aldo 20 aldo 3h aldo 20h +AngII +AngII

COX-2

Fig 3b: Western blot représentant l’effet de l’aldostérone (10-6 M sur l’expression de la COX

2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’Angiotensine II (2x10

) --7 M).

2.3) Stimulation des cellules avec de l’angiotensine II et expression de la

COX-2 en fonction de la variation de la concentration d’aldostérone (Fig.4)

Les résultats exprimés dans la Fig. 4 montrent que l’expression de la COX-2 sous

l’effet de l’aldostérone dépend de la concentration d’aldostérone utilisée. L’effet

inhibiteur que l’aldostérone exerce sur l’expression de cet enzyme induit par

l’AngII augmente de manière linéaire entre des concentration qui passent de 1 à

100 nM. L’aldostérone inhibe également l’expression de la COX-2 basale, mais de

manière non linéaire.

29

0 1 10 1000

100

200

aldoaldo + Ang II

aldostérone (nM)

CO

X-2

(% d

u co

ntrô

le)

Fig.4a : Variation de la concentration d’aldostérone et son effet sur l’expression de la COX-2

dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’AngII (2x10-7 M). Les cellules ont été

incubées soit avec, soit sans AngII (2x10-7 M) pour une durée de 3h, en présence ou en absence

de différentes concentrations d’aldostérone. Les cardiomyocytes ont été incubés pour une durée

de 20-24h avec l’aldostérone, à des concentrations variant de 1 à 100 nM. La COX-2 a été

révélée par électrophorèse et immunodétection (western blot).

30

COX-2

ctrl AngII aldo aldo aldo aldo aldo aldo 10-7 10-7 10-8 10-8 10-9 10-9

+AngII +AngII +AngII

Fig. 4b : Western blot représentant l’effet de l’aldostérone sur l’expression de la COX-2 en

fonction de la variation de concentration d’aldostérone.

31

3) EFFETS DE L’OESTRADIOL SUR L’EXPRESSION DE LA COX-2 DANS LES

CARDIOMYOCYTES VENTRICULAIRES:

3.1)Stimulation des cellules avec de l'ET-1 (Fig.5)

Contrairement à l'aldostérone, l'oestradiol (E2) ne produit aucun effet sur l'expression basale de la COX-2. Toutefois, l’induction de la COX-2 par l’ET-1 est légèrement, mais pas significativement inhibée par l’oestradiol. Cet effet inhibiteur est le même pour 20h et 3h de traitement à l’oestradiol.

Fig. 5a : Effets de l'oestradiol sur l'expression de la COX-2 dans des cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l'ET-1 (10-7 M).

33

Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans ET-1 (10-7M) pour une durée de 3h en présence ou en absence d’oestradiol (10-6M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h ou 20-24h avec l’oestradiol (10-6M). Ces colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM de 5 expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport aux valeurs basales dans des cellules non stimulées.

Fig 5b : Western blot représentant l’effet de l’oestradiol sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’ET-1.

3.2) Stimulation des cellules avec de l'Angiotensine II (Fig.6) Les résultats illustrés dans cette figure sont très semblables à ceux illustrés dans la figure 5: en absence de stimulation avec l'hormone, une incubation de 3h ou de 20h avec de l’E2 10-6M ne provoque pas de changement statistiquement significatif dans l'expression de la COX-2. En revanche, dans des cellules stimulées avec de l'AngII (2x10-7M), un prétraitement de 3h ou de 20h avec de l’E2 (10-6M) abolit l’expression de la COX-2 induite par l’AngII.

34

Fig.6a : Effets de l'oestradiol sur l'expression de la COX-2 dans des cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l'AngII (2x10-7 M). Les cellules ont été incubées, soit avec, soit sans AngII (2x10-7M) pour une durée de 3h en présence ou en absence d’oestradiol (10-6M). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 3h ou 20-24h avec l’oestradiol (10-6M). Les colonnes représentent les valeurs moyennes ± SEM de 6 expériences indépendantes. *=p<0.05 par rapport aux valeurs basales dans des cellules non stimulées. +=p<0.05 par rapport à la COX-2 dans des cellules stimulées avec de l’AngII.

Fig 6b : Western blot représentant l’effet de l’oestradiol sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’Ang II.

35

3.3) Stimulation des cellules avec de l'AngII et expression de la COX-2 en fonction de la variation de la concentration de l'oestradiol Une expérience dans laquelle nous avons utilisé des concentrations de 1 à 1000nM indique que des concentrations de 10 à 100nM ont des effets similaires à la concentration utilisée dans les expériences décrites dans ce travail (10-6 M); cette concentration n'est donc pas toxique pour les cellules musculaires cardiaques ventriculaires. En revanche, une concentration de 1 nM ne semble provoquer aucun effet; elle est donc insuffisante.

Fig.7 : Variation de la concentration d’oestradiol et son effet sur l’expression de la COX-2 dans les cardiomyocytes ventriculaires stimulés avec de l’AngII (2x10-7M). Les cellules ont été incubées soit avec, soit sans AngII (2x10-7M) pour une durée de 3h, en présence ou en absence de différentes concentrations d’oestradiol (1-1000 nM). Les cardiomyocytes ont été incubés pendant 20-24h avec les différentes concentrations d’oestradiol.

36

IV. DISCUSSION :

1) INDUCTION DE LA COX-2 PAR L’ANGIOTENSINE ET L’ENDOTHELINE

Pour la première fois, nous avons démontré dans les cardiomyocytes

ventriculaires que l’AngII et l’ET-1 induisaient la COX-2 de manière dépendante

du temps. Les premières expériences concernant l’induction de la COX-2 étaient

réalisées avant tout avec des cytokines. Récemment, il a été découvert que des

hormones telles que l’AngII et l’ET-1 pouvaient induire l’expression de la COX-2

dans certaines cellules. En effet, il a été démontré dans le muscle lisse

vasculaire que l’AngII induisait la COX-2 [67].

Young et al (2000) ont montré dans ces mêmes cellules une cinétique de

l’induction de la COX-2 semblable à celle vue dans des cellules stimulées avec une

cytokine, comme le TNF-α, ou avec de l’AngII. [68].

L’AngII était déjà connue pour augmenter la production de PG dans les cellules

mésangiales et les cellules endothéliales [69, 70].

Il a été démontré récemment par une équipe allemande qu’après un infarctus du

myocarde, une activation des fibroblastes cardiaques par l’AngII entraînait une

forte expression de la protéine COX-2, dépendante du temps [71].

En revanche, chez le rat, Cheng et al (1999) [72] ont observé qu’au niveau des

cellules de la macula densa du rein, l’AngII inhibe l’expression de la COX-2

stimulée par l’ester de phorbol ; le mécanisme d’action n’a pas encore été élucidé

En ce qui concerne l’ET-1, plusieurs groupes ont étudié l’effet de l’ET-1 sur

l’expression de la COX-2 dans les cellules mésangiales [73, 74, 75]. Hughes et al

(1995) [73] ont notamment démontré par une étude récente que l’ET-1 induisait

de manière prolongée la production de PGE2 dans les cellules mésangiales et

augmentait l’action de la COX-2 avec un net effet à une heure et un plateau d’une

37

durée d’environ 6 heures. Une étude japonaise [76] rapporte que l'endothéline

active l'expression de la COX-2 dans les astrocytes en culture, ce qui suggère

que l'ET est impliquée dans la régulation des fonctions des astrocytes.

2) LA MODULATION DE L'’EXPRESSION DE LA COX-2 PAR DES

HORMONES STEROÏDIENNES : ALDOSTERONE ET OESTRADIOL :

Notre étude montre que dans les cardiomyocytes, la COX-2 n’est pas seulement

induite, mais est également exprimée à l’état basal, dans des cellules qui durant

24 heures ont été déprivées de sérum. Cette observation est en accord avec

deux autres études. Sorli et al (1998) [77] ont démontré que dans les îlots

pancréatiques, la COX-2 est exprimée à l’état basal et après stimulation avec

l’interleukine-1. De même, Cheng et al (1999) [72] ont observé que dans les

cellules cTALH dans la région de la macula densa, la COX-2 est exprimée à l’état

basal en absence de stimuli externes.

Dans cette étude, nous avons également démontré que des hormones

stéroïdiennes telles que l’aldostérone et l’oestradiol entraînaient une modulation

de l’expression de la COX-2.

Nous avons constaté que l’aldostérone exerçait un effet négatif sur l’expression

de la COX-2 dans des cardiomyocytes ventriculaires. Un traitement de 3h avec

de l’aldostérone n’a pas d’effet sur la COX-2 basale, tandis qu’il abolit la COX-2

induite par l’ET-1 et l’AngII. Des incubations à long terme (20-24h) avec de

l’aldostérone réduisent à 35% l’expression de la COX-2 dans des cellules

contrôles et stimulées.

38

A notre connaissance, aucune étude n’a été publiée sur l’effet de l’aldostérone

sur la COX-2 dans le cœur, ni dans d’autres cellules.

Dans ce travail, nous avons également constaté que l’effet inhibiteur de

l’aldostérone dépendait le la concentration de l’hormone. Une concentration de

10-8 M provoque un effet inhibiteur significatif, ce qui indique que cet effet est

spécifique du récepteur aux minéralocorticoïdes. En effet, l’aldostérone active le

récepteur aux glucocorticoïdes uniquement à des concentrations > 10-7 M [78].

Néanmoins, d’autres expériences utilisant des inhibiteurs spécifiques aux

récepteurs corticoïdes seront nécessaires pour confirmer cette voie de

signalisation.

Quant à l’oestradiol, il abolit uniquement la COX-2 induite par l’AngII, mais n’a

pas d’effet significatif sur la COX-2 induite par l’ET-1. De même, l’oestradiol n’a

pas d’effet sur l’expression basale de la COX-2.

L’effet de l’oestradiol sur l’expression de la COX-2 a déjà été étudié dans

différents types cellulaires. Engstrom et al (2001) [79] ont démontré dans le

myomètre du rat non gravide une augmentation de la production d’ARNm de la

COX-2 sous l’influence de l’oestradiol. Par contre, dans l’utérus gravide de lapin,

l’oestradiol semble inhiber la production de prostaglandines E2 après suppression

de l’expression de la COX-2 stimulée par l’IL-1, ce phénomène permettrait donc

d’inhiber le déclenchement du travail, par inhibition de la production de PGE2

[80]. L’effet de l’oestradiol semble donc être dépendant des conditions

physiologiques d’un tissu spécifique.

Des études plus approfondies sont nécessaires pour déterminer à quel niveau

l’aldostérone et l’oestradiol interviennent. Il s’agirait de voir si elles inhibent

l’activité du promoteur de la COX-2 et/ou si elles accélèrent la dégradation de

l’ARNm de la COX-2.

39

En conclusion, notre étude montre que dans le cardiomyocyte ventriculaire, la

COX-2 est exprimée à l’état basal. L’AngII et l’ET-1 augmentent cette

expression de manière dépendante du temps. Quant à l’aldostérone et à

l’oestradiol, ils ont un effet modulateur négatif sur l’expression de la COX-2.

40

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