la cytométrie en flux la cytométrie mesure des cellules comparaison déchantillons paramètres...
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La cytométrie en flux
La Cytométrie Mesure des cellules Comparaison d’échantillons
Paramètres physiquesParamètres chimiques (sondes fluorescentes)Paramètres biologiques
Microscope, photos numériques
Le Flux Dénombrement de particule Passage une à une devant le détecteur Liquide en mouvement
La cytométrie en flux
Le Principe
Le laser
La focalisation hydrodynamique
La focalisation du laser
La diffraction du laser
Séparation des signaux
Les résultats
La cytométrie en fluxLe principe : le laser
laser Argon 488nm
Raie lumineuse monochromatique
Un seul type de photons (dans le bleu)
Forme elliptique après focalisation
Faisceau d’éclairement très concentré
COULTER® EPICS® XL
La cytométrie en fluxLe principe : la focalisation
hydrodynamique
P2
d1
d2
d1 >> d2
P1P2>P1
La cytométrie en fluxLe principe : la focalisation
hydrodynamique
100
1 ml de cellules 106/ml:
12 µm de diamètrecolonne de cellules de 9 km1 cellule / 0.9 cm
Manchon liquidien : 50 à 100 µm
Suspension cellulaire :10 à 15 µm
12
La cytométrie en fluxLe principe : la focalisation du laser
FOCALISATION LASER
Lentilles de focalisation
Le diamètre d'un faisceau laser : 0,7 mm
peu précis
2 lentilles permettent defocaliser le laser de manière àobtenir un faisceau elliptiqueproche, en taille, des événementsà analyser : TRES PRECISTRES PRECIS
La cytométrie en fluxLe principe : la diffusion axiale
photodiode
e-V
La cytométrie en fluxLe principe : la diffusion axiale
Diffusion dans l’axe
Forward scatter (FS, FSc)
Diffraction ++
Réflexion +/-
Réfraction +/-
Taille des particules
La cytométrie en fluxLe principe : la diffusion latérale
i1i2 Réflexion
Réfraction
La cytométrie en fluxLe principe : la diffusion latérale
Diffusion à angle droit
Side scatter (SS, SSc)
Diffraction -
Réflexion ++
Réfraction +
Hétérogénéité du contenu cellulaire
La cytométrie en fluxLe principe : la diffraction du laser
LaserDiffusion axiale
Diffusion latérale + fluorescence
La cytométrie en fluxLe principe : la séparation des signaux
Spécificité relative
Fluorochrome spécifique pour un constituant de la celluleToutes les cellules marquées
Ac.Nucléiques Protéines Ions
Spécificité absolue
Fluorochrome lié à une molécule biologique Substrat fluorogène Ligands: FC, AnV, lectines Anticorps
La cytométrie en fluxLe principe : la séparation des signaux
Sondes fluorescentes: plusieurs fluorescences pour chaque cellule
Fluo1
Fluo2
Fluo3Filtres optiques
Filtres interférentiels
Miroirs dichroïques
Filtres colorés absorbants
La cytométrie en fluxLe principe : la séparation des signaux
500nm 800nm700nm600nm
FITCFITC
PEPEECDECD PECy5PECy5
Emission
Rel
ativ
e F
luor
esce
nce
La cytométrie en fluxLe principe : la séparation des signaux
D1 D2 D3
D5
D4
D1, D2, …: photomultiplicateurs
La cytométrie en fluxLe principe : la séparation des signaux
La cytométrie en fluxLe principe : la séparation des signaux
La cytométrie en fluxLes résultats : la chaîne d’acquisition
h
Ampli
eVPMT
0V
10V
CAD
0
1023
0000000000
0000000001
0000000010
1111111011
11111111111111111110
La cytométrie en fluxLes résultats : Digitalisation /
Histogramme
1110 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 1023
N
Intensité du signal
N
intensité de fluorescence0 1023
N
%
Moy, CV, ...
La cytométrie en fluxLes résultats : analyse d’histogramme
Histogramme
de Distribution
N
intensité
- graphe
- courbe
- profil
Spectre de
fluorescence
inte
nsi
té
moy?Représentation des
résultats sous forme d’histogrammes de distribution de fréquence.
Analyses de populations dans des échantillons hétérogènes
La cytométrie en fluxLes résultats
La cytométrie en fluxLes résultats : Histogramme bi
paramétrique
1
1
0 2 3 4
0
2
3
4
N
Paramètre 1
Para
mèt
re 2
La cytométrie en fluxLes résultats : Histogramme bi
paramétrique
La cytométrie en fluxLes résultats : Combinaison de
paramètres
paramètre1 paramètre2
La cytométrie en fluxLes résultats : Conditionnement de
l’analyse
Diffusion Axiale
Diff
usio
n
laté
rale
Diffusion AxialeDiffusion AxialeDiffusion Axiale
La cytométrie en fluxLes résultats : Conditionnement
couleur
Diff
usio
n laté
rale
Diffusion axiale
Diff
usio
n laté
rale
Diffusion axiale
diffusionlaser
fluo1
fluo2
fluo3
électronique
La cytométrie en fluxSynthése
La cytométrie en fluxLes résultats : immunofluorescence
Excellente spécificité (Ac) théorique
Nombreux contrôles nécessaires Spécificité de l’Anticorps
Fixation non spécifique pour l’antigène
Affinité
La cytométrie en fluxLes résultats : Le contrôle négatif
Ac négatif Ac marqueur1
2
Lecture dérivée des observations au microscope
La cytométrie en fluxApplications : Analyse CD4 / CD8
Dif
f. L
atér
ale
Diff. Axiale
Anti-CD8
Anti-CD4
Sang
Lyse des GR
65%
20%
La cytométrie en fluxApplications : Analyse CD4 / CD8
La cytométrie en fluxApplications : Analyse des leucémies
Dif
fusi
on la
téra
le
CD45
Leuco
Ery
La cytométrie en fluxApplications : Analyse du cycle
cellulaire
Marqueurs de l’ADN
Intercalants
Spécificité relative
G1 M
Dnr
G1 M
Colc
G1 M
Cam
G1 M
Fluorescence proportionnelle à ADN
La cytométrie en fluxApplications : Analyse du cycle
cellulaire
La cytométrie en fluxApplications : Analyse de l’apoptose
Marqueurs membranaires
Marqueurs mitochondriaux
Marqueurs enzymatiques
La cytométrie en fluxApplications : Marquage Annexine V-
FITC-phospatidylsérines
-Annexine V-FITC
Apoptose
Intactes
Nécrose
Iodure de propidium vert
rouge
Témoin CHX
TNF TNF+CHX
IP
AnV
Apotose
Apotose tardive ou nécrose
La cytométrie en fluxApplications : Marquage Annexine V-FITC /
IP
La cytométrie en fluxLe tri par CMF
Cellules en suspension dans un jet de liquide
Formation de goutellettes
Charge Electrostatique
Déviation des gouttelettes
Technologie dérivée des imprimante à jet d ’encre
Jet de liquide instable dans l ’air gouttelettes
Oscillations modifient le point de rupture
La cytométrie en fluxLe tri par CMF : La formation de
gouttelettes
30kHz
d=Cte
La cytométrie en fluxLe tri par CMF : La formation de
gouttelettes
-
0
+
t (µs) ?
?
La cytométrie en fluxLe tri par CMF : La Charge des
gouttelettes
La cytométrie en fluxLe tri par CMF : La déviation des
gouttelettes
+
+
+
+-
-
-
-
0++
+
+
+-
-
-
-
3000 V
+3000 V-3000 V
Cellules
Liquide de veine
+/-
Electronique
Détecteur
La cytométrie en fluxLe tri par CMF
Technique longueSélection sur plusieurs paramètres à la foisChoix entre pureté et rendementBonne pureté >95%ClonagesPréparations pour :
Mise en cultureBiologie moléculaireWestern blotsActivité enzymatiquesEtc …
La cytométrie en fluxLe tri par CMF: Tri des cellules NK
99% CD56+
1,3% CD56+
CD56
SSc
Enricht rosette
Tri CMF
64% CD56+
0 h
3 hneglow
high
Jurkat 7C11
La cytométrie en fluxLe tri par CMF: Inhibiteurs des
caspases
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