population hétérogène seuil analyses quantitatives traitement des données décision principes de...

LA CYTOMETRIE EN FLUX(définition et principes)

DUPERRAY ChristopheService Régional de Cytométrie en Flux

INSERM U475Parc Euromédecine99, rue Puech Villa

34197 Montpellier cedex 5

Qu’est ce que la Cytométrie en flux?

C’est une technologie qui permet la mesure simultanée de plusieurs

caractéristiques physiques d’une cellule.

Quelles sont les informations sur la cellule apportéespar la cytométrie en flux (CMF)?

Sa taille relative (Forward Scatter),

Sa granularité ou sa complexité interne relative (Side Scatter),

Son intensité relative de fluorescence.

Définition:

La cy tomètri e en flu x est définie comme l’étude précise de

cellul es isolées entraîn ées par un f lux liq uid e.

Ell e permet une caractérisation :

Indivi duelle,

Quantitativ e,

Quali tative

de la cellul es

Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite unecombinaison de:

Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules,

Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux,

Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux

électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un

ordinateur.

PopulationHétérogène

Seuil

Analysesquantitatives

Traitementdes données

Décision

Principes de la cytométrie vus par les militaires

POPULATIONHETEROGENELASERANALYSESQUANTITATIVES

DES SIGNAUXLUMINEUX

SEUILTRAITEMENTDES

DONNEES

COMPTAGEDECISIONDE TRI

InformatiquePopulationHétérogène

Seuil

Analysesquantitatives

Traitementdes données

Décision

Laser

Echantillon

Liquide entraineur

Principe du centrage hydrodynamique

Laser

Echantillon

Principe du centrage hydrodynamique

Liquide entraineur

L’OPTIQUE

La source d’excitation consiste en:

Un laser ou une lampe.

Des lentilles pour mettre en forme et focaliser la source d’excitation.

L’optique de collection des signaux consiste en:

Un système de miroirs et de filtres pour diriger et sélectionner certaines

longueurs d’onde vers les détecteurs.

Figure 4: Spectres d’émission. La puissance est fonction du type de la source

utilisée.

les informations sur la cellule apportées par lacytométrie en flux (CMF)?

Sa taille relative (Forward Scatter),

Sa granularité ou sa complexité interne relative (Side Scatter),

Son intensité relative de fluorescence.

FORWARD SCATTER

(Diffusion aux petits angles)

La lumière diffractée est collectée sous un petit angle (compris entre 1 e t 10

degrés),

Le signal est relatif à la taille de la cellule.

SIDE SCATTER

(Diffusion aux grands angles)

La lumière diffractée est collectée à 90° de l’axe du laser,

Le signal est relatif à la granularité et la complexité cellulaire.

LYMPHOCYTES

MONOCYTES GRANULOCYTES

Figure 8: Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses

sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC

diffusion aux grands angles).

QU’EST CE QUE LA FLUORESCENCE?

¿ Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER,

¡ Le fluorochrome réemet l’énergie absorbée par:

+ vibration et dissipation de chaleur,

+ émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée.

Laser

Déviation de Stokes

Spectre d’absorption Spectre d’émission

COLORANT LIAISON/FONCTION l EX. * l EM. @

Hoechst 33342 ADN (bases A-T) 365 402

DAPI ADN (bases A-T) 357 451

Iodure de Propidium ADN (intercalant) 370, 560 631

Bromure d’Ethidium ADN (intercalant) 370, 530 622

Acridine Orange ARN/ADN 492/492 527/630

Alexa 430 conjugaison 430 540

FITC conjugaison 490 543

PE conjugaison 565 578

PerCP conjugaison 488 675

APC conjugaison 642 660

PerCP/Cy5.5 conjugaison 488 695

Cy5.5 conjugaison 678 703

APC/Cy7 Protéines 650 767

Rhodamine 123 potentiel mitochondrial 505 534

BCECF-AM pH 440 530

SNARF-1 PH/traceur 488 580/630

Cascade blue traceur 399 423

Fura Red Ca2+ 450-500 660

INDO-1-AM Ca2+ 331 405/480

Fluo-3 Ca2+ 506 526

Caractéristiques des principaux fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur

d’onde d’excitation, @: longueur d’onde d’émission).

R

λ

-Passe bas

R

λ

-Passe haut

R

λ

-Bande passe

Figure 5: Différents types de filtres utilisés en CMF.(R: Réflection, λ: longueur d’onde)

540

520

500

480

460

500/50500/50PASSEBANDE

540

520

500

480

460

SP500SP500PASSE

BAS

540

520

500

480

460

LP500LP500PASSE HAUT

Figure 6: Différents types de filtres utilisés en CMF.

Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux

PARAMETRE SIGNIFICATION UTILISATION

Diffusion de la lumière aux

petits angles

Proportionnel au diamètre

cellulaire

Identification morphologique

des cellules

Diffusion de la lumière à

angle droit

Proportionnel au contenu

cellulaire

Identification morphologique

des cellules

Fluorescences Proportionnelles à l’intensité

de marquage

Marqueurs cellulaires, ADN,

ARN, fonctions cellulaires...

Tableau 1: Signification des principaux signaux obtenus en cytométrie en flux.

Temps

Intensité

(volts)

0

10

Source

Lumineuse

Flux

0

1024

Conversion

Unités

arbitraires

Photomultiplicateur

Figure 9: Principe de fonctionnement d’un convertisseur analogique digital (ADC).

450 900

0

10

0

1024

900

0

10

0

1024

450

0

10

0

1024

900

0

10

0

1024

450

0

10

0

1024

450

Unités arbitraires

Nombre

de

cellules

CELLULE :

1

2

3

4

5

etc

Temps

Intensité

(volts)

0

10

Source

Lumineuse

Flux

0

1024

Conversion

Unités

arbitraires

Photomultiplicateur

AVAN TAGE ET LIMITES DE LA CMFCe qui distingue la CMF des autres techniques analytiques et préparatives est

qu’elle réunit les cinq caractéristiques essentielles suivantes: analysequantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse multiparamètrique cellulepar cellule, tri.

ANALYSE QUANTITATIVE

SENSIBILITE DE DETECTION

VITESSE DE TRAVA IL

L’ANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES

LE TRI

PRINCIPES DE L’IMMUNOFLUORESCENCE

Les anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants

membranaires spécifiques, permettent de distinguer des sous-populations

lymphocytaires.

∗∗M a r q u e u r f l u o r e s c e n t

C E L L U L E

A n t i g è n e

A n t i c o r p s

F i g u r e 1 : I M M U N O F L U O R E S C E N C E D I R E C T E

∗∗

∗∗

C E L L U L E

A n t i g è n e

A n t i c o r p s d e s o u r i s

M a r q u e u r F l u o r e s c e n t

A n t i c o r p s a n t i - i m m u n o g l o b u l i n e

d e s o u r i s

F i g u r e 2 : I M M U N O F L U O R E S C E N C E I N D I R E C T E

C E L L U L E

∗

∗

∗

∗

A n t i g è n e

A n t i c o r p s d e s o u r i s b i o t y n i l é

S t r e p t a v i d i n e + M a r q u e u r

F l u o r e s c e n t

1µg/ml

2µg/ml

4µg/ml

8µg/ml

16µg/ml

32µg/ml

Controle

Concentration

Moyenne de fluorescence

Concentration de l'AcM en µg/ml

Moyenne de Fluorescence

0

50

100

150

200

250

300

350

0 10 20 30 40

ÉTUDE DE LA SATURATION D’UN AcM (simulation)

Pour les marquages multiples plusieurs fluorochromes sont utilisés

simultanément. Dans ce cas, il faut que:

-leurs longueurs d’onde d’excitation correspondent à la source

lumineuse du cytométre (en général 488nm pour les cytométres les plus

courants),

-leurs longueurs d’onde d’émission soient suffisamment éloignées pour

que leurs signaux soient analysés séparément.

FILTRES

Spectre d’émission du FITC

SIGNAUX++ + -

Longueur d’onde

FILTRES

SIGNAUX+/- ++ +

Longueur d’onde

Spectre d’émission de la PE

FILTRES

SIGNAUX- +/-

Longueur d’onde

Spectre d’émission de la Cyanine

++

Figure 13: Fuites de fluorescence.

a

a

b

b

Figure 14: Cytogramme biparamètrique (FITC/PE) réalisé (a) sanscompensation et (b) avec compensation de fluorescence.

L’analyse multiparamétrique en cytométrie en flux des réactions

d’immunofluorescence permet d’identifier simultanément plusieurs

marqueurs membranaires et/ou intracytoplasmiques de suspensions

cellulaires d’origine animale.

La facilité avec laquelle nous pouvons maintenant étudier simultanément

plusieurs antigènes fournit de grands moyens pour l’étude de populations

cellulaires complexes.

Analyse multiparamétrique : réglage de la sensibilité

Analyse multiparamétrique : réglage fluorescence 1

Analyse multiparamétrique : réglage fluorescence 2

Analyse multiparamétrique : double marquage


R1

R2

R1



R2

R1

R3

R2

R3

R1


MARQUAGE SPECIFIQUE DE L’ADN POUR LA MESURE DU CYCLE

CELLULAIRE

DNA Content

C

e

l

l

N

u

m

b

e

r

0 32 64 96 128 160 192 224 256

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

ASCII.2

DNA Content

C

e

l

l

N

u

m

b

e

r

0 32 64 96 128 160 192 224 256

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

ASCII.2 CELL CYCLE

DATA

Mean G1= 96.4

CV G1 = 3.2

% G1 = 63.0

Mean G2=190.0

CV G2 = 3.9

% G2 = 7.8

% S = 29.0

G2/G1 =1.970

Chi Sq.= 2.4

Analyse du cycle cellulaire d’une lignée tumorale.

2X 3x

3x + ?

Evaluation de la quantité d’ADN par marquage à l’iodure de propidium

Evaluation du cycle cellulaire sur des

populations révélées par immunofluorescence

Cellules totales

Cellules totales et cellules marquées

population hétérogène seuil analyses quantitatives traitement des données décision principes de...

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