Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines d’enveloppe F et

HN, impliquées dans le mécanisme d’entrée cellulaire des virus parainfluenza

humains et animaux.

GRAND ORAL E2M2 – 29-30 JUIN 2009UCBL

VIRPATHCNRS FRE 3011

DR MANUEL ROSA-CALATRAVAPR BRUNO LINA

JEAN-CHRISTOPHE LE BAYON

ED 341 – E2M2

2

LES PARAINFLUENZA hPIV2 ET NDV

Famille : Paramyxoviridae Genre : Rubulavirus

Avulavirus

Terr

ier e

t al.

(200

8)

•Maladies respiratoires•Pas d’antiviraux•Virus enveloppé Ø 200nm •ARN négatif, simple brin

L’entrée dans la cellule est possible grâce aux GP F et HN

LA FUSION MEMBRANAIRE

F HN

Viral envelope

Cellular membrane

F1

HN

S

S

F2

C N

NC

Fusion peptide

Cytoplasmic tail

Extracellular domain

Transmembrane region

HR1

HR2

F

Taki

mot

o et

al.

(200

2)

3

4

OBJECTIFS M2

•Caractérisation fonctionnelle de mutants de F de hPIV2 (expression de surface et activité fusogénique)•Mutation observée sur des souches variantes cliniques de hPIV-2 ou transposées d’un variant de PIV-5Méthodes• Analyse bioinformatique de F hPIV2• Clonage des gènes F et HN et mutagénèse• Expression transitoire (cellules A549)• Cytométrie en flux et test de fusion intercellulaire

Rôle de ces mutations dans la fusion et dans l’interaction entre F et HN ?

5

T96A: favorise l’activation par HN

I24P: F “indépendante” de HN

K133E: interaction entre F et HN et augmentation de la fusion

I294A: favorise l’activation par HN

RÉSULTATS DE M2T

ête

Tig

e

I24PI294A

T96A

K133E

2 parties distinctes de la tête de F semblent être impliquées dans l’interaction F-HN

6

→ Caractérisation des interactions fonctionnelles entre F et HN

→ Mieux comprendre le mécanisme d’entrée dans la cellule des virus parainfluenza

→ Développement potentiel de nouvelles molécules anti-virales

OBJECTIFS DE LA THÈSE

PROJET DOCTORAL

7

Interactions fonctionnelles

Évaluation de l’activité

des GP mutantes

Études des interactions

F-HN

Organisation de surface et structure des

GP

Dr Manuel Rosa-Calatrava (CR1 - directeur de thèse)Dr JC Cortay (CR1)Gaëlle Cartet (technicienne)

Pr Bruno Lina (PUPH – directeur du laboratoire)

8

CARACTÉRISATION DE LA FUSION

Méthodes• Expression de GP mutantes (WB, FACS)

• Capacité fusogène des GP (Test de fusion intercellulaire luciférase, lipid-mixing)

• Comportement des mutants dans un contexte pseudo-viral ou viral (VLP et génétique inverse, collaboration avec Dr Dimitri Lavillette – INSERM U758-ENSL)

Résidus impliqués dans le rôle fusogène de F ?

9

ÉTUDE DES INTERACTIONS F/HN

Méthodes• Construction de mutants de déletion des GP

• Interactions entre F et HN (Cross-Linking, coimmunoprécipitation)

→ Domaines de F et HN impliqués dans l’interaction F et HN ?

→ Domaines de F et HN permettant la modulation de l’activité de F ?

10

ORGANISATION DE SURFACE ET STRUCTUREMéthodes• Observation et analyse des VLP et virus (MET,

cryoMET, collaboration avec Dr Daniel Thomas – Université Rennes I)

• Analyse in silico des mutations sur la structure des GP (collaboration avec Pr Gary Taylor, Dr Rupert Russell et Dr Olivier Terrier – Université de St Andrews, UK)

→ Corrélation entre l’organisation de surface, la structure et l’activité fonctionnelle des GP ?

PROJET DOCTORAL

11

Interactions fonctionnelles

Évaluation de l’activité

des GP mutantes

Études des interactions

F-HN

Organisation de surface et structure des

GP

Mécanismes d’entrée de PIV

et développement

d’antiviraux

12

PROJET PROFESSIONNEL

Objectif doctoral• Élaborer et gérer un projet de recherche

Autres objectifs• Constitution d’un réseau professionnel• Doctorant conseil

Objectif post-doctoral• R&D laboratoire pharmaceutique• Activité de conseil