méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire laurence...
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Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulairede protéines d’adhérence cellulaire
Laurence Martel
19 décembre 2002
UMR 5819 CNRS-CEA-UJF
Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
C-Cadhérine : résolution 0,308 nm(T. Boggon et al. 2002)
Positions des atomes
Relations structure/fonction des protéinesRelations structure/fonction des protéines
• Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de
• Cristaux 3D par Rayons X
résolution atomique (jusqu’à 0,1 nm)
Objectifs de cette étudeDévelopper une méthodologie pour étudier les interactions
entre protéines immobilisées et protéines en solution
• Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm
Hypothèses sur la fonction de la protéine
• Formation de complexes de protéines
– Immobilisation des protéines sur une surface
Informations sur les interactions entre protéines
Reconstruction 3D de la structureEnveloppe de la protéine
Sticholysine II : résolution 1,5 nm(Martin-Benito et al. 2000)
1,2nm
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
1ère Étape : Formation d’une monocouche de lipides à la surface de l’eau– Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni2+ : Ni-NTA-DLGE– + Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche
lipides ligandslipides diluants
OO
O
O
O
O
NHO
N
O
OH
OOH
OOH
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
2ème Étape : Injection de protéines
Ancrage par liaison de coordination
histidine-nickel
Exemple: Injection de cadhérines-His6
Exemple: Injection de fragments
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase
Étude des interactions entre protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
Étude des interactions entre protéines
Techniques d’étude expérimentaleTechniques d’étude expérimentale
Informations recherchées
Mesurer la quantité de protéines ancrées aux lipides– Sans marqueur
– Sans transfert de la couche de protéines
Suivi de l’évolution en temps réel et in situ
– Ellipsométrie à la surface de l’eau
Résolution 0,5 mg/m2 = 0,5 ng/mm2
– Résonance des plasmons de surface sur surface solide
Déterminer la structure verticale de la couche
– Réflectivité des rayons X
Résolution verticale 1 nm
1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Ligne de lumière Troïka II, ESRF (Responsable O. Konovalov)
Goniomètre Cellule échantillon
Faisceau synchrotron monochromatique
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
Réf
lect
ivité
(I/I
0)
0.50.40.30.20.10q z (Å
-1)
qc
1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
Mesure de l’intensité réfléchie spéculaire
sin4
irzq kk
Réflectivité I/I0
Cas d’une interface simple :Air-Eau
qz-4
1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
Ré
flect
ivité
(I/I
0)
0.50.40.30.20.10q z (Å
-1)
Lipides Ni-NTA-DLGE
qc
Réflectivité I/I0
Cas d’une couche sur un substrat :Lipides sur eau
1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante
– Monocouche de fragments de C-cadhérine
– Lipides ligands Ni-NTA-DLGE
Cas d’une couche complexe sur un substrat :
Protéines ancrées aux lipides sur eau
Courbe de réflectivité complexe• Avantage de l’ESRF : la brillance du faisceau
synchrotron permet de mesurer jusqu ’à des vecteurs de diffusion q~0,5 Å-1 soit une résolution de ~6,5 Å
• Nécessité d’une méthode d’analyse des données avec un modèle du système étudié
2. Ellipsométrie2. Ellipsométrie
Suivi des variations des angles ellipsométriques et en fonction du temps, de , de
...,,,,.tan 110 dnnfer
r i
s
p
Relation entre la mesure et l’indice de réfraction 3
2
1
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
180
150
120
90
60
30
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
Cas des lipides sur l'eau
Indice eau n=1.333
Paramètres des lipides : n=1.448 d=2,5 nm
Mesure du rapport des coefficients de réflexion des polarisations p et s de la lumière autour de l’angle de Brewster
3
2
1
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
180
150
120
90
60
30
0
(°)
5554535251Angle d'incidence (°)
2. Ellipsométrie2. Ellipsométrie
Suivi de l’adsorption de C-cadhérine à une monocouche de lipides ligands Ni-NTA-DLGE [Ca2+] = 0,5 mM
Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30
Conséquences– Non-linéarité de la variation de et de
avec l’adsorption à angle fixe– Interprétation des mesures cinétiques ?
Problème soulevé pour une couche épaisse (>10nm)
– Déplacement de la courbe ellipsométrique angulaire vers les grands angles
2h
2h17h30
17h30
Modélisation du système lipides+protéinesModélisation du système lipides+protéines
Objectif : Comparer les données expérimentales avec une courbe théorique pour déduire les paramètres (, d) caractérisant le système
Programmes de calcul : – Réflectivité X : Parratt32 (HMI Berlin), R. Ober
Paramètres ajustables : densité électronique , épaisseur d, rugosité – Ellipsométrie (et Résonance de Plasmon de Surface) : ce travail
Paramètres ajustables : indice de réfraction n, épaisseur d
Système à N couches (, d)N
• Équations de Fresnel
• Simulation des courbes par un calcul matriciel d’Abélès
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
Réf
lect
ivité
(I/I
0)
0.50.40.30.20.10q z (Å
-1)
Lipides Ni-NTA-DLGE
qc
Réflectivité des rayons X en incidence rasanteRéflectivité des rayons X en incidence rasante
Chaîne carbonée Tête polaire et groupement Ni-NTA
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
6040200-20Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
Réflectivité I/I0Modèle de profil de densité électronique des lipides • 2 couches : 7 paramètres d'ajustement (,d,)
Air Eau
Réflectivité des rayons X en incidence rasanteRéflectivité des rayons X en incidence rasante
Modèle de profil de densité électronique d’une monocouche de fragments de C-cadhérine
• 30 couches : d=0,7 nm, =0 nm 30 paramètres d'ajustement ()N
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niq
ue
(e.Å
-3)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
• Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits
Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :masse adsorbée par unité de surfacemasse adsorbée par unité de surface
dzRz
mmg emPOHP
OHelX
2
22 )()/(
Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipidesEllipsométrie [Ca2+] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca2+] = 5 mM
Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m2 Après 4h : 8,1 mg/m2
Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m2
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
<P> ~ 0,417 e.Å-3 : densité électronique moyenne de la protéine
Rem rapport masse / électron dans la protéine sèche
• Ellipsométrie : Approximation de De Feijter et al. (1978)
)Å()/( 22
POHP
el h
dcdn
nnmmg
dn/dc ~ 0,19 cm3/g : incrément d’indice de la solution de protéine
RésultatsRésultats
Mises au point1. Technique d’élaboration de monocouches de protéines2. Techniques expérimentales d’analyse de surface complémentaires3. Modélisation du système en multicouches
Ellipsométrie
• Mesure des angles ellipsométriques et
• Ajustement pour obtenir <n> et <h>
• Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides
• Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes
Réflectivité des rayons X
• Mesure de l’intensité réfléchie
• Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface
• Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides
Application à l’étude des interactions entre protéines d’adhérence cellulaire
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Exemple des cellules de l’endothélium vasculaire
Plusieurs familles de Protéines d’Adhérence Cellulaire
Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Famille des cadhérines
– Glycoprotéines transmembranaires
– Sur tous types de cellules
– Différentes cadhérines selon les cellules :• VE-cadhérine humaine
(Vascular Endothelium)
• C-cadhérine de Xenopus
– 5 domaines extracellulaires homologues (EC)
– 12 ions Ca2+/cadhérine pour un bon repliement
~23nm
Interaction entre molécules d ’adhérenceInteraction entre molécules d ’adhérence
Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine
parallèles et anti-parallèles
Concentrations critiques en calciumPerz et al. 1999
mM [Ca2+]
0
0,05
0,5
1
pas d’interaction
dénaturation
cis
trans
Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?
Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?
Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution
C-cadhérine : Interactions transselon 3 alignements
(mesures de force de surface)
E- et N-cadhérine : Interaction trans par domaines N-terminaux
Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?
VE-cadhérine : Formation d’hexamères du fragment VE-EC1-4
modèle d’interaction trans
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?
Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?
Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution
Les protéines recombinantes étudiéesLes protéines recombinantes étudiées
C-cadhérineCollaboration Deborah Leckband - UIUC, Urbana
Fragment principal : C-EC1-5 His
VE-cadhérineCollaboration Danielle Gulino - IBS, Grenoble
Fragment principal : VE-EC1-4 His
~19 nm
Parties extracellulaires seulement
~23 nm
Objectif de l’étude des cadhérinesObjectif de l’étude des cadhérines
Approche expérimentale
Caractérisation de couches de cadhérines• par ellipsométrie : masse adsorbée
• par réflectivité X : structure verticale
1) Variation de la concentration en calcium• Suivi de la masse adsorbée
• Évolution de la structure des couches
2) Interactions entre fragments de différentes longueurs
Questions posées
Structure et alignement cis ou trans
• le long des complexes de C-cadhérine?
• le long des hexamères de VE-cadhérine?
Monocouche de C-cadhérine en présence de Monocouche de C-cadhérine en présence de calciumcalcium
Monocouche de fragments C-EC1-5His avec [Ca2+] = 5 mM
– Lipides ligands Ni-NTA-DLGE
– Après 4 heures d’incubation
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
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ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
Épaisseur totale ~16 nm
Modèle d’interactions des cadhérines dans la couche
Complexes cis ou trans ?
• D’après la structure de T. Boggon et al. (2002)• Inclinaison moyenne de 50° / surface
Influence de la concentration en calcium sur une Influence de la concentration en calcium sur une couche de cadhérinescouche de cadhérines
Cadhérine sensible aux variations de la concentration calcium ?
Monomères ou
complexes cis
Complexes trans
[Ca2+] > 1 mM
Perte de masse due àDécrochement de cadhérines Dissociation des complexes
Pas de variation attendue
- calcium
[Ca2+] < 0,5 mM
Influence de l’agent chélatant d’ions divalents EGTA sur une monocouche de C-cadhérine
Dissociation de complexes de C-cadhérineDissociation de complexes de C-cadhérine
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
(°)
20191817Temps (h)
180
170
160
150
140
130
(°)
EGTACalcium10 mM10 mM
=459 nm, =52°5
A B C
Ellipsométrie : Suivi cinétique de et Masse apparente de protéine adsorbée
[Ca2+] =10mM[EGTA]=10mM[Ca2+] =5mM
-5%-17%
6,7 mg/m25,8 mg/m27,0 mg/m2
CBA
Perte de masse après l’ajout d’EGTA
La masse initiale de C-cadhérine est retrouvée à 95% par simple ajout de calcium
34% des fragments en complexes trans
Dissociation de complexes de C-cadhérineDissociation de complexes de C-cadhérine
À partir d’une couche élaborée sur forte concentration en calcium
3
4
5
6
789
10-8
2
3
4
5
6
789
10-7
2
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.30.20.10q z (Å
-1)
C-EC1-5His 1 mM Ca2+
Lipides Ni-NTA-DLGE Expérience Ajustement
3
4
5
6
789
10-8
2
3
4
5
6
789
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2
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.30.20.10q z (Å
-1)
C-EC1-5His
Dilué à 0,1 mM Ca2+
Lipides Ni-NTA-DLGE Expérience Ajustement
Dilution de la sous-phaseRéflectivité X
Conclusion
Pertes de masse et déstructuration des couches de C-cadhérines
0.42
0.40
0.38
0.36
0.34
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
200150100500Distance (Å)
[Ca2+
]=1 mM initial
Puis [Ca2+
]=0.1 mM
Profils de densité électronique
Perte de masse après dilution30% de fragments en complexes trans-15%
6,4 mg/m27,5 mg/m2
Conclusion sur la C-cadhérine Conclusion sur la C-cadhérine
• Cadhérines immobilisées sensibles au calcium
• Cadhérines inter-digitées dans la monocouche
• Dissociation de complexes trans de C-cadhérines
Mais …Les fragments possèdent tous une étiquette histidine
5
1
5
1 5
15
15
1
5
1
EGTA 75 mM
a) b) c)
NiCl2 75 mM
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1 5
15
15
1
5
1
EGTA 75 mM
a) b) c)NiCl2 75 mM
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
[Ca2+] = 1 mM [Ca2+] = 0,1 mM
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Localisation des interactions entre cadhérine le long de la protéine ?
Interactions établies en solution entre fragments identiques de VE-cadhérine
(S. Bibert et al. 2002)
Trois mélanges de fragmentsVE-EC1-4 et de fragments courts
Rapport 1:100 (EC1-4:court) pour favoriser la formation de complexes mixtes en solution
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 seul
His6
10-10
10-9
10-8
10-7
Réf
lect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His 5 mM Ca2+
Lipides Ni-NTA-DLGE
Expérience Ajustement
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
De
nsi
té é
lect
ron
iqu
e (
e.Å
-3)
300250200150100500Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His
eau
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Épaisseur totale ~ 21 nmHexamères en surface ?
Fragment 1-4 seul
~19 nm~23,3 nm
His6
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 1-3
10-10
10-9
10-8
10-7
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His + VE-EC1-3Lipides Ni-NTA-DLGE
Expérience AjustementHis6
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30D
en
sité
éle
ctro
niq
ue
(e
.Å-3
)300250200150100500
Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3
eau
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 1-3
Profil de densité électronique similaireau cas du fragment 1-4 seul
His6
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 2- 4
810
-9
2
4
6
810
-8
2
4
6
810
-7
2
Réf
lect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His + fragmentsLipides Ni-NTA-DLGE
Lipides VE-EC2-4His6
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 2- 4
• Profil similaire à celui des lipides• Pas d'interaction lipide-cadhérine
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
De
nsi
té é
lect
ron
iqu
e (
e.Å
-3)
6040200Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC2-4
Fragment 1-4 +fragment 1-3
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
300250200150100500Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3
eau
His6
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 3-4
810
-9
2
4
6
810
-8
2
4
6
810
-7
2
Ré
flect
ivité
x q
z4
0.40.30.20.10.0q z (Å
-1)
VE-EC1-4His + fragmentsLipides Ni-NTA-DLGE
Lipides VE-EC3-4His6
Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine
Fragment 1-4 + fragment 3-4
• Profil similaire à celui des lipides• Pas d'interaction lipide-cadhérine
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0D
en
sité
éle
ctro
niq
ue
(e
.Å-3
)
6040200Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC3-4
Fragment 1-4 +fragment 2-4
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
De
nsi
té é
lect
ron
iqu
e (
e.Å
-3)
6040200Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC2-4
Fragment 1-4 +fragment 1-3
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
300250200150100500Distance (Å)
Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3
eau
His6
Modèles d’interaction entre cadhérines
• Ancrage de protéines aux lipides dans le cas du mélange EC1-4/EC1-3
• Pas d’ancrage de protéines aux lipides dans le cas des mélanges EC1-4/EC2-4 et EC1-4/EC3-4
Conclusion sur la VE-cadhérine Conclusion sur la VE-cadhérine
Entre fragments de longueurs différentes
Importance du domaine EC4La formation de complexes bloque l’étiquette histidine
Dans l’hexamère
?
Conclusion sur la VE-cadhérine Conclusion sur la VE-cadhérine
Modèles d’interaction entre cadhérines
En plusieurs étapes ?
Formation de complexes cis puis de complexes trans
Mélange de complexes en surface ?
Sur la méthodologie développée
• Ellipsométrie
– Nécessaire prise en compte de la non-linéarité de et de avec l’adsorption (mesures à angle fixe)
– Estimation quantité de matière adsorbée en surface, Résolution 0,5 mg/m2
– Suivi de la quantité de matière adsorbée en temps réel
• Réflectivité des rayons X
– Des profils de densité électronique complexes rendent compte de changements fins dans la couche de protéines
Résolution ~ 1 nm (suivant la normale à la couche)
ConclusionsConclusions
Sur l’étude des cadhérines
• Dissociation de complexes et déstructuration de la monocouche de C-cadhérine par appauvrissement de la sous-phase en calcium
Il existe des complexes anti-parallèles totalement enchevêtrés en surface
• Importance du domaine EC4 dans les interactions entre fragments de VE-cadhérine
Hexamères en surface ?
PerspectivesPerspectives
Étude des Cadhérines– Étude des interactions entre cadhérines immobilisées avec
• Un plus grand nombre de fragments courts différents
• Fragments sans étiquette histidine
– Structure de complexes cristallisés à 2 dimensions (VE-cadhérine : thèse R. Al-Kurdi)
– Questions ouvertes
• Observations de différences d’affinités en surface et en volume
• Faible action de l’agent chélatant EGTA sur le nickel des lipides ligands ?
Modélisation de la Réflectivité X– Améliorer la modélisation en tenant compte de
• Couches d’épaisseurs variables• Conservation du nombre d’électrons dans une couche
Monocouche de protéines sur Surfaces Solides– Manipulation des échantillons facilitée
– Étude par Résonance de Plasmons de Surface et Réflectivité de rayons X durs
PerspectivesPerspectives
Appareil de mesure de la Résonance de Plasmons de Surface
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