memoire magister - univ-oran1.dz
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Université d’Oran Es-Sénia
Faculté des Sciences – Département de Biologie
Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique
MEMOIRE
En vue de l’obtention du diplôme de
MAGISTER
En Nutrition Clinique et Métabolique
Présenté par
Samira ZENNAKI
Thème
Effet d’un extrait méthanolique de Globularia alypum sur la glycémie, les teneurs en lipides
plasmatiques et le statut antioxydant chez des rats rendus diabétiques par la streptozotocine
Soutenu Octobre 2007 devant le jury
Président DERDOUR A. Professeur, Université d’Oran Es-Sénia.
Examinateurs BELHADJ M. Professeur, E.H.U d’Oran MAROUF A. Docteur ès-Sciences, Université d’Oran Es-Sénia Directeur
BOUCHENAK M. Professeur, Université d’Oran Es-Sénia
Co-directeur KROUF D. Docteur ès-Sciences, Université d’Oran Es-Sénia
Année Universitaire 2007/2008
SommaireSommaireSommaireSommaire
INTRODUCTION …………………………………………………………………...…..……1
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE …………………………………………………...………....4
1. Dyslipidémies et diabète…………………………………………………………..……..….5
2. Diabète et marqueurs du stress oxydant…..………………………………………...…….…5
2.1. Stress oxydatif et défenses antioxydantes………………………………………………....5
2.1.1. Systèmes de défenses enzymatique ou primaire………………….……………..6
� La superoxyde dismutase (SOD)……………………...………………..6
� La catalase (CAT)…………………………………...………………….7
� Les glutathion peroxydases (GPx)…………………...……………..…..7
� La glutathion réductase (GSSG-Red)…………………..……….……...7
2.1.2. Les systèmes de défense non enzymatiques ou secondaire……………...…..…8
2.2. Diabète et stress oxydant………………………………………………………………….9
3. Traitement du diabète par la médecine traditionnelle……………………………………...11
3.1. Les polyphénols……………………………………………………………..………..….11
3.2. Traitement par les plantes médicinales chez le patient diabétique ………………..….…12
3.3. Traitement par les plantes médicinales chez le rat.............................................................12
MATERIEL ET METHODE S…………………………………………..………...…….....15
1. Matériel végétal………………………………………………………...……………….….15
1.1. Préparation de l’éxtrait méthanolique de Globularia alypum……..………………….….15
2. Animaux et régimes………………………………………………………..…….…….…..16
3. Prélèvement du sang et des organes………………………………...………………….…..16
4. Analyses biochimiques……………………………………………..…………………..….18
4.1. Détermination de glycémie……………………………..………………………..18
4.2. Détermination des teneurs en hémoglobine et hémoglobine glycosylée……......18
4.3. Détermination des teneurs en créatinine, urée et acide urique……...……………18
4.3.1. Détermination des teneurs en créatinine……………………………….18
4.3.2. Détermination des teneurs en urée……………………………………..18
4.3.3. Détermination des teneurs en acide urique……………………….……19
4.4. Détermination des teneurs plasmatiques en cholestérol total et en triglycérides..19
4.4.1. Dosage du cholestérol total………………………………………….…19
4.4.2. Dosage des triglycérides……………………………………………….19
5. Evaluation du stress oxydant…………………………………………….…………………19
5.1. Dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS)
urinaires, plasmatiques et érythrocytaires………………………………………19
5.2. Dosage des TBARS tissulaires …………………………………………………..20
5.3. Peroxydation des VLDL-LDL……………………………………………………20
5.4. Dosage du glutathion réductase (GSH)…………………… …………………... 21
5.5. Mesure de l’activité des enzymes antioxydantes…………………………………21
5.5.1. Superoxyde dismutase (SOD)………………… ………………………21
5.5.2. Glutathion réductase GSSG-Red)…………………………………...….21
5.5.3. Catalase……………………………………………………………...….21
6. Analyse statique……………………………………………………………………………22
RESULTATS……………………………………………...………………………………..23
1. Evolution du poids corporel (PC) des animaux et nourriture ingérée…….…..…………....23
2. Evolution de la glycémie……………………………………………...……………….…...24
3. Teneurs en hémoglobine total (Hb) et hémoglobine glycosylée (HbA1C)… …….…….....24
4. Concentration en urée, créatinine et acide urique au niveau plasmatique et urinaire……..25
5. Teneurs plasmatique en cholestérol total (CT) et triglycérides (TG)………………….…..26
6. Concentrations en substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS)………….….26
6.1. Au niveau plasmatique, érythrocytaire et urinaire………………………………26
6.2. Au niveau tissulaire (foie, cœur, muscles, tissus adipeux, cerveau et rein) …….28
6.3. Au niveau des VLDL-LDL et des HDL…………………………………………...28
7- Teneurs en glutathion réduit (GSH)…………………………….…………………………29
7.1. Au niveau des érythrocytes et du plasma…………..……………………............29
7.2. Au niveau tissulaire………………………………………………………………30
8. Activité de certaines enzymes antioxydantes ……………...........…………………………30
8.1. Au niveau des érythrocytes………….…………………………………………...30
8.2. Au niveau tissulaire………………………………………………………………31
DISCUSSION………………………………………………….…………………………….33
CONCLUSION………………………………………………………………………………38
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ………………………………………………..…40
ANNEXES…………………………………………………………………………………...48
Liste des tableauxListe des tableauxListe des tableauxListe des tableaux
Tableau I. Composition des régimes………………………………………………..…...17
Tableau II. Teneurs en hémoglobine totale et hémoglobine glycosylée………………...25
Tableau III. Teneurs plasmatiques et urinaires en urée, créatinine et acide urique……..25
Tableau IV. Teneurs plasmatiques en cholestérol total (CT) et triglycérides (TG)…..…26
Tableau V. Croissance pondérale des animaux et nourriture ingérée…………………...48
Tableau VI. Evolution de la glycémie…………………………………………………...49
Tableau VII. Teneurs en TBARS au niveau du plasma, des érythrocytes et des urines...50
Tableau VIII. Concentrations tissulaires en TBARS…………………………………....51
Tableau IX. Concentration du glutathion réduit au niveau des érythrocytes et du plasma....52
Tableau X. Concentration tissulaire en glutathion réduit………………………………..53
Tableau XI. Activité des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes……….…54
Tableau XII. Activité des enzymes antioxydantes au niveau tissulaire………………...55
LISTE DES FIGURESLISTE DES FIGURESLISTE DES FIGURESLISTE DES FIGURES
Figure 1. Génération de substances réactives à l’oxygène et système de défense
enzymatique………………………………………………………………………………….9
Figure 2. Globularia alypum …………………………………………………… ………..15
Figure 3. Croissance pondérale des animaux et nourriture ingérée……………...…………23
Figure 4. Evolution de la glycémie…………………………………………………………24
Figure 5. Teneurs en TBARS au niveau du plasma, des érythrocytes et des urines…….….27
Figure 6. Concentrations tissulaires en TBARS …………….……………………………..28
Figure 7. Concentration du glutathion réduit au niveau des érythrocytes et du plasma …...29
Figure 8. Concentration tissulaire en glutathion réduit………….……………………….…30
Figure 9. Activité des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes…………………31
Figure 10. Activité des enzymes antioxydantes au niveau tissulaire………………...……..32
ABREVIATIONS
CAT : Catalase
CT: Cholestérol total
DT1: Diabète de type 1
DT2: Diabète de type 2
Ga : Globularia alypum
GPx: Glutathion peroxydase
GSH: Glutathion réduit
GSSG-Red: Glutathion réducuase
HbA1C: Hémoglobine glycosylée
HDL : Lipoprotéine de haute densité
LDL : Lipoprotéine de basse densité
LPL : Lipoprotéine lipase
MDA : Malondialdéhyde
SOD: Superoxyde dismutase
STZ: Streptozotocine
TBA : Acide thiobarbiturique
TBARS: Substances réactives à l’acide thiobarbiturique
TG: Triglycérides
VLDL : Lipoprotéine de très haute densité
Introduction
Les maladies cardiovasculaires (MCV) représentent la première cause de morbimortalité des
patients diabétiques : 80 % des décès de ces malades sont en rapport direct avec une maladie
vasculaire (Silvestre & Lévy, 2006). Les anomalies métaboliques du diabète sucré constituent
non seulement des signes biologiques informatifs, mais aussi des facteurs de complications
dégénératives (Girley, 2006).
Le diabète de type 1 (DT1) autrefois appelé diabète insulino-dépendant (ou encore diabète
juvénile) apparaît le plus souvent de manière brutale chez l'enfant ou chez le jeune adulte. Le
DT1 est une maladie auto-immune dans 90% des cas (10% idiopathiques) aboutissant à une
destruction totale des cellules β des îlots de Langerhans (Daneman, 2006). La prévalence
DT1 est en constante augmentation, il s'agit d'un défaut primaire de sécrétion d'insuline par le
pancréas, dont l'étiopathogénie est plurifactorielle. Même traité par l'insuline exogène, le
diabète de type 1 induit, au fil de son évolution, un grand nombre de complications
(métaboliques, cardiovasculaires, neurologiques…) Gratas-Delamarche & Heyman, 2005.
En Algérie, la prévalence du diabète est en progression rapide et le nombre maximal de
personnes diabétiques varie entre 1 et 1,5 millions (Belhadj, 2005).
La streptozotocine (STZ) est un antibiotique communément employé pour induire le diabète
de type I chez le rat, elle agit en détruisant les cellules β des îlots de Langerhans insulino-
sécrétrices.
Les effets délétères du stress oxydant sur les molécules du vivant permettent de comprendre
son rôle dans un grand nombre de pathologies majeures, fréquentes ou émergentes :
athérosclérose, diabète, pathologies articulaires, maladies cardiaques, cancer, maladies
neurodégénératives (Delattre et al., 2007). Le diabète, aussi bien de type I que de type II, est
caractérisé par une augmentation du nombre de radicaux libres et une réduction des défenses
antioxydantes, tout en ayant également une composante inflammatoire (King et al., 2003).
L’hyperglycémie dans le diabète est responsable du développement du stress oxydatif
caractérisé par une augmentation de la peroxydation lipidique qui se manifeste par des
altérations du cholestérol-LDL, de la coagulation sanguine et du fonctionnement des
vaisseaux sanguins, chacune contribuant à une augmentation du risque de maladie cardio-
vasculaire (Petlevski et al., 2004).
De nombreuses plantes sont utilisées en médecine traditionnelle pour leurs activités
hypoglycémiante, hypolipémiante et antioxydante. L’effet hypoglycémiant et antioxydant de
certaines plantes a été étudié et confirmé chez le rat (Pepato et al., 2005; Ruzaidi et al.,
2005 ; Hannan et al., 2007) et chez les sujets diabétiques (Herrera-Arellano et al., 2004 ;
Jayawardena et al., 2005).
La plante qui fait l`objet de cette étude est Globularia alypum (Globulariaceae), elle est
localisée sur le pourtour méditerranéen dans les lieux rocailleux et broussailleux secs. Ses
noms dialectaux au Maghreb sont "Tassalgha" (Lamnaouer, 2002) et "Ain Larneb" (Es-Safi
et al., 2006). Les feuilles de Globularia sont employées comme laxatif, stomachique,
purgatif, sudorifique (Bellakhdar, 1997). Elles ont un effet antihypertensif et hypoglycémiant
(Ziyyat et al., 1997 ; Jouad et al., 2002) et sont également utilisées dans le traitement des
maladies rénales et cardiovasculaires (Jouad et al., 2001).
Un nouveau composé actif de la globulaire, le glucoside iridoïde chloruré le globularioside
vient s’ajouter aux cinq autres glucosides iridoïdes connus, le globularin, le globularicisin, le
globularidin, le globularinin et le globularimin (Es-Safi et al., 2006). Jouad et al., (2002) ont
montré que les feuilles de Globularia alypum ont un effet hypoglycémiant chez les rats rendus
diabétiques par la streptozotocine. Il a été noté que l’extrait hydrométhanolique de Globularia
alypum provoque un important effet antioxydant (Khlifi et al., 2005).
Le but de cette étude est de mettre en évidence l’impact de l’extrait méthanolique de
Globularia alypum sur la glycémie et les teneurs en lipides plasmatiques d’une part, et sur la
peroxydation lipidique et le statut antioxydant d’autre part, chez des rats rendus diabétiques
par injection de streptozotocine.
Pour cela, différentes analyses sont effectuées:
- Les marqueurs du diabète tels que la glycémie et l’hémoglobine glycosylée.
- Le fonctionnement rénal par dosage de l’urée, la créatinine et l’acide urique.
- La peroxydation lipidique par la détermination des substances réactives à l’acide
thiobarbiturique (TBARS).
- La défense antioxydante par l’estimation des teneurs en glutathion réduit et de
l’activité de certaines enzymes antioxydantes : superoxyde dismutase (SOD),
glutathion réductase (GSSG-red) et catalase (CAT).
Avant de présenter les résultats une brève revue bibliographique est réalisée sur : la
dyslipidémie au cours du diabète, le diabète et les marqueurs du stress oxydatif, le diabète et
le stress oxydant et enfin, le traitement du diabète par la médecine traditionnelle.
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Dyslipidemies et diabète
Les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de mortalité et de morbidité dans
les pays industrialisés, elle représente un tiers de tous les décès (16,7 millions) dans le monde
(OMS, 2003). Les facteurs de risque cardiovasculaires sont des éléments ou des
comportements de la vie courante dont le caractère déclenchant, favorisant ou aggravant pour
les maladies cardiovasculaires a été scientifiquement démontré.
Les facteurs de risque cardiovasculaires peuvent être divisés en deux catégories :
- Une première regroupant des facteurs qui ne sont pas modifiables tels que l’âge, le
sexe et la prédisposition génétique (antécédents de maladie cardiovasculaire précoce
chez un ascendant ou un collatéral direct).
-Une seconde comportant, entre autres, les quatre principaux facteurs de risque
cardiovasculaire et qui sont cependant modifiables, il s’agit de l’hypercholestérolémie
(un taux élevé de cholestérol-LDL (C-LDL) et faible cholesterol-HDL (C-HDL)
l’hypertriglycéridémie, l’hypertension artérielle, le tabagisme et le diabète A ces
principaux facteurs s’ajoute l’obésité, la sédentarité et le stress (Paradis &
Thivierge, 2004).
Pris en compte simultanément, ces principaux facteurs de risque expliquent, à eux seuls,
environ la moitié de l’évolution des MCV. La prévention de ces facteurs de risque à un stade
précoce permettra de freiner l'évolution de cette pathologie et d’en limiter les conséquences.
De nombreuses recommandations internationales (JNC7, ESH-ESC, EMEA) insistent sur la
nécessité de prendre en compte l’atteinte des organes cibles pour évaluer le risque de
survenue d’événements cardiovasculaires (Chobanian et al., 2003).
Le diabète chez l’adulte est associé à un risque élevé (risque de 2 à 4 fois plus élevé chez le
diabétique que chez le non diabétique) de MCV, ces maladies étant la principale cause de
décès chez les sujets atteints de diabète de type 1 ou de type 2 (Booth et al., 2002). Chez les
personnes atteintes de diabète de type 1, les concentrations plasmatiques en lipides et
lipoprotéines peuvent être normales, mais il peut y avoir oxydation et glycosylation des
lipoprotéines, ce qui peut en altérer la fonction et/ou en accroître l’athérogénicité (Van
venrooij et al., 2002).
Dans le diabète de type 1 équilibré, peu d'anomalies quantitatives des lipoprotéines sont
notées, l’activité de la lipoprotéine lipase (LPL), le taux des TG-VLDL, C-LDL et C-HDL ne
varient pas.
En revanche, en situation de déséquilibre glycémique et d'insulinopénie relative, du fait de la
lipolyse, une accumulation de substrats est observée au niveau du foie, et est responsable
d'une synthèse accrue de VLDL et donc d'une hypertriglycéridémie. En situation de
décompensation acido-cétosique lorsque l'insulinopénie est majeure, intervient
essentiellement le déficit de la lipoprotéine lipase (LPL) insulinodépendante, responsable d'un
défaut de clairance métabolique des chylomicrons et des VLDL responsables de
l'hyperlipémie chez le diabétique.
La dyslipidémie, la plus fréquente dans le diabète de type 1 mal contrôlé, est la baisse des
HDL. De nombreux patients nécessitent une intervention thérapeutique du fait de leur LDL
élevé (Bougnères & Chanson, 2001).
2. Diabète et marqueurs du stress oxydant
2.1. Stress oxydatif et défenses antioxydantes
Le stress oxydant est défini comme un déséquilibre de la balance entre la production de
dérivés instables de l’oxygène (radicaux libres...), dont l’augmentation peut être d’origine
endogène ou exogène, et les substances antioxydantes. Ce déséquilibre peut avoir diverses
origines.
Par définition, les radicaux libres sont des substances chimiques très réactives comportant un
nombre impair d’électrons qui peuvent semer le désordre dans la structure des protéines
cellulaires, des lipides membranaires, des acides nucléiques et ils peuvent éventuellement
entraîner la mort cellulaire (Muzykantov 2001 ; Maritim et al., 2003). Parmi les espèces
radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il convient de distinguer celles dites
"primaires", qui jouent un rôle particulier en physiologie, de celles dites "secondaires" qui
dérivent des premières par réaction avec des composés biochimiques de la cellule.
Les radicaux primaires dérivent de l’oxygène par des réductions à un électron tels l’anion
superoxyde (•O2-) et le radical hydroxyle •OH (Yoshikawa et al., 2000). D’autres espèces
dérivées de l’oxygène comme l’oxygène singulet 1O2, le peroxyde d’hydrogène H2O2 ou le
nitroperoxyde (ONOOH) ne sont pas des radicaux libres, mais sont aussi réactives et peuvent
être des précurseurs de radicaux libres (Favier, 2003). Bien que le stress oxydatif puisse avoir
de graves conséquences au niveau cellulaire et vasculaire, il n’en demeure pas moins que dans
des conditions physiologiques normales, le stress oxydatif est une conséquence normale du
métabolisme en aérobie. En effet, dans ces conditions, l’oxygène moléculaire subit une série
de réactions qui conduit ultimement à la génération de molécules oxydantes. Ces dérivés sont
générés en continu au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale, et représentent des
produits secondaires de la respiration cellulaire (Ducrocq et al., 2001).
Dans les conditions dites «physiologiques», il y a équilibre entre la production de radicaux
libres et les mécanismes endogènes de défenses antioxydantes. Ces mécanismes impliquent
principalement des enzymes spécifiques (superoxyde dismutase (SOD), catalase (CAT),
gluthation peroxydase Gpx), ainsi que des molécules antiradicalaires (scavengers), qui piègent
les radicaux libres (vitamines antioxydantes A, C, E, thiols et ß-carotène) (Vouldoukis et al.,
2004).
2.1.1. Systèmes de défenses enzymatique ou primaire
Composés d’enzymes et de substances antioxydantes, ils ont comme fonction d’empêcher
l’initiation ou la propagation des réactions radicalaires.
� La superoxyde dismutase (SOD)
Les superoxydes dismutases sont capables d’éliminer l’anion superoxyde (O2–) qui est le
point de départ de la chaîne de production des radicaux libres par une action de dismutation
(la dismutation est une réaction dans laquelle le même composé chimique est à la fois oxydant
et réducteur). Cette réaction aboutit, à partir de deux superoxydes, à la formation d’une
molécule d’oxygène et d’une molécule de peroxyde d’hydrogène. Les superoxydes
dismutases existent sous plusieurs isoenzymes qui diffèrent selon la localisation
chromosomique du gène, leur contenu métallique, leur structure quaternaire et leur
localisation cellulaire (Zelko et al., 2002). La structure des superoxydes dismutases est bien
conservée lors de l’évolution et présente un puit hydrophobe au centre de la protéine dans
lequel se glisse l’anion superoxyde (Zelko et al., 2002). La nature du métal situé au centre de
l’enzyme permet de distinguer les superoxydes dismutases à manganèse (MnSOD) protégeant
la mitochondrie, de celles à cuivre-zinc protégeant le cytosol (cCu-ZnSOD), la face externe de
la membrane des cellules épithéliales (ecCu-ZnSOD) ou le plasma sanguin (pCu-ZnSOD) et
représentant environ 50% de l’activité totale des SOD (Zelko et al., 2002).
� La catalase (CAT)
La catalase est une enzyme (hémoprotéine à fer ferrique), dont le principal rôle catalytique, in
vivo, est de décomposer le peroxyde d'hydrogène. C’est une enzyme très importante dans le
sens ou elle catalyse la conversion du peroxyde d’hydrogène (toxique pour les cellules) en
oxygène gazeux et en eau selon la réaction suivante :
2 H2O2 --> O2 + 2 H2O
La catalase est une enzyme extrêmement active. Une seule molécule de cette enzyme est
capable de décomposer plusieurs millions de molécules de peroxyde par minute. La catalase
est surtout active lorsque le niveau du stress oxydant est élevé ou que la quantité de glutathion
péroxydase est limitée et elle joue un rôle significatif dans le développement d’une tolérance
au stress oxydatif dans la réponse adaptative des cellules (Wassmann et al., 2004).
� Les glutathion peroxydases (GPx)
Les glutathion peroxydases constituent sans doute l’un des plus importants systèmes
enzymatiques de protection. En effet, elles sont capables de détoxifier le peroxyde
d’hydrogène, mais aussi d’autres hydroperoxydes résultant de l’oxydation du cholestérol ou
des acides gras en couplant la réduction de l’hydroperoxyde avec l’oxydation d’un substrat
réducteur comme le glutathion, le cytochrome c (cytochrome c peroxydases), le NADH
(NADH peroxydases) (Thérond & Denis, 2005). Toutes les glutathion peroxydases
contiennent dans leurs sous unités un à quatre atomes de sélénium selon l’isoenzyme. Des
glutathion peroxydases à sélénium sont retrouvées dans le plasma (pGPx), le cytosol (cGPx),
au niveau de la membrane cellulaire (HPGPx), et une isoenzyme est spécifique aux cellules
digestives (GIGPx) (Ganther, 1999). Les glutathions péroxydases sont présentes dans le
cytoplasme où elles jouent un rôle majeur dans la régulation de l’état d’oxydoréduction
intracellulaire dans les cellules vasculaires (Wassmann et al., 2004). De plus, la fonction
antioxydante de ces enzymes est très importante puisqu’elles sont considérées comme des
partenaires essentiels des SOD (qui entraîne la production de H2O2) et de la vitamine E
(Richard et al., 1997).
� La glutathion réductase (GSSG-Red)
La glutathion réductase est une enzyme dépendante de NAD(P)H et FAD (Flavine Adénine
Dinucléotide) présents dans les globules rouges. L’enzyme catalyse la réduction du glutathion
oxydé (GS-SG) sous sa forme réduite (GSH) (Mdart, 2005).
2.1.2. Les systèmes de défense non enzymatiques ou secondaire
La destruction des espèces oxygénées activées EOA (et plus particulièrement des radicaux
libres) est également assurée par des molécules antioxydantes ou piégeurs (scavengers) qui
réagissent directement avec les radicaux libres pour former des dérivés oxydés.
Les antioxydants secondaires ou préventifs assurent l’inhibition de la production des radicaux
libres, parmi ces piégeurs le glutathion, l’acide urique, la bilirubine, les hormones sexuelles,
la mélanine, la mélatonine, l’acide lipoïque et le coenzyme Q. De tous ces composés
endogènes synthétisés par les cellules, le plus important est sans doute le glutathion réduit
(thiol majeur au niveau intracellulaire) qui protège non seulement contre les radicaux
oxygénés, mais aussi contre les peroxydes ou le •NO (Favier, 2003). Le glutathion est un
tripeptide dont les propriétés réductrices et nucléophiles jouent un rôle majeur dans la
protection contre les altérations oxydantes des lipides, des protéines et des acides nucléiques.
En situation de stress oxydant, son rôle protecteur et détoxifiant résulte principalement de sa
fonction de cosubstrat de deux enzymes GPx et GSH-S-transférase. Mais, il fait aussi l’objet
d’autre interactions synergiques avec d’autres composants du système de protection
antioxydante tels que la vitamine C, la vitamine E et les superoxydes dismutases.
Dans des conditions normales, le glutathion, sous sa forme réduite GSH, représente entre 90
à 98% du glutathion total. D’autres composés, tels que les vitamines E (tocophérol), C (acide
ascorbique), Q (coenzyme Q-10 ou ubiquinone), ou la provitamine A (ß-carotène), les
polyphénols apportés par les aliments, agissent en piégeant les radicaux et en neutralisant
l’électron non apparié, les transformant ainsi en molécules ou ions (Alleva et al., 1997 ;
Moure et al., 2001).
Ces substances antioxydantes peuvent agir en synergie dans leur lutte contre les radicaux
libres en un système de défense secondaire (Pincemail, 2002 ; Judde et al., 2003)
Fig1. Génération de substances réactives à l’oxygène et système de défense enzymatique (Chauhan & Chauhan, 2006)
2.2. Diabete et stress oxydant
Le diabète, aussi bien de type I que de type II, est caractérisé par une augmentation du nombre
de radicaux libres et une réduction des défenses antioxydantes, ainsi qu’un état inflammatoire
(King et al., 2003). L’élévation du glucose sanguin est associée à une augmentation du stress
oxydatif, qui semble contribuer au développement des complications du diabéte, incluant des
lésions sur les gros et les petits vaisseaux sanguins (macro et micro-angiopathie) susceptibles
d’avoir de graves conséquences sur des organes cibles comme les nerfs, les yeux ou les reins.
Le stress oxydant peut jouer un rôle important dans l’évolution du diabéte et peut contribuer à
la survenue des complications chroniques (Melamed-Frank et al., 2001 ; Asleh et al., 2003 ;
Asleh et al., 2005). En effet, le stress oxydatif chez les diabétiques est étroitement lié à une
hyperactivation des plaquettes (De Cristofaro et al., 2003), même en l'absence de
complications vasculaires (Véricel et al., 2004).
L’hyperglycémie augmente l’intensité de la glycation non enzymatique, caractérisée par la
fixation d’oses simples (glucose), ou de leurs dérivés, sur les groupements aminés des
protéines. Cette réaction conduit à la formation de composés complexes, les produits de
glycation avancés (AGE), qui modifient la structure et les fonctions des protéines. Les liens
entre glycation et stress oxydant sont très étroits, et les deux phénomènes sont souvent
regroupés sous le terme de “ glycoxydation ”. Tous les stades de la glycoxydation génèrent la
production de radicaux libres oxygénés, et certaines étapes sont communes avec celles de la
peroxydation lipidique (Gillery, 2006).
Le diabète est associé à une augmentation dans le sang des produits issus de la peroxydation
lipidique. Chez les patients, dont le diabète est mal équilibré, des périodes prolongées
d’hyperglycémie peuvent entraîner une élévation du stress oxydant et des modifications des
lipoprotéines. Ces modifications sont le résultat de phénomènes de glycation (liaison du
glucose à des protéines), d’oxydation, d’agrégation. Les études montrent que les patients
diabétiques ont une protection antioxydante significativement déficiente susceptible
d’augmenter leur vulnérabilité aux dommages oxydatifs et de favoriser le développement de
complications diabétiques. Des chercheur ont, ainsi, mis en évidence que des patients
souffrant de diabète avaient des niveaux anormalement élevés de radicaux libres et de faibles
taux de vitamine E par rapport à des sujets en bonne santé (Nourooz-Zadeh et al., 1997).
Le stress oxydant concerne tous les constituants cellulaires mais ce sont les lipides qui sont les
plus touchés par ce phénomène. La peroxydation lipidique désigne l’attaque des lipides
(principalement les acides gras polyinsaturés) par des radicaux libres, cette attaque des lipides
peut concerner aussi bien les phospholipides membranaires que les lipoprotéines circulantes,
avec évidemment des conséquences différentes. En effet, l’altération des phospholipides
membranaires va entraîner une modification de sa fluidité et affecte les systèmes de transfert
d’ions ainsi que le fonctionnement de nombreux transporteurs, récepteurs et les voies de
transduction des signaux (Favier, 2003).
L’attaque des lipoprotéines circulantes, notamment des LDL, va aboutir à l’oxydation de ces
dernières, qui seront ensuite captées par les macrophages pour donner des cellules spumeuses
à la base du dépôt lipidique de la plaque d’athérome (Beaudeux et al., 2003 ; Favier, 2003 ;
Peynet et al., 2005).
L’augmentation du stress oxydant au cours du diabète est principalement démontrée par
l’augmentation des dommages causés par les radicaux libres sur les protéines et les lipides. Le
principal marqueur de l’augmentation des radicaux libres est l’élévation de la peroxydation
lipidique. Plusieurs études ont mis en évidence l’augmentation du taux des produits de
peroxydation lipidique (diènes conjugués, hydroperoxyde d’acide gras et malondialdéhyde)
dans le plasma des sujets diabétiques (Jain et al., 1998 ; Hartnet et al., 2000).
3. Traitement du diabète par la médecine traditionnelle
La phytothérapie est une médecine qui utilise les plantes ayant des propriétés thérapeutiques
(ou plus précisément la "partie active" de ces plantes). Cette utilisation peut se faire de
différentes manières et suivant trois niveaux : traditionnel, pharmacologique et
symptomatique, clinique.
En effet, des études ethnopharmacologiques ont montré que de nombreuses plantes sont
utilisées en médecine traditionnelle pour leurs prétendues activités hypoglycémiante
hypolipémiante et antioxydante (Pari & Latha, 2004 ; Eddouks et al.,
2005 ; Kukongviriyapan et al., 2007). L’effet hypoglycémiant de certaines de ces plantes a
été étudié et confirmé chez le rat (Maghrani et al., 2004 ; Pepato et al., 2005; Ruzaidi et al.,
2005) et chez l’homme (Herrera-Arellano et al., 2004 ; Jayawardena et al., 2005).
3.1. Les polyphénols
Les polyphénols sont des phytomicronutriments synthétisés par les végétaux et sont
particulièrement abondants au niveau des fruits et légumes. De nombreuses études sont en
faveur d’un impact positif de leur consommation sur la santé. En effet, les polyphénols
pourraient permettre de prévenir de nombreuses pathologies comme les cancers (Brown,
1999; Mukhtar & Ahmad, 2000; Lambert & Yang, 2003), les maladies dégénératives et
cardiovasculaires (German & Walzem, 2000). Parmi les antioxydants végétaux, les
polyphénols apparaissent les plus efficaces, quant à leurs effets protecteurs dans l’organisme.
La moitié des polyphénols est composée de flavonoïdes dont les effets protecteurs au niveau
du système cardiovasculaire, aussi bien que leurs propriétés anticancéreuses, antivirales ou
antiallergiques ont été rapportées au cours de nombreuses expérimentations (Middleton et al.,
2000).
Les propriétés antioxydantes des polyphénols s’expliquent en partie par leur aptitude à réagir
directement avec les anions superoxydes, les radicaux hydroxyles et les radicaux produits par
la peroxydation lipidique (Nijveldt et al., 2001). Les autres effets antioxydants des
polyphénols incluent l’inhibition de la xanthine oxydase et une stimulation des systèmes
antioxydants endogènes (Nijveldt et al., 2001). Une autre source enzymatique importante
d’anions superoxydes est la NADPH oxydase dont l’expression et l’activité pourrait être
diminuée par les polyphénols (Seo et al., 2001; Wei et al., 2004).
Des études réalisées sur des extraits de plusieurs plantes comme l’extrait aqueux (Waheed et
al ., 2006 ; Lee et al., 2006 ; Odetola et al., 2006 ; Resmi et al., 2006 ; Andrade-Cetto et
al., 2007 ; Hannan et al., 2007 ; Revilla-Monsalve et al., 2007 ; Kukongviriyapan et
al.,2007), l’extrait hydrométhanolique (Khlifi et al., 2005), l’extrait butanolique (Andrade-
Cetto et al., 2005 ; Andrade-Cetto et al., 2007), l’extrait éthanolique (Pushparaj et al.,
2007), l’extrait méthanolique (Odetola et al., 2006) chez le rat ou d’autres modèles
expérimentaux, ont montré un effet hypoglycémiant, hypolipémiant et antioxydant de ces
plantes.
3.2. Traitement par les plantes médicinales chez le patient diabétique
Une étude entreprise par Herrera-Arellano et al., (2004) chez des patients diabétiques,
traités par l’extrait aqueux de Cecropia obtusifolia a montré une réduction de la glycémie, du
taux de cholesterol et des trigycérides plasmatiques prouvant ainsi l’effet hypoglycémiant et
hypolipémiant de cet extrait.
L’extrait aqueux de Cecropia obtusifolia Bertol utilisé en médecine traditionnelle mexicaine
pour son effet hypoglycémiant, entraîne une réduction significative de glucose après 4
semaines de traitement (Revilla-Monsalve et al., 2007) . De plus, les teneurs de l`HbA1C
sont sensiblement réduites après 6 semaines chez des sujets diabétiques
3.3. Traitement par les plantes médicinales chez le rat
Andrade-Cetto et al., (2005) ont montré que les extraits aqueux, éthanolique et butanolique
des racines de Malmea depressa à des doses respectives de 40, 80 et 120 mg/kg, chez des rats
rendus diabétiques par la streptozotocine ont un effet hypoglycémiant.
Odetola et al., (2006) ont étudié l'effet des graines fermentées de Parkia biglobosa
(PB)(haricot de sauterelle africain), fréquemment utilisées dans quelques régimes africains
comme épice, chez les rats rendus diabétiques par l’alloxane (120 mg/kg de poids corporel).
Ces auteurs ont noté une augmentation du C-HDL et une baisse du C-LDL et de la glycémie,
prouvant ainsi l’effet hypoglycémiant et hypolipémiant de cette plante.
Une étude réalisée par Resmi et al., (2006) sur l'extrait aqueux de Albizzia lebbeck (Linn.)
chez des rats rendus diabétiques par l`alloxane a montré une augmentation de l’activité des
enzymes antioxydantes, telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), la
glutathion peroxydase (GPX) et la glutathion réductase (GSSGred), ainsi qu’une baisse des
teneurs en substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS), démontrant ainsi l’effet
antioxydant de l'extrait aqueux de Albizzia lebbeck.
Andrade-Cetto et al., (2007) ont noté que les deux extraits aqueux et butanolique de
Tournefortia hirsutissima L. à une dose de 80 mg/kg, chez des rats rendus diabétiques par la
streptozotocine, diminuent de façon significative la glycémie. Une analyse par
chromatographie liquide sous haute pression ( HPLC) indique que les extraits aqueux et
butanolique ont la même composition chimique. Hannan et al., (2007) ont montré que les
graines de Trigonella foenum-graecum améliorent la tolérance orale de glucose.
L'administration quotidienne par voie orale de foenum-graecum de Trigonella à des rats
diabétiques, durant 28 jours, diminue la glycémie et augmente le contenu de glycogène de
foie ainsi que le statut antioxydant total.
Une étude a été réalisée dans le but de déterminer les propriétés hypoglycémiante et
hypolipidémiante d’extrait éthanolique de Cichorium intybus chez des rats rendus diabétiques
par la streptozotocine (STZ, 50mg/kg). En effet, Pushparaj et al., (2007) ont observé que
l`extrait éthanolique de Cichorium intybus à une dose de 125mg/kg entraîne une baisse de la
glycémie, des triglycérides, du cholestérol total et de l’activité de la glucose-6-phosphatase,
confirmant ainsi l’effet hypoglycémiant et hypolypémiant de cette plante.
Kukongviriyapan et al., (2007) ont montré chez des rats rendus diabétiques par la
streptozotocine, que les extraits de Cratoxylum formosum, Syzygium gratum et Limnophila
aromatica, des plantes utilisées dans la médecine traditionnelle thaïlandaise, ont une activité
antioxydante, en augmentant l’activité de la SOD et inhibant la formation du MDA.
Burton & Ingold, (1986) ont montré in vitro que l'extrait hydrométanolique de Globularia
Alypum (Ga), induit une diminution de la consommation d’oxygène, comparé au
butylhydroxytoluène (BHT). L’analyse chimique de la plante révèle la présence d’une
importante quantité de polyphénols, composés aux propriétés anti-radicalaires et anti-
oxydantes. L’implication des composés polyphénoliques dans l’activité antioxydante de Ga a
été démontré pour d’autre espèces, comme le phénylglucoside extrait à partir de Globularia
Trichosantha et Globularia davisiana et le Globularitol obtenu à partir de Globularia
orientalis (Calis et al. ,2001 ; Calis et al., 2002).
L’extrait hydrométhanolique de Globularia alypum provoque un important effet antioxydant
avec une réduction de la formation des diènes conjugués et de la consommation d’oxygène
moléculaire (Khlifi et al., 2005).
MATERIEL &
METHODES
1. Matériel végétal
Globularia alypum est une plante caractéristique des régions méditerranéennes surtout à
l'ouest du bassin méditerranéen, où elle forme dans la garrigue d'importants buissons très
ramifié, d'une hauteur allant de 30 cm à 1 m, avec des tiges brun-rouge striées, des feuilles
persistantes très nombreuses, coriaces, généralement spatulées et mucronées (terminées par
une pointe), et des fleurs bleues. Cette plante vivace pousse dans les lieux rocailleux et
broussailleux secs, de préférence sur du calcaire. Fréquemment, ces buissons poussent sur de
gros rochers isolés ou sur des falaises.
Le genre Globularia (les globulaires) regroupe des plantes classées dans la famille des
Plantaginacées et dans la sous-famille des GLOBULARIOIDEAE. Elles appartenaient
autrefois à la famille des globulariacées. Les pharmacopées traditionnelles méridionales
utilisent les feuilles de Globularia alypum L. en infusion pour leurs supposées propriétés
antidiabétiques, astringentes, antirhumatismales, purgatives, stimulantes, antiulcéreuses et
anticancéreuses.
Fig 2. Globularia alypum
1.1. Préparation de l’extrait méthanolique de Globularia alypum
Globularia alypum a été récoltée au mois d’avril 2006, la partie aérienne est séchée, nettoyée
et les feuilles finement broyées. 50g de poudre de Globularia alypum sont mélangés avec
500ml de méthanol, le mélange est porté à frémissement pendant 30mn puis filtré, l’opération
est répétée trois fois. La décoction obtenue est passée au Rotavapor, congelée à -70°C, pour
être ensuite lyophilisée (CHRIST, ALPHA 1-2 LD).
2. Animaux et régimes
Vingt rats mâles de souche Wistar (Iffa Credo, l’Arbresle, Lyon, France) pesant 272±6 g sont
rendus diabétiques par injection intra péritonéale d`une solution fraîchement préparée de
streptozotocine (STZ) diluée dans du tampon citrate (0,1 mol/L, pH 4,5), (50 mg/kg de poids
corporel). La streptozotocine se présente sous forme lyophilisée (N-méthylnitrosocarbamyl
glucosamine, C8H15N3O7, pm=265,2 Sigma, USA). La glycémie est mesurée au niveau de la
veine de la queue à l’aide d’un glucomètre (Glucotrend, Soft Test System, Roche
Diagnostics, Meylan, Germany) utilisant des bandelettes réactives (Accu-Chek active, Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany) avant injection de STZ, puis 48 heures après.
Les rats sont placés dans des cages à métabolisme et pesés chaque jour. Les urines sont
recueillies du 26ème au 28ème jour du protocole. Les rats reçoivent l’eau et les régimes ad
libitum, et la quantité d’eau et de nourriture ingérée est mesurée quotidiennement. Les
animaux des deux groupes sont maintenus dans une animalerie à la température de 22±2 °C,
l’hygrométrie 50±10% et un éclairage artificiel de 7-19heures. Les conseils généraux pour
l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivis (Council of European Communities,
1989).
Les rats diabétiques sont divisés en deux groupes :
- Le 1er groupe diabétique non traité est soumis à un régime à 20% de caséine.
- Le 2ème groupe diabétique traité consomme le même régime supplémenté avec 1,66%
d’extrait méthanolique de Globularia alypum.
3. Prélèvement du sang et des organes
A J28 de l’expérimentation, après 12 h de jeûne, les rats sont anesthésiés par injection intra
péritonéale au penthobarbital sodique (60mg/100g de poids corporel).
Le sang est prélevé par ponction de l’aorte abdominale puis centrifugé à 1000x g, pendant 20
min à 4°C avec de l’EDTA disodique (EDTA-Na2). Le plasma et le culot contenant les
globules rouges sont récupérés. Les différents organes (foie, cœur, reins, tissu adipeux,
muscle gastrocnémien et cerveau) sont prélevés, rincés soigneusement avec une solution de
NaCl à 0,9 %, séchés et pesés. Le plasma, le culot et les organes sont conservés à -70°C
jusqu'à leur utilisation. Le culot d’hématies est lavé, mis en suspension puis centrifugé 3-
fois. Deux ml d’hématies sont mis dans de l’eau distillée glacée puis centrifugés à 750 x g.
Tableau I. Composition des régimes1 (g/100g de régime)
Constituants Caséine Caséine + Ga
Caséine² 20 20
Amidon³ 59 58,5
Huile4 5 5
Saccharose5 5 5
Cellulose² 5 5
Vitamines6 2 2
Sels minéraux7 4 4
Extrait lyophilisé de
Globularia alypum L.
/ 1,66
1Les régimes sont isoénergétiques (16,28 MJ/kg de régime) et donnés sous forme de poudre.
²Prolabo, Paris, France. 3ONAB Sidi Bel Abbès, Algérie. 4CEVITAL, Bejaïa, Algérie. Composition (%): acides gras saturés, 12 ; acides gras
monoinsaturés, 21; acides gras polyinsaturés, 67. 5ENASUCRE, Sfisef, Algérie. 6UAR 200 (Villemoisson, 91360, Epinay, France). Composition du mélange vitaminique
(mg/kg) : rétinol, 12 ; cholécalciférol, 0,125 ; thiamine, 40 ; riboflavine, 30 ; acide
penthoténique, 140 ; pyridoxine, 20 ; inositol, 300 ; cyanocobalamine, 0,1 ; acide ascorbique,
1600 ; dl-α-tocophérol, 340 ; ménadione, 80 ; acide nicotinique, 200 ; acide para-
aminobenzoique, 100 ; acide folique, 10 ; biotine, 0,6. 7UAR 205 B (Villemoisson, 91360, Epinay/Orge, France). Composition du mélange minéral
(g/kg de régime) : Ca, 4 ; K, 2,4 ; Na, 1,6 ; Mg, 0,4 ; Fe, 0,12 ; éléments (traces) : Mn, 0,032 ;
Cu, 0,005 ; Zn, 0,018 ; Co, 0,00004 ; I, 0,00002, complété à 40000 avec de la cellulose.
4. Analyses biochimiques
4.1. Détermination de la glycémie
La glycémie est mesurée chaque semaine sur un échantillon de sang total de la veine caudale,
à l’aide d’un glucomètre (Accu–Chek active, Roche Diagnostics, Meylan, Allemagne).
4.2. Détermination des teneurs en hémoglobine et en hémoglobine glycosylée
L’hémoglobine est oxydée par le ferricyanure de potassium en methémoglobine qui est
ensuite transformée en cyanomethémoglobine par le cyanure de potassium. La lecture se fait à
une longueur d’onde λ = 540 mm.
Le sang est mélangé à un agent lysant contenant un détergent et une grande concentration en
ions borate. L’élimination de la base labile de Schiff est achevée durant l’hémolyse. Le sang
hémolysé est mélangé pendant 5 min à une faible résine échangeuse de cations. Durant ce
temps, l’Hb est reliée à la résine. Après la période de mélange, un séparateur spécial est utilisé
pour éliminer la résine du surnageant qui contient l’HbAıC. La proportion d’HbAıC est
donnée en pourcentage de l’hémoglobine totale dans l’échantillon et ceci par le dosage de la
fraction HbAıC et de l’hémoglobine totale à 415 nm en comparaison avec le dosage du
standard de l’HbAıC obtenu au cours de la réaction (Kit Wako, Allemagne).
4.3. Détermination des teneurs en créatinine, urée et acide urique
4.3.1. Détermination des teneurs en créatinine
La créatinine est déterminée par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit Biocon,
Germany). La créatinine présente dans l’échantillon réagit avec le picrate en milieu alcalin,
pour donner un complexe coloré. La vitesse de formation de ce complexe est mesurée dans
des périodes initiales courtes, en évitant ainsi l’interférence d’autres composés. La lecture se
fait à une longueur d’onde λ=500nm.
4.3.2. Détermination des teneurs en urée
L’urée est déterminée par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit Biocon, Germany).
L’urée présente dans l’échantillon donne en présence d’uréase et de nitroprusside un
indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie. La lecture se fait à une longueur
d’onde λ=600nm.
4.3.3. Détermination des teneurs en acide urique
L’analyse de l`acide urique est effectuée par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit
Biocon, Germany). L’acide urique présent dans l’échantillon donne en présence d’uricase un
indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie. La lecture se fait à une longueur
d’onde λ=510nm.
4.4. Détermination des teneurs plasmatiques en cholestérol total et en triglycérides
4.4.1. Dosage du cholesterol total
Le cholestérol total (CT) est déterminé par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit
Biocon, Germany). Le cholestérol libre et le cholestérol estérifié présents dans l’échantillon
donnent après hydrolyse enzymatique et oxydation un complexe coloré quantifiable par
spectrophotométrie. L’indicateur, la quinonéimine est formée à partir du peroxyde
d’hydrogène et du 4-amino-antipyrine en présence du phénol et de la peroxydase. La lecture
se fait à une longueur d’onde λ=500nm.
4.4.2. Dosage des triglycérides
Les triglycérides (TG) sont déterminés par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit
Biocon, Germany). Les triglycérides présents dans l’échantillon donnent après hydrolyse
enzymatique et oxydation un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie.
L’indicateur, la quinonéimine est formée à partir du peroxyde d’hydrogéne et du 4-amino-
antipyrine et du chlorophénol sous l’action de la peroxydase. La lecture se fait à une longueur
d’onde λ=500nm.
5. Evaluation du stress oxydant
5.1. Dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) urinaires,
plasmatiques et érythrocytaires
La réaction de dosage du malondialdéhyde, repose sur la formation en milieu acide et à chaud
entre le malondialdéhyde et deux molécules d'acide thiobarbiturique (TBA), d'un pigment
absorbant à 532 nm, extractible par le butanol (Quantanilha et al., 1982). La réaction
colorée, observée avec l'acide thiobarbiturique, mesure non seulement le malondialdéhyde
préexistant, mais aussi le malondialdéhyde formé par décomposition thermique des
peroxydes, et de ceux générés au cours même de la réaction (Favier, 1997).
Les étapes de dosage des TBARS sont les suivantes :
Dans un tube Sovirel déposer :
-200 µl H20 (blanc) ou MDA ou échantillon.
-200 µl SDS 8,1%.
-1500 µl acide acétique 20% pH 3,5 ajusté avec NaOH 10N.
-1500 µl TBA 0,8%.
-qsp 4ml H20 distillée.
Passer au vortex pendant 30 sec, incuber dans un bain marie chauffé à 100°C pendant 60 min.
Stopper la réaction avec de l’eau froide.
-Rajouter ensuite 1ml d’H20 distillée, 4ml de butanol.
Passer au vortex pendant 30secondes, et centrifuger à 1000x g pendant 10 min.
La lecture de la phase organique (supérieure) est effectuée à une longueur d’onde λ=532nm.
Le contenu en TBARS est exprimé en nmol.mL-1 plasma au niveau plasmatique, en
pmol.mg1 Hb au niveau érythrocytaire et en nmol.mg-1 creatinine au niveau urinaire.
5.2. Dosage des TBARS tissulaires (Ohkawa et al.,1978)
Les homogénats tissulaires sont préparés à raison de 100 mg de tissu broyé dans 0,9 ml de
tampon. Le milieu réactionnel (placé dans des tubes Sovirel) contient 200 µl d’homogénat,
200 µl de sodium dodrecyl sulfate (SDS à 8,1%), 1500 µl d’acide acétique à 20% (pH=3,5) et
1500 µl d’une solution aqueuse d’acide thiobarbiturique (TBA à 0,8 %). Le volume final du
milieu réactionnel est ajusté à 4 ml avec de l’eau distillée. L’incubation des tubes se fait à
100° C, pendant 60 mn , puis ils sont placés dans un bain glacé pendant 5 min afin de stopper
la réaction. 1 ml d’eau distillée et 4 ml de butanol sont ajoutés dans les tubes qui sont
vigoureusement agités, puis centrifugés à 1000 x g, pendant 10 min. la lecture de la phase
organique (supérieure) est effectuée à une longueur d’onde λ=532nm et les résultats sont
exprimés en nmol MDA.g-1 tissu.
5.3. Peroxydation des VLDL-LDL
Des VLDL-LDL plasmatiques sont obtenues après précipitation différentielle au sulfate de
dextran et chlorure de magnésium, selon la méthode Burstein et al., (1989), la peroxydation
lipidique est déterminée suivant la méthode décrite par Frémont et al., (1998). 100 l (250
g de protéines) de la fraction LDL sont incubés pendant 24h à 37°C en présence de 900 l
de tampon phosphate (10 mmol.L-1) et de 20 µL CuSO4 (0,25 mmol.L-1). La production des
substances réactives avec l’acide thiobarbiturique (TBARS) est déterminée par
spectrophotométrie à 535 nm selon la méthode de Quantanilha et al., (1982), en utilisant du
malondialdéhyde (MDA, préparé par hydrolyse du tétrahydroxypropane) comme référence.
5.4. Dosage du glutathion réduit (GSH)
Le dosage du glutathion réduit est effectué selon la méthode de Sedlak & Lindsay, (1988). A
500 l d`échantillon sont rajoutés 1,5 mL de tampon Tris HCI (0.2 mol. L-1), 100 L d`une
solution contenant du 5,5’-dithiobis-(2-acide nitrobenzoique 0,01 mol.L-1) et 7,9 ml de
méthanol. Bien vortexer, incuber pendant 30 min à 37 ºC et centrifuger 750 X g, pendant 15
min. Le surnageant est prélevé et la lecture se fait a une longueur d’onde λ= 412 nm. Une
solution mère de glutathion réduit à 10 mM (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA)
est utilisée pour établir la courbe de référence.
5.5. Mesure de l’activité des enzymes antioxydantes
5.5.1. Superoxyde dismutase (SOD)
L’activité de la SOD (SOD, EC:1.15.1.1) est mesurée par la méthode de Sun et al. (1988).
Cette méthode consiste à déterminer la capacité de l’enzyme à inhiber la réduction de l’anion
superoxyde par du nitroblue tetrazolium. La lecture se fait à une longueur d’onde λ= 560 nm.
Au niveau des tissus, l’activité SOD est exprimée en U.mL-1 de sang au niveau érythrocytes et
en U/mg de protéines au niveau des différents tissus
5.5.2. Glutathion réductase (GSSG-Red)
L’activité de la glutathion réductase (GSSGred, EC 1.6.4.2) est estimée par la mesure du taux
d’oxydation du NADPH en présence de glutathion oxydé (Goldberg & Spooner, 1992).
L’unité de l’activité de cette enzyme est définie comme la qualité d’enzyme capable d’oxyder
1 mmol de NADPH par min. L’activité de l’enzyme au niveau des différents tissus est
exprimée en U/mg de protéines, et en U. mL-1 au niveau érythrocytes.
5.5.3.Catalase(CAT) L’activ
ité de la catalase (CAT, EC 1.11.1.6) est mesurée selon la méthode de Claiborne (1985)
utilisant un milieu réactionnel contenant 1,95 mL de tampon phosphate(0,05M, pH=7), 1 mL
de peroxyde d`hydrogène (0,019M), 50 l d`échantillon (source enzymatique). La lecture se
fait en mesurant les variations de l`absorbance pendant 2 min à une longueur d’onde λ=
240 nm. L’activité de l’enzyme tissulaire est exprimée en U.mg-1 de protéines tissulaires, et en
U.mL-1 au niveau érythrocytes.
Les teneurs en protéines sont déterminées par la méthode de Lowry et al., (1951) : en milieu
alcalin, le complexe formé par les ions Cu²+ et les groupements tyrosine et tryptophane des
protéines est réduits par le réactif de Folin. Il se développe une coloration bleue dont
l’intensité est proportionnelle à la quantité de protéines de l’échantillon. La sérum albumine
bovine (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA) est utilisée pour établir la courbe de
référence. La lecture se fait à une longueur d’onde λ=750nm
6. Analyse statistique
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne±erreur standard (M±ES). Après analyse
de variance, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats diabétiques traités
ou non avec Globularia alypum. est déterminée par le test "t" de Student-Fischer.
RESULTATS
1. Evolution du poids corporel (PC) des animaux et nourriture ingérée
Après quatre semaines de traitement, le poids corporel des rats diabétiques traités (DGa) et
non traités par l’extrait méthanolique de Globularia alypum (D) est similaire chez les deux
groupes (201±9 et 195±10 g) (Fig. 2). Cependant, la nourriture ingérée est 1,9-fois plus faible
chez le groupe DGa comparé au groupe D (Fig. 3).
Fig 3. Croissance pondéral des animaux et nourriture ingérée.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001
2. Evolution de la glycémie
0
125
250
J0 J7 J14 J21 J28Jours
g
D
DGADGa
***
0
10
20
30
40
D DGA
g
D DGa
L’hyperglycémie provoquée par l’injection de streptozotocine (exprimée en mmol.L-1)
diminue de façon très significative chez les rats diabétiques traités par rapport aux
diabétiques non traités (P<0,001). En effet, la valeur est 2,3-fois plus faible à J7, cette
diminution persiste jusqu’à J28 où les valeurs représentent 5,21±0,83 vs 27,36±0,21 mmol.L-
1 (Fig. 4).
Fig 4. Evolution de la glycémie.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001
3. Teneurs en hémoglobine totale (Hb) et hémoglobine glycosylée (HbA1C) (Tableau II)
Les teneurs en hémoglobine totale sont augmentées de +22% chez les rats diabétiques traités
par rapport aux non traités. De plus, le pourcentage de l’HbA1C est diminué de 78% chez le
groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum .
************
0
10
20
30
J0 J7 J14 J21 J28 Jours
mm
ol.L
-1 s
an
g
D
DGA
D DGa
Tableau II. Teneurs en hémoglobine totale (Hb) et hémoglobine glycosylée.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; **P<0,01.
4. Concentration en urée, créatinine et acide urique au niveau plasmatique et urinaire
(Tableau III)
Au niveau plasmatique, les concentrations en urée et créatinine sont réduites respectivement
de -63% et -52% chez le groupe diabétique traité (DGa) par rapport au groupe non traité (D).
De plus, une diminution des valeurs de l’acide urique est notée chez le groupe DGa comparé
au groupe D (26,72±2,63 vs 20,66±1,70 g.L-1).
Au niveau urinaire, les concentrations en urée, créatinine et acide urique sont diminuées
respectivement de -53%,-35% et -63%, chez le groupe DGa comparé au groupe D.
Tableau III. Teneurs plasmatiques et urinaires en urée, créatinine et acide urique.
Urée (g.L-1) Créatinine (g.L-1) Acide urique (g.L-1)
Plasma Urines Plasma Urines Plasma Urines
D... 178,24±25,63 17,68 ±2,63 5,05±0,84 10,80±1,68 26,72±2,63 60,98±12,54
DGa 66,32±13,15*** 8,35±1,92*** 2,41±0,54** 7,06±0,42* 20,66±1,70* 22,88±6,07***
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; **P<0,01 ; *P< 0,05
Groupes Hémoglobine totale (g.dL-1) Hémoglobine glycosylée (%)
D 9,30± 0,33 13,75±0,14
DGa 11,90±0,24** 2,62±0,12***
5. Teneurs plasmatiques en cholestérol total (CT) et triglycérides (TG) (Tableau VI)
A J28, le traitement par l’extrait méthanolique de Globularia alypum entraîne chez le groupe
diabétique une diminution des valeurs plasmatiques du CT (-22%) et une réduction des TG
(46%) comparé au groupe non traité.
Tableau VI. Teneurs plasmatiques en cholestérol total (CT) et triglycérides (TG)
Groupes
CT (mmol.L -1)
TG (mmol.L -1)
D... 2,69±0,18 0,84±0,15
DGa 2,10±0,13* 0,53±0,08**
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; **P<0,01 ; *P< 0,05
.
6. Concentrations en substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS)
6.1. Au niveau plasmatique, érythrocytaire et urinaire (Fig.5)
Chez le groupe traité (DGa), après 4 semaines, les concentrations en TBARS diminuent au
niveau du plasma de (-76%), des urines (-55%) et des érythtrocytes (-39%) comparé au
groupe non traité (D).
Urines
8
12
nmol
.mL
-1
Plasma
Fig 5. Teneurs en TBARS au niveau du plasma, des érythrocytes et des urines
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001.
6.2. Au niveau tissulaire (foie, cœur, muscles, tissu adipeux, cerveau et reins)
(Fig.6)
Chez les rats diabétiques traités avec l’extrait méthanolique de Globularia alypum, les
teneurs en TBARS sont réduites au niveau du foie (-43%), du coeur (-51%), du cerveau
(-42%) et des reins (-23%). Cependant, aucune différence significative n’est observée au
niveau du muscle gastrocnémien et du tissu adipeux
Fig 6. Concentrations tissulaires en TBARS .
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; **P<0,01.
6.3. Au niveau des VLDL-LDL et des HDL
La peroxydation des VLDL-LDL (exprimée en nmoles TBARS /24h /mg de protéines) est
1,9-fois plus élevée chez les rats diabétiques traites par l’extrait méthanolique de Globularia
alypum comparés aux non traités. En effet, les valeurs représentent 5,62±0,62 vs 2,96±0,42.
Toutefois, aucune différence significative n`est notée au niveau des HDL (1,33±0,21 vs
0,97±0,41).
TBARS
**
***
*****
***
0
100
200
300
Foie Coeur Muscle Tissuadipeux
Cerveau Rein
nmol
e.g-
1 tis
su
D
DGa
D
DGa
7. Teneurs en glutathion réduit (GSH)
7.1. Au niveau des érythrocytes et du plasma
A J28, les concentrations du GSH sont augmentée de +36% au niveau des érythrocytes alors
qu’une réduction de - 35% est notée au niveau du plasma chez le groupe traité (DGa) par
rapport au groupe non traité (D) (Fig .7).
Fig 7. Concentration en glutathion réduit au niveau des érythrocytes et du plasma
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001.
Erythrocytes
***
0
20
40
D DGa
pmo
l.mg-1
Hb
Plasma
***
0
4
8
12
D DGa
nmo
l.mL-1
D DGa
D DGa
***
******
0
2
4
6
8
Foie Coeur Muscle Cerveau Rein
nmo
le.g-1
tiss
u
D
DGa
7.2. Au niveau tissulaire
Des concentrations élevée en glutathion réduit (GSH) sont notées au niveau du foie (+40%),
du cerveau (+25%) et des reins (+36%). Toutefois, aucune différence significative n’est
observée au niveau du cœur et du muscle gastrocnémien (Fig. 8).
Fig 8. Concentration tissulaires en glutathion réduit
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001.
8. Activité de certaines enzymes antioxydantes superoxyde dismutase (SOD), glutathion
réductase (GSSG-Red) et catalase (CAT)
8.1. Au niveau des érythrocytes
Chez le groupe diabétique traité par l’exrait méthanolique de Globularia alypum, les activités
enzymatiques de la SOD, GSSG-Red et CAT sont augmentées de +52%, +46% et +29%
respectivement, comparé au groupe diabétique non traité (Fig.9).
Fig 9. Activité des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. SOD : superoxyde dismutase,GSSG-Red : glutathion reductase et CAT : catalase. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; *P< 0,05
8.2. Au niveau tissulaire (Fig. 10)
Chez le groupe diabétique traité comparé au non traité, une augmentation significative de la
SOD est notée dans le foie (+27%), le muscle (+22%) et les reins (+24%). Cependant,
aucune différence significative n’est constatée au niveau du cœur et du cerveau.
Les valeurs de l’activité de GSSG-Red sont augmentées de +40% et +32%, respectivement
dans le foie et les reins. Toutefois, aucune variation n’est observée au niveau du cœur, du
muscle gastrocnémien et du cerveau.
Chez le groupe traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum, l’activité de la catalase
(CAT) est augmentée au niveau du foie (+13%), du cœur (+30%) et des reins (+20%), alors
qu’elle est similaire au niveau du muscle et du cerveau chez les deux groupes diabétiques
traités ou non.
***
***
*
0
100
200
300
400
SOD GSSG-red CAT
U.m
L-1 s
ang
DDGa
D DGa
Fig 10. Activité des enzymes antioxydantes au niveau tissulaire
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; **P<0,01 ; *P< 0,05
CAT
* ***
**
0
20
40
60
80
Foie Coeur Muscle Cerveau Rein
U.m
g-1 p
roté
ines
SOD
*
***
**
0
200
400
600
800
Foie Coeur Muscle Cerveau Rein
U.m
g-1 p
roté
ines
D
DGa
GSSG-red***
***
0
20
40
60
80
100
120
Foie Coeur Muscle Cerveau Rein
U.m
g-1 p
roté
ines
D DGa
DISCUSSION
Le but de cette étude est de mettre en évidence l’impact de l’extrait méthanolique de
Globularia alypum sur la glycémie et les teneurs de certains paramètres lipidique d’une part,
et sur et sur le statut antioxydant d’autre part, chez des rats rendus diabétiques par injection de
streptozotocine.
La streptozotocine est un agent chimique qui induit un diabète insulino-dépendant de type 1
chez le rat wistar par destruction des cellules β des îlots de Langerhans du pancréas
(Gonzalez et al., 2000).
Une diminution du poids corporel est notée durant les quatre semaines d’expérimentation
chez les deux groupes de rats diabétiques. Aucune différence significative n’est observée avec
le traitement par l’extrait méthanolique de Globularia alypum. Des résultats similaires sont
constatés avec l’extrait méthanolique de Parkia biglobosa (Odetola et al., 2006) alors
qu’une augmentation du poids corporel est notée chez les rats rendus diabétiques par la
streptozotocine traités par l’extrait aqueux de Trigonella foenum-graecum. (Xue et al., 2007)
et par l’extrait méthanolique de Heliotropium zeylanicum (Murugesh et al., 2006).
Les résultats de la présente étude montrent une réduction de la glycémie de J7 jusqu'à J28
chez le groupe traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum (DGa) par rapport au
groupe D, montrant ainsi l’effet hypoglycémiant de cette plante. En effet, Jouad et al., (2002)
ont noté que l’extrait aqueux de Globularia alypum entraîne une réduction de la glycémie,
sans aucune variation des teneurs sériques en insuline, suggérant ainsi que l’effet
hypoglycémiant serait probablement d’origine extra-pancréatique.
Plusieurs hypothèses ont été proposées quand à l’effet hypoglycémiant de certains extraits de
plantes médicinales chez des rats rendus diabétiques. L’augmentation de la sensibilité des
récepteurs de l’insuline expliquerait la diminution de la glycémie (Pari et al., 2004 ; Megalli
et al., 2006).
D’autres auteurs suggèrent une augmentation dans la synthèse du glycogène au niveau du
foie (Hannan et al., 2006 ; Hannan et al., 2007), l’inhibition de l’absorption intestinale du
glucose et l’amélioration de la motilité (Hannan et al., 2006).
Par ailleurs, Pushparaj et al., (2007) ont observé que l’extrait éthanolique de Cichorium
intybus réduit l'activité au niveau du foie, de la glucose-6-phosphatase diminuant ainsi la
production de glucose, qui a alternativement comme conséquence la réduction de la glycémie.
En plus du dosage de la glycémie, la détermination du pourcentage de l'hémoglobine
glycosylée est un indice très utile pour évaluer la qualité du contrôle glycémique. C'est le
dosage de référence pour juger de l'équilibre du diabète, car l'HbA1C est le témoin du niveau
moyen du glucose dans le sang, c'est donc bien plus intéressant que la glycémie à jeun d'une
part et c'est le témoin de la glycation des protéines d’autre part. Il faut rappeler que
l’hémoglobine glyquosylée est formée au cours du diabète par fixation non enzymatique
d'oses (excès de glucose) sur l'hémoglobine. L'HbA1C ne représente qu'une partie des
hémoglobines glyquées, même si elle en constitue la forme majeure, puisque d'autres sites que
l'extrémité N-terminale des chaînes β peuvent être glyqués, et que d'autres oses peuvent se
fixer sur l'hémoglobine (Goldstein et al., 2004).
En effet, l’extrait méthanolique de Globularia alypum induit une réduction du contenu en
hémoglobine glycosylée. Ces résultats concordent avec ceux obtenus avec les extraits de
Cucurbita ficifolia (Xia & Wang, 2006) et de Murraya koenigii (Arulselvan &
Subramanian, 2007) chez des rats rendus diabétiques par streptozotocine.
L’extrait méthanolique de Globularia alypum diminue le poids corporel, l’hyperglycémie
provoquée par l’injection de streptozotocine ainsi que l’hémoglobine glycosylée.
A la fin de l’expérimentation (J28), le groupe traité par l’extrait méthanolique de Globularia
alypum présente une diminution des concentrations plasmatiques et urinaires de l’urée et de
la créatinine, comparé au groupe non traité, traduisant chez ce dernier un dysfonctionnement
rénal. De nombreuses études ont prouvé l’efficacité de certaines plantes dans l’amélioration
de la fonction rénale chez le diabétique. En effet, Arulselvan et al., (2006) ont montré que
l’extrait éthanolique des feuilles de Murraya koenigii réduit les teneurs en urée et créatinine
chez les rats rendus diabétiques par la streptozotocine. De plus, Yamabe et al., (2007) ont
noté que Corni Fructus, un constituant de Hachimi-jio-gan réduit l’urémie et la créatinémie
chez les rats diabétiques. Par ailleurs, les résultats de notre étude montrent que l’extrait
méthanolique de Globularia alypum entraîne une réduction des concentrations plasmatiques
et urinaires de l’acide urique. L’augmentation des teneurs en acide urique peut être à l'origine
de complications néphropathiques chez le diabétique.
L’extrait méthanolique de Globularia alypum a un effet bénéfique sur le fonctionnement
rénal altéré lors du diabète induit par la streptozotocine.
Dans cette étude, les concentrations plasmatiques en cholestérol total (CT) et en triglycérides
(TG) sont diminuées chez le groupe diabétique traité (DGa) comparé au groupe diabétique
non traité (D). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus avec les extraits de Scoparia
dulcis (Pari & Latha, 2006) et d’aloès vera (Rajasekaran et al, 2006) chez des rats rendus
diabétiques par streptozotocine. De plus, Adaramoye & Adeyemi, (2006) ont observé que
l’extrait de certaines plantes, et plus particulièrement de leurs flavonoïdes, induit un effet
hypoglycémiant et hypocholestérolémiant. Le mécanisme par lequel ces plantes réduisent le
taux de cholestérol sérique serait probablement dù à l’augmentation de l’excrétion fécale du
cholestérol et en sa synthèse sous forme d’acides biliaires impliquant une activité 7α-
hydroxylase élevée.
En plus de son action favorable sur la glycémie et sur la fonction rénale, l’extrait
méthanolique de Globularia alypum a un effet hypolipémiant, chez le rat diabétique.
Dans ce travail, l’évaluation du statut antioxydant a porté sur la peroxydation lipidique et les
défenses antioxydantes au niveau de différents compartiments tels que les érythrocytes, le
plasma, les urines et certains organes.
En effet, les résultats indiquent une diminution très significative des teneurs en TBARS
plasmatiques, érythrocytaires et urinaires chez les rats diabétiques traités par l’extrait
méthanolique de Globularia alypum, comparés aux rats diabétiques non traités. Ces résultats
sont en accord avec ceux obtenus par Pari & Latha, (2004) chez des rats rendus diabétiques
par la streptozotocine et traités par l’extrait de scoparia dulcis.
Par ailleurs, les teneurs en TBARS au niveau du cerveau, du foie, du cœur et du rein sont
réduites chez le groupe DGa comparé au groupe D. Ces résultats sont en accord avec ceux
obtenus avec les extraits de Scoparia dulcis (Pari & Latha, 2005), d’Annona squamosa
(Kaleem et al, 2006), d’Albizzia lebbeck (Resmi et al., 2006) et de Vitis vinifera (Orhan et
al, 2006).
Seuls les adipocytes et le muscle gastrocnémien présentent des valeurs en TBARS similaires
entre les deux groupes traités ou non par l’extrait méthanolique de Globularia alypum
Une réduction de la peroxydation lipidique des VLDL-LDL est constatée chez le groupe
diabétique traité comparé au groupe non traité, alors que, les particules HDL ne sont pas
affectées par la peroxydation lipidique. Ces résultats concordent avec les travaux antérieurs de
l’équipe du laboratoire qui ont montré que l’extrait aqueux d’Ajuga iva induit chez des rats
rendus diabétiques par streptozotocine, une réduction des teneurs en TBARS des VLDL-LDL
sans aucune modification au niveau des HDL (Ghomari et al., 2005). Par ailleurs, Nwanjo et
al.,(2006) ont montré que l’extrait aqueux des feuilles de Gongronema latifolium chez les rats
rendus diabétiques par streptozotocine présente un effet bénéfique contre la peroxydation
lipidique.
Il est possible, pour évaluer le statut antioxydant de mesurer le glutathion réduit ainsi que
l’activité de certaines enzymes antioxydantes. En effet, Les concentrations du glutathion
réduit (GSH) au niveau des érythrocytes, du plasma et de certains tissus (foie, cerveau et
reins) sont augmentées chez le groupe traité (DGa) par rapport au groupe non traité (D).
Toutefois, aucune différence n’est observée au niveau du cœur et du muscle. Le glutathion
sous sa forme réduite GSH représente entre 90 à 98% du glutathion total. Le glutathion entre
dans le système de défense non enzymatique ou secondaire du stress oxydant. Il s’agit d’un
tripeptide dont les propriétés réductrices et nucléophiles jouent un rôle majeur dans la
protection contre les altérations oxydantes des lipides, des protéines et des acides nucléiques.
Des études réalisées sur les extraits de certaines plantes telles que Tribulus terrestris (Amin et
al.,2006) , Heliotropium zeylanicum (Murugesh et al., 2006), Terminalia arjuna (Raghavan
& Kumari, 2006) et Murraya koenigii (Arulselvan & Subramanian, 2007) ont montré,
chez le rat rendu diabétique une augmentation des concentrations du GSH au niveau du foie,
du plasma et des reins.
Les résultats de cette étude indiquent que l’activité de la superoxyde dismutase (SOD)
augmente de façon très significative dans les érythrocytes, le foie, le muscle et les reins chez
le groupe traité par rapport au groupe non traité. Ces résultats sont en accord avec ceux
obtenus chez des rats rendus diabétiques et traités par des extraits d’Annona squamosa,
d’Albizzia lebbeck (Resmi et al., (2006) et de Gongronema latifolium (Nwanjo et al., (2006).
Par ailleurs aucune différence significative de l’activité de la SOD chez les rats traités par
l’extrait méthanolique de Globularia alypum n’est noté au niveau du cœur et du cerveau. Ces
résultats différent de ceux obtenus par Pari & Latha, (2004) et Babu et al., (2006) sur des
extraits de Scoparia dulcis et de thé vert chez des rats rendus diabétique par la
streptozotocine. De plus, au cours du diabète, la glycation altère les activités enzymatiques,
dont la SOD (Krishnamurti et al., 2001 ; Sacks et al., 2002).
L’activité de la catalase (CAT) est augmentée au niveau du foie, du rein, du cœur et du
plasma. Par contre, aucune variation n’est constatée au niveau du muscle et du cerveau. Les
études réalisées sur les extraits de Terminalia arjun (Raghavan & Kumari, 2006) et
Heliotropium zeylanicum (Murugesh et al., 2006) ont montré que seuls le foie et le rein
présentent une augmentation de l’activité de la catalase, chez les rats diabétiques.
Une activité élevée de la glutathion réductase (GSSG-Red) au niveau des érythrocytes, du
foie et du rein est constatée chez les rats diabétiques traités par l’extrait méthanolique de
Globularia alypum comparés aux rats non traités. Cependant, aucune différence significative
n’est notée au niveau du cœur, du muscle gastrocnémien et du cerveau. Les travaux de
Raghavan & Kumari, (2006) ont montré que l’extrait éthanolique des écorces de tiges de
Terminalia arjun induit, chez le rat rendu diabétique, une augmentation de l’activité de la
glutathion réductase au niveau rénal et hépatique.
Chez le rat rendu diabétique par injection de streptozotocine, l’extrait méthanolique de
Globularia alypum a un effet bénéfique contre la peroxydation lipidique en réduisant les
concentrations en TBARS, et en augmentant la défense antioxydante non enzymatique
(GSH) et enzymatique (SOD, GSSG-Red, CAT).
CONCLUSION
Cette étude met en évidence l’impact de l’extrait méthanolique de Globularia alypum sur la
glycémie et certains paramètres lipidique d’une part, et sur le statut antioxydant redox par la
détermination de la peroxydation lipidique et des défenses antioxydantes d’autre part, chez le
rat rendu diabétique par injection de streptozotocine.
Le poids corporel chez le rat diabétique traité et non traité par de l’extrait méthanolique de
Globularia alypum L. ne montre aucune différence significative. La mesure de la glycémie à
montrée une importante diminution dès J7 jusqu'à la fin de l’expérimentation (J28) chez le
groupe diabétique traités comparés aux non traités. D’autre part, l’extrait méthanolique de
Globularia alypum réduit le réduit le taux d’hémoglobine glycosylée. L’ensemble de ces
résultats que l’extrait méthanolique de Globularia alypum exerce une activité
hypoglycémiante chez les rats rendus diabétiques par la streptozotocine.
En effet, il apparaît que le traitement des rats diabétiques par l’extrait méthanolique de
Globularia alypum induit une diminution des concentrations plasmatiques et urinaires de
l’urée et de la créatinine, ce qui laisse supposer que l’extrait méthanolique de Globularia
alypum améliore la fonction rénal.
Dans notre étude, les concentrations plasmatiques et hépatiques du cholestérol total (CT) et
des triglycérides (TG) sont diminuées chez le groupe diabétique traité comparé au groupe
diabétique non traité. Ces résultats montrent que l’extrait méthanolique de Globularia alypum
a un effet hypolipémiant.
L’évaluation du statut redox par la détermination de la peroxydation lipidique par le dosage
des teneurs des TBARS montre une réduction au niveau du plasma, des urines, du foie, du
cœur, du cerveau, des reins et des VLDL-LDL, alors qu’aucune différence significative n’est
observée au niveau des HDL, du muscle gastrocnémien et du tissu adipeux. Inversement, les
concentrations en glutathion réduit (GSH) sont augmentées au niveau du plasma, des
érythrocyte, du foie, cerveau et des reins. Toutefois, aucune différence n’est observée au
niveau du cœur et du muscle gastrocnémien.
En ce qui concerne l’activité de certaines enzymes antioxydantes il apparaît que l’extrait
méthanolique de Globularia alypum augmente l’activité de la SOD, de la GSSG-Red et de la
CAT au niveau érythrocytaire, hépatique et rénal. Cependant, aucune différence significative
n’est constatée au niveau du cerveau.
L’ensemble de ces résultats suggère l’existence d’une réduction de la peroxydation lipidique
et une augmentation de la défense antioxydante induite par l’extrait méthanolique de
Globularia alypum .
Les résultats obtenus au cours de cette étude montre l’efficacité thérapeutique de cette plante
au cours du diabète expérimental, suite a ses propriétés hypoglycémiante, hypolipémiante et
antioxydante.
Cette étude pourrait être poursuivie afin de mieux comprendre les mécanismes d’action de
l’extrait méthanolique de Globularia alypum .
• Détermination des composés actifs de Globularia alypum .
• Evaluation du taux de l`insuline plasmatique
• Evaluation des teneurs en prostaglandine F2-α et de la 8-epi-PGF2α
• Détermination du test de résistance des hématies à l’attaque radicalaire (KRL)
• Analyse de la composition en acides gras des membranes des hématies par
chromatographie en phase gazeuse (CPG) et des différentes fractions de lipoprotéines
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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ANNEXES
Tableau V. Croissance pondéral des animaux et nourriture ingérée.
Croissance pondérale Nourriture ingérée
D
DGa D DGa
J0 245,44±6,98
247,70±5,08
12,67±4,51
10,67±6,66
J7 221,78±10,42
223,30±7,77
32,78±1,97
17,78±1,44***
J14 214,67±8,80
210,60±12,29
33,11±1,27
18,11±1,17***
J21 207,33±11,58
201,60±8,31
34,16±0,93
18,6±1,14***
J28 200,89±9,77
195,10±8,62
34,7±1,62
19,3±1,09***
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001
Tableau VI. Evolution de la glycémie (mmol.L-1).
Chaque valeur repré
sente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer. ***P< 0,001
Jours D
DGa
J0 19,15±0,22
21,28±0,29
J7 18,48±0,28
8,06±0,18***
J14 22,12±0,13
5,93±0,16***
J21 23,12±0,12
5,71±0,2***
J28 27,83±0,04
5,32±0,15***
Tableau VII. Teneurs en TBARS au niveau du plasma, des érythrocytes et des urines.
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer. ***P< 0,001
Tableau VIII. Concentrations des TBARS tissulaires (nmol.g-1tissu)
D DGa
Foie 261,18±6,64
150,28±13,09***
Coeur 138,40±7,77
67,23±7,00***
Muscle 66,61±8,48
69,55±9,17
Tissu adipeux 188,08±22,73
126,26±14,74
Cerveau 285,67±10,25
165,95±6,59***
Reins 173,40±12,39
133,50±6,74**
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer. ***P< 0,001 ; **P<0,01.
Tableau IX. Concentration du glutathion réduit au niveau des érythrocytes et du plasma. D
DGa
Erythrocytes (pmol.mg-1Hb) 14,27±2,39
22,22±1,88***
Plasma (nmol.mL -1) 40,21±5,00
63,38±2,71***
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer. ***P< 0,001.
Tableau X. Concentration du glutathion réduit au niveau tissulaire (nmol.g-1tissu).
D DGa
Foie 4,36±0,31
6,13±0,26***
Cœur 0,77±0,07
0,72±0,07
Muscle 0,89±0,10
0,86±0,08
Cerveau 4,42±0,50
5,90±0,29***
Rein 0,39±0,05
0,55±0,04***
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001.
Tableau XI. Activité des enzymes antioxydantes au niveau des érythrocytes (U.mL-1sang).
D DGa
SOD 149,02±21,65
313,63±13,02***
GSSG-Red 64,31±11,27
120,20±7,37***
CAT 56,44±6,57
79,86±4,32*
SOD : superoxyde dismutase, GSSG-Red : glutathion réductase, CAT : catalase.Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; *P< 0,05
Tableau XII. Activité des enzymes antioxydantes au niveau tissulaire (U.mg-1 protéines).
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de 10 rats par groupe. D représente le groupe diabétique non traité et DGa, le groupe diabétique traité par l’extrait méthanolique de Globularia alypum pendant 28 jours. Après analyse de variance, la comparaison des moyennes est effectuée par le test "t" de Student-Fischer.***P< 0,001 ; **P<0,01 ; *P< 0,05
SOD GSSG-Red CAT
D DGa D DGa D DGa
Foie 98,09±11,50
133,77±16,05*
68,83±10,90
115,13±9,22***
43,75±2,92
49,79±1,92*
Cœur 178,35±15,07
186,74±9,70
36,58±2,71
33,57±4,41
37,60±3,51
49,06±2,32***
Muscle 397,26±26,20
505,87±22,60***
47,51±6,52
40,29±4,83 33,17±2,22
35,77±3,52
Cerveau 575,43±40,40
577,59±44,71
63,39±4,83
59,88±11,22
21,91±2,33
23,11±3,11
Rein 57,87±3,20
76,55±3,62**
44,59±9,24
65,89±5,84***
21,64±0,70
26,90±1,70**
RESUME
Le but de cette étude est de mettre en évidence chez des rats rendus diabétiques par injection de
streptozotocine l’impact de l’extrait méthanolique de Globularia alypum sur la glycémie et les teneurs
en lipides plasmatiques d’une part, et sur la peroxydation lipidique et le statut antioxydant d’autre part.
20 rats mâles de souche Wistar pesant 272±6g, soumis à un régime standard à 20% de caséine et
rendus diabétiques par injection intrapéritonéale de streptozotocine (50mg/kg de poids corporel), sont
divisés en deux groupes diabétiques non traité (D) et traité (DGa) avec l’extrait méthanolique de
Globularia alypum (1,66%) pendant 28 jours. La peroxydation lipidique est déterminée par le dosage
des substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS). Les défenses antioxydantes non
enzymatique et enzymatique sont évaluées par la détermination du glutathion réduit (GSH) et de
l’activité de la superoxyde dismutase (SOD), glutathion réductase (GSSG-Red) et catalase (CAT).
Les résultats sont comparés entre les diabétiques traités et non traités par l’extrait méthanolique de
Globularia alypum (DGa). Une perte pondérale est observée chez les deux groupes. A J28, la
glycémie et l’hémoglobine glycosylée (HbA1C) sont réduites de -78% et -81%, respectivement. Les
concentrations en urée, créatinine et acide urique sont diminuées respectivement de -63%, -53% et -
23% au niveau plasmatique et de -52% -35% et -63% au niveau urinaire. Une réduction des teneurs
plasmatiques en cholestérol total (-22%) et en triglycérides (-46%) est notée. Les concentrations en
TBARS plasmatiques, urinaires et érythrocytaires présentent une baisse très significative de -76%, -
55% et -39% chez le groupe diabétique traité comparé au groupe non traité. De plus, au niveau
tissulaire, une réduction des teneurs en TBARS est constatée au niveau du foie (-43%), du cœur
(-51%), du cerveau (-42%) et des reins (-23%), alors qu’aucune différence significative n’est observée
au niveau du muscle gastrocnémien et du tissu adipeux. La peroxydation des VLDL-LDL est 1,9-fois
plus élevée, alors qu’aucune différence significative n’est observée au niveau des HDL. Les valeurs du
glutathion réduit (GSH) sont augmentées de +36%, +40%, +36% et +25%, respectivement dans les
érythrocytes, foie, rein et cerveau, toutefois, aucune différence n’est observée au niveau du cœur et du
muscle. Chez le groupe traité par rapport au groupe non traité, l’activité enzymatique de la SOD,
GSSG-Red et CAT est augmentée de +29%, +46% et +29% au niveau des érythrocytes. Par ailleurs,
elles s’élèvent de +27%, +40% et +13% au niveau hépatique et +24%, +32% et +20% au niveau rénal.
Cependant, seul l’activité de la SOD est augmentée (+22%) au niveau du muscle et celle de la CAT
(+30%) au niveau du cœur, alors que des valeurs similaires sont observées au niveau du cerveau.
En conclusion, il apparaît que l’extrait méthanolique de Globularia alypum exerce un effet
hypoglycémiant et hypolipémiant. De plus, un effet bénéfique est noté contre la peroxydation lipidique
par des teneurs réduites en TBARS et une stimulation des systèmes de défense non enzymatique (GSH)
et enzymatique (SOD, GSSG-Red et CAT).
Mots Clés : Rat- Extrait méthanolique de Globularia alypum - Diabète- Streptozotocine- Glycémie- HbA1C - TBARS –GSH -SOD- GSSG-Red- CAT.
ABSTRACT
The present study was designed to investigate the possible hypoglycemic, hypolipemic and
antioxidant effects of Globularia alypum (Ga) lyophilised methanolic extract.
Twenty diabetic rats were divided into two groups, the untreated diabetic (D) group fed a 20% casein
diet and the treated DGa group fed the same diet supplemented with 1.66% of Ga for 28 days.
Diabetes was induced in rats by intraperitoneal injection of streptozotocin (50 mg/kg body weight).
The content of final lipid peroxidation products reacting with thiobarbituric acid (TBARS), in several
tissues, as well as the concentration of reduced glutathione (GSH) and enzymatic activities of
superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GSSG-Red) and catalase (CAT) were evaluated.
The results were compared between diabetic rats treated or not with Ga lyophilised methanolic
extract. During the experimentation, asimilar decrease in body weight was noted in the both groups.
At d28, glycemia and glycosylated hemoglobin (HbA1C) were decreased by 78% and 81%,
respectively. In addition, urea, creatinine and uric acid concentrations were lowered respectively by -
63%, -53% and -23% in plasma, and by -52% -35% and -63%, in urine. Plasma total cholesterol and
triacyglycerols were diminished by -22% and -46%, respectively. TBARS levels were decreased by -
76%, -55% and 39% respectively, in plasma, urine and erythrocytes. Moreover, TBARS values were
reduced by -43%, -51%, -42% and -23% in liver, heart, brain and kidney, respectively, excepted in
adipose tissue and muscle, where the concentrations were similar in the both groups. VLDL-LDL
peroxidation was 1.9-fold higher, whereas, no significant difference was noted in HDL. GSH
concentrations were increased respectively by +36%, +40%, +36% and +25% in erythrocytes, liver,
kidney and brain, while, similar values were noted in heart and muscle. In erythrocytes, SOD, GSSG-
Red and CAT activities were improved by 27%, +40% and +13%, respectively. Moreover, these
enzymes were increased by +27%, +40%, +13% in liver, and by +24%, +32%, +20%, in kidney.
Increased activities of SOD in muscle (+22%) and CAT in heart (+30%) were observed. SOD,
GSSG-Red and CAT activities in brain were similar in the both groups.
In conclusion, it appears that Globularia alypum methanolic extract has hypoglycemic and
hypolidemic effects. Moreover, it exerts a beneficial effect against lipid peroxidation by reducing
TBARS contents and improvement of non-enzymatic (GSH) and enzymatic (SOD, GSSG-Red and
CAT) antioxidant defense systems.
Keywords: Rat – Methanolic extract – Globularia alypum – Diabetes – Streptozotocin – Glycemia –
TBARS – GSH – SOD –GSSG-Red – CAT.
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