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Les prélèvements en

Microbiologie

: Modalités et précautions

SEBAI Nader

1

Introduction

2

Introduction

3

La qualité du résultat est

directement

proportionnelle à la qualité

du prélèvement

(acte clé de la phase pré-analytique

= geste destiné à obtenir un

échantillon biologique)

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Introduction

Un bon prélèvement microbiologique est toujours :

Correctement prescrit !!

Correctement identifié

Accompagné de renseignements cliniques

Apporté rapidement au laboratoire

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Introduction

Responsabilités

Les prélèvements sont réalisés par le personnel habilité

sous la responsabilité des biologistes.

Biologiste fourni : Matériel, Documents de

tracabilité+formation ou information = guide de

prélèvements qualité optimale du prélèvement

Certains recueils (selles, expectorations) sont fait par le

patient Des Instructions leur sont alors fournies pour

expliquer la conduite à tenir.

"Le biologiste est responsable depuis le

prélèvement de l'échantillon jusqu'à la remise des

résultats."

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Responsabilités

Le biologiste s ’occupe :

◦ Prélèvements issus de malades

diagnostic de l ’infection

identification des BMR en routine

◦ Prélèvements à visée épidémiologique

issus de malades

◦ Prélèvements d ’environnement

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Responsabilités

Le biologiste doit :

- S’assurer que le personnel a pris connaissance de ces

documents = guide de prélèvements

- Que le personnel est formé à l’utilisation du matériel

du prélèvement

Les rencontres + échanges avec le

personnel assurant les prélèvements

= indispensables pour consolider la démarche

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Stratégies

Pourquoi prélever ?

Quand prélever ?

Comment prélever ?

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Pourquoi prélever ?

Prélèvements diagnostiques :

◦ Confirme le diagnostic

◦ Précise le ou les microorganismes

◦ Permet de connaître la sensibilité du germe aux

ATB

Prélèvements épidémiologiques :

◦ Prédictifs

◦ Suivi

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Quand prélever ?

A quels moments ?

◦ le plus tôt possible, avant tout traitement, dès

le début du processus infectieux.

◦ Guidés par la symptomatologie et

l’observation clinique

◦ Lors d’échec thérapeutique ou d’évolution

défavorable.

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Précautions indispensables ?

◦ Stérilement en suivant les recommandations à

la fois pour protéger le patient et la qualité du

prélèvement (règles d’hygiène et d’asepsie

appropriées).

◦ Utilisation du matériel et des milieux

appropriés.

Donc bon protocole de prélèvement :

Elimination des MO contaminants/colonisants

12

Comment prélever ?

Comment prélever ?

Le préleveur

Le préleveur habilité doit être clairement identifié.

Il respecte les règles de soins et d’hygiène :

- le port de gants, blouse.

- dans certains cas : masque ou lunettes de protection.

• Il est informé des circonstances particulières par

l'ordonnance ou la fiche de liaison.

• Incident prélèvement ou un changement de la méthode de

prélèvement = le biologiste doit en être informé. 13

Comment prélever ?

Le site du prélèvement Les sites anatomiques appropriés : les plus proches

du foyer infectieux initial et des localisations secondaires.

La porte d'entrée,

Les voies d'excrétion ou d'évacuation de l'infection.

Il ne convient pas cependant de prélever les liquides de drainage recueillis dans les collecteurs.

des espèces les plus aptes à se multiplier secondairement ex vivo et non celles des micro-organismes présents dans les lésions profondes.

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Comment prélever ?

Contamination des prélèvements Des précautions particulières :

Contamination par les bactéries de l'environnement et par une grande variété de micro-organismes commensaux.

Sites respiratoire, ORL, oculaire, intestinal, génito-urinaire, cutané ou sous-cutané, ainsi que les prélèvements de sang pour hémoculture.

Les ponctions et l'abord chirurgical sont les meilleurs procédés de prélèvement pour éviter les contaminations.

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Comment prélever ?

Récipients contenant les échantillons

Récipients stériles à usage unique et étanches.

Chaque récipient doit être identifié par une étiquette comportant :

◦ Nom, prénom du patient et son âge

◦ Date, heure, nature et site du prélèvement.

◦ Le préleveur doit être identifié par son nom ou ses initiales.

◦ Le récipient : sac en plastique étanche et fermé hermétiquement, comportant un compartiment pour les papiers et la prescription.

16

17

Comment prélever ?

Risques d’erreurs

Traitement antibiotique : moment du prélèvement,

Application locale de produits anesthésiques sur les

lésions avant le prélèvement,

Utilisation antiseptique pour recueillir l'échantillon,

Transport ou le stockage impropre des échantillons,

milieu de transport inapproprié.

Difficultés de prélèvement : obtention d'un échantillon

non représentatif du processus infectieux,

Contamination habituelle par la flore endogène de

certains sites de prélèvement,

Difficulté de distinguer : simple colonisation versus

véritable infection due à des bactéries opportunistes.

18

Liste des circonstances justifiant un

refus d'analyse par le laboratoire

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Éléments d’un Prélèvement

Données administratives : Nom et Prénom du patient

Sexe

Age

N° d’immatriculation

Nature du prélèvement et origine

Types d’analyses demandés

Date et heure du prélèvement

Identité du patient

Le prescripteur, préleveur, leurs qualités

Renseignements cliniques ++++

Qualité du prélèvement

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LES PRÉLÈVEMENTS EN

MICROBIOLOGIE:

DIVERSITÉ DES SITES

ANATOMIQUES+VARIÉTÉ DES

ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

ITU est une des infections les plus fréquentes

Cela explique que l’examen cytobactériologique

des urines (ECBU) soit une des analyses

microbiologiques les plus demandées.

Son apparente simplicité d’exécution ne doit pas

faire oublier qu’il convient de respecter en toute

circonstance une méthodologie rigoureuse.

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Lavage hygiénique des mains.

Recueillir au milieu du jet,

Urines du matin de préférence, ou

ayant séjourné au moins 4 h dans la

vessie.

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Homme :

Lavage mains (eau+savon)

Décalotter le gland.

Antisepsie de la zone uro-génitale avec une

compresse imprégnée d'un antiseptique.

Eliminer le premier jet

Recueil de 20 ml d'urine environ.

24

Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

25

Femme:

Lavage mains (eau+savon)

Ecarter les grandes +petites lèvres

Antisepsie de la zone uro-génitale avec une

compresse imprégnée d'un antiseptique.

Eliminer le premier jet

Recueillir en position accroupie, lèvres écartées

20 ml d'urine environ sans toucher aux bords

récipient.

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Petit enfant et Nourrisson: Toilette minutieuse de la zone uro-génitale

(eau+savon).

Antisepsie de la zone uro-génitale avec une compresse imprégnée d'un antiseptique.

Fixer le sac plastique collecteur à bords adhésifs en pressant sur la périphérie du sac.

Conserver le sac collecteur au max 20 min.

Le remplacer si nécessaire après une nouvelle toilette.

Dès la miction terminée, le collecteur est ôté et les urines sont transvasées flacon stérile acheminées rapidement vers le laboratoire.

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Porteur de sonde à demeure:

Si le prélèvement est effectué lors d’un changement de sonde, faire le prélèvement sur la nouvelle sonde.

Clamper le tuyau d'évacuation du sac collecteur afin de laisser s'accumuler l'urine en amont.

Désinfecter le site de ponction avec une compresse imbibée d'un antiseptique.

Ponctionner directement avec une seringue.

Ne pas déconnecter le système de drainage qui doit rester clos.

jamais dans le sac collecteur.

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Porteur de sonde à demeure:

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Ponction sus-pubienne:

Existence d'un globe vésical 4-5 h après la dernière

miction.

Repérage du globe vésical.

Toilette minutieuse de la zone de ponction

(eau+savon).

Antisepsie de la zone de ponction avec une

compresse imprégnée d'un antiseptique.

Ponctionner avec une aiguille. 30

Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

Urétérostomie (sans sonde)

Après nettoyage soigneux de la stomie, on met

en place un collecteur stérile et l'on procède

comme pour le nourrisson.

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Examen cytobactériologique des

urines (ECBU)

◦ Apport rapide dans le laboratoire

multiplication +++ à température ambiante

X 10 en 1H

X 100 en 2H ……….. À 37°C

◦ Noter tous les éléments nécessaires au

biologiste +++++

◦ CBU sur sonde : seuil d’étude différent

◦ CBU sur néphrostomie : seuil plus bas ++++ 32

Culture du sang circulant : normalement stérile ; pouvoir

diagnostiquer une bactériémie et identifier l’agent infectieux

responsable.

Bactériémie :

* transitoire : décharge brève de bactéries dans le sang sans

manifestations cliniques et spontanément résolutive

(physiologique).

* continue : endocardite, brucellose, fièvre typhoïde….

* intermittentes : décharges répétées à la suite d’infections

diverses.

Septicémie = bactériémie prolongée + état

infectieux qui peut aller du sepsis simple à l’état de

choc septique.

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Examen Bactériologique du sang

= Hémoculture

Examen Bactériologique du sang

= Hémoculture

Comment ?

◦ La ponction veineuse : seule méthode valable pour

prélever le sang en vue de sa mise en culture.

◦ jamais cathéter périphérique

◦ Sites : pli du coude, v. épicrânienne, cou-de-pied,

ombilicale.

◦ procédure

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Examen Bactériologique du sang

= Hémoculture ◦ Quelle quantité ?

Adulte : 10 à 20 ml (bactériémie maximale : 1 bactérie/ml)

Enfant : 1 à 2 ml (densité plus importante)

Nature des flacons: aérobie, anaérobie

(localisations bucco-pharyngée, digestive, gynécologique, pulmonaire)

respect du ratio sang/bouillon.

◦ Quand ?

Hyperthermie >38,5 °C

Hypothermie <36,5°C

Frissons

Avant traitement antibiotique.

Endocardite soupçonnée, : prélever 2 séries de 2 bouteilles à 30-60 min d’intervalle et indiquer sur la demande «endocardite».

◦ Combien ?

2 à 3 par séries/ jour, Max 6 hémocultures (aérobie + anaérobie) en 2 j : 3x2 à 30-60 min d’intervalle le 1er jour et si c’est (-) au bout de 24h, 3x2 à 30-60 min d’intervalle le 2e jour.

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Examen Bactériologique du

liquide céphalo-rachidien (LCR)

Spécimen habituellement recueilli par ponction lombaire.

Essuyer le site de ponction avec un tampon de

chlorhexidine 2% - alcool 70% puis désinfecter avec un

tampon de teinture d’iode 2%.

Insérer l’aiguille à prélèvement entre 2 vertèbres

lombaires selon la méthode habituelle et retirer le stylet

lorsque l’espace sous-arachnoïdien est atteint.

Recueillir le LCR dans 3 flacons stériles sans gel ni

anticoagulants.

La quantité de liquide dans chaque flacon est de 1 à 2 ml

(sauf chez les bébés).

36

Examen Bactériologique du

liquide céphalo-rachidien (LCR)

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• Quantité + importante de liquide : mycoses (2-3 cc),

mycobactéries (3-5cc) et/ou virus.

• 1er flacon : en biochimie, 2ème : microbiologie : ED+culture.

• Envoyer T°C ambiante < 15 min. Ne jamais réfrigérer.

Fragilité de certaines bactéries (méningocoque).

• Chez les patients avec shunt ventriculo-péritonéal ou

réservoir, prélever stérilement au niveau du shunt ou du

réservoir.

• Sans délai (< 30 min) : lyse des polynucléaires.

Biomatérieux

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Mèches, Redons, Lames

Prélèvement

Les prélèvements doivent être pratiqués avec le maximum

d'asepsie et adressés dans des récipients stériles.

Particularités

Les mèches, lames et redons : prélèvements contaminés par

la flore commensale cutanée.

Valeur diagnostique : très discutable.

Réalisation : uniquement contexte infectieux +hémocultures.

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Cathéters

Quand prélever

Seulement en cas de suspicion

d ’infection

Pas de prélèvement systématique

++++

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Cathéters

Réalisation du prélèvement

◦ Désinfecter le pourtour du site du cathéter avec un

tampon de chlorhexidine 2% - alcool 70%.

◦ Retirer le cathéter avec une technique aseptique et

couper le bout distal du cathéter

◦ Couper les 5 derniers cm STERILEMENT

◦ Mettre dans un pot STERILE

1 SEUL cathéter par pot ++++

que le bout de cathéter

41

Cathéters

◦ Apport rapide au laboratoire

Envoyer T°C de la pièce au laboratoire de

microbiologie (< 15 min).

Max = 2 heures: Dessication facile

Multiplication dans le sang

Coagulation dans le cathéter

◦ Noter tous les éléments nécessaires au

biologiste +++++

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La culture de pus d’un site de cathéter est

inadéquate car elle ne représente que la

colonisation de site.

Prélèvements génitaux

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Examens Bactériologiques des

prélèvements génitaux chez l’homme

Toilette préalable du méat urinaire.

Prélèvement le matin.

Urétrite purulente:

écouvillonnage au niveau du méat.

◦ avant émission d’urines

◦ avant traitement antibiotique ou au minimum après 48 H d’arrêt du traitement.

◦ 1er jet d'urine.

Urétrite non purulente recueil de la sérosité à la curette pour ramener

des cellules

◦ Introduire un écouvillon pour chaque recherche dans l’urêtre sur plusieurs mm

◦ en effectuant 3 ou 4 rotations pour recueillir le maximum de cellules.

Lésion du gland ou du prépuce: recueil de la sérosité, du pus ou du

liquide de vésicule.

Chancre: faire sourdre le pus de la lésion sans faire saigner.

ganglions: ponction du ganglion.

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Examens Bactériologiques des

prélèvements génitaux chez l’homme

Prélèvement de sperme

Prélèvement/Recueil

Classiquement après une abstinence de 3 jours

Après une miction suivie d'une désinfection soignée du

gland avec un antiseptique et rinçage

Recueil dans un flacon stérile à large ouverture

Particularités

Le sperme est une sécrétion stérile à l'état normal

Transmission

De meilleurs résultats sont obtenus quand le prélèvement

est fait au laboratoire et l'examen bactériologique

immédiat.

Si c'est impossible : transport rapide au laboratoire à 37°C

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Examens Bactériologiques des

prélèvements génitaux chez la femme

Vulve: écouvillonner sans spéculum la lésion.

Vagin

- Exocol: écouvillonner au centre de la lésion pour

collecter les sécrétions.

- Endocol: Nettoyer l'exocol puis introduire

l'écouvillon dans l'endocol.

Urètre: écouvillonner sur 1 cm le canal urétral.

G. Bartholin: recueil par pression des glandes

N.B: renseignements cliniques ++++.

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Examens Bactériologiques des prélèvements

génitaux chez la femme

Proscrire tout traitement local (crème, gels, savons…)

ainsi que tout rapport sexuel dans les 24 h précédant

l’examen.

à distance de tout traitement antibiotique (> 15 j :

Chlamydiae, > 48 H pour les germes banals).

Après mise en place d’un spéculum à usage unique,

prélever en fonction du tableau suivant :

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Suppurations

48

L’écouvillonnage des sites superficiels

++++ utilisée la plus évidente.

L’écouvillonnage consiste à passer un écouvillon de coton sur

une surface de 1 cm2 de la plaie, dans un mouvement en Z

combiné à une rotation. pas sur les bords de la plaie.

Humecter avec sérum physiologique

L’inconvénient : recueille totalité de la flore aérobie colonisante

= spécificité de cet examen, même en cas de nettoyage

préalable de la plaie.

Noter la localisation du prélèvement sur les écouvillons

(obligatoire +++ surtout en cas de prélèvements multiples)

Joindre un bon de bactériologie renseigné complètement avec le

nom du préleveur, la date et l’heure du prélèvement

(obligatoires)

49

◦ Attention à la contamination par la flore commensale

◦ Éviter les écouvillons

◦ Prélèvements à la seringue

Foyers infectieux ouverts (désinfecter les berges)

infections fermées (désinfectées la peau)

◦ Si recherche d’anaérobies : flacons d’hémocultures

peuvent être ensemencés avec le prélèvement.

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Prélèvements des sites profonds

Examen Bactériologique des

infections fermées

51

Examen Bactériologique des

infections fermées

52

Prélèvements respiratoires

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Prélèvement de Crachat

En absence d'antibiothérapie ou après un arrêt.

A jeun le matin.

Rinçage buccal avec sérum physiologique ou eau du robinet.

Eventuellement avec kinésithérapie ou aérosol.

Prélever les expectorations obtenues après des efforts de toux.

Recueillir des expectorations dans un poudrier stérile.

Préciser les recherches (BK, légionelles, etc…).

Envoie rapide du prélèvement bactéries commensales

aux dépens des bactéries fragiles.

Ne jamais conserver ce prélèvement au froid.

Ne pas accepter les prélèvements salivaires. 54

Lavage bronchoalvéolaire

Fibroscope

Instillation de sérum physiologique dans

Bronches et réaspiration (4 à 6 fois)

Tolérance mauvaise et contamination.

Avantage : recheche de germes opportunistes (Pneumocystis,

CMV, Nocardia), intracellulaire (Legionelle)

Envoyer à T°C de la pièce le plus rapidement possible au

laboratoire de microbiologie.

conserver au réfrigérateur pour un maximum de 24 h.

55

Brossage bronchique protégé

distal

Opérateur entraîné.

Collecter les sécrétions avec une brosse

protégée par un double cathéter.

Envoi rapide au laboratoire:

pour éviter la mort des bactéries fragiles

(pneumocoque, Haemophilus,...)

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Prélèvement ORL

Tous ces prélèvements sont à acheminer dans les 2 h au

laboratoire à T°C ambiante.

Œil :

Frotter l’intérieur de la paupière inférieure et recueillir

des larmes.

Les sinus:

• prélever l'écoulement du méat par aspiration à la

seringue ou à la sonde molle par voie rétro-nasale.

• en cas de lavage de sinus, recueillir le liquide de lavage.

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Prélèvement ORL

Rhino-pharynx

Rinçage buccal préliminaire à l'eau du robinet.

Écouvillonnage : amygdales, pharynx, voile du palais.

Ne pas toucher aux dents et gencives.

Faire plusieurs écouvillons.

Si fausses membranes, prélever en périphérie.

Aspirer les mucosités avec une sonde molle.

Aspiration nasopharyngée

Recherche virale principalement (VRS,

CMV, coqueluche, rougeole).

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Prélèvement ORL

Prélèvement auriculaire

oreille externe:

– écouvillon humide pour collecter les débris ou croûtes

dans le canal auriculaire externe.

oreille interne:

– nettoyer le conduit auditif avec une solution antiseptique.

– recueillir le liquide auriculaire avec une seringue par

aspiration

– si rupture du tympan, écouvillonner le liquide auriculaire

avec un spéculum auriculaire. 59

Recherche de mycobactéries dans les

crachats

Matin et pendant 3 j consécutifs (un spécimen par jour).

Envoyer à T°C de la pièce le plus rapidement possible au

laboratoire de microbiologie (1 à 2 h).

Si non conserver à +4°C pendant max 24 h.

Lorsqu’un patient ne peut produire une expectoration de

qualité : induction par l’inhalothèrapeute.

Rècolter l’expectoration produite : Pot en plastique stérile.

60

Recherche de mycobactéries dans les

urines

Cet examen de seconde intention

exécuté sur prescription spécifique,

effectuée :

◦ sur la totalité de la première miction du matin,

◦ 3 jours de suite

◦ Après restriction hydrique.

61

◦ Renseignements indispensables pour

orienter les recherches :

Copro standard avec recherche de

Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter,

Choléra (voyage)…

Recherche de BMR : à préférer aux

écouvillons.

Recherche de toxines à Clostridium difficile

Recherche de parasite : attention à ne pas

mettre à +4°C.

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Coproculture et parasitologie des

selles

Coproculture et parasitologie des

selles

Echantillon de selles recueilli dans flacon stérile

donné par le laboratoire (Spécifier au patient de

ne pas remplir complètement le flacon).

Envoi (délai: 1- 4 h) au laboratoire ou le garder à

+4°C pendant 8 h.

Recueil des prélèvements liquides, muqueux,

sanglants.

Eviter la contamination par l'urine.

63

Sérologies bactériennes et virales

Particularités

- Il est recommandé de tester simultanément 2 sérums,

1er sérum précoce et 2ème tardif prélevé 3 semaines après,

ou même plus tard (2 mois).

- Les anticorps persistent des mois (ou même des années)

après l’infection, il peut donc être difficile de distinguer

une infection en cours d’une cicatrice sérologique.

Transmission : Délai < 12 h.

Conservation : Un an à – 20°C

64

Prélèvements en virologie

Au niveau du site de multiplication du virus, quand il est

accessible (organe cible, porte d’entrée du virus, site

d’excrétion virale)

Rapidement, au début des signes cliniques,

pendant la phase aiguë de la maladie quand l’excrétion

virale est maximale

Associer plusieurs prélèvements (maladies généralisées,

infections congénitales) ex : CMV = sang et urine

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Prélèvements en virologie

Sang total(leucocytes) : sur tube hépariné, la virémie précède

l'apparition des signes cliniques

Sérum

Selles

Urines

LCR

Liquide amniotique

Les prélèvements effectués à l'écouvillon : milieux de transport :

Milieu de culture ou Bouillon

Tryptose phosphate

Albumine ou de la gélatine

Antibiotiques

Antifongiques

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Prélèvements en virologie

En vue d’un isolement : la viabilité des virus présents doit être préservée

- acheminer le prélèvement le plus rapidement possible au laboratoire < 1h sinon

conservation à +4°C (quelques heures), -80°C++ ou azote liquide (au delà de 36 h), éviter à -20°C

- à l'abri de la dessiccation, de la chaleur, des variations de pH et d'une éventuelle pullulation bactérienne

En vue de la détection directe d'antigènes viraux intracellulaires

prélèvement doit contenir des cellules intactes et en grande quantité

prélèvement transporté et stocké à T°C ambiante ou à + 4 °C (la congélation altère les cellules)

67

Prélèvement de l’environnement

Hospitalier

◦ Caractéristiques particulières des germes

de l’environnement :

Souvent multirésistants aux antibiotiques......

Mais peu virulents.

Préfèrent des T°C d’incubation basses pour

pousser

Ne poussent pas forcément sur les milieux

riches utilisés en pratique médicale

Poussent lentement

Milieux spécifiques préférables : TS (R2A) à

garder plus longtemps pour amléliorer la

sensibilité....

68

Prélèvement de l’ environment

Hospitalier

o La contamination de l'environnement

hospitalier varie :

◦ qualitativement et quantitativement

◦ d'un établissement à un autre,

◦ et au sein d'un même établissement, en fonction

des services,

des patients, des soins pratiqués,

de la capacité de survie des micro-organismes dans

l'environnement

Et de la qualité de l’entretien

69

des méthodes de prélèvement si possible normalisées ou à défaut

standardisées ;

Prélèvement de l’ environment

Hospitalier Types de prélèvements

procédure de qualification d’une installation, ◦ avant le démarrage,

◦ dans un nouvel environnement

à visée de surveillance cadre du plan de maintenance d'une installation

de points critiques : établissement du niveau de base

et suivi

cadre de travaux : évaluation du niveau de risque.

à visée d’investigation si orientation vers une contamination environnementale :

recherche de la source de contamination afin de la supprimer.

Recherche d’un réservoir secondairement environnemental

pédagogique ◦ pour visualiser la présence de micro-organismes dans

l'environnement.

70

Conclusions

Devant la diversité des sites anatomiques

à prélever et des types d’échantillons

biologiques à analyser

le Prélèvement Microbiologique

complexe

71

Conclusions

72

Guide des Prélèvements

Microbiologiques

Communication entre préleveurs

et Biologiste

Prélèvement de Qualité