introduction générale sur la transduction de...

Introduction générale sur la transduction

de signal

Transduction de signal

Les cellules doivent communiquer

entre elles, même à longue distance

Existent donc des molécules

(hormones, cytokines, facteurs de croissance, etc...) qui

circulent dans l’organisme et qui transmettent les informations

d’une cellule à l’autre

Les cellules au sein d’un même tissu doivent également

communiquer :

Un vaisseau sanguin ayant

subi un dommage va d’abord voir l’arrivée des plaquettes

sanguines, et celles-ci vont produire des facteurs de

croissance pour reconstruire

le vaisseau (multiplication des cellules endothéliales)

Mais toutes les cellules ne doivent pas réagir de la

même manière !!!!

Dans une blessure, les

cellules immunitaires vont se déplacer vers la blessure

pour empêcher une infection.

Les fibroblastes ne se

déplaceront pas, mais vont réagir en produisant des

facteurs de croissance pour que le tissu blessé se

comble avec de nouvelles

cellules.

Une même molécule de signalisation (épinéphrine ici) peut aussi agir différemment selon la cellule touchée

SURVIE

DIVISION

DIFFERENCIATION

MORT

Les signaux transduits (transmis) d’une cellule à l’autre peuvent avoir des

conséquences très différentes

Problème: comment transmettre un signal dans une cellule alors que la membrane

plasmique est étanche aux molécules hydrophiles ?

Fonctions de la membrane plasmique

Maintien d’une haute concentration de matériaux intracellulaires

Maintien hors de la cellule de composants toxiques

Contrôle du mouvement des matériaux dans et hors de la cellule

Permet à la cellule de “sentir” et de réagir àson environnement extracellulaire

Réponses aux SIGNAUX

Les ligands hydrophiles se lient sur un récepteur

de surface cellulaire

Les ligands hydrophobes traversent la membrane

et se lient à des

récepteurs cytoplasmiques

Deux solutions selon le ligand

Types de ligands induisant des cascades de transduction

Hormones stéroïdes(hydrophobes)

Facteurs de croissance, cytokines (protéines solubles) Hormones non-stéroïdes(dérivés d’acides aminés)

Contacts entre récepteurs membranaires

Contact entre un récepteur membranaireet la matriceextracellulaire

Hormone stéroïde

InterféronsInterleukinesEGF, PDGFTNFEpinéphrine

Adhésion focale(intégrines, FAK)

TCR/CMH

cellule endocrinienne

courant sanguin

cellule cible

hormone

ENDOCRINE

cellule envoyant le signal

cellule cible

médiateurlocal

DÉPENDANT DU CONTACT

cellule envoyant un signal

cellule cible

molécule signalliée à la membrane

PARACRINE

AUTOCRINE

Origine du ligand

LES RECEPTEURS MEMBRANAIRES

Ligand

Récepteur

Molécules de

transduction

cibles

cellulaires

La transduction de signal

Récepteurs recrutant des effecteurs possédant l’activité enzymatique (récepteurs couplés aux protéines G)

Récepteurs ayant une activité enzymatique intrinsèque (récepteurs des hormones stéroïdes, récepteurs des facteurs de croissance)

Transduction de signal : les réponses cellulaires sont multiples

Modification Modification Modificationdu métabolisme d’expression de la forme des cellules

des gènes ou de leur mouvement

Le signal transduit peut amplifier une

réponse cellulaire

(activation d’enzymes par exemple)

La plupart des cascades de signalisation implique des protéines phosphorylées

Distribution des groupements

phosphates sur les phosphoprotéines

P-Tyr

P-Thr

P-Ser

Le génome humain a la capacité de coder 2000 kinases et 300 phosphatases différentes

Les protéines sont phosphorylées par des kinases et dé-phosphorylées par des phosphatases

Protein OH + ATP Protein O P

O

O−

O−

+ ADP

Pi H2O

Protein Kinase

Protein Phosphatase

Plus de 500 kinases différentes dans une cellule de mammifère

IMPORTANT : la phosphorylation peut avoir des effets activateurs ou inhibiteurs sur

l’activité selon la protéine considérée

Le signal peut modifier certaines molécules (récepteurs ou protéines intracellulaires associées)

Cascade d'amplification

Les P-Tyr sur les récepteurs sont des sites de recrutement de protéines cytoplasmiques

Comment détecter la phosphorylation des protéines ?

Utilisation d’anticorps spécifiques

Erk-P

Erk

facteur de croissance

(FC)

Erk Erk-P

-FC +FC

L'anti-P-Erk reconnaît spécifiquement le résidu Serine phosphorylé dans la protéine Erk suite à l'activation de la cascade de signalisation

Ligand RécepteurTransmission Transduction

Interférons(protéines solubles)

Plutôt paracrine

Membranairesans activité enzymatique

JAK/STAT

Epinéphrine(dérivé Aa) Endocrine

Membranairesans activité enzymatique

Protéines G (hétérotrimériques), AMPc

EGF, PDGF(protéines solubles)

Plutôt paracrine

Membranaireavec activité enzymatique

Petite protéine G (ras), MAPK

TCR/CMH(récepteursmembranaires)

Contact Membranairesans activité enzymatique

Petite protéine G (ras), MAPK

FasL(protéines solubles)

Plutôt paracrine

Membranairesans activité enzymatique

Protéines à domaine de mort, caspases

Hormones stéroïdes(derivés cholestérol)

Endocrine Cytoplasmiqueà activité transcriptionnelle

Transduction de signal

modulée par les hormones stéroïdes

Hormones stéroïdes

• Glucocorticoïdes

• Mineralocorticoïdes

• Oestrogenes

• Androgenes

• Vitamine D

• Hormones Thyroïdiennes

• Acide Rétinoïque

Les hormones stéroïdes sont des dérivés du cholestérol et sont solubles dans la membrane plasmique

Fonctions des glucocorticoïdes (Cortisol)

• Réguler le taux de glucose

• Maintenir le volume sanguin constant

Fonctions des hormones thyroïdiennes (TH)• Maintenir la pression sanguine

• Réguler la croissance cellulaire

• Participer au développement du système nerveux

• Participation dans la reproduction

Ces hormones diffusent via le sang. Selon les cellules réceptrices, les réponses

cellulaires seront très différentes

Les hormones stéroïdes hydrophobes

peuvent traverser la

membrane plasmique

Elles se lient à un récepteur cytoplasmique

Le couple récepteur/hormone peut alors passer au noyau

Liaison de

l’hormone

42-94% homologie

15-57%

homologie

Les récepteurs des hormones stéroïdes

ont des motifs conservés

Hormonesteroïde

Récepteur activé

hsp90

TATA boxHRE

Espace extracellulaire

Cytoplasme

Noyau

Récepteur inactif

Coactivateurs

Récepteur inactif Récepteur actif

hsp90

La liaison de l’hormone sur son récepteur modifie son repliement. Le récepteur est alors capable de se lier à l’ADN sur les régions promotrices

des gènes activés par les hormones

Les hormones stéroïdes ont un effet direct sur

l’expression de

certains gènes

Les produits de ces gènes de réponse primaire peuvent ensuite agir sur d’autres gènes (réponse secondaire)

Selon la cellule considérée, le panel de gènes induits (réponse primaire ou secondaire) sera différent selon :

La méthylation ou non des gènes selon l’état de différenciation des cellules

L’existence ou non, l’activation ou pas des co-activateurs transcriptionnels

Transduction de signal

modulée par l’interféron gamma

Transduction de signal par l’interféron gamma (IFNγγγγ)

Cette cytokine est produite par certaines cellules immunitaires au cours d’une infection virale ou bactérienne

Le contact entre une cellule et l’IFNγγγγ active l’expression de plus d’une centaine de gènes

L’interféron est produit par les cellules infectées par un virus.

Il protège ensuite les cellules non-infectées (interférence)

Expression de différents gènes en réponseà une induction par l’ IFNγγγγ

Analyse par northern blot

IFNγγγγ (unités/ml) 0 50 100 200

TATARapporteur ++

-

++ ++

Expression du gène rapporteur

TATARapporteur

TATARapporteur

TATARapporteur

-IFNγγγγ +IFNγγγγ

++++

-

+ ++

GAS

Réponse à l’IFNγγγγ Expression constitutive

Tous les gènes inductibles par l’IFNγγγγ contiennent un motif GAS

Analyse par retard sur gel des protéines associées à la séquence GAS

GAS

- + IFNγγγγ

Séquence GAS : TTN5AA

Sélection de mutants ayant perdu la réponse à l’interféron

Comment identifier les molécules impliquées dans la transduction de signal de l’IFNγγγγ ?

Mutagénèse

Transfection d’ADN et sélection de transfectants dans lesquels la réponse à l’IFN a été restaurée

IFN-R chaine alpha

IFN-R chaine beta

JAK1 JAK2 STAT-1

Identification de 5 molécules

STAT-1 total

STAT-1 P-tyr

STAT-1 est phosphorylé sur un résidu tyrosine en réponse à l’IFN

IFNγγγγ - +

Retard sur gel (supershift) :STAT-1 est associée à la séquence GAS

Dimérisation du récepteur de l’IFNγγγγ

Trans-phosphorylation de JAK-1 et JAK-2 (P-Tyr)

Liaison de l’IFNγγγγ

Les JAKs phosphorylent le récepteur (P-Tyr), créant le site de recrutement de STAT-1

Les JAKs phosphorylent STAT-1 (P-ser)

Homodimérisation de STAT-1 phosphorylé

Translocation nucléaire de STAT-1

Transcription des gènes de réponse contenant le motif GAS

Activation complète de STAT-1

20 min après addition d’IFN, STAT revient dans le cytoplasme

1 minute après addition d’IFN, STAT est lié à la séquence GAS

Import nucléaire de GFP-STAT-1

Cellule non traitée Induction 20 min à l’IFN

Induction 20 min à l’IFN

STAT-1 sauvage

STAT-1 muté dans le NLS

Retro-contrôle de la transduction

Elimination des cytokines du milieu extracellulaire (élimination par leur captation, dégradation ou par des récepteurs solubles qui sont éliminés)

SOCS : suppressor of cytokine signalling (famille de protéines). Les SOCS sont induites par les cytokines. Ce sont des inhibitrices de kinase.

Certaines vont inhiber l'action des JAK.

D'autres connectent le récepteur au système ubiquitine-protéasome, permettant la dégradation des récepteurs.

Le même mécanisme existe pour de nombreuses autres cytokines comme l’interleukine 4

Transduction de signal

modulée par l’épinéphrine

Cascade de signalisation de l’épinéphrine dans le foie :

Conséquence biologique : libération de glucose à partir de glycogène

La cascade active l’enzyme permettant cette dégradation (glycogène phosphorylase)

Epinéphrine (rôle dans le foie)

Glycogène phosphorylase

Cascade de

signalisation

de l’épinéphrine

= amplification

Structure du récepteur de l’épinéphrine

Liaison de

l’épinéphrine

Ce récepteur n’a pas d’activité enzymatique et doit s’associer avec une protéine Gpour transduireun signal

La sous-unité αααα de la protéine G s’associe au récepteur

Les protéines G classiques sont hétérotrimériques (alpha, beta et gamma).

Alpha et gamma ont des extrémités lipidiques qui leur permettent d'être ancrées dans la membrane.

Lors de la liaison du récepteur et de l'hormone, la G protéine est recrutée. C'est alpha qui se lie au récepteur sous sa forme GDP.

La liaison au récepteur active le relargage du GDP et la liaison du GTP.

Activation de la protéine G, puis de son effecteur

L’effecteur activé par l’épinéphrine (via les protéines G) est

l’Adenylyl Cyclase (ou adenylate cyclase)

AMP cyclique

L’AMPcyclique active la protéine kinase A

PKAactive

La liaison d’AMPc sur la PKA (protéine kinase A) permetla libération dessous-unités régulatrices(inhibitrices) et l’activationde l’enzyme

La PKA est une sérine-thréonine kinase

Hydrolyse du glycogène induite par

l’épinephrine

PKA

Phosphorylase kinase

Glycogène phosphorylase

Glycogène

Glucose

Bilan de l’amplification due à l’activation de la cascade

La PKA peut aussi passer dans le noyau et phosphoryler CREB, un facteur de transcription

Enzymes de synthèse du glucose

PKA active

Hydrolyse du glycogène(activation de la phosphorylase)

Phosphorylation de CREBet activation de gènes de réponse à l’AMPc(gènes impliqués dans la neo-synthèse de glucose)

Phosphorylation (inhibition)de la glycogène synthase

Selon le type cellulaire, l’épinéphrine a des effets différents pour un même signal AMPc-dépendant

FOIE ADIPOCYTES

Hydrolyse du glycogène

Hydrolyse du tri-acylglycerol

FOIEAdénylate cyclase

Hydrolyse du glycogène

MUSCLEPhospholipase C

Contraction musculaire

Selon le type cellulaire, l’épinéphrine a des effets différents en utilisant des récepteurs différents et une

signalisation différente

La norépinéphrine se lie sur un récepteur alpha-adrénergique qui a pour effecteur la phospholipase C

La phospholipase C produit des messagers

secondaires

PIP2

DAG InsP3 (ou IP3)

DAG : membranaire

InsP3 ou IP3 : cytoplasmique

xx

active

Gp Protein Stimulation of Phospholipase C

Phospholipase C active

L’IP3 se lie à un récepteur localisé en surface du reticulum

Conséquence : sortie du calcium du RE dans le cytoplasme

Ca++

La libération de calcium par le reticulum active la calmoduline qui active à son tour plusieurs enzymes

La caldesmone est activée

Contraction musculaire

La libération de calcium par le reticulum active la PKC (protéine kinase C) qui active à son tour plusieurs protéines

NFκκκκBinactif

IkB

Noyau

P

Activationtranscriptionnelle

PKC activée

Dégradation par le

protéasome

NFκκκκBactif

Retro-contrôles de la cascade :

Cette inhibition se produit à plusieurs niveaux:

- Diminution du taux d'hormone disponible

- Activation de phosphatases qui déphosphorylent les kinases et donc les inhibent.

- Activation d'AMPc phosphodiestérases qui dégradent l'AMPc.

- Arrestine qui se lie au récepteur, l'empêche de lier les protéines G, et l’entraine vers des vésicules d'endocytose

Comment se fait la spécificité de la réponse cellulaire et le choix de l'effecteur par la protéine G ?

Il y a de nombreuses sous-unités de protéines G, dont l'expression est spécifique de tissu pour certaines.

Elles ont des différentiels de reconnaissance des récepteurs et des effecteurs.

20 sous-unités G alpha5 sous-unités G beta

12 sous-unités G gamma

Il y a en plus des protéines adaptatrices (AKAP) qui connectent une G protéine particulière sur un effecteur spécifique.

Transduction de signal

modulée par les facteurs

de croissance

Les plaquettes sanguines émettent du PDGF (Platelet-derived Growth Factor) pour stimuler

la croissance des cellules endothéliales vasculaires

et pour remplacer les cellules endommagées

Forte destruction cellulaire suite aux UV

FGF

Les fibroblastes dermiques synthétisent du FGF

pour activer la prolifération

des kératinocytes des couches profondes

de l’épiderme

Le FGF (Fibroblast Growth Factor) est un facteur de

croissance produit par les fibroblastes localisés dans

la peau

PDGFou

FGF

PDGF-Rou

FGF-R

Les récepteurs des hormones de croissance ont une activité enzymatique : après liaison du ligand, les

récepteurs se phosphorylent sur des résidus tyrosine

Le récepteur de l’EGF phosphorylé devient

le site de recrutement d’unepetite G protéine monomérique

RAS

RAF

MEK-1

Erk1,2

Elk, AP1

La cascade de transduction impliqueensuite une chaine de kinases à

sérine/thréonine, les protéines de la famille des MAPK (MAP kinases)

Gènes régulés via les facteurs de croissance

Proto-oncogènes cellulaires : c-myc, c-fos, c-jun

(activateurs transcriptionnels)

Protéines modulant la réplication : cycline D1(activation de la mitose)

Protéines pro-apoptotiques : p53 Fasanti-apoptotiques : bcl-2

(protection contre la mort cellulaire)

Dans les cellules cancéreuses,on trouvera des mutations dans les cascades de signalisation aux facteurs de croissance

Gliome : PDGF-RCancer du sein : erb-BCancer de l’ovaire : HER-2Cancer de la thyroïde : RET

Dans des cascades de transduction de signal

30 % des tumeurs sont mutées pour RAS

Dans des proto-oncogènes

Leucémies, neuroblastomeCancers du sein, de l’estomac, du poumon

Myc

Mélanocyte Mélanomes

P-Erk

Erk-2

c-Fos

RAS

RAF

MEK-1

Erk1,2

AP1 (c-fos/c-jun/....)

Mutés dans plus de 80% des mélanomes

Dans les mélanomes, ces kinases sont constamment activées suite à une mutation dans cette cascade : les cellules tumorales sont soumises à des signaux

favorisant leur prolifération

Transduction de signal

modulée lors de l’apoptose

L’apoptose est essentielle dans différents mécanismes

APOPTOSE

Lymphocyte Tcytotoxique

Fas/FasL

Granzyme

Mutation dans l’ADN

Apoptose via Fas (élimination de lymphocytes T trop actifs par exemple)

FasL Fas

Mort cellulaire programmée

Lymphocyte T cytotoxique

Elimination par les lymphocytes T cytotoxiques des cellules tumorales ou des cellules infectées par des virus ou des bactéries

Emission de granules de granzyme

- Détection des anomalies- Arrêt du cycle cellulaire

- Tentatives de réparation de l’ADNMUTATION

Une cellule ayant acquis des mutations et n’ayant pu les réparer entrera en apoptose

Cellulenormale

Celluleapoptotique

Corps apoptotique

Cascade d’événementsau cours de l’apoptose

La cellule (noyau

et cytoplasme)

se condense

L’ADN se fragmente

La cellule forme

des corps apoptotiques

Les corps apoptotiques

sont phagocytés par les

cellules immunitaires

Condensation de la chromatine

Evénement détecté au cours de l’apoptose : fragmentation de l’ADN

Ladderd’ADN

Intensité de coloration àl’iodure de propidium

Tai

lled

es c

ellu

les

9%

Cellule normale

43%

Cellule apoptotique

Autre événement détecté : les cellules en apoptose deviennent

perméables à l’iodure de propidium

L’apoptose (mort cellulaire programmée) implique des CASPASES

Les caspases sont des protéases existant sous forme inactive dans la cellule (pro-caspase)

Leur activation implique leur clivage

C: cystéine (dans le site actif)

Asp: aspartate (Aa site de coupure)

Ase: enzyme

Pro-caspase 3

Caspase 3 clivée et activée

Activation des caspasespar clivage

Apoptose via Fas

Apoptose via Fas

Dégradation de protéines par les caspases

Cytosquelettedésorganisé

Inhibition de la réplication

Inhibition de la

réparation de l’ADN

FRAGMENTATION DE L’ADN

La caspase 9 digère certaines protéines des pores nucléaires

La caspase 3 peut franchir les pores

Dégradation de ICAD (inhibiteur de CAD)

Activation de CAD (endonucléase)

Dégradation de l’ADN chromosomique

FRAGMENTATION DE L’ADN

Voie mitochondriale de l’apoptose

Activée par le granzyme ou par une accumulation de mutations dans l’ADN qui n’ont pu être réparées

Elle implique une famille de protéines(bcl-2, bid, bad, bax, etc...) qui module le relargage de cytochrome c de la mitochondrie

cytochrome c

mitochondrie

Apaf-1Apaf-1

Apaf-1

caspase 9caspase 9

caspase 9

“apoptosome”apoptose

caspase 3

Apaf-1

caspase 9

Clivage de Bid

Caspase 8activée

Granzyme B

Bad ou bax

Echec de la réparationApoptose (voie mitochondriale)

p53 active la transcription de protéines pro-apoptotiques et la mort mitochondriale est initiée

Inhibition de l’apoptose

Bcl-2Bcl-X

IAP (famille)XIAP (le plus actif de la famille)

Agissent à plusieurs niveaux de la cascade

Activation de transcription:

- bcl-2

- XIAP

Inhibition de Bad par phosphorylation

Réduction d’expression de:

- Fas

-p53 (activateur de la transcription de Bax)

Inhibition de l’apoptose par les récepteurs des facteurs de croissance

Les cellules tumorales peuvent devenir résistantes à l’apoptose

Activation des cascades de signalisation des facteurs de croissance (anti-apoptotique)

Réduction d’expression du récepteur Fas

Sur-expression des molécules anti-apoptotiques (exemple: Bcl-2 est sur-exprimé dans certaines lymphomes)