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Les méthodes d’analyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

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Page 1: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Les méthodes d’analyse des

transcrits différentiels

Christine Bole-Feysot

Page 2: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

INTRODUCTION

Qu’est-ce qui caractérise une cellule ?-les gènes exprimés-leur niveau d’expression

Les mécanismes moléculaires à l’origine de tous les processus biologiques normaux et pathologiques

passent par des modifications quantitatives et qualitatives des ARN et des protéines.

Méthodes permettant de repérer et d’identifier les ARN et les protéines dont la

quantité varie

Page 3: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

La régulation de l’expression des gèneschez les organismes eucaryotes

Page 4: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Définitions

Protéome : ensemble des protéines présentes dans une cellule ou un tissu

Transcriptome : ensemble des ARN présents dans une cellule ou un tissu

Transcrit ou Protéine différentielle :Transcrit ou Protéine dont la quantité est modifiée ( ou )

Page 5: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Historique des techniques d’analyse des transcrits différentiels 

   Technologies appliquées aux ADNc

 Techniques d’analyse des transcrits différentiels dérivées

 Caractéristiquede l’analyse 

 

Années 80

 Banques d’ADN complémentaires

 Banques soustractives

 QualitativeNon exhaustive 

 

Années 90

 PCR

 -Differential Display,CDNA-AFLP-RDA-SSH 

 QualitativeNon exhaustiveFacile à réaliser

 Fin années 90

 Séquençage systématique :-de génomes entiers-de séquences exprimées (EST)Bio-informatiqueMicrotechniques appliquées à la biologie moléculaire 

 -SAGE-microarrayspuces à ADN (« DNA chips »)

 Quantitative« exhaustive »lourde et onéreuse

Page 6: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Cellules A

ARNm A

ADNc A

Cellules B

ARNm B

ADNc B

BANQUE SOUSTRACTIVE

dNTP-Biotine

Hybridation

A /A A /B B /B

Banque soustractive A-B

Elimination des ADNc portant de la biotine

Page 7: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Méthodes d’analyses des transcrits différentielsA PETITE ECHELLE

mRNA Differential Display

PCR soustractive :Representational Difference Analysis (RDA)Subtractive Suppressive Hybridization (SSH)

Arrays sur membrane

Page 8: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

mRNA - DIFFERENTIAL DISPLAY

CMAAAAAAAAA-An

CMAAAAAAAAA-AnGMTTTTTT

GMTTTTTTAGCCAGCGAA

GMTTTTTTAGCCAGCGAA

GMTTTTTTAGCCAGCGAA

Transcription inverse

Amplification par PCR

5’-TTTTTTTTTTTTMG-3’ (T12MG)dNTPsTranscriptase inverse

5’-AGCCAGCGAA-3’ (amorce AP1)5’-TTTTTTTTTTTTMG-3’ (T12MG) dNTPs-(35S-dATP) ou -(33P-dATP)Taq polymerase

Page 9: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

ADNc A

Cellules B

ARNm B

ADNc BElectrophorèse (polyacrylamide)

mRNA - DIFFERENTIAL DISPLAY

Analyse des ADNc positifs potentiels(clonage, élimination des « faux positifs »)

A BAutoradiographie

Bande « positive »

Extraction des bandes « positives » du gel

PCR

RT(oligodT ancré)

TTTTTTTAAAAAAAAAAA

PCR (oligodT/amorce aléatoire)dATP-S35

AAAAAAAAAAA

TTTTTTTAGCCAGCAA

Cellules A

ARNm A

RT (oligodT ancré)

TTTTTTTAAAAAAAAAAA

PCR (oligodT/amorce aléatoire)dATP-S35

AAAAAAAAAAA

TTTTTTTAGCCAGCAA

Page 10: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Autoradiogramme de Differential DisplayComparaison des cellules A et B

A B A B A B A B A B A B

Page 11: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

mRNA Differential Display

Nombre d’oligonucléotides et de PCR possibles

- Transcription inverse

T AATTTTTTTTTTTTCC GG

3 possibilités 4 possibilités

12 oligonulcéotides différents

- PCR

Primer 3’ (T12MX) : 12 possibilitésPrimer 5’ (10-mers) : 16 possibilités

Nombre de PCR différentes possibles par échantillon : 12 x 16 = 192

Pour 2 échantillons : 192 x 2 = 384 PCR

Pour 2 échantillons, PCR en duplicat ou triplicat : 768 ou 1152 PCR !!!

Page 12: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Autoradiogramme de Differential Display

Induced

Induced

Constant

Comparaisons Contrôle et échantillon : C / E2 (3 PCR différentes pour C et 3 PCR différentes pour E2)

Page 13: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Avantages du mRNA Differential Diplay

Peu d’ARN nécessaire

Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes :- faiblement exprimés (en principe)- inconnus-soumis à épissage alternatif

Comparaison simultanée de plusieurs échantillons (cinétique, dose/réponse…)

Mise en évidence de régulation positive et négative

Facile à mettre en œuvre

Très rapide

Peu onéreux

Page 14: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Inconvénients du mRNA Differential Diplay

Non exhaustif -compatibilité avec les oligonucléotides de PCR-Taille des produits de PCR ne doit pas excéder 500 pb

Biais de la PCR : Grand nombre de « faux positifs »

température d’annealing trop basse PCR manque de reproductibilité

Elimination des faux positifs longue et fastidieuse

Amplification préférentielle de certains ADNc- Réduction de la complexité des ADNc- Représentation de chaque type d’ADNc très différente de celle des ARNm dont ils sont issus

Identification des ADNc pas toujours facile (dépend de l’espèce)

Page 15: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Electrophorèse (polyacrylamide)

A BAutoradiographie

Bande « positive »

Digestion enzymatique

Cellules A

ARNm A

ADNc A

Ligation d’adaptateurs

Cellules B

ARNm B

ADNc B

PCR

cDNA - AFLP

Page 16: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Principe général des techniques de PCR soustractives (RDA & SSH)

Hybridation

PCR suppressiveA - B

Sous-clonage

Banque soustractive A - B

A/A

A/B

B/B Pas d’amplification

Amplification linéaire

Amplification exponentielle

Digestion enzymatique

Cellules A

ARNm A

ADNc A

Ligation d’adaptateurs PCR

Cellules B

ARNm B

ADNc B

Digestion enzymatique

Page 17: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

REPRESENTATIONAL DIFFERENCE ANALYSIS (RDA)

Page 18: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

SUBTRACTIVE SUPPRESSIVE HYBRIDIZATION (SSH)

Banque soustractive A - B

Page 19: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Avantages de la RDA et de la SSH

Peu d’ARN nécessaire

Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes :- faiblement exprimés (SSH surtout)- inconnus-soumis à épissage alternatif

Identification facile des cDNA

Assez facile à mettre en œuvre

Rapide

Peu onéreux

Page 20: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Inconvénients de la RDA et de la SSH

Comparaison simultanée de plusieurs échantillons difficile

Non exhaustif Les cDNA doivent avoir un minimum de 2 sites de restriction pour générer des produits amplifiables.

Fabrication de 2 banques soustractives pour voir les gènes induits ET réprimés

Biais de la PCR : Amplification préférentielle de certains ADNc- Réduction de la complexité des ADNc- Détection préférentielle des transcrits différentiels abondants-Faux positifs

Page 21: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

MACROARRAYS

ADNc « positif »

indétectable

Page 22: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

MACROARRAYSAnalyse de l’expression de 96 gènes au cous du cycle cellulaire d’une lignée synchronisée

GA

G1/S

G1

G2

NS

Cellules non synchronisées (NS), en arrêt de croissance (GA), en phases G1, G1/S et G2 du cycle cellulaire.

Page 23: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Avantages des macroarrays

Peu d’ARN nécessaire

Comparaison simultanée de plusieurs échantillons (cinétique, dose/réponse…)

Choix du matériel à spotter sur les membranes :-produits de PCR : RT-PCR, plasmides ou lysats bactériens amplifiés -clones bactériens : issus de banques d’ADNc, de banques soustractives

Assez facile à mettre en œuvre (automatisation possible)

Page 24: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Inconvénients des macroarrays

Non exhaustif 

Préparation des membranes peut être longue

Attention à la qualité du matériel spotté

Cross-hybridation (faux négatifs)

Page 25: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Microarrays sur Nylon8000 gènes

Page 26: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Méthodes d’analyses des transcrits différentielsA GRANDE ECHELLE

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

Microarrays sur lames, DNA chips (puces à ADN)

Page 27: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

Page 28: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

SERIAL ANALYSIS OF GENES EXPRESSION (SAGE)

TTTTTTAAAAAA

AAAAAA

TTTTTTAAAAAA

ATTTTTTAAAAAA

B

BA

ARNm

Transcription inverse sur bille

Digestion par l ’enzyme d ’ancrage

Ligation d’adaptateurs (A ou B)

Digestion par l’enzyme d ’étiquettage

Digestion (bouts francs)Ligation

Amplification par PCR

Digestion, Concaténattion

Clonage, Séquençage

BA

Page 29: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Restriction digest double-stranded cDNA with a 4-base cutter “anchoring enzyme” (NlaIII); bind to streptavidin coated beads

GGATGCATGXXXXXXXXXXCCTACGTACXXXXXXXXXX

AAAATTTT

AAAATTTTGTAC

AAAATTTT

AAAATTTT

GGATGCATGOOOOOOOOOOCCTACGTACOOOOOOOOOO

GGATGCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGCATCCCCTACGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACGTAGG

CATGGTAC

1CATGGTAC

2

1 2

Generate cDNA primed withbiotin-oligo(dT)

Divide pool in half & ligate to different linkers (1 or 2),both of which have a restriction site for the “tagging enzyme” (BsmFI)

Restriction digest with a “reach & grab” enzyme (BsmFI) which recognizes the linker sequences and cuts downstream in a sequence independent fashion; fill-in 5’ overhang to blunt ends.

Blunt end ligate pool 1 to pool 2, and PCR amplify with primers specific to linker sequences 1 and 2

Restriction digest with same anchoring enzyme (above); gel isolate ‘di-tags’; concatenate ditags and ligate to cloning/sequencing vector

1 2

AAAATTTT

AAAATTTTGTAC

Tag 1 Tag 2

Ditag

----- CATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATG-------- GTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTAC----

Ditag Ditag

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4

SAGE

Page 30: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATAAANNNNNNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’

CATGNNNNNNNNNN : 14 pb4 pb site de restriction pour NlaIII + 10 pb étiquette (TAG) spécifique

ADNc complet5’

Page 31: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

SAGE : analyse des résultats

NB : La qualité des résultats dépend du nombre de Tags séquencés

1-Précision du SAGE:Echantillonnage de Tags statistiquement représentatif de la totalité du transcriptome : 50 000 Tags ->QuantitatifEn-dessous de 50 000 Tags les quantités relatives calculées de chaque transcrit ne sont pas constantes (pour 1000, 1500, 2000 Tags) -> seulement semi-quantitatif 2-Sensibilité du SAGE : dépend du nombre de Tags séquencés(résultats moins fiables pour les transcrits rares)

Compilation des résultats de séquençageCalcul de la fréquence d’apparition

Séquençage en série

Page 32: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Avantages du SAGE

~ ExhaustifBilan transcriptionnel

Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes :- faiblement exprimés (limite en fonction du nombre de tags séquencés)-Inconnus

Mise en évidence de régulation positive et négative

Construction de bases de données de SAGE

Page 33: Les méthodes danalyse des transcrits différentiels Christine Bole-Feysot

Inconvénients du SAGE

Techniquement difficile à mettre en œuvre

Haute capacité de séquençage nécessaire

Long et onéreux

Identification des ADNc pas toujours facile - Attention aux erreurs de séquençage (des Tags de SAGE et des bases de données)- Identification très difficile pour les espèces

« exotiques »- Comparaison d’un grand nombre d’échantillon difficile

Initialement beaucoup d’ARN nécessaireOptimisation MicroSAGE, SADE

Biais de la PCR : - Amplification préférentielle de certains ADNc (même avec des amplicons de taille identique)

- Modification de la représentation de chaque type d’ADNc par rapport à celle des ARNm dont ils sont issus

- Parfois grand nombre de Ditags identiques : artefacts