agrégats moléculaires, villetaneuse, 24, 25 octobre 2001 dissociation en phase gazeuse de...
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Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Dissociation en phase gazeuse de complexes non-Dissociation en phase gazeuse de complexes non-covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance covalents: un outil pour l'étude de la reconnaissance
moléculaire. moléculaire. Réalités et espoirs.Réalités et espoirs.
Valérie Gabelica, Frédéric Rosu, Nives Galic, Edwin De PauwUniversité de Liège (Belgique)
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Les interactions non covalentesLes interactions non covalentes
+ +
Ponts salinsLiaisons HydrogèneDipole-DipoleDipole-Dipole induit
Interactions« hydrophobes »
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Comment produire ces espèces « fragiles » en phase Comment produire ces espèces « fragiles » en phase gazeusegazeuse
1/T
Ln k Désorption d’ions
Décomposition
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Les sources d’ions: la source MALDILes sources d’ions: la source MALDI
QuickTime™ et un décompresseurGIF sont requis pour visualiser
cette image.
From Leonid V. Zhigilei web site
From Finnigan
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Source Electrospray
Concentration: 10-6 – 10-3 MSolvent: H2O (+ MeOH, CH3CN)
Cone de Taylor
Les sources d’ions: l’électrosprayLes sources d’ions: l’électrospray
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Manipulation des ionsManipulation des ions
Activation par collisions MS/MS
MS2MS1
Régimes d’activation: haute énergie: keV (secteurs)Basse énergie: quadrupôlesSlow heating: pièges à ions!!! Source CID!!!
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
(AB)+
E0(2)
Er
E0(1)Einternal
Reaction coordinate
A+ + B
[Ligand + Substrat] Ligand + Substrat
[E(A+) + E(B)] – E(AB+) = E0 - Er
On mesure la STABILITE CINETIQUE ou LABILITE
Les dissociations unimoléculairesLes dissociations unimoléculaires
kuni
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
k(E ) G‡ (E E0)
hN (E )
k(E ) s E E0
E
DOF 1
RRKM
RRK
• Les calculs sont difficiles pour les systèmes à grand nombre de degrés de liberté• Peut-on toujours appliquer les modèles statistiques ?• Comment obtenir la distribution d’énergie interne ?• L’activation collisionnelle des systèmes à grand nombre d’atomes est mal connue
Constantes de vitesse statistiquesConstantes de vitesse statistiques
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Les spectromètres de masse Les spectromètres de masse Le QTOF (MSLe QTOF (MS22))
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Temps d’activation: 3 ms to 10 s
Les spectromètres de masseLes spectromètres de masseLe piège à ions (MSLe piège à ions (MSnn))
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
ExemplesExemples
• Duplexes DNA
• Complexes Duplexes-Ligands
• Complexes cyclodextrine-ligands
• Complexes Proteine(s)-Proteine(s)
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Les duplexes ADNLes duplexes ADN
NN
O
O
Sugar
CH3
H NN
N
NSugar
NH
H
Major groove
Minor groove
NN
O
N
Sugar
HH
NN
N
NSugar
H
O
NHH
Major groove
Minor groove
T A
C G
On peut calculer l’énergie d’interaction sur base d’un modèles de proches voisins:nombre de liaisons H
CG:3 AT:2 stacking
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
L’évolution des duplexes DNAL’évolution des duplexes DNA
• Dissociation
• Fragmentations B B
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Les duplexes DNA et leurs complexesLes duplexes DNA et leurs complexes
OH
NHN
NH N
N
NH+
N
NH
NHO
N
NH O
NH2NH2
NH
NH2
NH2
O
N
NH
NHO
N
NH O
NH2
NH2
O
NNH
O
+ +
+
NH
NH2NH2
NH2NH2
+
+
NHN
N
NH2NH2
NH2NH2
+
+
Netropsin (432)
Distamycin A (481)
Hoechst 33258 (425)
DAPI(278)
Berenil (281)
N+
NH2
NH2 C2H5
Br
N
NH
NH
SCH3
O O
N
N
N
O
Ethidium Bromide (314 + 79)
Amsacrine (363)
Ascididemin (286)
Ligands du petit sillon
Intercalants
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
quadrupole (t 1-10 µs)
piège à ions (t = 30 ms)
Duplex: d(CGCGAATTCGCG)2
Les duplexes DNA: dissociation ou fragmentation ?Les duplexes DNA: dissociation ou fragmentation ?
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Comparaison entre duplexes d’énergie d’interaction Comparaison entre duplexes d’énergie d’interaction croissantecroissante
Sequence % of CGbasepairs
A d(5’-CGTAAATTTACG-3’)2 33 %
B d(5’-CGCGAATTCGCG-3’)2 67 %
C d(5’-CGCGGGCCCGCG-3’)2 100 %
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Compétition dissociation-fragmentationCompétition dissociation-fragmentation
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Origine de l’influence du régime de collisionsOrigine de l’influence du régime de collisions
Chauffage lent
Activation rapide
S
- ++ -
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Maintien de la structure en double hélice en phase Maintien de la structure en double hélice en phase gazeusegazeuse
5’-AAATCGCGGCGCTAAA-3’ 3’-TTTAGCGCCGCGATTT-5’
Hn-n = -136.8 kcal mol-1
5’-GGGCTATAATATCGGG-3’ 3’-CCCGATATTATAGCCC-5’
Hn-n = -125.3 kcal mol-1
5’-AGACTGTGAGTCAGTG-3’ 3’-TCTGACACTCAGTCAC-5’
Hn-n = -122.6 kcal mol-1
5’-GGGCTTTTAAAACGGG-3’ 3’-CCCGAAAATTTTGCCC-5’
Hn-n = -135.9 kcal mol-1
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Minor groove bindersComplexes Duplexes-droguesComplexes Duplexes-drogues
OH
NHN
NH N
N
NH
NNH
NHO
N
NH O
NH2NH2
NH
NH2
NH2
O
N
NH
NHO
N
NH O
NH2
NH2
O
NNH
O
Netropsin Distamycin AHoechst 33258
ligands du petit sillon
1:1 complex 2:1 complex
ou
Intercalation « random » entre les paires de bases
Intercalatants
N+
NH2
NH2 C2H5
N
NH
NH
SCH3
O O
N
NN
O
Ethidium Amsacrine Ascididemin
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
•Complexes5- avec ligands du petit sillon
•Complexes5- avec intercalants
(GC+H)5-
C2-G3- Hoechst (NR3H+)30 eV
1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0
100
%
(GC+N)5-
C2-(G+N)3- Netropsin (NR4
+)30 eV
1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0
100
%(GC+A)5-(GC)5-
Amsacrine(neutral )12 eV
1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900m/z0
100
%
Ethidium(NR4
+)25 eV
(GC+E)5-G3-
C3- (G+E)3-C2-
(C+E)2-
MS/MS pour la détermination rapide du mode de MS/MS pour la détermination rapide du mode de complexationcomplexation
1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z0
100
%
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Changement de conformation Contribution entropique et enthalpique
(contribution à H >0, S > 0)Transfert hydrophobe Contribution entropique (S < 0)Création de liaisons intermoleculairesEffet enthalpique (H < 0)
Contribution de l’intercalation à l’énergie libre Contribution de l’intercalation à l’énergie libre de liaisonde liaison
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Daunorubicin (R = H) Doxorubicin (R = OH)
ds+D5-
ds+D5-
ds5-
ds5-
R = OH
R = H
Stabilité cinétique relative des intercalants (1)Stabilité cinétique relative des intercalants (1)
O
O
OH
OH
OH
O
O
CH2R
O
OMe
NH2OH
CH3
Spectres MS/MS dans des conditions identiques
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Intercalants: intercalation « random »Stabilité cinétique relative des intercalants (2)Stabilité cinétique relative des intercalants (2)
NH
N
CH3+
NH
N
CH3
+
Cryptolepine
Neocryptolepine
ds+C5-
ds+NeoC5-
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Comportement en solutionComportement en solution
• Titrages, mesure des constantes de stabilité ou expériences de compétition
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Spécificité des complexes en solutionSpécificité des complexes en solutionvsvs
stabilité cinétique en phase gazeusestabilité cinétique en phase gazeuse
(ds+C)5-
(ds)5-
(ds)4-
(ds+2C)5-
(ds)5-
(ds+neoC)5- (ds+neoC)4-
(ds+C)4-
(ds)4-
(ds+2C)4-
En solution: ESI full scan
duplex5-
(duplex+C)5-
(duplex+neoC)5-
duplex5-
En phase gazeuse MS/MS
I (com
plex
)/I
(dup
lex)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4Cryptolepine
Neocryptolepine
33% 66% 100% 33% 66% 100%
Specificité de séquence
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Détermination de la cible biologiqueDétermination de la cible biologique
(FP+neoC)+
(FP)+
(FP)+
(FP-O-FP)+
(FP-O-FP+ C)+
(FP-FP+neoC)+
(FP-O-FP)+
(FP-FP)+
Complexe hème-cryptolepine
Complexe hème-neocryptolepine.
Le mode de fixation est différent
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Interactions hydrophobes fortes dans l’eauPlus longues sont les chaînes, plus forts les complexes
L’électrospray peut-il produire des complexes spécifiques?
n K Calorimetry(M-1)
Complex in MS
4 no complex Yes5 24 1 Yes6 93 1 Yes7 629 21 Yes8 1786 83 Yes
10 Yes12 Yes
COO–
CH2 n
COO–
Conformation in solution
Les complexes de cyclodextrinesLes complexes de cyclodextrines
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
n(CH2)
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Co
ll.
En
. 5
0 %
23.0
23.5
24.0
24.5
25.0
n(CH2)
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Co
ll. E
n. 5
0 %
10.5
11.0
11.5
12.0
12.5
13.0
Complexes 2-
L’information reste-elle spécifique en phase gazeuse L’information reste-elle spécifique en phase gazeuse ??
Complexes 1-
n = 7
Taux de survie
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Influence de la forme des ionsInfluence de la forme des ions
From Clemmer’s web site
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Exemples de fragmentation Exemples de fragmentation « shape dependant »« shape dependant »
Résultats du groupe de D. Clemmer
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Energ
ie
1-mer 7-mer 14-mer
Nombreuses applications aux complexes multiproteines
Deduction de la symétrie des complexes: GroEL
Topologie des complexes par MS/MSTopologie des complexes par MS/MS
(C. Robinson, Current opinion in biology, 1999)
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
Hot topicsHot topics
• Mesures de vitesse d ’échange H/D (S.R. Kass, JASMS, sous presee)
• ECD et analyse du maintien des liaisons non covalentes durant la fragmentation
(R. Zubarev Rapid Comm. Mass Spectrom. 2001; 15 (19) : 1849-1854.)
• Dissociation avec répartition inégale des charges (J.S. Klassen, Anal. Chem, 2001, 73, 4647-4661)
Agrégats moléculaires, Villetaneuse, 24, 25 octobre 2001
o De la conformation des ions produitso De l’énergie transférée lors des collisions (source CID ou
MS/MS)o Des déplacements cinétiques qui peuvent être importants o De la contribution entropique o De la validité des théories statistiques
La spectrométrie de masse et la MS/MS sont utilisées dans le cas de complexes de plus en plus « gros » . Si, dans les cas favorables, les complexes semblent transportés « intacts » et de manière quantitative en phase gazeuse (MS simple), on ne connaît quasi rien:
Conclusions: nouvelles questionsConclusions: nouvelles questions
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