effekt des anti-gangliosidären monoklonalen antikörpers ... · ganglioside monoclonal antibody...
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Aus der Kinderklinik der Universität Düsseldorf
Direktor: Prof. Dr. med. H. G. Lenard
Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4
auf die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3-Zellen.
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Marius Skasa
aus Falkenberg in Polen
1999
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden in: Stephan V., Seibt A., Dukanovic D., Skasa
M., Swaim W.D., Berenstein E.H., Siraganian R.P., Wahn V. (1997) �Anti-
ganglioside monoclonal antibody AA4 selectively inhibits IgE-induced signal
transduction pathways in rat basophilic leukemia cells� , Mol. Immunol., 34, 227-
235 veröffentlicht.
Dekan: Professor Dr. med.Gert Muhr
Referent: Privat-Dozent Dr.med.Volker Stephan
Koreferent
Tag der mündlichen Prüfung:
______________________________________________________________________________
To my three ladies with love
1 1 1 1 1 EINLEITUNG ........................................................................................................................................ 1
1.1 PHYSIOLOGIE DER HUMANEN MASTZELLEN UND BASOPHILEN GRANULOZYTEN........................................... 21.1.1 Morphologie und Ultrastruktur ........................................................................................... 31.1.2 Mediatoren............................................................................................................................ 61.1.3 Rezeptoren der Zelloberfläche............................................................................................ 151.1.4 Abstammung und Differenzierung ...................................................................................... 171.1.5 IgE-Rezeptor mit hoher Affinität ........................................................................................ 19
1.1.5.1 Struktur und Verteilung ...................................................................................................................201.1.5.2 Interaktionen des humanen IgE-Rezeptors ...................................................................................... 23
1.2 AGONISTEN DER HUMANEN BASOPHILEN GRANULOZYTEN UND MASTZELLEN ........................................... 281.3 FUNKTION DER BASOPHILEN GRANULOZYTEN UND MASTZELLEN ........................................................... 311.4 RBL-2H3-ZELLEN ALS VERSUCHSMODELL FÜR DIE HUMANEN BASOPHILEN GRANULOZYTEN UND
MASTZELLEN .................................................................................................................................. 371.4.1 Beschreibung der RBL-2H3-Zellinie .................................................................................. 371.4.2 Beschreibung der RBL-2H3-m3.7-Zellinie ......................................................................... 381.4.3 Signalübertragungsmechanismen in RBL-Zellen ............................................................... 39
1.4.3.1 Intrazelluläres Calcium ...................................................................................................................441.4.3.2 Degranulation .................................................................................................................................47
1.5 GANGLIOSID G D1b
............................................................................................................................................................................................. 481.5.1 Allgemeines ......................................................................................................................... 481.5.2 Der monoklonale Antikörper AA4 ...................................................................................... 49
1.6 FRAGESTELLUNG ............................................................................................................................. 51
2 MATERIALIEN UND METHODIK................................................................................................. 55
2.1 QUIN-2 ALS INDIKATOR FÜR CALCIUMKONZENTRATION ......................................................................... 552.1.1 Chemische Eigenschaften von Quin-2 ................................................................................ 552.1.2 Physikalische Eigenschaften von Quin-2 ........................................................................... 572.1.3 Prinzip der spektrofluometrischen Messungen mit Quin-2 ................................................ 592.1.4 Kalibrieren der Calziumkonzentration bei den Messungen mit lebenden Zellen ............... 61
2.2 ZELLKULTUR................................................................................................................................... 642.3 ZELLSTIMULATION ........................................................................................................................... 65
2.3.1 Messung der Serotoninfreisetzung ...................................................................................... 672.3.2 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration........................................................... 69
3 ERGEBNISSE........................................................................................................................................ 73
3.1 BESTIMMUNG DER SPEKTRALEN EIGENSCHAFTEN VON QUIN-2............................................................... 733.1.1 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/AM ......................................................... 733.1.2 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2................................................................ 753.1.3 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/Ca2+
................................................................................................ 763.2 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE DES KOMPLEXES QUIN-2/Ca2+
............................................................................ 783.3 BESTIMMUNG DER ABHÄNGIGKEIT DER FLUORESZENZINTENSITÄT VON DER QUIN-2/Ca²+-KONZENTRATION ....
................................................................................................................................................793.4 AUTOFLUORESZENZ DER NATIVEN RBL2H3-ZELLEN .............................................................................. 813.5 ERMITTLUNG DER OPTIMALEN UND SUBOPTIMALEN ANTIGENKONZENTRATION FÜR DIE
STIMULATIONSVERSUCHE ................................................................................................................. 823.6 UNTERSUCHUNG DER EFFEKTIVITÄT DES LADEVERFAHRENS VON RBL-2H3-ZELLEN MIT QUIN-2/ AM .......... 84
3.6.1 Angebotene Quin-2/AM-Konzentration versus intrazelluläre Quin-2-Konzentration ....... 853.6.2 Ladezeit versus intrazelluläre Quin-2-Konzentration ........................................................ 86
3.7 UNTERSUCHUNG DER AUSWIRKUNG DER UNTERSCHIEDLICHEN QUIN-2/AMM-KONZENTRATIONEN
AUF DIE FUNKTION DER RBL2H3-ZELLEN .......................................................................................... 87
Inhaltsverzeichnis I______________________________________________________________________________
3.8 BESTIMMUNG DER EXTRAZELLULÄREN QUIN-2 FRAKTION BEI ROUTINEMÄSSIG GELADENEN
RBL-2H3-PROBEN .......................................................................................................................883.9 MESSUNG DER SEROTONINFREISETZUNG UND DES CALCIUMEINSTROMS ................................................... 89
4 DISKUSSION ........................................................................................................................................ 99
4.1 ETABLIERUNG DER METHODIK ........................................................................................................... 994.2 EFFEKT DES ANTI-GANGLIOSIDÄREN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS AUF DIE CALCIUMKONZENTRATION UND
SEROTONINFREISETZUNG DER RBL-2H3- UND RBL-2H3-M3.7-ZELLEN ........................................101
5 ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................................... 109
6 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................ 111
7 DANKSAGUNG .................................................................................................................................. 130
8 LEBENSLAUF .................................................................................................................................... 131
II Inhaltsverzeichnis______________________________________________________________________________
Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1 Humane Mastzelle der Haut..................................................................... S. 4Abbildung 2 Schema der Synthese der Lipidmetaboliten in humanen Mastzellen....... S. 9Abbildung 3 Biologische Effekte der Mediatoren, Proteasen und Zytokinen der
Mastzellen................................................................................................S. 13Abbildung 4 Struktur des hochaffinen IgE Rezeptors (FcεRI).................................... S. 22Abbildung 5 Mastzellen als Effektorzellen der angeborenen und erworbenen Immunität.
................................................................................................................S. 33Abbildung 6 Ein hypothetisches Modell der Interaktion der Mastzellen und T- und B-
Lymphozyten........................................................................................... S. 35Abbildung 7 Schema der Signalübertragungsmechanismen in RBL-2H3-Zellen....... S. 41Abbildung 8 Struktur der α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD
1b......................S. 50
Abbildung 9 Formeln von Quin 2 und Quin 2/AM...................................................... S. 55Abbildung 10 Absorptions- und Emissionsspektra von Quin 2 bei unterschiedlichen
Calciumkonzentrationen..........................................................................S. 58Abbildung 11 Schema eines Spektrofluorometers...................................................... S. 60Abbildung 12 Absorptionsspektrum von Quin 2/ AM. ..............................................S. 74Abbildung 13 Emissionsspektrum von Quin 2/ AM. ..................................................S. 74Abbildung 14 Absorptionsspektrum von Quin 2. ........................................................S. 75Abbildung 15 Emissionsspektrum von Quin 2. ...........................................................S. 76Abbildung 16 Absorptionsspektrum von Quin 2/Ca2+. ................................................S. 77Abbildung 17 Emissionsspektrum von Quin 2/Ca2+. ..................................................S. 77Abbildung 18 Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin 2/Ca2+. .....S.79Abbildung 19 Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration des Kom
plexes Quin 2/Ca2+.................................................................................S.80Abbildung 20 Absorptionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Ab
sorptionsspektrum von Komplex Quin 2/Ca2+. ......................................S.81Abbildung 21 Emissionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Emissions
spektrum von Komplex Quin 2/Ca2+. ....................................................S.82Abbildung 22 Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration der stimulierten RBL-
2H3-Zellen in Abhängigkeit von DNP35
HSA-Konzentration................S.83Abbildung 23. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung der RBL-2H3-Zellen von der
DNP35
HSA-Konzentration. ...................................................................S.84Abbildung 24. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zel-
len von der angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration....S.85Abbildung 25. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zel
len vom Dauer des Ladevorganges mit Quin-2/AM. ...........................S. 86Abbildung 26. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen von der ange
botenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration.............................S. 87
Verzeichnis der Abbildungen III______________________________________________________________________________
Abbildung 27. Abhängigkeit des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration inRBL-2H3-Zellen von der angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration. ..................................................................................................S. 88
Abbildung 28. Spontane Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen. ..............................................................................................................S. 90
Abbildung 29. Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen nach der Stimulation. .........................................................................................S. 91
Abbildung 30. Basale intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3- m3.7-Zellen in Abhängigkeit von Präinkubation mit monoklonalem Anti körper AA4. ......................................................................................S. 93
Abbildung 31. Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL- 2H3-m3.7-Zellen nach der Stimulation. .............................................S. 94
Abbildung 32. Effekt des monoklonalen anti-gangliosidären Antikörpers AA4 auf die Serotoninfreisetzung und die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL- 2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen nach der Stimulation. .....................S. 96
Abbildung 33. Effekt des Maus-Antikörpers der IgG1-Klasse auf die Serotoninfreisetzung und die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3-Zellen nach der Stimulation mit DNP
35HSA. ..............................................................S. 97
IV Verzeichnis der Abbildungen______________________________________________________________________________
1______________________________________________________________________________
1 Einleitung
Die humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten wurden erstmalig
von Paul Ehrlich im Jahr 1877 (1) resp. 1879 (2) entdeckt und beschrieben. Der
Erstbeschreiber charakterisierte seine Entdeckung als sich basophil anfärbende,
mit prominenten, metachromatischen, cytoplasmatischen Granula ausgestattete
Zellen, deren Funktion er damals in Speicherung der phagozytierten Nährstoffe
sah. Erst im Laufe des folgenden Jahrhunderts konnten weitere Erkenntnisse über
die zentrale Rolle, die diese Zellen mit von ihnen sezernierten Mediatoren bei den
Entzündungs- und Überempfindlichkeitsreaktionen spielen, gewonnen werden. Die
beiden Zellpopulationen weisen Gemeinsamkeiten in ihrer Struktur, Funktion und
Aktivierungsmechanismen auf. Beide enthalten zahlreiche prominente Granula,
die sich durch hohen Gehalt an sulphatierten Proteoglykanen metachromatisch
anfärben lassen. Mastzellen und basophile Granulozyten synthetisieren und spei-
chern Histamin und Proteasen, die bei Aktivierung freigesetzt werden. Die physio-
logische Aktivierung durch die Kreuzaggregation der hochaffinen Immunglobulin
E-Rezeptoren (FcεRI) über die Bindung der Antigene, die von antigenspezifischen
Immunglobulin E-Moleküle erkannt und gebunden werden, resultiert in der
Degranulation und Freisetzung der präformierten und de novo synthetisierten Media-
toren sowie in der Induktion der Transkription der mRNA der zahlreichen Zytokine.
Die Mediatoren und die Zytokine definieren die Rolle der beiden Zellpopulationen
bei der Auslösung der allergischen bzw. inflammatorischen Reaktionen. Die Mast-
zellen sind die Haupteffektorzellen der allergischen Sofortreaktion, wo basophile
Granulozyten eine wichtige Rolle in der Spätreaktion (late phase reaktion) und in
der Überempfindlichkeit-Typ IV-Reaktionen (delayed-type hypersensitivity), vor
allem der humanen Haut und Lungen, spielen.
Darüber hinaus wird eine wichtige Funktion der Mastzellen und der
basophilen Granulozyten in vielen weiteren physiologischen Reaktionen des
menschlichen Organismus vermutet. Im Laufe des letzten Jahrzehntes gewonne-
ne Erkentnisse lassen eine wichtige Rolle, die diese beide Zellpopulationen über
die Synthese und die Freisetzung der Zytokine nicht nur als Effektorzellen der
allergischen Reaktionen aber auch in der Initierung und Modulation der Immun-
antwort bei den inflammatorischen Reaktionen, bei antimikrobiellen Abwehrreak-
tionen, bei der endogenen Fibrino- und Thrombolyse und bei der Entstehung der
Organfibrose spielen, erkennen.
Die früher angenommenen Ähnlichkeiten dieser beiden Zellpopulationen
konnten durch die Erkentnisse über weitgehende Differenzen hinsichtlich der Mor-
phologie, Repertoire an Mediatoren, Zytokine und Oberflächenrezeptoren sowie
Funktion, wo IgE vermittelte Mediatorenfreisetzung nur eine Facette der sehr aus-
differenzierten Effektormechanismen darstellt, weitgehend widerlegt werden. Wei-
terhin bleibt die eigentliche Rolle, die diese beiden Populationen unter physiologi-
schen Bedingungen spielen, weitgehend unklar.
1.1 Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten
Die Mastzellen sind eine klassische gewebeständige Population und daher
unter physiologischen Bedingungen in der Blutbahn und im Knochenmark so gut
wie nicht anzutreffen. In Rahmen der malignen Mastozytose und Mastzellen-Leuk-
ämie kommen die neoplastischen Klone der Mastzellen im peripheren Kreislauf
vor. Bei gesunden Individuen verteilen sich die Mastzellen in allen bindegewebigen
Strukturen, vor allem in der Nähe der Blut- und Lymphgefäße, der Nerven und in
den Schleimhäuten des Respirations- und Gastrointestinaltraktes. Die Mastzellen
können in fast allen Gewebearten vorkommen, finden sich jedoch überwiegend
an den großen Körperbarrieren und in bestimmten muskulären Organen wie Herz,
Gefäße und Uterus.
Die basophilen Granulozyten finden sich nur in einer kleinen Anzahl in der
Blutbahn und stellen ca. 0,2% (0,0-1,0%) der gesamten Leukozytenpopulation
dar. Sie finden sich vermehrt intravasal bei allergischen und parasitären Reaktio-
nen sowie bei neoplastischen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems und
beim myelodysplastischen und myeloproliferativen Syndrom. Die Gewebe-
penetration erfolgt nur in Rahmen einer Entzündungsreaktion. Trotz einzelner
funktioneller und phänotypischer Eigenschaften, die die humanen basophilen
Granulozyten mit den Mastzellen teilen, wie die Expression von FcεRI und
2 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 3______________________________________________________________________________
Histaminliberation, sind die humanen basophilen Granulozyten entwicklungsge-
schichtlich, phänotypisch und funktionell eng mit den eosinophilen Granulozyten
verwandt (3).
1.1.1 Morphologie und Ultrastruktur
Die reifen Mastzellen (4, 5, 6) sind runde oder ovale mononukleäre, ca.
12,6-13,5 µm messende Zellen. Deren Cytoplasma ist mit multiplen, im Durch-
schnitt ca. 1000, mit Volumen von 0,3 µm3, basophilen sekretorischen Granula
gefüllt. Der Nucleus ist mit 4-7 µm relativ groß, rund, nicht selten exzentrisch gele-
gen und von den Granula verdeckt. Elektronenmikroskopische Untersuchungen
der Ultrastruktur der Mastzellen zeigen villöse Strukturen auf der Zelloberfläche,
einzelne Mitochondrien, einen schwach ausgeprägten Golgi-Apparat, rauhes
endoplasma-tisches Reticulum, Ribosomen und fibrilläre Strukturen des
Zytoskeletts. Es finden sich cytoplasmatische Filamente und lipidhaltige Körper-
chen (lipid bodies), deren Funktion die Synthese der Arachidonsäuremetaboliten
ist. Die sekretorischen Granula sind mit der Zellmembran verbunden und enthal-
ten verschiedene Ultrastrukturen wie �scrolls�, Kristalle und Partikel oder eine Kom-
bination dieser drei Strukturen. Die für die Sekretionsgranula der basophilen
Granulozyten typischen Charcot-Leyden-Kristalle (CLC) finden sich nicht. Die
Granula der Mastzellen speichern die präformierten Mediatoren (s. Kap. 1.1.1.2),
die in Rahmen der Degranulation nach der Aktivierung der Zelle freigesetzt wer-
den. Es konnten zwei Typen der Degranulation für Mastzellen und basophile
Granulozyten gezeigt werden: 1. die schrittweise verlaufende Degranulation
(piecemeal degranulation) mit typischen Zeichen der leeren bzw. halbleeren Granula
ohne Verschmelzung miteinander oder mit der Zellmembran und mit Verbleib der
entleerten Granula im Cytoplasma (7) sowie 2. die anaphylaktische Degranulation
mit konfluierenden Granula, Exocytose und Entleerung der Riesengranula durch
Verschmelzung mit der Zellmembran (8). Die immuncytochemischen Untersuchun-
gen von Irani et al. (9) zeigten das Vorhandensein zweier unterschiedlicher Phä-
notypen der humanen Mastzellen, die abhängig von ihrem Gehalt an neutralen
Proteasen MCT und MC
TC genannt werden. Die MC
TC-Mastzellen enthalten die
Tryptase und die Chymase und machen die Mehrheit der Mastzellenpopulation
der Haut, der Synovia, des Herzens, der intestinalen Submukosa und 10 % der
Mastzellen der Lunge aus. Die MCT -Mastzellen enthalten nur die Tryptase, sind
vorwiegend in der intestinalen Mucosa anzutreffen und machen ca. 90% der pul-
monalen Mastzellenpopulation aus. Bei den beiden Subpopulationen finden sich
die Unterschiede beim Auftreten bei bestimmten Krankheitsbildern und Hinweise
auf die Unterschiede in dem Satz ihrer Zytokine, was die Annahme der divergie-
renden funktionellen Bedeutung als berechtigt erscheinen läßt. Die MCT -Mast-
zellen scheinen primär in die Abwehrfunktionen des Organismus eingebunden zu
sein. Ihre Anzahl ist um die Zentren der Proliferation der Th2-Lymphozyten sowie
Abbildung 1 Humane Mastzelle der Haut. Aus: Dvorak A.M. (1997) �New aspects of mast cellbiology.�Int.Arch.Allergy Immunol., 114, 1-9
4 1 Einleitung______________________________________________________________________________
bei allergischen und parasitären Erkrankungen erhöht und bei Patienten mit ange-
borenen und erworbenen Immundefektsyndromen (congenital and acquired
immunodeficiency syndrome) erniedrigt (10). Die MCTC
-Mastzellen scheinen für
die Angiogenese und die Geweberemodelierung verantwortlich zu sein. Sie finden
sich in erhöhter Anzahl nur bei fibrotischen nicht jedoch bei allergischen und para-
sitären Erkrankungen. Auch die Oberflächenrezeptoren dieser beiden
Subpopulationen weisen einige Unterschiede auf. Da die beiden Subtypen FcεRI
exprimieren, sind sie verständlicherweise in der Lage an allen IgE-vermittelten
Reaktionen teilzunehmen.
Lichtmikroskopisch (11) präsentieren sich die basophilen Granulozyten als
mittelgroße, polymorphe, runde Zellen mit einem Durchmesser von 10-18 µm. Ihr
Kern ist vielgestaltig entweder monolobulär oder bi -bzw. multilobulär, teilweise
eingestülpt mit grober Chromatinstruktur. In der panoptischen Färbung nach
Pappenheim imponiert diese als rotviolet. Das Cytoplasma der basophilen
Granulozyten, da oxyphil, färbt sich rosa. In dem Cytoplasma finden sich multiple,
unterschiedlich große, kugelförmige, basophile also blauviolet gefärbte Granula,
die über dem Zellkern liegen. An der Zelloberfläche finden sich unregelmäßige
Membranfortsätze. Elektronenmikroskopisch stellen sich die basophilen Granula
mit einem Durchmesser von 0,2-1,2 µm als eine Ansammlung von feinen Parti-
keln von einer zweischichtigen Membran umgeben mit unterschiedlich
elektronendichten Einlagerungen dar. Diese Granula enthalten präformierte Media-
toren. Die Charcot-Leyden-Kristalle können manchmal detektiert werden, sind aber
für diese Zellpopulation, da auch in eosinophilen und basophilen Myelozyten an-
zutreffen, nicht spezifisch. Die Zellen enthalten Mitochondrien und cytoplasmatische
glykogenhaltige Vesikel. Der Golgi-Apparat und das endoplasmatische Reticulum
treten nicht besonders prominent auf. Die Degranulationsmechanismen mit
�piecemeal degranulation� und �anaphylactic degranulation� entsprechen denen
der Mastzellen.
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 5______________________________________________________________________________
1.1.2 Mediatoren
Eine Aktivierung der humanen Mastzellen führt über die Kreuzvernetzung
der hochaffinen Immunglobulin-E Rezeptoren (FcεRI´s) zur Degranulation und Frei-
setzung der metabolisch aktiven Mediatoren. Mediatoren sind hormonähnliche
Wirkstoffe, die durch verschiedene Zellen bzw. Gewebe produziert und im Rah-
men der physiologischen und pathologischen Reaktionen sezerniert und auf cha-
rakteristische Weise entweder in der Nähe oder entfernt ihrer Bildungsstätte wirk-
sam werden (12). Die von Mastzellen synthetisierten Mediatoren können in
präformierte Mediatoren der sekretorischen Granula, nach der Aktivation de-novo
synthetisierte Lipidmediatoren und Zytokine aufgeteilt werden.
Die basophilen Granulozyten so wie die Mastzellen reagieren auf die Akti-
vierung via Kreuzvernetzung der FcεRI´s mit Degranulation und Liberation der
präformierten Mediatoren, de-novo Synthese und Freisetzung der Lipidmediatoren
und Zytokine. Trotz der vielfachen Ähnlichkeiten der beiden Populationen zeich-
nen sich die grundlegenden Unterschiede ab.
Die Gruppe der präformierten Mediatoren umfaßt Histamin, Proteoglykane,
neutrale Serinproteasen, Sulphatasen und Exoglykosidasen.
Histamin (4-(2�-Aminoäthyl)-Imidazol) ist das einzige von humanen Mast-
zellen produzierte biogene Amin (13), das die besondere und herausragende
Funktion dieser Zellen bei den inflammatorischen Reaktionen mitdefiniert. Das
durch die Decarboxylierung der Aminosäure Histidin im Golgi-Apparat entstehen-
des Histamin wird als Komplex mit Carboxilgruppen der Seitenketten der
Proteoglykane und Proteine in den sekretorischen Granula gespeichert. Das do-
minierende Proteoglykan der humanen Mastzellen ist zu 75 % das Heparin. Das
Histamin wird im geringerem Grade auch an ein anderes Proteoglykan
Chondroitinsulphat E gebunden. Die Bindung an die Proteoglykane beeinflußt die
Freisetzungsgeschwindigkeit des Histamins und der Proteasen. Die Proteoglykane
stabilisieren das Histamin sowie weitere Mediatoren wie neutrale Proteasen und
saure Hydrolasen. Sie entfalten selbständige Wirkungen wie Inhibition der Kom-
plement- und Kallikreinkaskade, Antikoagulation und Verstärkung der Bindung
zwischen dem Kollagen und Fibronectin. Der Gehalt an Histamin in den Mast-
zellen variiert abhängig vom Ort ihres Vorkommens zwischen 1-3 pg / Zelle
6 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 7______________________________________________________________________________
(Mastzellen der Mucosa) bis 3-8 pg / Zelle (Mastzellen der Lunge, Haut, des lym-
phatischen Gewebes und des Intestitiums). Nach der Freisetzung entfaltet das
Histamin über spezifische H1, H
2, H
3 und H
ic-Rezeptoren seine mannigfaltige
Wirkung. Via H1-Rezeptor kommt es u.a. zur Dilatation und Erhöhung der Gefäß-
permeabilität, Kontraktion der glatten Muskulatur besonders des Respiration- und
Gastrointestinaltraktes. Über H2-Rezeptor wird die zytotoxische Wirkung der Lym-
phozyten, Mediatorenfreisetzung und Rezeptorenexpression der Granulozyten
erhöht. Die Aktivierung der H3-Rezeptoren bewirkt die Freisetzung von PGI
2 durch
die Endothelzellen u.a.. Hic ist ein intrazellulärer Histamin-Rezeptor mit Wirkung
der Promotion der Zellproliferation und des Wachstums. Da das Histamin in vivo
durch Histamin-N-Methyltransferase und Diaminoxidase (Histaminase) relativ
schnell (1-2 Min.) degradiert wird, erscheint die Wirkung des Histamins auf den
direkten Ort seiner Sekretion beschränkt zu sein.
Die Gruppe der neutralen Proteasen umfaßt die Tryptase, Chymase und
Carboxypeptidase B.
Die Tryptase ist eine tetramerische Trypsin-ähnliche Serinprotease mit ei-
nem MG von ca. 130 kD. Tryptase aktiviert die Kollagenase und Urokinase, be-
sitzt die Kallikreinartige Aktivität der Degradation der Matrixproteine wie Fibronectin
und Kollagen Typ VI, stimuliert die Freisetzung von IL-8 und ist mitogen für
Fibroblasten, Epithelzellen und glatte Muskelzellen der Trachea. Die weiteren wich-
tigen Funktionen der Tryptase sind die Spaltung des Komplementfaktors C3 in
C3b und C3a, die chemotaktische Wirkung auf eosinophile und neutrophile
Granulozyten, die Induktion der Synthese von Kollagen I durch die Lungenfibro-
blasten sowie zusammen mit Heparin die Biodegradation von C3a und
bronchodilatatorischen Peptide zu inaktiven Peptide (14). Die zwei Formen der
Tryptase, α-Tryptase und β-Tryptase, sind Produkte der Transkription zweier
unterschiedlicher Gene. Die α-Tryptase wird konstitutionell sezerniert. Ihre
intravasale Konzentration spiegelt die Anzahl der Mastzellen des Organismus wie-
der. Die β-Tryptase wird in den sekretorischen Granula gespeichert und ihre
intravasale Konzentration korreliert mit dem Grad der Aktivierung der Mastzellen
(15). Die Chymase ist eine monomerische Chymotrypsin-ähnliche Protease, die
Prokollagenase und Gelatinase aktiviert, IL-4 degradiert und für die Konversion
von IL-1 zu IL-1β und Angiotensin I zu Angiotensin II verantwortlich ist (16). Die
weiteren wichtigen Funktionen sind die Biodegradation von Kollagen Typ IV und
Aufschließen der dermal-epidermalen Verbindungen (junctions). Die Carboxy-
peptidase B ist eine 35 kDa Metalloprotease, die für die Entfernung der
carboxyterminalen Residuen der zahlreichen Proteine wie Angiotensin, Leu-
Enkephalin, Neuromedin und Neurotensin zuständig ist und mit dem Phänotypus
MCT der Mastzellen assoziiert ist. Sowohl Tryptase wie Chymase und
Carboxypeptidase B sind in den sekretorischen Granula als Komplexverbindun-
gen mit Heparin enthalten und werden nach der Aktivierung der Zelle freigesetzt.
Die neutrale Protease Cathepsin G wird in MCT-Mastzellen gefunden. Die maturen
Mastzellen enthalten in ihren sekretorischen Granula eine Anzahl der Hydrolasen
wie β-Hexosaminidase, β-Glukuronidase, β-D-Galaktosidase und Arylsulphatase,
die gleichzeitig mit Histamin bei der Degranulation freigesetzt werden.
Histamin ist der wichtigste präformierte Mediator der basophilen Granulozyten
(17). Es wird durch die Decarboxylierung des Histidins im Golgi-Apparat synthe-
tisiert und an das Proteoglykan Chondroitinsulfat A gebunden und in sekretori-
schen Granulae gespeichert. Chondroitinsulfat A weist strukturelle Verwandschaft
mit Chondroitinsulfat E der Mastzellen auf und seine Wirkung ist mit der des
Heparins identisch jedoch schwächer ausgeprägt. Der Gehalt an neutralen
Serinproteasen unterscheidet die basophilen Granulozyten eindeutig von den
Mastzellen. Die Chymase und die Carboxypeptidase werden von basophilen
Granulozyten nicht synthetisiert, die Tryptase nur in kleinsten, kaum detektierbaren
Mengen.
Weitere wichtige Gruppe der Mediatoren der Mastzellen sind die Metaboliten der
Arachidonsäure (Lipidmediatoren).
Im Gegensatz zu den präformierten Mediatoren werden die Lipidmediatoren
erst nach der Aktivierung der Mastzellen via FcεRI oder durch Zytokine de-novo
synthetisiert und freigesetzt. Mindestens zwei Phospholipasen A2 (PLA
2) sind für
die Mobilisierung von Arachidonsäure in Mastzellen verantwortlich (18).
Cytosolische Phospholipase A2 (cPLA
2) wird durch FcεRI-vermittelten Anstieg
der ([Ca²+]i) aktiviert. Nach der dadurch bedingten Translokation zur Kernmembran
generiert sie freie Arachidonsäure, die überwiegend zur Leukotriensynthese ver
8 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 9______________________________________________________________________________
wendet wird. Die sekretorische Phospholipase A2 (sPLA
2) lagert in Granulaeund
wird nach der Aktivierung der Zelle via FcεRI oder durch Zytokine freigesetzt. Die
sekretorische Phospholipase A2 ist ein nicht Arachidonsäure-spezifisches En-
zym, das neben der Hydrolyse der Phospholipiden, wie Phosphatydilcholin der
äußeren Zellmembran, zu Arachidonsäure eine Mediatorenrolle zu erfüllen scheint.
Durch sPLA2 generierte Arachidonsäure wird vorwiegend zur Prostanoiden-
synthese verwendet.
Arachidonsäure ist ein Substrat für die 5-Lipooxygenase (5-LO) und zwei
Isoenzymen der Cyclooxygenase COX-1 und COX-2. Die 5-LO ist ein mikrosomales
Enzym, das nach der Zellaktivierung an die Zellkernmembran transloziert und an
ein 18 kDa Protein (FLAP, 5-lipooxygenase activating protein) bindet (19).
Abbildung 2 Schema der Synthese der Lipidmetaboliten in humanen Mastzellen. Aus: Marone G., Casolano
V., Patella V., Florio G., Triggiani M. (1997) �Molecular and cellular biology of mast cell and basophil.�, Int.
Arch. Allergy Immunol., 114, 207-217
Antigen
Lysophospholipide
AAAA
LTC4
LTA4 LTA4
LTC4
AA
ProstaglandineThromboxane
ProstaglandineThromboxaneZellkern
FLAP
sekretorischesPLA2
cytosolischesPLA2
5-LO
COX-1
COX-2COX-2mRNA
endoplasmatischesReticulum
FLAP ist ein integrales Protein der perinuklearen Membran und stabilisiert die
Bindung von 5-LO, cPLA2 und Leukotriene an der Zellkernmembran. 5-LO gene-
riert über Hydroperoxyeicosatetraenoiksäure (5-HPETE) LTA4, aus dem durch en-
zymatische Kopplung mit reduziertem Glutathion durch LTC4-Synthase LTC
4 ent-
steht. Intrazelluläres LTC4 wird über einen Carrier extracellulär transportiert und
konvertiert zu LTD4 und LTE
4. LTC
4, LTD
4 und LTE
4 wurden früher unter dem Be-
griff �slow reacting substances of anaphylaxis� zusammengefaßt. Kleine Mengen
von LTA4 werden von cytosolischen LTA
4-Hydrolase zu LTB
4 konvertiert. Das
Lysophospholipid, das nach der Hydrolyse von der Arachidonsäure aus dem 1-O-
Alkyl-2-azyl-sn-glyzeryl-3-phosphorylcholin entsteht, wird nach der Azetylierung
zum PAF (platelet actvating factor). PAF induziert die Aggregation und Degranulation
der Thrombozyten, erhöht den Luftwegenwiderstand und führt zur systemischen
Hypotension, was eine Rolle von PAF als Mediator in der systemischen Anaphyla-
xie impliziert. Die beiden Isoenzyme der Cyclooxygenase sind in den Mastzellen
präsent. COX-1 ist die stabile konstitutionelle Isoform, die in den meisten huma-
nen Zellen präsent ist. Die andere Isoform, COX-2, wird nur von aktivierten
Entzündungszellen einschließlich der Mastzellen und basophilen Granulozyten
exprimiert. COX-1 scheint für die IgE-induzierte-, COX-2 für die Zytokine-induzier-
te Synthese der Prostanoide verantwortlich zu sein. Die Cyklooxygenasen kon-
vertieren die Arachidonsäure sequentiell zu intermediären Metaboliten PGG2 und
PGH2. Das letzte wird durch Glutathion-abhängige PGD
2-Synthase in PGD
2 über-
führt. Die Sekretion der Leukotriene und Prostaglandine konnte als abhängig von
der Lokalisation der Mastzellen gezeigt werden. Die Mastzellen der Lunge, des
Herzens und der Mucosae sezernieren PGD2 und LTC
4, die der Haut PGD
2 und
sehr geringe Mengen oder kein LTC4. Alle Mastzellen sezernieren kleine Mengen
an LTB4 und LTA
4, das möglicherweise die Leukotrienensynthese in den
inflamatorischen Loci dadurch verstärkt, daß Endothelzellen und Thrombozyten
über eine LTC4-Synthase verfügen, die LTA
4 direkt zu LTC
4 konvertiert. Die Wir-
kung der Leukotriene LTC4, LTD
4 und LTE
4 gleicht der des Histamins über H
1-
Rezeptoren, ist jedoch wesentlich potenter. Sie induzieren eine prolongierte
Bronchokonstriktion (ca. 10-1000 Mal potenter als Histamin), erhöhen die Gefäß-
permeabilität, induzieren die Konstriktion der arteriellen, arteriolären und der
10 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 11______________________________________________________________________________
intestinalen, glatten Muskulatur. PGD2 entfaltet über ihren spezifischen DP-Re-
zeptor bzw. Thromboxan-Rezeptor sehr vielfältige Wirkung u.a. inhibiert sie die
Thrombozytenaggregation, verursacht die Kontraktion der glatten Muskulatur des
Respiration- und Gastrointestinaltraktes sowie der Gefäße, ist chemotaktisch für
die neutrophilen Granulozyten vergrößert die Gefäßpermeabilität, was zum ge-
steigerten Einfluß der Serumproteine wie Komplementfaktoren, Immunglobuline
etc. in das Gewebe führt, und verstärkt die von LTD4 vermittelte Neutrophilie. Dar-
über hinaus verursacht LTB4 die Adhäsion der Leukozyten an den Endothelzellen
mit nachfolgender Migration der ersten in die Gewebe.
Die Synthese der Metaboliten der Arachidonsäure wird in basophilen
Granulozyten ähnlich wie unter Kap. 1.1.1.2 beschrieben, initiiert. Im Gegensatz
zu den Mastzellen produzieren die basophilen Granulozyten keine nennenswer-
ten Mengen an Prostanoiden. Der Hauptlipidmediator ist Leukotrien LTC4, das
nur nach der Aktivation der Zelle via FcεRI de-novo in großen Mengen syntheti-
siert wird.
Zytokine sind Proteine oder Glykoproteine, die von Lymphozyten syntheti-
siert und sezerniert werden und andere Zellen aktivieren oder ihre Funktion beein-
flussen (20).
Die humanen Mastzellen generieren eine Reihe von proinflammatorischen
wie immunmodulierenden Zytokine (21). Für diese Zellpopulation konnte entwe-
der auf mRNA- oder Proteinebene die Synthese von Interleukine IL-1, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13 und IL-16 sowie von GM-CSF, TNF-α und
Chemokine wie MIP-1α und MIP-1β (macrophage inflammatory protein) nachge-
wiesen werden. Auch ein Unterschied im Repertoire der sezernierten Zytokine
zwischen den MCTC
und MCT-Subpopulationen der humanen Mastzellen konnte
demonstriert werden. So wird das IL-4 vorwiegend von MCTC
sezerniert und IL-5
und IL-6 fast ausschließlich von MCT-Subpopulation synthetisiert (22).
Die Wirkung der einzelnen Interleukine ist pleiotrop und unterliegt den man-
nigfachen Wechselwirkungen der verschiedenen Zellpopulationen, so daß das
Wissen über einzelne durch sie ausgelöste Aktionen weiterhin noch lückenhaft ist
und die in vitro gewonnenen Erkenntnisse nicht ohne weiteres auf in vivo Verhält-
nisse übertragen werden können. Um so mehr müssen die in vitro gewonnenen
.
Informationen als einzelne Facetten eines komplizierten Netzwerkes aus verschie-
denen Mediatoren und Zellpopulationen angesehen werden.
Das Interleukin-1 kann die Expression der Adhäsionrezeptoren verstärken.
Es induziert die Synthese der anderen Interleukine (IL-2, IL-6, IL-8) und Zytokine
und verstärkt zusammen mit IL-6 die Aktivierung der T-Lymphozyten. IL-1 indu-
ziert die Proliferation der mesenchymalen Zellen. Das Interleukin-2 ist ein essen-
tieller Wachstumsfaktor, Chemoattraktant und Induktor der Produktion von IL-5
für die T-Zellen. Das Interleukin-3 wurde als das wichtigste Interleukin für das
Wachstum, Entwicklung und Aktivierung der Mastzellen identifiziert. Darüber hin-
aus ist es notwendig für die lokale Proliferation dieser Zellpopulation und der
eosinophilen Granulozyten. Das Interleukin-4, das seine funktionellen Eigenschaften
weitgehend mit Interleukin-13 teilt, ist essentiell für die Induktion der Umschaltung
(switching) der B-Lymphozyten zu den IgE produzierenden Isotypen. Die Ent-
wicklung und Wachstum der Th2-Lymphozyten aus den Th0-Lymphozyten sowie
Induktion der Adhäsionsmoleküle an den Endothelzellen, wie z.B. VCAM-1 (vascular
cell adhesion molecule-1) werden von diesen Interleukinen gesteuert. Das
Interleukin-5 zeigt einen starken regulatorischen Effekt auf die Eosinophilopoese,
Differenzierung, Aktivierung sowie lokale gewebeständige Proliferation der
eosinophilen Granulozyten. Das Interleukin-6 induziert die Differenzierung der B-
Lymphozyten, Aktivierung der T-Lymphozyten und wirkt als Kopromotor der IgE-
Produktion. Das Interleukin-8 wirkt als ein potenter Aktivator und Chemoattraktant
für die neutrophilen Granulozyten. Das Interleukin-10 kann in vitro die Aktivität der
Thymozyten, Mastzellen und B-Lymphozyten stimulieren. Eine Inhibition der
Zytokinproduktion durch die Makrophagen, eosinophile und neutrophile
Granulozyten und Th1-Lymphozyten konnte demonstriert werden. Die Anwesen-
heit des Interleukins-12 zusammen mit IL-4 induziert die Entwicklung der Th2-
Lymphozyten. Die Rolle des Interleukins-13 ist der IL-4 ähnlich. Es stimuliert die
B-Lymphozyten, wirkt bei der Isotypenumschaltung der B-Lymphozyten und be-
günstigt die Transformation der Monozyten zu den dendritischen Zellen. Über
eine weitgehende Homologie der IL-4 und IL-13 Rezeptoren wird spekuliert. Die
IL-4 und IL-13 und der lösliche Ligand des CD40-Rezeptors (CD40L), die die
Produktion von Immunglobulin E durch die B-Lymphozyten induzieren, werden
12 1 Einleitung______________________________________________________________________________
sowohl von humanen Mastzellen wie auch basophilen Granulozyten sezerniert
(23). Humane Mastzellen sind bis dato die einzige bekannte Zellpopulation, die
konstitutionell d.h. vor jeglicher Aktivierung TNF-α synthetisiert und sezerniert.
Das TNF-α wird als Schlüsselzytokin der allergischen Reaktionen und der anti-
bakteriellen Abwehr bezeichnet wird. Es ist für das Priming der Leukozyten und
dadurch für die de novo Synthese der Zytokine sowie für die verstärkte Sekretion
der endothelialen und epithelialen Adhäsionsmoleküle und Chemokine verant-
wortlich. Die regulatorische Rolle scheint über das Initiieren der Dissoziation von
NF-κB, die auch IL-5 und GM-CSF verursachen, bedingt zu sein (24). Darüber
hinaus konnte neulich in den Granula der Mastzellen SCF (stem cell factor) nach-
gewiesen werden, was für den autokrinen Charakter dieses Mediatores, der eine
essentielle Rolle in dem Wachstum und der Differenzierung spielt und als che-
motaktischer Faktor der Mastzellen identifiziert werden konnte (weiter s. Kap.
1.2), spricht.
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 13______________________________________________________________________________
Abbildung 3 Biologische Effekte der Mediatoren, Proteasen und Zytokinen der Mastzellen. Aus ChurchM.K., Levi-Schaffer F. (1997) �Updates on cells and cytokines: the human mast cell.�, J. All. Clin. Immunol..,99,155-160.
Die Zytokine-Produktion der humanen basophilen Granulozyten unterschei-
det sich von deren der Mastzellen. Die herausragende Rolle spielen Interleukin-4
und Interleukin-13, die nur von dieser Zellpopulation konstitutionell exprimiert wer-
den. IL-4 und IL-13 konnten sicher in ruhenden, nicht aktivierten wie in via FcεRI
aktivierten Zellen in granulären Strukturen nachgewiesen werden (25, 26). Inter-
essanterweise konnte für diese Zellen weder eine andere Zytokine-mRNA noch
der Nachweis eines anderen Zytokine auf der Proteinebene gezeigt werden. Es
werden keine weitere Zytokine, die dem Th1 oder Th2-Phänotyp entsprechen,
exprimiert. Die IL-4 und IL-13 besitzen die Fähigkeit, Th-2-Immunantwort zu indu-
zieren und zu verstärken. Die Th-2-Immunantwort ist eine Immunantwort, die über-
wiegend durch Aktivierung der Th2 Population der T-Helfer Lymphozyten gekenn-
zeichnet ist. Die Lymphokine der Th2-Lymphozyten wie IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10,
IL-13 nicht aber IL-2, IL-12 und INFγ der Th1-Population werden bevorzugt in
entzündlichen Infiltraten der allergischen Reaktionen gefunden und sind wichtige
Modulatoren der Funktion der eosinophilen und basophilen Granulozyten. Es wird
angenommen, daß eine Th-2-Immunantwort typischerweise einen Entzündungs-
typ initiiert, der dem der allergischen Entzündung entspricht, während die Th-1-
Immunantwort eher zum Typ der pyogenen Entzündung mit neutrophil-monozytärem
Infiltrat führt. Durch die alleinige Sekretion von IL-4 und IL-13 durch die basophilen
Granulozyten wird die Annahme verstärkt, daß diese Zellpopulation eine wichtige
Rolle in der Immunomodulation der Th-2-Immunantwort spielt. Die IL-4 induziert
die erhöhte Expression der Adhäsionsmoleküle wie VCAM-1, was zur gesteiger-
ten selektiven transendothelialen Migration der vielen Zellpopulationen insbeson-
dere der eosinophilen Granulozyten führt. Die weiteren Mediatoren sind CD40L
und Chemokine. Das lösliche Ligand für CD40 Rezeptor (CD40L) wird nach der
Stimulation der basophilen Granulozyten via FcεRI freigesetzt und spielt zusam-
men mit IL-4 und IL-13 eine wichtige Rolle in der Induktion der IgE Produktion von
B-Lymphozyten (s.Kap. 1.1.3) (27).
14 1 Einleitung______________________________________________________________________________
1.1.3 Rezeptoren der Zelloberfläche
An der Oberfläche der Mastzellen und basophilen Granulozyten exprimierte
Moleküle können in: 1. Immunglobulinrezeptoren, 2. Rezeptoren für Wachstums-
und Differenzierungsfaktoren (Zytokinrezeptoren), 3. Rezeptoren für die
Komplementfaktoren 4. Adhäsionsrezeptoren und Erkennungsmoleküle aufgeteilt
werden (28).
Die beiden Populationen exprimieren nur die hochaffinen Rezeptoren für
die Immunglobulin E (FcεRI) aber keine niedrigaffinen (FcεRII/CD23). Die huma-
nen Mastzellen und die basophilen Granulozyten besitzen auch die niedrigaffinen
Rezeptoren für das Immunglobulin G (FcγRII, CD w23). Durch die Kreuzvernetzung
mit dem hochaffinem IgE Rezeptor (FcεRI) können die Subtypen von FcγRII
(FcγRIIB1 und FcγRIIB2) über ITIM-Sequenz (immunoreceptor tyrosine based
inhibitory motif, eine hochkonservierte Sequenz der elf Aminosäuren, die zwar
strukturell und funktionell ITAMs (Kap. 1.1.5.2) ähnlich ist, aber inhibitorisch auf
die Signalübertragungsmechanismen wirkt) die FcεRI-vermittelte Aktivierung der
Signalübertragungsmechanismen unterbinden (29).
Die humanen Mastzellen exprimieren regelmäßig ein Rezeptor für SCF (stem
cell factor syn. c-kit ligand receptor/mast cell growth factor). SCF ist das essentiel-
le Zytokine für Differenzierung und Wachstum der Mastzellen (siehe Kap. 1.1.4),
induziert die Mediatorensekretion der reifen Zellen, vermutlich auch auf dem
autokrinen Wege. Die über den SCF-Rezeptor vermittelten Signale induzieren bzw.
modulieren die Proliferation, Chemotaxis, Migration und Adhesion der Mastzellen.
Die weiteren Zytokinrezeptoren konnten bis dato nicht detektiert werden.
Auf der Oberfläche der basophilen Granulozyten finden sich funktionelle
Rezeptoren für das Interleukin-3 (30), Interleukin-5 und GM-CSF (granulocyte
monocyte colony stimulating factor, CD 116) (31, 32), die zur Superfamilie der
Rezeptoren der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren gehören (hemopoietin
receptor superfamily, HRS). Diese Zytokine regulieren die Differenzierung und
Funktion der humanen basophilen und eosinophilen Granulozyten. Neulich konn-
te auf der Oberfläche der basophilen Granulozytenauch ein CCR3-Chemo-
kinenrezeptor identifiziert werden. Weiterhin konnten die Rezeptoren für die
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 15______________________________________________________________________________
inhibitorischen Wachstumsfaktoren INF-γ (Interferon-γ CD 119) und TGF-β
(transforming growth factor-β) sowie für das Interleukin-1 (IL-1RII, CD 121b) und
das Interleukin-8 gefunden werden.
Die Komplementfaktoren C3a, C4a, C5a, die früher unter dem Namen
Anaphylotoxine zusammengefasst wurden, induzieren die Mediatorenfreisetzung
aus den basophilen Granulozyten. Auf den humanen Mastzellen der Haut (MCTC
)
konnte ein C5a-Rezeptor (C5aR, CD 88) identifiziert werden. Die Bindung von
C5a an diesem Rezeptor verursacht die Histaminliberation. Die anderen
Mastzellpopulationen exprimieren keine weiteren Rezeptoren für die Komplement-
faktoren. Die humanen basophilen Granulozyten besitzen die folgenden Rezepto-
ren: CR1 (CD35), CR3/C3biR (CD11b), CR4 (CD 11c) und C5aR. Die CR1 und
CR4 binden die Komplementfaktoren C3b/C4b.
Die Gruppe der Erkennungsmoleküle (recognition molecules, RM) setzt sich
aus drei Familien: Integrine, Selektine und Mitglieder der Immunglobulin-Super-
familie (immunoglobulin supergene family) zusammen. Die RM-Mitglieder agieren
miteinander (intracellular recognition) und mit extrazellulären Matrixbestandteilen
(wie Kollagen, Fibronektin, Laminin). Manche spielen eine Rolle bei der Antigen-
präsentation bzw. �erkennung, binden die immunomodulatorischen Faktoren oder
mikrobiellen/viralen Epitope (33). Die Moleküle dieser Gruppen ermöglichen die
Migration der Leukozyten in die Gewebe. Der erste Schritt, die lose Assoziation
der Zellen an das Endothel, bedarf der Anwesenheit der Selektine und ihrer
kohlenhydrathaltigen Liganden. Die basophilen Granulozyten exprimieren das L-
Selektin (CD62L), das GlyCAM-1, CD43 und MAdCAM-1 bindet. Die Mastzellen
besitzen E- und P-Selektin auf ihrer Oberfläche, die an kohlenhydrathaltigem Lewis-
Blutgruppenantigen (CD15) binden. Die engere Adhäsion der Leukozyten an das
Endothel bedarf einer Aktivierung durch die Chemokine . Die darauf folgende Leu-
kozyten-Diapedese scheint durch die β1- und β
2-Integrine sowie Mitglieder der
Immunglobulin-Superfamilie (ICAM-1=intracellular adhesion molecule, VCAM-
1=vascular cell adhesion molecule, PECAM-1=platelet-endothelial cell adhesion
molecule) reguliert zu werden (34). Die Mastzellen exprimieren β1-(VLA=very late
antigen, VLA-4a und VLA-5a mit Liganden Fibronektin und VCAM-1) und β3-
Integrinen (CD41/CD61 mit Liganden Fibrinogen und Fibronektin, CD51/CD61
16 1 Einleitung______________________________________________________________________________
mit dem Ligand Vitronektin) (35). Die basophilen Granulozyten besitzen β1- (VLA-
3 mit Liganden Kollagen und Laminin, VLA-4, VLA-5) und β2-Integrine (LFA-
1=leukocyte function-associated antigen mit Liganden ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3,
Mac-1 mit Liganden C3bi, ICAM-1, p150,95 mit Liganden Fibronektin und C3bi)
(36). Von den Moleküle, die der Immunoglobulin-Superfamilie angehören,
exprimieren die basophilen Granulozyten PECAM-1 sowie ICAM-1, ICAM-2 und
ICAM-3. Die drei letzten binden an LFA-1. Die Mastzellen haben auf ihrer Oberflä-
che ICAM-1.
Die weiteren wichtigen Erkennungsmoleküle, die von den beiden
Zellpopulationen exprimiert werden, sind die MHC-Antigene (major histocompability
complex antigens), die Selbst-Erkennungsmechanismen der interzellulären Inter-
aktionen ermöglichen. MHC-Antigene der Klasse I werden von Mastzellen und
basophilen Granulozyten, MHC-Antigene der Klasse II nur von aktivierten Mast-
zellen exprimiert. Die Mastzellen und basophilen Granulozyten tragen auf ihrer
Zelloberfläche CD40-Ligand, das an CD40 der B-Lymphozyten bindet. Diese Wech-
selwirkung verursacht zusammen mit IL-4 und IL-13 die Induktion der Immun-
globulin E-Synthese in B-Lymphozyten.
1.1.4 Abstammung und Differenzierung
Seit langem wurde auf Grund der morphologischen und funktionellen Ähn-
lichkeiten eine gemeinsame Ontogenese der humanen basophilen Granulozyten
und Mastzellen vermutet. Die zahlreichen Arbeiten von Dvorak et al. (37, 38, 39)
konnten den gemeinsamen Ursprung der basophilen Granulozyten und Mastzellen
von den aus dem Nabelschnurblut isolierten Vorläuferzellen (agranular precursors
cells) beweisen. Die Untersuchungen von Kirshenbaum et al. (40, 41) zeigten die
gemeinsame Abstammung dieser beiden Zellpopulationen von CD 34+ multi-
potenten Stammzellen des Knochenmarkes. Durch die Elimination der Vorläufer-
zellen für die T-Zellen (CD2+), B-Zellen (CD19+ und CD20+), eosinophile
Granulozyten und Makrophagen (CD14+) konnte die Abstammung der Mastzellen
von diesen Zellpopulationen ausgeschlossen werden. Rottem et al. (42) haben
die Vorläuferzellen der Mastzellen als CD34+/FcεRI−-Population identifiziert.
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 17______________________________________________________________________________
Der hämatopoetische Stem-cell-factor SCF (Ligand des Protoonkogenes
c-kit-Tyrosinkinase) wurde als essentielles Zytokin für die Reifung und den
Differenzierungsprozeß der CD43+/FcεRI −-Zellen zu den reifen humanen Mast-
zellen gefunden (43, 44) und wird synonym auch als MGF (mast cell growth factor)
bezeichnet. Die Rezeptoren für SCF (CD117) konnten identifiziert und isoliert wer-
den (45). Zusammenfassend entwickeln sich die maturen Mastzellen aus den
multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen (multipotent colony forming
progenitors cells), die primär das Knochenmark besiedeln. Diese verlassen das
Knochenmark und zirkulieren in der Blutbahn als colony forming mast progenitor
cells, die CD43-Antigen sowie SCF (MGF)-Rezeptor auf ihrer Oberfläche
exprimieren und noch kein FcεRI besitzen. Nach der Migration in die Gewebe
differenzieren sie unter dem Einfluß von SCF, der in der membrangebundenen
Form von nativen Fibroblasten (und wahrscheinlich auch von anderen Stroma-
und Endothelzellen) exprimiert wird, in die funktionell reifen Mastzellen. Die her-
anreifenden Mastzellen exprimieren FcεRI und FcγRII/III, bevor die charakterischen
Sekretionsgranula erscheinen und sie morphologisch erkannt werden können. Es
wird angenommen, daß Differenzierung- und Reifungsprozesse auch von den
anderen Zytokine, wie IL-3, moduliert bzw. beeinflußt werden können. Die Vor-
läuferzellen konnten in geringer Anzahl im peripherem Kreislauf insbesondere bei
Patienten mit Mastocytose gefunden werden.
Dieser Entwicklungsmodus konnte von Kitamura et al (46) bei Nagetieren
(Maus, Ratte) untersucht und eindeutig bewiesen werden. Bei den Nagetieren
erscheinen die Vorläufer der Mastzellen während der Embryogenese zuerst im
Dottersack, gefolgt von der Leber. Die Kolonisation der anderen Geweben nimmt
ihren Ausgang in der Leber und die in die Gewebe eingewanderte Vorläuferzellen
bleiben da lebenslang proliferationsfähig, obwohl das Knochenmark die wichtigste
Quelle dieser Zellen für die erwachsenen Tiere repräsentiert. Derartige eindeutige
Beweise konnten für die humanen Mastzellen bis dato noch nicht vollständig er-
bracht werden.
Die basophilen Granulozyten entwickeln sich aus den pluripotenten hämato-
poetischen Stammzellen zu den myelomonozytären Vorläuferzellen. Die Phänotyp-
merkmale dieser beiden Zellformen, die für die basophile Linie der Granulozyto-
18 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 19______________________________________________________________________________
poese charakteristisch wären, konnten noch nicht identifiziert werden. Die ersten
Vorläuferzellen der basophilen Granulozyten (basophile Myeloblasten), die phä-
notypisch untersucht werden konnten, unterscheiden sich deutlich in der
Rezeptorenausstattung von den Vorläufern der Mastzellen. Auf ihrer Oberfläche
exprimieren sie CD40 und Interleukin-3-Rezeptor jedoch kein Rezeptor für SCF.
Die basophilen Myeloblasten entstammen direkt den myelomonozytären Vorläufer-
zellen. Der Maturationsprozeß vollzieht sich im Knochenmark unter dem essenti-
ellen Einfluß von Interleukin-3 (47). Auch für Interleukin-5 und GM-CSF
(Granulozyten, Monozyten colony stimulating factor), die neben des IL-3 zur Super-
familie der Rezeptoren der hämatopoetischen Wachstumfaktoren gehören, konn-
te in vitro ein Einfluß auf die Differenzierung der Vorläuferzellen der basophilen
Granulozyten demonstriert werden. Diese Tatsache ist auf die gemeinsame βββββ-
Kette der dimerischen Rezeptoren für IL-3, IL-5 und GM-CSF zurückzuführen (48).
Der nächste Schritt der morphologischen Differenzierung nach den basophilen
Myeloblasten ist die Entwicklung zum basophiler Promyelozyt, Myelozyt, jugendli-
chem Granulozyt, stabkernigem und segmentkernigem basophilem Granulozyt,
der die ausdifferenzierte, reife Form darstellt. Im Gegensatz zu den Mastzellen
verlassen erst die maturen segmentkernigen basophilen Granulozyten das Kno-
chenmark und sind in der Blutbahn einzutreffen. Die ersten sekretorischen Granula
treten, noch unreif, im Stadium des Promyelozyten auf.
1.1.5 IgE-Rezeptor mit hoher Affinität
Der hochaffine Rezeptor für Immunglobulin E (FcεRI) gehört zur großen
Familie der Rezeptoren, die an der Oberfläche der Zellen des Immunsystems
exprimiert sind und das Fc-Segment der Immunglobuline binden (multichain
immunrecognition receptors MIRR) (49).
Die Rolle dieser Rezeptoren ist die Bindung der spezifischen Immunglobulin-
Moleküle und über Signalübertragungsmechanismen die Aktivierung der Zellen.
Der hochaffine Immunglobulin E-Rezeptor (FcεRI) tritt in zwei Formen auf. Die
tetramerische Form von FcεRI (αβγ2) wird überwiegend von basophilen
Granulozyten und Mastzellen exprimiert. Seine Anwesenheit definiert die
Effektorrolle dieser Zellpopulationen bei allen IgE-vermittelten Reaktionen. Die
Aktivation der Zellen via FcεRI über die Bindung der Rezeptoren mit Immunglobulin
E-Moleküle, die an einem polyvalentem Antigen gebunden sind, und nachfolgen-
der Kreuzvernetzung der Rezeptoren führt zur Degranulation und konsekutiver
Freisetzung der Mediatoren, Biosynthese und Sekretion von Metaboliten der
Arachidonsäure (wie Leukotriene und Prostanoide) und der Zytokine (s. Kap. 1.1.2).
Im letztem Jahrzehnt konnte die Expression der trimerischen Form von FcεRI
(αγ2) auf den Antigenpräsentierenden Zellen (APC-antigen presenting cells) wie
epidermalen Langerhans�chen Zellen (50), dermalen und peripheren dendritischen
Zellen sowie Monozyten und eosinophilen Granulozyten gezeigt werden. Im Un-
terschied zu den basophilen Granulozyten und Mastzellen fehlt dem FcεRI, der
von APC�s exprimiert wird, die klassische β-Kette. Die Expression des FcεRI er-
möglicht den APC�s die spezifische Antigenaufnahme via Endocytosis. Es wird
angenommen, daß die APC�s mit Zuhilfenahme dieses Mechanismus die weitere
IgE-Synthese über die Rekrutierung der T-Helfer 2 (Th2)-Lymphozyten ankurbeln.
Dadurch erscheint die Rolle der APC�s bei der Initierung der primären Immun-
antwort denkbar (51).
1.1.5.1 Struktur und Verteilung
FcεRI�s erscheinen bereits frühzeitig im Laufe des Reifungprozesses an
der Oberfläche der reifenden Mastzellen und basophilen Granulozyten noch be-
vor in Rahmen der Zelldifferenzierung die typischen sekretorischen Granula auf-
treten und die Zellen noch undifferenziert sind. Die unmittelbaren Vorläufer der
Mastzellen und basophilen Granulozyten, die multipotenten hämatopoetischen Vor-
läuferzellen, exprimieren noch kein FcεRI. Die Transfektionsstudien mit cDNA für
α-, β- und γ-Untereinheiten lassen vermuten, daß die einzelnen Untereinheiten
vor dem Verlassen des prä-Golgi-Apparates, wo sie posttranskriptional modifiziert
werden, zu endständigen Rezeptor-Molekülen gebunden werden. Interessanter-
weise können α- und γ-Untereinheiten in Abwesenheit der β-Untereinheit zum
funktionstüchtigen Rezeptor binden, was am ehesten an die Funktion der β-Un-
tereinheit als Verstärker der Signalintensität zurückzuführen ist. Die FcεRI sind
20 1 Einleitung______________________________________________________________________________
über die gesamte Oberfläche der exprimierenden Zellen verteilt, ein
cytoplasmatisches Depot, der die kompletten Rezeptor-Moleküle enthält, wurde
nicht identifiziert. Die Rezeptormoleküle sind, vor IgE-Bindung, innerhalb der Zell-
membran hoch mobil und frei beweglich. Ihre Anzahl beträgt zwischen 103 und
106 pro Zelle und wird in vivo über den IgE -Spiegel reziprok reguliert.
Der FcεRI ist ein tetramerischer Komplex aus einer α-Kette (FcRα), einer
β-Kette (FcRβ) und einem Dimer aus zwei identischen γ-Ketten (FcRγ). Der FcεRI
ist in der Zellmembran eingebettet und kreuzt diese insgesamt sieben Mal (52)
Die α-Kette besteht aus einem langen extracellulären Segment, der zwei
Immunglobulin E-bindende Domänen enthält, aus einem einzelnen kurzen trans-
membranösen Teil sowie aus einem relativ kurzen cytoplasmatischen Abschnitt.
Anhand der Analyse vom komplementären DNA wurde die Länge der α-Kette auf
260 Aminosäuren bestimmt. Das extrazelluläre Segment mißt ca. 180 Aminosäu-
ren, auf die IgE-bindenden Domänen entfallen 40 resp. 42 Aminosäuren. Diese
werden von jeweils zwei Cystein-Moleküle, die über Disulfidbrücken verbunden
sind, geformt. Das Molekulargewicht der α-Kette beträgt ca. 55 kd (45-65 kDa).
Sie ist glykolisiert, wahrscheinlich um dieses Polypeptid vor einem Angriff der Se-
rumproteasen zu schützen. Insgesamt finden sich sechs Aminosäuren, die N-
glykolisiert werden. Das Immunglobulin E bindet an der α-Kette des FcεRI mit
seinem Fc Fragment. Durch Lyse mit Papain entstehendes Fc Fragment enthält
die Cε2, Cε3 und Cε4-Domänen. Trotz zahlreicher Untersuchungen mit
monoklonalen Antikörpern, die gegen die einzelnen Epitope der Domänen des Fc-
Fragmentes gerichtet sind, ist es leider noch nicht eindeutig gelungen, die spezifi-
schen Domänen, die direkt mit der α-Kette eine Bindung eingehen, zu identifizie-
ren. Es gibt jedoch deutliche Hinweise auf die besondere Rolle der N-terminalen
Region der Cε3 Domäne für die Bindung an FcεRα (53).
Die einzelne β-Kette (MW 33 Kd) kreuzt die Zellmembran insgesamt vier
Mal, ihre N- und C-terminalen Kettenenden befinden sich intracytoplasmatisch.
Die β-Kette besteht aus 244 Aminosäuren und ist im Gegensatz zu der α-Kette
nicht glykolisiert. Die β-Kette besteht aus zwei Untereinheiten, die durch die
Proteolyse separiert werden können. Die β1-Untereinheit ist mit der Zellmem-
bran assoziiert, die β2-Untereinheit ist ein phosphoryliertes Polypeptid mit MW
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 21______________________________________________________________________________
Die beiden über eine Disulfidbrücke verbundenen γ-Ketten (MW jeweils 9
kD) bilden ein Dimer und besitzen jeweils einen sehr kurzen extraplasmatischen
Anteil, ein einzelnes transmembranöses Segment und einen langen cytoplasma-
tischen Anteil. Die Länge einer γ-Kette beträgt 68 Aminosäuren. Die Disulphidbrücke
besteht zwischen den intramembranös liegenden Anteilen der γ-Ketten, den
Cysteinresten (Cys7-Cys7). Die γ-Kette kann an vier Threonin-Residuen
phosphoryliert werden. Es konnte eine hochgradige Homologie zwischen den Genen
für die γ-Kette und ζ-Kette des T-Lymphocyten Rezeptors (TCR) gezeigt werden,
die die Entstehung der beiden Gene durch Duplikation vermuten läßt. Die γ-Kette
ist mit FcγRIIIa der Makrophagen und mit dem humanen CD16- FcγRIIIAaassoziiert.
Möglicherweise erfüllen die γ-Untereinheiten dieser Rezeptoren und die homologe
22 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Fc RIe a
Fc RIe g Fc RIe b
Syk p56Lyn
SH2
SH2
SH3
SH3P
P
P
S
S
S
S
von 9-10 kDa und repräsentiert den cytoplasmatischen Anteil der β-Kette. Die β-
Kette gehört der Familie der CD20-Moleküle und ist für FcεRI spezifisch.
Abbildung 4 Struktur des hochaffinen IgE Rezeptors (FcεRI). Aus: Xu Y., Potter J. W., Willmann C. L.
(1996), �The function of src family tyrosine kinases in hematopoietic cells.� Leukemia Research, 20, 229-234
ζ-Kette der TCR eine sehr ähnliche, wenn nicht sogar identische Rolle in Rahmen
der Signalübertragungsmechanismen. FcRIβ und FcRIγ besitzen sog. ITAMs (s.
Kap. 1.4.3), die für die eigentliche Signalübertragung von essentieller Bedeutung
sind.
1.1.5.2 Interaktionen des humanen IgE-Rezeptors
Der FcεRI (54) bindet mit dem Immunglobulin E-Molekül in 1:1 Stöchiometrie
(55, 56) und folgt wegen des Überschußes an FcεRIs in vivo als pseudomono-
molekuläre Reaktion der Kinetik der Reaktion der ersten Ordnung.
IgE + FcεRI ⇔ IgE-FcεRI
Die Bindungkonstante Ka ist mit 109-1010 M-1 sehr hoch (57) und entsprechend ist
die Interaktion sehr spezifisch und kann durch den Überschuß an anderen
Immunoglobuline nicht inhibiert werden. Die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante
k1 beträgt 105 M-1s-1, die Geschwindigkeitskonstante k
-1 für die Dissoziation des
Komplexes IgE-FcεRI ist mit 10-5 M-1s-1 sehr klein. Aufgrund dessen ist die Halb-
wertszeit t1/2
der Bindung des Immunglobulins E an den zellulären Rezeptoren mit
20 bis 100 Stunden in vitro sehr lang. In vivo dürfte t1/2
eben noch länger sein, da
intakte IgE-Moleküle nach der Dissoziation von FcεRI die Bindungen mit weiteren
Rezeptoren einhergehen können. Die Interaktionen von monovalenten IgE-
Mölekülen führen zur keinerlei Aktivierung der Signalübertragungsmechanismen
der FcεRI exprimierenden Mastzellen und basophilen Granulozyten. Erst die Kreuz-
vernetzung und die darauffolgende Aggregation der FcεRI´s durch an polyvalentem
Antigen gebundene IgE-Moleküle bzw. bivalente Antikörper gegen FcεRI verursa-
chen wahrscheinlich die strukturellen Konformationsänderungen der Tertiärstruktur
der Untereinheiten des Rezeptors, die zur weiteren, die eigentliche Signal-
übertragung umfassenden Ereignissen führen (s. Kap. 1.4.3). Die Anzahl der Ag-
gregationen (receptor cross-links) zwischen den einzelnen FcεRI, die notwendig
sind, um eine Aktivierung herbeizuführen, wurde mit einigen (ca.20) bis
einigen Tausend (Medianwert ca. 2500) für die basophilen Granulozyten
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 23______________________________________________________________________________
.
und Maszellen bestimmt (58). Die maximale Freisetzung des Histamins konnte
bei der Aggregation der ca. 10% aller FcεRI gemessen werden. Eine messbare
Antwort kann detektiert werden, wenn ca. 100 Rezeptoren von den ca. 3∗105 pro
Zelle aggregieren (59).
Die Interaktion zwischen dem Antigen, IgE-Moleküle und FcεRIs resultiert in der
Kreuzvernetzung und Aggregation der Rezeptoren an der Zelloberfläche. Nach
ca. 30-60 sec. kommt es zur Formation der kettenartigen Aggregate, die relativ
schnell (t1/2
3-5 Min.), wie das für RBL-Zellen gezeigt werden konnte (60), über
coated pits mitsamt der IgE-Moleküle internalisiert und wahrscheinlich nachfol-
gend degradiert werden.
Die cytoplasmatischen Anteile der FcRβ und FcRγ enthalten sog.
�immunreceptor tyrosine-based activation motifs � (ITAMs früher auch �antigen
recognition activation motif� ARAM genannt). Dieser Begriff bezeichnet hoch-
konservierte Aminosäurensequenzenmotive der Polypeptiden, die regelmäßig in
den cytoplasmatischen Anteilen der Untereinheiten der Antigenrezeptoren der B-
und T-Lymphozyten sowie Rezeptoren des Fc-Regions der Immunoglobuline (wie
FcεRI, FcβRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαR) detektiert werden können und erstmalig
von Reth (61) beschrieben wurden. Diese Sequenzenmotive wurden als eigentli-
ches morphologisches Korrelat der Signalübertragung identifiziert. Die Versuche
von Romeo et al. und Irving et al. (62, 63, 64) zeigten, daß diese Sequenzen,
wenn isoliert und an die Domänen der Moleküle gebunden, die an sich zu keinerlei
Signalübertragung fähig sind, die Chimärenrezeptoren formen. Diese Chimären-
rezeptoren weisen in der Signalübertragung die Funktionen auf, die mit Funktio-
nen der naturellen Antigenrezeptoren identisch sind. Die ITAMs existieren in einer
oder mehreren Kopien an cytoplasmatischen Anteilen der für die Signalübertragung
verantwortlichen Untereinheiten der Rezeptoren. Jede Kopie besteht aus der Se-
quenz der 26 Aminosäuren D/EX7D/EX
2YX
2L/IX
7YX
2L/I. (Ein-Buchstabe-Code für
die Aminosäuren: D= L-Asparaginsäure, E=L-Glutaminsäure, Y=L-Tyrosin, L=L-
Leucin und I=L-Isoleucin). X bezeichnet die anderen Aminosäuren, die in der ITAM-
Sequenz nicht konserviert sind. Der FceRI besitzt je eine ITAM-Sequenz in den β-
und γ-Ketten also insgesamt drei Sequenzen pro Rezeptor-Tetramer.
Nach der Bindung des spezifischen Antikörpers an die α-Untereinheit des
24 1 Einleitung______________________________________________________________________________
IgE-Rezeptors kommt es über die Aktivierung einer rezeptorständigen Tyrosinkinase
zur raschen und vorübergehenden Phosphorylierung der beiden Tyrosinresten der
ITAM-Sequenzen, was zum Entstehung der temporären Bindungsstellen für die
weitere Tyrosinkinasen führt. Die Phosphorylierung der ITAM-Sequenzen der β-
und γ-Ketten kann bereits 5-15 sec. nach der Aggregation der FcεRI´s detektiert
werden (65, 66). Diese Mechanismen initiieren die weiteren Signalübertragungs-
mechanismen. Die Bindung der Tyrosinkinasen an die ITAM-Sequenzen geschieht
über sog. SH-Domänen der Tyrosinkinasen.
Die Generation der Interaktionen zwischen zwei Proteinen, die für die wei-
tere Übertragung der Information verantwortlich sind, ist ein essentieller Mecha-
nismus der zellulären Signalübertragung. Die an der Signalübertragung unmittel-
bar beteiligten Proteine besitzen eine oder mehrere kleine Domänen, die es erlau-
ben mit ihren Partnern durch die Erkennung der bestimmten Peptidsequenzen ein
Komplex zu bilden. Diese Domänen sind durch die Induktion der Konformations-
veränderungen nach der Bindung an die Partner-Proteine an der Regulation der
eigenen oder dessen enzymatischer Aktivität beteiligt. Von der Bedeutung für die
Signalübertragungsmechanismen der FcεRI´s sind SH2 und SH3 Domänen der
Proteine. Neben dieser existiert noch eine weitere Reihe der Protein-bindenden
Domänen. Die SH2-Domänen bestehen aus einer hochkonservierten Sequenz
von ca. 100 Aminosäuren und binden die Phosphotyrosin-enthaltende Peptide.
Die SH3-Domänen bestehen aus einer Sequenz von ca. 60 Aminosäuren und
binden die Prolinreiche-Peptide (67, 68).
Die Aggregation des tetramerischen FcεRI verursacht über die
Autophosphorylation der Lyn-Proteintyrosinkinase ihre Aktivation (69). Die Lyn-
Proteintyrosinkinase, ein Vertreter der Familie der Src-Proteintyrosinkinasen, bin-
det über ihre SH2-Domäne an der ITAM-Sequenz der β-Kette und ist in der inne-
ren Schicht der Zellmembran über ihr N-terminalen Glycinrest verankert. Der Me-
chanismus dieser Aktivation ist zur Zeit noch unklar, am wahrscheinlichsten er-
scheinen durch die Aggregation des Rezeptors verursachte Konformations-
änderungen für den Vorgang verantwortlich zu sein. Lyn-Tyrosinkinase
phosphoryliert die N-terminalen Tyrosinreste der ITAMs jeder γ-Kette (70). Durch
die Änderungen der Tertiärstruktur der ITAM-Sequenzen der γ-Kette kommt es zur
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 25______________________________________________________________________________
Bildung der temporären Bindungstellen für die SH2-Domänen und zur Interaktion
mit denen der Proteintyrosinkinase der Syk Familie. Eine effiziente Bindung der
Syk- Proteintyrosinkinase verlangt der Transphosphorylierung der beiden ITAM-
Sequenzen der FcRγ (71). Durch die Bindung wird eine Änderung der Konformation
der Syk Proteintyrosinkinase verursacht, was zur Autophosphorylierung und Akti-
vierung ihrer enzymatischen Aktivität führt. Weitere durch die Aggregation der
FcεRI aktivierten Proteintyrosinkinasen sind Btk- und Emt- Proteintyrosinkinasen
der Tec-Familie, Fer, FAK (fokal adhesion kinase) und MAP-Proteintyrosinkinasen
(mitogen activated protein kinase) (72). Die durch die Aggregation der FcεRI´s
induzierte Tyrosinphosphorylierung wird durch die transmembranösen und
cytoplasmatischen Proteintyrosinphosphatasen wie Proteintyrosinphospatase
CD45 reguliert. Diese dephosphorylieren die ITAM-Sequenzen der FcRβ und FcRγ,
jedoch keine Tyrosin-phosphorylierte Proteintyrosinkinasen Lyn und Syk (73).
Die Syk Proteintyrosinkinase phosphoryliert und aktiviert viele weiteren
Proteine, die SH2-Domänen besitzen. Diese Proteine, wie Phospholipasen
(Phospholipase A2, Phospholipase C-γ1 (74), Phospholipase C-γ2, Phospholipase
D), Phospholipidkinasen, Adaptor-Moleküle und mit dem Cytoskeleton assoziierte
Proteine wie FAK und seine potentiellen Substrate wie Fap (FAK associated
protein) und Paxillin, aktivieren weitere Pfade der zellulären Signalübertragung.
Eine dieser Proteine ist die Phospholipase C-γ1, die polyphosphatidyl-
inositolspezifisch ist und das Entstehen von 1,2-Diazylglyzerol (1,2-DAG) und
Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) durch Spalten der Membran-Phospholipide wie
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (IP2) katalysiert (75). IP
3 aktiviert Proteinkinase
C und führt über die Bindung an einem spezifischen IP3-Rezeptor, der ein Ligand-
aktivierter Ionenkanal der Organellenmembrane ist (76), zur Mobilisierung der
Calciumkationen aus den cytoplasmatischen Depots (vor allem aus dem
endoplasmatischen Reticulum), was wiederum zu Calciumabhängiger Aktivierung
der weiteren Moleküle wie cytoplasmatischer Phospholipase A2
führt. Die
Phospholipase A2 generiert Phospholipide, die wahrscheinlich die Fusion der Mem-
bran der sekretorischen Granula mit der Zellmembran bewirken. Durch die Fusion
der beiden Membranen kommt es zur Degranulation und Freisetzung der
26 1 Einleitung______________________________________________________________________________
präformierten Mediatoren. Phosphoinositol-3-Kinase wird nach der Aggregation
der FcεRI´s aktiviert und katalysiert die Phosphorylierung des Sphingosins in das
Sphingosin-1-Phosphat. Sphingosin-1-Phosphat spielt eventuell eine wichtige
Rolle in der Aktivierung der Freisetzung des Calciums aus den cytoplasmatischen
Depots und konsekutiv in der nachfolgenden Aktivierung des Calciumflusses aus
dem extrazellulären Raum in die Zelle.
Die Aggregation der FcεRI´s aktiviert über den Austauschfaktor Sos, der
an die Adaptor-Proteine Grb2 bindet, den Ras-Pfad der Signalübertragung. Das
Grb2 wird nach der FcεRI -vermittelten Phosphorylierung der Shc-Proteintyrosin-
kinase aktiviert. Ras phosphoryliert Raf1, das die MEK-Kinasen phosphoryliert,
die wiederum die MAP-Kinasen phosphorylieren. Die Translokation der MAP-
Kinasen ins Innere des Zellkerns führt zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren
und dadurch zur Expression der Genprodukte wie Interleukine.
Mannigfache Untersuchungen zeigen eine FcεRI-vermittelte Induktion der
Zytokinproduktion. Die Arbeitsgruppe von Marone et al. (77) konnte ein NFAT-1
immunreaktives Protein (nuclear factor of activated T cells) detektieren. NFAT-1
ist in die Regulation der mRNA-Transkription der meisten von den humanen Mast-
zellen und basophilen Granulozyten sezernierten Zytokine (IL-3, IL-4, IL-5, GM-
CSF, TNF-α und vielleicht IL-13) involviert.
Viele anderen Moleküle werden konstitutionell phosphoryliert und dieser
Prozeß wird durch die Aggregation der FcεRI nicht verstärkt. Dazu gehören zahl-
reiche an der Adaptor-Moleküle Grb2 bindenden Proteine wie Sos, ein Nukleotiden-
Austauschfaktor,der an der SH3-Domäne der Grb2 bindet und Shc, das an der
SH2-Domäne der Grb2 bindet.
Es konnte gezeigt werden, daß FcRγ für die eigentliche Signalübertragung
verantwortlich ist, wo FcRβ als ein Verstärker des Signals fungiert. Die FcRβ-
Untereinheit besitzt im Gegensatz zu FcRγ keine Fähigkeit die Zellaktivierungs-
vorgänge zu initiieren. Die Intensität des Signals gemessen anhand der Aktivie-
rung der Syk-Tyrosinkinase und des Anstieges der intrazellulären Calcium-
konzentration wird um den Faktor 5-7 verstärkt. Der Mechanismus der Amplifika-
tion des Signals involviert die ITAM-Sequenz der FcRβ-Untereinheit. Diese fun-
giert als eine Art Anker für Lyn-Tyrosinkinase und verstärkt dadurch die Lyn-
Physiologie der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 27______________________________________________________________________________
abhängige Phosphorylationvon FcRγ verstärkt. Phosphorylation von FcRγ führt
wiederum zu verstärkten Aktivation der Syk-Tyrosinkinase und verstärkten Mobi-
lisation der Calciumionen aus den cytoplasmatischen Depots und somit zur Erhö-
hung der Intensität des Signals (78).
1.2 Agonisten der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten
Die Mastzellen und die basophilen Granulozyten werden durch die Kreuzvernetzung
der IgE-Rezeptoren u.a. zur Freisetzung und de novo Synthese von Mediatoren
aktiviert. Darüber hinaus konnten für diese beiden Zellpopulationen eine Reihe
der Substanzen identifiziert werden, die eine FcεRI-unabhängige Aktivierung be-
wirken.
Die Mastzellen können durch eine Reihe der weiteren Faktoren wie
Neuropeptide, �basic compounds�, Peptide, Anaphylotoxine, Lektine, Zytokine
und Adhäsionsmoleküle aktiviert werden. Die daraus resultierende Degranulation
erscheint morphologisch der FcεRI-induzierten ähnlich, ihr können jedoch grund-
sätzlich andere biochemischen Prozesse zugrunde liegen.
Die Familie der polybasischen Moleküle (�basic compounds�) faßt Compound
48/80, Mastoparan, Polymyxin B und die Polymere der basischen Aminosäuren
um. Alle diese Substanzen scheinen die Degranulation der Mastzellen (79) über
einen gemeinsamen Mechanismus der Aktivierung der G-Proteine auszulösen.
Das Vorhandensein spezifischer Rezeptoren konnte nicht demonstriert werden.
Die Gruppe der Peptide, die die Aktivierung der Mastzellen herbeiführen,
besteht aus den Peptide, die eine zur CH4-Domäne der IgE korrespondierende
Sequenz (Residuen 497-506) besitzen, wie ACTH und Mellitin; Neuropeptide wie
Substanz P, CGRP (calcitonin gene-related peptide), Somatostatin, VIP (vasoactive
intestinal polipeptide) und Neurotensin (80) und dem rab3A Peptide (81). Die
Mechanismen der Aktivierung der Mastzellen durch diese Peptide sind noch nicht
genau geklärt, obwohl für manche eine Aktivierung der G-Proteine wahrscheinlich
erscheint.
Die multiplen Zytokine, für die eine Aktivierung der Mastzellen demonstriert
werden konnte, wie Interleukine (IL-1, IL-3, IL-8), GM-CSF, SCF , PF4 (platelet
28 1 Einleitung______________________________________________________________________________
factor 4) und Chemokine wie MIP-1α (macrophage inflammatory protein) verfügen
über eigene spezifische Rezeptoren, die die Aktivierung über das Initiieren der
Signalübertragungsmechanismen propagieren.
Der Stem Cell Factor (SCF) verfügt über einen Rezeptor, der aus einer
extrazellulären Untereinheit, die für die Bindung der SCF-Moleküle verantwortlich
ist, einer cytoplasmatischen Untereinheit mit Eigenschaften einer Proteintyrosin-
kinase und einer transmembranösen Untereinheit besteht. Die Bindung von SCF
an dem SCF-Rezeptor resultiert in der Autophosphorylation des Rezeptors und
über die Bindung von Phospholipase-γ1 und Phosphatidylinositol-3-Kinase an den
SH2-Domänen des Rezeptors in der Aktivierung dieser beiden Enzyme. Diese
und weitere durch die Bindung von SCF an seinem Rezeptor bedingte Ereignisse
wie Aktivierung der p21ras, über die Phosphorylierung bedingte Aktivierung einer
cytoplasmatischen Proteintyrosinkinase der Src-Familie Tec, Tyrosin-
phosphorylierung der Proteintyrosinphosphatasen PTP 1C und PTP 1D;
Tyrosinphosphorylierung der Adaptor-Protein Grb2 resultieren in einem ganzen
Spektrum der zellulären Reaktionen, die die biologische Funktion von SCF für die
Mastzellen definieren. Diese Funktion beinhaltet die Degranulation mit Freiset-
zung der Mediatoren, die �down-regulation� der FcεRI, Chemotaxis sowie die Wir-
kung als essentieller Faktor für die Proliferation, Entwicklung und Reifung der
immaturen und maturen Mastzellen. Die Mastzellen exprimieren β1- und β
3-Integrine,
die Hauptrezeptoren der Zelloberfläche, über die die Adhäsion der Zellen mitein-
ander wie auch mit den Bestandteilen der extrazellulären Matrix (Kollagen,
Fibronectin, Fibrinogen, Vitronectin etc.) ermöglicht wird. Die Bindung der Agoni-
sten an die Integrine führt zur Aktivierung der Src Proteintyrosinkinase, die über
die Phosphorylierung der zahlreichen cytoplasmatischen Proteine die mehrere
Pfade der Signalübertragung initiiert und somit für die biologischen Funktionen
wie Verstärkung der FcεRI-vermittelten Degranulation und die Modulation der Dif-
ferenzierung und Proliferation verantwortlich ist. Es konnte eine Reihe der Protei-
ne identifiziert werden, die nach der Aktivierung der Integrine über SH2- und SH3-
Domänen an Src Proteintyrosinkinase binden, einer Tyrosinphosphorylierung un-
terliegen und somit aktiviert werden. Dazu gehören u.a. fokale Adhesionsproteine
wie p125Fak, Paxillin, Talin, α-Aktin und Cas und die regulatorischen Proteine wie
Agonisten der humanen Mastzellen und basophilen Granulozyten 31______________________________________________________________________________
Grb2, das Ras-MAP-Pfad aktiviert, und C-crk.
Die kutanen Mastzellen exprimieren eigenständige Rezeptoren für die
Komplementfaktoren C3a und C5a, deren Aktivierung zur Mediatorenfreisetzung
führt (82) und einen chemotaktischen Einfluß ausübt. Diese Rezeptoren gehören
der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren von Rhodopsin-Typ an. Auch
den Adhesionsmoleküle wie E- und P-Selektine sowie ICAM-1 wird ein aktivieren-
der Einfluß auf die Funktion der Mastzellen nachgesagt. Für die humanen kardia-
len Mastzellen konnte eine Aktivierung durch ECP (eosinophil cationic protein)
und MBP (major basic protein) demonstriert werden (83).
Auch die humanen basophilen Granulozyten werden neben der FcεRI-ver-
mittelten Aktivierung durch eine Reihe anderer Substanzen aktiviert. Diese Funk-
tion konnte für die Chemokine wie IL-8, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 (monocyte
chemotactic proteins 1-4), RANTES und MIP-1α (macrophage inflammatory
protein), Komplementfaktoren C3a und C5a und u.a. demonstriert werden.
Die Chemokine gehören zur Familie der Zytokine, wirken jedoch nicht als
die Modulatoren der zellulären Funktionen, sondern als deren Trigger. Sie werden
abhängig von der Position der beiden ersten Cysteingruppen in CXC-(die
Cysteingruppen voneinander durch eine Aminosäure getrennt) und in CCC-
Chemokine (die Cysteingruppen direkt einander folgend) unterteilt. Die humanen
basophilen Granulozyten besitzen auf ihrer Zelloberfläche die spezifischen
Chemokin-Rezeptoren, die zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an-
gehören. Das Interleukin-8 auch NAP-1 (neutrophil-activating peptide), das zur
Familie der C-X-C-Chemokine gehört, übt über seinen spezifischen Rezeptor ei-
nen chemotaktischen Einfluß auf die humanen basophilen Granulozyten (84) aus
und zeigt nur schwach ausgeprägte Aktivierung der Degranulation.
Die Desensibilisierungsexperimente zeigen die Existenz von zumindest drei
unterschiedlichen Rezeptoren für die C-C-Chemokine auf der Oberfläche der hu-
manen basophilen Granulozyten (85). Der CCR3-Rezeptor konnte eindeutig iden-
tifiziert werden. Die Vertreter der Familie der �monocyte chemotactic protein� wie
MCP-1, MCP-2, MCP-3 und MCP-4 induzieren stärker als die anderen C-C-
Chemokine wie RANTES (regulated on activation, normal T expressed and
secreted) und MIP-1α (macrophage inflammatory protein) die Histaminfreisetzung.
30 1 Einleitung______________________________________________________________________________
RANTES, MIP-1α und MCP-3 üben einen spezifischen chemotaktischen Einfluß
auf die humanen basophilen Granulozyten aus (86). Ein weiteres von basophilen
und eosinophilen Granulozyten exprimiertes Chemokin, Eotaxin 2, das spezifisch
an CCR3-Rezeptor bindet, wirkt chemotaktisch auf die basophilen Granulozyten
und induziert die Freisetzung von Histamin und Leukotriene wie LTC4. Auch für
andere Substanzen wie Zytokine PAF (platelet activating factor), ECP (das
eosinophile kationische Protein) und Analogon der bakteriellen Lipoproteine wie
fMLP konnte ein aktivierender Einfluß auf die Funktion der basophilen Granulozyten
gezeigt werden
1.3 Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten
Die Rolle, die diese beiden Zellpopulationen in den Überempfindlichkeits-
reaktionen spielen, scheint durch zahlreiche in vitro und in vivo Untersuchungen
gut untermauert zu sein (87). Über die Rolle als Effektorzellen der Über-
empfindlichkeitsreaktionen herausgehende Funktion der Mastzellen und
basophilen Granulozyten bei den Abwehrmechanismen, Regulation der Immun-
antwort, Entwicklung einer Fibrose und bei endogener Fibrinolyse und
Thrombolyse ist ein Objekt der zahlreichen Hypothesen.
Die allergische Reaktion wird in die Phase der Sensibilisierung und die
Effektorphase unterteilt. Die Effektorphase besteht aus einer Früh- (Sofortreaktion)
und Spätreaktion. Die Sofortreaktion tritt nur wenige Minuten nach der
Allergenexposition auf und wird durch die Bindung der Antigen-Immunglobulin E-
Komplexe an FcεRI�s der gewebeständigen Mastzellen der Haut und der Schleim-
häute des Respirations- und Gastrointestinaltraktes ausgelöst. Die Bindung der
allergenspezifischen IgE-Moleküle an FcεRI�s führt zur Kreuzvernetzung der Re-
zeptoren, Initialisierung der Signalübertragungsmechanismen und konsekutiver
Freisetzung der Mediatoren wie Histamin, Proteasen und Lipidmediatoren wie
PGD2, LTB
4, LTC
4 und PAF (88). Deren Wirkung bedingt das klinische Bild einer
Sofortreaktion mit Rötung der Haut, Muskelkontraktionen der glatten Muskulatur
wie zum Beispiel Bronchokonstriktion, Gefäßdilatation, Permeabilitätssteigerung
der Gefäße und Ödembildung durch das Transudat. Die Annahme der Schlüssel-
Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten 31______________________________________________________________________________
-rolle der Mastzellen bei der Auslösung der Sofortreaktion wird durch die folgen-
den Befunde untermauert (89): die allergische Sofortreaktion zeigt einen Anstieg
der intravasalen Konzentration von Histamin, Tryptase, LTC4 und PGD
2, die alle-
samt von Mastzellen sezerniert werden. Die erhöhten Spiegel von Histamin und
Tryptase werden in der BAL-Flüssigkeit bei dem allergischen Asthma bronchiale,
im nasalen Sekret bei exogener Rhinitis, in der Tränenflüssigkeit bei allergischen
Konjunktivitis und intravasal bei systemischen anaphylaktischen Reaktionen ge-
funden. Die Sofortreaktion ist in der Regel innerhalb von 0,5-2 Stunden schnell
reversibel und führt nicht zur Gewebedestruktion. In etwa 2-24 Stunden (meist 4-
8 Stunden) folgt meist eine Spätreaktion (late phase reaction). Diese ist durch ein
zelluläres Infiltrat aus zunächst Neutrophilen und später folgenden mononuklären
Zellen wie Lympho- und Monozyten bedingt. Charakteristisch für dieses Infiltrat ist
das vermehrte Auftreten von eosinophilen und basophilen Granulozyten sowie
Mastzellen und Abwesenheit von Tryptase und PGD2. Die Aktivierung der
Effektormechanismen dieser drei Zellpopulationen bildet die molekulare Grundla-
ge für die klinische Symptomatik der allergischen Spätreaktion (90).
Den basophilen Granulozyten wird eine besondere Rolle in Rahmen der
Spätreaktion zugeschrieben, da sie multiple Rezeptoren auf ihrer Oberfläche
exprimieren, auch von FcεRI´s unabhängig stimuliert werden können und Media-
toren und Zytokine freisetzen können. Vor allem die Eigenschaft, große Mengen
an LTC4 und kein PGD
2 zu sezernieren, spricht für diese Annahme (91, 92).
Die Immunantwort kann in die native und erworbene aufgeteilt werden. Es
finden sich multiple Hinweise auf eine herausragende Rolle der humanen Mast-
zellen und basophilen Granulozyten in diesen beiden Prozessen. Es konnte de-
monstriert werden, daß eine Anzahl der bakteriellen Faktoren wie Pepstatin A
(93), Typ 1 Fimbriae der E. coli (94), Protein A der Staphylococcus aureus (95),
Protein L der Peptostreptococcus magnus (96) u.a. sowie virale Faktoren wie gp120
des HIV und Protein Fv (97), das regelmäßig bei chronischen viralen Hepatitiden
im Serum gefunden wird, eine Aktivierung der Mastzellen und/oder der basophilen
Granulozyten hervorrufen können. Die Mastzellen zeigten die Fähigkeit zur
Phagozytose der lebenden bakteriellen Organismen wie Enterobacteriae und Ver-
arbeitung deren Antigene für die Präsentation zusammen mit MHC Klasse I -Mole-
32 1 Einleitung______________________________________________________________________________
küle den T-Lymphozyten (98). Das TNF-α, das konstitutionell nur von Mastzellen
sezerniert wird, zeigt eine Aktivierung der neutrophilen Granulozyten, die eben-
falls eine Rolle in der antimikrobiellen Abwehr spielen kann. Auch die Präsenz der
MHC Klasse II-Moleküle auf Mastzellen (MMC-like bone marrow derived mast cells,
BMMC�s) und Antigenpräsentation zu den CD4+ T-Lymphozyten konnte demon-
striert werden (99, 100). Diese Untersuchungen haben zeigen können, daß BMMC�s
alle Kriterien der APC�s (antigen presenting cells) erfüllen 1. Internalisation und
Degradation der Antigenproteine zu immunogenen Peptide 2. Expression des
Komplexes MHC Klasse II-Peptid auf der Zelloberfläche und 3. stimulierende Wir-
kung auf die T-Lymphozyten. Diese Mechanismen sind nur auf die exogenen An-
tigene beschränkt. Sie betreffen nicht die endogenen Autopeptide und Autoantigene.
Abbildung 5 Mastzellen als Effektorzellen der angeborenen und erworbenen Immunität. Aus:
Mecheri S. und David B. (1997) �Unravelling the mast cell dilemma: culpritor or victim of its
generosity ?�, Immunology Today, 18, 212-215
Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten 33______________________________________________________________________________
Alle diese Tatsachen unterstützen die Annahme der wichtigen Rolle, vor
allem der Mastzellen, in der Initiation und Immunomodulation der Immunantwort.
Die genauen Mechanismen bleiben aber weiterhin noch hypothetisch.
Es finden sich Hinweise auf die wichtige Rolle von TNF-α in der Induktion
der Mobilisation der neutrophilen Granulozyten in Rahmen der Entzündung-
reaktionen, die durch die Immunkomplexe induziert werden. Diese Induktion invol-
viert die Immunglobulin G-Fc Rezeptoren, was unter Berücksichtigung der Tatsa-
che, daß die Mastzellen die FcγRII und FcγRIII exprimieren, die Annahme erlaubt,
daß die Mastzellen eventuell auch die Immunantwort in den Entzündungsreaktionen
induzieren können. Darüber hinaus konnte eine zytotoxische Aktivität der Mast-
zellen, die durch die monoklonalen Antikörpern gegen TNF-α inhibiert wird, de-
monstriert werden (101), was für die Annahme der Induktion der nichtspezifischen
Zytotoxizität der Mastzellen durch TNF-α spricht. Auch den humanen basophilen
Granulozyten wird eine Rolle bei der Immunantwort gegen die bakteriellen und
viralen Erregern zugeschrieben, da eine Reihe dieser wie Staphylokoken (102),
Escherichia coli (103), Salmonellen (103), Candida albicans (104) und Vibrio
cholerae (105) die Freisetzung von Histamin von basophilen Granulozyten stimu-
lieren.
Die basophilen Granulozyten und Mastzellen können über die Sekretion
von IL-4 die Differenzierung der Th0- in die Th2-Subpopulation der T-Lymphozy-
ten initiieren. Die Triggerung der Freisetzung von IL-4 konnte für die Antigen-prä-
sentierende Mastzellen demonstriert werden, so daß dieser Prozeß MHC II-ab-
hängig erscheint. Die weiteren wichtigen Eigenschaften der Mastzellen und der
basophilen Granulozyten sind die Induktion der Proliferation und Differenzierung
der B-Lymphozyten über MC-BSA. Die humanen Mastzellen und die basophilen
Granulozyten sezernieren CD40L und können über ein CD40-Rezeptor mit B-Lym-
phozyten interagieren (23). Diese Interaktion und Einfluß von IL-4 führen zur Diffe-
renzierung der B-Zellen in die IgE-produzierenden Plasmazellen. Ein hypotheti-
sches Modell dieser Interaktion ist in der Abbildung 6 dargestellt.
Den Fibroblasten und Mastzellen, insbesondere dem MCCT
-Phänotyp, wird
die Schlüsselrolle in den Prozessen der Geweberemodellierung und Gewebefibrose
zugeschrieben. Unter den physiologischen Bedingungen besteht ein Gleich-
34 1 Einleitung______________________________________________________________________________
-gewicht zwischen fibrolytischer und fibrogener Aktivität, während die Fibrose durch
eine exzessive Produktion von Kollagen und anderen Bestandteile der extra-
zellulären Matrix verursacht ist. Diese Überproduktion ist entweder durch eine
gesteigerte Aktivität der Fibroblasten, oder eine Fibroplasie bedingt. Das Histamin
und LT4 steigern die Proliferationsrate und Kollagenproduktion der Fibroblasten.
Tryptase und Chymase degradieren die Bestandteile der extrazellulären Matrix,
aktivieren die Kollagenasen und stimulieren die Proliferation der Fibroblasten. Die
Zytokine der Mastzellen wie TNF-α und IL-4 stimulieren ebenso die Proliferation
der Fibroblasten. Im Gegenzug können die Fibroblasten die Replikation, die
Adhärenz, die phänotypische Variabilität und die funktionelle Aktivität der Mast-
zellen über die Freisetzung von SCF, IL-8 und MCAF (mast cell activity factor)
regulieren. Diese gegenseitigen Einflüße zwischen den Fibroblasten und Mast-
zellen könnten die Basis des physiologischen Gleichgewichtes zwischen
Abbildung 6 Ein hypothetisches Modell der Interaktion der Mastzellen und T- und B-Lymphozy-
ten. Aus: Mecheri S. und David B. (1997) �Unravelling the mast cell dilemma: culpritor or victim of
its generosity ?�, Immunology Today, 18, 212-215
Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten 35______________________________________________________________________________
fibrolytischer und fibrogener Aktivität bilden, dessen Störung in einer Gewebefibrose
münden könnte. Über diese bidirektionale Rückkopplung könnten die Mastzellen
bei der Geweberemodelierung und Entstehung einer Fibrose eine Rolle spielen.
Diese Hypothese scheint durch die erhöhte Anzahl der Mastzellen und ihre erhöh-
te Aktivität u.a. bei idiopathischer dilatativer und ischämischer Kardiomyopathie,
die durch die Fibrose des Myocards gekennzeichnet sind, untermauert zu sein.
Die weiteren nosologischen Entitäten, die mit diesen Befunden einhergehen, sind
Sklerodermie, Asthma bronchiale und die fibrotischen Lungenerkrankungen.
Die endogene Fibrinolyse ist ein Teil der Reparationsvorgänge, die einer
entzündlichen oder anderen lokalen mit transienter Fibrinablagerung einherge-
henden Reaktion folgen. Eine besondere Rolle der Mastzellen in der Regulation
dieses Prozesses wird postuliert (106). Eine Reihe der Mediatoren der Mastzellen
zeigt die Eigenschaften, die diese Hypothese sehr wahrscheinlich erscheinen las-
sen. Die Tryptase degradiert das Fibrinogen und aktiviert die Pro-Urokinase.
Chymase inaktiviert das Thrombin. Heparin wirkt als Kofaktor für Antithrombin III
(AT III) und aktivierender Kofaktor von Tryptase und tPA (tissue plasminogen
activator). Die Mastzellen exprimieren enzymatisch aktives tPA und die u-PA-Re-
zeptoren. Die Expression der Inhibitoren von tPA und u-PA konnte bis dato nicht
demonstriert werden (107). Zusammenfassend exprimieren die Mastzellen eine
Reihe der fibrinolytischen Substanzen und sind imstande die Fibrinolyse in vitro zu
induzieren. Es erscheint möglich, daß die Mastzellen zunächst die �capillary
leakage� induzieren und dann an lokaler Fibrinolyse teilnehmen. Da für die Endothel-
zellen (EC) die Freisetzung von SCF demonstriert werden konnte, wäre es mög-
lich, daß Thrombin-aktivierte EC�s SCF synthetisieren und freisetzen, der die Che-
motaxis und Akkumulation von Mastzellen bewirkt. Diese könnten dann vermehrt
tPA sezernieren und die Fibrinolyse und endogene Thrombolyse bewirken.
Es bestehen fundierte Hinweise auf eine regulatorische Funktion der Mast-
zellen im Prozeß der Angiogenese. Die Mastzellen der Bindegewebe sind
topografisch mit den kleinen Gefäßen assoziiert. Die erhöhte Anzahl der Mast-
zellen findet sich bei vielen Prozessen, die mit gesteigerten Angiogenese einher-
gehen, wie Wundheilung, Ovulation, Hämangiome, Neoplasien und in
dysfunktionellem Myocard. Zahlreiche Mediatoren der Mastzellen weisen einen
36 1 Einleitung______________________________________________________________________________
ausgeprägten angiogenetischen Effekt wie Histamin (über H1- und H
2-Rezepto-
ren), Heparin und TNF-α. Die weiteren Mediatoren der Mastzellen sind in die
Regulation der Funktion der Endothelzellen involviert. TNF-α induziert die Ex-
pression von ELAM-1 (endothelial leukocyte adhesion factor) von Endothelzellen.
Die Tryptase überführt prä-ANF (atrial natriuretic factor) in seine aktive Form
ANF. Andere Untersuchungen suggerieren, daß die Mastzellmediatoren wie Hist-
amin und Heparin die anderen Zellpopulationen wie die Makrophagen und
Fibroblasten zu Freisetzung von angiogenetischen Proteasen und Zytokine sti-
mulieren. TGF-α erhöht die Expression von VEGF (vascular endothelial growth
factor) von Fibroblasten und Epithelzellen. VEGF stimuliert direkt die Proliferati-
on und Migration der Endothelzellen. Heparin potenziert die Wirkung eines der
stärksten angiogenetischen Faktoren FGF (fibroblast growth factor) durch die
Erhöhung der Affinität von FGF zu seinem Rezeptor und die Hemmung der FGF-
Degradation. Im Gegenzug induzieren FGF, PDGF und VEGF die chemotakti-
sche Migration der Mastzellen.
Alle diese aufgeführte hypothetische Annahmen bedürfen der weitergehen-
den Untersuchungen, die zu der eventuellen Bestätigung führen können.
1.4 RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell für die humanen Mastzellen und
basophilen Granulozyten
1.4.1 Beschreibung der RBL-2H3-Zellinie
Die RBL-2H3 Zellinie (rat basophilic leukemia cell line) wurde kloniert und
isoliert im 1978 in Laboratorium der Immunologie des Nationalen Institutes für die
stomatologische Forschung (Laboratory of Immunology at the National Institute of
Dental Research, National Institutes of Health, Bethesda, USA) aus den basophilen
Zellen der Wistarratten (108). Die RBL-2H3-Zellinie ist eine in der Kultur adhärent
wachsende stabile Zellinie, die die hochaffinen Immunoglobulin E-Rezeptoren
(FcεRI) in Zahl von ca. 3∗105 membranständig exprimiert. Die weiteren von dieser
Zellinie exprimierten Rezeptoren sind SCF-Rezeptor, niedrigaffine IgG-Rezepto-
ren FcγRII und FcγRIII (109) und die Adhäsionsmoleküle wie Integrine und
Funktion der Mastzellen und basophilen Granulozyten 37______________________________________________________________________________
Adenosinrezeptoren (A2a
, A2b
, A3). Interessanterweise wird die Subform der
niedrigaffinen IgG-Rezeptoren (FcγRII) FcγRIIB1 im Gegensatz zur Subform
FcγRIIB2 nur von den stimulierten RBL-2H3-Zellen exprimiert. Die FcγRIIB2-Re-
zeptoren werden von den stimulierten und ruhenden RBL-2H3-Zellen exprimiert.
Die punktuelle Mutation der Asparaginsäure in der Position 814 des SCF-Rezeptors
wird für das neoplastische Wachstum dieser Zellinie verantwortlich gemacht (110).
Die Rezeptoren für die Komplementfaktoren C3a und C5a werden nicht detektiert.
Interessanterweise inhibiert den Komplementfaktor C3a die FcεRI-vermittelte Ak-
tivierung der RBL-2H3-Zellen, am wahrscheinlichsten durch die Bindung an FcRβ
(111). Die RBL-2H3-Zellen lassen sich problemlos in großer Zahl kultivieren. Durch
ihre Eigenschaften erfüllt diese Zellinie die wesentlichen Voraussetzungen als ein
Modell für die Mastzellen und die basophilen Granulozyten. Durch die Aggregati-
on der FcεRIs kommt es zur Zelldegranulation und konsekutiver Freisetzung von
Histamin, Serotonin sowie anderer zellulären Mediatoren. Die RBL-2H3-Zellen wur-
den zur Untersuchung der Struktur der Immunglobulin E Rezeptoren eingesetzt.
Mit Hilfe dieser Zellinie konnte erstmalig die Struktur der hochaffinen IgE-Rezep-
toren identifiziert werden (112). Diese Erkentnisse führten mittelbar zur Klonierung
der humanen FcεRI, der Entdeckung der Signalübertragungsmechanismen der
FcεRI sowie der verschiedenen Aspekte der zellulären Signalvorgänge wie die
Aktivation der Proteinkinasen, Phospholipasen, G-Proteinen und Einfluß der in-
trazellulären Calciumkonzentration auf diese Vorgänge.
1.4.2 Beschreibung der RBL-2H3-m3.7-Zellinie
Die Zellinie RBL-2H3-m3.7 exprimiert die humanen muskarinen Acetylcholin-
rezeptoren Subtyp 3 auf ihrer Oberfläche. Diese neue Zellinie entstand durch die
Transfektion der Zellen mit AP 129 Retrovirus, in dessen Genom ein humaner m3-
mAChR Gen aus der G418 resistenten NIH-3T3-Fibroblasten-Zellinie integriert
wurde (113). Die Zellen der RBL-2H3-m3.7-Zellinie wachsen analog der
Mutterzellinie adhärent und stabil in Zellkulturen und lassen sich in großer Zahl
kultivieren. Durch die Bindung eines Acetylcholinagonisten wie Carbachol
(Carbamylcholinchlorid) kommt es durch die Aktivation des mit G-Protein-gekop-
38 1 Einleitung______________________________________________________________________________
-pelten Rezeptors zum Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration mit kon-
sekutiver Degranulation und damit zur Freisetzung von Mediatoren wie Histamin,
Serotonin und anderen. Diese Zellinie ist bis auf m3-AChR mit der Zellinie RBL-
2H3 phänotypisch identisch.
Die RBL-2H3-m3.7-Zellen können entweder über m3-ACh-Rezeptor oder
über Immunglobulin E-Rezeptor stimuliert werden. Diese Tatsachen erlaubt die
Diskriminierung zwischen diesen zwei unterschiedlichen Pfaden der Signal-
übertragung wie auch die Untersuchung der Modulation der einzelnen Pfade durch
exogene Faktoren. Die Faktoren, die Signalübertragungsmechanismen an nur ei-
nem der Rezeptoren beeinflußen, bleiben auf diese Weise ohne Einfluß auf die
Ereignisse, die aus der Aktivierung des anderen Rezeptors resultieren.
1.4.3 Signalübertragungsmechanismen in RBL-2H3-Zellen
Die Signalübertragungsmechanismen in �rat basophilic leukemia� Zellen
(RBL-2H3-Zellen) werden am Beispiel des Immunglobulin E-Rezeptors vorgestellt.
Darüber hinaus existiert eine Fülle an Erkenntnissen über die weiteren Mechanis-
men der Signalübertragung der anderen von RBL-2H3-Zellen exprimierten Re-
zeptoren, deren Darstellung jedoch die Rahmen dieser Arbeit sprengen würde.
Die FcεRI der RBL-2H3-Zellen weisen nur geringgradige Unterschiede im
Vergleich zu humanen FcεRI, die sich vor allem auf die Länge der einzelnen Un-
tereinheiten beziehen. Die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der FcεRI
der RBL-2H3-Zellen entsprechen weitgehend der humanen FcεRI, wie unter 1.1.5
beschrieben.
Die Aggregation der FcεRI der RBL-2H3-Zellen resultiert in der Aktivierung
der p53/56lyn Proteintyrosinkinase der Src-Familie. Diese ist über ihre SH4-Domä-
ne (N-terminales Ende) in der Zellmembran verankert. Die Aktivierung wird am
ehesten durch die sterischen und strukturellen Konformationsänderungen der p53/
56lyn -Moleküle, die durch die Aggregation des FcεRI-Tetramers verursacht wer-
den und zur Autophosphorylation der p53/56lyn Proteintyrosinkinase führen. Diese
verursacht die schnelle Phosphorylation der γ-Untereinheiten des FcεRI. Es wer-
den die Tyrosinreste der beiden ITAM-Sequenzen der γ-Untereinheiten
RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell 39______________________________________________________________________________
phosphoryliert. Die ITAM�s weisen die folgende Sequenz auf: (D/E)X2YX
2LX
6-7YX
2-
(L/I). Die Phosphorylation kann nur im aggregierten Zustand des Rezeptors erfol-
gen, eine Disaggregation verursacht eine schnelle Dephosphorylation. Die
phosphorylierten ITAM-Sequenzen der γ-Untereinheiten dienen als hochaffine
Bindungsstellen für die Tandem-SH2-Domänen der Proteintyrosinkinase p72syk.
Die ITAM-Sequenz der FcRβ-Untereinheit fungiert als eine Art Anker für p53/56lyn
und kann dadurch die p53/56lyn -abhängige Phosphorylation von FcRγ verstärkt
(114). Die Bindung an ITAM�s der γ-Untereinheiten aktiviert die katalytische Aktivi-
tät der p72syk, was wiederum zur Autophosphorylation dieser und entstehen der
Bindungsstellen für die SH2-Domänen enthaltenden Proteinen führt. Bis dato konnte
eine Anzahl der Proteine mit katalytischen Eigenschaften identifiziert werden, die
über die Bindung an SH2-Domäne der p72syk aktiviert werden und weitere Pfade
der Signalübertragung eröffnen. Die Phospholipase C-γ1 enthält zwei SH2- und
eine SH3-Domäne. PLC-γ1 katalysiert die Hydrolyse des Phosphatidylinositol 4,5-
biphosphates (IP2) zum 1,2-Diazylglyzerol (1,2-DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat
(IP3). PLC-γ1 wird nach der Bindung an SH2-Domänen der p72syk von dieser
phosphoryliert und danach disloziert in die cytoplasmatische Fraktion (115). Die
durch die Hydrolyse des Phosphatidylinositol 4,5-biphosphates entstehenden Ver-
bindungen fungieren als second messengers in der weiteren Signalübertragung.
Dem 1,2-Diazylglyzerol (1,2-DAG) wird die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC)
und der weiteren Kinasen zugeschrieben. 1,2-DAG wird zur biologisch aktiven
Phosphatidylsäure phosphoryliert. Inositol-1,4,5-tris-phosphat (IP3) bindet an dem
eigenen Rezeptor der Membran des endoplasmatischen Reticulums und führt dar-
über zur Freisetzung der dort gespeicherten Calciumkationen, was wiederum zur
Mitaktivierung der Ca2+-abhängigen Enzymen führen kann. IP3 dient als Prekursor
für die Synthese der weiteren Inositolpolyphosphaten (IP4, IP
5, IP
6), die mögli-
cherweise durch die Interaktion mit weiteren intrazellulären Proteinen eine biolo-
gische Rolle spielen. Die Proteinkinase C (PKC) ist eine Threonin/Serinkinase
mit Ca2+-abhängigen und Ca2+-unabhängigen Isoenzymen α und β bzw. δ, ε und
ξ. Die Rolle der PKC wird in der Regulation der Aktivität der Phospholipase A2
und Phospholipase C-γ1 gesehen. Jedes dieser Enzyme wird durch ein Ca2+-
abhängiges und Ca2+-unabhängiges Isoenzym der PKC reguliert. PLA2 von PKCβ
40 1 Einleitung______________________________________________________________________________
und δ (116), PLC-γ1 von PKCα und PKCε (117). Die Aktivierung der PKC verur-
sacht durch die Phosphorylierung der Phosphatidylinositolkinase (PI) und der
Phosphatidylinositol-4-Phosphatkinase (PIP) ein Anstieg der Konzentration von
Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PIP) und Phosphatidylinositol-4,5-Biphosphat
(PIP2). Dieser Anstieg Korreliert mit dem Grad der Aktin-Polymerisation, was eine
mögliche Interaktion zwischen den Polyphosphoinositolen und Aktin-bindenden
Proteinen wie Gelsolin und Profilin impliziert. Dadurch könnte die PKC eine Rolle
im Prozeß der Degranulation spielen (118).
Abbildung 7 Schema der Signalübertragungsmechanismen in RBL-2H3-Zellen. Aus:Hamawy
M.M., Mergenhagen S.E., Siraganian R.P. (1995), �Protein tyrosine phosphorylation as a
mechanism of signalling in mast cells and basophils.�, Cell.Signal., 7, 535-544
RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell 41______________________________________________________________________________
Ca2+ Fc RIe
b ga b
Integrine
Btk
P
P
P
P
P
P
Ca2+
SH2
SH3
Lyn
P
FAP
P
P P
P
P
Vav
Nck
HS1
MAP
?
PI
a
IP3-K
pp105-115FAK
IP3
PKC
DAGPPP
PPP
PLC 1g
SH2 SH2Syk
P
Paxillin
Die Aggregation der FcεRI verursacht die Phosphorylierung von pp125FAK
(focal adhesion kinase) und Paxillin. Dieser Vorgang bedarf der Aktivierung der
Proteinkinase C und ist calciumabhängig. Die pp125FAK wird durch die p72syk an
Tyrosin-Residuen phosphoryliert. Da die Bindung von mAb AA4 keine
Phosphorylierung von pp125FAK verursacht und nicht in der Degranulation der Zel-
le resultiert, scheint pp125FAK eine Rolle in den Sekretionsvorgänge zu spielen.
Paxillin, ein cytoskelettales Protein, verfügt über die Bindungsstellen für die SH2-
und SH3-Domänen und pp125FAK. Paxillin wird in vitro von pp125FAK phosphoryliert.
Es wird angenommen, daß diese beiden Proteine eine wichtige Rolle in der FcεRI-
vermittelten Degranulation spielen (119). Die Rolle der weiteren cytoskelettalen
Proteine wie Myosin erscheint noch unklar.
Die Aggregation der FceRI´s verursacht die Aktivierung der Sphingosin-
kinase (SK), die Spingosin-1-phosphat synthetisiert. Durch die spezifische Inhibition
der SK bleibt ein FcεRI-vermittelter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration
fast vollständig aus bei regelrechter Aktivierung der p72syk und einem Anstieg der
IP3-Konzentration (120). Sehr wahrscheinlich kommt es über diesen Mechanis-
mus zum eigentlichen FcεRI-vermittelten Anstieg der intrazellulären Calcium-
konzentration durch die Freisetzung aus dem endoplasmatischen Reticulum. Die-
se Annahme wird durch die Tatsachen unterstützt, daß der IP3 -vermittelte Anstieg
der Ca2+-Konzentration der Degranulation nicht vorauszugehen scheint.
Der FcεRI-vermittelter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration führt
zur Translokation der cytoplasmatischen Phospholipase A2 (cPLA
2) zur Zellkern-
membran (121), wo die cPLA2 im Komplex mit 5-LO und FLAP die Leukotrienen-
synthese katalysiert.
Die Kreuzvernetzung der FcεRI induziert das NFAT (nuclear factor of
activated T-cells) (122). Dieser ist in die Regulation der mRNA-Transkription der
Zytokine wie IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF, TNF-α und vielleicht IL-13 involviert. Der
FcεRI-vermittelter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration verursacht
die Aktivierung der Ca2+-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die das
cytosolische NFAT dephosphoryliert und dadurch aktiviert, was zur Translokation
von NFAT ins Zellkerninnere führt. NFAT bindet mit Transkriptionsfaktoren der
AP-1 (Fos/Jun)-Familie und generiert die NFAT-AP-1-Bindungstellen, die in den
42 1 Einleitung______________________________________________________________________________
regulatorischen Gen-Regionen der induzierbaren Zytokine der Zellen des Immun-
systems gefunden werden. Ein weiterer Signalpfad, der eine wichtige Rolle in der
Regulation der Gentranskription spielt, ist der Ras-MAP-Kinase-Pfad. Die Aggre-
gation der FcεRI´s aktiviert über den Austauschfaktor Sos, der an die Adaptor-
Proteine Grb2 bindet, den Ras-Pfad der Signalübertragung. Das Grb2 wird nach
der FcεRI-vermittelten Phosphorylierung der Shc-Proteintyrosinkinase aktiviert.
Ras phosphoryliert Raf, das die MEK-Kinasen phosphoryliert, die wiederum die
MAP-Kinasen (mitogen activated proteins kinase) phosphorylieren (123). Die
Translokation der MAP-Kinasen ins Innere des Zellkerns führt zur Aktivierung
der Transkriptionsfaktoren und dadurch zur Expression der Genprodukte wie
Interleukine. Die Rolle der MAP-Kinasen wird in der Integration der verschiede-
nen Pfaden der Signalübertragung, die eine funktionelle Bedeutung für die Re-
gulation des Zellzyklus besitzen, gesehen (124).
In den RBL-2H3-Zellen wird durch den Anstieg der [Ca2+]i und Aktivierung
der PKC die Phospholipase D aktiviert. Diese verursacht ein Anstieg der Konzen-
tration von Phosphatidylsäure und Diglyzeride, die als second messenger fungie-
ren.
Die Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3) wird nach der Aggregation der
FcεRI´s aktiviert. Sie katalysiert die Formation der Phosphodiester, die an der
Position 3� des Inositolringes mit einem Fettsäure verbunden sind. Diese Verbin-
dungen inhibieren die Aktivität der Phospholipase C-γ1. Die Phosphatidylinositol-
polyphosphate sind ein Substrat der Proteinen, die Plekstrin-Homologie-Domä-
nen enthalten, wie Btk Proteintyrosinkinase, die Regulatorproteine wie Sos und
Vav, sowie ras-GAP und PLC-γ. Die regulatorische Einheit p85der PI3 ist mit Syk
Proteintyrosinkinase assoziiert. Alle diese Tatsachen erlauben die Annahme, daß
die PI3 in der Kontrolle der Signalübertragung eine Rolle spielen könnte.
Es konnte eine Reihe der weiteren Proteine wie Grb2 (Ras-pathway mit
Sos, Shc, MAP-Kinasen und p95vav), GTP-ase aktivierende Protein der p21ras und
Phosphatidylinositolkinase 3� identifiziert werden, die nach der Zellaktivierung via
FcεRI phosphoryliert bzw. aktiviert werden. Ihre Bedeutung für die FcεRI-vermit-
telten Signalübertragungsmechanismen der RBL-2H3-Zellen ist zur Zeit noch nicht
eindeutig definiert und ein Gegenstand der weiteren Forschungsvorhaben.
RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell 43______________________________________________________________________________
1.4.3.1 Intrazelluläres Calcium
Die Calciumkationen spielen eine wichtige Rolle in den Signalübertragungs-
mechanismen. Dank ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften erfüllen
sie in vielen Systemen der fast allen bekannten Organismen die Rolle als spezifi-
scher second messenger. Die Calciumkationen fungieren als ein phylogenetisch
sehr alter Aktivierungsfaktor der katalytischen Aktivität der zahlreichen enzyma-
tisch aktiven Proteine bzw. als Kofaktor der weiteren Aktivierungs- und
Inhibitionsprozessen. Diese Funktion der Calciumkationen konnte für die Prozes-
se der Genexpression, zellulären Sekretion, Kontraktion und des zellulären
Metabolismus nachgewiesen werden (125). In RBL-2H3-Zellen konnte bei der Er-
forschung der Signalübertragungsmechanismen eine Reihe der Ereignisse, bei
denen eine direkte Ca2+-Abhängigkeit besteht, identifiziert werden. Dazu gehören
Aktivierung von PKC, PLA2, NFAT, Degranulation und viele andere.
Ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in den eukaryotischen
Zellen kann entweder durch die Freisetzung der Calciumkationen aus den intra-
zellulären Depots oder durch den Eintritt des Calciums aus dem extrazellulären
Raum in die Zelle erfolgen. In den elektrisch erregbaren Zellen erfolgt dieser Ein-
tritt über die spannungsabhängigen Ionenkanäle. Im Gegensatz zu solchen Zel-
len, wie z.B. Neuronen, verfügen die RBL-2H3-Zellen wie auch die humanen
Mastzellen und die basophilen Granulozyten über keine spannungsabhängigen
Ionenkanäle. In den elektrisch nicht erregbaren Zellen wie in Zellen des Immun-
systems, Endothelien, Epithelien und Hepatozyten erfolgt der Eintritt der Calcium-
kationen in die Zelle über sog. �store-operated Ca2+-entry�, wo der direkte Eintritt
der Calciumkationen in die Zelle über den Füllzustand der intrazellulären Calcium-
depots wie das endoplasmatische Reticulum reguliert wird (126). Die erste De-
monstration dieses Mechanismus gelang Hoth und Penner (127) für die Mast-
zellen und die entdeckten Calciumkanäle (calcium influx channels) wurden ICRAC
(Ca2+ release activated Ca2+ current) genannt. Gegenwärtig stellt ICRAC
den am
besten untersuchten �store-operated Ca2+-entry�-Mechanismus mit der höchsten
Sensitivität für die Calciumkationen dar. Die Existenz der ICRAC
konnte auch für
die RBL-2H3-Zellen demonstriert werden (128).
44 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Die Calciumkanäle ICRAC
können durch eine Reihe der Faktoren, die alle-
samt die Eigenschaft der Entleerung der IP3-sensitiven Depots besitzen müssen,
aktiviert werden. Unabhängig von dem Mechanismus der Entleerung der Calcium-
depots zeigen die ICRAC
die identischen Eigenschaften. Sie sind spannungs-
unabhängig, weisen eine hohe Selektivität für die Calciumkationen auf, aber nur
eine sehr geringe Leitfähigkeit des einzelnen Kanals für die Calciumkationen (0,02
pS) (129). Obwohl die molekulare Struktur der ICRAC
noch nicht entschlüsselt wer-
den konnte und die Frage, ob es sich bei diesem Mechanismus um ein Ionenkanal
oder um ein Trägerprotein handelt, noch nicht endgültig beantwortet werden konnte,
sprechen die Indizien dafür, daß ICRAC
ein Ionenkanal mit zumindest zwei Ca2+-
Bindungsplätzen (130) ist.
Es scheint, daß die Aktivierung der ICRAC
nur durch die Entleerung der Inositol-
3-Phosphat sensitiven Depots erfolgen kann. Die anderen Depots wie z.B.
Sphingosin-1-Phosphat sensitive Depots, die auch in RBL-2H3-Zellen detektiert
werden, zeigen keine Wechselwirkung mit dem ICRAC
-abhängigen Eintritt der
Calciumkationen in die Zelle (131). Die Signalübertragung zwischen den IP3-sen-
sitiven Depots und ICRAC
-Ionenkanäle bedarf zumindest zwei Elemente: einen Sensor
des Ca2+-Gehaltes und einen Aktivierungsfaktor. Die molekulare Natur des Sensors
bleibt bis dato unklar. Eine mögliche Rolle der IP3-Rezeptoren selbst und weiteren
Ca2+-bindenden Proteinen wie Calmodulin und Calreticulin, die Haupt-Calcium-
bindendes Protein des endoplasmatischen Reticulums darstellt, wurde postuliert,
konnte jedoch nicht eindeutig bewiesen werden (132, 133). Auch die Natur des
postulierten Aktivierungsfaktor konnte trotz der mannigfachen Untersuchungen
noch nicht geklärt werden. Die hypothetischen Modelle der Signalübertragung, die
die Calcium-Depots mit den ICRAC
-Ionenkanälen verbinden, werden in die Mecha-
nismen der direkten (IP3 und IP
4-Rezeptor , IP
3-Rezeptor Typ3) und indirekten
Kopplung (cGMP, IP4, Tyrosinkinase, Proteinkinase C, Calcium/Calmodulin ab-
hängige Kinase, Proteinphosphatase, Vesikelfusion, kleine G-Proteine, Cytochrom
P-450) vermutet. Für keinen dieser Mechanismen konnte ein eindeutiger Beweis
für seine Rolle erbracht werden. Es konnten mehrere Mechanismen identifiziert
werden, die die Inaktivierung der ICRAC
-Ionenkanäle bewirken. Für die RBL-2H3-
Zellen konnte eine Inaktivierung durch die Calciumkationen, ATP bzw. seinen
RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell 45______________________________________________________________________________
Analogon Adenosine 5�-O-(3-thiotriphosphat) (ATPγS) und eine Verstärkung der
Inhibition durch die Stimulation der Proteinkinase C gezeigt werden. Die ICRAC
-
Ionenkanäle werden wie ihre Gegenspieler, die spannungsabhängigen Ionenkanäle,
durch den Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration inhibiert. Hoth und
Penner (134) haben einen lokalen Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration,
der aus den Einfluß über die ICRAC
-Ionenkanäle resultiert, als einen schnellen loka-
len inhibitorischen Feedback-Mechanismus vorgeschlagen. Dieser Mechanismus
könnte eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zeit und des Ausmaßes von dem
Einfluß der Calciumkationen in die RBL-2H3-Zelle spielen. Für die T-Lymphozy-
ten demonstrierte Inaktivierung der ICRAC
-Ionenkanäle durch das Auffüllen der in-
trazellulären Depots (135) konnte für die RBL-2H3-Zelle nicht nachgewiesen wer-
den. Eine Reihe der Rezeptoragonisten, deren Stimulation zur Aktivierung der
ICRAC
-Ionenkanäle führt, vermittelt die Aktivierung der Proteinkinase C. Diese Akti-
vierung scheint eine Rolle in der Inhibition der ICRAC
-Ionenkanäle in den RBL-2H3-
Zellen als ein negativer Feedback-Mechanismus zu spielen (136).
Obukhov et al. (137) gelang die Identifizierung der anderen Ionenkanäle
in RBL-2H3-Zellen. Diese nicht selektive Kanäle sind durch hohe Leitfähigkeit für
die Calciumkationen, die höher als die der ICRAC
-Ionenkanäle ist, und die fehlende
Aktivierung durch die steigende intrazelluläre Calciumkonzentration charakteri-
siert. Insgesamt könnten diese weniger als ICRAC
zahlreiche Ionenkanäle, die je-
doch eine höhere Leitfähigkeit aufweisen, zu einem hohen lokalisierten und vor-
übergehenden Anstieg der Calciumkonzentration führen, was eine Triggerung
der Sekretion auslösen könnte.
Zusamenfassend folgt der Aggregation der FcεRI in der RBL-2H3-Zellen
in ca. 30 sec. ein transienter Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration
von der basalen Konzentration ( ca. 100-200 nM) (138), der über die Freisetzung
der Ca2+-Kationen aus den intrazellulären Depots (endoplasmatisches Reticulum)
durch IP3 und wahrscheinlich durch Sphingosin-1-Phosphat (s. Kap. 1.4.3) zu-
stande kommt. Die zeitliche Verzögerung ist durch die notwendige Rekrutierung
der cytoplasmatischen Enzyme wie Proteintyrosinkinasen, Phospholipase-1γ und
Sphingosinkinase bedingt. Die maximale intrazelluläre Calciumkonzentration und
Erreichen der transienten Plateauphase mit ca. 1200 nM werden durch den Eintritt
46 1 Einleitung______________________________________________________________________________
der Calciumkationen aus dem extrazellulären Raum über ICRAC
(und möglicherwei-
se über die nicht selektiven, hoch leitfähigen Kationenkanäle) in die Zelle erreicht.
Der Eintritt der Calciumkationen durch die ICRAC
-Ionenkanäle wird durch die Ent-
leerung der IP3-sensitiven Calciumdepots des endoplasmatischen Reticulums aus-
gelöst. Die Natur des Calciumkonzentration-Sensings sowie der Kopplungs-
mechanismen zwischen den Depots und den ICRAC
-Ionenkanäle bleiben zur Zeit
noch weitgehend unklar.
1.4.3.2 Degranulation
Das Verständnis der Mechanismen, die zur Degranulation der RBL-2H3-
Zellen führen, ist weiterhin noch lückenhaft. Die Degranulation (Exocytosis) ver-
langt die Konformationsänderungen der Proteine, die das Cytoskelett formen. Es
erscheint sehr wahrscheinlich, daß die Formation von F-Aktin und Redistribution
der Aktinfilamente zu den morphologischen Veränderungen der Zelle führen, die
letztendlich im Prozeß der Degranulation münden. Zwei durch die FcεRI-vermittel-
te Signalübertragungsmechanismen induzierte Ereignisse scheinen eine beson-
dere Rolle im Prozeß der Degranulation zu spielen: 1. Anstieg der intrazellulären
Calciumkonzentration, die conditio sine qua non der Degranulation repräsentiert
(139) und 2. Aktivierung der PKC. In den Mastzellen wie in den RBL-2H3-Zellen
erfolgt der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration überwiegend, wenn
nicht ausschließlich über die ICRAC
-Ionenkanäle (140, 141). Die mögliche Funktion
der PKC könnte die Phosphorylierung der Kinase der leichten Myosinketten, die
Interaktion zwischen Aktin und Myosin reguliert und eine Rolle in der
Konformationsänderungen des Cytoskellets spielt, darstellen.
Weitere Proteine, die wahrscheinlich eine Rolle in der Degranulation der
RBL-2H3-Zellen spielen sind p125Fak und Paxillin. Die p125Fak ist ein fokales
Adhäsionsprotein mit Proteintyrosinkinase-Aktivität, die Schlüsselrolle in Integrin-
vermittelten Signalübertragungsmechanismen spielt. Die Aggregation der FcεRI�s
induziert die Tyrosinphosphorylation von p125Fak durch die p72syk . Dieser Vorgang
ist Ca2+- und PKC-abhängig. Die Paxillin, ein cytoskelettales mit α-Aktin reagie-
rendes Protein, wird in vitro durch p125Fak-Kinase Calcium- und Proteinkinase C-
RBL-2H3-Zellen als Versuchsmodell 47______________________________________________________________________________
48 1 Einleitung______________________________________________________________________________
abhängig phosphoryliert. Dieser Vorgang kann in vitro auch Ca2+- und PKC-unab-
hängig durch die Aggregation der FcεRI´s induziert werden. Die phosphorylierte
Paxillin bindet an zahlreichen Proteinen des Cytoskelletons.
In RBL-2H3-Zellen konnte eine Reihe regulatorischer G-Proteine nachge-
wiesen werden. Mindestens zwei Vertreter dieser Proteingruppe wird eine Rolle
in der Spätphase der Exocytosis nachgesagt: das heterotrimerisches Gi3-Protein
und ein monomerisches kleines Ras-ähnliches G-Protein, das wahrscheinlich ein
Mitglied der rab3-Familie ist. Die Versuche mit den permeabilisierten peritonealen
Mastzellen der Ratte zeigten, mittels GTPγS (Guanosin 5´-O-triphosphat), eine
Auslösung der Degranulation, die Phospholipase C-unabhängig ist und bei der die
Calciumkationen als ein Modulator der sekretorischen Antwort fungieren. Diese
Befunde suggerierten eine mögliche Rolle eines G-Proteins in der Auslösung der
Degranulation (142). Dieses Protein konnte als Gi3-Protein, das in den Mastzellen
mit in der Zellmembran und in der Membran des Golgi-Apparates gebundenen
Subformen einzutreffen ist, identifiziert werden (143). Die Rolle der kleinen GTP-
bindenden Proteine in dem Prozeß der Sekretion wird als die eines Mediators der
Fusion der sekretorischen Granula impliziert (144). In den peritonealen Mastzellen
der Ratte könnten zwei Isoformen der rab3-Familie der kleinen GTP-bindenden
Proteine (Rab3B und Rab3D) identifiziert werden (145). In den permealisierten
Mastzellen der Ratte konnte, ähnlich wie durch GTPγS, eine Auslösung der kom-
pletten Exocytosis durch ein synthetisches Peptid (Rab3AL), das homolog zu der
Effektor-Domäne der Rab3A ist, demonstriert werden(146).
1.5 Gangliosid G D1b
1.5.1 Allgemeines
Die Ganglioside umfassen die Stoffgruppe, die den Sphingoglykolipiden
zuzurechnen ist. In dieser Gruppe ist die terminale Hydroxylgruppe des Sphingosins
glykosidisch mit mehreren Monosacchariden verknüpft. Die Ganglioside bestehen
aus einem Ceramid-Teil, einem neutralen Oligosaccharid mit meist zwei bis vier
Monosaccharidresten, meist Glukose, Galaktose und N-Acetylgalaktosamin,
sowie einer oder mehreren Sialinsäuren (N-Acetyl- und N-Glykolylneuraminsäuren),
die an den Galaktoseresten ketosidisch gebunden sind. Die charakteristische
Grundstruktur der Ganglioside entsteht durch schrittweise verlaufendes Ankop-
peln von nucleotidaktivierten Kohlenhydratresten (Urapidildiphosphoglukose,
Urapidildiphosphogalaktose, Urapidildiphospho-N-Acetylgalaktosamin und Cytidin-
monophosphat-N-Acylneuraminsäure) an ein Ceramidmolekül (Acylosphingosin)
durch Akzeptor-spezifische Transferasen.
Die Ganglioside sind ein konstitutioneller Bestandteil der Zellmembranen
und können die mannigfachen biologischen Funktionen ausüben. Sie fungieren
als Rezeptoren für die bakteriellen Toxine, spielen eine Rolle in den intrazellulären
Interaktionen und bei den Differenzierungsprozessen und können transmembra-
nöse Signalübertragungsmechanismen modulieren. Die Modulation der Rezeptor-
funktion durch die Inhibition der Tyrosinkinase konnte für die EGF- (epidermal
growth factor), Insulin- und PDGF- (platelet derivated growth factor) Rezeptoren
demonstriert werden. (147, 148, 149). Die an den Ganglioside bindenden
monoklonalen Antikörper üben vielfältigen Auswirkungen an den zellulären
Metabolismus wie Erhöhung der Konzentration an cGMP, Aktivierung der
Proteinkinase C, Stimulierung des intrazellulären Calciumeinflusses und Inhibition
der cAMP-Synthese. Viele dieser Funktionen erscheinen Proteintyrosinkinase-
abhängig.
1.5.2 Der monoklonale Antikörper AA4
Basciano et al. (150) generierten eine Anzahl von monoklonalen Antikör-
pern, die Bindung von IgE an RBL-2H3-Zellen inhibieren. Ein von diesen Antikör-
pern mAb AA4 weist die besonderen Eigenschaften auf. Es bindet nicht an einem
Epitop des FcεRI, obwohl sein Bindungsepitop mit dem IgE-Rezeptor strukturell
eng assoziiert ist, und zeigt die Inhibition der Histaminfreisetzung. Das mAb AA4
gehört zur IgG1-Subklasse. Die Bindungsepitope des mAb AA4 wurden von Guo
et al. (151) als zwei α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD1b
der RBL-2H3-
Zellen identifiziert. Die Struktur der beiden Antigene konnte, wie in der Abbildung
8 dargestellt, identifiziert werden. Die Anzahl der Bindungsepitope für das mAb
Gangliosid GD1b
49______________________________________________________________________________
50 1 Einleitung______________________________________________________________________________
Abbildung 8 Struktur der α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD1b
. Nach: Guo N.H., Her
G.R., Reinhold V.N., Brennan M.J., Siraganian R.P., Ginsburg V. (1989) �Monoclonal antibody
AA4, which inhibits binding of IgE to high affinity receptors on rat leukemia cells, binds to novel α-
galaktosyl derivates of ganglioside GD1b
�, J. Biol. Chem., 264, 13267-13272
AA4 ist um den Faktor 10-15 größer als die Anzahl der FcεRI´s. Die Ceramide des
Antigens I enthalten gleiche Mengen an C24:0, C22:0, C20:0, C18:0 und C16:0 N-
Acyl Fettsäuren. Die Ceramidbasen sind überwiegend die Sphingosine mit nur
kleinem Gehalt an Dihydrosphingosin. Die Ceramide des Antigens II enthalten
vorwiegend C24:0 N-Acyl Fettsäure mit viel kleinerem Gehalt an C22:0, C20:0,
C18:0 N-Acyl Fettsäuren. Die Ceramidbasen sind Sphingosine mit ca. 55% und
Dihydrosphingosin mit 45%. Es konnten keine ungesättigten Fettsäuren detektiert
werden.
Für das Gangliosid GD1b
konnte die Inhibition der Aktivität der
Phosphodiesterase der zyklischen Nukleotiden, eines Calmodulin-abhängigen
Enzyms, demonstriert werden (152). Das Gangliosid GD1b
bindet direkt an
Calmodulin, ein wichtiges Ca2+-abhängiges regulatorisches Protein, das insbeson-
dere in der Regulation der mRNA-Transkription eine wichtige Rolle spielt (153).
Die Anzahl der Moleküle des Gangliosids GD1b
auf RBL-2H3-Zellen konnte
Antigen I
Antigen II
3
3
Gal 1-3 Gal 1-3 Gal Nac 1-4 Gal 1-4 Glc 1-1 Cera b b b b
Gal 1-3 Gal 1-3 Gal 1-3 Gal Nac 1-4 Gal 1-4 Glc 1-1 Cera a b b b b
NeuAc 2-8 NeuAc 2a a
NeuAc 2-8 NeuAc 2a a
Fragestellung 51______________________________________________________________________________
mit 1-2∗105/Zelle bestimmt werden. Die Spezifität dieser Derivate für die Ratten-
Mastzellen (154) und die Ähnlichkeit der strukturellen und funktionellen Verände-
rungen der RBL-2H3-Zellen nach der Bindung mit mAb AA4 mit denen nach der
Aktivierung der Zellen via FcεRI konnten demonstriert werden. Es zeigte sich ein
kleiner Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und der Hydrolyse von
Phosphatidylinositol sowie Redistribution der Proteinkinase C. Swaim et al. (155)
zeigten zusätzlich zu diesen Ereignissen die Tyrosinphosphorylation der β- und γ-
Einheiten des FcεRI, der Phospholipase C-γ1 und der Tyrosinkinasen p53/p56lyn
und p75syk. Diesen Veränderungen folgte keine Histaminfreisetzung. Im Gegen-
satz zur Aktivierung via FcεRI zeigt die Bindung von mAb AA4 an das Gangliosid
GD1b
folgende Unterschiede: 1. die Rate der Kinasenaktivierung und
Phosphorylierung der Substrate ist langsamer 2. die FcεRβ und FcεRγ werden
stärker phosphoryliert 3. pp125FAK und pp105-115 werden nicht phosphoryliert 4.
die Distribution der Phosphoproteine ist unterschiedlich. Minoguchi et al. (156)
gelang der Nachweis der strukturellen Assoziation von α-Galaktosyl Derivate des
Gangliosids GD1b
mit Tyrosinkinase p53/p56lyn der Src-Familie, die nicht sekun-
där zu der Assoziation dieser Kinase mit FcεRI ist. Die weiteren mit dem Gangliosid
GD1b
assoziierten Proteine sind eine pp41/42 kDa Serinkinase und ein pp71-80
Protein. Diese Erkenntnisse belegen die Bedeutung und regulatorische Rolle
des Gangliosids GD1b
bei der Signalübertragung über den IgE-Rezeptor der RBL-
2H3-Zellen.
1.6 Fragestellung
Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren: 1. die Etablierung der Methodik
der Untersuchung der zellulären Vorgänge, die durch die Signalübertragungs-
mechanismen des Immunglobulin E-Rezeptors (FcεRI) in RBL-2H3-Zellen indu-
ziert werden. Als Parameter der Stimulation via FcεRI wurden die Serotonin-
freisetzung und der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration gewählt.
Diese Vorgänge repräsentieren die Endstrecken der Pfade der intrazellulären
Signalübertragung und erlauben somit den direkten Vergleich der Einflüsse, die
die Stimulation der RBL-2H3-Zellen via FcεRI modulieren. 2. die Untersuchung
52 1 Einleitung______________________________________________________________________________
des Effektes vom Gangliosid GD1b
auf die Signalübertragungsmechanismen des
Immunglobulin E-Rezeptors.
1. Die ersten Schritte der vorliegenden Arbeit beinhalteten die Etablierung
der Methodik der Messung der Serotoninfreisetzung und der intrazellulären
Calciumkonzentration mit intrazellulärem Fluoreszenzindikator Quin-2. Die ver-
schiedenen Zellarten unterscheiden sich in ihrem Gehalt an unspezifischen Ester-
asen, die Hydrolyse von Quin-2/AM in freies, Calcium-bindendes Anion Quin-2
gewährleisten. Das führt dazu, daß die notwendige, extrazelluläre Konzentration
vom Quin-2/AM und der Dauer des Ladevorganges zwischen den unterschiedli-
chen Zellarten sehr stark variieren können und deshalb sollen zwingend bestimmt
werden. Da die Hydrolyseprodukte von Quin-2/AM zellulären Metabolismus
konzentrationsabhängig alteriieren, soll die gewählte Quin-2/AM Konzentration,
bei noch ausreichend hohen Amplitude des Fluoreszenzsignals, die zellulären
Prozesse so wenig wie möglich beeinflussen. Die Bestimmung der spektralen
Eigenschaften von Quin-2/AM, Quin-2 und des Komplexes Quin-2/Ca2+ sowie
der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+ sollte der Überprüfung
der Validität des gewählten experimentellen Set-up`s dienen.
Der nächste Schritt war es, die die optimale Konzentration vom DNP35
HSA
(an Humanalbumin gekoppelte 35 Moleküle von 2,4-Dinitrophenyl) zu ermitteln.
DNP35
HSA wurde nach der Präinkubation der RBL-2H3-Zellen mit monoklonalem
anti-DNP Antikörper der IgE-Klasse zur direkten Stimulation der Zellen via FcεRI
verwendet.
2. Das Gangliosid GD1b
scheint einen regulatorischen Einfluß auf die Signal-
übertragungsmechanismen des Immunglobulin E -Rezeptors (FcεRI) zu nehmen.
Da eine strukturelle Assoziation des Gangliosids mit Tyrosinkinase p53/p56lyn der
Src-Familie und FcεRI demonstriert werden konnte, erscheint es wahrscheinlich,
daß eine noch nicht definierte Interaktion mit bzw. Einfluß auf die Funktion der
Tyrosinkinasen eine Erklärung dafür sein könnte. Die bis dato vorliegende Arbei-
ten lassen eine inhibitorische Wirkung des monoklonalen Antikörpers AA4 auf die
FcεRI-vermittelte Mediatorenfreisetzung über die Inhibition der intrazellulären
Calciumkonzentration als noch nicht eindeutig erscheinen, da nach der Bindung
des mAb AA4 an die α-Galaktosyl Derivate des Gangliosids GD1b
ein Anstieg der
Fragestellung 53______________________________________________________________________________
intrazellulären Calciumkonzentration der ruhenden, nicht aber über FcεRI stimu-
lierten RBL-2H3-Zellen zu verzeichnen ist. Die vorliegende Arbeit untersucht die
Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration der RBL-2H3-Zellen, die
nach der Inkubation mit mAb AA4 und einem Antigen (DNP35
-HSA) mit Antigen-
spezifischem Antikörper (anti-DNP-IgE) stimuliert werden. Die Arbeit untersucht
die Einflüsse des an dem Gangliosid GD1b
bindenden monoklonalen Antikörpers
AA4 auf die intrazelluläre Calciumkonzentration, deren Anstieg ein Ereignis in
der Signalübertragung über FcεRI darstellt, sowie auf die Serotoninfreisetzung,
die ein Ereignis der Endstrecke der FcεRI-vermittelten Aktivierung der RBL-2H3-
Zellen repräsentiert.
54______________________________________________________________________________
N
N COO-
ON
CH3
COO-
COO-
COO-
CH3O
QUIN2
N
N OCH2OCOCH3
ON
CH3
OCH2OCOCH3
OCH2OCOCH3
OCH2OCOCH3
CH3O
QUIN2 / AM
2 Materialien und Methodik
2.1 Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration
2.1.1 Chemische Eigenschaften von Quin-2
Quin-2 (N (2-((8 (bis (carboxymethyl) amino)-6 methoxy-2-quino linyl) methoxy)-4-
methyl-phenyl-N-carboxymethylglyzin) wurde 1980 von Roger Tsien (157) als neu-
artiger Fluoreszenzindikator für die Messungen der Calciumkonzentration ent-
worfen und synthetisiert.
Abbildung 9 Formeln von Quin 2 und Quin 2/AM
55______________________________________________________________________________
56 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
Quin-2 (C26-
H27
N3O
10) ist eine hydrophile Substanz mit Molekulargewicht von 541,52
Dalton. Der Tetracarboxylesther (C38
H43
N3O
18), auch Quin-2/AM genannt, weist
eine ausgeprägte Lipophilie und Molekulargewicht von 829,8 Dalton auf. Quin-2
ist ein Prekursor der großen Familie der Fluoreszenzindikatoren, die direkte Mes-
sung der intrazellulären Ionenkonzentration in vivo ermöglichen, ohne daß irgend-
welche mechanische Manipulationen an den Zellen vorgenommen werden müß-
ten und somit die Messungen an intakten und in ihrer Funktion nur gering alte-
rierten Systemen erlauben. Quin-2 ist, dank seiner strukturellen Eigenschaften
in der Lage eine Komplexverbindung mit einem Calciumkation zu bilden. Eine
Komplexverbindung (158) besteht aus einem zentralen Metallkation, an das eine
oder mehrere Anionen oder Moleküle, die als Liganden bezeichnet werden, ge-
bunden sind. Als Beispiel derartiger Verbindung ist EDTA (Ethylen-
diamintetraessigsäure), der mit dem zentralen Calciumkation insgesamt sechs
Koordinationsbindungen ausbildet, zu erwähnen. Die Komplexverbindungen, die
mehr als eine Bindung mit dem Metallkation bilden, werden als Chelate bezeich-
net und zeigen höhere Stabilität als die Komplexverbindungen, die nur eine Bin-
dung mit dem Kation einhergehen.
Quin-2 ist ein in der Stöchiometrie 1:1 Calciumkationen bindendes Chelat.
Strukturell weist diese tetrakarboxyle Säure gewisse Ähnlichkeiten mit EGTA
(Ethylenglykol-bis-(b-aminoethylether)-N,N,N�,N�-tetraessigsäure) auf, da der Ent-
wurf des Quin-2-Moleküls auf dem der EGTA basierte. Ähnlich wie EGTA hat Quin-
2 (121) ausgeprägte Calcium-Magnesium Selektivität von 104:1, die weitgehend
pH-unabhängig ist. Die Dissoziationskonstante Kd beträgt (bei 37°C, pH=7,05 und
im ionischen Milieu, das dem intrazellulären im Bezug auf die Ionenstärke und -
Konzentration nachempfunden ist) 115 mM. Jeder der Stickstoffatomen der insge-
samt drei imidodiazetischen Gruppen dient als eine Koordinationsstelle, die mit
dem zentralen Calciumkation eine Koordinationsbindung ausbildet. Die Stickstoff-
atome besitzen jeweils ein Elektronenpaar, das nicht an den Bindungen des Quin-
2-Moleküls beteiligt ist und dem Calciumkation zur Bildung einer Koordinationsbind-
ung zur Verfügung gestellt werden kann. Da die Stickstoffatomen sehr stark
deprotoniert sind (die höchste pKa um 6,5) müssen die Protonenpaare zur Bildung
einer Koordinationsbindung nicht displaziert werden, was entscheidend die
Geschwindigkeit der Bindung von Calciumkationen an Quin-2 und der Dissoziati-
on des Komplexes beschleunigt. Die Messungen der Bindungsgeschwindigkeit
zeigten t1/2
von 1 msec und Dissoziations-t1/2
von 10 msec. Die Verschiebung des
Elektronenpaares der Stickstoffatome ist direkt für die Änderung der spektralen
Eigenschaften des Komplexes Quin-2/Ca2+ im Vergleich zu freiem Anion Quin-2
verantwortlich.
2.1.2 Physikalische Eigenschaften von Quin-2
Die Fluoreszenz bezeichnet die Eigenschaft mancher Substanzen bei Be-
strahlung mit kurzwelligen oder ultravioletten Licht die Photonen zu emittieren. Die
Moleküle der Substanz absorbieren die Energie des einfallenden Photons nur wenn
diese Energie der Energiedifferenz der zwei erlaubten angeregten Zuständen ei-
nes Elektrons im Bereich der Atomhülle entspricht. Die absorbierte Photonen-
energie erlaubt einem Elektron ein Übergang von einem niedrig- (Grundzustand)
zu einem höherenergetischem angeregten Zustand. Auf diese Weise absorbierte
Energie wird aufgrund der Vibration und Rotation der Moleküle sowie durch Kolli-
sionen mit anderen Molekülen als Wärme abgegeben und das Elektron kehrt zu
seinem primären niedrig energetischem Grundzustand zurück. Dieser Prozeß nimmt
nur sehr kurze Zeit in Anspruch (ca. 10-12 sec.). Wenn aber die Energieabgabe
nach der Anregung aufgrund der strukturellen Eigenschaften der Moleküle lang-
samer verläuft, kann die absorbierte Energie nicht nur in der oben beschriebenen
Weise aber auch als Emission eines Photons (als charakteristische Spektrallinie)
abgegeben werden. Die charakteristische Energie der emittierten Photonen ist
aufgrund der Energieabgabe durch die Elektronen im angeregten Zustand auf
mechanische Weise deutlich niedriger als die der absorbierten Photonen und ver-
ständlich die Wellenlänge größer.
Die Eigenschaften der fluoreszendierenden Substanzen (159) werden durch
die Begriffe des Emissions-, Absorptionsspektums mit ihren Emissions- und Ab-
sorptionsmaxima sowie quantum yield Qf näher charakterisiert. Das Emissions-
spektrum ist die Wellenlänge-abhängige Variabilität der Fluoreszenzintensität, wenn
die Substanz mit Photonen einer fixen Wellenlänge bestrahlt wird.
Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration 57______________________________________________________________________________
Das Absorptionsspektrum beschreibt diese Variabilität gemessen für eine be-
stimmte und fixe Wellenlänge, wenn die Substanz der Strahlung mit unterschied-
lichen Wellenlänge ausgesetzt ist. Das Emissionsmaximum bezeichnet die Wel-
lenlänge in dem Emissionsspektrum bei der die Fluoreszenzintensität am höch-
sten ist. Das Absorptionsmaximum ist die Wellenlänge, bei der im Absorptions-
spektrum die höchste Fluoreszenzintensität gemessen wird. Qf gibt den Anteil
der Moleküle der Substanz, die nach der Absorption der Energie des Photons
diese als Fluoreszenz abgeben, wieder.
58 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
Abbildung 10 Absorptions- und Emissionsspektra von Quin 2 bei unterschiedlichen Calcium-
konzentrationen ( bei 120 mM K+, 20 mM Na+, 1 mM Mg+ und pH=7,05). Aus:Tsien R. Y., Pozzan
T., Rink T. J. (1982) �Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored
with a new intracellulary trapped fluorescence indikator.�, J. Cell. Biol., (94), 325-334.
Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration 59______________________________________________________________________________
Durch die Bindung des Calciumkations ändert sich das Emissionsmaximum von
Quin-2 nicht. Der Komplex Quin-2/Ca2+ hat Absorptionsmaximum von 339 nm und
Emissionsmaximum liegt bei 490-500 nm. Aufgrund der Komplexbildung Quin-2/
Ca2+ steigt die Intensität der Fluoreszenz um den Faktor von ca. 6,2.
2.1.3 Prinzip der spektrofluometrischen Messungen mit Quin-2
Die Messung der Calciumkonzentration mit Quin-2 (160) wird mit Hilfe von
einem Spektrofluorometer durchgeführt. Diese Geräte verfügen über eine Licht-
quelle, Filter und Monochromatoren, eine Vorrichtung für die zu messende Probe
und ein Photodetektor. Da die technischen Einzelheiten der verschieden Geräte-
typen variieren, beziehen sich die Ausführungen in diesem Absatz auf das
Spektrofluorometer CA-261 der Firma Jasco, mit dem die Messungen in der vor-
liegenden Arbeit durchgeführt worden sind.
Als die Lichtquelle dient eine 150W Xenonlampe (1), die Photonen des
breiten Spektrums mit hoher Helligkeit emitiert. Diese werden durch einen
eliptischen Spiegel (2) in einem planen Eingangsschlitz des Anregungs-
monochromators (3) fokussiert. Nach dem Verlassen des optischen Zerstreuers
(4) wird der Strahl mit durchgehendem Spektrum durch das optische Gitter (6)
gespalten und nach der Fokussierung durch einen Absorptionsmonochromator
durch die geometrische Anordnung des Ausgangschlitzes (7) kann ein mono-
chromatischer Strahl der vorgewählten Wellenlänge erzeugt werden. Der Strahl
wird im Zentrum der Küvette (11) mit der zu messenden Probe durch einen fla-
chen (9) und einen toroidalen Spiegel (10) fokussiert. Die Fluoreszenzstrahlung
der Probe, d.h. Emissionsphotonen, wird mit einem toroidalen und flachen Spie-
gel (12, 13) auf den planen Eigangschlitz des Emissionsmonochromators (13)
fokussiert. Dieser entspricht in dem Aufbau dem Anregungsmonochromator. Der
monochromatische Lichtstrahl tritt nach dem Verlassen des Monochromators nach
der Fokussierung durch einen flachen Spiegel (14) über einen Eingangsschlitz
(15) in einen Photomultiplier (16), der als Photodetektor dient und wo die einzel-
nen Photonen in die elektrischen Impulse umgewandelt und um Faktor 1∗106-108
verstärkt werden. Die Amplitude des Impulses wird als F bezeichnet und in
relativen Einheiten ausgedruckt. Die in der Küvette untergebrachte Probe wird
dem Licht mit Wellenlänge von 339 nm (Spektrumbreite 5-10 nm) ausgesetzt. Die
Photonen des entstehenden Emissionspektrums werden auf das Emissions-
maximum von 495-500 nm monochromatisiert und nach der Umwandlung in die
elektrischen Impulse im Photomultiplier wird die gemessene Amplitude des Si-
gnals F, die zu der Intensität der Fluoreszenz direkt proportional ist, nach der
Mikroprozessor-gestützten Umrechnung direkt als [Ca2+] angegeben.
Da der Anteil mit Calciumkationen gebundener Quin-2-Moleküle mit der Funktion:
: [Ca2+]=Kd ∗ ([Ca2+-Quin-2]/[Quin-2]) (Formel I) (159)
dargestellt werden kann und aufgrund der direkt proportionalen Abhängigkeit der
Intensität der Fluoreszenz des Komplexes Ca2+-Quin-2 (F) von der absoluten [Ca2+],
geben die Veränderungen der Fluoreszenzintensität die Änderungen der Calcium-
konzentration wieder. Diese kann aus der Gleichung:
[Ca2+]=Kd ∗ (F-F
min)/(F
max-F) (Formel II) (159)
Abbildung 11 Schema eines Spektrofluorometers. Aus: Bashford C.L. und Harris D.A. (Ed.)
�Spectrophotometry and spectrofluorimetry-a practical approach, Oxford, Washington D.C., IRL
Press, 1987
60 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
errechnet werden. Fmin
ist die minimale Fluoreszenzintensität, die nach der Ver-
drängung aller Calciumkationen aus ihren Bindungen mit Quin-2 gemessen wird.
Die Verdrängung kann durch die Bindung mit einem Chelaten, der höhere Affinität
als Quin-2 zu Calciumkationen aufweist, wie EGTA mit Kd im Bereich der nM,
durchgeführt werden. Fmax
ist die bei der Sättigung aller Quin-2-Moleküle mit
Calciumkationen gemessene maximale Fluoreszenzintensität. Diese kann durch
die Zugabe der Calciumkationen, deren Konzentration um einige 10-Potenzen höher
als die Quin-2-Konzentration ist, herbeigeführt werden. Kd bezeichnet die effektive
Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+.
In Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bestimmung des Anregungs-
und Emissionsspektrums für Quin-2-Anion, Quin-2/AM, Quin-2/Ca2+, Dissoziations-
konstante des Komplexes Quin-2/Ca2+ und Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität
des Komplexes Quin-2/Ca2+ von der Calciumkonzentration durchgeführt. Die Er-
gebnisse sind im Kapitel 3 dargestellt.
2.1.4 Kalibrieren der Calciumkonzentration bei den Messungen mit lebenden
Zellen
Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfordert den Trans-
fer der Quin-2-Moleküle in die Zellen (161). Da die Zellmembran für das hydrophi-
le Quin-2 Molekül undurchgängig ist, müssen die Zellen einem Azetoxymethylester
von Quin-2 (Quin-2/AM) ausgesetzt werden. Quin-2/AM bindet mit Calciumionen
keinerlei Verbindungen. Quin-2/AM wird üblicherweise mit DMSO (Dimethylsulfoxid)
vermengt, um die bessere Löslichkeit dieser hydrophoben und lipophilen Sub-
stanz in hydrophilen Lösungen zu erreichen. Diese Lösung wird der Zellsuspension
oder in die Kulturflaschen der adhärent wachsenden Zellen zugesetzt. Quin-2/AM
passiert unbehindert die Zellmembran und wird von unspezifischen cytoplasma-
tischen Esterasen zum Quin-2-Anion konvertiert. Dies geschieht durch die schritt-
weise verlaufende Hydrolyse der Esterbindungen aller vier Acetoxymethylgruppen
des Quin-2/AM. Die Konversion des Quin-2/AM zu Quin-2 resultiert in der Ver-
schiebung des Maximums des Emissionsspektrums von ca. 430 zu 490-500 nm,
Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration 61______________________________________________________________________________
was jedoch die komplette Hydrolyse aller vier Estergruppen voraussetzt. Nach der
Konversion kann das hydrophile Quin-2-Anion die Zelle nicht verlassen und wird
auf diese Weise passiv intrazellulär angereicht. Die zugesetzten Konzentrationen
von Quin-2/AM zwischen 1 bis 100 µM zeigen für die Messungen zufriedenstellen-
de Intensität der Fluoreszenz nach dem Abschluß des Ladevorgangs. Dabei ge-
messene intrazelluläre Quin-2 Konzentration betragen 0,1-5 mM. Die intrazellulä-
ren Organellen bis auf Zellkern scheinen Quin-2 überhaupt nicht selektiv anzurei-
chern und aufgenommene Menge verteilt sich gleichmäßig intracytoplasmatisch.
Das inkorporierte Quin-2 zeigt eine Zellart-abhängige Zytotoxizität, die am ehe-
sten als durch die Hydrolyseprodukte von Quin-2/AM verursacht aufzufassen ist.
Bei der Hydrolyse entstehen acht Protonen, vier Azetylreste und vier Formaldehyd-
moleküle. Der Formaldehyd beeinträchtigt in höherer Konzentration viele wichtige
metabolische Vorgänge, so kann es zum Beispiel die intrazelluläre ATP-Konzen-
tration mindern, die Laktatproduktion erhöhen, die Glykolyse inhibieren etc. Dar-
auf beruht die Wichtigkeit der Bestimmung der Konzentration-abhängigen Quin-
2/AM-Zytotoxizität, um bei geringsten negativen Einflüssen auf die untersuchten
Zellen die noch optimale Fluoreszenzintensität erreichen zu können. Die Anrei-
cherung von Quin-2 ist an der Vitalität der Zellen angekoppelt, da die stark alte-
rierten bzw. sterbende Zellen ein Austritt von Quin-2 aus der Zelle ermöglichen
(�dye leaking�). Das Ausmaß der Anreicherung ist von der angebotenen
extrazellulären [Quin-2/AM]e Konzentration, dem Dauer des Ladevorganges und
Temperatur-abhängig. Da die verschiedenen Zellpopulationen, abhängig von ih-
rem Gehalt an unspezifischen Esterasen, mit unterschiedlichen Geschwindigkei-
ten die Konversion von Quin-2/AM zum Quin-2-Anion zeigen, soll ein zeitliches
Optimum für jede neu untersuchte Zellpopulation ermittelt werden. Die durch-
schnittliche Dauer des Ladevorganges beträgt bei 37°C zwischen 45 bis 60 Mi-
nuten. Der Ladevorgang verläuft bei der Temperatur von 37°C unter den für die
geladenen humanen Zellpopulationen optimalen physiologischen Bedinungen.
Bei der Temperaturerhöhung oberhalb von 37°C neigt Quin-2/AM zur Aggregati-
on, die niedrigeren Temperaturen beeinträchtigen, durch das Alterieren der un-
spezifischen Esterasen, die Konversionsgeschwindigkeit und -rate sowie können
zur Anreicherung von Quin-2/AM in anderen zellulären Kompartimenten führen,
62 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
Quin-2 als Indikator für Calciumkonzentration 63______________________________________________________________________________
wo die Hydrolyse nicht vollgezogen werden kann.
Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgt nach unter
2.1.3 beschriebenen Prinzipien. Die Probe wird in einer Küvette mit einer Rühr-
und Thermostatvorrichtung untersucht. Dies gewährleistet die optimale Tempera-
tur (üblicherweise 37°C) und verhindert weitgehend die physikalische Aggregati-
on der Zellen, die sonst den Signal empfindlich stören könnte. Die Anregung der
Fluoreszenz erfolgt mit monochromatischen 339 nm Photonen und die Intensität
der Fluoreszenz wird über den Photomultiplier für die Wellenlänge 495-500 nm
gemessen. Fmax
, entsprechend der vollständiger Sättigung der Quin-2-Moleküle
mit Calciumkationen, wird nach der Zugabe eines Detergentes gemessen. Da-
durch kann das bisher intrazelluläre Quin-2 mit Überschuß an Calciumionen aus
dem extrazellulären Medium reagieren. Fmin
wird nach der Zugabe eines Chelators
gemessen, der alle Calciumkationen aus dem Ca2+/Quin-2-Komplex verdrängt und
auf diese Weise die für Quin-2 erreichbare Calciumkonzentration gegen Null zu-
rückführt. Üblicherweise wird EGTA verwendet, da es höhere Affinität für die
Calciumkationen als Quin-2 selbst aufweist. Die Berechnung der [Ca2+] wird mit Kd
von 115 nm vorgenommen. Die effektive Dissoziationskonstante Kd ist von der
Temperatur, Ionenstärke, Konzentration der Magnesiumkationen und pH-Wertes,
wenn dieser unter 6.5-6,8 fällt (da die höchste pKa des Quin-2 ca. 6,5 beträgt),
abhängig. Die Einflüße seitens der Temperaturänderungen können durch das Tem-
perieren der Probe ausgeschaltet werden. In humanen Zellen sind die Ionen-
stärke und totale Konzentration der monovalenten Kationen relativ konstant. Der
Einfluß der Magnesiumkonzentration auf die gemessene Fluoreszenzintensität
ist bei der Absorption mit 339 nm Wellenlänge gering. Durch die Dispersion der
Zellen in Pufferlösungen kann eine weitgehende pH-Stabilität erreicht werden,
zumindest aber ein pH-Wert über 6,8, zumal fast alle Säugetierenzellen ein intra-
zelluläres pH von 6,9-7,4 aufweisen. Diese Annahmen erlauben die Kd-Bestim-
mung in vitro in einem Medium, dessen Zusammensetzung die des Cytosols imi-
tiert. Auf diese Weise bestimmte Kd weist in Anwesenheit von 120 mM K+, 20 mM
Na+, 1 mM Mg2+, pH=7,05 und 37°C ein Wert von 115 nM auf. Diese Ergebnisse
konnten durch in vivo durchgeführte Bestimmungen bestätigt werden, so daß
viele Geräte, wie Jasco CA-261, nur diese Größe akzeptieren. Aufgrung der obi-
gen Ausführungen erscheint
die Annahme der intrazellulären Kd-Konstanz und des K
d-Wertes gerechtfertigt
und durch subtile Verschiebungen der oben genannten Parametern hervorgeru-
fene Änderungen der Kd zu vernachlässigen.
Aufgrund des Wertes für Dissoziationskonstante Kd ist die Sensitivität der
Calciumkonzentrationsmessung für die Werte, die um den Kd-Wert liegen, am größ-
ten. Da die Kd in den vitalen Zellen Wert um 115 nM aufweist, werden [Ca2+]
i der
nicht aktivierten Zellen, die dieser Größeordnung (100-200 nM) entsprechen, am
sensitivsten erfaßt. Die Erhöhung der Calciumkonzentration um eine Größeordnung
der Kd verursacht fast die vollständige Sättigung des Indikators mit Calciumkationen
und daher nur sehr geringe Sensitivität der Messung. Für die humanen Zellen
entspricht dieser Wert der [Ca2+]i von ca. 10-6 M und gleicht der intrazellulären
Calciumkonzentration der stimulierten Zellen.
In Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bestimmung der Effektivität
des Ladevorganges in Abhängigkeit von der extrazellulären Quin-2/AM, der Dau-
er des Vorgangs. Es folgte die Bestimmung des Einflusses der unterschiedlichen
extrazellulären Quin-2/AM-Konzentrationen auf die Vitalität und Funktion der un-
tersuchten Zellinien. Diese Ergebnisse sind ausführlich im Kapitel 3 dargestellt.
2.2 Zellkultur
Die Zellinien RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7, die das Objekt dieser Arbeit
sind, wurden freundlicherweise von Herrn Dr. Reuben P. Siraganian (Labor für
Klinische Immunologie ,National Institute of Dental Research, National Institutes
of Health, Bethesda, Maryland 20-892, USA) zur Verfügung gestellt. Die RBL-
2H3- bzw. RBL-2H3-m3.7- Zellen (weiter RBL-2H3 bzw. RBL-2H3-m3.7 genannt)
wurden in 175 cm² �Falcon� Zellkulturflaschen (Fa. Becton-Dickinson, Katalog-Nr.
3024) kultiviert. Die Subkultivation folgte der Methodik nach Siraganian et al. (162).
Zum Ablösen der Zellschicht von dem Boden der Flasche führte die Gabe von 10
ml Trypsin-EDTA (Fa. Gibco, Katalog-Nr. 043-053004 a 100 ml) mit anschließen-
der Inkubation über 5 Min. bei 37 °C mit 5%CO2 im Brutschrank. Durch das sanfte
Klopfen der Flasche wurden die Zellen von dem Boden vollständig abgelöst. Dar-
aufhin folgte die Zugabe von 10 ml Zellkulturmedium. Die Zellsuspension
64 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
wurde in 50 ml �Falcon� Röhrchen (Becton-Dickinson, Katalog-Nr. :2070) über-
führt. Das Zellkulturmedium wurde mit Minimum Essential Medium (Fa. Gibco
Katalog-Nr. : 041-01090M a 500 ml) unter Zugabe von 15% FCS (Fötales Kalb-
serum Fa. Gibco Katalog-Nr. : 01106290M, Charge-Nr. : 40669126, hitzeinaktiviert,
a 500 ml), 2 mM Glutamin (Fa. Gibco Katalog-Nr. : 043-050-30H, a 100 ml) 1%
Antibiotikum (Penicillin 5000 IE /ml, Streptomycin 5000 µg/ml, Fa. Flow Katalog-
Nr. : 16700-49, a 100 ml) und 100 Mm HEPES (Fa. Serva Katalog-Nr. : 47260,
1M/l, a 50 ml) hergestellt. Darauf folgender Waschvorgang bestand aus: 1. 5 Min.
Zentrifugieren bei 300∗g (1000 U.p.m. in Labo-Fuge 1, Modell 1620, Fa. Heraeus,
Deutschland) 2. Dekantieren des Überstandes und 3. Auflösen der Zellpellets in
20 ml Zellkulturmedium. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt und so
gewaschene Zellen konnten in 30 ml Medium überführt und alliquot (a 10 ml) auf
drei 175 cm² �Falcon� Zellkulturflaschen verteilt werden. Abschließend folgte das
Auffüllen der Flaschen mit Medium auf das Endvolumen von 25 ml mit initialer
Zellmenge von ca. 5∗106 Zellen pro Flasche. Die Flaschen lagerten bei 37 °C und
5% CO2 im Brutschrank. Die Subkultiverung wurde nach 48 bis 72 Stunden ab-
hängig von der mikroskopisch festgestellten Zelldichte (Invertoskope Id 03 MT,
Carl Zeiss, Deutschland) wiederholt. Die durchschnittliche Zellmenge betrug nach
48 bis 72 Stunden ca. 30∗106 Zellen pro 175 cm² �Falcon�- Zellkulturflasche.
2.3 Zellstimulation
Die für die Stimulationsversuche bestimmten Zellen wurden wie unter 2.1
beschrieben vom Boden der Zellkulturflaschen abgelöst, unter Zugabe von 5 ml
des Zellkulturmediums in 15 ml �Falcon�-Rörchen (Fa. Becton-Dickinson, Kata-
log-Nr. : 2097) überführt und nachfolgend bei 300∗g zentrifugiert. Nach dem De-
kantieren des Überstandes und Ersetzen dieses durch 10 ml des Zellkulturmediums
folgte das Zentrifugieren bei 300∗g. Dieser Prozedere wurde insgesamt zweimalig
durchgeführt. Die gewaschenen Zellen konnten nachfolgend in der Neubauer-Zähl-
kammer gezählt werden. Durch Zugabe von Kulturmedium erfolgte die Einstellung
der Zellzahl auf 0,5∗106 / ml. Insgesamt 2,5 ∗106 Zellen mit zusätzlich 5 ml Kultur-
medium wurden in eine 75 cm² Zellkulturflasche (Fa. Becton-Dickinson, Katalog-
Zellstimulation 65______________________________________________________________________________
66 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
-Nr. : 3024) gegeben und über ca. 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brut-
schrank inkubiert. Da die Stimulationsversuche zum Ermitteln der Serotonin-
freisetzung und des Calciumeinstroms nicht an den gleichen Zellproben durchge-
führt werden konnten (Radioaktivität der Proben für die Serotoninfreisetzung mit
Konsequenz der Kontamination), mußte nach diesem Arbeitsschritt die getrennte
Inkubation vor den nachfolgenden Stimulationsversuchen unternommen werden.
Die Zellen der Zellinie RBL-2H3 wurden mit monoklonalem anti-DNP-IgE
(anti-2,4-dinitro-phenyl-IgE aus dem Mausaszites) (163) in der Suspension vom
Kulturmedium in den 75 cm² Kulturflaschen über 120 Min. inkubiert. Die Verdün-
nung von anti-DNP-IgE betrug in der Kulturflasche 1:10000). Nach dem
Abpippetieren des Mediums, um das überschüssiges, nicht an FcεRI gebundenes
anti-DNP-IgE entfernen zu können, wurden die 75 cm² Zellkulturflaschen entspre-
chend den vorgesehenen Stimulationsversuchenreihen (Messung der Serotonin-
freisetzung in An- und Abwesenheit von mAb AA4, Messung des Calciumeinstroms
in An- und Abwesenheit von mAb AA4) beschichtet. Die Konzentration von mAb
AA4, die bei der den eigentlichen Stimulationsversuchen vorausgehenden Inku-
bation verwendet wurde, wurde den Arbeiten von Stephan et al. (164) entnom-
men.
Für die Serotoninfreisetzungmessungen bestimmten 75 cm²-Zellkultur-
flaschen wurden in zwei Versuchsreihen aufgeteilt: 1. in Abwesenheit von mAb
AA4 2. in Anwesenheit von mAb AA4 (Inkubation mit 60 µg/ml von mAb AA4). Bei
den 75 cm²-Zellkulturflaschen der beiden Versuchsreihen folgte die Beschichtung
mit Zellkulturmedium in Volumen von 10 ml pro Flasche unter Zugabe von 1 µl
anti-DNP-IgE und 5 µl von 5-Hydroxy [³H]Tryptaminkreatininsulphat (Fa. Amersham
Katalog -Nr.: TRK233, 1mCi/ml, Aktivität in 75 cm²-Zellkulturflasche 5nCi). An die-
sem Arbeitsschritt schloß sich die 16 stündliche Inkubation bei 37°C und 5% CO2
im Brutschrank an.
Für die Calciumeinstrommessung vorgesehene 75 cm²-Zellkulturflaschen
wurden ebenso in zwei Versuchsreihen aufgeteilt (mit und ohne Inkubation mit
mAb AA4). Die Zellen inkubierten ohne Zugabe von 5-Hydroxy [³H] Tryptamin-
kreatininsulphat, die Menge an mAb AA4 betrug für die entsprechende Versuchs-
reihe 60 µg/ml.
Zellstimulation 67______________________________________________________________________________
Die Zellen der Zellinie RBL-2H3-m3.7 unterlagen außer der Zugabe von
anti-DNP-IgE, da sie mit Carbachol via m3-AChR stimuliert wurden, den gleichen
Arbeitschritten bei den Stimulationsversuchen vorausgehender Inkubation wie
bereits für die Zellinie RBL-2H3 beschrieben. Sie wurden auch anschließend über
16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert.
2.3.1 Messung der Serotoninfreisetzung
Die Bestimmung der Serotoninfreisetzung basierte im wesentlichen auf der
erstmalig von Otsuki et al. beschriebenen Methodik (165) modifiziert nach Taurog
et al. (166). In der Inkubationsphase (Kap. 2.3) angebotenes 5-Hydroxy (³H)-
Tryptaminkreatininsulphat wird von den Zellen inkorporiert und zur Synthese von
Serotonin (5-Hydroxy-(³H)tryptamin) verwendet. Durch die Stimulation der RBL-
2H3-Zellen, mit einem bestimmten Antigen (hier an Humanalbumin gekoppelte 35
Moleküle von 2,4-Dinitrophenyl), die vorher mit einem gegen diesem Antigen ge-
richteten spezifischen monoklonalen Antikörper (anti-DNP-IgE) inkubiert wurden,
kommt es über durch das Antigen verursachtes Bridging an den FcεRI gebunde-
nen IgE Moleküle zur nachfolgenden Degranulation und extrazellulären Freiset-
zung von mit ³H radioaktiv markiertem Serotonin. Die Zellen der Sublinie m3.7
wurden mit Carbachol stimuliert. Durch Bindung dessen an den m3-AChR kommt
es über G -Protein zur Degranulation und zur extrazellulären Freisetzung von 5-
Hydroxy(³H)tryptamin. Nach dem Zentrifugieren kann die im Überstand befindli-
che Menge an 5-Hydroxy(³H)tryptamin, die der Menge des von den Zellen freige-
setzten Serotonins entspricht, mit Hilfe von einem Szintillationszähler ermittelt
werden. Die Gesamtmenge des in den Zellen befindlichen 5-Hydroxy-(³H)tryptamins
kann durch die vollständige Zellyse mit Perchlorsäure bestimmt werden. Die
Serotoninfreisetzung wird als freigesetztes 5-Hydroxytryptamin in Prozent der Ge-
samtmenge angegeben.
Nach der unter 2.3 beschriebenen Inkubation der Zellen der Zellinien RBL-
2H3 und RBL-2H3-3M folgte im nächsten Arbeitsschritt die Ablösung der Zellen
vom Boden der Kulturflaschen und zweimaliges Waschen unter Zugabe von 10 ml
Zellkulturmedium (37°C, 300∗g, 5 Min.). Nach der Umsetzung der Zellpellets in
die 50 ml �Falcon�-Röhrchen und Zugabe von 35 ml des Zellkulturmediums
verbrachten die Proben 120 Min. in einem Hybridisationsofen bei 37°C und einge-
schaltetem Rotor. Für die Serotoninfreisetzungmessung bestimmten Zellpopula-
tionen unterlagen nach diesem Arbeitsschritt unter 2.3.2 beschriebenen Lade-
verfahren mit Quin-2. Nach dem Abschluß des Ladevorganges folgte nach dem
letzten Waschen der Zellen, um das von den Zellen nicht inkorporiertes 5-Hydroxy-
Tryptaminkreatininsulphat zu entfernen, das Resuspendieren in 5 ml PBS-Puffer
0,1% BSA (PBS-Puffer: 150 Mm NaCl, 3,7 mM KCl, 3,0 mM Na2HPO
4, 3,5 mM
KH2PO
4, 1 mM CaCl
2, 0,5 mM MgCl
2 in 1000 ml H
2O (in Mili-Q gereinigt, Milipore
Corporation) pH 7,4 mit Zusatz von 0,1 % BSA (Rinderserumalbumin-�bovine
albumin initial fractionation by cold precipitation� der Fa. Sigma Chemicals Kat.
Nr.: A-7638).
Für die Zellen der Zellinie RBL-2H3 wurden insgesamt vier Versuchsreihen
in 6ml �Poly-Q-Vials�-Röhrchen (Fa. Beckmann, Katalog-Nr. : 592928) unter je-
weiliger Zugabe von 500 µl von der Zellsuspension vorbereitet: 1. Gesamtserotonin-
freisetzung mit 500 µl von 10% Perchlorsäure (Endkonzentration 5%) 2.
Spontanserotoninfreisetzung mit 500 µl von 0,1% BSA PBS-Puffer 3.
Serotoninfreisetzung bei der optimalen Stimulation mit DNP35
-HSA (35 Moleküle
von 2,4-Dinitrophenol konjugiert mit einer Moleküle von humanem Serumalbu-
min,Fa. Calbiochem, Kat. Nr.: 324101) in Konzentration von 100 ng/ml mit 500 µl
von DNP35
-HSAaq (Konzentration der Arbeitslösung 20 ng/ml) 4. Serotonin-
freisetzung bei der suboptimaler Stimulation mit DNP35
-HSA in Konzentration von
10 ng/ml mit 500µl von DNP35
-HSAaq (Konzentration der Arbeitslösung 200 ng/
ml). Die Konzentrationen von DNP35
-HSAaq für die optimale und suboptimale
Antigenstimulation wurden in den Vorversuchen ermittelt (s. Kap.3). Für die Mes-
sungen wurden die Zellen verwendet, die wie unter 2.3 beschrieben in An- und
Abwesenheit von mAb AA4 inkubiert wurden. Die so vorbereiteten Proben ver-
brachten nach dem Mischen des Rörcheninhaltes 30 Minuten im Wasserbad bei
37°C. Nach dem Zentrifugieren bei 1500 U.p.m. über 5 Min. wurden jeweils 200 µl
des Überstandes entnommen und zu 10 ml der Szintillationsflüssigkeit (�Ready
Safe� Liquid Scintillation Cocktail, Fa. Beckman, Katalog -Nr.: S203022) in einem
6 ml Counterrörchen zugegeben. Die Messung der β-Aktivität der Proben erfolgte
mit Hilfe von einem Szintillationszähler der Fa. Beckmann. Die Serotoninfreisetzung
68 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
der einzelnen Proben wurde aus dem Quotienten zwischen der in dem Supernatant
der Probe gemessenen Szintilationsrate (counts per minute) und der Szintillations-
rate der Probe, in der die Bestimmung der Gesamtmenge des radioaktiv markier-
ten Serotonins, das von den Zellen synthetisiert wurde, durch Lyse der Zellen
durch Perchlorsäure erfolgte, errechnet. Alle Werten für die Serotoninfreisetzung
wurden prozentuell angegeben.
Die Bestimmung der Serotoninfreisetzung für die Zellen der Zellinie RBL-
2H3-m3.7 folgte dem oben beschriebenen Prozedere. Es wurden vier Versuchs-
reihen in An- und Abwesenheit von mAb AA4. Die Stimulation der Zellen erfolgte
durch Inkubation mit Carbachol (Carbamylcholinchlorid, Fa. Sigma, Katalog Nr.:
C-4382) in Endkonzentrationen 3 µM und 1000 µM. Diese Konzentrationen wur-
den in Vorversuchen ermittelt (s. Kap.3). Die Proben für die Gesamt- und
Spontanserotoninfreisetzung wurden analog dem Verfahren für RBL-2H3-Zellen
vorbereitet. Die Auswertung entsprach dem oben aufgeführten Procedere.
2.3.2 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration
Für die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration vorgesehene
Zellproben wurden gleichzeitig mit den Zellproben für die Serotoninfreisetzung
präpariert. Wie unter 2.3.2 beschrieben wurden die Zellen der RBL-2H3 und RBL-
2H3-m3.7-Zellinie nach der Subkultivierung über 16 Stunden in 75 cm² �Falcon�-
Flaschen einer Präinkubation unter Zugabe von monoklonalen anti-DNP-IgE über
2 Stunden (nur die RBL-2H3-Zellen, die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden über glei-
chen Zeitraum mit Zellmedium inkubiert) unterzogen. Die Zellen wurden in zwei
Versuchsreihen für die Stimulationsversuche in An- und Abwesenheit von mAb
AA4 aufgeteilt. Die Konzentration von mAb AA4 war wie unter 2.3.angegeben. Es
folgte die weitere Inkubation über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brut-
schrank. Danach konnten die Zellen mit Trypsin-EDTA von Flaschenböden abge-
löst werden und nach zweimaligen Waschen mit dem Zellmedium, um
überschüßiges mAb AA4 zu entfernen, in 50ml �Falcon� Röhrchen unter Zugabe
von 35 ml des Zellkulturmediums überführt werden. Die so erstellten
Zellstimulation 69______________________________________________________________________________
70 2 Materialien und Methodik______________________________________________________________________________
Zellproben verblieben 120 Min. in einem Hybridisationsofen bei 37°C und
eigeschaltetem Rotor, um der Zellaggregation vorzubeugen. Nach dem darauffol-
genden Zentrifugieren bei 300∗g über 5 Min. wurde der Zellpellet in 10 ml des
Kulturmediums aufgelöst und unter Zugabe von 10 µl von 10mM Quin-2/AM Lö-
sung (in DMSO gelöst, Fa. Sigma Chemicals, Kat. Nr.: Q-4875, Endkonzentration
von Quin-2/AM 10 µM) in ein 10 ml �Falcon� Röhrchen überführt. Der Ladevor-
gang der Zellen mit Quin-2/AM wurde über 45 Min. in dem Hybridisationsofen,
unter Bedinungen wie angegeben, vollgezogen. Die angegebene Konzentration
von Quin-2/AM sowie die Dauer des Ladevorganges wurden in Rahmen der Vor-
versuche (s. Kapitel 3) für optimal für die Vitalität der Zellen gefunden. Nach dem
Abschluß des Ladevorganges wurden die Zellen zwei Mal mit PBS 0,1%-BSA
gewaschen, um verbleibenden von den Zellen nicht aufgenommenen Anteil an
Quin-2/AM zu eliminieren, und anschließend die Zellpellets nach der Einstellung
der Zellzahl auf 1∗106/ml in 10ml PBS 0,1% BSA resuspendiert.
Die Zellproben von 2 ml Volumen verblieben zunächst 3 Min. in der 4 ml
Quarzküvette des Spektrofluorometers (Jasco FP-777, Jasco, Grobzimmern,
Deutschland). Die Zellsuspension wurde unter ständigem Mischen mit einem ma-
gnetischen Rührfisch auf 37°C temperiert. Die Zellproben, die momentan für die
Messungen nicht gebraucht worden sind, verblieben weiterhin im Hybridisations-
ofen. Direkt vor der Messung wurden sie zentrifugiert und in frisches Medium über-
führt, um die extrazelluläre Quin-2-Fraktion zu eliminieren.
Die Stimulation der mit anti-DNP-IgE vorinkubierten RBL-2H3-Zellen er-
folgte durch Zugabe von DNP35
HSA in zwei Konzentrationen: 10ng/ml der
Zellsuspension (suboptimale Stimulation) und 100ng/ml der Zellsuspension (op-
timale Stimulation). Die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden mit Carbachol in
suboptimaler und optimaler Konzentration (3 µM resp. 1 mM) stimuliert. Alle an-
gegebene Konzentrationen beziehen sich auf die Endkonzentration in der Küvette.
Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration folgte der von R.
Tsien etablierten Methodik (167). Die Emissions- und Absorptionswellenlänge be-
trugen 339 nm resp. 492 nm mit Schränkenbreite von jeweils 5-10 nm. Die Inten-
sität der Fluoreszenz wurde alle 2 Sekunden gemessen. In typischem Experiment
folgte in 10-15 s nach der Antigenzugabe der langsame Anstieg der Calcium-
Zellstimulation 71______________________________________________________________________________
-konzentration bis zum Erreichen der Plateauphase, gefolgt von langsamem Ab-
fall bis zur Ausgangkonzentration. Nach der Zugabe von 80 µl Tris -EGTA
(Endkonzentrationen: TRIS 40 mM, EGTA 10 mM), das eine größere Bindungs-
konstante für Calciumkation als Quin-2 besitzt, konnte die minimale Intensität der
Fluoreszenz (Fmin
) gemessen werden. Die maximale Intensität der Fluoreszenz
(Fmax
) der Probe wurde nach der Beendigung jedes Experiments über die Lyse der
Zellen mit einem nichtionischen Detergent Triton X-100 (10 µl, Endkonzentration
in der Küvette 0,05%) gemessen. Auf diese Weise konnte die vollständige Satu-
ration von Quin-2 mit Calciumkationen erreicht werden. Der verwendete
Spektrofluorometer verfügt über einen Mikroprozessor, der automatisch über ei-
nen EDV-gestützten Algorithmus die alle 2 sec. während des Versuches gemes-
sene Fluoreszenzintensität in die Calciumkonzentration umrechnen kann. Da das
gemessene Fluoreszenzsignal zum Teil nicht unerhebliche Oszillationen aufweist,
die auf die Zellaggeregaten zurückzuführen sind, wurden die Werte für die Calcium-
konzentration der unstimmulierten Zellen und für die maximale Calcium-
konzentration nach der Antigenstimulation als Mittelwerte der allen in der Aus-
gangs- und Plateauphase alle 2 sec. ermittelten Calciumkonzentrationen ange-
geben.
72______________________________________________________________________________
3 Ergebnisse
3.1 Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2
Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2/AM, Quin-2 und des
Komplexes Quin-2/Ca2+ diente der Prüfung der Übereinstimmung dieser mit den
Parametern der Literaturangaben und somit der Qualitätskontrolle des verwende-
ten experimentellen Set-up`s. Die Anregungs- und Emissionsspektra wurden nach
der Auflösung des untersuchten Quin-2 Derivates in den Puffern, die keine zellulären
Bestandteile enthielten, vorgenommen. Die Anregungs- und Emissionsspektra für
Quin-2/AM wurden in 100 mM KCl bei 22°C gemessen. Die Anregungs- und
Emissionsspektra für Quin-2 wurden in PBS-Puffer mit 2 mM K2H
2EGTA bei 22°C
gemessen. Die Zugabe von 2 mM K2H
2EGTA sollte die nicht auszuschließende
Kontamination mit Calciumkationen eliminieren. Die Hydrolyse des Tetraacetylesters
des Quin-2 (Quin-2/AM) und somit Übergang in freie Form (Quin-2) erfolgte durch
Zugabe von NaOH. Die Anregungs- und Emissionsspektra für Quin-2/Ca2+ wur-
den in Puffer mit 130 mM KCl, 10 mM MOPS, 1 mM EGTA, 2 mM CaCl2 bei
pH=7,2 (mit KOH bei 20°C eingestellt) und 37°C gemessen. Die Endkonzentration
der Calciumkationen betrug 1 mM. Die Anregungs- und Emissionsspektra wurden
separat für Quin-2/AM, Quin-2 und das Komplex Quin-2/Ca2+ bei kontinuierlichem
Rühren mit einem magnetischen Rührer durchgeführt. Die Ergebnisse der Be-
stimmung der spektralen Eigenschaften der untersuchten Verbindungen werden
in Form der Absorptions- und Emissionsspektra in den folgenden Kapiteln 3.1.1-
3.1.3 graphisch als Originaldaten dargestellt.
3.1.1 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/AM
73______________________________________________________________________________
Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2/AM,erbrachte die Er-
gebnisse, die mit Literaturangaben übereinstimmen. Das Absorptionsmaximum
und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2/AM bei λex= 339 nm und λ
em= 430
nm. Die in der Literatur angegebene Maxima für Quin-2/AM, sind λex
= 339 nm und
λem
= 430 nm.
Abbildung 12 Absorptionsspektrum von Quin 2/ AM. 20 µM Quin-2/AM in 100 mM KCl bei 22°C.
Spektrum der Wellenlänge der Anregungsphotonen 300-400 nm. Das Absorptionsmaximum bei
gemessener Emission von 500 nm lag bei 339 nm.
Abbildung 13 Emissionsspektrum von Quin 2/ AM. 20 µM Quin-2/AM in 100 mM KCl bei 22°C.
Spektrum der Wellenlänge der gemessenen emitierten Photonen 425-510 nm. Das
Emissionssmaximum bei gemessener Absorption von 340 nm lag bei 430 nm.
74 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Wellenlänge (nm)
Flu
ore
sze
nzin
tensitä
t
Absorptionsmaximum=339 nm
320 340 360 380 400
450 500
Emissionsmaximum=430 nm
Wellenlänge (nm)
Flu
ore
szenzin
tensität
3.1.2 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2
Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2, erbrachte die Ergeb-
nisse, die mit Literaturangaben weitgehend übereinstimmen. Das Absorptions-
maximum und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2 bei λex= 364 nm und λ
em=
502 nm. Die in der Literatur angegebene Maxima für Quin-2 sind λex= 352 nm und
λem
= 492 nm. Die leichte Verschiebung der beiden Maxima erklärt sich am ehe-
sten dadurch, daß die maximalen Wellenlängen der Anregung und Emission in
Spektren sich über einige Nanometer erstrecken und keinen eindeutig zu erken-
nenden Peak-Wert besitzen.
Abbildung 14 Absorptionsspektrum von Quin 2. Messung in PBS-Puffer mit 2 mM K2H
2EGTA bei
22°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH. Spektrum der Wellenlänge der An-
regungsphotonen 300-400 nm. Das Absorptionsmaximum bei gemessener Emission von 500 nm
lag bei 364 nm.
Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2 75______________________________________________________________________________
Absorptionsmaximum=364 nm
400380360340320
Wellenlänge (nm)
Flu
ore
szenzin
tensität
Abbildung 15 Emissionsspektrum von Quin 2. Messung in PBS-Puffer mit 2 mM K2H
2EGTA bei
22°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH. Spektrum der Wellenlänge der ge-
messenen emitierten Photonen 400-600 nm. Das Emissionssmaximum bei gemessener Absorp-
tion von 350 nm lag bei 502 nm.
3.1.3 Anregungs- und Emissionsspektrum von Quin-2/Ca2+
Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften des Komplexes Quin-2/Ca2+, er-
brachte die Ergebnisse, die mit Literaturangaben weitgehend übereinstimmen. Das
Absorptionsmaximum und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2/Ca2+ bei λex
=
331 nm und λem
= 501 nm. Die in der Literatur angegebene Maxima für Quin-2/
Ca2+, sind λex
= 332 nm und λem
= 492 nm. Die leichte Verschiebung der beiden
Maxima erklärt sich am ehesten dadurch, daß die maximalen Wellenlängen der
Anregung und Emission in Spektren sich über einige Nanometer erstrecken und
keinen eindeutig zu erkennenden Peak-Wert besitzen.
76 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Flu
ore
szenzin
tensität
450 500 550 600
Emissionsmaximum=502 nm
Wellenlänge (nm)
Abbildung 16 Absorptionsspektrum von Quin 2/Ca2+. Messung in 130 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1
mM EGTA,10 mM MOPS pH=7,2 bei 37°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH.
Spektrum der Wellenlänge der Anregungsphotonen 300-450 nm. Das Absorptionsmaximum bei
gemessener Emission von 500 nm lag bei 331 nm.
Abbildung 17 Emissionsspektrum von Quin 2/Ca2+. Messung in 130 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM
EGTA,10 mM MOPS pH=7,2 bei 37°C nach der Hydrolyse von 20 µM Quin-2/AM mit NaOH.
Spektrum der Wellenlänge der gemessenen emitierten Photonen 400-600 nm. Das Absorptions-
maximum bei gemessener Absorption von 330 nm lag bei 501 nm.
Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2 77______________________________________________________________________________
Flu
ore
szenzin
tensität
350 400 450
Wellenlänge (nm)
Absorptionsmaximum=331 nm
Flu
ore
szenzin
ten
sität
500 550 600
Wellenlänge (nm)
Emissionsmaximum=501 nm
3.2 Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+
Die Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+
diente der Prüfung der Übereinstimmung dieser mit den Literaturangaben und
somit der Qualitätskontrolle des verwendeten experimentellen Set-up`s. Die Be-
stimmung der Dissoziationskonstante Kd folgte der von Tsien et al. (168) für die
Fluoreszenzindikatoren beschriebenen Methodik. 10 µM Quin-2/AM wurde durch
die Zugabe von NaOH hydrolysiert und in freies Quin-2-Anion überführt. Bei
pH=7,04 und Temperatur 37°C und Puffer, der Konstanz an Konzentration der
Calcium- und Magnesiumkationen gewährleistet (115 mM KCl, 20 mM NaCl, 10
mM MOPS, 2,207 mM K2H
2EGTA, 1,207 mM MgCl
2, pH mit KOH auf 7,05 einge-
stellt bei 37°C) wurde die Fluoreszenzintensität der Proben mit steigender Kon-
zentration an freien [Ca2+] gemessen. Es wurde Fmin
und Fmax
für [Ca2+]f =0,0 µM
resp. [Ca2+]f→+∞ gemessen. Die steigende Konzentration an freien Calcium-
kationen wurde durch die Zugabe von konstanten Volumina (5-20 µl) an 0,02 mM
K2CaEGTA in die Küvette des Fluorospektrometers erreicht. So konnten bei kon-
stanten pH und Temperatur die annäherend reellen Calciumkonzentrationen a
posteriori errechnet werden (159) und falsche [Ca2+]f, die durch die nicht vermeid-
baren Pipettierfehler beim Erstellen der a priori gewählten [Ca2+] entstehen, ver-
mieden werden. Die Berechnung der Konzentrationen der freien Calciumkationen
([Ca2+]f) folgte der Formel [Ca2+]
f = [Ca2+-EGTA](K
d/[EGTA]). Die so gewonnenen
Parameter wurden in Form eines sog. �Hill plot��s als Funktion log (F-Fmin
/Fmax
-F)
versus log [Ca2+]f dargestellt und analysiert. Nach der EDV-gestützten Funktions-
analyse folgt die Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration
der freien Calciumkationen der Funktion:
[Ca2+]f =a
1((F-F
min/F
max-F) + a
0
,wo a1=1,00 und a
0 =-0,938.
Diese Funktion kann auch als:
log [Ca2+]f =log(F-F
min/F
max-F)+log K
d
anhand der Formel II (Kap.1.2.3) dargestellt werden. Daraus errechnete Kd
log Kd=-0,938 (K
d=10-0,938µM=0,11534µM)
beträgt 115,34 nM bei pH=7,04, 37°C und [Mg2+]=1 nM.
78 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
1 0-1
1 00
1 01
1 02
1 03
1 00
1 01
1 02
1 03
1 04
log [Ca2+-Konzentration]
log [
(F-F
min
)/(F
max-F
)]Die in vitro durchgeführte Bestimmung der Dissoziationskonstante K
d er-
brachte ein Wert von 115 nM, der allgemein als eine Konstante für diese Substanz
eingesetzt wird.
Abbildung 18 Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin 2/Ca2+. Messung
der maximalen (Fmax
) und minimalen (Fmin
) Fluoreszenzintensität bei a posteriori bestimmten
Calciumkonzentrationen zwischen 0,267 µM und 598,7 µM bei 37°C in ionischem Milieu von
115 mM KCl, 20 mM NaCl, 2,207 mM K2H
2EGTA, 1,207 mM MgCl
2 (pH=7,05 mit KOH eingestellt).
10 µM Quin 2/AM wurde mit NaOH hydrolysiert. Die Analyse der Messwerte erfolgte in Form
eines Hill-plots. Daraus errechneter Wert der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin 2/
Ca2+ bei [Mg2+]=1 mM und 37°C beträgt 115 nM.
3.3 Bestimmung der Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Quin-2/
Ca²+-Konzentration
Die Fluoreszenzintensität des Komplexes Quin-2/Ca2+ weist eine lineare
Beziehung zu dessen Konzentration auf und ist somit direkt proportionell zur intra-
zellulären Calciumkonzentration (zumindest unter den physiologischen Bedingun-
gen, wo die intrazelluläre Calciumkonzentration ca. 100 nM bis ca. 1 mM beträgt).
Bestimmung der Dissoziationskonstante des Komplexes Quin-2/Ca2+ 79______________________________________________________________________________
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
1000
2000
3000
r2=0,9992
[Komplex Quin 2/Ca2+
] in µM
Flu
ore
szen
zin
ten
sit
ät
(arb
iträ
reE
inh
eit
en
) Die Bestimmung der Eichkurve der Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von
der Calciumkonzentration kann, wie bereits unter 2.1.4 beschrieben, in einem
zellfreien System erfolgen. Die Messungen wurden mit Suspension von freien Kation
von Quin-2 im PBS-Puffer bei pH=7,4 und 37°C durchgeführt. Die Endkonzentra-
tionen von [Ca2+]f und [Mg2+]
f betrugen 1 mM und 0,5 mM. 100, die minimale F
min
nach der Zugabe von 0,5 mM MnCl2 gemessen. 10 mM Quin-2/AM wurden mit
äquimolarer Menge an NaOH über 5 Min. bei Zimmertemperatur zum freien Tetra-
anion Quin-2 hydrolysiert. Die λex
und λem
betrugen 339 nm resp. 492 nm. Die
maximale Intensität der Fluoreszenz (Fmax
) wurde nach der Zugabe von 0,05%
Triton X, die minimale (Fmin
) nach der Zugabe von 0,5 mM MnCl2 gemessen. Die
Ergebnisse sind in der Abbildung 19 dargestellt.
Abbildung 19 Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration des Komplexes
Quin 2/Ca2+. Quin 2/AM wurde mit NaOH hydrolysiert. Die Messung wurde mit Quin 2-Konzentra-
tionen von 0,5 µM bis 10 µM im PBS-Puffer bei 37°C und pH=7,4 vorgenommen. Die
Endkonzentrationen von Calcium- und Magnesiumkationen betrugen [Ca2+]=1 mM und [Mg2+]=0,5
mM. Die Messung der maximalen Fluoreszenzintensität (Fmax
) erfolgte nach Zugabe von 0,05%
Triton-X, der minimalen Fluoreszenzintensität (Fmin
) nach 0,5 mM MnCl2. Die Analyse der
Messdaten ergab ein Korrelationskoeffizient r2=0,992.
80 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
3.4 Autofluoreszenz der nativen RBL-2H3-Zellen
Da die zellulären Komponenten eine gewisse Autofluoreszenz aufweisen,
die unter Umständen die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration alte-
rieren kann, erfolgte die Bestimmung der spektralen Eigenschaften der nativen
RBL-2H3-Zellen, um den Anteil der Autofluoreszenz an der gesamten Fluoreszenz-
intensität der Proben zu bestimmen. Die Bestimmung der Absorptions- und
Emissionsmaxima erfolgte unter Standardbedingungen für die RBL-2H3-Zellen in
PBS 0,1% BSA Puffer bei der Zellzahl von 1∗106 Zellen/ml. Die Absorptionsmaxima
und die Emissionsmaxima der Autofluoreszenz der RBL-2H3-Zellen lagen bei λex
=
328 nm, 352 nm und 365 nm bei der Emission von 500 nm und λem
= 432 nm, 444
nm und 489 nm bei der Absorption von 332 nm, die Amplitude der Fluoreszenz-
ntensität bei der Absorption bei 332 nm betrug nur 13,04% des Signals mit Quin-
2 geladenen Zellen, so daß auf eine Korrektur der in den Stimulationsversuchen
ermittelten Werte der Calciumkonzentration verzichtet werden konnte.
Abbildung 20 Absorptionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Absorptions-
spektrum von Komplex Quin 2/Ca2+.Die RBL-2H3-Zellen (1*106/ml) wurden mit 10 µM Quin 2/AM
über 45 Min. im PBS-Puffer mit 0,1% BSA geladen. 10 µM Quin 2/AM wurden nach der Hydrolyse
mit NaOH im PBS-Puffer mit 0,1% BSA gelöst. Gemessene Maxima für die nativen Zellen waren
328 nm, 352 nm, 365 nm. Im Vergleich zu Fluoreszenzintensität des Komplexes Quin 2/Ca2+
betrug die Fluoreszenzintensität der nativen RBL-2H3-Zellen bei gemessenen Emission von 500
nm ca. 10%.
Autofluoreszenz der nativen RBL-2H3-Zellen 81______________________________________________________________________________
Absorptionsmaximum=362 nm
Quin 2-Ca2+
Flu
ore
szenzin
tensität (a
rbiträ
re E
inheite
n)
320 340 360 380 400
Wellenlänge (nm)
Absorptionsmaxima= 328 nm, 352, 365nm
native RBL-2H3-Zellen
Abbildung 21 Emissionsspektra der nativen RBL-2H3-Zellen im Vergleich zum Emissionsspektrum
von Komplex Quin 2/Ca2+.Die RBL-2H3-Zellen (1*106/ml) wurden mit 10 µM Quin 2/AM über 45
Min. im PBS-Puffer mit 0,1% BSA geladen. 10 µM Quin 2/AM wurden nach der Hydrolyse mit
NaOH im PBS-Puffer mit 0,1% BSA gelöst. Gemessene Maxima für die nativen Zellen waren 432
nm, 444 nm und 489 nm. Im Vergleich zu Fluoreszenzintensität des Komplexes Quin 2/Ca2+ be-
trug die Fluoreszenzintensität der nativen RBL-2H3-Zellen bei gemessenen Emission von 500
nm ca. 13,04 %.
82 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
3.5 Ermittlung der optimalen und suboptimalen Antigenkonzentration für die
Stimulationsversuche
Die Bestimmung der optimalen Konzentration, d.h. der Konzentration von
DNP35
HSA, bei der die maximale Stimulation der RBL-2H3-Zellen erreicht werden
kann, und der suboptimalen Konzentration , d.h. der Konzentration, bei der eine
noch messbare Stimulation bewirkt werden kann, wurde vorgenommen. Die Be-
stimmung erlaubt den sicheren Ausschluß der unzureichenden Stimulation der
Zellen sowie die Bestimmung der niedrigsten Antigenkonzentration, bei der eine
stimulatorische Antwort noch erfolgt. Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl
1∗106/ml mit 10 µM Quin-2/AM über 45 Min. geladen. Die Stimulation erfolgte mit
DNP35
HSA in unterschiedlichen Konzentrationen (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml
und 1000 ng/ml).
Flu
ore
szenzin
tensität (a
rbiträ
re E
inheiten)
Emissionsmaximum=502 nm
Quin 2-Ca2+
native RBL-2H3-Zellen
Wellenlänge (nm)
Emissionsmaxima= 432 nm, 444 nm, 489 nm
450 500
Die Bestimmung der optimalen Antigen-(DNP35
-HSA)-Konzentration zeigte
eine optimale Stimulation der RBL-2H3-Zellen bei 100 ng/ml mit Serotoninfrei-
setzungsrate von 38,86% (Standardabweichung = 5,11%). Dieser Wert entspricht
der gängigen DNP-Konzentration, die in den referierten Stimulationsversuchen
mit RBL-2H3-Zellen eingesetzt wird. Die suboptimale Antigenkonzentration wurde
mit 10 ng/ml DNP35
-HSA ermittelt. Dabei gemessene Rate der Serotoninfreisetzung
betrug 26,44% (Standartabweichung = 4,49%). Der für die optimale und suboptimale
Antigenkonzentration parallel gemessene Anstieg der intrazellulären Calcium-
konzentration war 239 nM (Standartabweichung=109 nM) bzw. 127 nM (Standart-
abweichung=120 nM).
Abbildung 22 Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration der stimulierten RBL-2H3-Zellen
in Abhängigkeit von DNP35
HSA-Konzentration.Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1*106/
ml mit 10 µM Quin-2/AM über 45 Min. geladen. Die Stimulation erfolgte mit DNP35
HSA in vier
unterschiedlichen Konzentrationen (1ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1000 ng/ml). Die Werte für
den Anstieg der Calciumkonzentration sind Differenz zwischen der Calciumkonzentration nach
der Stimulation und der basalen Calciumkonzentration Die Ergebnisse der Versuche sind als
Mittelwert ± SEM der n=8 Versuche dargestellt.
0
100
200
300
10 -1 10 0 10 1 102 10 3 10 4
DNP BSA-Konzentration in ng/ml 35
An
sti
eg
der
[Ca2+] i
nach
der
Sti
mu
lati
on
in
nM
157,5 11,22±
239,44 10,48±
127,67 10,98±
10,00 5,55±
Optimale und suboptimale Antigen Konzentration 83______________________________________________________________________________
Abbildung 23. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung der RBL-2H3-Zellen von der DNP35
HSA-
Konzentration. Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1∗106/ml mit 10 µM Quin-2/AM über
45 Min. geladen. Die Stimulation erfolgte mit DNP35
HSA in vier unterschiedlichen Konzentratio-
nen (1ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1000 ng/ml). Die Ergebnisse der Versuche sind als Mittel-
wert ± SEM der n=8 Versuche dargestellt. Die optimale Antigenkonzentration von 100 ng/ml
entspricht der für den Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration bestimmten optimalen
Antigenkonzentration (s. Abb. 22).
3.6 Untersuchung der Effektivität des Ladeverfahrens von RBL-2H3-Zellen mit
Quin-2/ AM
Die verschiedenen Zellpopulationen, abhängig von ihrem Gehalt an unspe-
zifischen Esterasen, zeigen die Konversion von Quin-2/AM zum Quin-2-Anion mit
unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Daher soll ein zeitliches Optimum des Lade-
verfahrens mit Quin-2/AM für jede neu untersuchte Zellpopulation ermittelt wer-
den. Da die Unterschiede in der Empfindlichkeit der unterschiedlichen Zellarten
84 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
0
10
20
30
40
50
10 -1 100 10 1 10 2 10 3 104
DNP BSA-Konzentration in ng/ml 35
32,86 1,84±
38,86 2,26±
26,44 2,12±
6,8 1,18±
Sero
ton
infr
eis
etz
un
g n
ach
der
Sti
mu
lati
on
in
%
auf die Hydrolyse-Produkte von Quin-2/AM auszumachen sind, soll eine optimale
intrazelluläre Quin-2 Konzentration, die zu der angebotenen extrazellulären Quin-
2/AM Konzentration proportionell ist, determiniert werden. Auf diese Weise kann
bei der noch ausreichend hohen Intensität der Fluoreszenz die geringste Beein-
trächtigung der zellulären Funktionen gewährleistet werden.
3.6.1 Angebotene Quin-2/AM-Konzentration versus intrazelluläre Quin-2-
Konzentration
Effektivität des Ladeverfahrens von RBL-2H3-Zellen mit Quin-2/AM 85______________________________________________________________________________
Abbildung 24. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zellen von der
angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration.Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl
1∗106/ml mit unterschiedlichen Quin-2/AM -Konzentrationen (2 µM, 5 µM, 7,5 µM, 10 µM, 12,5
µM, 15 µM, 20 µM und 50 µM) über 45 Min. geladen. Die Ergebnisse der Versuche sind als
Mittelwert ± SEM der n=7 Versuche dargestellt. Die intrazelluläre Quin-2 Konzentration erreichte
Plateau bei der extrazellulären Quin-2/AM Konzentration von 15 µM. Die maximale intrazelluläre
Quin-2 Konzentration war bei Quin-2/AM Konzentration von 50 µM zu verzeichnen.
[Quin 2/AM] extrazellulär in µM0,0 10 20 30 40 50
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
[Qu
in 2
] in
trazellu
lär
in µ
M
0,256 0,076±
1,31 0,229±
2,9 0,264±
4,23 0,321±
5,41 0,271±
6,54 0,1±6,24 0,344±
6,15 0,36±
Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl von 1∗106/ml mit unterschiedli-
chen Quin-2/AM Konzentrationen (2-50 µM) über 45 Min. geladen. Die Bestim-
mung der optimalen Konzentration von Quin-2/AM zeigte eine maximale Konzen-
tration von intrazellulärem Quin-2 bei angebotener extrazellulären Quin-2/AM Kon-
zentration von 50 µM. Da aber eine hohe intrazelluläre Quin-2 Konzentration die
physiologischen Prozesse negativ beeinflußt, wurde die extrazellulären Quin-2/
AM Konzentration von 10 µM gewählt, die bei noch ausreichend hoher Amplitude
des Signals (Fluoreszenzintensität) am wenigsten die untersuchten Ereignisse
(Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration und die Rate der Serotonin-
freisetzung) beeinträchtigt (s. Kap. 3.7) gewählt.
3.6.2 Ladezeit versus intrazelluläre Quin-2-Konzentration
Abbildung 25. Abhängigkeit der intrazellulären Quin-2 Konzentration in RBL-2H3-Zellen vom
Dauer des Ladevorganges mit Quin-2/AM. Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1∗106/ml
mit 10 µM Quin-2/AM. über Zeit von 15 bis 120 Minuten geladen. Die Ergebnisse der Versuche
sind als Mittelwert ± SEM der n=4 Versuche dargestellt. Die intrazelluläre Quin-2 Konzentration
erreichte das Maximum bei der Ladezeit von 30 Minuten. Die längere Ladezeit von 45 Minuten
wurde gewählt, um die vollständige intrazelluläre Hydrolyse der Estergruppen von Quin-2/AM zu
gewährleisten.
86 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
[Qu
in 2
] in
trazellu
lär
in µ
M
Ladezeit in Minuten
0 30 60 90 1200
1
2
3
4
5
1,83 0,68±
1,48 0,51±
1,85 0,6±
2,36 0,6±
2,95 0,5±
3,48 0,4±
4,21 0,26±
3,22 0,3±
1,11 0,07±
RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl von 1∗106/ml mit 10 µM Quin-2/AM gela-
den. Die Werte in der Abbildung 25 geben die intrazelluläre Quin-2-Konzentrati-
on wieder. Die optimale Dauer des Ladeverfahrens lag zwischen 15-45 Min. Es
wurde die längere Zeit von 45 Min. gewählt, um die vollständige Hydrolyse der
Estergruppen von Quin-2/AM zu gewährleisten.
3.7 Untersuchung der Auswirkung der unterschiedlichen Quin-2/AM-Konzen-
trationen auf die Funktion der RBL-2H3-Zellen
Die RBL-2H3-Zellen wurden nach der Inkubation mit anti-DNP-IgE mit Quin-
2/AM in Konzentration zwischen 0,0 -50 µM über 45 Min. geladen und anschlie-
ßend mit 100 ng/ml DNP35
HSA stimuliert. Die Zellzahl betrug 1∗106 Zellen/ml. Die
Serotoninfreisetzungsrate und Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration
wurden in drei unabhängigen Versuche gemessen. Die Ergebnisse sind in der
Abbildungen 26 und 27 dargestellt.
Abbildung 26. Abhängigkeit der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen von der angebotenen
extrazellulären Quin-2/AM Konzentration.Die RBL-2H3-Zellen wurden bei der Zellzahl 1*106/ml
mit unterschiedlichen Quin-2/AM -Konzentrationen (0 µM, 5 µM, 10 µM, 15 µM, 20 µM und 50
µM) über 45 Min. geladen. Es sind die Ergebnisse der drei unabhängigen Versuche dargestellt.
Quin-2/AM und die Funktion der RBL-2H3-Zellen 87______________________________________________________________________________
88 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Abbildung 27. Abhängigkeit des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-
2H3-Zellen von der angebotenen extrazellulären Quin-2/AM Konzentration. Die RBL-2H3-Zellen
wurden bei der Zellzahl 1∗106/ml mit unterschiedlichen Quin-2/AM -Konzentrationen (5 µM, 10
µM, 15 µM, 20 µM und 50 µM) über 45 Min. geladen. Es sind die Ergebnisse der drei unabhängi-
gen Versuche dargestellt.
3.8 Bestimmung der extrazellulären Quin-2-Fraktion bei routinemäßig gelade-
nen RBL-2H3-Proben
Die stark alterierten bzw. sterbende Zellen ermöglichen ein Austritt von
Quin-2 aus der Zelle (�dye leaking�). Auf diese Weise kann die Bestimmung der
intrazellulären Calciumkonzentration verfälscht werden. Um diesem Problem zu
begegnen, wurde im Überstand der routinemäßig mit Quin-2 geladenen Zellproben
(Zellzahl 1∗106Zellen/µl, 10 µM Quin-2/AM, 45 Min.) die extrazelluläre Quin-2-
Fraktion bestimmt. Da die Proben auch nach 120 Minuten, eine Zeitspanne, die
bei den Stimulationsversuchen nicht überschritten werden dürfte, nur einen
geringgradigen Austritt von ca. 5% der Gesamtmenge des geladenen Quin-2 in
den extrazellulären Raum zeigten, konnte auf diesbezügliche Korrektur verzichtet
werden.
[Quin-2/AM] extrazellulär in µM5,0 10 15 20 50
0,0
250
500
[Ca2+] i
-An
sti
eg
in
nM
3.9 Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms
Die Aggregation der FcεRI der RBL-2H3-Zellen resultiert im Anstieg der
intrazellulären Calciumkonzentration von ca. 100-200 nM bis auf über 1000 nM,
wenn mit Quin-2 gemessen, und in der Freisetzung von Serotonin. Die Messung
dieser Parameter erlaubt ein Rückschluß auf den Grad der Aktivierung der unter-
suchten Zellen.
Der Mittelwert der Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-Zellen, die
in Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden, 37,69 % bzw. 30,66 %
(DNP35
HSA-Konzentration von 100 ng/ml und 10 ng/ml). Die spontane
Serotoninfreisetzung betrug für diese Zellen 3,24 %. Für die mit 60 µg/ml mAb
AA4 inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug der Mittelwert der Serotoninfreisetzung
18,02 % bzw. 9,65 %. Die Rate der spontanen Serotoninfreisetzung betrug 9,18%.
Die Unterschiede der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung zwischen den
RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die
mit mAbAA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,01; t-Test bei
unabhängigen Stichproben, Abbildung 28). Die Unterschiede der Rate der
Serotoninfreisetzung nach der Stimulation mit DNP35
HSA zwischen den RBL-
2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3- Zellen, die mit
mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,001, für 10 und 100
ng/ml in einfaktoriellem ANOVA-Test, nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 29).
Der Mittelwert der Rate der Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-
m3.7-Zellen, die in Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden, 28,16 % bzw.
3,73 % (Konzentration von Carbachol 1mM bzw. 3 µM). Die spontane Serotonin-
freisetzung betrug für diese Zellen 2,36 %. Für die mit 60 µg/ml mAb AA4
inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug die Serotoninfreisetzung 32,56 % bzw. 8,92
%. Die Rate der spontanen Serotoninfreisetzung betrug 6,87%. Die Unterschiede
der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zel-
len, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb
AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,01; t-Test bei unabhängi-
gen Stichproben, Abbildung 28). Die Unterschiede der Rate der Serotoninfrei-
setzung nach der Stimulation mit Carbachol zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen,
Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms 89______________________________________________________________________________
90 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Abbildung 28. Spontane Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen.
Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe mit
bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) oder mit dem Maus-Antikörper der IgG1-
Subklasse, über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 präinkubiert. Nach dem zweimaligen Wasch-
vorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im Hybrydysationsofen bei 37°C und 45 minutiger La-
devorgang mit Quin-2/AM. Die Abbildung stellt die Ergebnisse der drei unabhängigen Versuche
dar. Die Unterschiede der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung in An- und Abwesenheit von
mAb AA4 sind sowohl für RBL-2H3- wie auch RBL-2H3-m3.7-Zellen statistisch signifikant (p<
0,01; t-Test bei unabhängigen Stichproben)
die ohne mAb AA4 inkubiert wurden und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4
inkubiert wurden, waren statistisch nicht signifikant (p> 0,05; für beide Konzentra-
tionen in einfaktoriellem ANOVA-Test, nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 29).
sp
on
tan
e S
ero
ton
infr
eis
etz
un
g in
%
0,0
RBL-2H3 Zellen RBL-2H3-m3.7 Zellen
2,5
5,0
7,5
10
12,5
15
ohne mAb AA4 ohne mAb AA4mit mAb AA4 mit mAb AA4mit IgG1
Abbildung 29. Serotoninfreisetzung der RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-Zellen nach der Stimula-
tion. Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe
mit bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) oder mit Maus-Antikörper der IgG1-
Subklasse, über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank präinkubiert. Nach dem zwei-
maligen Waschvorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im Hybrydysationsofen bei 37°C und 45
minutiger Ladevorgang mit Quin-2/AM. Die RBL-2H3-Zellen wurden mit 10 ng/ml DNP35HSA bzw.
mit 100 ng/ml DNP35HSA, die RBL-2H3-m3.7-Zellen mit 3 µM bzw. mit 1mM Carbachol für 30
Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die Proben wurden bei 1500 U.p.m. abzentrifugiert
und 200 µl des Überstandes wurden in 10 ml der Szintillationsflüssigkeit gelöst. Abschließend
folgte die Bestimmung der Aktivität der Probe im Szintillationszähler. Die Abbildung stellt die
Ergebnisse drei bzw. zwei unabhängiger Versuche dar. Die Unterschiede der Rate der
Serotoninfreisetzung der RBL-2H3, die in An- bzw. Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wur-
den, sind für beiden angewandten Konzentrationen von DNP35HSA statistisch signifikant (p <
0,001 im einfaktoriellen ANOVA nach Bonferroni-Korrektur). Die Unterschiede der Rate der
Serotoninfreisetzung für RBL-2H3-m3.7-Zellen waren im Gegensatz nicht statistisch signifikant
(p>0,05; im einfaktoriellen ANOVA nach Bonferroni-Korrektur).
Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms 91______________________________________________________________________________
Serotoninfreisetzung in %
0,0 10 20 30 40
Stimulation der RBL-2H3-Zellen mit:
10 ng/ml DNP ohne AA4
10 ng/ml DNP mit AA4
100 ng/ml DNP ohne AA4
100 ng/ml DNP mit AA4
10 ng/ml DNP ohne IgG1
10 ng/ml DNP mit IgG1
100 ng/ml DNP ohne IgG1
100 ng/ml DNP mit IgG1
3 µM Carbachol ohne AA4
3 µM Carbachol mit AA4
1000 µM Carbachol ohne AA4
1000 µM Carbachol mit AA4
Stimulation der RBL-2H3-m3.7-Zellen mit:
Die mittlere intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]i) der nicht stimulier-
ten RBL-2H3-Zellen betrug in Ab- und Anwesenheit von 60 µg/ml von mAb AA4
138 nM bzw. 175 nM. Die Unterschiede der basalen Calciumkonzentration zwi-
schen den RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-
Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p < 0,01; t-
Test bei unabhängigen Stichproben, Abbildung 30).
Nach der Stimulation gemessene Werte der maximalen intrazellulären
Calciumkonzentration ([Ca2+]i) betrugen 736 nM für 100 ng/ml DNP
35HSA und 528
nM für 10ng/ml DNP35
HSA für die RBL-2H3-Zellen, die in Abwesenheit von mAb
AA4 präinkubiert wurden den. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4 inkubierten RBL-
2H3-Zellen betrugen diese Parameter 381 nM bzw. 162 nM. Die Unterschiede der
Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35
HSA zwischen den RBL-
2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit
mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0.05, für 10 und 100
ng/ml in einfaktoriellem ANOVA-Test nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 31).
Die mittlere intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]i ) der nicht stimu-
lierten RBL-2H3-m3.7-Zellen betrug in Ab- und Anwesenheit von 60 µg/ml von
mAb AA4 109 nM bzw. 165 nM. Die Unterschiede der basalen Calciumkonzentration
zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und
RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signi-
fikant (p < 0,001; in t-Test bei unabhängigen Stichproben, Abbildung 30).
Nach der Stimulation mit Carbachol gemessene Mittelwerte der maximalen
intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) betrugen 891 nM für 1000 µM
Carbachol und 444 nM für 3 µM Carbachol für die RBL-2H3-m3.7-Zellen, die in
Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden. Für die mit 60 µg/ml von mAb
AA4 inkubierten RBL-2H3-m3.7-Zellen betrugen diese Parameter 1736 nM bzw.
556 nM. Die Unterschiede der Calciumkonzentration nach der Stimulation mit
Carbachol zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wur-
den, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren für 3
µM statistisch nicht signifikant (p>0,05 in einfaktoriellem ANOVA-Test nach
Bonferroni-Korrektur, Abbildung 31) für 1 mM statistisch signifikant (p<0,001 in
einfaktoriellem ANOVA-Test nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 31).
92 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Abbildung 30. Basale intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-
Zellen in Abhängigkeit von Präinkubation mit monoklonalem Antikörper AA4.
Für die Versuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe mit bzw. ohne
des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 präinkubiert.
Nach dem zweimaligen Waschvorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im Hybrydysationsofen
bei 37°C und 45 minutiger Ladevorgang mit Quin-2/AM. Die intrazelluläre Calciumkonzentration
wurde bei 37°C in der Zellsuspension gemessen. Die Ergebnisse der Versuche sind als Mittel-
wert ± SEM der n=6 Versuche dargestellt. Die Unterschiede der Calciumkonzentration zwischen
den RBL-2H3- und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-
und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, sind statistisch signifikant (p< 0,05
für RBL-2H3-Zellen und p< 0,001 für RBL-2H3-m3.7-Zellen in t-Test bei unabhängigen Stichpro-
ben).
Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms 93______________________________________________________________________________
RBL-2H3 RBL-2H3-m3.7
127,6 6,2±
172,3 9,1±
109,4 6,1±
164,6 9,8±
0,0
50
100
150
200
intr
azellu
läre
Calc
ium
ko
nzen
trati
on
in
nM
ohne AA4 ohne AA4mit AA4 mit AA4
Abbildung 31. Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3-m3.7-
Zellen nach der Stimulation.
Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, abhängig von der Stimulationsreihe mit
bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml) über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2
präinkubiert. Nach dem zweimaligen Waschvorgang erfolgte 120 minutige Inkubation im
Hybrydysationsofen bei 37°C und 45 minutiger Ladevorgang mit Quin-2/AM. 10 ng/ml DNP35HSA
wurde für die suboptimale Stimulation bzw. 100 ng/ml DNP35HSA für die optimale Stimulation via
IgE-Rezeptor wurden bei 37°C der Zellsuspension der RBL-2H3-Zellen (PBS-Puffer mit 0,1 %
BSA) in der Küvette des Spectrofluorometers zugegeben. Die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden mit
3 µM Carbachol für die suboptimale bzw. mit 1000 µM Carbachol für die optimale Stimulation
über muskarinischen Acetylcholin-Rezeptor stimuliert. Die Werte der intrazellulären Calcium-
konzentration wurden als Differenz zwischen dem maximalen Wert der intrazellulären Calcium-
konzentration nach der Stimulation mit DNP35HSA für die RBL-2H3 -Zellen bzw. mit Carbachol für
RBL-2H3-m3.7-Zellen und der basalen Calciumkonzentration vor der Stimulation. Die Abbildung
stellt die Ergebnisse drei unabhängiger Versuche dar.
94 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Stimulation der RBL-2H3-Zellen
10 ng/ml DNP ohne AA4
10 ng/ml DNP mit AA4
100 ng/ml DNP ohne AA4
100 ng/ml DNP mit AA4
3 µM Carbachol ohne AA4
3 µM Carbachol mit AA4
1000 µM Carbachol ohne AA4
1000 µM Carbachol mit AA4
Anstieg der [Ca2+]i nach der Stimulation in mM
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Stimulation der RBL-2H3-m3.7--Zellen
Die Inhibition der Serotoninfreisetzung bzw. des Anstieges der intrazellulären
Calciumkonzentration nach der Stimulation wurde wie folgend berechnet:
(S - Sspontan
) - (SAA4
- Sspontan
) / (S)
wo S, SAA4
, Sspontan
die Serotoninfreisetzung der RBL-2H3-Zellen ohne Präinkubation
mit mAb AA4, nach der Präinkubation mit mAb AA4 und spontan bedeuten.
(∆[Ca2+]i -∆[Ca2+]
i AA4) / (∆[Ca2+]
i)
wo ∆[Ca2+]i und ∆[Ca2+]
i AA4 ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration
der RBL-2H3-Zellen in Ab- bzw. Anwesenheit von mAb AA4 bedeuten.
Die Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit mAb AA4 führte bei der Stimulation
mit DNP35
HSA zur Inhibition der Serotoninfreisetzung um 74,5 % bzw. 99,94 %
(optimale und suboptimale Konzentration von DNP35
HSA), zur Inhibition des FcεRI-
vermittelten Anstieges der [Ca2+]i um 66,39 % bzw. 98,04 % (optimale und
suboptimale Konzentration von DNP35
HSA) zum Anstieg der [Ca2+]i der ruhenden
Zellen von 26,12 % und zum Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung um 183,33
%. Die Unterschiede der Inhibition des Serotoninfreisetzung zwischen den RBL-
2H3-Zellen, die mit 10 ng/ml DNP35
HSA stimuliert wurden, und RBL-2H3-Zellen,
die mit mit 100 ng/ml DNP35
HSA stimuliert wurden, waren statistisch signifikant (p
< 0,05; t-Test bei unabhängigen Stichproben). Die Unterschiede der Inhibition des
Anstieges der Calciumkonzentration zwischen den RBL-2H3-Zellen, die mit 10
ng/ml DNP35
HSA stimuliert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit mit 100 ng/ml
DNP35
HSA stimuliert wurden, waren statistisch signifikant (p< 0,001; t-Test bei
unabhängigen Stichproben).
Die Inkubation der RBL-2H3-m3.7-Zellen mit mAb AA4 führte bei der Sti-
mulation mit Carbachol nicht zur Inhibition der Serotoninfreisetzung und nicht zur
Inhibition des Anstieges der [Ca2+]i jedoch zum Anstieg der [Ca2+]
i der ruhenden
Zellen von 50,51 % und zum Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung um 191,1
%.
Die Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit Antikörper der Subklasse IgG1 führ-
te weder zur signifikanten Inhibition der Serotoninfreisetzung und des Anstieges
der [Ca2+]i noch zum signifikanten Anstieg der [Ca2+]
i der ruhenden Zellen (p>0,05
in einfaktoriellem ANOVA-Test nach Bonferroni-Korrektur, Abbildung 33).
Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms 95______________________________________________________________________________
Abbildung 32. Inhibitorischer Effekt des monoklonalen anti-gangliosidären Antikörpers AA4 auf
die Serotoninfreisetzung und die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3 und RBL-2H3-
m3.7-Zellen nach der Stimulation. Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden, ab-
hängig von der Stimulationsreihe mit bzw. ohne des monoklonalen Antikörpers AA4 (60 µg/ml)
über 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 präinkubiert. 10 ng/ml DNP35HSA wurde für die suboptimale
Stimulation bzw. 100 ng/ml DNP35HSA für die optimale Stimulation via IgE-Rezeptor verwendet.
Die RBL-2H3-m3.7-Zellen wurden mit 3 µM Carbachol für die suboptimale bzw. mit 1000 µM
Carbachol für die optimale Stimulation über muskarinischen Acetylcholin-Rezeptor stimuliert. Die
Werte der intrazellulären Calciumkonzentration wurden als Differenz zwischen dem maximalen
Wert der intrazellulären Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35HSA für die RBL-
2H3 -Zellen bzw. mit Carbachol für RBL-2H3-m3.7-Zellen und der basalen Calciumkonzentration
vor der Stimulation. Die Abbildung stellt die Ergebnisse drei unabhängiger Versuche dar. Die
Ergebnisse der Versuche sind als Mittelwert ± SEM der n=3 Versuche dargestellt.
96 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
Inhibition in %
-150 100500,0-100 150-50
Stimulation der RBL-2H3-Zellen
10 ng/ml DNP35-BSA
100 ng/ml DNP35-BSA
Stimulation der RBL-2H3-m3.7-Zellen
3 µM Carbachol
1000 µM Carbachol
98,04 0,87±
99,94 4,18±
66,39 2,17±
74,5 6,61±
-17,06 21,11±
-64,8 44,3±
-120,9 50,42±
-0,23 5,38±
Serotoninfreisetzung
[Ca2+]
Abbildung 33. Effekt des Maus-Antikörpers der IgG1-Klasse auf die Serotoninfreisetzung und
die intrazelluläre Calciumkonzentration in RBL-2H3-Zellen nach der Stimulation mit DNP35HSA.
Für die Stimulationsversuche bestimmte Zellen wurden , abhängig von der Stimulationsreihe mit
bzw. ohne des Maus-Antikörpers der IgG1-Klasse (60 µg/ml) über 16 Stunden bei 37°C und 5%
CO2 präinkubiert. 10 ng/ml DNP35HSA wurde für die suboptimale Stimulation bzw. 100 ng/ml
DNP35HSA für die optimale Stimulation via IgE-Rezeptor verwendet. Die Werte der intrazellulä-
ren Calciumkonzentration wurden als Differenz zwischen dem maximalen Wert der intrazellulä-
ren Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35HSA für die RBL-2H3 -Zellen und der
basalen Calciumkonzentration vor der Stimulation. Die Abbildung stellt die Ergebnisse zwei un-
abhängiger Versuche dar. Die Ergebnisse der Versuche sind als Mittelwert ± SEM der n=2 Versu-
che dargestellt. Die Unterschiede der Calciumkonzentration und der Serotoninfreisetzung zwi-
schen den RBL-2H3-Zellen , die ohne IgG1 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit IgG1
inkubiert wurden, sind statistisch nicht signifikant (p>0,05 in einfaktoriellem ANOVA -Test unter-
sucht).
Messung der Serotoninfreisetzung und des Calciumeinstroms 97______________________________________________________________________________
0,0 10 20 30
Serotoninfreisetzung in %
0,0 200 400 600
Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in nM
Stimulation der RBL-2H3-Zellen mit:
10 ng/ml DNP in Abwesenheit von IgG1
10 ng/ml DNP in Anwesenheit von IgG1
100 ng/ml DNP in Abwesenheit von IgG1
100 ng/ml DNP in Anwesenheit von IgG1
13,45 2,86 %±
132 4 nM±
16,12 2,12 %±
128 3 nM±
26,21 1,96 %±
24,35 0,74 %±
540 126 nM±
389 18 nM±Serotoninfreisetung
Anstieg der intrazellulärenCalciumkonzentration
98 3 Ergebnisse______________________________________________________________________________
4 Diskussion
4.1 Etablierung der Methodik
Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften von Quin-2, erbrachte die
Ergebnisse, die mit Literaturangaben weitgehend übereinstimmen. Das Ab-
sorptionsmaximum und das Emmisionsmaximum lagen für Quin-2/AM bei λex
= 339
nm und λem
= 430 nm, für Quin-2 bei λex
= 364 nm und λem
= 502 nm und für das
Komplex Quin-2/Ca2+ bei λex
= 331 nm und λem
= 501 nm, Die in der Literatur
angegebene Maxima für Quin-2/AM sind λex
= 339 nm und λem
= 430 nm, für Quin-
2 λex= 352 nm und λ
em= 492 nm und für das Komplex Quin-2/Ca2+ λ
ex= 332 nm
und λem
= 492 nm.
Die leichten Verschiebungen der λex
und λem
für Quin-2 und Quin-2/Ca2+
erklären sich am ehesten dadurch, daß die maximalen Wellenlängen der Anre-
gung und Emission in Spektren sich über einige Nanometer erstrecken und kei-
nen eindeutig zu erkennenden Peak-Wert besitzen. Nach der Fokussierung durch
die geometrische Anordnung des Ausgangschlitzes des Spektrofluorometers kann
theoretisch ein monochromatischer Strahl der vorgewählten Wellenlänge erzeugt
werden. Durch die technischen Begebenheiten beträgt die Breite des Wellen-
spektrums der Photonen zumindest 5 nm (bis 10 nm), um die ausreichende Inten-
sität der exzitatorischen Photonen zu gewährleisten, so daß die registrierten
geringgradigen Unterschiede der Wellenlänge der Absorptionsmaxima (λex
) für
Quin-2 und Quin-2/Ca2+ ohne Einfluß auf die Qualität der Messung bleiben dürfen.
Die Fluoreszenz der Probe, d.h. Emissionsphotonen, wird mit einem toroidalen
und flachen Spiegel auf den planen Eigangschlitz des Emissionsmonochromators
des Fluorospektrometers fokussiert. Der Emmisionsmonochromator bedingt , ähn-
lich wie im Fall der Anregungsphotonen, Wellenspektrums der emitierten Photo-
nen mit einer Breite von zumindest 5 nm (bis 10 nm), so daß die geringgradigen
Unterschiede der Wellenlänge der Absorptionsmaxima (λem
) für Quin-2 und Quin-
2/Ca2+ die Messung nicht beeinflußen dürften. Die in vitro durchgeführte Bestim-
mung des Wertes der Dissoziationskonstante Kd erbrachte ein Wert von 115 nM,
der allgemein als eine Konstante für diese Substanz eingesetzt wird.
99______________________________________________________________________________
Die Bestimmung der optimalen Konzentration von Quin-2/AM zeigte eine
maximale Konzentration von intrazellulärem Quin-2 bei angebotenen extrazellulären
Quin-2 Konzentration von 50 µM. Da aber die hohe intrazelluläre Quin-2 Konzen-
tration die physiologischen Prozesse negativ beeinflußt, wurde die extrazelluläre
Quin-2/AM Konzentration von 10 µM, die bei noch ausreichend hoher Amplitude
des Signals (Fluoreszenzintensität) am wenigsten die untersuchten Ereignisse (An-
stieg der intrazellulären Calciumkonzentration und die Rate der Serotonin-
freisetzung) beeinträchtigt (siehe unten), gewählt. Die optimale Dauer des Lade-
verfahrens lag zwischen 15-45 Min. Es wurde die längere Zeit von 45 Min. ge-
wählt, um die vollständige Hydrolyse der Estergruppen von Quin-2/AM zu gewähr-
leisten. Die Untersuchung der Auswirkung der unterschiedlichen Quin-2/AM-Kon-
zentrationen auf die Funktion der RBL-2H3-Zellen zeigte die progrediente Minde-
rung der Rate der Serotoninfreisetzung und des Anstieges der intrazellulären
Calciumkonzentration mit steigender Quin-2/AM Konzentration. Bei der gewähl-
ten Quin-2/AM Konzentration von 10 µM war die Rate der Serotoninfreisetzung,
im Vergleich zu 0 µM Quin-2/AM, nur um 11,24 % gemindert (29,84% versus
33,62%). Die Quin-2/AM Konzentration von 5 µM bedingt die Minderung der Rate
der Serotoninfreisetzung um 9,4% (30,46% versus 33,62%). Im Vergleich verur-
sacht die extrazelluläre Quin-2/AM Konzentration von 50 µM die Minderung der
Serotoninfreisetzung um 37,9% (20,85% versus 33,62%). Die beim Ladevorgang
mit 5 µM Quin-2/AM erreichte intrazelluläre Quin-2 Konzentration lag bei nur 1,31
µM Quin-2 intrazellulär . Bei der extrazellulären Quin-2/AM Konzentration von 10µM
lag die intrazelluläre Quin-2 Konzentration bei 4,23 µM, bei 50 µM Quin -2/AM bei
6,54 µM. Da die Unterschiede in der Auswirkung der 5 µM und 10 µM Quin-2/AM
auf die funktionellen Parameter der RBL-2H3-Zellen sich nur geringgradig unter-
scheiden, die intrazelluläre Quin-2 Konzentration jedoch bei 10 µM um über das
Dreifache höher liegt, wurde die Konzentration von 10 µM Quin-2/AM für die wei-
teren Versuche gewählt.
In der Literaturangaben liegen die angewandten, für die suffiziente Intensität der
Fluoreszenz ausreichenden Konzentrationen von Quin-2/AM zwischen 1 bis 100
µM. Dabei gemessene intrazelluläre Quin-2 Konzentrationen betragen 0,1-5 mM.
Diese Konzentrationen beziehen sich auf den geschätzten bzw. gemessenen
100 4 Diskussion______________________________________________________________________________
mittleren Volumen der untersuchten Zellen. In den vorliegenden Versuchen er-
reichte intrazelluläre Quin-2 Konzentrationen liegen beinah drei Größeordnung
niedriger. Diese wurden jedoch, aufgrund der fehlenden technischen Vorrausset-
zungen für eine Messung, nicht auf den tatsächlichen intrazellulären Volumen be-
zogen, so daß die Angaben der Quin-2 Konzentration sich auf den Gesamtvolu-
men der Proben (2 ml) beziehen. Die tatsächliche intrazelluläre Quin-2 Konzentra-
tion dürfte nach der Zellvolumenkorrektur in der Größeordnung der Literaturanga-
ben (0,1-5 mM) liegen.
Die optimale Konzentration an DNP35
HSA, mit dem die direkte Stimulation
der RBL-2H3- und RBL-2H3-m3.7-Zellen herbeigebracht wurde, betrug 100 ng/
ml. Bei dieser Konzentration konnte eine maximale Serotoninfreisetzung und der
maximale Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration registriert werden. Eine
weitere Steigerung der DNP35
HSA Konzentration auf 1 µg/ml erbrachte im Ver-
gleich zu 100 ng/ml weder eine Erhöhung der Rate der Serotoninfreisetzung
(38,86% versus 32,86%) noch eine Erhöhung des Anstieges der intrazellulären
Calciumkonzentration (239 nM versus 157 nM). Als suboptimale Konzentration
d.h. die Konzentration von DNP35
HSA, bei der noch signifikante Serotonin-
freisetzung und einen messbarer Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration
gemessen wurden, wurde 1 ng/ml gewählt. Bei dieser DNP35
HSA Konzentration
gemessene Rate der Serotoninfreisetzung und der Anstieg der intrazellulären
Calciumkonzentration lagen im Vergleich zu Stimulation mit 100 ng/ml DNP35
HSA
bei 6,8% versus 38,86% bzw. 10 nM versus 239 nM. Die Stimulation mit darunter
liegenden DNP35
HSA-Konzentrationen erbrachte keine nennenswerten Änderun-
gen dieser Parameter. Diese Ergebnisse sind mit den Ergebnissen, die in der
Literatur zu finden sind, kongruent.
4.2 Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 auf die intrazel-
luläre Calciumkonzentration und Serotoninfreisetzung in RBL-2H3- und RBL-2H3-
m3.7-Zellen
Das Mittelwert der Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-Zellen, die
in Abwesenheit von mAb AA4 präinkubiert wurden 37,69 % bzw. 30,66 %
Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 101______________________________________________________________________________
(DNP35
HSA-Konzentration von 100 ng/ml und 10 ng/ml). Die spontane
Serotoninfreisetzung betrug für diese Zellen 3,24 %. Für die mit 60 µg/ml von mAb
AA4 inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug der Mittelwert der Serotoninfreisetzung
18,02 % bzw. 9,65 %. Die Rate der spontanen Serotoninfreisetzung betrug 9,18
%. Die Unterschiede der Rate der spontanen Serotoninfreisetzung zwischen den
RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die
mit mAbAA4 inkubiert waren statistisch signifikant. Der Mittelwert der Rate der
Serotoninfreisetzung betrug für die RBL-2H3-m3.7-Zellen, die in Abwesenheit von
mAb AA4 präinkubiert wurden 28,16 % bzw. 3,73 % (Konzentration von Carbachol
1mM bzw. 3 µM). Die spontane Serotoninfreisetzungbetrug für diese Zellen 2,36
%. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4 inkubierten RBL-2H3-Zellen betrug die
Serotoninfreisetzung 32,56 % bzw. 8,92 %. Die Rate der spontanen
Serotoninfreisetzung betrug 6,87%. Die Unterschiede der Rate der spontanen
Serotoninfreisetzung zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4
inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert waren
statistisch signifikant . Die Unterschiede der Rate der Serotoninfreisetzung nach
der Stimulation mit Carbachol zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb
AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wa-
ren statistisch nicht signifikant. Die mittlere [Ca2+]i der nicht stimulierten RBL-2H3-
Zellen betrug in Ab- und Anwesenheit von 60 µg/ml von mAb AA4 138 nM bzw.
175 nM. Die Unterschiede der basalen Calciumkonzentration zwischen den RBL-
2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-Zellen, die mit
mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant . Nach der Stimulation
gemessene Werte der maximalen [Ca2+]i betrugen 736 nM für 100 ng/ml DNP
35HSA
und 528 nM für 10ng/ml DNP35
HSA für die RBL-2H3-Zellen, die in Abwesenheit
von mAb AA4 präinkubiert wurden den. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4
inkubierten RBL-2H3-Zellen betrugen diese Parameter 381 nM bzw. 162 nM. Die
Unterschiede der Calciumkonzentration nach der Stimulation mit DNP35
HSA zwi-
schen den RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-
Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch signifikant . Die mitt-
lere [Ca2+]i der nicht stimulierten RBL-2H3-m3.7-Zellen betrug in Ab- und Anwe-
senheit von 60 µg/ml von mAb AA4 109 nM bzw. 165 nM. Die Unterschiede der
102 4 Diskussion______________________________________________________________________________
basalen Calciumkonzentration zwischen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb
AA4 inkubiert wurden, und RBL-2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wur-
den, waren statistisch signifikant . Nach der Stimulation mit Carbachol gemesse-
ne Mittelwerte der maximalen [Ca2+]i betrugen 891 nM für 1000 µM Carbachol und
444 nM für 3 µM Carbachol für die RBL-2H3-m3.7-Zellen, die in Abwesenheit von
mAb AA4 präinkubiert wurden. Für die mit 60 µg/ml von mAb AA4 inkubierten
RBL-2H3-m3.7-Zellen betrugen diese Parameter 1736 nM bzw. 556 nM. Die
Unterschiede der Calciumkonzentration nach der Stimulation mit Carbachol zwi-
schen den RBL-2H3-m3.7-Zellen, die ohne mAb AA4 inkubiert wurden, und RBL-
2H3-m3.7-Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert wurden, waren statistisch nicht signi-
fikant.
Die hier vorliegenden Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen
zeigen eine signifikante Inhibition des FcεRI-vermittelten Anstieges der [Ca2+]i und
der Serotoninfreisetzung nach der Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit
monoklonalem Antikörper AA4. Bei der optimalen Antigenkonzentration von 100
ng/ml DNP35
HSA betrug die Inhibition 66,39 % bzw. 74,5 %. Für die suboptimale
Antigenkonzentration von 10 ng/ml DNP35
HSA konnte die Inhibitionsrate von 98,04
% bzw. 99,94 % ermittelt werden. Die Inkubation der RBL-2H3-m3.7-Zellen mit
monoklonalem Antikörper AA4 zeigte bei der Stimulation mit der optimalen und
suboptimalen Konzentration von 1000 µM bzw. 3 µM Carbachol keine signifikante
Inhibition. Im Gegensatz dazu konnten nach der Präinkubation der RBL-2H3-m3.7-
Zellen mit mAb AA4 und darauffolgender Stimulation mit Carbachol eine Erhö-
hung der Serotoninfreisetzung (0,23 % bzw. 64,78 % für 1 mM und 3 µM Carbachol)
und die Erhöhung des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration (in der
Plateauphase, nach der Stimulation mit Carbachol, 120,92 % bzw. 18,4 %) de-
monstriert werden. Die Stimulation der mit mAb AA4 präinkubierten RBL-2H3-
m3.7-Zellen mit DNP35
HSA zeigte ähnlich wie bei den RBL-2H3-Zellen Inhibition
des FcεRI-vermittelten Anstieges der [Ca2+]i und der Serotoninfreisetzung. Da die
Inhibition des Anstieges der [Ca2+]i und der Serotoninfreisetzung für die RBL-2H3-
m3.7-Zellen nur die FcεRI-vermittelte nicht jedoch mAChR-vermittelte Stimulation
betraf , sprechen diese Ergebnisse für die Spezifität der Inhibition nur für die FcεRI-
vermittelte Stimulation. Die Unterschiede der Rate der Serotoninfreisetzung nach
Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 103______________________________________________________________________________
der Stimulation mit DNP35
HSA zwischen den RBL-2H3-Zellen, die ohne mAb AA4
inkubiert wurden, und RBL-2H3- Zellen, die mit mAb AA4 inkubiert waren stati-
stisch signifikant (p< 0,001, einfaktorieller ANOVA-Test).
Eine inhibitorische Wirkung des der gleichen Subklasse IgG1 wie mAb AA4
angehörenden monoklonalen Antikörpers konnte nicht gezeigt werden. Die Ago-
nisten der niedrigaffinen IgG-Rezeptoren (FcγRIIB1 und FcγRIIB2) wie IgG1 verur-
sachen eine Inhibition der Signalübertragungsmechanismen und der Aktivierung
der murinen Mastzellen (169) wie auch der RBL-2H3-Zellen (170). Nach der
Koaggregation mit einem eine ITAM-Sequenz beinhaltendem Rezeptor wie z.B.
FcεRI werden die Tyrosinresiduen der ITIM-Sequenz phosphoryliert, was zum
Entstehen der temporären Bindungsstellen für die SH2-Domäne beinhaltenden
Proteinen, wie die Phosphatasen wie Proteintyrosinphosphatasen SHP-1 und SHP-
2 sowie SHIP (Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase), führt. Diese Proteintyrosin-
phosphatasen dephosphorylieren die ITAM-Sequenzen, was in der Inhibition der
Signalübertragungsmechanismen resultiert. Es wird angenommen, daß die FcγRIIB-
Rezeptoren einen inhibitorischen Korezeptor für alle die ITAM-Sequenzen bein-
haltenden Rezeptoren der hämatopoetischen Zellen darstellen können (171). Die
ruhenden RBL-2H3-Zellen exprimieren die Subform FcγRIIB2, die stimulierten RBL-
2H3-Zellen die beiden Subformen der niedrigaffinen IgG-Rezeptoren (FcγRIIB1
und FcγRIIB2). Entgegen der Erwartungen konnte in Rahmen der vorliegenden
Arbeit eine Inhibition der Serotoninfreisetzung und des Anstieges der intrazellulä-
ren Calciumkonzentration für die RBL-2H3-Zellen, die mit IgG1 und anti-DNP-IgE
präinkubiert und anschließend mit DNP35
HSA stimuliert wurden, nicht demonstriert
werden. Da zum Zeitpunkt des Durchführen des experimentellen Teils der Arbeit
die inhibitorische Funktion der ITIM-Sequenzen der niedrigaffinen IgG-Rezepto-
ren noch nicht gesichert war, wurde diese Tatsache nicht weiter experimentell
verfolgt. Als mögliche Erklärung der ausgebliebenen Inhibition bittet sich die feh-
lende bzw. sehr geringe Affinität des benutzten monoklonalen Maus-IgG1-Antikör-
pers zu den hochaffinen IgE-Rezeptoren der RBL-2H3-Zellen und somit die feh-
lende Kreuzvernetzung zwischen den hochaffinen IgE-Rezeptoren (FcεRI) und
den niedrigaffinen Rezeptoren für Immunoglobulin G (FcγRII). Diese hypotheti-
sche Annahme wird durch die Tatsache unterstützt, daß die inhibitorische
104 4 Diskussion______________________________________________________________________________
Wirkung der FcγRIIB1 und FcγRIIB2 vom Bocek et al. (172) mit dem monoklonalen
Ratte-IgG2a
Antikörper demonstriert werden konnte. Für Ratte-IgG2a
Antikörper
konnte, im Gegensatz zu den anderen IgG-Immunkomplexen bzw. den anderen
Subklassen der Immunkoplexe, eine Kreuzreaktivität mit FcεRI demonstriert wer-
den (173). Diese stellt eine �conditio sine qua non� der ITIM-vermittelten Inhibition
der Signalübertragungsmechanismen. Die fehlende Inhibition der Serotoninfrei-
setzung und des Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration für die RBL-
2H3-Zellen durch die Präinkubation mit dem monoklonalen IgG1-Antikörper, der
der gleichen Spezies entstammt und mit mAb AA4 isotypisch ist, unterstreicht die
Spezifität der mAb AA4-vermittelten Inhibition der Aktivierung der RBL-2H3-Zel-
len und läßt die Annahme einer unspezifischen, für die IgG1-Antikörper typischen
Interaktion als unberechtigt erscheinen. Auf dieser Weise konnte die spezifische,
inhibitorische Wirkung der Bindung des mAb AA4 an die α-Galaktosyl Derivate
des Gangliosids GD1b
für die FcεRI-vermittelte Signalübertragungsmechanismen
demonstriert werden.
Darüber hinaus konnten bereits von Basciano et al. (150) demonstrierter
Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung und der Anstieg der basalen, intra-
zellulären Calciumkonzentration der nicht-stimulierten RBL-2H3-Zellen durch die
Präinkubation mit mAb AA4 erneut gezeigt werden. Der Anstieg der basalen, in-
trazellulären Calciumkonzentration der nicht-stimulierten RBL-2H3-Zellen betrug
26,12 % bei dem Anstieg der spontanen Serotoninfreisetzung um 183,3 %. Erwar-
tungsgemäß wurden mit 50,51 % und 191,1 % die ähnlichen Parameter auch für
die Zellinie RBL-2H3-m3.7 erhoben.
Die bereits demonstrierte Assoziation des Gangliosids GD1b
mit der
Proteintyrosinkinase p53/56lyn und dem FcεRI könnte die inhibitorische Wirkung
von mAb AA4 erklären. Die Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit dem Antigen
(DNP35
HSA) und mAb AA4 verursacht nach der Stimulation mit dem spezifischen
IgE (anti-DNP-IgE) eine signifikante Reduktion der Rate der Tyrosinphosphorylation
der Rezeptoreinheit FcRβ (164), die als eine Bindungsstelle für die Proteintyrosin-
kinase p53/56lyn fungiert. Die Bindung von p53/56lyn an FcRβ verursacht die ver-
stärkte Aktivierung der Proteintyrosinkinase p72syk und dadurch ca. 5-7 malige
Verstärkung der Signalamplitude, die als ein Anstieg der [Ca2+]i und Ansieg der
Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 105______________________________________________________________________________
p72syk-Aktivität gemessen werden können. Die Proteintyrosinkinase p72syk spielt
eine Schlüsselrolle in der Aktivierung der weiteren Proteine, die weiterführende
Pfade der Signalübertragung eröffnen. Die durch mAb AA4 bedingte
Minderphosphorylation der Tyrosingruppen der FcRβ und daraus resultierende
verminderte Bindung von p53/56lyn an FcRβ könnte zur verminderten Aktivierung
der Proteintyrosinkinase p72syk führen, was in der Inhibition der Signalübertragungs-
mechanismen mündet und in dem vermindertem Anstieg der [Ca2+]i und der Rate
der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen resultiert. Der genaue Mechanismus
der über Gangliosid GD1b
vermittelten Minderphosphorylierung der FcRβ bleibt
zur Zeit unklar und bedarf der weiteren Untersuchungen.
Die Funktion der p125Fak, einer fokalen Adhäsionsprotein, die zentrale Rol-
le in Integrin-vermittelten Signalübertragungsmechanismen der RBL-2H3-Zellen
spielt und der eine Schlüsselrolle in der FcεRI-vermittelten Degranulation der RBL-
2H3-Zellen zugeschrieben wird (119), bleibt zur Zeit noch unklar. Interessanter-
weise wird die der FcεRI-vermittelten Stimulation der RBL-2H3-Zellen folgende
Phosphorylation von p125Fak durch die Bindung von mAb AA4 inhibiert. Da über
eine Phosphorylation der p125Fak durch die Proteintyrosinkinase p72syk spekuliert
wird, könnte eine über das Gangliosid GD1b
vermittelte Minderphosphorylierung
der FcRβ eine Erklärung für dieses Ereignis bitten. Eine anderweitige Inhibition
der Phosphorylation der p125Fak kann jedoch zum jetzigen Zeitpunkt nicht ausge-
schlossen werden. Zusammenfassend könnte p125Fak einen weiteren Eingriffs-
punkt für die Wirkung des mAb AA4 darstellen, was zum vermindertem Anstieg
der [Ca2+]i und der verminderten Rate der Serotoninfreisetzung in RBL-2H3-Zellen
führen könnte.
Die weitere Eigenschaft des Gangliosids GD1b
an das Calmodulin, einem
wichtigem regulatorischen Protein zu binden und dadurch die katalytische Aktivi-
tät der cytosolischen Proteine zu modulieren wie Inhibition der Calmodulin-abhän-
gigen Phosphodiesterase (152, 153), erlaubt die hypothetische Annahme eines
möglichen, durch eine Interaktion zwischen dem Gangliosid GD1b
und Calmodulin
regulierten, Einflusses auf die Mechanismen der Signalübertragung und
Zellaktivierung. Da jedoch die Aktivierung der Calmodulin im Vergleich zur
Tyrosinphosphorylierung des FcRβ ein spätes Ereignis im Verlauf der FcεRI-ver-
mittelten Signalübertragung darstellt, erscheint die hypothetische Calmodulin-ver-
mittelte Inhibition des Anstieges der [Ca2+]i und der Rate der Serotoninfreisetzung
in RBL-2H3-Zellen eher unwahrscheinlich.
106 4 Diskussion______________________________________________________________________________
Die vorliegende Arbeit demonstriert die regulatorische Funktion des
Gangliosids GD1b
in den FcεRI-vermittelten Signalübertragungsmechanismen. Die
hypothetischen Mechanismen der Inhibition bedürfen noch einer weitergehenden
experimentellen Klärung, die genauer die Funktion des Gangliosids GD1b
definie-
ren könnte. Zur Zeit erscheint die Minderphosphorylierung der Rezeptoreinheit
FcRβ eine Schlüsselrolle in diesem Prozeß zu spielen.
Effekt des anti-gangliosidären monoklonalen Antikörpers AA4 107______________________________________________________________________________
108______________________________________________________________________________
5. Zusammenfassung
Die Immunglobulin E-Rezeptor (FcεRI) exprimierenden Zellen des huma-
nen Immunsystems (Mastzellen, basophile Granulozyten) spielen eine Schlüssel-
rolle in Rahmen der allergischen Reaktion vom Soforttyp. Die �rat basophilic
leukemia�-Zellinie (RBL-2H3) exprimiert den FcεRI und dient als Model bei der
Erforschung der FcεRI-vermittelten Signalübertragungsmechanismen. Das
Gangliosid GD1b
ist mit dem FcεRI und mit der Proteintyrosinkinase p53/56lyn
sterisch assoziiert. Der monoklonale Antikörper AA4 ist gegen die Epitope des
Gangliosids GD1b
gerichtet. Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluß des
Antikörpers AA4 auf den FcεRI-vermittelten Anstieg der intrazellulären Calcium-
konzentration (∆[Ca2+]i) und die Rate der Serotonin-freisetzung in den RBL-2H3-
Zellen.
Die RBL-2H3-Zellen wurden mit monoklonalem anti-2,4-dinitrophenyl-
Immunoglobulin E (anti-DNP-IgE) inkubiert. Die Messungen der Serotonin-
freisetzung und der ∆[Ca2+]i folgten unmittelbar der Zugabe von 2,4-Dinitrophenyl
in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (100 ng/ml und 10 ng/ml). Für die Mes-
sung der ∆[Ca2+]i wurden Zellen mit 10 µM Quin-2/AM (Fluoreszenzindikator für
die intrazelluläre Calciumkonzentration) über 45 Minuten bei 37°C geladen. Als
Kontrollgruppe diente die RBL-2H3-m3.7-Zellinie, die eine mit dem humanen Gen
für den muskarinergen M3-Rezeptor stabil transfizierte RBL-2H3-Zellinie präsen-
tiert. Die Messung der Serotoninfreisetzung und der ∆[Ca2+]i folgte unmittelbar
nach Zugabe von Carbachol in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (1 mM
und 3 µM). Die Rate der Serotoninfreisetzung und ∆[Ca2+]i wurden für beide Zellinien
in An- und Abwesenheit von 60 µg/ml AA4 gemessen.
Die Bestimmung der spektralen Eigenschaften erbrachte folgende Ergeb-
nisse: Quin-2/AM λex
= 339 nm und λem
= 430 nm; Quin-2 λex
= 364 nm und λem
= 502
nm; Komplex Quin-2/Ca2+ λex
= 331 nm und λem
= 501nm; die Dissoziationskonstante
Kd des Komplexes Quin-2/Ca2+ lag bei 115 nM. Die optimale Stimulation der RBL-
2H3-Zellen wurde für 100 ng/ml DNP35
-HSA ( Serotonin-freisetzung 38,86%, ∆[Ca2+]i
239 nM) gezeigt. Die maximale intrazelluläre Quin-2 Konzentration wurde bei an-
gebotener extrazellulärer Quin-2/AM Konzentration von 50 µM gemessen.
109______________________________________________________________________________
110 5 Zusammenfassung______________________________________________________________________________
Die extrazelluläre Quin-2 /AM Konzentration von 10 µM, die bei noch ausreichend
hoher Amplitude des Signals (Fluoreszenzintensität) am wenigsten die untersuch-
ten Ereignisse beeinträchtigt hat, wurde angewandt. Die optimale Dauer des Lade-
verfahrens lag zwischen 15-45 Min.
Die Rate der Serotoninfreisetzung war nach der vorausgegangenen Inku-
bation der RBL-2H3-Zellen mit monoklonalem Antikörper AA4 (Inhibition um 66,4
% bei 100 ng/ml DNP, um 98,04 % bei 10 ng/ml) im Gegensatz zu den RBL-2H3-
m3.7-Zellen inhibiert. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration war
nach der vorausgegangenen Inkubation der RBL-2H3-Zellen mit monoklonalem
Antikörper AA4 (Inhibition um 74,5% bei 100 ng/ml DNP, um 99,9 % bei 10 ng/ml)
im Gegensatz zu den RBL-2H3-m3.7-Zellen inhibiert. Die Inkubation der RBL-
2H3-Zellen in Anwesenheit des polyklonalen Antikörper der IgG1 Klasse (60 µg/
ml) zeigte keine inhibitorische Wirkung weder auf die Serotoninfreisetzung noch
auf den Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration.
Eine Inhibition der FcεRI-vermittelten Serotoninfreisetzung und des FcεRI-
vermittelten Anstieges der intrazellulären Calciumkonzentration durch den anti-
gangliosidären monoklonalen Antikörper AA4 in RBL-2H3-Zellen konnte demon-
striert werden. Eine derartige Inhibition konnte für RBL-2H3-m3.7-Zellen nicht
demonstriert werden, was die Spezifität dieses Prozesses für die FcεRI-vermittel-
te Signalübertragung belegt. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen
lassen eine mögliche regulatorische Funktion des Gangliosids GD1b
auf die FcεRI-
vermittelte Signaltransduktionsereignisse vermuten. Diese Funktion könnte durch
die Assoziation des Gangliosids GD1b
mit der Proteintyrosinkinase p53/56lyn be-
dingt sein.
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Danksagung
Herrn Professor Dr. med. H. G. Lenard danke ich für die Möglichkeit,
diese Arbeit an seiner Klinik durchführen zu dürfen.
Herrn Professor Dr. med. V. Wahn danke ich für die Überlassung des Themas.
Herrn Privatdozent Dr. med. V. Stephan gilt mein besonders herzlicher Dank für
die in freundschaftlicher Atmosphäre erfolgte fachliche Betreuung bei der Pla-
nung, Durchführung und Diskussion der Versuche.
Frau Anette Seibt möchte ich für die geduldige fachliche Einarbeitung und die
jederzeitige Hilfsbereitschaft bei der Bewältigung der auftretenden Probleme
danken.
130 Danksagung______________________________________________________________________________
Lebenslauf
Marius Skasa
27.11.1968 geboren in Falkenberg (Polen)
Sept. 1975-Juni 1983 Grundschule Karthaus (Polen)
Sept. 1983-Juni 1987 Lyzeum Karthaus (Polen)
02.06.1987 Abitur
Okt. 1987-Juni 1989 Vorklinisches Studium der Medizin an der
Medizinischen Akademie in Danzig (Polen)
Okt. 1990-Feb. 1994 Klinisches Studium der Medizin an der
H. Heine Universität in Düsseldorf
Apr. 1995-Feb. 1996 Praktisches Jahr in St. Josef Krankenhaus
in Wuppertal
Juli 1996-Dez. 1997 Arzt im Praktikum in der Medizinischen Klinik
des St. Marien Hospitals in Hamm/Westfalen
02.01.1998 Vollapprobation als Arzt
Okt. 1998-Sept. 2000 wissenschaftlicher Mitarbeiter an der RWTH
in Aachen (Physiologie / Kardiologie)
Okt. 2000-bis dato Assistenzarzt an der Medizinischen Klinik 2
Klinikum Wuppertal
Lebenslauf 131______________________________________________________________________________
132______________________________________________________________________________