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Génétique des Dyskinésies Ciliaires

Primitives (DCP) :

interprétation des données moléculaires

Marie Legendre

UMR_S933 Inserm & U.F. de Génétique clinique et moléculaire (AP-HP)Serge Amselem

Hôpital Armand Trousseau, Paris

Epidémiologie moléculaireEpidémiologie moléculaire

Stratégie moléculaire de routineStratégie moléculaire de routine

Transmission des résultatsTransmission des résultats

Recherche de nouvelles étiologies moléculairesRecherche de nouvelles étiologies moléculaires

Stratégie diagnostique des DCP

Fréquence de battement ciliaireet/ou vidéomicroscopieBrossage nasal ou biopsie bronchique

Normal

Tableau non évocateur

Arrêt étude

Kartagener ou tableau évocateur

Anormal

Microscopie électroniqueGlutaraldéhyde

Etude génétiqueEDTA, héparinate

Etude complémentaire ARNRNA portect, RNA later

1 : P

héno

type

2 : G

énot

ype

Epidémiologie moléculaireEpidémiologie moléculaire

Bras de Dynéine Externes (BDE)

Phénotype ultrastructural des DCP (%)

30%30%

15% 15%

10%

Bras de Dynéine Externes et Internes (BDE et BDI)

Bras de Dynéine Internes et désorganisation (BDI)

Complexe Central (CC)

DCP à cils « normaux »

Gènes impliqués en pathologie

BDE

BDE et BDI

BDI et liens

CC

DCP cils normaux

DNAI1 Pennarun et al., Am. J. Hum. Genet. 1999

DNAH5 Olbrich et al., Nat. Genet. 2002

DNAI2 Loges et al., Am. J. Hum. Genet. 2008

TXNDC3 Duriez et al., PNAS, 2007

DNAL1 Mazor et al., Am. J. Hum. Genet. 2011

DNAAF1 Duquesnoy et al., Am. J. Hum. Genet. 2009

DNAAF2 Omran et al., Nature, 2008

DNAAF3 Mitchison et al., Nat.Genet. 2012

RPGR Moore et al., J. Med. Genet. 2006

CCDC39 Merveille et al., Nature Genetics, 2011

CCDC40 Becker-Heck et al., Nature Genetics, 2011

RSPH4A Castelman et al., Am. J. Hum. Genet. 2009

RSPH9

DNAH11 Bartoloni et al., PNAS, 2002

Gènes étudiés

BDE

BDE et BDI

BDI et liens

CC

DCP cils normaux

DNAI1 20 exons

DNAH5 79 exons

DNAI2 14 exons

TXNDC3 18 exons

DNAL1 8 exons

DNAAF1 (LRRC50) 12 exonsDNAAF2 (KTU) 3 exonsDNAAF3 (PF22) 12 exons

RPGR 19 exons

CCDC39 20 exons

CCDC40 20 exons

RSPH4A 6 exons

RSPH9 5 exons

DNAH11 82 exons

Séquençage totalSéquençage total Etude indirecteEtude indirecte

Stratégie moléculaire de routineStratégie moléculaire de routine

ADNADN

Rappel sur la structure d’un gène

ARNARN

ProtéineProtéine

11 22 33 44 55 66 77

11 22 33 44 55 66 77Cap AAAAAAAA

Amorces de PCR

Exon Intron

Transcription / Epissage

Traduction

ATG Stop

ATG Stop

PCRPCR

Rappel sur le séquençage

Mutation ? Polymorphisme ? Variant non classé ?

Comparaison à une séquence de référenceComparaison à une séquence de référence

Lecture sens

SéquençageSéquençage

Lecture antisens

InterprétationInterprétation

VariationVariation

Non sens

Frameshift

Délétion

Epissage

Délétère = mutation

Faux sens

Mutation ou polymorphisme ?

Diagnostic de routine

Etudenégative

Etudenégative

Limites

Epissage ?

Description ?

Localisation ?

Conservation ?

Nature ?

Ségrégation ?

Evaluation du caractère délétère d’une variation

Etude de l’ARN, IF, modèles animaux

Homo_sapiens ITILVALRRLHCPRNYVHTQLF

Canis_lupus IAILVALRRLHCPRNYIHTQLF

Mus_musculus IAILVALRRLHCPRNYIHTQLF

Rattus_norvegicus IAILVALRRLHCPRNYIHTQLF

Gallus_gallus VTVLMAFRRLRCPRNYIHIQLF

Danio_rerio VLILLLFRRLHCTRNYIHMQLF

: :*: :***:*.***:* ***

Merveille et al. Nat Genet 2011

Les DCP : des maladies récessives

Allèle paternel

Allèle maternel

M1

M2

M1 M2

Homozygote / Hémizygote

M1

M1 ou

M1

Del

Homozygote Hémizygote

M1 M1

Hétérozygote Hétérozygote

Hétérozygote composite / Allèle complexe

M1

M2 M2

Hétérozygote composite Allèle complexe

M1

M1 M2

ou

Transmission des résultatsTransmission des résultats

Lettre de couverture (synthèse)Lettre de couverture (synthèse)

Le compte rendu

���� médecin prescripteur

���� médecin et patient (confidentialité)Compte rendu détailléCompte rendu détaillé

Choix du gène

Intérêt de l’origine géographique

Régions analysées

Technique

Contrôle

Mutation : délétère

Variation de séquence (non classée) : délétère ?

Polymorphismes : bénin

Référence(s) bibliographique(s)

Interprétation du génotype

Contrôles nécessaires (ADN patient, parents)

Mode de transmission

Nature et conséquence des mutations

Etude(s) complémentaire(s) (ARN brossage)

Limites techniques

Conseil génétique / Devoir d’information

Recherche de nouvelles étiologies moléculaires

Recherche de nouvelles étiologies moléculaires

Approches classiques

Recherche de nouvelles étiologies : approches class iques

Etudes de liaison

Caryotype, puce

Gènes candidats

SyndromiqueSyndromique

Familial et/ou consanguinitéFamilial et/ou consanguinité

Autres casAutres cas

Nouvelles technologies

Recherche de nouvelles étiologies : nouvelles techn ologies

NGS Next Generation DNA -Sequencing

Séquençage ciblé

Exome

Séquençage pangénomique

Exome

Exome : sujets à analyser

Trio (de novo)CI indépendants Etude familiale

Modifié d’après Bamshad et al. Nat Rev Genet 2001

Exome

100 synonymes200 faux-sens2 sites d’épissage5 non sens

1 patient1 patient

100 000 variations100 000 variations

300 non décrites300 non décrites

Limites actuelles des nouvelles technologies

Interprétation des variations

Rendu des résultats

Ethiques

Coût

Stockage

Compétence bioinformatique

Couverture

Erreurs d’assignation

Frameshifts, délétions…

Mutations incluses dans dbSNP

Echec / Gène déjà impliqué…

TechniquesTechniques DiagnostiquesDiagnostiques

Conclusion

Données clinico-biologiquesDonnées clinico-biologiques Données familialesDonnées familiales

� 01 44 73 52 95

serge.amselem@trs.aphp.frestelle.escudier@trs.aphp.frmarie.legendre@trs.aphp.fr

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U.F. de Génétique moléculaire& Inserm U933

Hôpital Armand Trousseau, Paris

Nathalie Collot

Bruno Copin

Florence Dastot

Philippe Duquesnoy

Denise Escalier

Laury Galeron

Ludovic Jeanson

Esther Kott

Frédérique Laury

Guy Montantin

Estelle Escudier

Serge Amselem

Microscopie électroniqueCHIC, Créteil

Issam Abd Alsamad

Anne-Marie Vojtek

Les patientsADCP

Centre de Référence des Maladies Respiratoires Rares

Annick Clement