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Accréditation N’oubliez pas les ANAEROBIESces inconnus maltraités
C. Neut, L. DubreuilUniversité de Lille II, France
Quand faut-il rechercher les anaérobies ?
Nécessité ou non de milieux de transport
Milieux d’isolement – type d’anaérobiose
Identifier comment, jusqu’à quel niveau ?
Quel méthode pour l’antibiogramme?
Souches de référence
Quels antibiotiques faut-il tester et durée d’incubation ?
Retrospective study of anaerobic bacteremia
Salonen CID 1998 26:1413
Blood cultures positive for anaerobes 81 patients
Clinically significant bacteremia57 patients
Clinically insignificant bacteremia24 patients
Initial tt effective 49%
Initial tt ineffective Changed to effective 32%
Initial tt ineffective Not changed 19%
5% died
17% died
55% died
QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?
QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?
Mauvaise odeur de l’échantillon (souvent tardif)Présence de gaz dans une lésion,
Formation d’abcès, gangrène, nécrose de tissuInfections chroniques
Foyers proches des muqueuses[dentaires, orofaciales, abdominales, gynécologiques (sauf MST)]
Infections secondaires à des morsures humaines ou animales
QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?
QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?
Infections tumorales (bronchiques, coliques et utérins)
Infections où les anaérobies sont toujours en cause : dentaires,péritonites, infections post-chirurgicales abdominales pneumonies d ’aspiration, otites et sinusites chroniquesinfections des extrémités chez le diabétique)
QUAND FAUT-IL RECHERCHER LES ANAEROBIES ?
Coloration noire du pus ou fluorescence rouge du prélèvementPrésence d ’un pus ou grain de soufre (Actinomyces)
A l’examen direct présencede leucocytes altérés et flore très abondante polymorphe
de formes caractéristiques d’anaérobies Fusobacterium, ClostridiumCulture stérile ou isolement d ’un seul germe sans rapport avec l ’aspect polymorphe de l ’examen direct.Selle stérile
Clostridium tetani
Actinomyces israelii
Infections intra-abdominalesInfections intra-abdominales
Bactéries IB AH P A
B. fragilis +++ +++ +++2 +++Prevotella ++ ++ ++ ++Fusobacterium ++ ++1 ++ ++Clostridium +++ +++ +++ +++Eubacterium + + + +Peptostreptococus ++++ +++ +++ +++
Espèces associées spécifiquement : 1 F. necrophorum ; 2 Bilophila wadsworthia
IB = infections biliaires, AH = abcès hépatique, P = péritonites, A = appendicites
Infections en O.R.L.Infections en O.R.L.
Bactéries SC OC ID ALVB. fragilis + +Prevotella +++ +++ +++ ++Porphyromonas ++ ++ +++ +Fusobacterium +++ +++ +++ 1 ++++Clostridium + + +Eubacterium + + + +Peptostreptococus ++++ +++ +++ +++
Espèces associées spécifiquement : 1 F. necrophorum + spirochètes; 2 P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus + E. corrodens, Capnocytophaga, S. milleri
SC = sinusites chroniques, OC = otites chroniques, ID = dentaires, A LV= angines
Infections de la peau et des tissus mousInfections de la peau et des tissus mous
Bactéries UD AR MH MA ASB. fragilis +++ +++Prevotella + + +++ +++ ++1Porphyromonas + + +++ +++ +++Fusobacterium + + +++ +++ +++Clostridium + +++ ++2Peptostreptococus ++ ++ +++ ++ +++
Espèces associées spécifiquement : 1 B. ureolyticus; 2 C. perfringens et C. tetani, + E. corrodens, Capnocytophaga, Pasteurella
UD = ulcère de décubitus, AR = abcès rectal,escarre, MH et MA = morsures humaines ou animales, AS= abcès du sein
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Recherche et identification
Il est donc possible • - de prévoir les espèces qui seront isolées selon la
pathologie • - de selectionner les bactéries qui doivent être
identifiées et leur sensibilité aux antibiotiques déterminée.
• NB hémocultures , LCR, biopsies cérébrales, osseuses > toutes bactéries
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Don Whitley AES
Ruskinn
Rechercher simplement des bactéries anaérobies
Le prélèvement– Éviter l’écouvillon– Utiliser un cryotube contenant 1,5 mL d’un milieu de
transport réduit et introduire à la seringue quelques microlitres du prélèvement
• Un tube déjà rempli réduit la quantité d’air• Le réducteur favorise la survie• Ne pas conserver au froid
Le transport
• Le plus rapidement possible• Mais: survie des bactéries anaérobies jusque
24h dans le milieu de transport sans changement important des proportions bactériennes
Les milieux réduits
• Milieux pré-réduits prêt à l’emploi• « Régénération » des milieux liquides juste
avant l’ensemencement• Stockage de quelques géloses en sachet
anaérobie au froid jusqu’à l’emploi
Les milieux de culture
• Gélose avec 5% de sang:– Gélose Columbia– Gélose Wilkins-Chalgren– Gélose Brucella
• Préparer juste avant l’emploi ou stocker au froid en anaérobiose
L’ensemencement
L’incubation
• En chambre anaérobie• En jarre• En sachet individuel (jusque 4 boites)
– Avantages: observation des boites possibles sans casser l’anaérobiose
Observation après culture
Vérification du type respiratoire
• Ensemencer un tube de Veillon• La culture anaérobie est passée en milieu
liquide paraffiné (milieu de Rosenow ou autre milieu liquide de préférence avec l’indicateur d’Andrade)
Aspect de la culture en milieu liquide
1- Tube rose, faible production de gaz:Gram: petit bac Gram-:forte présomption de Bacteroides
ou Prevotella2- Tube jaune, avec ou sans production de
gaz: Gram: cocci Gram+bac Gram- (Fusobacterium)bac Gram+ (Clostridium)
Identification phénotypique
• Difficile sauf pour Bacteroides
• Très facile et fiable par spectrométrie de masse
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Sensibilité aux antibiotiques• Lister les résistances naturelles• Choisir antibiotiques standard :Amox; amox+ clavu,
pip-taz, imipenem, clinda, metro, vanco• Si abcès cérébral ou os
Levofloxacine et rifampicineSi multirésistance
Linézolide, moxifloxacine, tigécycline, chloramphénicolIncuber 48h et relire le métronidazole à 5 jours
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Sensibilité aux antibiotiques
• Ajouter des règles négatives1- ne pas tester la céfoxitine (B. fragilis)2- ne pas rechercher les ß-lactamases sur B. fragilis3- Souche plus sensible à amox+ clavu /amox ne signifie pas production de ß-lactamaseß-lactamase des Prevotella préférer E test amox
Résistance naturelle des anaérobiesRésistance naturelle des anaérobies
Résistance naturelle:
triméthoprime, aztréonam, fosfomycine (sauf Fusobacterium)
acide nalidixique et quinolones classiques
aminoglycosides (kanamycine 75 mg/l, néomycine 20mg/L)
en fonction des espèces
métronidazole : Propionibactéries et Actinomyces
rifampicine : F. necrophorum et F. mortiferum
céphalosporines : C. difficile
vancomycine : C. innocuum
Taux de résistance à la clindamycine de 1977 à 2008
1
8 1013
1612 13
2329 28
33 3238
35
05
10
1520253035
40
1977 1985 1989 1993 1997 2000 2006
Résistance à la clindamycine 2006
Bacteroides fragilis 39%
Fusobacterium 11% (F. necrophorum)
C. difficile 72%
Autres clostridia 46%
P. acnes 25%
Peptostreptococcus sp 25% ( Finegoldia magna)
Ensemble des anaérobies 30,8%
Clostridium autres que C. perfringens et C. difficile
ßlactamase produite par : C. butyricum,
C. clostridioforme, C. ramosum
Résistance naturelle : vancomycine (C. innocuum)
C. innocuum intrinsic resistance to vancomycinC. innocuum intrinsic resistance to vancomycin
Mory, Dubreuil, Leclercq JCM 1998
For most clostridia MIC Vancomycin 0.5-2 mg/L range
C. innocuum 28 strains
Vanco MIC 8-16 mg/L MIC90 16mg/L
Teicoplanin MIC 0.25-1mg/L MIC90 0.5 mg/L
Inhibition zone diameter 14-16mm but 46% > 17 mm
Resistance among clostridia of the RIC group
Low-level intrinsic resistance :
C. ramosum : vancomycin, linezolid, daptomycin
C. innocuum : vancomycin daptomycin
C. clostridioforme: teicoplanine, daptomycin, ramoplanin
Les mousquetaires anaérobiesdes infections pulmonaires et O.R.L
Prevotella et Porphyromonas
Prevotella non pigmentéesP. oris, P. buccae, B. buccalis, P. veroralis
P. bivia, B. disiens
Prevotella pigmentéesP. melaninogenica, P. intermedia, P.corporis, P. denticola
Porphyromonas
P. gingivalis, P. endodontalis, P. asaccharolytica
Role of ß-lactamases from gram neg anaerobesRole of ß-lactamases from gram neg anaerobes
Nord-Brook
ß-lactamases excreted by Prevotella or Fusobacterium caused clinical failures when patients were treated by penicillins
otitis - sinusitis-dental abcess-lung abcess-recurrent tonsillitis
0
5
10
15
20
25
0.01 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256
Distribution des CMI de l ’amoxicillineen fonction de la production de ß-lactamase
Nb de souches
mg/l
Prevotella
Sensibilité des Fusobacterium
1990-1993 : 336 souches 4,7% des souches ß-lac+
Résistance naturelle : macrolides bas niveau
Sensibilité : pénicillines (si ß-lactamase -) ,
pénicillines + inhibiteurs (si ß-lactamase +),
streptogramines, métronidazole
Résistance acquise : clindamycine
F. necrophorum bithérapie ?
Sensibilité aux FQ des Prevotella et Fusobacterium
Antibiotique Prevotella FusobacteriumCMI 50% 90% 50% 90%
Ciprofloxacine 1 4 2 4Ofloxacine 2 8 1 4Lévofloxacine 2 4 1 2
Moxifloxacine 0,12 0,5 0,12 1
Bacteroides du groupe fragilis
Bacteroides et Parabacteroides
B. fragilis, B. thetaiotaomicronP.distasonis, P. merdae
B. caccae, B. ovatus, B. vulgatusB. uniformis, B. stercoris
B. eggerthii,B.intestinalis, B. nordii, B. salyersaeB. caccae, B. coprocla,B. dorei, B. finegoldii,
P. johnsonii, B. massiliensis,B. plebeius
Phénotypes de résistance parmi les souches de B. fragilis imipénème sensibles
Antibiotique type hyperproduction de ßlactamase ou/et absence sauvage de porine ou carbapénèmase silencieuse
(80) (10) (6) (2) (1)
Ticarcilline S R R R R
Coamoxyclav S S S/I I/R R
Ticar+ clavu S S S S I/R
Pipéra+tazo S S S S I
Imipenem resistance : B. fragilis
MIC in mg/l
imipenem 128
cefoxitin 128
piperacillin >128
carbapenemase : metalloenzyme, zinc dependant
inhibited by EDTA, not by clavulanic acid.
Règle de lecture interprétative : toute souche imipenem R est résistante à toutes les ß-lactamines
Taux de résistance à l ’imipénème de 1984 to 2008
0
1
21,5
4
1
2,6
0,8 0,8
000,5
11,5
22,5
33,5
4
1984 1988 1994 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2008
AMX TIC PIP
CEF FOX CTT
AMC TCC PTZ
CTX IMP
ERY
TE
MTR
CM
C
AMX TIC PIP
CFT CFX CTT
AMC TCC PTZ
CTX IMP MTZ
ERY CLN
TE CM
B. fragilis metronidazole-R
Disk diffusion test
difficult to apply for slow growing organisms
May indicate :
B. fragilis High resistance level to clindamycin (MIC >128 mg/l)
carbapenemase production
metronidazole resistance (to be confirm by E test)
Clostridia, Prevotella and Fusobacterium ß-lactamase production
(to be confirm by E test : MIC ≥ 0.38 mg/l)
MIC in agar dilution ≥0.5 mg/l
Peptostreptococcus High resistance level to clindamycin
E test and anerobesE test and anerobes
reading at 24h 64% of strains including 77% of B. fragilis group48h 95% 100%
Agreement with agar reference method (+1log ) 85%Major discrepancies 1.7%, very major discrepancies 1.7%
very major errors 16.6% (24h) 2.5% B. fragilis (48h)37.5% 0 % Clostridia
tendancy to lower MIC if Mc farland 0.5E test 100µl on a 150mm Petri dish = 6,000 CFU/mm2
Steers replicator 2mm2 / spot = 40,000 CFU/mm2
Amoxicillin-clavulanate resistance rates from 1985 to 2008
01
54
75,6
6,6
4 4,3 4,35,5
14,2
02
468
10
121416
1984 1992 1994 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2008
B. fragilis S or Intermediate to metronidazole
H. Marchandin et al.
Detection of nim genes by PCR in :
• 7 isolates of the Bacteroides fragilis grouplocalization MIC geneSigmoid abcess 64 nimA (x2)Pancreas fluid 16 nimA (x2)Blood 4 nimBPus (sacrum) 4 nimEPus (intra-abdominal) 4 nimDAscitic fluid 8 nimDPeritoneal fluid 4 nimB
• 1 isolate of Veillonella sp.Sacrum scab 4 nimE
Results (2)
1 5 40 28 27 26 25 24 22 21 20 19 18 17 16 T- M T- 23 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 7 39 14 15
458
pb
Detection of nim genes by PCR
PCR + 7 Bacteroides fragilis group1 Veillonella sp.
Metronidazole resistance in France
French resistant strains MTZ-R
1 Prevotella buccae and 3 strains of P. loescheii CMI = 16 mg/L
1 B. fragilis MIC = 64 mg/L
H. Marchandin et al. Anaerobes 2002;8:137
Veillonella nim E in a metronidazole-susceptible Veillonella sp. strain MIC = 4 mg/L
H. Marchandin, Dubreuil, AAC 2004 48:3207
Metronidazole resistance
B. fragilis & B. ovatus from appendicetomy MIC >32 mg/l : failure in Koweit
Rotimi et al. Clin Microbiol Infect 1999 ; 5:166-169
B. fragilis MIC =256 in New Delhi with clinical failureChauldry, Emerging Infect Dis 2001,7,485-486
B. fragilis MIC >32 mg/L in SeattleShapiro et al. J Clin Microbiol 2004 ;42:4127-4129
B. fragilis in Hungary (Nagy et al.), Poland (Wojcik)
Prevotella loescheii MIC 12 mg/L subdural empyema
in Cardiff Sandoe JAC 2001;47:366-367.
Metronidazole resistance
C. difficile MIC =16 mg/L in Hong Kong, Madrid and CardiffWong et al.Diagn Microbiol Infect Dis 1999 ;34:1-6
Pelaez AAC 2002,46:1647-1650 Brazier et al. JAC 2001;48:471-472
Equine isolates in Sacramento MIC = 32 mg/lJang et al. Clin Infect Dis 1997, S2�66-267
Finegoldia magna MIC >128 mg/L Cape TownTheron et al. JAC 2004; 54 :240-242
C. perfringens in Edinburgh MIC >32 mg/L Faris et al. J Infect 1999,2:164-165.
Anaerobes & E-test ou MICE in routine
inoculation McFarland 1 in brucella broth (or Schaedler)
agar medium Brucella+blood 5% + vitK1 + supplements or MH-F
drying 10mn
incubation in anaerobiosis as soon as possible
reading after 24 or 48h of incubation
48h if clindamycin
E -test vs ATB ANA bioMérieux
E test* ATB ANA**
% McFarland 1,48h CA-SFM NCCLS
Agreement 95.1 94.3 94.4
Minor discrepancies 3.8 4.8 3.8
Major errors 0.5 0.3 0.7
Verymajor errors 0.6 0.6 0.6
Preference for CA-SFM metronidazole,amoxicillin and Gram+
NCCLS amoxicillin and gram negative
*Pierrard **Dubreuil
Metronidazole hetero-resistance in C. difficile
• Detection 9/73 patients
Disk diffusion (5µg) after 5 days of incubation
• Susceptible: 28 -30 mm• Resistant: 10-22 mm or no zone of inhibition,• Squatter colonies inside the inhibition zone after 5 days of incubation• Nearly same results using freshly isolated strains and E test strips after
a 5 days incubation period
Pelaez et al.; J Clin Microbiol 2008, 46:3028
Metronidazole hetero-resistance clinical impact ?
• Relapses in patients treated with metronidazole :
• Heteroresistant strains 44% (4/9)• Susceptible strains 15.6% (10/64)
» P=0.06
» Sanchez-Somolinos et al., Clin Inf Dis 2008 47:818
Clinical failure linked to heteroresistanceamong anaerobes
• B. fragilis • Prevotella and metronidazole• Eggerthella lenta and imipenem
• Initial empiric treatment failed anaerobe alone in all blood cultures +
• susceptible strains at 48h heteroresistance
• anaerobic infection cured by an adequate therapy
31/10/2011 66
A savoir• Detection résistance possible par antibiogramme• Confirmation par E test ou MICE• ATB Biomérieux possible si souche pousse sur
Wilkins Chalgren• Pas de recherche du gène nim• Recherche gène cfiA interessant avec commentaire
pour le clinicien• Hétérorésistance 5J pour métronidazole,clindamycine
31/10/2011
[Multirésitance aux antibiotiques]
B. fragilis
Mythe
ou
réalité
31/10/2011
Multirésistance aux antibiotiquesAmoxicilline > 128 Amoxicilline + ac clavulanique >128Ticarcilline >256 Ticarcilline + ac clavulanique >256Pipéracilline >256 Pipéracilline + Tazobactam > 256Céfoxitine, Céfotétan, Céfotaxime, ceftriaxone > 64Imipénème, Méropénème, Faropénème >128Erythromycine, Azithromycine, Clindamycine >128Ofloxacine 64 Sparfloxacine 16 Métronidazole 8 Chloramphénicol 8
Activité du linézolide sur les anaérobies stricts
Ecart CMI 5O CMI 90
B. fragilis 2-4 4 4
Fusobacterium 0,06-2 0,5 1
Prevotella 0,06-8 2 2
P. acnes 0,25-1 0,5 0,5
Peptostreptococcus 0,25-2 1 2
Clostridium 0,06-4 2 4
Activité de la tigécycline sur les cocci à Gram positif
0
5
10
15
20
0.06 0.25 1 4 16 16 64Cocci ̂ gram +
Cocci ˆ gram +
Activité de la tigécycline sur les Bacteroides du groupe fragilis
05
10152025
0.06 0,25 1 4 16
B. fragilis
B. thetaiota
Autres
B. fragilis B. thetaiota Autres
Detection of resistant anaerobes is needed
Bacteroides fragilis imipenem
fragilis group clindamycin, amox+ clavu
decreased susceptibility to metronidazole
Fusobacterium penicillinase and clindamycin
Prevotella ß-lactamase and clindamycin
+ métronidazole
Veillonella métronidazole
Clostridium clindamycin, ß lactamase
intrinsic resistance to glycopeptides
C. difficile vancomycin and metronidazole
ConclusionNeed of antibiotic surveys
Metronidazole resistance is widespreading in many anaerobic genera
Decreased susceptibility to metronidazole : detection requires longer incubation time on solid media.
PCR detection of nim gene may miss resistant strains
Look at glycopeptides & lipopeptides resistance
......... and multiresistant strains
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