grand oral e2m2 – 29-30 juin 2009 ucbl

Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines d’enveloppe F et

HN, impliquées dans le mécanisme d’entrée cellulaire des virus parainfluenza

humains et animaux.

GRAND ORAL E2M2 – 29-30 JUIN 2009UCBL

VIRPATHCNRS FRE 3011

DR MANUEL ROSA-CALATRAVAPR BRUNO LINA

JEAN-CHRISTOPHE LE BAYON

ED 341 – E2M2

2

LES PARAINFLUENZA hPIV2 ET NDV

Famille : Paramyxoviridae Genre : Rubulavirus

Avulavirus

Terr

ier e

t al.

(200

8)

•Maladies respiratoires•Pas d’antiviraux•Virus enveloppé Ø 200nm •ARN négatif, simple brin

L’entrée dans la cellule est possible grâce aux GP F et HN

LA FUSION MEMBRANAIRE

F HN

Viral envelope

Cellular membrane

F1

HN

S

S

F2

C N

NC

Fusion peptide

Cytoplasmic tail

Extracellular domain

Transmembrane region

HR1

HR2

F

Taki

mot

o et

al.

(200

2)

3

4

OBJECTIFS M2

•Caractérisation fonctionnelle de mutants de F de hPIV2 (expression de surface et activité fusogénique)•Mutation observée sur des souches variantes cliniques de hPIV-2 ou transposées d’un variant de PIV-5Méthodes• Analyse bioinformatique de F hPIV2• Clonage des gènes F et HN et mutagénèse• Expression transitoire (cellules A549)• Cytométrie en flux et test de fusion intercellulaire

Rôle de ces mutations dans la fusion et dans l’interaction entre F et HN ?

5

T96A: favorise l’activation par HN

I24P: F “indépendante” de HN

K133E: interaction entre F et HN et augmentation de la fusion

I294A: favorise l’activation par HN

RÉSULTATS DE M2T

ête

Tig

e

I24PI294A

T96A

K133E

2 parties distinctes de la tête de F semblent être impliquées dans l’interaction F-HN

6

→ Caractérisation des interactions fonctionnelles entre F et HN

→ Mieux comprendre le mécanisme d’entrée dans la cellule des virus parainfluenza

→ Développement potentiel de nouvelles molécules anti-virales

OBJECTIFS DE LA THÈSE

PROJET DOCTORAL

7

Interactions fonctionnelles

Évaluation de l’activité

des GP mutantes

Études des interactions

F-HN

Organisation de surface et structure des

GP

Dr Manuel Rosa-Calatrava (CR1 - directeur de thèse)Dr JC Cortay (CR1)Gaëlle Cartet (technicienne)

Pr Bruno Lina (PUPH – directeur du laboratoire)

8

CARACTÉRISATION DE LA FUSION

Méthodes• Expression de GP mutantes (WB, FACS)

• Capacité fusogène des GP (Test de fusion intercellulaire luciférase, lipid-mixing)

• Comportement des mutants dans un contexte pseudo-viral ou viral (VLP et génétique inverse, collaboration avec Dr Dimitri Lavillette – INSERM U758-ENSL)

Résidus impliqués dans le rôle fusogène de F ?

9

ÉTUDE DES INTERACTIONS F/HN

Méthodes• Construction de mutants de déletion des GP

• Interactions entre F et HN (Cross-Linking, coimmunoprécipitation)

→ Domaines de F et HN impliqués dans l’interaction F et HN ?

→ Domaines de F et HN permettant la modulation de l’activité de F ?

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ORGANISATION DE SURFACE ET STRUCTUREMéthodes• Observation et analyse des VLP et virus (MET,

cryoMET, collaboration avec Dr Daniel Thomas – Université Rennes I)

• Analyse in silico des mutations sur la structure des GP (collaboration avec Pr Gary Taylor, Dr Rupert Russell et Dr Olivier Terrier – Université de St Andrews, UK)

→ Corrélation entre l’organisation de surface, la structure et l’activité fonctionnelle des GP ?

PROJET DOCTORAL

11

Interactions fonctionnelles

Évaluation de l’activité

des GP mutantes

Études des interactions

F-HN

Organisation de surface et structure des

GP

Mécanismes d’entrée de PIV

et développement

d’antiviraux

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PROJET PROFESSIONNEL

Objectif doctoral• Élaborer et gérer un projet de recherche

Autres objectifs• Constitution d’un réseau professionnel• Doctorant conseil

Objectif post-doctoral• R&D laboratoire pharmaceutique• Activité de conseil