expression d'une protéine recombinante

Qu’est-ce que c’est une protéine ?

Des molécules biologiques

De faible masse moléculaire

Macromolécules

Acides gras sucres nucléotides Acidesaminés

Protéines Acides nucléiques

polysaccharides

toutes formées d'un squelette carboné

ADN, ARN

AmidonGlycogène

Primaire

Secondaire

Tertiaire

Quaternaire

Acides aminés

Hélice alphaFeuillet bêta

Fonctions des protéines

Structurale Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres.Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sontsecrétées par les cellules le tissu conjonctif comme lesfibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Lecollagène est le composant le plus abondante de la peaules tendons et les os. Le collagène représente le 25% dela masse totale de protéines chez les mammifères.

Fonctions des protéines

Immunitaire Les anticorps

Groupe A

Groupe B

Groupe AB

Groupe O

Globules rouges

Anticorps

AntigènesA B A et B Aucun

AucunAnti-B Anti-A Anti-A Anti-B

Paratope

Fonctions des protéines

Catalytique Les enzymes. Ces protéines ont lapropriété de catalyser ou accélérerles réactions chimiques qui ont lieudans les cellules et dans les milieuxextracellulaires. Si les enzymesn’étaient pas présents, les réactionschimiques se feraient à une vitessesi faible que la vie ne serait paspossible.

Biosynthèse de protéines

Le code génétique universel

Production de protéines thérapeutiquesLa déficit de production de certaines protéinesou la production de certaines protéines nonfonctionnelles dans l’organisme amènefréquemment à des maladies qui peuvent êtregraves.

Ces maladies peuvent parfois être traitées parl'administration clinique de la protéineprovenant de sources externes.

Cependant, de nombreuses protéineshumaines ayant une valeurpharmaceutique importante sontobtenues difficilement à partir de leursource naturelle.

La technologie de protéinesrecombinantes, apparue à la fin desannées 70, offre une plateformetechnique très puissante pour laproduction contrôlée de protéinesd'intérêt par des procéduresrelativement bon marché.

Recombinaison génétiqueLes protéines recombinantes sont desprotéines produites par des cellules dont l'ADNa été modifié par recombinaison génétique.

Un gène codant uneprotéine d'intérêt estintroduit dans le génomede l'espèce productrice.

Les protéines recombinantes peuvent être purifiéeset utilisées à des fins thérapeutiques, industriellesou bien encore dans les activités de recherche.

La recombinaison génétique est un échange d‘information génétique entre deux génomes différents.

Production de protéines recombinantes

Construction d’une molécule recombinante

Plasmide recombinant

Gène de PqsD

Gène de PqsD provenant dePseudomonas aeruginosa

Plasmide d’expression

Notre plasmide d’expression

PqsD

KanOri

pET28

6His

Transformation de notre souche d’expression

E. Coli BL21

Étapes pour la production de notre protéine recombinante

Pré-culture Culture CentrifugerCulot : Cellules

Milieu

Inoculer notre bactérie (souche d’expression) dans 5 ml de milieu LB ou TSB + kan 30 µg/ml

Incuber à 37°C/over night/sous agitation

Inoculer 100 ml de milieu LBavec notre pré-culture defaçon à obtenir une D0600

initiale de 0,05.

Incuber à 37°C/240rpm

Lors qu’une DO600 de 0,6 estatteinte, induire avec 1 mMd’IPTG final

Incuber 2h de plus

Collecter les cellules parcentrifugation à 7000rpm/15min/4°C

Laver le culot cellulaire avec70ml de tampon de lavage.

Recollecter les cellules parcentrifugation à 7000rpm/15min/4°C

Garder le culot cellulaire à-20°C jusqu'au jour de lalyse.

Culot : Cellules Lyse cellulaire

Fraction Cytoplasmique (surnageant)Fraction

Membranaire (culot)

Séparation de fractions cellulaires

Étapes pour la purification de notre protéine recombinante

Lyse: Resuspendre le culot cellulairecongelé à 20°C dans 6ml de tamponde lyse Bugbuster®.

Vortexer pour détacher le culot desparois du tube en plastique.

Incuber sous agitation douce àtempérature pièce pendant 20minutes.

Séparation des fractions cellulaires:Centrifuger à 20000xg/30min/4°Cpour décanter la fractionmembranaire.

Diluer le surnageant obtenu avec 6ml de tampon d’imidazole 10mM.

Filtrer avec un filtre de 0,2µm pouréliminer les débris cellulaires ensuspension.

Étant donné que notre protéinerecombinante se trouve solubledans le cytoplasme, on purifieradonc notre protéine à partir decette fraction.

Chromatographie d’absorption ou d’affinité

Les chromatographies d'adsorption est un méthode de séparation où lamolécule d'intérêt d'un mélange complexe est isolée des autres constituantsparce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait lachromatographie.

FPLC Fast protein liquidchromatography

Beaucoup d’affinité

Peu d’affinité

Mélange complexe

Élimination de protéines non-spécifiques du mélange

Élution de la protéine d’intérêt pure

Étapes de la chromatographie d’affinité

1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml del’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminerl’éthanol qui est présente dans la colonne.

2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’unesolution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min.

3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.

Imidazole

5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solutiond’imidazole 10mM pour éliminer les protéines nonspécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant7,5 minutes.

6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant ungradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit2ml/min pendant 50 minutes.

Fractions d’élution collectées de 2ml

Étape d’élution. Concentration croissante

d’imidazole (Gradient)

Imidazole 250mM

Étape d’injection et lavage. Concentration constante

d’imidazole (10mM)

Collecte le volume mort

Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE

L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.

On fait bouillir un mélange de protéines en présence :

•d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanolqui réduit les ponts disulfure.

•d'un détergent anionique fort : le SDS qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives.

Ces charges se repoussent et déplient les chaînes polypeptidiques.

En conséquence : •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native

•les protéines n'ont plus de ponts disulfure : elles sont sous une forme monomérique

Électrophorèse SDS-PAGE

Fractions à analyser:Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, contrôle positif.

Préparation des échantillons:Volume de fraction: 80µlVolume de loading buffer (5x) 20µlVolume final: 100µl

Chauffer l’échantillon préparé à95°C/5min.

Déposer entre 60 à 80µl dans les puits.

Migrer à 70 volts/over night

Lorsque le gel aura migré complètement,colorer à l’argent

Vérifier le présence d’une bandecorrespondant à notre protéine d’intérêt.

Direction de l’électrophorèse