“acide aminé-acide ribonucléique”, intermédiaire dans la synthèse des liaisons peptidiques....

BIOCHIMICA ET BIOPHYSlCA ACTA 585

BBA 82?8

"ACIDE AMIN]~-ACIDE RIBONUCL1~IQUE", INTERM]~DIAIRE

DANS LA SYNTHI~SE DES LIAISONS PEPTIDIQUES. VI

MIRKO BELJANSKI ET MONIQUE BELJANSKI

Service de Biochimie CeUulaire, Insti tut Pasteur, Paris (France)

(Regu le 22 f6vrier 1963)

SUMMARY

"Amino acid-RNA", an intermediate in the formation o/peptide bonds

Formation of peptides from free amino acids by purified enzymes of Alcaligenes /aecalis requires an RNA fraction. This RNA is capable of fixing all L-amino acids "activated" in the presence of each of the four ribonucleoside 5'-triphosphates and purified polypeptide synthetases. An "amino acid-RNA" complex was isolated. The acceptor fraction was identified as rapidly labelled RNA containing both "messenger" and eosomal RNA. Base analogs incorporated into this fraction modify its capacity for amino acids fixation.

INTRODUCTION

Nous avons ddcrit prdc~demment les propri6t~s d'enzymes solubles caract~ris~s d'une part par leur capacitd ~ dchanger les ribonucl~oside 5'-diphosphates avec les ribonucl~oside 5'-triphosphates homologues 1 et d'autre part par leur propri~t~ d'activer l'incorporation des acides aminds dans des fragments subcellulaires d'Alcaligenes faecalis 2. Par la suite nous avons montr~ que ces m~mes prdparations enzymatiques en presence de divers acides aminds et de ribonucl~oside 5'-triphosphates donnent lieu

la synth~se d'une varidtd de peptides de faible poids moMculairO. Nous avons ~tabli la stoechiom~trie de ces r~actions qui se produisent vraisemblablement de la fa~on suivante:

X-R-P-P-P+acides amin6s enzyn~e X-R-P-P+orthophosphate+peptides Nos prSparations enzymatiques ne semblaient pas exiger la pr6sence d'une

fraction de RNA pour les r6actions ~tudides. A la suite de purifications plus pouss~es nous avons observ~ que les r~actions catalys~es par ces enzymes se produisaient ~ un taux maximum en presence de certaines fractions de RNA. Dans ce travail nous ~tudions tout particuli~rement ]a formation et les propridtds d'un complexe entre les L-acides amines et une fraction de RNA. Une note br~ve a rdsum6 des r~sultats pr6liminaires 4.

Abrdviations: r-RNA, RNA ribosomal; s-RNA, I~NA de transfert; rm-RNA, RNA ribosomal+RNA ~ marquage rapide; AA-RNA, complexe entre acide amind et RNA; AA-rm-RNA, complexe entre acide amind et rm-RNA; aza-GTP, azaguanosine triphosphate; PCMB, p-chloro- mercuribenzoate; poly-AGUC et poly-U, polynucldotides synthdtisds par la polynucMotide phos- phorylase.

Biochim. Biophys. Acta, 72 (1963) 585-597

586 M. BELJANSKI, M~ BELJANSKI

MAT]~RIEL ET MI~THODES

Provenance des produits utilisds

L-Acides amin6s uniform6ment marqu6s au 14C: Institut Pasteur; L- et D-[12C 1 acides amin6s: "Calbiochem", Hoffmann-La Roche; ribonucl6oside 5'-mono-, di- et triphosphates (sel de sodium), desoxyribonucl6oside 5'-triphosphates: Sigma Che- mical Company, Schwarz BioResearch, Inc., Mann Research Laboratories; [14C]ADP et [14CIATP: Schwarz BioResearch, Inc.; 5-fluorouracile offert par Hoffmann-La Roche; azaguanine, [l*Cturacile et 5-fluoro-[l*Cluracile, "Calbiochem"; RNAase et DNAase: Worthington Biochemical Company. H3PO , marqu6 all a'P: Commissariat l't~nergie Atomique; 5-fluoro-UTP et aza-GTP nous ont 6t6 aimablement donn6s par le Dr. R. B. Ross, Cancer Chemotherapy, National Service Center, Public Health Service, Bethesda, Md. (U.S.A.); 5-fluoro-UDP et 5-fluoro-deUTP offerts par le Dr. C. HEIDELBERGER. PCMB, iodoac6tate et DFP sont des produits commerciaux.

Prdparations enzymatiques

Elles ont 6t6 obtenues A partir d'extraits solubles d' Alcaligenes [aecalis d'apr6s la m6thode publi6e comportant cinq 6tapes 5. Une purification plus pouss6e des fractions 0.40-o.70 de (NH,)2SO 4 (I~tape 5) est obtenue en utilisant une colonne de DEAE 6quilibr6e par le tampon Tris o.oi M, pH 7-4. Les prot~ines sont 61u6es ~ l'aide d'un gradient de KC1 (O.l-O.6 M); les 6chantillons sont pr~cipit6s par (NH4),SO4 0.70 de saturation; apr6s dialyse contre du tampon Tris o.oi M, pH 7-4, les activit6s d'~change (X-R-P-P ,-~ X-R-P-P-P), de lib6ration d'orthophosphate et la formation du complexe "AA-ARN" ont 6t6 d6termin6es dans diverses fractions. Les trois activitds sont tout particuli6rement pr~sentes dans les 61uats 0.2-0.3 M de KC1. Pour obtenir des pr6parations enzymatiques contenant moins de 0.2 % d'acides nucl6iques, la quantit6 de protamine (Etape 4) a 6t6 augment6e de 25 %. Avant leur utilisation les fractions d'enzymes ont 6t6 trait6es par la bentonite 6.

Prdparation des acides nucldiques

Dans les exp6riences pr61iminaires le r-RNA et le s-RNA ont ~t6 isol6s au ph6nol ~, partir de ribosomes ou de surnageant ~. lO5 ooo ×g provenant de bact6ries d'Al- caligenes [aecalis broy6es en pr6sence de MgC1, io-*M (ref. 7)- Nous isolons mainte- nant les acides nucMiques par une m6thode voisine de celle d'OFENGAND et al. s. Les bact6ries lav6es, sont resuspendues dans du tampon Tris o.oi M, pH 7.0, et ad- ditionn~es de lauryl sulfate ~ 1. 5 % (concentration finale). Le m~lange est port6 IOO ° pendant 3 rain (ou simplement agit6 pendant 5 rain ~ la temp6rature du laboratoire en pr6sence de MgC12 lO -2 Met de bentonite 0.2 % (concentration finale). Le s-RNA est extrait ~ l'aide de NaC1 1.5 M (refs. 8, 9) et le RNA non extractible dans ces conditions est extrait au ph6nol. I1 est d6sign6 par le sigle rm-RNA. Les solutions d'acides nucl6iques sont ensuite trait6es par la DNAase (2.5 #g/ml) puis d6prot6ini- s6es par la mdthode de SEVAG 10. Le DNA a 6t6 pr6par~ ~ partir d'acides nucl~iques totaux isol~s au ph6nol puis trait6s par la RNAase (5 #g/ml) et enfin d6prot6inis6s. Les acides nucl6iques ont dt6 repr6cipit6s plusieurs fois par l'alcool A 95 °, resuspendus dans de l'eau distill6e, dialys6s d'abord 4 min contre une solution d'ammoniaque o.oi N puis 6 h contre de l'eau distiLl6e et emfin trait6s par la bentonite e. Le RNA


ACIDEN AMm-RNA. VI 587

renouvellement rapide (contenant selon les donn6es actuelles le RNA "messager" et une fraction de RNA (6osomal) pr6curseur de r-RNA), a 6t6 caract6ris6 sur un gradient de sucrose n A partir du RNA total isold des bact~ries marqu6es pendant 3o sec par le [~P]orthophosphate soit par le [~tC]uracile (ou le 5-fluoro-[~lC]uracile). Les RNA contenant le 5-fluorouracile ou le azaguanine ont 6t6 isol6s A partir de bact6ries auxquelles, en phase exponentielle de croissance, furent ajout6s des analogues (io A 25 #g/ml) pour des temps variables. La quantitd de RNA a 6t6 ddtermin6e colorim~triquement TM et par absorption ~ 260 m#. Le DNA fut dos~ par la mdthode de DISCHE TM.

Formation et isolement du complexe "[14C]AA-RNA"

Le milieu d'incubation pour la formation du complexe est le suivant: MgC12, 5 #moles; tampon de Tris (pH 8.o), 50 #moles; KF, 2#Moles ribonucl6oside 5'-triphosphate, 0.5-2.0 #moles; RNA, 200 #g (soit s-RNA, DNA ou polynucl6otides synth6- tiques); le [14C]acide amin~, 3-50 m#moles (I. lO 5 A 2. IO ~ coups/min); pr6parations enzymatiques, 50 #g; volume final, I ml. Incubation, sauf indication, 20 min. Tem- perature, 3 o°. Le complexe "AA-rm-RNA" est pr6cipit6 par HC104 0.3 M (concentration finale) A 4 % 15o #g de RNA des levures et 300/~g d'albumine de s6rum sont alors ajout6s comme entraineurs. Dans de telles conditions le complexe "AA- rm-RNA" est stable pendant plusieurs heures. Le pr~cipit6 s6par6 par centrifugation est lay6 deux fois avec HC104 0.3 M puis redissout dans l'ammoniaque I N. Les 6chantillons sont s6ch6s et la radioactivit6 d6termin6e dans un compteur Tracerlab ~, fen6tre mince. Les r6sultats corrig6s pour l'autoabsorption sont exprim6s en m#moles de [14C~acides amin6s incorpor6s dans 200/~g de rm-RNA, ou par nombre de coups/ min.

RESULTATS

Propridtds des prdparations enzymatiques

Nous avons compar6 en cours de purification les diverses activit~s des polypeptide synth6tases. Le Tableau I r6sume les r~sultats et montre que les trois r6actions d'6change (X-R-P-P ~ X-R-P-P-P), de lib6ration d'orthophosphate et de formation du complexe "AA-rm-RNA" sont catalys6es dans les m~mes proportions par les m~mes fractions enzymatiques. On observe en particulier que la quantit6 de [laC]- alanine fix6e sur le rm-R2qA est du m~me ordre que la quantit~ d'orthophosphate lib6r6. Dans nos conditions donn6es de fixation des acides amin6s sur le rm-RNA la formation de peptides est n~gligeable. Nos r6sultats ant~rieurs ont montr~ qu'il y avait une stoechiom6trie entre les liaisons peptidiques form~es et l'orthophosphate lib6r63.

Diverses caract6ristiques de ces pr6parations enzymatiques ont 6t6 d6j A d6crites ~. Rappelons cependant que la r6action d'6change entre le [8~P]diphospha*e et Fun des quatre ribonucMoside 5'-triphosphates en pr~ence de chacun des vingt L-acides amin6s n'est pas catalys6e par les polypeptide synth~tases sauf, occasionnellement avec ATP en pr6sence de L-valine ou de L-leucine. Pr~cisons 6galement que nous n'avons pu d6celer d'~change significatif entre le [32P~orthophosphate et les ribo- nucl6oside 5'-triphosphates ni en absence ni en pr6sence de rm-RNA et de L-acides amin6s.


588 M. BELJANSKI, M. BELJANSKI

TABLEAU I

COMPARAISON DES ACTIVITI~S DES POLYPEPTIDE SYNTHI~TASES AU COUR$ DE LA PURIFICATION

Echange et lib6ration d' orthophosphate ont 6t6 d6terrnin6s selon les m6thodes d6crites 11. La quantit~ de [14C]alanine incorpor6e dans le rm-RNA fur calcul6e d'apr~s les valeurs prises entre la

15~me et la 2o6me minute d'incubation (incorporation lin6aire en prdsence d'ATP).

l~moleslmg de protkineslk

Fractions [I4C]Alanine P lib~r~ enzymatiques Eckange Pkosphore incorporle dans le Rapport

X-R-P-Px-.~-X-R-P-P-P lib~r~ rm-RNA Alanine incorpor~e

i. Extrai t 75 -- -- -- 2. 0.25-0.7 ° (NH,)2SO , 15o -- -- -- 3. Ca3(PO4)z, 61uat 42o o.I9 o.17 i . io 4- Protamine, surnageant 18oo o.73 0.78 o.94 5- 0-40-0.70 (NH4)sSO4 4500 1.54 1.38 i . i o 6. DEAE, 61uat 1813o 6.70 5.9 ° 1.14

E/ /e t des acides nucldiques sur la libdration d'orthophosphate et sur la synthOse des

peptides

D a n s nos exp6r iences pr6c6dentes les f rac t ions ac t ives (F rac t i on 5) dans la

l ib6ra t ion d ' o r t h o p h o s p h a t e e t dans l a synth~se p e p t i d i q u e c o n t e n a i e n t 1 - 3 %

d ' ac ides nucl6 iques . De te l les p r6pa ra t i ons c a t a l y s a i e n t la d6g rada t i on des r ibo-

nucl6oside t r i p h o s p h a t e s et la syn th~se des pep t i de s sans a d d i t i o n de R N A exog~ne.

Lo r sque les p r6pa ra t i ons e n z y m a t i q u e s p l u s purif i6es c o n t i e n n e n t moins de 0.2 % de

ma t6 r i e l nuc l6o t id ique la l ib6ra t ion d ' o r t h o p h o s p h a t e et la synth~se des p e p t i d e s son t

t o u t ~t fair r a l en t i e s ( T a b l e a u x I I et III). L ' a d d i t i o n de r m - R N A dans les cond i t ions

de nos exp6r iences in f luence dans les m 6 m e s p r o p o r t i o n s les d e u x r6ac t ions t a n d i s que

le s - R N A et le D N A son t sans ef fe t 4. L a sp6cifici t6 des r ibonuc l6os ide 5 ' - t r i p h o s p h a t e s

p o u r les g roupes d ' ac ides amin6s 8 est e s sen t i e l l emen t la m S m e en pr6sence ou en

absence de r m - R N A . Tou te fo i s dans les m~mes cond i t ions le r m - R N A s t imu le la

d6g rada t i on de c e u x des nuc l6o t ides f a i b l e m e n t d6grad6s en l ' ab sence d ' ac ides

nuc l6 iques . N o t o n s que les nuc l6o t ides su ivan t s : a z a - G T P , 5 - f l u o r o - U T P , r i bonu-

cl6oside 5 ' -d iphospha te s , d6soxyr ibonuc l6os ide 5 ' - t r i p h o s p h a t e s ne son t pas d6grad6s

p a r les p o l y p e p t i d e syn th6 tases .

TABLEAU II

EFFET DE R M - R N A SUR LA DI~GRADATION DES RIBONUCLI~OSIDE 5t-TRIPHOSPHATES EN PRI~SENCE D'ACIDES AMINI~S

/,moles]ml: ribonucl6oside 5'-triphosphates, 2.o; L-alanine, 6.0; tampon Tris (pH 8.0), ioo; KF, 2; MgClz, 5.0; acides nucMiques, 3o/zg; enzymes (Fraction 5), 3 °0/*g; les inhibiteurs ont 6t6

pr6-incub6s avec de l 'enzyme pendant 5 rain ~. la temp6rature du laboratoire.

itmole de phosphore mineral lib~r~

ATP GTP aza-GTP UTP

Milieu complet 0.40 o.21 0.07 o.19 Sans MgC1 z o.oi o.oi o.oi o.oi Sans alanine o.oi O.Ol O.Ol o.oi Sans rm-RNA o.io 0.o 4 o.oi o.oi rm-]RNA apr~s !q.NAase o. I i o.o 4 -- 0.05 rm-RNA+iodoae6tate lO -2 M 0.40 o.21 -- 0.20 rm-RNA +PCMB lO -5 M o.io 0.03 -- 0.02 rm-RNA+ DFP lO -3 M o.41 0.20 -- o.18


ACID AMINE-RNA. V I 589

TABLEAU I I I

ANALYSE DES PEPTIDES ~ [14C]ALANINE FORM]~S EN PR]~SENCE D 'ATP

umoles/ml: ATP, 2.5; MgCls, 5.o; t ampon Tris (pH 8.o), IOO; L-[14C]alanine 6.o (1.5-2.o' lO 5 coups/rain); acides nucl~iques, 3 ° pg; enzymes (Fraction 5), 4 °0 Pg; incubat ion 2 h g 3 2°.

#mole de [l/C]a/ani~ pmo[e de [I4C]alanine pmole de [laC]alanine darts peptides darts dipeptide darts t~trapeptide

Milieu complet o.94 o.16 o.78 Sans rm-RNA o.12 o.12 pas rm-RNA + D F P lO -a M 0.96 o.17 o.79

Incorporation des [laCJacides aminds dans le r m - R N A

L e r61e a c f i v a t e u r d u r m - R N A d a n s l a r ~ a c t i o n de l i b 6 r a t i o n d ' o r t h o p h o s p h a t e

e t d a n s l a s y n t h ~ s e des p e p t i d e s , sugg~re q u e ce t R N A es t u n i n t e r m ~ d i a i r e d a n s l a

f o r m a t i o n des l i a i sons p e p t i d i q u e s . N o u s a v o n s c h e r c h 6 les c o n d i t i o n s p e r m e t t a n t

l ' i n c o r p o r a t i o n des ac ides a m i n d s d a n s le r m - R N A . L e s r 6 s u l t a t s p r 6 s e n t 6 s clans le

t a b l e a u m o n t r e n t e n e f fe t q u ' u n c o m p l e x e "[14C]AA-rm-RNA" p e u t ~ t re isol6 sous

f o r m e de p r 6 c i p i t 6 s t a b l e e n p r e s e n c e de HC104 ( T a b l e a u IV) . E n m i l i e u f o r t e m e n t

a l c a l i n ( p H > IO) l ' a c i d e a m i n 6 es t l ib6r6 d u R N A e t se t r o u v e sous f o r m e l ibre .

TABLEAU i V

mpMOLES DE [14C]AcIDE AMIN]~ INCORPORI~ DANS 2oopg DE RM-19~qA

Conditions ddcrites dans le texte. Incubat ion ~ 3 °0 pendan t io min pour [l~C]leucine et 25 min pour [l~C]alanine.

Conditions [14C]Alanine [*4C]Leuc/ne

ATP GTP UTP CTP

Milieu complet 1.15 0.63 0.87 0.96 Sans nucl6otide 0.05 0.04 0.06 0.04 Sans MgC1, 0.03 0.03 0.04 0.03 Sans enzyme 0.03 0.03 0.03 0.04 Sans rm-RNA 0.04 o.o2 0.03 0.04 rm-RNA chauffd a ioo ° 15 rain

pH 7.0 1.13 0.67 0.84 0.89 s-RNA sans rm-RNA 0.22 o.18 0.20 0.26 DNA sans rm-RNA o.o8 0.06 0.o6 o.o 7 Poly-U sans rm-RNA o.o6 0.05 o.o 5 o.04 Poly-AGUC sans rm-RNA 0.o 7 o.o 5 0.04 o.o 4 r m - R N A + s - R N A (ioo pg) 1.o4 0.57 0.84 0.93 rm-RNA apr~s l~hrAase 0.06 0.05 0.07 0.08 r m - I ~ N A + D F P io -s M 1.12 o.60 -- -- rm-RNA+or thophospha t e 2/~M 0.48 0.26 o.31 0.25 rm-RNA+diphospha t e 2 pM 0.28 0.23 -- -- RNA de l 'enzyme 1.o 3 o.51 -- 0.82 Milieu comple t+PCMB lO -4 M 0.20 o.12 -- -- Milieu complet +iodoacdtate

IO-* M 1.3 ° 0.50 -- -- Milieu comple t+NH2OH IM o.o 3 0.02 0.o 4 o.o 5

D a n s les c o n d i t i o n s cho i s i e s l a f o r m a t i o n d u c o m p l e x e " A . A - r m - R N A " d 6 p e n d

de l a c o n c e n t r a t i o n e n Mg 2+ e t d u p H de la s o l u t i o n t a m p o n (Figs. I e t 2). Le t a b l e a u I V

m o n t r e q u e le r m - R N A n ' e s t p a s r e m p l a g a b l e p a r s - R N A , D N A , A G U C e t p o l y - U .

Biochim. Biophys. Aaa, 72 (i963) 585-597


,== x

o E t I t I t t t I I I I

5 10 ~Jg Mg CI2/rnl

Fig. r. Effet de MgCI= sur la formation du complexe "AA-rm-RNA". Conditions identiques celles du Tableau IV.

I I

o

~Z'~ 0 i .t, I t I I I [ I I I 5 10

pH

Fig. 2. Incorporation d'acides amin6s dans le rm-RNA ~ diffdrents pH. Des solutions tampon d e cacodylate et de Tris ont 6t~ utilis6es.

Le DFP et l'iodoac~tate sont sans effet sur les activit6s enzymatiques, tandis que le PCMB est un inhibiteur puissant. En presence de NH,OH I M on n'observe pas la formation du complexe."

En pr6sence de fortes concentrations d'enzymes et de 2oo#g de rm-RNA la fixation des acides amines est proportionnelle, pour des faibles concentrations, aux ribonucl6oside 5'-triphosphates, ]usqu'h un niveau maximum oh s'observe alors une inhibition en presence d'un exc~s de nucl~otides (Fig. 3).

Les ribonucl~oside 5'-monophosphates: AMP, GMP, UMP et CMP n'ont pas d'effet sur la formation du complexe "AA-rm-RNA" (Fig. 4). Par contre les

I1/

E 1 2 3 4 p r n o l e s n ucleotide/rnt

Fig. 3. Format ion du complexe " A A - r m - R N A " en presence de diverses concentrat ions en r ibo nuc]~oside 5'-tr iphosphates. Condit ions d~crites dans ]e texte. Enzymes (Fract ion 5).


ACIDE AMIN~;-RNA. vI 591

ribonuddmside 5'-diphosphates: ADP, GDP, UDP et CDP aioutds en m~me temps clue les ribonucldoside triphosphates, inhibent fortement la formation du complexe. I1 est intdressant de remarquer que les ddsoxyribonucldoside 5'-triphosphates pos- s~dent un tr~s fort pouvoir inhibiteur (particuli~rement le fluoro-deUTP contenant le 5-fluorouracile (Fig. 4).

@ ,@

u

E

UMP(AMP)

~ ~ - - ^ ~ - - -

"~..,. ~ - ~ d e GTP(deATP) I I ,1 I ~ I t 5 - F - d e U T P

1 2 3 4 5 ----~0 IJmoles nucl6otidel ml

Fig. 4. Effet de divers nucl~otides sur la formation du complexe "AA-rm-RNA". Conditions d~crites darts le texte. Les diffdrents nucldotides ont dt6 ajoutds au milieu d'incubation en m~me

temps que I'UTP. 5-FU, 5-fluorouracile; 5-F-deUTP, 5-fluoroddsoxyuridine triphosphate.

La cindtique d'incorporation des acides aminds dans le rm-RNA est illustrde par la Fig. 5.

Pour des faibles concentrations de rm-RNA, la quantitd de [14C]acides aminds

/ / 7 . . , - ' ~ , ~ - U T P

O E 60 120 T e m p s ( r n i r l )

Fig. 5" Cindt ique d' incoz~)oration de [14C]alanine dans ]e r m - R N A . Condi t ions d~rJ tes dRns ]e tez te .

fixds est propoltionnelle & la quantitd de rm-RNA en prdsence d'un exc~s d'enzyme (Fig. 6).

La fixation d'acides aminds sur le rm-RNA est proportionnelle & la quantitd d'enzyme lorsque celui-ci est utilisd en faible concentration (Fig. 7).

Pour des quantitds infdrieures A la saturation la fixation d'acides aminds sur le rm-RNA est proportionnelle tLla concentration en acides aminds et le maximum est atteint environ & lO -5 M (Fig. 8).

Nous avons vdrifid que les fractions enzymatiques actives dtaient capables de former un complexe entre le rm-RNA et les acides aminds suivants: Ala, Leu, Val, His, Phe, Ser, Arg, Pro, Gly, Tyr, Glu, Ileu, Lys, Try, Met. Les conditions de fixation

Biochim. Biophys. Acta, 72 (I963) 585-597


ATP

"~_ / _7

god,'., ,;o ' pg r-m-RNA/rnl

Fig. 6. Formation du complexe "AA-Em-RNA" en fonction de ]a concentration en rm-RNA. Conditions ddcrites dans le texte.

E 0

[14C]Alanine

[14C] Leucine

GO 100 = pg enzymes /m l

Fig. 7. Effet de diverses concentrations d'enzymes sur la formation du complexe "AA-rm-RNA". Conditions d6crites dans le texte. Enzyme (Fraction 6).

E

[14C] Alanine

2 c i n e

• 0 i l l I I l I :L 10 20 E rnHrnoles acide orninelml

Fi~. 8. Formation du complexe "AA~-rm-RNA" en pr6sence de diverses concerLtrations en [t4C]acides amin*s. Conditions d6crites dans le texte. Enzyme (Fraction 5).

m a x i m u m ont 6t6 6tablies pour : Ala, Leu, Val, Phe, Lys. Les valeurs donn~es pour les au t res acides amin6s ont 6t6 prises ~. la v ingt i~me minu te d ' i ncuba t ion dans ]es condi t ions d6cri tes (Tableau V).

Sp~ci/icit~ des acides amines dans la /ormation du complexe "AA-rm-RNA"

Les donnges prgc~dentes sugg~rent que la f ract ion de r m - R N A utilisge peu t f ixer au m a x i m u m une quant i t6 l imit6e d 'ac ides amings. Les r6sul ta ts pr6sent6s darts le


ACIDE A M I ~ - R N A . VI 593

TABLEAU V

In/~MOLES DE [I¢C]ACIDE AMIN]~ INCORPOI~ DANS 200/ /g DE rm-RNA

Nucl~otides utilis~s: ATP (Ala, Lys); GTP (Arg); CTP (Leu, Phe, Val, His). Enzymes, 2opg (Fraction 6).

m~mo/es

[ItC]AJa i . 15 [ttC]Lys L o o [x4C]Leu 0.96 [ltC]Phe 0.74 [I*C]Val 0.80 [14C]Arg o.66 [l~C]His o.41

tableau montrent que la somme des acides amin6s fix6s sur le rm-RNA dans les meilleures conditions de fixation correspond A la somme de chacun d'entre eux individuellement incorpor6s (Tableau VI). II semble donc d'apr6s ces r6sultats que chaque acide amin6 se fixe sur le RNA ind6pendamment de la pr6sence d'autres acides amin6s c'est A dire qu'il n'y a pas de comp6tition pour les sites accepteurs. Confirmant ces observations les r6sultats pr6sent6s dans le Tableau VII montrent que de tr6s fortes concentrations en un ~sC]acide amin6 (L- ou D-) OU en un m61ange de ~SC]acides amin6s n'influencent ni la cir~6tique ni le taux de fixation du [14C]acide amin6. Nous concluons de cet ensemble de r6sultats que le syst6me enzymatique poss~de une sp6cificit6 presque absolue clans le choix des L-acides amin6s en pr6sence du rm-RNA.

TABLEAU VI

INCORPORATION D E P L U S I E U R S L-ACIDES AMINI~S D A N S 2 0 0 ~ g D E rm-RNA

Nucl6otides utilis6s en presence de divers acides amin6s sont ceux du Tableau V.

[x4C]Ala [ t 'C]AJa + [1 'C]Leu [ I 'C] Ala + [ I 'C] Leu + [ I 'C] His [t4C]Ala+ [ ttC]Leu+ [t*C]His+ [l~C]Phe [x~C]Ala+ [ ttC]Leu + [tiC]His+ [xtC]Phe+ [xtC]Lys

m~moles

1.I8 2.31 2.98 3.70 4.68

TABLEAU VII

INCORPORATION DE [ltC]ALANINE ET DE [14C]LEUCINE EN Pl~SENCE DE [IIC]ACIDE AMIN]~

Conditions dans la Mgende du Tableau IV. Les D- et L-~mC]acides amines ajout~s au temps z6ro.

m/.~mo/e de [x*C]ac/de amlnd incorpord darts aoo I~g de rm-RNA

[l*C]Alani~ [l'C]Lcuc/~ ATP UTP

Milieu complet Milieu complet + L- [xmC]Ala 5 pM Milieu complet + D- [ItC] Ala 5/LM Milieu complet+L-[tmC]Leu 5/~M Milieu complet+D-[~C]Leu 5 paM Milieu 9omplet+t~[aIC]His 5/~M Milieu complet+L-[l~]Arg 5/tM

i.x 5 0.87 0.04 0.93 i .04 0.9o z .x 4 0.03 1.o8 0.88 x.o6 0.82 z .o9 0.85

B i o c h i m . B i o p h y s . A a a , 72 (t963) 585-597


Identification de la /faction de RNA accepteur d'acide~ aminds

Nous avons cherch6 & d6terminer quelle 6tait la fraction de RNA responsable de la fixation des acides amin6s. On sait que les bact6ries contiennent principalement trois tailles de RNA (23 S, 16 Se t 4 S) s6parables en particulier ~ l'aide d'un gradient de sucrose. Nous montrons que le RNA & renouvellement rapide marqu6 pendant 30 sec & l'aide de p~C]uracile pr~sente une courbe large et ~tendue (Fig. 9) caract~- ristique de ce type de RNA. Par contre les autres fractions de RNA ne sont pas

1£ - ~ 5 0 0 C K.

o ~ ~ooc t4O o,I o ,13 8 .U aooo

u= 0.5 .~ 2000

1000

o o~

23s ~

/

i'I /~.~ "-.e ,/ % \-

1 £) 2~O N u m e P o d e s t u b e s

",~,,

3~o

2000

'5 P

U

1ooo .- E

(3

Fig. 9. Profil des RNA d' Alcaligenes/aecalis apr~s gradient de sucrose. Le RNA rnarqu6 (36 sec) au [14C]uracile est centrifug6 pendant 16 h (SW 25) A 25 ooo rev./min (Spinco) dans un gradient lin6aire de sucrose 5-20 % contenant o.oi M de Tris (pH 7.2) et o . iMde NaC1. Lecture A 260 m/~ contre H20 distill6e. L'absorption due au sucrose n 'a pas 6t6 retranch6e. Les r6sultats de l'incorporation des [14C]acides amin6s dans le ~NA de chaque fraction du gradient sont exprim6s en nombre de coups/min. Les valeurs de la radioactivit6 correspondant au I14C]uracile dans le RNA ont ~t6 d~duites. O - O , absorbance; O - O , [14C]uracile; × - - - x , [l*Clalanine; &--LX,

[14C]valine.

marqu6es dans ces conditions en presence de [14C]uracile, pendant les temps indiqu6s, Nous avons examin6 la capacit6 de chacune des fractions du gradient ~ former le complexe avec les [14C]acides arnin6s en presence d'un des ribonucl6oside 5'-triphosphate et d'un exc~s d'enzyme. Les r6sultats sont exprim6s en nombre de coups/min par ~chantillon. I1 est @onnant de constater que la courbe du complexe "[I*CIAA- RNA" ne suit pas celle des densit~s opti.ques des divers types de RNA (Fig. 0). Elle se superpose pratiquement & la courbe du RNA ~ marquage rapide par le [t*C]uracile. Pour divers [14C]acides amines (Ala, Leu, Val, Lys, Phe) fix6s chacun individuellement sur la fraction "act ive" de RNA nous avons obtenu des courbes du complexe "AA-RNA" semblables & celles pr6sent~es dans la figure.

Nous avons pens6 que l'incorporation de deux analogues, le 5-fluorouracile et le azaguanine dans le RNA & marquage rapide nous permetterait de d6montrer d'une autre faqon le r61e de ce RNA dans la formation du complexe avec les acides amin6s. I1 est connu que ces deux analogues s'incorporent dans les acides nucl6iques 14,16 et modifient la distribution des acides amin6s dans les prot6ines leou ceux du pool 17. Nous avons tout d'abord constat~ (Fig. 9), comme pour le [14C]uracile que seule la


ACIDE A M I N ~ - R N A . VI 595

]raction de RNA ~ renouvellement rapide contenant du messager se marque en pr6sence de 5-fluoro[14Clhracile. Ce RNA contenant soit du 5-fluorouracile soit du azaguanine pr6sente des modifications de la fixation et de la distribution des acides amin6s lids au RNA actif. Remarquons en particulier le cas de l'histidine dont l 'incorporation darts le 5-fluoro-rm-RNA, contrairement aux autres acides amin6s essay6s, est fortement augment6e. En revanche l 'azaguanine-rm-RNA se pr6sente comme un mauvais accepteur des acides amin6s (Tableaux VIII et IX). L'ensemble de

TABLEAU VIII

INCORPORATION DE [14C]ACIDES AMINES DANS 200 pg DE rm-RNA CONTENANT DU 5-FLUOROURACILE

IZibonuc16oside 5'-triphosphates indiqu~s dans la 1~gende du Tableau V, ont 6t6 utilis~s. Enzyme {Fraction 5); incubation 2o rain ~ 32°. Les valeurs pour le rm-RNA au temps z~ro, sont prises

comme IOO. Pourcentage de fixation exprim6 par rapport au rm-RNA au temps 5 min.

Temps d'incorporation du 5-[luorouracile dans le rm- R N A

o rain 0.5 rain 2. 5 rain 5 rain (mpmoles) (m/*moles) (m~moles) (m/~moles)

Pourcentage de fixation (5 rain)

Ala IOO 85 68 45 55 Leu IOO 72 53 37 63 Lys IOO 85 5I 48 52 Val IOO 92 51 47 53 His IOO 2o0 178 196 zoo

TABLEAU IX

INCORPORATION DE [14C~AcIDES AMINI~S DANS 2OO/*g DE rm-RNA CONTENANT L'AZAGUANINE

Conditions identiques ~ celles du Tableau Vlll. Azaguanine-rm-RNA iso16 des bact6ries pr~in- eub6es en pr6sence d'azaguanine pendant 5 min. Enzyme (Fraction 5).

rm-RNA Azaguanine-rm-RNA Inhibition ( ml*moles ) ( ml* moles) ( % )

Ala i .06 0.43 60 Leu 0.94 0.36 61 L ys 0.95 0.35 62 Val 0.77 0.27 65 His 0.38 o.zo 49

cesrdsultats permet de penser que le rm-RNA pourrait constituer une matrice alignant les acides aminds "activds" avant qu'ils soient polym6ris6s en chaines peptidiques.

Nous prdsenterons ailleurs des donndes concernant les propri6tds de la liaison formde entre les acides aminds et le rm-RNA, Les mdthodes et les r6sultats permet- rant d'identifier des sites accepteurs des acides amin6s sur le rm-RNA seront ddcrits dans la m6me publication.

CONCLUSIONS ET DISCUSSION

Nous avons ant6rieurement montr6 que les polypeptide synth6tazes, utilisent en l'absence ou en presence de fragments bact&iens les quatre ribonucl~oside triphosphates pour former des peptides ~t partir de L-acides amin6s3, 4. Afin de d&erminer l'effet des acides nucl6iques sur l'activit6 de ces enzymes nous avons utilis~ des

Biochira. B iophys . Acta, 72 (I963) 585-597


preparations enzymatiques purifi6es contenant moins de o.2 ~ de materiel nucl6oti- dique. Les r6sultats obtenus ont mis en dvidence qu'une fraction de RNA permet de r~activer ces preparations peu actives en absence d'acides nucl6iques. Cette fraction de RNA est capable de fixer darts les conditions donn~es tous les L-[l~C]acides amines. Pour un m~lange de [llC]acides amin6s, la radioactivit6 totale fix~e sur le RNA marquage rapide repr6sente la somme des radioactivit~s de chaque acide amin~ incorpor6. De plus la fixation d'un [14C]acide amin6 est ind6pendente du nombre d'autres E~sC]acides amin6s pr6sents dans le milieu d'incubation. Ces r6sultats in- diquent l'existence de sites accepteurs sp6cifiques dans le RNA actif et dans les pr6- parations enzymatiques l'existence d'un enzyme pour chaque acide amin6. CalcuM pour vingt acides amin6s, un acide amin6 est li6 pour environ 35 nucl~otides du rm-RNA. Dans la r6gion du gradient situ6 entre 14 S e t 4 S, r6gion ou le RNA tt marquage rapide semble le mieux s6par6 des autres fractions, nous trouvons ap- proximativement o.I 3 mpmole de [14C]alanine fix6 pour environ I~-I 5 nucl6otides, et o.Io m/zmole pour la valine.

Si ce RlgA joue le r61e de matrice pour les acides amin6s on devrait s'attendre ~t ce que l'introduction de 5-fluorouracile par exemple perturbe ses r6actions vistt vis des acides amin6s. Nos exp6riences montrent en effet que cet analogue (ou l'azaguanine) incorpor6 dans le RNA tt marquage rapide modifie profond6ment les capacit6s de ce RNA A fixer les acides amin6s en pr6sence de polypeptide synth6tases. Ces m~mes analogues, incorpor6s abon~lamment dans le s-RNA ne modifient passes propri6t6s~eJ s. Nous pensons donc que le RI~A tt marquage rapide peut servir de matrice pour aligner directement les acides amin6s "activ6s" par les polypeptide synth6tases. Pr6cisons que ce RNA contient du RNA messagerla, ~°, et du RNA 6osomal~L Nos r6sultats ne nous permettent pas de d6cider si l'un, ou les deux sont actifs comme accepteurs des acides arnin6s.

Rappelons que dams nos exl~riences pr6c6dentes s les pr6parations enzymatiques purifi6es contenant I-3 % d'acides nucl6iques pouvaient former des peptides sans addition de RNA exog6ne. Nous avons v6rifi6 que le RNA de ces enzymes contient une fraction de RNA A marquage rapide. Isol6 A partir des polypeptide synth6tases purifi6es, ce RNA fixe les acides amin6s dans les conditions d6crites.

Souhguons enfin que des enzymes purifies ~ partir d'Escherichia coli, probable- ment identiques aux polypeptide synth6tases, sont capables de d6grader les ribo- nucl6oside 5'-triphosphates en pr6sence de L-acides amin6s aa. Des extraits des levures semblent 6galement contenir ces enzymes ~s. Certains syst~mes subcellulaires d'origine animale ~,l~ poss~dent des enzymes pr6sentant des analogies avec ceux utilis6s dans notre travail. De plus une fixation d'acides amin6s sur le "RNA des microsomes" du foie de rat semble avoir ~t6 observ6e en pr6sence d'extraits solubles is,~.

REMERCIEMENTS

Nous remercions vivement le Professeur J. MONOD pour tout l ' int~et qu'il a bien voulu prendre ~ ce travail.

Les ~chantillons de poly-AGUC et de poly-U nous ont ~t~ aimablement donn~s par le Dr. M. GRUNBERG MANAGO que nous remercions.

Ce travail a bdn6fici~ de l'aide du Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research, du National Institutes of Health, du Commissariat ~ l'Energie Atomique et de la D~|dgation g~n~rale ~ la Recherche Scientifique et Technique.

Biochim. Biophys. Aaa, 72 (x963) 585-597

ACIDE AmNg-RNA. vI 597

R~SV~

Des enzymes purifids d'Alcaligenes/aecalis forment des peptides ~t partir d'acides aminds libres en prdsence d'une fraction de RNA. Ce RNA accepte tousles L-acides aminds "activds" en prdsence de chacun des quatre ribonucldoside 5'-triphosphates; le complexe "acide amind-RNA" a dtd isold. La fraction de RNA actif fut identifid comme RNA ~t marquage rapide, mdlange de RNA messager et de RNA dosomal. Les analogues des bases, incorpords dans cette fraction modifient sa capacitd ~ fixer les acides aminds.

B I B L I O G R A P H I E

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“acide aminé-acide ribonucléique”, intermédiaire dans la synthèse des liaisons peptidiques....

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