les sillons de l ’adn

Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01

Les sillons de l ’ADN

Observer la différence entre

le grand sillon

le petit sillon

Intéressant pour la reconnaissancedes protéines

L’ ADN sous forme BL’ ADN sous forme B

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L’ ARN sous forme AL’ ARN sous forme A

Les sillons de l ’ARN

le petit sillon

le grand sillon

le petit sillon

le grand sillon

Large et peu profond

Étroit et profond

donc propriétés de reconnaissancecomplètement différentes de celles de l’ADN.

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Forme

Nombre de paires de bases par tour

Angle de torsion par paire de base

Pas de l'hélice

Distance axiale entre les paires de bases

Angle de basculement

Largeur des sillons Grand

Petit

Distance du phosphore à l'axe de l'hélice

B

10 (10,4)

36°

34 Å

3,4 Å

voisin de 0

11,4 Å

6,0 Å

9,3 Å

A

11

32,7°

29 Å

2,6 Å

à peu près 20

2,4 Å

11,0 Å

9,5 Å

Forme

Nombre de paires de bases par tour

Angle de torsion par paire de base

Pas de l'hélice

Distance axiale entre les paires de bases

Angle de basculement

Largeur des sillons Grand

Petit

Distance du phosphore à l'axe de l'hélice

B

10 (10,4)

36°

34 Å

3,4 Å

voisin de 0

11,4 Å

6,0 Å

9,3 Å

A

11

32,7°

29 Å

2,6 Å

à peu près 20

2,4 Å

11,0 Å

9,5 Å

Caractéristiques des formes canoniques A et B des AN34

Å3,

4Å

Forme B

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A : rappels sur le génome

Les acides nucléiquesLe DNA circulaire

La chromatine

B: Les outils de la biologie moléculaireEnzymes qui coupent les acides nucléiquesEnzymes qui changent les contraintes des ANEnzymes qui travaillent sur les phosphatesEnzymes qui recopient les acides nucléiques

C: Les techniques de la biologie moléculairePurification des acides nucléiquesElectrophorèse sur gelMéthode de transfert d’après SouthernTechnique de l’amplification géniqueLe séquençage de l’ADN

Plan du cours : première partie

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L’ADN Circulaire

l’ADN circulaire

Une forme particulière de l’ADN

DéfinitionSens des super enroulementsNotion de topoisomèresImportance des ADN circulaires

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Molécule d’ADN circulaireMolécule d’ADN circulaire

5’

5’ 3’

3’

La chaine d’ADN peut ce circulariser et chaque brin se refermer sur lui même par des liaisons phosphodiester

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LE SUPERENROULEMENT POSITIFLE SUPERENROULEMENT POSITIF

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LE SUPERENROULEMENT NÉGATIFLE SUPERENROULEMENT NÉGATIF

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LE SUPERENROULEMENT LE SUPERENROULEMENT

POSITIFPOSITIF

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LE SUPERENROULEMENT LE SUPERENROULEMENT

NÉGATIFNÉGATIF

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ADN circulaire : topoisomèresADN circulaire : topoisomères

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Relaxée Torsadée Super torsadée

Topoisomères de l’ADN circulaireTopoisomères de l’ADN circulaire

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La Chromatine

La structure de l’ADN dans la cellule

la chromatine

Pourquoi compacter l’ADN dans la cellule ?

La machinerie de compaction

Les histones

Le nucléosome

Les superstructures de l’ADN

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Compaction de l’ADNCompaction de l’ADN

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Modèle de compaction de l’ADNModèle de compaction de l’ADN

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Double hélice d ’ADN

Double hélice d’ADN + histones

Fibre dechromatine

ChromatideChromosome

Compactions de l ’ADNCompactions de l ’ADN

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- Comprend de l'ADN (environ 200 pb)

-Des protéines :

-des histones sous forme d'octamères:

2 x H2A, 2 x H2B, 2 x H3 et 2 x H4

et des protéines non histones.

- La protéine histone H1 est extérieure à la partie

principale du nucléosome. Elle est sous forme

d'une protéine unique.

LE NUCLÉOSOMELE NUCLÉOSOME

Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01

Le nucléosomeLe nucléosome

Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01

200 pb 200 pb d'ADNd'ADN

Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4

LE NUCLÉOSOMELE NUCLÉOSOME

Histone H1

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Empaquetage de l’ADNEmpaquetage de l’ADN

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Chromosomes humainsChromosomes humains

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Les outils de la biologie moléculaire

• Enzymes qui coupent les acides nucléiques

• Enzymes qui changent les contraintes des AN

• Enzymes qui travaillent sur les phosphates

• Enzymes qui recopient les acides nucléiques

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C A G

3’

PP P P

3’ 3’

5’ 5’ 5’

Polarité de la chaîne d’ADNPolarité de la chaîne d’ADN

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Les nucléases

Les enzymes de restriction

La DNase I

La nucléase S1

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Les enzymes de restriction

DéfinitionLe palindromeSymétrie de la coupureCoupure à bouts collantsCoupure à bouts francsRestriction et méthylation de l’ADN

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Les enzymes de restriction sont des outils utilisés pour couper l’ADN.La coupure de l’ADN se fait en un site particulier reconnu par l’enzyme.Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique.

Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléasesc’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entredeux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique

Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Les enzymes de restrictionLes enzymes de restriction

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Enzymes de restrictionEnzymes de restriction

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Les séquences de nucléotidesReconnues par les enzymes derestriction sont habituellementdes séquences dites palindromiques.Les séquences palindromiques sontdes séquences où la succession desnucléotides lue dans le sens 5’3’(gauche - droite) pour le premier brinest identique à la séquencelue dans le sens droite - gauche pourle second brin (sens 5’3’).Ces séquences palindromiques sontle plus souvent constituées de 4 ou 6 paires de bases.

LAVALMot palindromique

Séquence palindromique

5’- GAATTC -3’3’- CTTAAG -5’

PalindromePalindrome

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Sites de restrictionSites de restriction

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Symétrie des enzymes de restrictionSymétrie des enzymes de restriction

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LES COUPURES À BOUTS COLLANTSLES COUPURES À BOUTS COLLANTS

Enzyme Eco RIEnzyme Eco RI : :

5'5' -- G G A A T T C - A A T T C - 3'3'

3'3' -- C C T T A A T T A A G - G - 5'5'

5’ – G – 3’OH 5’P – AATTC – 3’5’ – G – 3’OH 5’P – AATTC – 3’

3’ –3’ – CTAAGCTAAG – 5’P 3’OH – G – 5’– 5’P 3’OH – G – 5’

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LES COUPURES À BOUTS FRANCSLES COUPURES À BOUTS FRANCSEnzyme Hae IIIEnzyme Hae III : :

5'5' -- G G G G C C C C - - 3'3'

3'3' -- C C C C G G G G - - 5‘5‘

5’ – GG – 3’OH 5’P 5’ – GG – 3’OH 5’P – – CCCC – – 3’3’

3’ 3’ –– CC CC – – 5’P 3’OH – GG – 3’5’P 3’OH – GG – 3’

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MÉTHYLATION DES CYTOSINES MÉTHYLATION DES CYTOSINES Enzyme Msp IEnzyme Msp I : : CoupureCoupure

5'5' -- C C C* G G - C* G G - 3'3'

3'3' -- G G C* G G C* C C - - 5'5'

Enzyme Hpa IIEnzyme Hpa II : : Pas de coupurePas de coupure

5'5' -- C C* G G - C C* G G - 3'3'

3'3' -- G G C* CG G C* C - - 5'5'

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MÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTIONMÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTION

Enzyme Hind IIIEnzyme Hind III : coupure par l'enzyme : coupure par l'enzyme..5'5' -- AAA G C T TA G C T T - - 3'3'

3'3' -- T T C G AT T C G A A A - - 5‘5‘

Enzyme Hind III (avec hémi-méthylation sur Enzyme Hind III (avec hémi-méthylation sur

l'adénine en N6)l'adénine en N6) : Absence de coupure par Hind III. : Absence de coupure par Hind III.

5'5' -- A*A*A G C T TA G C T T - - 3'3'

3'3' -- T T C G A AT T C G A A - - 5'5'

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LA DNase ILA DNase I

5' 3'

3'3' 5'5'

C'est une endonucléaseC'est une endonucléase

Ses coupures se font au hasardSes coupures se font au hasard

Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)

Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01

La DNase 1 est une endonucléase qui dégradel’ADN double brin ou simple brin.

Les coupures (« nicks ») sont complètementaléatoires sans spécificité de site.

Les produits de la réaction sont des oligonucléotidesqui possèdent un groupement phosphate en 5’.

L’activité dépend des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+)

La DNaseLa DNase

P P P PP

P P P PP

3’

5’OH

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La Nucléase S1La Nucléase S1

La nucléase S1 dégrade l’ADN simple brin.

Nettoie les extrémités simples brins.Coupe un misappariement

Sans activité sur le double brin « parfait »Sans activité sur les hybrides ADN/ARN

S1

5’

5’3’

3’

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Enzymes des phosphates

Les phosphatases

Les kinases

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Phosphatases et KinasesPhosphatases et Kinases

Les phosphatases sont des enzymes qui enlèventles groupements phosphates situés en 5’ d’une chaîne d’ADN.Phosphatase alcaline est active à pH basique.

Les kinases, à l’inverse des phosphatases, sont desenzymes qui ajoutent un groupement phosphate àl’extrèmité 5’ d’un ADN , en présence d’ATP.

C’est le phosphate en γ de l’ATP qui est transféré.

αβγ A

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Enzymes recopiant les acides nucléiquesEnzymes recopiant les acides nucléiques

Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN

DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase RNA dépendanteRNA polymérase DNA dépendanteRNA polymérase RNA dépendante

Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’

La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle.

L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates(XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP)

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Les DNA polymérases

Propriétés

DNA polymérase DNA dépendante

DNA polymérase I : Activités exonucléasiques

Fragment de Klenow

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LES ADN POLYMÉRASESLES ADN POLYMÉRASES - Un brin d'ADN matrice- Un brin d'ADN matrice

- Une amorce oligonucléotidique- Une amorce oligonucléotidique

- Une synthèse du brin nouveau 5'- Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'

3'(OH)3'(OH) 5'5'

5'5' 3'3'

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DNA polymérase DNA dépendanteDNA polymérase DNA dépendante

Ces enzymes recopient l’ADN en ADN.Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique.La réaction catalysée est:(dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi

Amorce avec une extrémité 3’-OH libre

La nouvelle chaîne est synthétisée dansle sens 5’ 3’

Règle de complémentarité et de polarité inverse

Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01

La DNA polymérase 1La DNA polymérase 1

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Fragment de KLENOWFragment de KLENOW

Le fragment de Klenow est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli.

Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’ 3’ mais garde l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’ 5’.

Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base qui vient d’être ajoutée obéit à la règle de complémentarité.(fonction d’édition)

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LES ARN POLYMÉRASESLES ARN POLYMÉRASES

- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.

- Présence de nucléotides : NTPs et d'ions - Présence de nucléotides : NTPs et d'ions

magnésium (Mgmagnésium (Mg2+2+).).

Pr. Jacques PAOLETTISC-L3BH-01

- Une synthèse du brin nouveau dans le - Une synthèse du brin nouveau dans le

sens 5'sens 5' 3'. 3'.

- Absence de fonction d'édition.- Absence de fonction d'édition.

- Nécessité de reconnaître le promoteur - Nécessité de reconnaître le promoteur

spécifique correspondant.spécifique correspondant.

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