analyse de l’expression de proteines d’adhesion d’osteoblastes et de fibroblastes cultives sur...

ANALYSE DE L’EXPRESSION ANALYSE DE L’EXPRESSION

DE PROTEINES D’ADHESION DE PROTEINES D’ADHESION

D’OSTEOBLASTES ET DE FIBROBLASTES D’OSTEOBLASTES ET DE FIBROBLASTES

CULTIVES SUR DU NITI DE 2 RUGOSITES CULTIVES SUR DU NITI DE 2 RUGOSITES

DIFFERENTESDIFFERENTES

http://leibo.univ-lyon1.fr

C. WIRTH, C. LAGNEAU, A.M. FREYRIA, D. DECORET, P. EXBRAYAT, M. LISSAC

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Le contexte buccalLe contexte buccal

Matériaux

???

BiofilmTissus

Cellules épithéliales

Cellules fibroblastiques

Cellules ostéoblastiques

Matériaux métalliques

Céramiques

Polymères

S. mutans

Actinomyces

Lactobacillu

s

??? ???

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

NiTi poli-miroir(NiTi 2400)

NiTi rugueux(NiTi 400)

Matériaux implantaires :Matériaux implantaires :

Ticp, Ti6Al4V, NiTi ?

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Ra ≈ 0.07, ≈ 0.15 µm

Dans notre étude, 2 états de surface :

C. WIRTH, V. COMTE, C. LAGNEAU, P. EXBRAYAT, M.LISSAC, N. JAFFREZIC, L. PONSONNET. Nitinol surface roughness modulates in vitro cell response: a comparison between fibroblasts and osteoblasts. Materials Science and Engineering C 2005, 25 : 51-60.

Types cellulaires Types cellulaires étudiés: étudiés: Cellules ostéoblastiques de calvaria de rat

obtenues par digestion enzymatique

Cellules fibroblastiques de gencives humaines par technique des explants

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

immunomarquage biochimie (SDS-PAGE, Western Blot) biologie moléculaire (extraction ARN, RT-PCR)

Techniques Techniques utilisées :utilisées :

• collagène de type I• fibronectine • ostéocalcine• ostéopontine • ostéonectine

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

noyau

substrat

membrane cellulaire

protéine adhésive de la MEC

intégrines

complexe d’adhérence

cytosquelette

Protéines étudiées :Protéines étudiées :

Protéines adhésives de la MEC

Protéines spécifiques des ostéoblastes

Réaction d’amplification en chaîne = Réaction d’amplification en chaîne = PCR PCR

5’

5’3’

3’

Séquence cible : ADN à amplifier

Amorces Taq Polymérase

Pol

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Premier cycle

Étape 1 : DÉNATURATION

: 95°C

: 45 s

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

5’ 3’

5’3’

5’ 3’

5’3’

: Tm

: 1 min

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Étape 2 : HYBRIDATION

5’ 3’

5’3’

Pol

Pol

: 72°C

: 1 min

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Étape 3 : POLYMÉRISATION

5’3’

5’ 3’

: 72°C

: 1 min

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Pol

Pol

Étape 3 : POLYMÉRISATION

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

1er cycle 2ème cycle 3ème cycle 4ème cycle

GAPDH(450pb)

Collagène de type I(352pb)

Fibronectine(442pb)

1000 pb

100

200

300400500ARN extraits de fibroblastes

humains cultivés sur du NiTi poli-miroir et rugueux

ARN extraits d’ostéoblastes de rat cultivés sur du

NiTi poli-miroir et rugueux

1000 pb

100

200300400500

GAPDH(393pb)

Collagène de type I(557pb)

Fibronectine

(351pb)

Résultats des électrophorèsesRésultats des électrophorèses22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

Pas d’influence de la rugosité de surface sur la synthèse du collagène de type I et de la fibronectine par les ostéoblastes et les fibroblastes

400 2400 400 2400 400 2400

400 2400 400 2400 400 2400

22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy

ARN extraits d’ostéoblastes de rat cultivés sur du

NiTi poli-miroir et rugueux

OP(688pb)

ON(650pb)

OC(760pb)

1000 pb

100

200

300

400500

OP : ostéopontine ON : ostéonectineOC : ostéocalcine

L’expression de l’ostéocalcine est favorisée par un état de surface poli-miroir

Résultats des électrophorèsesRésultats des électrophorèses

400 2400 400 2400 400 2400

Intensité de la bande plus importante sur le NiTi poli-miroir que le NiTi rugueux

Conclusion & PerspectivesConclusion & Perspectives

Étude de la synthèse d’autres protéines comme des intégrines, des cytoxines, des facteurs de croissance, des marqueurs d’apoptose par biologie moléculaire

NiTi avec Ra=0.07µm bon compromis pour obtenir un comportement optimum des ostéoblastes et des fibroblastes