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IntroductionEn raison de l’essor de la biologie moléculaire, la place de

la culture cellulaire dans le diagnostic virologique se restreint.Il reste cependant un certain nombre d’indications pour les-quelles l’isolement viral sur culture conserve une utilité. Lecas le plus évident concerne les virus qui ne sont pas encorecaractérisés moléculairement : la culture permet en effetd’ouvrir l’éventail des virus recherché sans se limiter à un agentpathogène donné, contrairement aux techniques PCR ou dediagnostic antigénique (ELISA ou tests d’immunofluorescenceindirects). Un autre intérêt majeur est la possibilité deconserver des souches virales en vue d’études ultérieures(caractérisation antigénique et moléculaire des souches,étude de la sensibilité à divers désinfectants, étude fonda-mentale sur les cycles infectieux…). Enfin, cette techniquedemeure pour de nombreux agents la technique de référence.

Ces techniques restent cependant peu utilisées car ellessont contraignantes pour le laboratoire et donc onéreuses. Deplus, certains virus de culture difficile imposent un grandnombre de passages et nécessitent donc un long délai d’iden-tification parfois peu compatible avec les contraintes du« terrain ». Pour améliorer ces 2 paramètres (coût et délai),l’Institut en Santé Agro Environnement (ISAE) a étudié l’effetdu mode d’adsorption du virus sur les cultures cellulairesafin d’améliorer le rendement de l’isolement viral. Dans cecontexte, l’efficacité de la méthode d’adsorption du virus parcentrifugation a été comparée avec celle de l’adsorption par

contact en couches minces classiquement utilisée en médecinevétérinaire.

Matériel et Méthodes

CHOIX DES ÉCHANTILLONS ET DES SOUCHES VIRALES

Dix échantillons de terrain de statut connu obtenus à partirde broyats tissulaires (par homogénéisation des tissus dansun homogénéisateur de type ultra-turaxr) et 9 souches viralesde référence [souche DVB (Diarrhée Virale Bovine,NADL/ATCC VR-1422), souche PI3 (Parainfluenza 3, vac-cin para III), souche RIB (Rhinotrachéite Bovine, IBR5AFSSA Lyon), souche Adénovirus 3 (ADB6 AFSSA Lyon),souche VRS (Virus Respiratoire Syncytial, B35-1 isolée etidentifiée à l’ISAE), souche parapoxvirus (5047, AFSSALyon), souches HBV2 et HBV4 (Herpès Virus Bovins 2 et 4,HB2 AFSSA et HBV4 LVD 85) et souche Aujeszky(Kojnock AFSSA Ploufragan)] ont été utilisées dans cetteétude.

CULTURES CELLULAIRES

Les isolements et identifications ont été réalisés sur descultures primaires (rein de fœtus de bovin de passages 2 à

RÉSUMÉ

Le diagnostic virologique sur culture cellulaire présente encore beaucoupd’intérêt malgré le développement de la biologie moléculaire. L’objectif decette étude est de montrer que la méthode d’adsorption du virus sur culturecellulaire influe sur le rendement d’isolement. Pour cela, 10 échantillons deterrain et 9 souches virales de référence ont été déposés sur des cellules enculture adhérentes puis incubés 1 heure à 37°C lors d’une adsorption en cou-che mince par contact ou centrifugés à 1 000g à 25°C pendant 45 minuteslors d’adsorption par centrifugation. Le mode d’adsorption par centrifuga-tion a permis de réduire significativement le délai d’apparition de l’effetcytopathogène (P < 0.05) et d’obtenir des titres viraux significativementplus élevés (P < 0.01). Ces résultats montrent qu’une adsorption par centri-fugation augmente le rendement d’isolement des virus recherchés en méde-cine vétérinaire.

Mots-clés : Culture cellulaire, virus, méthode de diagnostic,centrifugation, adsorption.

SUMMARY

Improvement of the methods of virological diagnosis on cellular culture

The virological diagnostic on cellular culture still presents a lot of interestdespite the development of molecular biology. The aim of this study is toinvestigate how the adsorption modality can modify the virus isolation yield.Ten ground samples and 9 reference viral strains were deposited on a layerof adherent cells then incubated at 37°C for one hour in the case of theadsorption by contact on thin layer or centrifuged at 1 000g for 45 minutesat 25°C in the case of the adsorption by centrifugation. The adsorption bycentrifugation has significantly shortened the delay of the occurrence of thecytopathogenic effect (P < 0.05) and has significantly increased the viral titres(P < 0.01). These results show that the adsorption by centrifugation improvesthe isolation yield of viruses usually found in veterinary medicine.

Keywords: Cellular culture, virus, method of diagnosis,centrifugation, adsorption.

Amélioration des méthodes de diagnosticvirologique sur culture cellulaire

E. MICHEL1*, C. QUEFELEC1, S. SERRAND1, M. JAMELOT1, E. LE DREAN1

1Service de Virologie, Institut en Santé Agro Environnement, 24 rue Antoine Joly, 35 031 Rennes cedex, France.

* Auteur chargé de la correspondance : evelyne.michel@cg35.fr

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10) entretenues et contrôlées indemnes de bactérie, myco-plasme et des virus recherchés conformément à la normeNFU47-200 [11]. Ces cellules sont aussi contrôlées pour leursensibilité vis-à-vis des virus recherchés aux passages précités.Elles ont été cultivées sur plaques de 12 puits (Ref 353043Falcon) dans du milieu MEM (Ref M0268 Sigma) additionnéde 1 % de L-glutamine (Ref G7513 Sigma), de 1 % d’acidesα-aminés non essentiels (Ref M7145 Sigma), d’antibiotiques[pénicilline – streptomycine (Ref P4333 Sigma), polymyxineB sulfate (Ref P4932 Sigma) et amphotéricine B (Ref A9528Sigma)] et de sérum fœtal de bovin (Dutscher) indemne debactérie, mycoplasme et des virus recherchés à raison de 10 %en phase de croissance cellulaire (milieu de culture) et de 2 %en phase d’entretien des cellules (milieu d’entretien).

MÉTHODES D’ADSORPTION ET D’ISOLEMENT VIRAL

Adsorption par contact en couche mince

Cette méthode d’isolement est issue de la technique deréférence décrite dans le texte international de l’OIE [1, 3].Après remplacement du milieu de culture par du milieu d’en-tretien, les cellules sub-confluentes (60 000 cellules /mL etpassage de 24 à 72 heures) ont été inoculées par les souchesvirales de référence ou les broyats tissulaires (100 μL/puits)par contact pendant 1 heure à 37°C. Passé ce délai, l’ensemblemilieu / inoculum a été éliminé et remplacé par du milieud’entretien. Après incubation à 37 ± 2°C, 5% CO2 pendant 3à 10 jours en fonction du virus recherché (Tableau I), les cellulesinoculées de 1er passage ont ensuite été congelées à une tem-pérature inférieure à -65°C. Le 2ème passage est réalisé pardépôt des cellules de 1er passage décongelées et décollées dusupport par grattage sur des nouvelles cellules sub-confluentes.Les conditions d’inoculation et d’adsorption ont été identiquesà celles du 1er passage, le volume de l’inoculum représentantau maximum 1/10 du volume total du milieu. Les culturescellulaires ont été observées quotidiennement au microscopeinversé au grossissement X40 afin de mesurer le délai d’ap-parition d’un effet cytopathogène.

En parallèle, les souches virales de référence ou les échan-tillons de terrain testés chacun sur 4 puits d’une plaque de 96puits (Ref 353072, Falcon), les différents témoins [témoins

cellules : cellules non inoculées, positifs (témoins virus deréférence) et négatifs (sérum de fœtus de bovin contrôléindemne des virus recherchés)] ont été incubés pendant aumoins 48 heures à 37 ± 2°C, 5 % CO2 puis fixés à l’acétoneselon la méthode décrite par la technique de référence [1].Après addition des anticorps monoclonaux spécifiques desdifférentes souches virales (tableau II) et incubation à 37 ±2°C pendant 15 minutes, une étape avec un anticorps antiespèce (anti-souris) biotinylé est effectuée. Les complexesimmuns formés ont été révélés par fixation des complexesavidine-biotine-peroxydase (kit Vectastain ELITE ABC, RefPK6102, Abcys) ce qui permet d’amplifier le signal, puis parajout du substrat spécifique de l’enzyme (3-amino-9-ethyl-carbazole/n,n-diméthyl formamide / H2O2). Des incubationsde 15 minutes à 37 ± 2°C ont été réalisées pour chaque étape.Les puits ont ensuite été observés au microscope inversé auxgrossissements X40 et X200. Les cellules infectées apparaissentcolorées et contrastent nettement avec les cellules non infectéesqui restent incolores. La coloration est toujours comparée àcelle obtenue sur le témoin positif correspondant.

Adsorption par centrifugation

Dans le cas de l’adsorption par centrifugation, les cellulessub-confluentes et les inocula viraux ont été centrifugés à

Type de virus Durée du 1er passage (jours)

DVB 3 – 7

PI3 4 - 7

RIB 3 - 7

Adénovirus 3 7 - 10

VRS 4 - 7

Parapoxvirus 4 - 7

HBV4 7 - 10

Aujeszky 3 - 7

TABLE I : Durée d’incubation du 1er passage sur cellules de reins defœtus de bovin en fonction de la souche virale.

DVB : Diarrhée Virale Bovine ; PI3 : Parainfluenza 3 ; RIB : RhinotrachéiteBovine ; VRS : Virus Respiratoire Syncytial ; HBV4 : Herpès Virus Bovin 4.

Type de virus Anticorps monoclonaux anti-virusSpécificité Fournisseur / Référence

DVB NR AES (BIO 295)PI3 Protéine M Pourquier (PO 1210)RIB gB HBV1 Pourquier (PO 1310)Adénovirus 3 NR LSI (BIO 038)VRS Protéines F0 + F1 Pourquier (PO 1110)Parapoxvirus NR AFSSA LyonHBV4 NR AES (BIO 279)Aujeszky Protéine gB Porc LSI (PRVGB1)

TABLE II : Anticorps monoclonaux antivirus spécifiques utilisés dans l’identification virale par immunocytochimie (marquage à la per-oxydase).

DVB : Diarrhée Virale Bovine ; PI3 : Parainfluenza 3 ; RIB : Rhinotrachéite Bovine ; VRS : Virus Respiratoire Syncytial ; HBV4 : Herpès Virus Bovin 4 ;NR : Non renseigné.

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1 000 g à 25°C pendant 45 minutes [15] puis le surnageant aété remplacé par du milieu d’entretien. Les conditions de 1er

et 2ème passages et d’identification virale par observationdirecte au microscope et immunocytochimie ont été identiques.

DÉTERMINATION DES TITRES VIRAUX

Le calcul du titre viral a été effectué selon la méthode deKÄRBER [8] : après dilutions des souches virales de 10 en 10(de 10-1 à 10-8) et en considérant la dernière dilution pourlaquelle un effet cytopathogène a été visualisé ou le virus a étémis en évidence par immunocytochimie, le titre (T) expriméen DECP50 (dose entraînant 50 % d’effet)/ unité de volume aété calculé selon la formule suivante :

T = d + [r/N(n+N/2)] où d : log10 de la dernière dilutiondonnant une réponse positive ; r : log10 de l’intervalle de dilution ;N : nombre de puits par dilution et n : nombre de puits positifs.

ANALYSES STATISTIQUES

Les résultats obtenus par les différentes méthodes d’ad-sorption ont été analysés par des tests non paramétriques(test de Wilcoxon pour l’analyse des titres viraux et test duchi2 pour la comparaison des résultats qualitatifs). Les diffé-rences ont été considérées comme positives pour une valeurde P < 0.05.

RésultatsComme le montre le tableau III, l’isolement viral révélé

par visualisation de l’effet cytopathogène à 100 % a réussidans 14/16 des souches de référence et de terrain testées(87.5 %) lors de l’adsorption par contact en couche mince etdans 15/16 (93.8 %) des cas lors de l’adsorption par centri-fugation, le degré d’agrément (nombre de scores identiques)entre ces 2 techniques étant de 93.8 %. En outre, le délaid’apparition de l’effet cytopathogène s’est retrouvé signifi-cativement raccourci (P < 0.05) pour 83 % des souches viralesde référence et pour 50 % des souches de terrain, lorsquel’adsorption a été réalisée par centrifugation. L’identificationvirale par immunocytochimie (Tableau III) des 6 souchesvirales de référence testées s’est avérée positive quelle quesoit la méthode d’adsorption. En ce qui concerne les échan-tillons de terrain, 2 résultats négatifs (04 082 et 99 035) ontété obtenus après adsorption par contact en couche mince etun seul (98 070) après adsorption par centrifugation, l’agré-ment total (souches de terrain et souches de référence) entreles 2 méthodes étant de 81.3 %.

L’examen microscopique des cultures cellulaires mises enprésence des différents virus révèle que la méthode d’ad-sorption par centrifugation permet un enrichissement en virusde la culture : pour une dilution identique de l’inoculum misen contact avec les cellules sub-confluentes, l’effet cytopa-thogène (figure 1a) et le marquage immunocytochimiquecellulaire (figure 2a) sont apparus plus intenses après une

Souches virales Délai d’apparition de l’ECP (h) ImmunocytochimieContact Centrifug. Δ Contact Centrifug.

De référenceDVB (NADL) 72 48 -24 DVB+ DVB+PI3 (vaccin para III) 96 96 0 PI3+ PI3+RIB (IBR5) 72 48 -24 RIB+ RIB+Adénov. 3 (ADB6) 96 72 -24 Adénov.3+ Adénov.3+VRS (B35-1) 72 48 -24 VRS+ VRS+Aujeszky (Kojnock) 72 48 -24 Aujeszky+ Aujeszky+

De terrain04070 96 96 0 DVB+ DVB+04089 120 96 -24 PI3+ PI3+04082 120 96 -24 PI3- PI3+03154 120 96 -24 VRS+ VRS+98070 pas d’effet pas d’effet - VRS+ VRS-01083 96 48 -48 Parapoxv.+ Parapoxv.+95533 48 48 0 Parapoxv.+ Parapoxv.+95596 48 48 0 HBV4+ HBV4+02109 24 24 0 Aujeszky+ Aujeszky+99035 pas d’effet 96 -96 Aujeszky- Aujeszky+

Total 14/16 15/16

TABLE III : Influence de la méthode d’adsorption (par contact en couche mince 1 heure à 37°C ou par centrifugation à 1 000 g à 25°Cpendant 45 minutes) sur le rendement de l’isolement des souches virales de « terrain » (n = 10) ou de référence (n = 6). La présencedu virus est confirmée par observation microscopique (microscope optique inversé) par visualisation d’un effet cytopathogène de100 % ou marquage par immunocytochimie par la peroxydase.

ECP : effet cytopathogène ; Contact : adsorption virale par contact sur couche mince (1 heure à 37°C) ; Centrifug. : adsorption virale par centrifugation(1 000 g, 25°C, 45 minutes) ; Δ : Différence dans le délai d’apparition ; DVB : Diarrhée Virale Bovine ; PI3 : Parainfluenza 3 ; RIB : Rhinotrachéite Bovine ; AdénoV. :Adénovirus ; VRS : Virus Respiratoire Syncytial ; Parapoxv. : Parapoxvirus et HBV4 : Herpès virus bovin 4.

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étape d’adsorption par centrifugation qu’après une adsorptionpar contact (figures 1b et 2b, respectivement). La qualité delecture a été également améliorée par une meilleure répartitiondes foyers infectieux et une augmentation du nombre de cellulesinfectées par foyer. Afin de comparer les différences dedétectabilité, les titres des souches virales de référence ontété mesurés après adsorption en couche mince ou par centri-

fugation (tableau IV). Il apparaît que pour toutes les souches

testées, à l’exception de la souche Aujeszky qui a fournit un

titre identique, les titres obtenus après adsorption par centri-

fugation ont été significativement plus élevés (de 4.69 % à

30.95 %) que ceux obtenus par adsorption sur couches minces

(P < 0.01).

FIGURE 1 : Effet cytopathogène du virus VRS (Virus Respiratoire Syncytial, B35-1, dilution initiale de 102.5 DCP50 dans l’inoculum)après une étape d’adsorption par centrifugation (1 000 g, 25°C, 45 minutes) (a) ou par contact en couche mince (1 heure à 37°C)(b). Grossissement X40.

(a) (b)

FIGURE 2 : Marquage immunocytochimique par la peroxydase du virus VRS (Virus Respiratoire Syncytial, B35-1, dilution initiale de102.5 DCP50 dans l’inoculum) après une étape d’adsorption par centrifugation (1 000 g, 25°C, 45 minutes) (a) ou par contact encouche mince (1 heure à 37°C) (b). Grossissement X40.

(a) (b)

Souches virales titrées Contact Centrifugation ΔR (%)[Adsorption sur couche mince] [adsorption par centrifugation]

DVB (NADL) 4.8 5.3 10.42PI3 (vaccin para III) 5 5.6 12.00RIB (IBR5) 5.9 6.8 15.25Adénov. 3 (ADB6) 3.9 4.2 7.69VRS (B35-1) 4.2 5.5 30.95Parapoxv. (5047) 7.5 8.1 8.00HBV2 (HB2) 5.1 5.9 15.69HBV4 (LVD 85) 6.4 6.7 4.69Aujeszky (Kojnock) 8.4 8.4 0.00

TABLE IV : Comparaison des titres viraux (DEPC50 / mL) des souches virales de référence lors d’isolement après adsorption parcontact en couche mince (1 heure à 37°C) ou par centrifugation (1 000 g à 25°C pendant 45 minutes).

DVB : Diarrhée Virale Bovine ; PI3 : Parainfluenza 3 ; RIB : Rhinotrachéite Bovine ; VRS : Virus Respiratoire Syncytial ; HBV4 : Herpès Virus Bovin 4 ;NR : Non renseigné.

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DiscussionDans la méthode d’adsorption par centrifugation, il existe

plusieurs conditions de centrifugation (vitesse, durée et tem-pérature) d’un auteur à l’autre : ont ainsi été proposés commeparamètres de centrifugation 1 900 g à température ambiantependant 30 minutes [12] ou 671 g à température ambiante ouà 4°C pendant 2 heures [9]. Néanmoins, les caractéristiquesadmises de centrifugation permettant de préserver la qualitédes cellules et l’intégrité de la grande majorité des espècesvirales isolées couramment en médecine bovine sont de1 000 g à température ambiante pendant 45 minutes [10, 15].Les résultats obtenus dans cette étude confirment qu’unecentrifugation à l’étape d’adsorption permet d’améliorer ladétectabilité de la technique, c'est-à-dire la capacité de cettedernière à détecter la plus petite quantité de virus. Cette amé-lioration est caractérisée par l’augmentation des titres virauxobtenus avec la technique d’adsorption par centrifugation.Ce mode d’adsorption est déjà fortement préconisé dans lecadre du diagnostic virologique en médecine humaine. Desrésultats similaires ont été décrits dans le cadre de la culturedes cytomégalovirus [4], des herpès virus [5, 14], du VRS [7]et des adénovirus humains [2]. Outre l’amélioration du ren-dement d’isolement, l’adsorption par centrifugation raccourcitde façon significative le délai d’apparition de l’effet cytopa-thogène des souches bovines de l’ordre de 1 à 2 jours dans lamajorité des souches virales testées dans cette étude. Cetavantage de l’adsorption par centrifugation a déjà été soulignéen virologie humaine [13].

Les processus cellulaires ou moléculaires intervenant dansl’amélioration de l’interaction cellule – virus restent encoreà identifier avec précision. HUDSON [6] démontre que cetteinteraction n’est pas simplement due à l’augmentation de lavitesse de sédimentation mais résulte d’une augmentation dela pénétration du virus dans la cellule et également de laréplication virale par modification de la membrane cellulaireet du cytosquelette. KARIWA [9], en comparant les effetsd’une centrifugation avant, après et au moment de l’inoculationdémontre que la centrifugation améliore les premières étapesde l’interaction cellule – virus plutôt que les étapes tardivesde la réplication. Il semblerait que la centrifugation modifiel’expression ou la disponibilité des récepteurs cellulaires desvirus [9]. Cette hypothèse confirme les données produitespar OSBORN et WALKER [12] qui montraient que l’effetmaximal de la centrifugation est observé dans les 10 premièresminutes et concerne donc les étapes précoces de l’infectionvirale. Néanmoins, cet effet de la centrifugation dépend de lanature des virus et des cellules cibles [10].

En conclusion, cette étude comparative montre qu’unecentrifugation à l’étape d’adsorption augmente, dans la plupartdes cas, les rendements d’isolements des souches virales cequi se traduit par une augmentation de la détectabilité, del’intensité de l’effet cytopathogène et de la rapidité d’apparitionde l’effet cytopathogène.

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