Philippe Garneau

Étude de la régulation de l'expression des gènes cysE et

cysS de Batcillus subtitis : Surproduction et puriffcation de

leurs produits respectifs, et production d'anticorps

spécinques.

Mémoire

présenté

a la Faculté des études supérieures

de l'université Laval

pour l'obtention

du grade de Maître ès sciences (M. Sc.)

Département de biochimie

Faculté des sciences et de génie

Université Laval

O Philippe Garneau, 1999.

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Résumé

Les gènes cysE et cysS de Bacülus subtüis sont cotranscrits et sont

régulés par un même mécanisme d'antitemiinaison de la transcription

contrôlé par le niveau d'ARNtCVs. Les rôles divergents des produits de ces

deux gènes (respectivement la sérine acétyltrarisférase (SAT) et la

cystSny1-ARNt synthétase (CysRS)) par rapport à la L-cystéine soulèvent la

possibilité d'un second mécanisme de régulation de leur expression. En

effet. la SAT contribue à former de la Gcystéine alors que la CysRS l'utilise

lors d'une étape cruciale de la biosynthèse des protéines. C'exploration de

l'existence d'un second mécanisme constitue l'objectif de ce projet de

maîmse. Dans le cadre de ce projet. la SAT et la CysRS ont été

surproduites et purifiées, pour permettre la production d'anticorps

spécifiques. Ces derniers ont été obtenus. et ont permis de mesurer le

niveau -intraceUulaire de la CysRS dans des échantillons de B. subtilis

cultivé en rniueu minimal-glucose avec différentes sources de soufke; des

variations de ces niveaux dan t jusqu'à 3 fois ont été obsenrées selon la

nature de la source de soufre. La SAT n'a pu être détectée dans ces

échantillons de B. subtil&. en raison de la faible spécificité des anticorps

obtenus lors de l'immunisation contre un variant synthétique de celle-ci,

qui possède une queue d'histidines à son extrémité N-terminaie.

Tout d'abord, je tiens à remercier le Dr. Jacques Lapointe. pour sa

patience lors de la correction préliminaire de ce mémoire et ses 0

encouragements durarit les longues périodes creuses qui ont parsemé ce

projet de maîtrise. Je tiens également à remercier pour leurs conseils et

leur opinions les membres de mon comité aviseur, les Dr. Michel Frenette.

Serge Laberge et aussi M. MartLn Pelchat. qui sera lui aussi bientôt

Docteur.

J'aimerais remercier pour leur soutien, leurs conseils et de

nombreux petits et grands senrices, les membres du laboratoire de

biosynthèse des protéines que j'ai côtoyé lors de mon séjour : le Dr. Yves

Gagnon, le Dr. Nathalie Champagne, Daniel Dubois, Éric Madore, J o ë e

Gauthier, Pierre-Marie Akochy. le Dr. Marie-Hélène Mazauric, et Louis-

Patrick Gagnon. Des remerciements encore plus chaleureux pour le Dr.

Lucille Lacoste et Mme Yang, également de ce laboratoire. pour leur aide

essentielle à l'aboutissement de ce projet.

J'aimerais aussi remercier Josée Lamoureux du laboratoire du Dr.

André Darveau, ainsi que le Dr. Darveau lui-même, pour l'aide qu'ils ont

apporté lors de mes Westerns.

J e souhaite également remercier mes amis, Alain Labbé et Christian

Blouin, qui malgré l'éloignement de leurs lieux d'études de doctorat

respectif& ont su me prodiguer de nombreux conseils et encouragements.

et ont su parfois comment me faire voir mes problèmes d'une perspective

plus heureuse.

En dernier lieu, je souhaite exprimer ma plus complète gratitude envers

ma famiue, qui m'a supporté tout au long de ce projet de maîtrise.

Table des Matitres.

Résumé:

Avant-Propos: Remerciements

Table des matières:

Liste des Tableaux et Figures

Abréviations utilisées:

Chapitre 1 : Introduction: 1

1.1) Aminoacyl-ARNt synthétases chez les procaxyotes. 1

1.1.1) rôle et importance des aaRS chez les organismes vivants. 1

1.1.2) nécessité d'une régulation de l'expression des gènes

codants pour des aaRS. 2

1.2) Régulation de i'expression des gènes des aaRS chez les

procaryotes.

1.2.1) Régulation de l'expression des gènes procaryotes

en général.

1 -2.1.1) au niveau transcriptionne1

1.2.1.2) au niveau traductionnel

1 -2.1.3) dégradation des ARNm

1.2.2) Mécanismes de régulation de l'expression de

certaines aaRS chez Escherichia coli.

1.2.3) Mécanismes de régulation de i'expression des

aminoacyl-ARNt synthétases chez B. subtüis.

1.2.3-1) Généralités

1.2.3.2) L'antiterminaison de la transcription

1.3) Description de l'opéron gItX-cysE-cysS de BacilLus subtüis. 11

1.3.1) Position, arrangement et transcription des gènes. 11

1.3.2) Régulation de l'expression de cysE et cysS par

l'antiterminaison de la transcription.

1.3.3) Particuliarités des transcrits.

1.4) Biosynthèse et utilisation de la cystéine chez les procaryotes.

1.4.1) Le sentier de biosynthèse de la cystéine chez E. coli

1.4.1.1) Description de l'ensemble de la voie de

biosynthèse.

1.4.1.2) La cystéine synthétase.

1.4.1 -3) Le régulon cystéine.

1.4.1.4) La séruie acétyltransférase.

1.4.2) Biosynthèse de la cystéine chez Bacillus subtilis

et les autres bactéries Gram-positives.

1.4.3) La cystéine comme précurseur d'autres composés.

1.5) Problématique.

1.6) Objectifs du projet.

Chapitre 2 : Matériel e t Méthodes.

2.1) Matériel utilisé.

2.1.1) Souches bactériennes et plasmides.

2.1.2) Enzymes, oligonucléotides et réactifs divers.

2.1.3) Milieux de culture utilisés.

2.2) Méthodologie.

2.2.1) Conditions de culture.

2.2.2) Préparation et traitement des extraits celiulaires.

2.2.3) Techniques de génétique moléculaire.

2.2.4) Dosages des protéines.

2.2.5) Techniques d'électrophorèse.

2.2.6) Méthodes de dosage enzymatique.

2.2.6.1) Méthode de dosage de l'activité CysRS.

2.2.6.2) Méthode de dosage de l'activité SAT.

2.2.7) Chromatographies.

2.2.7.1) Utiüsées lors de la purifkation de la QsRS.

2.2.7.1.1) Chromatographie d'échange d'anions.

2.2.7.1.2) Chromatographie sur colonne

d'hydroxyapatite.

2.2.7.2) Uülïsées lors de la purification de l'HisSAT.

2.2.8) Techniques immunologiques.

2.2.8.1) Protocole d'immunisation des lapins.

2.2.8.2) Méthode de dosage des niveaux intracellulaires

des protéines par immunodétection.

2.2.9) Conditions de protéolyse de l'HisSAT.

Chapitre 3 : Résultats et Discussion. 42

3.1) Surproduction et purification de la CysRS de B. subfilis

et préparation d'anticorps contre cette enzyme.

3.1.1) Transfomation de la souche E. coli DH5a

avec le plasmide pYG209.

3.1.2) Surproduction de la CysRS de B. subtilis chez

E, coli DH5a.

3.1.3) Purification de la CysRS.

3.1.3.1) Partition dans un système à 2 phases.

3.1.3.2) Chromatographie d'échange d'anions.

3.1.3.3) Chromatographie sur c o l o ~ e d'hydroxyapatite.

3.1.3.4) Electrophorèse préparative de la Q s R S .

3.1.4) Obtention d'anticorps de lapin contre la CysRS

de B. sublilis.

vii

3.1.4.1) Immunisation de lapins avec la CysRS

purifiée.

3.1 A.2) Tests de la spécificité et de la sensibilité

des sérums anti-CysRS.

3.2) Niveaux intracellulaires de la CysRS chez B. subtiüç 1Al.

3.3) Clonage du gène cysE de B. subtüls. surproduction et

puriacation de 1'HisSAT, et préparation d'anticorps.

3.3.1) Construction du vecteur d'expression pET16bcysE.

3.3.2) Surproduction et purification de I'HisSAT.

3.3.2.1) Surproduction de I'HlsSAT.

3.3.2.2) Chromatographie d'affinité.

3.3.2.3) Chromatographie d'échanges d'anions

à haute vitesse.

3.3.2.4) Coupure de la queue de la polyhistidine

de I'HisSAT.

3.3.2.5) Electrophorèse préparative de I'HisSAT.

3.3.3) Obtention d'anticorps de lapin contre I'HisSAT

de B. subtiZis.

3.3.3.1) Immunisation de lapins avec 1'HisSAT

purifiée.

3.3.3.2) Tests de la sensibilité et de la spécificité

des sérums anti-HisSAT.

Chapitre 4 : Conclusion générale.

4.1) Survol des résultats obtenus.

4.2) Perspectives.

Liste des Tableaux et des Figures. Titre :

F i w e 1 : Structures secondaires de la région a leader . de

l'ARN messager codant pour le gène thrS de Bacillus

subtilis selon le niveau intraceUulaire de thréonyl-mtThr.

F i ~ e 2 : Carte physique des gènes glUZ, cysE. et cysS

de Bucillus subtüh.

Figure 3 : Mécanisme d'antiterminaison de la transcription

de l'opéron gltX-cysE-cysS.

Figure 4 : Alignement des séquences de type

Shine-Dalgarno des gènes cysE et cysS avec la

partie homologue de l'extrémité 3' de I'ARNr 16s

de Bacillus subtilis.

m e 5 : Chevauchement des gènes cysE et cysS

de Bacillus subtüis.

Figure 6 : Sentier de biosynthèse de la cystéine et

mécanismes régulateurs le contrôlant.

F i ~ e 7 : Représentation schématique des fonctions

de la sérine acétyltransférase (SA3 et de la

cystéïnyl-ARNt synthétase (CysRS)dans la biosynthèse

de la Gcystéine.

Tableau 1 : Description des souches bactériennes employées

dans le cadre de ce projet de maîtrise.

Tableau 2 : Séquences des oligonucléoti~es synthétisés

dans le cadre de ce projet de maîtrise.

Figure 8 : Surproduction de la CysRS de B. subtilis dans

E. coli DH5a(pYG209) après induction de la transcription

de cysS avec de I'IPTG.

Figure 9 : Résultats de la chromatographie d'échange

d'anions Q-Sepharose lors de la purification de la CysRS.

Fimire 10 : Chromatographie de la CysRS sur colonne

d'hydroxyapatite.

Tableau 3 : Purification de la cystéinyl-ARNt synthétase

de B. subtil& surproduite à partir de 10.5 g (poids humide)

de cellules de E. coli DH5a(pYG209), suite à l'induction à l'IPTG

1 m.

Figure 11 : Analyse par SDS-PAGE de fiactions provenant

de plusieurs des étapes de purification de la QsRS.

F i m e 12 : Imrnunoempreinte a Western r de la CysRS de

Baciüus subtilis 1Al obtenue de cultures en &eux

minimaux Mg-glucose en présence ou non de divers acides

minés.

Figure 13 : Quantification des niveaux intracellulaires

de CysRS chez BacüZus subtilis cultivé en milieu

minimal Mg + glucose 1%.

Figure 14 : Courbes de croissance de B. subtitis 1A1 en

milieu minimal M9+ glucose 1% supplémenté de certains

acides aminés.

F i ~ e 15 : Représentation schématique de la mutagenèse

par PCR et du sous-clonage du gène cysE dans le vecteur

de surexpression pET16b.

Figure 16 : Surproduction de i'HisSAT dans

E. coli BL2 1 (DE3)pLysS/pETlGb cysE.

F i m e 17 : Chromatographie d'affinité de I'HisSAT sur une

colonne de résine HisBind (NoMgen).

Firnire 18 : Résultats de la chromatographie haute vitesse de

lWsSAT sur un échangeur d'anions de type POROS.

F i m e 19 : Essais de cïivage de la queue d'histidines de I'HisSAT

par le facteur Xa.

F ime 20 : Tests de I'immunodétection de la SAT de B. subtil& par

des sérums anti-HisSAT.

Liste des Abréviations

OC :

aaRS :

ADN :

ARN :

ARNm :

A m :

Asn :

Asp :

BSA :

Cys :

CysRS :

d m :

m:

DTNB :

DTT :

EDTA :

Fmt :

Gh :

Glu :

HEPES :

His :

HisSAT :

degré Celsius

aminoacyl-ARNt synthétase

acide désoxyribonucléique

acide ribonucléique

ARN messager

ARN de transfert

asparagine

acide aspartique

albumine sérique bovine

cystéine

cystéinyl-ARNt synthétase

didésoxyribonucléotides

mélange équimolaire de quatre désoqribonucléotides :

ATP, CTP, 'ITP et GTP.

5.5'-dithionitro (acide benzoïque)

dithiothréitol

éthylènediamine tétraacétate

N-formyl-méthionine m e t )

glutamine

acide glutamique

N-12-hvdroxvethvl~i~erazine-N'l2-ethaneslhoc acidl

histidine

Sérine acétyltransférase avec 10 histidines et un site de

reconnaissance du facteur X à à l'extrémité N-terminale.

Immunoglobuline

isoleucine

isopropyl-P-D-thiogalactopyranoside

Luria-Bertani

xii

Leu :

Lys :

PCR :

PMSF :

SAT :

SDS :

SDS-PAGE :

Ser :

Stp :

Thr:

Tm :

leucine

lysine

polymerase cimût reaction

phénylméthyisulphonylfIuorure

sérine acétyltransférase

sodium dodécyl sulphate

sodium dodecyl sulphate polyacry lamide gel

electrophoresis

serine

arrêt de la traduction.

thréonine

température de fusion (pour un ADN bicaténaire. c'est la

température à laquelle il y a bris de 50% des ponts

hydrogènes).

tryptophane

Chapitre 1

Introduction

1.1 Les aminoac~l-ARNt smthétases chez les ~rocaryotes.

1,Ll Rôle et importance des amhoacyl-ARNt svnthétases.

Les arninoacyl-ARNt synthétases (aaRS) sont des enzymes

ubiquitaires essentielles au fonctionnement de la biosynthèse des protéines.

Elles catalysent la réaction d'activation d'un acide aminé spécifique, ainsi

que celle de l'estérification par cet acide aminé activé du ribose de I'extrémité

3' d'ARNs de transfert spécifiques à chacune de ces enzymes. La spécificité

de ces réactions contribue a la capacité des ribosomes de respecter

fidèlement le message génétique lors de la synthèse des protéines. Comme

les aaRS régissent la première étape de la biosynthèse des protéines. leur

activité fait l'objet d'un contrôle dépendant de la demande cellulaire des

produits de leurs réactions. Ce contrôle peut être effectué à deux niveaux,

soit celui de leur activité enzymatique, ou bien celui de la quantité de ces

enzymes dans l'organisme.

Tout d'abord, comme pour la plupart des enzymes. l'activité

enzymatique des aaRS est fonction de l'équilibre entre les concentrations de

leurs substrats et celles de leurs produits. Dans des conditions de

croissance exponentielle, de l'ordre de 80 à 85% des ARNt sont aminoacylés,

et ce pourcentage ne semble pas varier considérablement. Également. le fait

que les activités des différentes aaRS correspondent aux niveaux

d'incorporation de leus acides aminés propres dans les protéines en

formation semble indiquer que ces enzymes ne jouent pas un rôle limitant

pour la synthèse protéique (Gnuiberg-Manago, 1996). Cependant, un

équilibre entre le niveau intracellulaire des aminoacyl-ARNt synthétases et

les concentrations d'ARNt est très important pour contrôler la fidélité du

mécanisme de biosynthèse. En effet. il a été démontré qu'une surexpression

de la glutaminyl-ARNt synthétase de Escherichia coü in vivo produisait un

niveau élevé d'aminoacylation de l'ARNt supresseur ambre avec de la

glutamirie. Cet effet est annulé lorsque l'ARNtc"'' est également surproduit

(Swanson et d 1988).

Cette constance dans la quantité de leurs produits, du rapport

enzyme/ARNt ainsi que leur rôle important dans le métabolisme cellulaire

semblent exclure que les aminoacyl-ARNt synthétases soient contrôlées

finement au niveau de leur activité. Malgré cela. les aaRS de classe Ic

requièrent la présence de leur ARNt pour se iier à leur acides aminés

respectifs (Moras, l992). Aucun autre cas connu de contrôle allostérique de

cette classe d'enzymes n'a été rapporté a ce jour. Ainsi, il semblerait que ce

soit davantage au niveau de I'expression des gènes des aaRS que serait situé

la régulation du niveau d'efficacité de ces enzymes.

1.1.2 : Nécessité d'une régulation cellulaire contrôlaat

l'emression des gènes codant Dour les aminoacvl-ARNt synthétases.

Il a été observé chez la bactérie E. coli que la concentration en aaRS

pouvait varier selon certaines conditions physiologiques. Dans cette

bactérie, il a été montré pour 10 aaRS qu'une moyenne de 500 molécules

était retrouvée par génome en milieu minimal avec u n e seule source de

carbone, alors que la moyenne observée était supérieure à 800 en conditions

de culture riches (Bremer et Dennis, 1987; Neidhardt et d 1977). De plus.

la plupart des aaRS montrent une variation de l'ordre de deux fois de leurs

niveaux de synthèse en réponse à une variation de la température de la

culture de 28 à 42°C (Lemaux et d1978). il faut ajouter que le taux

d'aminoacylation des ARNt joue un rôle très important au niveau même du

métabolisme cellulaire. Il pourrait. en influençant le niveau intracellulaire

de ppûpp, semir de signal à la régulation stringente. du moins chez la

bactérie E. coli (Grunberg-Manago. 1996). Les aminoacyl-ARNt synthétases

s'avèrent donc d'une telle importance, pour l'ensemble des processus

cellulaires bactériens qu'il est nécessaire d'en savoir plus sur les mécanismes

moléculaires qui contrôlent leur expression.

1.2 : Régulation de l'ex~ression des gènes des aaRS chez les

procamotes.

1.2.1 : Rédation de l'ex~ression des gènes nrocarvotes en

générai.

Les gènes procaryotes peuvent être contrôlés à diverses étapes de leur

expression. soit lors de la transcription de leur séquence d'ADN en ARN

messager. et également lors de la traduction du message génétique sur cet

ARNm en un polypeptide. Ce polypeptide peut être ensuite modifié de

différentes façons avant de former une protéine capable de jouer le rôle qui

lui est alloué dans la machinerie ceiiulaire. Ces modifications sont parfois

l'objet d'un contrôle. Également, la durée de vie de I'ARN messager vient

jouer un grand rôle dans le niveau d'expression d'un gène donné. et peut

aussi êixe la cible d'un mécanisme de régulation.

1-2-1.1 : au niveau transcriptionne1

L a transcription d'un gène en un ARN messager est souvent l'objet

d'un ou de plusieurs modes de régulation. En effet, un gène peut faire

partie d'un opéron, et voir ainsi son expression liée a plusieurs autres gênes

ayant des fonctions complémentaires. L'expression d'un tel opéron peut être

alors contrôlée de façon à ce qu'elle soit déclenchée uniquement lorsque le

besoin s'en fait sentir, comme c'est le cas de i'opéron lac de E. coli ou des

opérons de biosynthèse des acides aminés, comme i'opéron trp. Ce contrôle

peut s'eSectuer lors de l'initiation de la transcription, comme dans le cas de

l'opéron lac, ou lorsque celle-ci est amorcée. et que i'ARN polymérase

rencontre des obstacles qui viennent ralentir ou arrêter son activité. comme

c'est le cas pour l'opéron trp. Dans ces deux cas, ces modulations de

I'activité de I'ARN polymérase sont causées par des conditions intracellulaires

précises, soit l'absence de P-galactoside intracellulaire dans le cas de l'opéron

lac et une haute concentration en tryptophane dans le cas de I'opéron trp

(Singer et Berg. 1992). Il sera question plus loiri (à la section 1.2.3) de

mécanismes similaires affectant l'expression de certaines aminoacyl-ARNt

synthétases d'E. colï.

1.2.1.2 : au niveau traductionne1

Plusieurs parallèles ont été remarqués entre les processus de la

transcription et de la traduction. En effet. ces deux processus requièrent

l'assemblage séquentiel d'un complexe enzymatique à un endroit précis d'une

matrice d'acides nucléiques. Ainsi, un peu de la même façon. la traduction

d'un gène peut être contrôlée à son initiation seIon la nature et la

disponibilité du site de fixation du ribosome, mais aussi lors du processus

lui-même. par I'interférence de la structure secondaire de I'ARN messager ou

d'autres protéines qui s'y lient également. De plus, la f i n de la traduction

d'une séquence codante peut permettre dans certains cas d'initier celle d'un

gène adjacent, où l'absence d'un site de fixation fort pour les ribosomes

diminue fortement l'expression. En effet, un modèle, présenté par Adhin et

van Duin (1990). stipule que la sous-unité 30s du ribosome a la

particularité de se déplacer sur une assez courte distance le long d'un ARNm

jusqu'à ce qu'elle trouve un site favorable à l'initiation de la traduction. La

sous-unité 30s peut se déplacer autant vers l'extrémité 3' que l'extrémité 5'

de I'ARNm. Toutefois, le modèle de Adhin et van Duin ne démontre qu'une

telle recherche d'un site d'initiation de la traduction ou nscanningr que dans

un cas particulier, celui d'une rémtiation traductionnelle, soit après que le

ribosome ait terminé la traduction d'une séquence codante. Lorsqu'une

seconde séquence codante dotée d'un codon d'initiation est présente près

(e40 nucléotides. en amont ou en aval) du codon stop du premier gène. la

sous-unité 30s va initier la traduction de ce second gène, sans qu'une

séquence Shine-Daigarno soit nécessaire à sa fixation.

1.2.1.3 : dégradation des ARNm

Le modèle de dégradation couramment accepté, qui date de moins de

10 ans. provient presque exclusivement de l'étude de E. coli (Hue et aL 1995).

Chez cette bactérie. les ARNm sont dégradés par un groupe de cinq

ribonucléases, dont trois sont des endonucléases. la RNAse III, la RNAse E et

la RNAse K. Les d e n autres enzymes sont des exonucléases, la

polynucléotide phosphorylase (PNPase) et la RNAçe II qui dégradent 1'ARNm

de l'extrémité 3' vers 5'. Tout d'abord, 1'ARNm est parcouni à partir de

l'extrémité 5' vers i'aval par les endonucléases qui recherchent leur site de

coupure. et qui clivent le brin après l'avoir trouvé. Les nombreux fkagments

résultants sont alors dégradés par les exonucléases. Ce procédé laisse aux

ARNm des demi-vies allant de 0.5 à 20 minutes chez les procaxyotes

(Pedersen. et ai. 1978, Nilsson et aL 1984). Iî semble dors évident que la

dégradation des ARNm est un facteur déterminant du niveau d'expression

génétique. La régulation de la demi-vie du message génétique codant pour

les protéines pourrait être une façon pour l'organisme de contrôler le taux

cellulaire de synthèse de ces demiêres. Ainsi, une telie variation (40 fois)

daiis les demi-vies de différents ARNm pourrait être expliquée par l'existence

de modes de protection contre la dégradation (Hajnsdorf et cd, 1994).

Seulement quelques modes de protection de ItAFtNm contre la

prédation par les ribonucléases ont été élucidés. L'un de ceux qui semblent

être les plus répandus est la présence d'une structure secondaire en tige et

boucle à l'extrémité 3' de I'ARNm, laissée par l'arrêt de la transcription à la

suite d'un t e m a t e u pindépendant. Certaines études ont établi que

l'effiacité de cette protection est plus importante in vwo qu'in vitro. Cela

laisse supposer que des facteurs protéiques pourraient être impliqués dans le

blocage des nucléases au niveau de cette structure en 3' de I'ARNm (McLaren

et aL 199 1). Une autre méthode de stabilisation semble être la coupure de

l'ARNm dans des régions importantes de la structure secondaire de ce

dernier; par exemple 1'ARNm de thrS de Bacülus subtüis est clivé entre la

boîte T et le terminateur, ce qui laisserait 1'ARNm avec une structure en tige

et boucle en 5' (Condon et aL 1996). Il a été montré qu'une telle structure

protège l'ARNm contre I'attaque des ribonuclêases (Belasco et aL 1986).

1.2.2 : Mécanismes de réguïatian de l'expression de certaines

aaRS chez Escherichia coli.

De façon générale, l'expression des gènes des aaRS est soumise à la

régulation métabolique, c'est à dire qu'elle est samulée par une

augmentation du taux de croissance cellulaire. L'augmentation de

l'expression des aaRS est de 2 à 3 fois pour chaque augmentation de 5 fois

de ce taux. Par contre, les gènes des aaRS ne semblent pas particulièrement

sensibles à la régulation astringente)). et ce malgré le fait que la production

des ARN stables (ARNr et M t ) est stoppée en réponse à celle-ci. Toutefois,

chez E. colt 10 gènes d'aaRS voient la répression de leur expression levée par

une carence en leurs acides aminés correspondants, mais pas par une

carence globale de plusieurs acides aminés (Grunberg-Manago. 1996). Ce

type de régulation permettrait au micro-organisme d'utiliser plus

efficacement des concentrations faibles de l'acide aminé en question.

Comme cela a été mentionné plus haut (section 1.1.2), environ la moitié des

aaFS voient leur expression réprimée de l'ordre de deux fois lors d'un

changement de température soudain, ce qui est également obsenré dans les

cas des facteurs d'élongations EF-G et EF-T mais pas dans celui du facteur

EF-Tu. Dans Ia plupart des cas. on ignore les mécanismes exacts par

lesquels ces régulations sont exercées.

Toujours chez E. colt l'expression des gènes des aaRS est contrôlée de

multiples façons. Par exemple. le site d'initiation de la traduction du gène

thrS est précédé d'une séquence %leader. qui peut prendre les formes de deux

structures secondaires remarquablement similaires à celle du bras de

l'anticodon de deux A R N ~ ~ isoaccepteurs (Romby et cd 1996; Moine et d

1990). L a thréonyl-ARNt synthétase reconnaît ces deux structures

secondaires de l'ARN messager et peut ainsi réprimer sa propre biosynthèse

lorsqu'elle n'est pas associée à ~ ' A R N ~ ~ (Springer, et aL 1985).

L'autorégulation traductionnelle est loin d'être le seul type de contrôle de

l'expression des gènes des aaRS chez E. colt D'autres mécanismes (Ekztney

et SchirnrneI 1981: Fayat et aL 1983). tels que la répression

transcriptionrielle dans le cas du gène alaS ainsi que l'atténuation

transcriptiomeile pour les gènes pheST ont également été proposés, quoique

dans le premier cas, il n'aitjamais été démontré in vivo (Putzer. 1997).

1.2.3 : Mécanismes de régulation de I'emnssion des aminoacvl-

ARNt synthétases chez B. subtilis.

1.2.3. 1 : Généralités

Chez B. subtüis, une bactérie Gram-positive, l'expression de cette

classe d'enzymes est soumise à plusieurs facteurs différents de ceux

découverts chez E. coli

En premier lieu, contrairement à la situation chez E. coli, la grande

majorité des gènes des aaRS sont transcrits dans le même sens que l'onde de

réplication du chromosome de cette bactérie. 11 est à noter que cette

disposition des gènes est partagée avec plus de 80% des transcrits de B.

subtiiis. incluant tous les gènes fortement exprimés étudiés jusqu'à

maintenant. Il est possible que cet arrangement soit favorable au bon

fonctiomement conjugué de la répiication et de la transcription (French,

1992). De plus. les gènes des aaRS sont principalement regroupés en trois

sections sur le chromosome de B. subtüis, ce qui est également différent du

cas de E. coli, où ils sont plutôt dispersés. Toutefois, on ignore à ce jour les

raisons de tels regroupements. Notons également l'absence de glutaminyl-

ARNt synthétase (GLnRS), remplacée par l'action conjugée de la glutaniyI-

ARNt synthétase et d'une g l u t a m y 1 - ~ ~ ~ t ~ ~ amidotransférase. Cette

amidotransférase a été retrouvée chez la majorité des organismes procaryotes

(Gram-positifs, cyanobactéries) et les archaebactéries mais pas chez les

bactéries pourpres (à l'exception de Rhizobium melitoti (Gagnon et aL 1996)).

ni les organismes eucaryotes, à l'exception de leurs organelles (pour une

revue, voir Freist et al. 1998).

Une autre différence entre les gènes des aminoacyï-ARNt synthétases

d'E. coli par rapport à celles de B. subtilis se retrouve au niveau du contrôle

de leur expression. En effet, chez cette demière bactérie ainsi que chez

plusieurs autres organismes Gram-positifs. plusieurs gènes, dont plus de la

moitié des gènes d'aaRS et certains opérons de biosynthèse d'acides aminés

sont conk6lés par un seul type de mécanisme, l'antitemiiriaison

transcrip tiomeue.

Le mécanisme d'antiterniiriaison de la transcription par intéraction

d'un ARNt avec l'ARNm en construction est particulièrement bien connu pour

le gène th6 de B. subtüb. codant pour la thréonyl-ARNt synthétase (ThrRS)

(voir figure 1). Tout d'abord, la structure de la région du .leader. comporte

u n terminateur p-indépendant, qui &te la transcription de 1'ARNm de thrS

en conditions où le niveau intracellulaire de thréonyI-ARN~' est sufAsant

pour la cellule, donc de façon générale beaucoup plus important que le

niveau libre. Lorsque le niveau d'mtThr libre vient à augmenter.

ce qui veut dire soit qu'il y ait diminution du niveau de thréonyl-ARNt

synthétase. soit qu'a y ait diminution de.la concentration intracellulaire en

thréontne. la ceiiule a un besoin accru de cet enzyme. L'anticodon GGU de

I'ARN~- vient alors se lier à un codon spécificateur ACC à l'aval de la boîte T

d'un ARNm codant pour thrS en voie de synthèse. Son extrémité 3'

acceptrice. CCA, va alors se lier à une courte séquence complémentaire GGU.

située dans la boite T, ce qui déstabilise la structure du terminateur et

forme une autre structure, i'antitemiinateur. Celui-ci permet la suite de la

transcription de I'ARNm. et ainsi l'expression de thrS en 'ïhrRS. ce qui va

faire diminuer le niveau ~ ' A R N ~ ~ libre dans la cellule, donc qui va rétablir

par a feedback * la structure du temxinateur. Cela arrête alors l'expression

de thrS (Putzer et aL 1992. Grundy et Henkin, 1993).

A cette action de I'ARNt non chargé sur la structure secondaire du

leader de l'ARNm codant pour l'aaRS correspondant s'ajoute possibiement

celle de l'ARNt chargé. avec lequel il serait en compétition pour les sites de

fixation sur la séquence leader (Grundy et aL 1994. Garrity et Zahler, 1994).

Ce type de régulation par compétition permet sans doute un contrôle très fin

de l'initiation de la traduction des gènes dotés de boîtes T sur la séquence

leader de leur ARNm.

FIQUIC 1 : Structures secondaires de la région a leader . de I'ARN messager codant pour le gène thrS de B. subtüis selon le niveau intracdulaire de thréonyl-ARN~~: La figure du haut (A) représente la forme de I'ARNm en présence d'un niveau élevé de thréonyl-ARN~~. alors que la figure du bas (B) représente le cas ofi le niveau d'MtRir non-chargé est élevé (Condon et d 1996).

1.3 : Description de l'opéron alGK-cusBcusS de Bacillus subtitis.

1.3.1 : Position et arrangement et transcription des gènes.

L'opéron gWC-cysE-cysS est situé à environ 9 O (105 000 pb) de l'origine

de réplication du génome de B. subtüis. L'opéron contient trois gènes codant

respectivement pour la glutamyl-ARNt synthétase (GluRS). la sérine

acétyItransférase (SA-. et la cystéinyl-ARNt synthétase (CysRS) (figure 2).

L a séquence de cet opéron a été déterminée par l'équipe du Dr. Lapointe

(Breton et aL . 1990; Gagnon et d 1994.). qui a démontré que les gènes gWZ.

cysE et cysS sont CO-transcrits dans cet ordre a partir d'un promoteur situé à

40 pb en amont du codon d'initiation de gWL Il s'agit du premier cas connu

où les gènes de deux aaRS sont CO-transcrits. soit gltX et cysS.

Également. comme la sérine acétyltransférase est la première eIlzyme de la

voie de biosynthèse de la cystéine. l'opéron gWZ-cysE-cysS est le premier cas

rapporté de CO-transcription d'un gène d'aaRS avec celui d'une enzyme de la

voie de biosynthèse de l'acide aminé correspondant. 0.5 Kb

FfPurc 2: Carte physique des gènes gW cysE, et cysS de B. subtiZis (Gagnon et al. 1994). Un promoteur est situé en amont du gène g l K II initie Ia transcription des gènes de gauche à droite de la figure. Une structure de terminaison de la transcription p- indépendante (représentée par une structure en tige et boucle est située entre les gènes gltX et cysE, immédiatement en aval de la boîte T. Eue arrête la transcription après gltX en présence d'une forte concenhation de cystéinyl-ARN~~. La boîte T induirait l'antiterminaison de la transcription a ce terrninateur à basse concentration de cystéinyl- A R N ~ ~ et ainsi la synthèse d 'un long transcrit Un site de coupure de ce Iong transcrit serait situé immédiatement en aval de la structure d 'antiterminaison. donnant un ARNm codant pour güX et un ARNm codant pour cysE et cysS qui conserverait la structure du terminateur pindépendant (Pelchat et Lapointe, 1999).

L'emplacement de la terminaison de la transcription de

cysE-cysS s'avère assez complexe. En effet. seul un transcrit

été obtenu par hybridation Northern avec une sonde située à

i'opéron gltX-

de 1700 pb a

l'intérieur du

gène g W , ce qui permet de situer l'emplacement d'un terminateur entre les

gènes ghX et cysE. Toutefois, aucun autre promoteur n'a été identifié entre

les gènes gItX et cysE, ou en amont du gène cysS. L'expression de ces deux

gènes a été démontrée par complémentation de mutations cysE- et cysS" chez

Ecoli Par contre. dans ces mêmes souches, le clonage de ces deux derniers

gènes sans le promoteur du plasmide a mené à une absence de

complémentation, ce qui suggère fortement que cysE et cysS sont transcrits

à partir du même promoteur que gWC (Gagnon et aL 1994).

Des études plus approfondies ont permis de détecter un banscrit

couvrant les gènes gltX-qsE-cysS (Pelchat et Lapointe. 1997; 1999). La

transcription de ce dernier se terminerait à environ 300 pb en aval du codon

de temitnaison de cysS. Le transcrit de 1700 pb se terminant dans la région

intergénique gltX-cysE dont la séquence est très similaire à une boîte T du

mécanisme d'antiterminaison de la transcription (section l.2.3.S), il est

probable que les gènes cysE et cysS soient assujettis à ce type de régulation.

Cette hypothèse est appuyée par le fait que la surproduction en tram de la

CysRS inhibe la transcription des gènes cysE et cysS (Gagnon et al. 1994).

La région intergénique gltX-cysE est longue de 293 nucléotides. et une fois

transcrite, comporte des séquences pouvant former des structures en tiges et

boucles à même de former un terminateur de la transcription. Ce

terminateur est précédé en aval d'une séquence très conservée qui

correspond aux séquences des boites T retrouvées chez les autres gènes

d'aaRS de B. subtüis et de plusieurs autres organismes Gram-posiafs. En

plus du terminateur , cette mëme région peut former d'autres structures

secondaires moins stables, qui pourraient correspondre à l'antiterminateur

(voir figure 3). Comme dans le cas d'autres mécanismes d'antiterminaison

de gènes d'aaRS. on peut observer en amont de la boîte T un codon UGC

complémentaire à I'anticodon GCA des A R N ~ ~ , dont on a trouvé que cet

isoaccepteur chez B. subfilis (Wawrousek et d 1984. Genbank MD: g143735,

génome cca -cys * Boîte T

cca

O ARNm Boîte T

FiWe 3 : Mécanisme d'antiterminaison de la transcription de l'opéron gltX- qsE-cysS. La partie A montre les conséquences d'une prépondérance de cystéinyl- A R N ~ ~ dans le cytoplasme. où il y a formation d'un temiinateur pindépendant qui empêche toute transcription des gènes en aval. La partie B présente le cas où l'ARNtW non chargé est présent en fortes concentrations intracellulaires. Cet ARNt peut alors se fixer à la boîte T et a des ribonucléotides complémentaires à i'anticodon, ce qui mëne à la formation d'une structure secondaire de 1'ARNm concurrente au terminateur. et ainsi permet la transcription des gènes cysE et cysS. La structure de l'antiterminateur est ensuite coupée. ce qui résulte en 2 ARNm distincts. comprenant respectivement les gènes gWC et cysE-cysS. [Pelchat et Lapointe, 1999)

nucléotides 1464-1534; K u n s t et aL 1997. Genbank NID: g2633055,

nucléotides 14946% 149537; Ciimmirigs et Cornerton, 1997. Genbank NID :

g1673387. nucléotides 16317-16387). On peut en déduire que tous les

éléments du mécanisme d'antiterminaison de la transcription sont présents

en amont des gènes cysE et cysS. et qu'un A R N ~ ~ non-arninoacylé pourrait

se lier par son anticodon au codon UGC et par sa tige accepmce au GGU de

la boite T formant une partie de la structure de l'antitemiinateur.

Ainsi, on peut supposer que dans Ie cas où la concentration de

cystéinyl-ARN~ est élevée par rapport à celie de l'ARNtCys, ce qui est

indicateur de niveaux suffisants de CysRS et de SAT. la structure du

terminateur de la transcription aurait de grandes chances de se former, ce

qui empêcherait l'expression des deux gènes codant pour ces protéines. Par

contre. lorsque le niveau ~ ' A R N ~ ~ non-chargé est élevé. ces ARNt auraient

davantage de chances de se lier à la boîte T et d'y former l'antitexminateur

qui permet l'expression des 2 gènes dont les produits sont requis.

Le mécanisme d'antiterrninaison de la transcription de l'opéron gltX-

cysE-cysS se complique du fait que le long transcrit est coupé en aval du

terminateur, le séparant en 2 ARNm, l'un codant uniquement pour gWC. et le

second pour les gènes cysE et cysS. Cette situation est analogue à la

coupure de l'ARNm du gène thrS, sauf que dans ce cas le site de coupure est

dans l'antiterminateur. Cette forme de coupure de l'ARNm pourrait former à

l'extrémité 5' de l'ARNm cysE-cysS une structure secondaire qui protégerait

ce dernier contre la dégradation par des exoribonucléases. (Pelchat et

Lapointe. 1999; Condon et aL 1996).

1.3.3 : Particuliarités du transcrit cvsEcvsS.

Le transcrit cysE-cysS aurait une longueur d'approximativement 2380

nucléotides. et comporte plusieurs éléments intéressants. En effet. son

extrémité 5' pourrait former une structure secondaire stable en forme de tige

et boucle ne laissant que peu de nucléotides simples brins en 5' où des

exoribonucléases pourraient se fixer (Pelchat et Lapointe. 1999). Par contre.

aucune structure en tiges et boucles n'a pli être détectée en 3' du long ARNm

codant pour les trois gènes. ce qui peut rendre celui-ci vulnérable à l'attaque

des exoribonucléases 3'-5'. Malgré cela, comme le site de terminaison exact

du transcrit n'a pas encore été déterminé. la structure secondaire de la

région en 3' de ce dernier ne peut être identifiée de façon certaine.

Le gène cysS est précédé d'une séquence Shine-Dalgarno bien

conservée et ainsi facilement identifiable. Par contre, la séquence Shine-

Dalgarno du gène cysE est moins conservée. par rapport à la séquence

complémentaire idéale à celle de l'extrémité 3' de l'Amr 16s. comme le

montxe la figure 4. En effet. seulement 6 nucléotides sont conservés d'une

séquence à l'autre, alors que 8 nucléotides le sont dans le cas de cysS. Cela

laisse supposer que cysE est traduit moins efficacement. car les séquences

Shtne-Dalgamo sont très importantes à la première étape du processus de

traduction. De la même manière, le codon d'initiation du gène cysS est un

AUG, qui est commun pour une séquence codante : il est utilisé dans environ

70% des cas chez B. subtilis. Par contre. le codon d'initiation du gène cysE

est un GUG. qui est un codon d'initiation plutôt rare. En effet, il n'est utilisé

que dans 8% des cas chez E. col& quoiqu'il le soit davantage chez B. subtilis.

où les codons mineurs sont utilisés plus kéquemment. En effet, il

semblerait que la force d'une structure d'initiation de la traduction chez B.

subtüiç soit davantage dépendante de la consenration de la séquence Shine-

DaIgarno que du codon d'initiation (Vellanoweth. 1993). Ainsi. la

conservation de ces structures suggère que 1'ARNm du gène cysS soit

fortement traduit. ce qui est confirmé par le haut niveau de surproduction de

la CysRS sous le contrôle d'un vecteur d'expression (Gagnon et al 1994). De

plus, des expériences semblables indiquent que le gène cysE l'est beaucoup

moins.

mure 4 : Mgnement de séquences de type Shine-Dalgamo des gènes cysE et cgsS avec la partie homologue de l'extrémité 3' de I'ARNr 16s de B. subtil&. Les 1- et troisièmes lignes. identiflées 16s. correspondent aux nucléotides complémentaires à ceux des nucléotides 1196 a 1209 de 1'ARNr 16s de B. subtilis (Genbank accession #X60646). La deuxième &ne correspond à la séquence Shine-Dalgarno précédant la séquence codante du gène cysE. La quatrième ligne correspond à la séquence Shine-Daigarno précédant la séquence codante du gène cysSS Les nucléotides en caractères gras et soulignés sont conservés d'une séquence a l'auee.

U n second Srpe de structure de l'ARNm pouvant potentiellement lui

semir de protection contre les ribonucléases est situé à l'intérieur du gène

cysE. En effet, la séquence codante de ce gène contient 4 séquences ayant

une certaine homologie avec l'extrémité 3' de SARNr 16s. Airisi. celles-ci

pourraient être utiîisées par la sous-unité 30s d'un ribosome comme site de

fixation. bien que l'absence de codons d'initiation identifiables interdise toute

traduction a partir de ces points. Ces sous-unités 305 capturées par

l'ARNm pourraient alors nuire aux mouvements des exoribonucléases. Ceae

hypothèse est appuyée par des expériences de protection à la nucléase SI.

qui ont montré que ces stmctures correspondaient aux extrémités 5' de

sous-espèces d'ARNm cysE-cysS dégradés. Cela indique que ces structures

pourraient. in vivo. protéger les parties en aval de l'ARN messager, en

l'occurrence le gène cysS (Pelchat et Lapointe, 1997).

Un troisième élément intéressant sur cet ARNm est le fait que les

séquences codantes des gènes cysE et cysS se chevauchent sur une très

courte distance (voir figure 5). En effet, Le codon de terminaison du gène

cysE est situé à 1 nucléotide en aval du codon d'initiation du gène cysS. Ce

positionnement est presque qu'idéal pour une situation de réinitiation de la

traduction (voir section 1.2.1.2) à partir de la fin de la séquence codante de

cysE vers le codon d'initiation du gène cysS. n faut toutefois rappeler que le

gène cysS est précédé d'une séquence Shine-Dalgamo qui possède un bon

degré d'homologie à l'extrémité 3' de 1'ARNr 16s' ce qui indique que ce gène

serait certainement traduit fortement même sans la présence de cyçE. Donc

en théorie, la présence d'une réinitiation de la traduction dans ce cas

n'apporterait à cysS qu'un apport proportionnel au niveau de traduction de

cysE. selon les conditions où ce dernier est fortement exprimé. Il est

possible que celles-ci soient dépendantes de facteurs liés au processus de

biosynthèse de la cystéine. dont le produit du gène cysE, la sérine

acétyltransférase, est une enzyme-clé.

t I I

séquences peptidiq es :

~ v s ~ v s ~ l v ~ e r ~ l e ~ ç n ~ l n ~ v & ~ tp i

Extrémité C-terminale de la Sérine acétyltransférase, codée par Ie gène cysE. Extrémité N-terminale

de la Cystéinyl-ARNt synthétase. codée par le gène cysS.

Fiéure 5: Chevauchement des gènes cysE et cysS de B. subtiüs. Séquence de I'ARN messager et acides aminés codés pour chaque phase de traduction. La séquence de nucléotides soulignés est la séquence codante du gène cysE incluant le signal de terminaison UGA. alors que la séquence de nucléotides en gras correspond à celle du gène cysS. Les structures primaires partielles des 2 protéines codées par ces gènes sont également présentées selon le même mode, les acides aminés étants placés vis-à-vis leurs codons respectifs.

1.4 Biosmthèse de la cvstéine chez les nrocaryotes.

1.4.1 : Le sentier de biosynthèse de la cpstéine chez E. coli.

1.4.1.1 : Description de l'ensemble de la voie de

biosynthèse.

Toute culture bactérienne a besoin d'une certaine quantité de soufre

pour atteindre une densité cellulaire importante. Chez la bactérie E. colt

cette concentration a été estimée à 70 p M dans un milieu liquide pour que la

culture puisse atteindre une densité de log ceUules/ml (Kredich et aL 1975).

Chez cette bactérie, plusieurs sources de soufre sont utilisées, entre autres le

sulfate, le sulfite, le thiosulfate, la Gcystine et la Gcystéine.

Le chemin métabolique menant à la formation de la cystéine chez E.

coü est caractérisé par la convergence de deux sentiers, l'un servant à l'entrée

du sulfate dans la cellule ainsi qu'à sa réduction en ion sulfide. et le second a

l'activation de la sérine (voir figure 6a). On peut remarquer que la majorité

des enzymes nécessaires à la biosynthèse de la cystéine servent à la

réduction du sulfate en ion sulfide. Si ce dernier est présent dans le milieu

de culture, la biosynthèse de la cystéine ne nécessite que deux enzymes, soit

la sérine acétyltransférase et l'O-acétylsérine (thio1)-lyase (OASL).

Le sulfate entre à l'intérieur de la cellule par un système de transport

périplasmique qui est codée par 5 gènes. cyçP, cysz cysW, c y s . et sbp. Les

cellules intactes de E. colt intègrent le sulfate avec un Km de 36 pM; ce

système de transport utilise également le sulfite, le sélénate, le chromate, le

thiosulfate et le molybdate comme substrats. Les gènes cysW et cysT codent

sans doute pour des peptides homologues transmembranaires qui forment

une ouverture permettant l'entrée de ces substrats. cysA code pour une

protéine associée à la membrane cytoplasmique et qui présente une

homologie à des protéines fiant les nucléotides. Sbp et cysP, les deux

derniers gènes codent pour des protéines périplasmiques liant

respectivement le sulfate et le thiosulfate. Il est à noter que la Lcystéine

semblerait aussi entrer dans les bactéries par I'intermédiaire d'une protéine

périplasmique, ce qui est supporté par la sensibilité à un choc thermique du

système de transport de la cystéine (Delaney & al. 1992).

Une fois le sulfate à l'intérieur du cytoplasme, il est associé à des

dérivés de I'ATP pour pouvoir être réduit par la suite. Cette association,

appelée l'activation du sulfate. débute par une substitution des deux derniers

phosphates d'une molécule d'ATP par le sulfate. ce qui donne de l'adénosine

5'-phosphosulfate (APS) ainsi que du pyrophosphate comme produits. Cette

demière réaction est catalysée par 1'ATP sulfus.lase. Une seconde réaction,

catalysée cette fois par I'APS kinase. ajoute un résidu phosphate à

l'adénosine de W S pour former le PAPS.

Ce composé est alors attaqué par la PAPS sulfotransférase, ce qui

libère alors du sulfite [SOJ. Cette réaction a la particularité d'utiliser la

thiorédoxine comme donneur d'électrons. Il est possible que le résidu

sulfate soit bansféré sur le groupement sulfhydqle de la thiorédoxine réduite

au cours de cette réaction. après quoi un résidu sulfite est libéré de la

thiorédoxine. qui est alors sous la forme oxydée.

Le s&te est ensuite réduit en ion sulfide (s*-) par l'action de la

sulfite reductase NADPH-dépendante. Cette enzyme est un exemple

remarquable de la capacité oxido-réductrice des bactéries, son

action réduisant de 6 électrons l'atome de soufke. L a sulfite réductase

NADPH-dépendante est constituée de deux sous-unités hétérogènes a et P. assemblées selon le rapport a$,. La sous-unité a est une flavoprotéine de

66 kDa codée par le gène q s J . qui a pour fonction d'accepter les électrons

du NADPH et de le transférer à la sous-unité P. qui est un peptide Lié à un

hème. réduisant le sulfite en ion sulfide. L'hème associé à la sous-unité B est particulier : il s'agit d'un sirohème. un cofacteur retrouvé uniquement

chez les sulfite- et les nitrite-réductases. Une fois le sulfite réduit en ion

sulfide, la synthèse de la cystéine peut être effectuée à l'aide de deux

enzymes, la sérlne acétyltransférase et l'O-acétyl sérine (thio1)Iyase (OASL).

Cette demière enzyme est présente sous deux formes dans la cellule :

l'isoforme A qui utilise iïon sulfide pour former la cystéine. et l'isoforme B.

qui utilise le thfosulfate (~~0:') dans le même but.

Sulfate perméase

thioredoxin Kinase

oxydée réduite

/S /SR NADP* NADPH -i- W R I \S R 'SH

3'-Phosphoadenosule 5'- ion sulfide 'tj phosphosulfate

NADPH-Sulphite (s033 PAF'S PAPS

Sérine AcéeyZtransférase Acétyl-CoA

Fimue 6 : Sentier de biosynthèse de la cystéine et mécanismes régulateurs le contrôlant. L a partie A montre le sentier métaboiique aux deux branches convergentes. la première branche comprenant les enzymes d'incorporation et de réduction du s o d e inorganique, alors que la seconde branche décrit les mécanismes d'activation de la sérine, menant à I'échange du cofacteur CoA iié au Cg de la O-acétylsérine par un ion suIfide. La partie B de la figure montre les mécanismes de régulation contrôlant le fonctionnement des différentes parties du sentier de biosynthèse.

BI Induction des gènes

O Sérine

inhibition

S2- acétyltransférase

L-sérine .1- /-• O-acétylsérine

A L-cystéine

acéwl-CoA 1 I O-acétylsérine

N-acétylsérine - (thio1)-1 yase

1.4.1.2 : La cystéine svnthétase.

Chez E. coli et SuimoneUa typhimur[um les deux enzymes de

biosynthèse de la cystéine à partir @ la s é ~ e sont p~cipalemerit

retrouvées ensemble sous la forme d'un complexe multifonctiomel (appelé

cystéine synthétase) comprenant au rninirnum quatre O-acéwlsérine (thio1)-

lyases-A (l'isoforme la plus fréquente) et de quatre à six séririe

acétyltransférases. Ce complexe a un poids moléculaire de près de 309 kDa

mais on observe souvent des agrégats de deux à quatre fois cette taille. Les

seules façons d'obsenrer des SATs sous la forme libre sont de surproduire

l'enzyme (Leu & Cook, 1994 ; Hulanicka & Kredich, 1976). ce qui crée un

surplus ne pouvant pas s'associer avec les OASIS. ou bien d'utiliser une

souche sans OASL. Les études d'activité menées sur la forme libre de la SAT

montrent que la forme complexée n'est pas nécessaire à la fonction in vitro de

l'erizyme. La cystéine synthétase peut ètre dissociée en présence d'O-

acétylsérine, l'un des produits de la SAT et l'un des substrats de l'OASL. Le

K,,, de dissociation du complexe est d'environ 20 pM pour l'O-acétylsérine et

cette dissociation est inhibée en présence de l'ion sulfide.

La s é ~ e acéty1transférase est donc une enzyme de 30 kDa sous la

forme libre, et est codée chez E. coü par le gène cysE (Denk et Bock. 1987).

L'activité de cette enzyme est inhibée de façon allostérique par la Lcystéine.

ce qui permet le contrôle efficace de la production de cet acide aminé par la

bactérie. Il s'agit d'ailleurs du seul exemple de régulation au niveau de

l'activité enzymatique de tout le sentier de biosynthèse de la cystéine.

1.4.1.3 : Le régulo~ cvstéine.

L'un des produits de la réaction catalysée par la SAT est l'O-

acétylsérine, qui est le précurseur direct du N-acétylsénlne, l'inducteur du

régulon cystéine. qui contrôle l'expression de la quasi totalité des gènes

codants pour les enzymes de la voie d'activation et de réduction du sulfate

(voir figure 6B de ce mémoire; Kredich. 1996: chapitre 3 1, tableau 11,

incluant les gènes codant pour les deux isoformes de I'OASL, airisi que les

gènes cysK et cysM. L'expression des gènes du réguion cystéine est régulée

par le facteur de transcription CysB, qui agit comme activateur pour la

majorité de ceux-ci. à l'exception de cysB, où on assiste à un cas

d'autorépression, et q s E , dont l'expression en la SAT ne semble pas être

contrôlée, contrairement à ce qui est observé chez B. subtiliç. L'activité de

CysB est donc induite par le N-acétylsérine. dont l'accumulation de son

précurseur (l'O-acétylsérine) est symptomatique d'un manque de l'ion sulfide.

ce qui permet la synthèse des enzymes nécessaires à la formation de cet ion.

D'autres molécules viement inhiber l'action de CysB, soit l'ion sulfide et le

thiosulfate, que E. coli peut également utiliser comme donneur de S2' pour

former de la cystéine à l'aide de 1'OASL-B. La figure 6b résume de façon

schématique l'ensemble des mécanismes contrôlant les voies de biosynthèse

de la cystéine.

Comme mentionné plus haut. la SAT est retrouvée principalement sous

la forme complexée à l'intérieur de la cystéine synthase, ce qui complique

considérablement les études de son activité enzymatique. De plus, la

formation d'agrégats par la cystéirie synthase fait varier l'affinité des enzymes

qui la constitue pour ses substrats. un problème qui est ampliflé par l'effet

de rétroinhibition par la Lrcystéine (Cook & Wedding, 1978). À l'aide

d'études où la SAT est suxexplfmée ou puriflée. donc a l'état libre. on a

démontré que le mécanisme cinétique de cette enzyme (celle de S.

typhimurium) est de type a bi-bi ping-pong B, soit que l'acétyl-CoA est lié en

premier lieu et le Coenzyme A ensuite relâché. Par la suite, la Lsérine est

liée à l'enzyme, puis transformée en O-acétylsérine (Leu & Cook, 1994).

1.4.2 : Biosynthèse de la cystêine chez BaciZZus subtilis.

Les différentes étapes de la biosynthèse de la cystéine chez B. subtüis

sont encore mal connues. L'état des connaissances de ce système se limite

à des comparaisons entre celui-ci et le même sentier de biosynthèse chez E.

coü. On a observé des similitudes à différents niveaux : présence chez les

deux bactéries de l 'AT sulfurylase et APS kinase. deux enzymes nécessaires

à l'activation du sulfate et a sa réduction subséquente en s'' (Pasternak et

aL1965). On a égaiement détecté les activités enzymatiques accomplissant la

réduction du sulfate en S2- et l'incorporation de cet ion suIfide à la sérine

pour donner de la cystéine (Pasternak. 1962). On sait également que

l'activation du sulfate et s a réduction en ion sulfide sont réprimés chez B.

subtfüs mis en présence de cystéine. Cette absence de domées concrètes

sur le fonctionnement de ce mécanisme de biosynthèse de la cystéine chez B.

subtil& ainsi que les similitudes observées incitent à puiser ces informations

chez E. coli, où l'état de la recherche est nettement plus avancé.

La sérine acétyltransférase est égaiement présente chez B. subtilis. où

elle est codée également par le gène q s E . Cette protéine ofke un bon degré

d'identité avec son homologue chez E. col& soit 38.6%. Sa séquence primaire

est toutefois plus courte que celle de la SAT de E. coli n'ayant que 217

résidus contre 273 pour celle de E. col& la majorité de résidus

supplémentaires de cette dernière étant situés à l'extrémité N-terminale. L a

SAT de B. subtilis a donc un poids moléculaire de 24 K d a (Gagnon et al.

1994).

1.4.3 : La cvstéine comme précurseur d'autres com~os6s.

La biosynthèse de la cystéine est la principale voie d'acquisition du

soufke chez les bactéries aérobies. En effet, contrairement aux procaryotes

anaérobies, qui utiiisent le sulfate comme accepteur h a 1 d'électrons. Ce

composé est réduit en s2- et sous cette forme utiiisé conjointement à la G

sérine pour former de la Lcystéine. Cet acide aminé est alors incorporé

dans les protéines oü bien sert à la synthèse d'autres composés soufrés tels

que la Grnéthionine ou le Coenzyme A (figure 7). La biosynthèse de la

cystéine chez les bactéries est donc radicalement dinerente de celle retrouvée

chez les mammifères, où la Lméthionine, I'un des dix acides aminés

essentiels. est le précurseur de la Gcystéine (Voet & Voet, 1995). II est à

noter que chez E. coli, la Lméthionine ne peut être utilisée pour synthétiser

de la Lcystéine.

SAT S2- / C ~ S R S biosynthèse L-serine OAS -L L-cystEine cystéinyl

--+ des pro téines

L-méthionine CoA thiamine Fime 7 : Représentation schématique des fonctions de la sérine acétyltransférase

(S.43 et de la cystéinyl-ARNt synthétase i C- s RSi dans la biosynthèse de la L-cystéine et des dérivés de la Gcystéine. ainsi que dans la biosynthèse des protéines en général chez les bactéries.

Les gènes cysE et cysS codent pour des protéines jouant des rôles

différents vis-à-vis la concentration intracellulaire en Gcystéine. En effet, la

sérine acétyltransférase (codée uniquement par cysE chez B. subtilis (Kunst

et aL 1997.)) contribue à produire de la cystéine, alors que la cystéinyl-ARNt-

synthétase utilise cet acide aminé lors du chargement de ~ ' A R N ~ ~ . Le fait

que ces deux gènes soient cotranscrits et que le site de tennïnaison de la

traduction de cysE soit très près du site d'initiation de cysS (Gagnon et d

1994). suaère qu'il existe plusieurs modes de contrele de l'expression de ces

deux gènes. Le mécanisme d'antiterminaison de la transcription permet à B.

subtüis de contr6ler le niveau de cystéine intracellulaire pour répondre aux

besoins de la machinerie de biosynthèse des protéines. mais il est possible

qu'un autre mécanisme soit requis pour réguler ce niveau pour tenir compte

de l'utilisation de la cystéine pour la biosynthèse d'autres composés soufrés

tels que la méthionine. ou l'acétyl-CoA (figure 7). Existe-t-il donc un second

mécanisme permettant à B. subtüis de moduler l'expression d'un des deux

gènes étudiés par rapport à l'autre selon la nature de la source de soufke?

C'est à cette question que ce projet de maitrise cherche en partie à répondre.

1.6 : Objectifs du proiet.

a) Purifier la cystéinyl-ARNt synthétase de B. subtüis surproduite chez

E. coli RB79 1 en présence du plasmide pYG209 (Gagnon e t al. 1994).

b) Surproduire et purifier la sérine acéty1transférase de cette même

bactérie.

C) Obtenir des anticorps spécifiques à la CysRS et à la SAT.

d) Mesurer par immunoempreinte a Western n les niveaux

intracellulaires de sérine acéty1trarisférase et de la cystéiny1-ARNt

synthétase chez B. subtüis sauvage en présence et en absence de

cystine, un précurseur de la cystéine.

Chapitre Kt

Matériel et Méthodes.

2.1 : Matériel utilisé.

2.1.1 : Souches bactériennes et plasmides.

Les souches bactériennes (ainsi que leur génotype), utilisés au

cours de ce projet sont présentées au tableau 1. Les plasmides pYG208 et

pYG209 ont été obtenus et utilisés lors de travaux précédents dans notre

laboratoire (Gagnon et aL 1994). Le vecteur de surexpression de protéines

de fusion avec queue d'histidines pET16b provient de la compagnie

Novagen.

Tableau 1 : Description des souches bactériennes employées dans le cadre

de ce projet de maîtrise.

Souche Génotype Référence

Escherichia coli RB79 1 W31LO; lacPL8 Amam et ai (1988)

Escherichia coZi DH5a supE44, thi-1, AlacU169(@80 Hanahan (1983)

1 endAl, recAl.

hsdR17. gyrA96. relAl

Escherichia cou XLlBlue recAl , end4 1. gyrA96, thi-1 . Stratagene

hsdR17, supE44, reIAl. iac

proAl3 lacPZ4M15 Tnl O rem EscherichiucoliBL21(DE3) F, OW hsdS, (r,' rrgï, g d , Novagen

[pLysSl w, WB]. pLgsslcrnRll

Bacillus subtilis IAl (16ûT) trpC2 Burkholder et Giles (1947)

2.1.2 : Enzvlnes, oliPonucléoüdes et réactifs divers.

Le facteur Xa. les enzymes de restriction et de modification utilisées

dans le cadre de ce projet, ainsi que Iqurs tampons. ont été achetés chez

Phmacia . Gibco BRL et Boehringer-Mannheim. Le DTNB et l'acétyl-

Coenzyme A uolisés lors du dosage de l'activité de la sérine

acéiyltransférase de B d u s subNis proviennent de Sigma. Nous nous

sommes procurés le [=~]pyrophosphate utilisé Iors du dosage de l'activité

de la CysRS de Bacülus subtilis chez NEN-Dupont. L'inhibiteur des

phosphatases endogènes KF employé dans le cadre de ce protocole. a été

gracieusement fourni par le laboratoire du Dr. Roger Lévesque. Les £Wes

de fibres de verre Whatmann GF/Cm et VWRbrand grade 69 lm. également

utilisés lors de ce protocole. ont été achetés respectivement chez Sigma et

Fisher. Le BSA et le réactif de Folin, utilisés pour le dosage des protéines

(protocole de Lowry). ont été achetés chez Sigma.

Les oligonucléotides utilisés pour la détermination de la séquence

du gène cysS de Bacülus subtüts sur le vecteur pYG209 ont été synthétisés

au service de séquencage et de synthèse d'oligonucléotides du pavillon

Marchand de l'université Laval, et sont 'présentés au tableau 2. Les

oiigonucléotides utilisés pour extraire la séquence du gène cysE du vecteur

pYG208 sont également représentés au tableau 2.

Les colonnes de chromatographie utilisées Iors de la purification de

la CysRS de Baciuus subtilis. soit la colonne d'échanges d'anions 9- Sépharose XK- 16 et la colonne d'hydroxyapatite. proviennent

respectivement de Pharmacia et de BioRad. La colonne de

chromatographie d'affinité KisBindm, utilisée lors de la purification de la

sérine acétyttransférase dotée d'une queue de 10 histidines à l'extrémité N-

terminale (HisSAT: voir fig. 17A) a été achetée chez Novagen.

Les électrophorèses sur gel de polyacrylamide en présence de SDS

(SDS-PAGE) ont été réalisées à l'aide des équipements Mini-Protean II de

BioRad. Les électrotransferts effectués lors de la préparation d'échantillons

pour l'immunisation des lapins et pour des Imniunoempreintes Western

ont été réalisés à l'aide du Mini Tranç-Biot@ Electxophoretic Transfer Cell

de BioRad. Lors de ces manipulations, les protéines ont été eansférées

sur des feuilles de nitroceilulose HybondTM-C Extra de Amersham Life

Science, Les anticorps commerciaux anti-Ig de lapin proviennent

d'Arnersham Life Science.

Les traitements aux ultrasons ont été réaiisés à l'aide de l'appareil

a Sonifier Cell Disruptor, modèle W185 fabriqué chez Heat Systems-

Ultrasonics Inc.

Tableau 2 : Séquences des ~Iigonucléotides synthétisés dans le cadre de

ce projet de maîtrise.

Nom Composition Utilisation

CysSseq1 5'-GAGCTGAAGCCAGAAC~TG-3' Séquençage cysS

CysSseq2 5'CGGCTGCCGAAAAGCCGAC-3' Séquençage C~SS

Cy~Sseq3 5'-CCATCCGGGCGGACAGG3' Séquençage CE@

CysSseq4 5'-GGTTGAAGAACACCGCAAGC-3' Séquençage WSS

Q s S ~ ~ S 1 5'-GCGCAAGACCG?TAAGCTCrC-3' Séquençage CYSS

CysSqes2 5'-CCCITC~GGTCCGCATACATAC-~' Séquençage cysS et de HiscysE

xNde 15cysE ~'-GG~C~=CA'TATGTI-I-I?TAGAATGCEAL%-~' Mutagenèse PCR de cysE

xXho 13cysE 5'-AATCrCGAGCCGTGGGTCCGCAT-3' Mutagenèse PCR de cysE

C~SEZ* 5'-CrCCCGAmTAGCG3' Séquençage de H ~ s c ~ s E

* : Fourni gracieusement par Martin Pelchat.

2.1.3 : Milieux de cultures utilisés.

Les cultures de Escherichia coli et de BacUus subtilis lAl ont été

réalisées dans le milieu Luria-Bertani (Sambrook et a2. 1989). Le Bacto-

Txyptone et le Yeast Extract entrant dans la composition de ce milieu ont

été achetés chez Difco Laboratories. Les antibiotiques utilisés, soit

l'ampicilline et le chloramphénicol. ont été obtenus respectivement chez

ICN et Sigma.

Certaines cultures de Bacillus subtdis 1Al ont été réalisées en milieu

rninilnal M9 (Sambrook et aL 1989). Les sels entrant dans la composition

de ce milieu défini proviennent de plusieurs fournisseurs, tels que Fisher

dans le cas du CaCL. Mailllnckrodt pour le MgSO,, Aldrich Chemical

Company pour le NH,Cl, BDH Inc. pour le NaCI, le W P O , et le Na$PO,.

Le Gglucose servant de source de carbone au milieu M9 vient quant a lui

de Anachemia.

2.2.1 : Conditions de cdture.

Les cultures de Escherichia coli DH5a [pYG209] (plasmide

d'expression portant le gène cysS de B. subtüfs) ont été cultivées dans des

erlenmeyers de 2L contenant 600 ml de &eu LB + 100 %/ml

d'ampicilline. Elles ont été inoculées (après préincubation à la température

de culture) a partir de dilutions 1/100 de précultures incubées durant

environ 18 heures dans Ie même milieu. Elles ont été incubées a 37OC et

soumises a une rotation de 250 rpm. Les cultures ont été induites à

l ' IFE 1mM lorsque leurs densités optiques mesurées à 600 nm ont atteint

0,6. La durée de l'induction a été de 3 heures.

Les cultures de Escherichia coli BL21(DE3)pLyS/pETlGbcysE ont été

égaiement réalisées dans 600 ml de milieu LB + 100pg/ml d'ampicilline et

35pg/ml de chloramphénicol. et inoculées (après préincubation a la

température de culture) à partir de dilutions 1/300 d'une préculture à

saturation. Les cultures ont été incubées à 37°C. 250 rpm d'agitation

jusqu'à une densité optique à 600 n m de 0.6. À ce moment. i'expression

du gène cysS fut induite à l'aide d'IPTG 1 mM. et incubés à 28°C. 250 rpm

durant 20 heures.

Les cultures de Bacülus subtilis 1Al récoltées pour la détection de la

QsRS et de la SAT dans leurs cytoplasmes ont été obtenues de la façon

suivante. Des milieux LB et minimaux Mg-glucose 1% (p/v) (Sarnbrook

et aL 1989) de 100 ml fixent inocdés (après préincubation à 37°C) à partir

de dilutions 1/140 de précultures ayant atteint la phase stationnaire

(D.0.595- = 1.5) dans le même milieu. Ces cultures ont été cultivées en

paires à 37°C. avec une agitation de 400 rpm. La densité optique de

celles-ci a été suivie régulièrement de façon à pouvoir déterminer le temps

de génération. À une densité optique à 600 n m de 0.4. 100 ml d'une des

deux cultures identiques ont été prélevés et centrifugés, pour récolter les

cellules bactériennes. Les cultures restantes ont été incubées dans les

mêmes conditions. et leur densités optiques ont été mesurées jusqu'à ce

qu'elles atteignent la phase stationnaire.

2.2.2 : Pré~aration et traitement des extraits ceilulaires.

Les culots de cellules bactériennes ont été resuspendus dans 1.5 ml

de tampon A (tris-HC1 10 mM pH 7.5. EDTA 100p.M. glycérol 10% (v/v))

par gramme de bactéries (poids humide). Dans le cas d'E. coli

DH5a[pYG209]. on a ajouté à ce tampon du PMSF à une concentration

ka le de 2 rnM et du D m 3 mM, respectivement un inhibiteur de

protéases et un agent anti-oxydant. Cette suspension a été traitée 3 fois à

une pression de 700 psi dans une MiniCeii à l'aide d'une Presse de French.

Dans le cas &Escherichia coli BL2 1 @E3)pLysS/pETl6bcysE, la

suspension, resuspendue dans le tampon A, a été soumise à 20

traitements de 30 secondes aux ultrasons. à intensité 3 de l'appareil

a Sonifier Cell Disruptor, modèle W185 de Heat Systems-Ultrasonics Inc.

Les suspensions ont été gardées sur glace entre les traitements. Les

suspensions de Bacillus subais 1A1, ont été préalablement traitées au

lysozyme (300pg/ml) durant 15 minutes à 25T. Elles furent ensuite

soumises à 10 traitements aux ultrasons de 30 secondes a intensité 3.

Les suspensions de cellules ont été gardées sur la glace durant cette étape.

Une fois les traitements aux ultrasons ou à la Presse de French

terminés. les suspensions ont été centrïhgées à 4°C durant plusieurs

périodes de 20-30 miriutes à 6000 x g dans le rotor GSA de Sorvall.

jusqu'a l'obtention d'un lysat clair. La phase supérieure a été récupérée.

de même qu'un échantillon du culot pour analyse.

Lors de la purification de la CysRS, l'extrait cellulaire a été soumis à

une partition dans un système a deux phases, tel que décrit par Lin et UL

(1992). Ce système a consisté à incuber avec agitation durant une heure

à 4°C l'extrait cellulaire en présence de Dextran T500 1'5% et de

polyethylène glycol 8000 7% préalablement dissous dans un volume égal

de tampon A (voir ci-haut). Les deux phases ont ensuite été séparées par

une cen&gation de 20 minutes à 6000 x g. La phase supérieure

(aqueuse) est conservée, débarrassée de la plupart des acides nucléiques.

2.2.3 : Techniques de eénétiaue moléculaire.

L'isolement de l'ADN plasmidique a été réalisé à l'aide de la trousse

QIAprepsTM (QIAGEN). La visualisation de la taille des plasmides a été

effectuée (après que ces derniers soient Iinéarisés par coupure à uri site de

restriction unique) par des électrophorèses sur gel d'agarose 0.7% (p/v)

(voir section 2.2.5). La quantité de plasmides dans une solution a été

déterminée par mesure de la densité optique d'une aliquote de cette

demière à une longueur d'onde de 260 nm. La puriflcation de fkgments

d'ADN plasmidique après digestion par des endonucléases de restriction a

été réalisée selon les instructions et le matériel de la trousse QIAquickm de

QIAGEN. L a purification de fkagmerits d'ADN plasmidique par extraction

au phénol-chloroforme, ainsi que leur concentration par précipitation à

l'éthanol 95% (v/v) ont été effectuées selon les protocoles retrouvés dans

I'annexe E de Sambrook et al. (1989).

Des réactions PCR ont été effectuées pour obtenir le gène cysE de

Bacülus subtilis (à partir du vecteur pYG208) flanqué de sites de restriction

Ndel/XhoI appropriés à un clonage dans le vecteur pET16b de Novagen.

Ces PCRs ont été réalisés dans le milieu réactionnel suivant, ayant un

volume mal de 50 pl: d N T P 200 pM, oligo xNdel5cysE 400 nM,

Shol3cysE 400 nM. KC1 10 mM, NJ,SO, 10 mM, Tris-HC1 20 mM

pH8.8. MgSO, 3.2 mM. Triton X-100 0.1% (v/v) et pYG209 2ng/pl. La

réaction a eu lieu selon le protocole de PCR à 30 cycles (Page 14.18- 19 de

Sambrook et aL, 1989). à des températures de dénaturation de 94°C' de

renaturation de 65°C et d'élongation de 76OC, propices à l'utilisation de

l'ADN polymérase Vent et des amorces xNdel5cysE et S h o l3cysE. Les

Tm respectifs des segments d'ADN bicaténaires formés par ces

oligonucléotides et leur séquence complémentaire sont de 79.5"C et de

80.5OC. Iis ont été calculés selon l'équation de Wailace (Wallace et aL

1979).

La transfomation des souches de E. coli a été réalisée avec des

plasmides circulaires selon le protocole de transformation de cellules

bactériennes préalablement rendues compétentes par la méthode de

Chung et aL (1988). La souche E. coli XLl Blue (Stratagene) étant déjà

ultracompétente, elle a été transformée directement avec le plasmide désiré

selon le protocole fourni avec celle-ci. Les colonies transformées ont été

sélectionnées selon leur résistance à des antibiotiques, et dans le cas de

XLlBlue. les plasmides recombinants ont été testés par .crackingr. Ce

protocole permet d'effectuer rapidement sur gel d'agarose une estimation

de la taille des plasmides contenus dans une colonie de bactéries. Ii

consiste a exposer une faible quantité de bactéries prélevées d'une colonie

à un tampon de lyse constitué de NaOH 50 mM. d'EDTA 5 mM pH 8.0, de

SDS 0.5% (p/v). de bleu de bromophépol 0.025% (p/v) et de glycérol 5%

(v/v). Les extraits cellulaires obtenus ont été soumis à une électrophorèse

sur gel d'agarose.

L e s plasmides ont été séquencés au service de séquencage et de

synthèse d'oligonucléotides du pavillon Marchand de l'université Laval,

selon la méthode de Sanger (Sanger et d 1977).

L a construction du vecteur pET16bcysE est représentée

sommairement à la figure 13. et sera décrite à la section 3.2.1 .

2.2.4 : Dosaes des protéines.

Les dosages des protéines ont été réalisés à l'aide du protocole

présenté par Lowry et aL (1951), et utilisent le BSA comme protéine

standard. Le second procédé consiste à déterminer la densité optique à

260nm et 280nm. et à appliquer les dorinées obtenues à l'équation de

Warburg et Christian (1942). Cette dernière méthode ne donnait pas des

résultats très nets lorsqu'utilisée pour doser les protéines des extraits

cellulaires, c'est pourquoi la première méthode lui a été souvent préférée.

2.2.5 : Techniques d'électrophorêse.

L'examen des protéines a été effectué par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide de lmm d'épaisseur en présence de SDS (Sambrook et aL 1989). La QsRS de Bacülus subtilis a été visualisée de façon optimale sur

des gels de polyacrylamide 10Yo (p/v), alors que la Hls-SAT, de plus petite

taille. est mieux visible sur des gels de polyacrylamide de 12 a 15% (p/v).

Après l'électrophorèse, les gels sont colorés 30 miriutes dans une solution

contenant du bleu de Coomassie 0.1% (p/v), de l'acide acétique 10% (v/v),

et de l'éthanol40% (v/v). Ils sont ensuite décolorés par lavages successifs

dans une solution contenant du méthanol 40% (v/v) et de l'acide acétique

10% (v/v)

La visualisation de la taille des plasmides et des fkagments de

plasmides digérés a été effectuée par électrophorèse sur des gels d'agarose

0,7% (p/v), polymt5risés dans le tampon TBE 1X Les gels sont d'une

dimension de 7 x 10 c m ou de 24 x 20 cm, et sont soumis à un gradient de

potentiel électrique continu de 10 V par cm durant 1 à 4 heures. Les

hgmerits d'ADN ont été révélés par coloration des gels au bromure

d'éthidiurn 1 pg/ml. et décolorés à Peau bidistillée.

Le dépôt de protéiqes dénaturées sur des membranes de

nitrocellulose a été effectué par électrotransfert à 90 V durant une heure.

dans les conditions décrites dans le manuel d'utilisation du Mini Trans-

Biot@ Electrophoretic Transfer Cell de BioRad. Selon la nature de

l'expérience, des échantillons de protéines serni-purifiées ou d'extraits

cellulaires ont été examinés par SDS-PAGE de concentration en

polyacrylarnide de 10 à 12% (p/v). Les protéines ainsi séparées ont été

transférées par un courant électrique continu sur une membrane de

nitrocellulose. Les protéines sur la membrane ont été révélées à l'aide de

Rouge Ponceau. La coloration des membranes est éliminée par des

lavages dans de l'eau bidistillée.

Deux stratégies d'électrophorèse préparative furent employées.

Toutes deux ont nécessité le dépôt de protéines semi-puriflées dans deux

puits larges d'un gel de polyacrylarnide 10Yo (p/v) en présence de SDS.

Après migration, le gel d'acrylamide a été coupé en deux. Selon la

première méthode, l'une des moitiés du gel a été utilisée pour un

électrotransfert des protéines sur une membrane de nitroceUulose (voir

paragraphe précédent). Après coloration, la bande correspondant à la

CysRS (et uniquement celle-là) a été découpée, décolorée puis tranchée en

fragments très fins. Ces fi-agments de membranes ont ensuite été brisés

aux ultrasons et puis gardés congelés dans une solution isotonique

jusqu'à l'immunisation d'un lapin.

La dewüëme méthode utiiisée requiert le découpage direct sur gel de

polyacrylamide de la bande correspondant à la CysRS (révélée par mise du

gel dans une solution d'eau glacée). Les protéines ont été extraites du gel

par électroélution à 4"C, et dialysées pour éliminer le SDS de la solution.

La CysRS a alors été concentrée par centricon 10 et conservée à 4OC dans

un tampon isotonique jusqu'à l'immunisation d'un lapin.

2.2.6 : Méthodes de dosage enzymatiques.

2.2.6.1 : Méthode de dosage de l'activité CvsRS.

La méthode de dosage de l'activité de la Q s R S mesure la formation

de [ y - ~ A T P lors de la réaction d'échange, réaction inverse de l'activation

de l'acide aminé, catalysée par toute aminoacyl-ARNt synthétase. En

ajoutant uniquement de la cystéine au milieu réactionnel, o n s'assure que

seule l'activité de la Q s R S est détectée par ce dosage. Le protocole utilisé

est une adaptation de celui présenté par Ériani et a& (1990). Le mélange

réactionnel utiiisé contenait du Na-HEPES pH 7,5 100 mM, du MgCI, 10

mM, de l*AV 2 mM, du pyrophosphate 2 mM. du [''~]p~rophosphate (1 a 2

cpm/pmole), du KF 10 rnM (pour inhiber l'activité des pyrophosphatases),

de la cystéine 5 mM et l'enzyme.

Plusieurs durées d'incubation à 25OC peuvent avoir lieu pour une

même réaction, en prélevant à des temps précis des aliquotes de 45pl qui

ont été par la suite déposés dans des tubes contenant une solution (100 p l

d'une suspension de charbon activé 4% (p/v) et 100 pi d'acide perchlorique

30% (v/v)/pyrophosphate 0.4 M) à O°C arrêtant la réaction. Ces

solutions-stops ont été agitées dès l'addition de l'aliquote. et gardées sur la

glace jusqu'à la fin des réactions. Elles ont alors été déposées sur des

m e s de verre qui firrent rincés à 5 reprises avec 1 ml d'eau froide distillée

et désionisée. Les filtres furent alors asséchés et leur teneur en [y-P~JATP

mesurée dans un compteur à scintillation. Trois réactions-témoins ont

permis de mesurer le bruit de fond : une réaction d'échange réalisée à 0°C.

un dosage réalisé sans ajouter de CysRS, et une réaction sans l'acide

aminé. Une Unité enzymatique pour cette réaction catalyse la formation

d'une p o l e d'ATP à partir de pyrophosphate pendant une minute.

2.2.6.2 : Méthode de dosae de l'activité SAT.

La sérine acétyltransférase a été dosée selon la méthode de l'échange

de fonctions disulfures. décrite par Kredich et Tomkins (1966). Le

Coenzyme A libéré de I'acétyl-CoA lors de la réaction d'activation de la

sérine catalysée par la SAT réagit avec un second composé. le 5.5'-

dithiobis(acide 2-nitrobenzoïque) ou DTNB. pour former de l'acide

thionitrobenzoïque TNB. qui absorbe la lumière à 412 nm. Le mélange

réactionnel est composé de DTNB 1 mM. d'acétyl-CoA 200 nM, de tris-HC1

50 mM pK 7.6. de Na EDTA 1 mM, de Gsérine 4 mM et d'enzyme. Une

réaction en absence de Lsérine a aussi été effectuée pour chaque essai. de

façon à pouvoir détermuier le bruit de fond dû aux groupements S H libres

dans les fractions dosées. L'unité enzymatique de cette réaction a été

définie comme étant la quantité de SAT nécessaire à I'acétylation de 1

pmde de Lsérine par minute.

2.2.7.1 : Utilisées lors de la mxri£ication de la CysRS.

2.2.7.1.1 : Chromatographie d'échanges

d'anions.

L a phase supérieure de la partition a été diluée 4 fois dans le

tampon B (Tris-HC120 rnM pH 7.5; glycérol 10% (v/v)). W é e puis déposée

sur une colome XK-16 Hi-Load Q-sepharose de Pharmacia à une vitesse

de 2.5 ml/miri. La colonne a été lavée avec environ 350 ml de tampon B,

puis avec un gradient de O à 0.6 M de NaCl dans le tampon B. Des

volumes connus des fractions collectées ont été dosés respectivement pour

leur concentration en protéines (voir section 2.3.2). l'activité CysRS (voir

section 2.5.4). et leur contenu en protéines a été examiné par SDS-PAGE

(voir section 2.3.2). Les fkactions jugées riches en Q s R S ont été

concentrées et désalées par Centricon-30 contre le tampon C (tampon

phosphate 10 mM pH 7.2. glycérol 10% (v/v). DTT 1 mm.

2.2.7.1.2 : Chromatomanhie sur colonne

d'hydroxyanatite.

La &action enrichie en CysRS de B. subtilis obtenue à l'étape

précédente (2.2.7.1.1.) a été déposée à une vitesse de 0,8 ml/- sur une

colonne de 1 ml d'hydroxyapatite (BioRad). Après environ 30 ml de lavage

avec le tampon C (voir section précédente), uri gradient de O à 0.6 M de

PO:- pH 7.2 a été appliqué à la colonne. De la même façon que la

chromatographie précédente, les fkctions coiïectées fiuent testées pour

leurs concentrations de protéines totales. l'activité WsRS, et leur contenu

en protéines a été visualisé. Les fractions pures en CysRS ont été

concenfxées, mises dans un tampon contenant du glycérol 50940 (v/v) et

conservées à -20°C. Des quantités connues de ces fkactions ont été

utilisées pour la préparation d'échantillons de CysRS pour l'immunisation

de lapins (section 2.2.8.1).

2.2.7.2 : Utilisées lors de la ~urlEication de la serine

acétyltransférase avec aueue de 10 histidines [HlsSAT).

L'HisSAT a été surproduite dans les conditions décrites à la section

2.2.1. La préparation d'un extrait cellulaire à partir de ces cultures est

décrite à la section 2.2.2. Une partie de l'extrait cellulaire a été diluée

1/10 daris le tampon de dépôt (Ms-HCl 20 mM pH 7.9. imidazole 5 mM.

NaCl 0,5 M). f i é e sur filtre de 0.45 puis déposée sur une colonne

contenant 2.5 ml de résine HisBindRd de Novagen préalablement chargée

en NiSO, 50 mM. Après le dépôt. la colonne a été lavée avec 30 ml d'un

tampon Tris-HC1 10 rnM pH 7,9, imidazole 30 mM, NaCl 0.25 M. Les

protéines liées a la résine HisBind ont ensuite été éluées dans 15 ml de

tampon Tris-HC1 10 mM pH 7.9. imidazole 0.5 M et NaCl 0.25 M. L a

composition des tampons et la procédure pour réaliser cette

chromatographie ont été tirées du manuel a PET system. 7m editionm de

Novagen (1997). Les fkactions obtenues ont été analysées par SDS-PAGE,

et leur concentration en protéines ainsi que leur activité sérlne

acétyltransférase ont été dosées selon les méthodes décrites aux sections

2.2.4 et 2.2.6.2 respectivement.

Les fractions jugées riches en HisSAT ont été rassemblées,

concentrées et équilibrées contre un tampon de conservation (HEPES 50

mM pH 7,O et NaCl 500 mM] à raide d'un centricon 10. Elles ont ensuite

été déposées sur une colonne POROS 10 HQTM pour une chromatographie

d'échange d'anions à haute vitesse. Le dépôt et les lavages furent

effectués dans un tampon Tris-HC120 mM p H 7.0. rélution a été réalisée

avec un gradient de O à 2 M de NaCl a pH 7.0. Les fractions obtenues ont

été analysées par SDS-PAGE. leur concentration en protéines totales ainsi

que leur activité sérine acétyltransférase ont été dosées selon les méthodes

décrites aux sections 2.2.4 et 2.2.6.2 respectivement

2.2.8 : Techniques immunologiaues

2.2.8.1 : Protocole d'immunisation des la-s

Les échantillons préparés selon la méthode présentée à la section

2.2.5 ont été mélangés à un volume égal de l'adjuvant de Freund (AusubeI

et al. 1994). et injecté à des lapins femelles de 4 kg de type Nouvelie-

Zélande.. dont on a prélevé préalablement du sérum comme contrôle.

Une période de 1 mois s'est écoulée avant qu'un nouvel échantillon

préparé par la même méthode soit injecté aux lapins. Une semaine plus

tard. des échantillons de sérums de lapins ont été prélevés et analysés par

buvardage de type Western pour tester la sensibiiité et la spécificité des

anticorps à la protéine-cible.

2.2.8.2 : Méthode de dosage de Pa.CysRS et de la SAT

par immunodétection.

La méthode d'imxnunoempreinte Western décrite dans le manuel

d'instruction de la trousse RenaissanceTM de NEN-Dupont a été utilisée

pour les mesures de la sensibilité et de la spécificité des sérums prélevés

des lapins. Elle a aussi été appliquée lors'des dosages des niveaux

intracellulaires de CysRS et de SAT chez Bacillus subtilis 1Al. Cette

méthode utilise le principe de l'oxydation du lumfnol par le &O2, une

réaction catalysée par la péroxydase du raifort (HRP), enzyme conjuguée à

un IgG d'âne spécifique aux IgG de lapin. Ce conjugué anticorps-HRP

(second anticorps) sert à révéler par chemilurninescence le complexe

protéine-cible/Ig de lapin spécifique a la protéine qu'on veut doser. La

protéine-cible a été fxé à une membrane de nitrocellulose par un

électrotransfert, tel que décrit à la section 2.2.5. Dans la plupart des cas,

le second anticorps a été dilué 2000 fois.

Une fois l'immunoempreinte Western complétée, les antigènes ont

été révélés par une réaction de chemiluminescence. dont les paramètres

sont présentés dans le manuel d'instruction de la trousse RendssanceTM

de NEN-Dupont.

De manière à mesurer l'efficacité de l'immunisation des lapins

injectés avec la CysRS et la SAT purifiées. des volumes de 8-10 ml de sang

ont été prélevés avant l'injection (contfile), et 10 jours après chaque

rappel. Les sérums résultants ont été aliquotés puis congelés pour

conservation à long terme. Ces sérums ont été testés à différentes

dilutions par irnrnunoempreinte Western pour déterminer leur sensibüité à

la protéine contre laqueue ils ont été immunisés. La dilution domant le

meilleur rapport signal/bruit de fond a été utiïisée pour présenter le

niveau de spécificité du sérum (sections 3.1 A.2 et 3.2.3.2).

La CysRS des extraits cellulaires a été quantifiée par comparaison

entre l'intensité de sa bande spécBque à une courbe standard des

intensités correspondant à des quantités connues de CysRS purifiée.

L'intensité des bandes obtenues sur les autoradiogrammes a été mesurée à

l'aide du logiciel MacBAS. après que ces derniers aient été digitalisés.

La spécificité des sérums contre la protéine imniunogène a été testée

par immunoempreinte Western contre des concentrations connues

d'extraits cellulaires de BQCiLLus subtilis 1Al [obtenus selon la méthode

présenté à la section 2.2.2). Les concentrations d'agent bloquant (lait

instantané sans gras 5% (p/v) dilué dans le tampon phosphate pH 7.4 9'4

mM. Tween 20 5% (v/v) (PBST). la dilution de l'anticorps secondaire (dans

une solution de BSA 1% (p/v) dans le tampon P B W et la quantité de

protéines totales transférées sur la membrane de nitrocellulose ont été

testées par cette méthode. Cette fois. c'est le meilleur rapport signal

spécifique/signaux non-spécifiques qui est recherché pour l'optimisation

du protocole de détection et de quantification de la protéine cible dans un

extrait cellulaire.

2.2.9 : Conditions de protéolyse de I'HisSAT.

Des essais de coupure de la queue de polyhistidine de la HisSAT par

le facteur Xa bovin ont été effectués. Ces réactions de protéolyse ont été

réalisées dans un mélange réactionnel (Tris-HC1 50 mM pH 8.0. NaCl 100

mM. CaCL, 1 mM) ayant un volume total de 12 pl incluant 5 pg de la

protéine cible. Ces réactions ont été testées à différentes concentrations

de la protéase et pour différentes durées d'incubation à 25OC. La

protéolyse a été stoppée par l'addition de 3 pl de tampon d'échantillon 5X

pour gel SDS-PAGE. Un contrôle a temps zéro . a été préparé avec le

tampon d'échantillon déjà inclus dans la composition du mélange

réactionnel. pour prévenir toute coupure.

Chapitre Iïï

Résultats et Discussion.

3.1 : Sumroduction et purification de la CvsRS de B. subtizis et

prémaration d'anticorps contre cette e m e .

3.1.1 : Transformation de la souche E. coZi DH5a avec le

plasmide nYG209.

La CysRS de Bacillus subtilis a été surproduite précédemment chez

E. coli RB79 1 (recA') à l'aide du vecteur pYG209 induit à 1'IPM; (Gagnon et

aL 1994). Nous avions prévu de surproduire cette enzyme par la même

méthode. mais suite à la détection d'une mutation dans le gène cysS (suite

à une transformation de RB791), il a été décidé d'utiliser une souche hôte

recK : E. coli DH5a.

Nous avons donc transformé cette souche avec le plasmide pYG209

original. Les bactéries transformées ont été sélectionnées selon leur

résistance à l'arnpicillirie. Les plasmides recombinants ont été isolés par

minipréparations de plasmides et sélectionnés en premier lieu par

digestion avec l'endonucléase de restriction Sca 1. dont ï'un des sites de

restriction sur le plasmide est situé dans le gène cysS (résultats non

présentés). Un des clones positifs a été ensuite séquencé (section 2.2.3).

Comme la séquence du gène cysS de ce clone ne comportait pas de

mutations, il a été utilisé pour les étapes suivantes.

3.1.2 : Surproduction de la CysRS de B. subtilis chez

E.coli DHSa.

La figure 8 montre que la souche E. coü DH5a(pYG209) cultivée en

présence d'IPTG à partir du miüeu de la phase exponentielle a surproduit

une protéine de 54 kDa. Ce poids moléculaire est celui attendu pour le

produit du gène cysS. Cette protéine devrait être la seule surproduite car

son gène est sous le contrôle d'un promoteur lac du plasmide pYG209,

seul promoteur sensible à la présence d ' I F E en raison du génotype lacde

sa souche-hôte. En effet. le puit 4 de cette figure montre une forte bande

à la hauteur attendue. alors que le puits 1 ne présente pas une telle

bande. Le puit 2. par contre, montre une faible bande à l'endroit attendu.

ce qui indique que le promoteur lac initie toujours un certain niveau de

transcription malgré l'absence de l'IPTG inducteur. Le niveau de

surexpression est assez important: la bande correspondante est

comparable à celle déjà obtenue précédemment par Gagnon et aL (1994).

et celle-là était estimée à 40% du total des protéines de l'extrait. Le culot

de lyse ne contenait pas une concentration plus importante de CysRS par

unité de volume que celie observée dans le surnageant. Il est probable

que ces molécules se sont retrouvées dans le culot de lyse parce qu'elles

étaient dans des cellules non lysées, ou elles ont été capturées par des

débris cellulaires, ou elles faisaient partie de corps d'inclusion. Toutefois.

la grande majorité des molécules de CysRS se sont retrouvées dans le

surnageant.

Des membres de notre laboratoire ayant réaiisé des essais de

surproduction de la CysRS avaient également constaté un arrêt de la

croissance de la culture lorsque mise en présence d'IPTG (Gagnon et aL

1994). Comme les cultures de E. coli DH5a cultivées en parallèle ne

montrent pas un tel arrêt de croissance (résultats non présentés). il

semblerait que ce demier soit relié à la surproduction de la Q s R S de B.

Poids moIéculaire CkDd

200

m e 8 : Surproduction de la QsRS de B. subtüis dans E. coli DH5a(pYG209) après induction de la transcription de cysS avec de I'IPMf. Des échantillons d'extraits cellulaires de cette souche cultivée en présence et en absence d'IPM; 1 rnM montrent une importante surproduction d'une protéine de 54 kDa, qui est le poids moléculaire de la CysRS. Les quantités suivantes de protéines ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS : puit 1, 40 pg d'extrait cellulaire de DH5a sans plasmide. Puit 2 : 35 pg d'extrait cellulaire de DH5a (pYG209) cultivé saris IPrCr. b i t 3 : 12 pg d'un mélange de marqueurs de poids moléculaire Broad Range de BioRad, dont les poids moléculaires sont indiqués à gauche du gel. Puit 4 : 70 pg d'extrait cellulaire de DH5a (pYG209) cultivé en présence d'IFE. Puit 5 : 40 pg de la phase supérieure de la partition. Puit 6 : 90 pg de la phase inférieure de la partition. Les quantités de protéines ont été déterminées selon la méthode de L o v . Après électrophorèse, le gel de polyacrylarnide a été coloré au bleu de Coomassie.

subtüis. il est possible que ce soit l'ampleur de la surproduction qui

affecte la vitesse de croissance de la cellule. Il est aussi possible que la

QsRS de B. subtil& soit tordque lorsque produite en grande quantité par

E. coli En effet. il existe plusieurs exemples de cas d'aaFS de certaines

bactéries qui sont toxiques chez E. colt et certains de ces cas ont été

étudiés (Pelchat et al. 1998).

3.1.3.1 : Partition dans un svstème à 2 ha ses.

La partition dans un système à deux phases est décrite à la section

2.2.2. Environ 40% des protéines totales se sont retrouvées dans la phase

inférieure lors de la partition (tableau 3). Comme les dosages de l'activité

de la CysRS dans des extraits cellulaires se sont avérés plutôt imprécis, la

comparaison de l'activité totale entre ces deux étapes ne nous permet pas

d'évaluer avec certitude la proportion de CysRS dans la phase inférieure.

Les puits 5 et 6 de la figure 8 montrent des échantillons de la phase

supérieure et de la phase Ulférieure de la partition dans le système

Dextran/PEG 8000 après cen&gation. En considt5rant les quantités

différentes de protéines déposées, ces deux échantillons montrent que la

CysRS est retrouvée autant dans la phase inférieure (PEGSOOO/Dextran)

que dans la phase supérieure de la partition. Toutefois, comme le volume

de la phase inférieure est beaucoup moins important que celui de la phase

soluble (3 ml contre 28 ml), la perte en CysRS devrait être assez faible.

Les diacultés de dosages rencontrées pomaient être dues à la

présence de pyrophosphatases. malgré l'inhibition par le KF présent dans

le mélange réactionnel. Comme cette étape vise plutôt a éliminer les acides

nucléiques en solution, qui peuvent nuire aux dosages de la CysRS ainsi

Figure 9 : Résultats de la chromatographie d'échange d'anions 9- Sepharose lors de la purification de la CysRS. La partie B montre le tracé

de I'absorbance à 286 nrn selon la &action de la chromatographie,

surplombé de données plus précises (partie A) : soit l'activité et la

concentration en protéines pour les fractions de I'élution qui en

contiennent. Les protéines ont été dosées par la méthode de Warburg et

Chri.stian, et vérifiées par la méthode de Lowry dans le cas des fkactions 17

à 31. Ces dernières ont été identifiées par SDS-PAGE 10%; les gels,

colorés au bleu de Coomassie, sont présentés à la partie C. L'échantillon

(( D * présenté en B et C constitue 15 pl de ce qui a été déposé, alors que D,

correspond à la fraction éluée lors du dépôt. De la même manière. L,, L2,

L3 correspondent aux fractions recueillies lors du lavage.

~ ~ ~ + ~ ~ e + + e a + + e a fractions de I'blutlon par gradlent ds NaCl 0.6 M.

\ / Agrandissement

D,L,L,L, 123 6 f voirci-haut \ 3 4 6 54 56 61 66 76 83 -994 -100- -101-

Gradient de NaCl de O à 0,6 M

qu'à son adsorption aux colonnes de chromatographie qui suivent, on peut

considérer que les pertes sont acceptables (voir Tableau 3).

3.1.3.2 : Chromatopanhie d'échange - d'anions.

Sept cent mg de protéines ont été déposées sur la colome Q-

sépharose, qui a une capacité totale de 2.5 g d'albumine. Les données de

cette chromatographie sont présentées à la figure 9.

Lors de précédentes chromatographies d'échanges d'anions, il a été

déterminé que la CysRS de B. subtüis était éluée à une concentration de

0.29 M de NaCl. Comme la CysRS d' E. coli est éluée à une concentration

de 0.18 M (Eriani et aL 1991). alors il est peu probable qu'il y ait

contamination de la première par celle-ci. En tenant compte de ces

informations. nous avons décidé d'utiliser une élution plus lente (2

rnl/min) pour la zone allant de 0.18 M à 0,4 M. Comme la concentration

en protéines de l'éluat était telie qu'elle dépassait le plafond de mesure du

spectrophotomètre de notre FPLC (Fîg. 9B). les dosages des protéines faits

à partir des fiactions ont permis de visualiser un tracé d'élution (Fig. 9A).

Ce graphique, ainsi que Les analyses par SDS-PAGE (Fig. 9C).

montrent qu'une bande de la tailie de la CysRS est visible de la fraction 17

(0.25 M NaCl) à la fraction 40. Une augmentation de l'activité CysRS.

présentée en pointillée sur ce graphique. est visible à partir de la fraction

20. Une bande correspondant au poids moléculaire attendu pour la

CysRS est présente dans cette fraction et celles qui la suivent. Cette

fkaction a été éluée près de la concentration attendue (0,28 M NaCl au lieu

de 0,29 M). Toutefois. les fractions 29 et 30, qui montrent le plus

d'activité CysRS détectées ainsi que la plus grande pureté en CysRS (fig. 9C puits 28 et 30). ont été éluées beaucoup plus tard, à une concentration

en NaCl de près de 0.4 M. Ce phénomène de pic ayant une très mauvaise

résolution est parfois rencontré Iorsqu'une colonne a été surchargée.

L'analyse par SDS-PAGE des hctions recueillies lors du dépôt et des

lavages ne montre pas des concentrations importantes de protéines, qui

serait u n signe de surchargement de la colonne. Le volume de ces

fractions étant très important (de l'ordre de 80 à 100 ml). il est possible

que l'échantillon analysé sur gel soit trop dilué pour pouvoir indiquer un

tel surchargement. La densité optique à 286 nm, par contre, qui atteint

rapidement un plateau lors de I'élution. laisse suggérer que la colonne

était très chargée.

Quoiqu'il en soit, il semble évident après coup que le gradient de

NaCl était trop prononcé r pour la quantité de protéines déposé. et à été

arrêté trop vite. Malheureusement, sur le moment, il était impossible de

se rendre compte de cela. en raison de la trop forte teneur en protéines des

fractions.

Les deux autres pics observables sur le tracé d'absorbance sont le

résultats de l'élution de composés à une concentration de NaCl de 0,6 M.

L'analyse par SDS-PAGE des fractions correspondantes montre qu'il ne

s'agit pas de protéines, malgré la forte couleur jaune observée (résultats

non présentés).

Les &actions 29 et 30. qui contenaient la plus forte activité WsRS

observée. et le plus haut degré de pureté ont été rassemblées, ce qui nous

a donné 145 mg de protéines contenant une forte proportion de CysRS

pour continuer la purification. Elies ont été dialysées contre le tampon C

(ne contenant pas de NaCl) tel que décrit à la section 2.2.7.1.1. Nous

nous sommes servis de ces fiactions pour la suite des manipulations. Les

fractions 23 à 26. 27, 28. 3 1 et 32 a 36 ont également été conservées à - 20°C, et représentent au total environ 300 mg de CysRS, quoiqu'elie soient

beaucoup moins concentrées que les fractions 29 et 30.

En comparant les fkactions 29-30 rassemblées (Fig. 11. puit 3) a un

échantillon suivant la partition (Fig. 11 puit 2). on peut constater que

cette première chromatographie a permis d'éliminer la majorité des

contaminants. Le tableau 3 montre qu'à cette étape. la CysRS a été

enrichie de près de 4 fois. est probable que cette valeur

d'enrichissement soit trop élevée, car il est estimé que la CysRS

représentait déjà 40% des protéines au niveau de l'extrait ceilulaire.

Dû a l'inhibition par des pyrophosphatases, il est possible que les

dosages d'activité lors des étapes précédentes aient sous-évalué la

quantité réelle de CysRS. Ainsi, seulement après cette

chromatographie nous pourrions voir une valeur représentative de

l'activité CysRS.

C r a ~ h i e sur colonne

Nous avons déposé 15 mg de protéines totales (ce qui constitue la

capacité totale de cette colonne de 1 ml) provenant des fractions 29-30 de

i'éta-pe précédente sur la colonne d'hydroqapatite. Le dépôt et les lavages

n'ont pas fait décrocher beaucoup de protéines de la résine. ce qui est

reflété par l'absence de pics avant le gradient d'élution sur le tracé

d'absorbante à 286 nrn (résultats non présentés). Comme on peut le

constater par l'augmentation de l'activité d'échange ATP-~~PP~ (Fig. 1 OA) , la

CysRS est éluée à une concentration d'ions PO:' de 360 mM, ce qui est

confirmé par l'analyse par SDS-PAGE des fkactions correspondantes (Fig.

10B). qui présentent un peptide de la taille attendue (54 kDa).

La chromatographie d'hydroqapatite n'a pas pemiis d'éliminer tous

les contaminants (Fig. 10B, fraction 40). En effet. lorsque comparée

directement à l'étape précédente (Fig. 11. puits 3 et 4). cette

chromatographie n'a pas augmenté sensiblement la pureté de la CysRS.

Poids moléculaire mal

200 IL6 97.5 66

m e IO : Chromatographie de la CysRS sur colonne d'hydroxyapatite. A) tracé d'élution des protéines par gradient d'ions PO:-. avec en pointillé l'activité ATP-PR* spécifique à la CysRS pour les fiactions identifiées en haut de la figure. B ) Photo d'un gel SDS-PAGE 10% coloré au bleu de Coomassie présentant des échantillons de 15 pl de chacune des hct ions identifiées à la partie A. Le puits identifié D . correspond à un échantillon de 15 pl de la solution déposée sur la colonne.

c-i

O cl)

2 cl) Q) Ln

3 E:

5 a L; e cl) Q) 3 2 E 3

4 >

1 . .

CysRS (54 ma)

m e 11 : Analyse par SDS-PAGE de &actions provenant de

plusieurs des étapes de purification de la CysRS. Ces échantillons sont

analysés par gel de polyacrylamide 10% coloré au bleu de Coomassie. Les

quantités de protéines ont été déterminées selon la méthode de L o w .

L'origine des échantillons pour chaque puit (et la quantité de protéines déposée) suit :

1) extrait cellulaire de E. coli DH5a(pYG209) non-induit (50 pg de protéines) ;

2) phase supérieure de la partition (50 pg de protéines) ;

M) 12 pg de marqueur de poids moléculaire (Broad Range) :

3) fractions 29-30 rassemblées après la colonne Q-sépharose (40 pg de protéines) ;

4) fkaction 40 de l'élution de la 3' colonne d'hydroxyapatite (60 pg de protéines) ;

5) CysRS purifiée par découpage de bandes sur gel SDS-PAGE d'un échantillon de la fkaction 4 d'hydroxyapatite (10 p g de protéines).

Toutefois. les contamïnants observés sont en quantités trop faibles pour

expliquer la brusque baisse d'activité observée à cette étape (tableau 3).

Cette chute se répercute au niveau du rendement total de la purification.

Comme la grande majorité (94%) des protéines déposées ont été récupérées

dans les hc t i ons 40 et 41, il est probable que la baisse de l'activité CysRS

constatée soit plutôt due à Ia dégradation de cette dernière. Il est possible

que cette baisse soit causée par la dégradation de l'enzyme lors de son

passage sur la colonne, car on peut observer l'apparition de bandes

contaminantes au poids mo1éculaire légèrement Meneur à celui de la

CysRS, ce qui pourrait être un signe de dégradation. Ii est également

possible que les ions phosphates de la colonne et ceux ayant servi à

l'élution, de par leur similitude au pyrophosphate et à I'ATP, modifient la

structure du site actif ou de la protéine entière, la rendant plus susceptible

a la dégradation.

La CysRS obtenue lors de la cette étape de puriffcation n'est pas

encore assez pure pour servir à 1'irnniunisation de lapins. Une dernière

étape de purification est donc nécessaire.

Les protéines contaminantes, encore visibles par SDS-PAGE (F'ig.

11). pourraient s'avérer plus imrnunogènes que la CysRS et ainsi venir

diminuer la spécificité de la réaction immune contre cette dernière. Il est

probable qu'après 2 chromatographies différentes. la seule protéine dans

la bande de 54 kDa visible par SDS-PAGE soit la CysRS. Donc,

l'électrophorèse préparative. une méthode simple et rapide qui permet

d'aller chercher cette bande, a été choisie pour terminer la purification de

l'enzyme.

Les méthodes employées pour l'électrophorèse préparative sont

décrites à la section 2.2.5. La première méthode. qui transfère la WsRS

sur membrane de nitrocellulose (ce qui permet de l'isoler) est ditFcile à

évaluer, car la protéine est liée très foeement cette dernière. Par contre.

la seconde donne en bout de ligne de la CysRS pure sous forme soluble, ce

qui permet de visualiser l'efficacité de la purification (Fig. 1 l : puit 5).

Toutefois. elle a nécessité une plus grande quantité de CysRS au départ

(300 pg) pour parvenir à une protéine pure injectable à un lapin (100 pg),

en raison des étapes plus nombreuses et de nature plus propices à des

pertes.

Comme on peut le voir à la figure 11, l'électrophorèse préparative a

pennis d'obtenir de la CysRS suffisamment pure pour servir à

l'immunisation de lapins.

3.1.4 : Obtention d'anticoros de lapin contre la -RS de

B. subtilis.

3.1.4.1 : Immunisation de lanins avec la CvsRS

purifiée.

L'immunisation a été enectuée selon le protocole présenté à la

section 2.2.8.1. 50 pg de CysRS purifiée à l'étape précédente ont été

utilisés lors de la première infection et lors du rappel.

Deux lapins ont été injectés avec des échantillons obtenus par les

deux méthodes différentes (section 2.2.5). Pour le lapin JL34. la CysRS

était liée à des fragments de nitrocellulose, alors que pour le lapin -5,

elle a été injectée sous forme soluble. La fixation d'une protéine

immunogène à un support est souvent utilisée pour amplifier la réponse

immunitaire Pelletier. 1998. et Pelletier, communication personnelle).

3.1.4.2 : Tests 'de la s~écificité et de la

sensibilité des sérums anti-WRS.

La technique utüisée pour mesurer le niveau de détection de la

CysRS par les sérums de lapins est décrite à la section 2.2.8.2. Le sérum

du lapin JL35 (QsRS soluble) s'est avéré environ deux fois moins sensible

que celui du lapin JL34 (CysRS sur nitrocellulose). ce qui semble

confirmer l'utilité du support de nitrocellulose lors de l'immunisation

(résultats non présentés).

Un exemple d'ïmmunoempreinte Western, réalisée avec une dilution

1/5000 du sérum immun du lapin JL34 est présentée à la figure 12. On

obtient un signal clair qui est proportionnel à la quantité de CysRS

(fkaction 40 de la colonne d'hydroqapatite) présente. Il a été observé que

le bruit de fond est généralement très bas. ce qui semble être particulier à

la trousse Renaissance ordinaire. qui a été utilisé pour effectuer la réaction

de chemiîumuiescence lors de cette inununoempreinte (observation

personnelle; après comparaison à la trousse Renaissance Plus de la même

compagnie).

Des bandes de poids moléculafre légèrement inférieur à celui de la

CysRS sont reconnues par les anticorps du sérums de lapin. Comme de

la WsRS pure a été utilisée comme antigène, les anticorps de ce sérum ne

devraient reconnaître que des épitopes de cette protéine. Pour appuyer

cet argument. une seconde immunoempreinte faite en parallèle avec le

sérum contrôle de JL34 n'a montré aucun signal (résultats non présentés).

Cela laisse supposer que ces bandes seraient des sous-produits de

dégradation de la CysRS. bien visibles dans cette fkaction lorsque celle-ci

est analysée par SDS-PAGE (Fig. 11).

Figure 12 : Immunoempreinte * Western * subtüis 1 A 1 obtenue de cultures en milieux minimaux Mg-glucose en présence ou non de divers acides aminés. 1 : Surnageant de l'extrait celiulaire de la culture en milieu Mg-glucose 1% + tryptophane (50 pg/ml): 51 pg de protéines totales déposées. II : Surnageant de l'extrait cellulaire de la culture en milieu Mg-glucose 1% + tryptophane (50 pg/ml) + cystine (100 pg/ml): 39 pg de protéines totales déposées. ïII : Surnageant de l'extrait cellulaire de la culture en milieu Mg-glucose 1% + tryptophane (50 pg/ml) + DL-méthionine (100 pg/ml): 55 pg de protéines totales déposées. Les quantités de protéines ont été déterminées selon la méthode de Lowry.

TS TMS TSC TMSC

Acides amines aioutas au milieu de cultuta.

Figure 13 : Quantification des niveaux intraceUulaires de CysRS

chez Baciiius subtil& cultivé en rniiieu minimal M9 + glucose 1%. Les

échantillons ont été récoltés à une D.0.- de 0,4 (sauf it T r , qui a été

récolté à 0.2). Dans certaines conditions, indiquées ci-haut. les composés

suivants ont été ajoutés au milieu de culture : T = L-tryptophane (50

pg/ml); M = Grnéthionine (50 pg/ml); C = L-cystine (25 =/ml); S = So t - 2

mM. Le signe Jh r indique que pour les composés qui le suivent, la

moitié de la concentration précédente a été utilisée. La CysRS a été

révélée par immunoempreinte Western. dont les conditions sont décrites à

la section 2.2.8.2. La CysRS des extraits a été quantifiée par comparaison

entre l'intensité de sa bande spécifique à une courbe standard des

intensités correspondant à des quantités connues de Q s R S purifiée. Il

faut noter qu'une seule valeur est disponible pour r TMS r. donc aucun

écart-type n'est calculable pour cette dernière. Les quantités de protéines

ont été déterminées selon la méthode de Lowry.

O 5 10 15 20 25 30 35 40

temps de culture (heures)

O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Temps de culture (heures)

Figure 14 : Courbes de croissance de B. subtilis 1Al en milieu minimal M9 + glucose 1% supplémenté de certains acides aminés. (t T )) = L- tryptophane 50 pg/rnl. (t S x = ~0:- 2 mM. u M M = DL-méthionine 100 pg/ml, C r = GCystine 25 pg/ml. Le signe (( '/in indique que pour les composés qui le suivent, la moitié de la concentration précédente a été utilisée.

3.2 : Niveaux intracellulaires de la CvsRS chez Bacillus subtilis

1Al-

Les signaux obtenus à la figure 12 montrent qu'il existe des

variations dans les niveaux intracellulaires de CysRS sebn la composition

du milieu de culture. Ces variations sont sans doute plus importantes

que celles auxquelles on doit s'attendre en raison des quantités d'extraits

cellulaires légèrement Mérentes pour chaque puits (voir Fig 12 : légende).

Les signaux sont suffisamment forts et le bruit de fond est suffisamment

bas pour permettre la quantification. Dans de telles conditions, et en

prenant soin d'ualiser des quantités de CysRS pure comparables à celies

attendues dans les extraits, ï'immunoempreinte Western semble être une

technique utilisable pour mesurer les niveaux intracellulaires de la CysRS.

L'utilisation des sénuns anti-CysRS lors d'immunoempreintes

western (réalisées dans les conditions décrites à la section 2.2.8.2) a permi

de mesurer les niveaux UitraceUuiaires de la WsRS dans les extraits

cellulaires de Bacülus subtil& (Fig. 13). Toutefois. le manque de temps

pour répéter les expériences n'a pas permis d'obtenir des données aussi

précises que l'on aurait pu espérer.

On peut remarquer qu'en fh de phase exponentielïe (la croissance

s'arrête dans un milieu M9 autour de D.O.,, : 0,5). les niveaux de Q s R S

ne varient pas beaucoup d'un type de milieu à l'autre, et ce malgré les

grandes différences de temps de génération (de 2 heures à 4h30)

observées. En effet, selon les conditions de croissance étudiées (Fig.13 :

légende), les concentrations en Q s R S dans le cytoplasme varient d'environ

3 fois : soit entre 80 et 260 ng par mg d'extrait cellulaire. Toutefois. les

divergences des données obtenues pour les 2 essais réalisés ont résulté en

des écart-types très importants (plus de 50% de la valeur moyenne) pour

certaines conditions (e TS r, TC . et T%(SC) r). Ainsi, les valeurs

proposées pour ces échantillons ne peuvent pas être utilisées pour une

analyse plus poussée.

Airisi. les résultats montrent qu'en milieu rnlliinial M9 supplementé

en glucose 1%. la Cy&S constitue entre 0.008 et 0.026% de la masse

totale des protéines de i'extrait cellulaire. selon les acides aminés présents.

Pour déterminer si les variations dans les valeurs pour les dinérentes

conditions présentées à la figure 13 sont significatives par rapport au

niveau maximum de cette enzyme, qui devrait être atteint lorsque le taux

de croissance est optimal. il serait nécessaire d'obtenir des valeurs du

niveau de CysRS dans des échantillons prélevés en phase exponentielle

d'une culture en milieu riche.

Les temps de génération ne semblent pas toujours correspondre à la

richesse du milieu. Par exemple. la culture a TMSC. (fig. 13 : légende)

avait un temps de génération plus long que a TMS ou TSC m. bien qu'elle

contienne un acide aminé de plus que ces derniers. Ii faut toutefois noter

que les cultures utiusées présentent des courbes de croissance plut6t

complexes (fig.14). En effet, certaines des cultures présentent des

courbes de croissance diauxiques. et l'arrét des croissances (dues sans

doute à l'épuisement des substrats) se faisait rarement à une absorbance

supérieure à 0.6. Comme nous avons prélevés les échantillons à une

absorbance de 0.4. les temps de générations mesurés en phase

exponentielle ne sont peut-être pas représentatifs de l'état de la culture au

moment du prélèvement. Cela est bien ennuyeux. car des mesures fiables

du temps de génération auraient pu nous indiquer si la variation des

niveaux intracellulaires constatée ci-haut était similaire à celles observées

pour les aaRS qui ont pour cause la régulation métabolique. Chez E. col&

celle-ci est une augmentation de 2 à 3 fois du niveau de l'aaRS pour

chaque augmentation de 5 fois du taux de croissance (Grunberg-Manago,

1996).

Si on compare les niveaux en CysRS des différents extraits entre

eux, une seule tendance assez claire peut être remarquée. Il semble y

avoir un besoin accru de CysRS lorsqu'il y a présence de Grnéthionine et

en absence ou en concentration faible de Gcystine (fig. 13 : 8 TMS B, r TM . et a TM1h(SC). ). En effet. Les 3 des 4 titres les plus élevés en CysRS

présentent cette situation (I'échantiIlon ne correspondant pas à cette

tendance provenant de a TJh(SC) . ). Si on considère uniquement les

milieux concernés, cette observation pourrait être expliquée assez

simplement par la régulation métabolique. Toutefois, comme les temps de

génération mesurés manquent de fiabilité, on ne peut pas affLrmer qu'il

s'agit bel et bien de ce type de contrôle. Un autre mécanisme de

régulation pourrait contribuer à obtenir de tels résultats. La dérepression

par carence d'un acide aminé spécifique, détectée pour plusieurs aaRS de

E. coli, peut expliquer pourquoi on obtient un plus haut niveau de CysRS

en faibles concentration de cystéine (Neidhardt et aL 1996). Par contre ce

mécanisme n'explique pas pourquoi on observe ce résultat uniquement en

présence de méthionine.

3.3 : Clonaee du gène cusE de B. subtilis. surproduction et

purification de I'HisSAT, et prénaration d'anticoms.

3.3.1 : Construction du vecteur dTe2mression vET16bcrrsE.

L'expression du gène cysE de B. subtilis a été étudiée précédemment

dans notre laboratoire (Gagnon et aL 1994). Ces études ont montré que

l'expression de ce gène est peu élevée, à partir du plasmide pYG208 chez

E. coli Cela est probablement dû à la présence d'une structure de

terminaison de la transcription p-indépendante en amont du gène. et que

la séquence codante de ce dernier débute par un GUG, u n codon

d'initiation utilisé assez rarement chez E. coli (Draper. 1996).

Pour éliminer ces contraintes à l'expression de cysE. nous avons

sous-cloné le gène cysE (présent sur le vecteur pYG208) dans un plasmide

Oligo xNdeIScysE LI- A

Digestion N/X

Brin codant du plasmide

Facceur Xa N X

fin HisTag

f i i n codant Su plasmide \ GTATGTATGCGGACCCACGGGmACAAT

3'-TACGCCTGGGXCC-TCTAA-5'

Oligo xXhoI3cysE

milieu ILB bons clones + ampicilfine

1) cracking

2) séquençage

Transformation au DMSO de E. coli BL2 1 @E3/pLysS)

milieu LB + ampicihe + chloramphenicol

F ime 15 : Représentation schématique de la mutagenèse par PCR et du sous-clonage du gène cysE dans le vecteur de surexpression pET16b. P : promoteur trc. P-: promoteur du phage T7. C& : séquence comprenant une boxte T et un termiriateur p-indépendant.

d'expression PET. Nous avons donc amplifié la séquence codarite du gène

par PCR (voir section 2.2.31 à l'aide d'oligonucléotides complémentaires

aux flancs du gène (voir tableau 2 et figure 15). Tel que prévu. un

fragment PCR 1 de 752 paires de bases a été obtenu, et a été p d é sur

gel (section 2.2.3). 1 pg de ce hgrnent PCR ainsi que 1 pg du vecteur de

destination, pETlGb, ont été digérés par les endonucléases de restriction

NdeI et WoI. avec un temps d'incubation de 21 heures dans le cas de la

digestion du fragment PCR pour compenser pour la proximité des sites de

restriction aux extrémités du kagment.

Ce fiagrnent ainsi que le vecteur pET16b digérés ont ensuite été

puritiés par extraction au phénol-chloroforme-éther. puis précipités à

l'éthanol (section 2.2.3). Les culots ont été resuspendus dans 16 pl d'eau

distillée et désionisée (bidistillée), puis la moitié de ces volumes ont été

utilisés pour une lïgatïon à 12OC durant 20 heures en présence de T4 DNA

ligase. Le rapport insertion : plasmide était alors d'environ 7,5/ 1. Des

contrôles de ligation ont également été réalisés en parallèle. Une aliquote

des produits de chaque réaction de ligation et de contrôle furent analysées

par électrophorèse sur gel d'agarose. Le reste des produits de ligati on (1 5

pl) a été éutilisé pour transformer une suspension d'E. coü XLlBlue

ultracompétente selon le protocole fourni par la compagnie Stratagène. Les

colonies obtenues après sélection à l'ampicilhe furent criblées par

acracking~ (section 2.2.3).

Sur les 36 colonies analysées, 18 se sont avérées contenir le

plasmide pEIT16b recombinant. Quatre d'entre elles ont été utilisées pour

l'extraction de plasmides (section 2.2.3). Ceux-ci furent puriflés et la

présence de l'insertion a été confirmée par digestion XhoI/NdeI. Les 4

clones positifs ont été séquencés en utilisant les oligonuclêotides

CysSqes2 et CysE2 (section 2.2.3; tableau 2). Le séquençage des

plasmides ne révélant aucune mutation dans le gène Hiç-cysE ou dans le

Figure 16 : Surproduction de I'HisSAT dans E. coli BL 2 1 @E3)pLysS/pETlGbcysE. Analyse par SDS-PAGE 12% des échantillons d'extraits cellulaires et de culots de lyse. Les échantillons de cette souche cultivée en présence et en absence dïFTG 1 mM montrent une surproduction d'une protéine de 25,5 m a , qui corresponds au poids moléculaire de I'HisSAT (suivre la flèche à la droite de la figure). Le puits 1 contient environ 50 pg d'extrait cellulaire de E. coli BL21 (DES)pLysS/pETlGb, cultivé en présence d'IPTG 1 mM. Le puits 2 contient environ 50 pg d'extrait cellulaire de la souche surproductrice cultivé sans IPTG 1 mM. Le puits 3 contient environ 50 pg d'extrait cellulaire de la souche surproductrice cultivé en présence d'IPM; 1 mM. Le puits identifié n M * contient 12 pg d'd'un mélange de marqueurs de poids moléculaire Broad Range de BioRad. dont les poids moléculaires sont indiqués à droite du gel. Veuillez noter que le décalage des bandes vers le bas de gauche à droite est sans doute dû à une torsion du gel lors de la prise de la photo. Les concentration en protéines ont été déterminées par la méthode de Lowry.

promoteur le précédant, ces demiers ont été employés lors de la

transformation de Escherichia coli BL2 1 (DE3)pLysS.

La surproduction de 1'HisSAT chez E. coZi

BL2l@E3)pLysS/pETlGbcysE a été effectuée selon les conditions

présentées à la section 2.2.1. à l'exception de la température d'induction,

qui a été réglée à 28°C- En effet. lors d'expériences préliminaires. nous

avons obtenu une production plus importante d'un polypeptide de 25.5

kDa (poids moléculaire attendu de I'HisSAT) à la température de la pièce

plutôt qu'à 37OC, et une condition médiane a été utilisée pour retrouver de

meilleures conditions de croissance pour la bactérie. ce qui devrait mener

à un meilieur rendement total. La longue période d'induction a été choisie

également pour obtenir une plus grande quantité de bactéries. Les

causes de la mauvaise surproduction de i'HlsSAT à 37OC ne sont pas

connues. bien qu'on ait exclu qu'elle soit due à la formation de corps

d'inclusion : l'analyse des culots par SDS-PAGE n'a pas révélé plus de

cette protéine que dans les extraits cellulaires solubles. Une mutation au

niveau du promoteur T, ou des séquences d'initiation de la traduction a

également été éliminée comme cause possible de ce problème. car aucune

n'a été détectée lors du séquençage. Il est possible que I'HlsSAT soit

toxique en concentrations élevées chez E. cok La température d'induction

moins élevée pourrait. diminuer l'activité de cette enzyme suffisamment

pour permettre à la bactérie de survivre plus longtemps. et donc d'en

produire davantage.

À l'examen de l'extrait cellulaire de la souche transformée avec

pETIGbcysE, cultivée sans mTC; (Fig. 16 : puit 2). on peut obsenrer une

bande importante à la même hauteur que l'HisSAT. On serait porté à

croire que ce polypeptide est l'HisSAT, produit malgré l'absence d'PIC par

un phénomène de fuite du promoteur. Or, ce dernier ne devrait pas être

important en raison de la présence du vecteur pLysS. qui contient le gène

codant pour le T, lysozyme, un inhibiteur de la T, polymérase. L'action de

Ia lysozyme limite énormément la transcription à partir du promoteur T,

lorsque cette dernière n'est pas induite à I'IPM;. La bande importante à la

même hauteur dans le puits 1 (souche transformée avec le vecteur pETl6b

sans le gène qsE) montre qu'une partie importante des peptides de cette

taiue visibles par SDS-PAGE est présente naturellement dans la souche

surproductrice. La N t e du promoteur observée est donc moins

importante qu'on pouvait le croire initialement. Il est peu probable que

les peptides de la même taiue que I'HisSAT soient des contamùiants

durables lors de la purification. L a chromatographie d'affinité, suivie d'une

chromatographie d'échanges d'anions. devrait nous permettre d'obtenir

1'HisSAT comme seule protéine de ce poids moléculaire. Cela est très

important. car la dernière étape de purification. l'électrophorèse

préparative en présence de SDS. n'utiïise que le poids moléculaire comme

moyen de séparation.

On a déposé 75 mg de protéines de i'extxait brut de E. colt

BL21(DE3)pLysS/pET16bcysE sur la colonne d'affinité d'un volume de 3

ml de résine HisBind. L'HisSAT s'est assez bien liée a la résine de nickel.

quoiqu'on puisse observer des pertes lors des lavages (Fig. 1773). Cela est

confirmé par les mesures de l'activité SAT (Fig.l?A), qui montrent

également que la protéine de fusion possède toujours son activité.

L'HlsSAT a été éluée presque seule dans les fractions d'élution E2 et E3. à

l'exception de quelques bandes contaminantes mineures (Flg.17B). La

fkaction E2, qui contient 6 mg de protéines, a est utilisée pour la seconde

colonne.

Figure 17 : Chromatographie d'aninité de I'HisSAT sur une colonne

de résine HisBind (Novagen). La partie A montre la concentration en

protéines et l'activité SAT (en pointillés) pour chaque fractions, d'un

volume de 10 ml lors du dépôt. de 3 ml lors des lavages et de 1'5 ml lors

de l'élution. La méthode de dosage de l'activité de l'enzyme dans les

fractions est décrite à la section 2.2.6.2. Les concentrations en protéines

des différentes fractions ont été déterminées par la méthode de Lowry. La

partie B présente une électrophorèse analytique par SDS-PAGE 12% des

fractions analysées à la partie A. à raison de 15pl de fkaction par puit. Les

gels de polyacrylamide ont été colorés au bleu de Coomassie.

O 1 O 20 30 40 50 60 70 80

volume (mi)

Dépôt > ~ ~ '

Poids moléculaire

EX M Dl D2 D3 D4 Wl W2 W3 W4 W5 M El E2 E3 E4 Es E, E9 SMp (KDa)

Poids Moléculaire

m a )

Conductivité (mS>

Absorbance à 280 nm

Fime 18 : Résultats de la chromatographie de 1'HisSAT sur un échangeur d'anions & haute vitesse. La partie A montre le tracé d'élution au NaCl des protéines déposées sur la colome. L'élution au NaC1 2 M s'est faite à un débit de 8 ml/-. Les fractions correspondant au premier et deuxième pics ont été rassemblées séparément. et concentrées 6 et 8 fois. Leurs concentrations en protéines totales ont été mesurées puis 20 pg de chacune ont été analysées par SDS-PAGE 15% (partie B). a 1 correspond au rassemblement des hctions du premier pic. et a II à celui du second pic. M : 12 pg d'un mélange de marqueurs de poids moléculaire Broad Range de BioRad. Les quantités de protéines ont été déterminées selon la méthode de Lamy. Après électrophorèse, le gel de polyacrylamide a été coloré au bleu de Coomassie.

3.3.2.3 : Chrornatoaanhie d'échange d'anions à

haute vitesse,

On a déposé 4 mg de la hc t ion E2 de I'étape précédente sur une

colonne POROS. Le dépôt et les lavages ont permis d'éliminer une bonne

partie des contaminants (résultats non présentés). L'HisSAT a été éluée

en 2 pics (Fig.18A). L'analyse par SDS-PAGE (fig.18B) monire que les

deux fractions sont presque pures (seulement 2 bandes contaminantes

d'environ 70 ma), et de composition très similaire. Il est possible que le

second pic ne soit que I'épaulement du premier (sa concentration en

protéines étant beaucoup plus basse), ou bien l'HisSAT possède plusieurs

confoxmations de stiuctures secondaires différentes ne présentant pas

leurs résidus chargés de la même façon. ce qui résulte en des élutions

séparées sur gradient de NaCl. Les fractions correspondant au premier

pic contiennent 1.5 mg de protéines, qui ont été utilisées pour les essais de

coupure de la queue d'histidines. et pour la préparation d'échantillons par

électrophorèse préparative.

3.3.2.4 : Coupure de la queue d'histidines de

1'HisSAT.

Les essais de coupure. dont les résultats sont présentés à la figure

19. ont été effectués selon la protocole décrit à la section 2.2.9. L'analyse

des produits de réactions par SDS-PAGE 12% (Fig.19B) montre que

lWsSAT semble résistante à l'action du facteur Xa. malgré la présence

dans sa structure d'un site de reconnaissance pour cette protéase

(Fig.19A). En effet. à cette concentration d'acrylamide, on aurait dû

apercevoir lors d'une protéolyse partielle 2 bandes distinctes

correspondant à 1'HisSAT et à la SAT sans queue d'histidine. Les témoins

négatifs, où la réaction n'a pas eu le temps d'avoir Iieu (Fig.19B : puits

1.6,11 et l6), nous permettent d'afnrmer (malgré l'effet a sourire m. un

Site de coupure du Facteur Xa

mure 19 : Essais de clivage de la queue d'histidines de l'HisSAT par le facteur Xa. La partie A préserite la structure primaire de l'HisSAT, telle que surproduite par le vecteur pET16bcysE. ainsi que les peptides obtenus après coupure par le facteur Xa. Les caractères en italique représentent la séquence sauvage de la SAT, et la mutation silencieuse V-> M du codon d'initiation est indiquée par une flèche. La partie en caractères gras représente le site de recomaissance du facteur Xa; son site de coupure est représenté par une flèche. La partie B montre le résultat d'une analyse par SDS-PAGE 12% des produits de réactions de coupure de la queue d'histidines de I'HisSAT par le facteur Xa. 20 conditions de digestion ont été tentées. en variant le temps d'incubation (II) (a la température de la pièce) et le rapport Xa/protéine cible (p/p) (1). 5 pg de HisSAT purifiée ont été utilisés dans chaque réaction. Les quantités de protéines ont été déterminées selon la méthode de Lowry. Après électrophorèse. le gel de polyacrylamide a été coloré au bleu de Coomassie.

artefact de la technique SDS-PAGE) qu'il ne s'agit pas de protéolyse

complète. car on aurait alors observé une différence de migration entre les

bandes du témoin et celles des réactions.

Comme 1'HisSAT est une petite protéine. iI est surprenant que le site

de recomaissance du facteur Xa ne soit pas disponible. Les dosages

d'activités lors de la chromatographie d'affinité montrent que l'HisSAT

possède toujours son activité enzymatique, ce qui laisse supposer que la

structure secondaire de l'enzyme ne doit pas étre très affectée, et que la

queue d'histidines devrait être libre d'interactions avec le corps de la

protéine, et airisi. accessible. La nature généralement hydrophile de la

queue d'histidines et du site de reconnaissance du facteur Xa supportent

cette dernière hypothèse.

Il faut toutefois rappeler que nous avons eu des problèmes de

fixation de I'HlsSAT en utilisant une autre résine de nickel. et qu'on a

observé des pertes de cette protéine lors des lavages de la chromatographie

d'affinité. Ces problèmes dépendant aussi de la disponibilité de la queue

d'histidines pour des interactions avec le milieu environnant. viement

appuyer la possibilité que les problèmes de coupures par le facteur Xa sont

dus à la protéine de hision plutôt qu'à la protéase.

Ces essais de coupure ont pexmis de montrer que I'HisSAT semble

très stable dans les conditions de réaction : après 20 heures. on observe

aucune dégradation de cette demière.

La préparation d'échantillons d'HisSAT p u d é e a été réalisée selon la

méthode présentée à la section 2.2.5. en utilisant 90 pg de protéines de

départ.

3.3.3 : Obtention d'anticorps de fanin contre la SAT de

B.subtiLis.

3.3.3.1 : immunisation de Ianins avec 1'HisSAT

pinifiée.

Malgré i'échec de la coupure de la queue d'histidines, nous avons

décidé d'injecter PHisSAT préparée à l'étape précédente plutôt que de la

SAT tel qu'il avait été préw. Cette protéine de fusion, qui est dénaturée

lors de la préparation des échantillons. contient les mêmes épitopes que la

SAT, bien qu'elle contienne également des épitopes non spécifiques à cette

dernière due à la présence de la queue d'histidines et du site de

reconnaissance du facteur Xa. Comme il &ste commercialement des

anticorps contre les queues d'histidines. nous pourrons utiïiser ces

demiers comme contrôle pour vérifier que les signaux détectés sont bien

spécifiques à la SAT.

Nous avons fait injecter 2 lapins (identifiés JLû2 et -3) avec 90

d'HisSAT, en suivant le protocole présenté à la section 2.2.8.1. Pour

obtenir une meilleure spécificité, nous avons fait un second rappel au

lapin -2. avec la même quantité d'HisSAT.

M 1 II III HS M a b c

75 66

45

31

21 front

1 II III HS M M 1 II III HS

DI

HisSAT

kDa 97 75

66

45

31

21 front

HisSAT

HisSAT

F ime 20: Tests de lïmmunodétection de la SAT de B. subtilis par des sérums anti- HisSAT. Les membranes de nitrocellulose, sur lesquelies les protéines séparées par SDS- PAGE ont été transférées, furent traitées selon la technique du buvardage Western présentée à la section 2.2.8.2, en utilisant une dilution de 1/2000 du second anticorps. Les complexes protéines-Ig de lapins ont été révélés par chemilumiriescence, une méthode également traitée à cette section. La membrane A a été exposée au sérum-contrôle JL82 à une dilution 1/8000. La membrane B a été exposée au sérum Jt82-S3 à une dilution de 1/8000. La membrane C a été exposée au sérum -2-S3 a une dilution de 1/16000. La membrane D a été exposée au sérum -3-S2 à une dilution de 1/8000. Les pistes visibles sur les membranes de nitroceluiose présentent les patrons de migration SDS- PAGE suivants. a : 1 pg de glutarnyl-ARNt synthétase avec une queue d'histidine a l'extrémité C-terminale. b : 1 pg de glutamyl-ARNt synthétase sauvage. c : 10 pg d'extrait cellulaire de E. coli BL2 l(DE3) pLysS/pfElGkcÿsE cültivé er? présence d'IPTG 1 mM. 1 : 50 pg d'extrait cellulaire de B. subtilis 1Al cultivé en milieu Luria-Bertani. II : 50 ug d'extrait cellulaire de B. subtilis LA1 cultivé en milieu minimal M9 additionné de L- tryptophane 50pg/ml- III : 50 ug d'extrait celïdaire de B. subtilis LA1 cultivé en milieu minimal. M9 additionné de Ltryptophane 50pg/ml et de Gcystirie 25 pg/rnl. HS : lpg d'HisSAT purifiée. M : 12 pg d'un mélange de marqueurs de poids moléculaire Broad Range de BioRad. Leur révélation au rouge Ponceau a perrni d'identifier sur les membranes les points correspondants à un poids molécuiaire donné. Les quantités de protéines ont été déterminées selon la méthode de Lowry.

3.3.3.2 : Tests de la sensibilité et de la s~écificité

des sérums anti-HfsSAT.

Les sérums de lapins immunisés obtenus ne présentent pas une

grande spécificité pour I'HlsSAT. En effet, les anticorps présents dans le

sérum-contrôle du lapin JL-82 détecte 1'HisSAT (Fig.2OA : HS), et ce à une

dilution importante (1/8000). Le sérum immun provenant de ce lapin

détectent I'HisSAT avec une sensibilité légèrement supérieure (Fig.20C) et

aussi dans un extrait cellulaire de E. coli BL21@E3)pLysS/pET16bcysE

d'où la protéine a été isolée (Fig. 20B: c). Bien que ces

imrriunoempreintes montrent de nombreux signaux non-identifiés. il est

possible que le faible signal légèrement supérieur à la bande de 31 kDa

dans ce dernier extrait soit la SAT de E. colt dont le poids moléculaire

attendu est près de 30 kDa. S'il s'agit bien de cette protéine, cela

montrerait que les sérums possèdent des anticorps spécifiques à la sérine

acétyltransférase. qui est assez bien consemée d'un organisme à l'autre

(Gagnon et d 1994).

Malheureusement, les sérums -2 et -3 (dans une moindre

mesure : Fïg.20D) occasionrient un bruit de fond trop important pour

qu'on puisse détecter la SAT dans les extraits cellulaires de B. subtüis

(Fig.20 : 1, II. III). L'abondance de signaux non-spécifiques et le bruit de

fond important qu'on observe pourraient être dus à la trousse de

chernilurninescence Renaissance Plus. qui cause des problèmes sinulaires

(mais de moindre ampleur) aux imrnunoempreintes Westerns réaiisées

pour détecter la CysRS. Les agents bloquants utilisés (albumine. Tween)

ne sont pas adéquats pour tous les types d'échantilions dosés. et il est

possible qu'un blocage incomplet cause ces signaux non spécifiques (Josée

Lamoureux, communication personnelle).

En conjugaison avec ces problèmes. il est également possible que la

SAT ne soit tout simplement pas produite chez B. subtüis à un niveau

détectable par les Ilnmunoempreintes Western en utilisant les sérums

obtenus lors de ce projet. La régulatiog de l'expression du gène cysE chez

B. subtüis est très différente de celle observée chez E. coli où il est exprimé

de façon constitutive (et où on détecte peut-être son produit. voir ci-haut).

Par contre. la transcription du gène cysE de B. subtüis, comme le gène

cysS, est sous le contrôle d'un mécanisme d'antitemiinaison de la

transcription (Gagnon et ai 1994). Peut-être que la SAT n'est pas

nécessaire dans la phase de croissance examinée lors de ces travaux. et

donc peu produite ou bien dégradée rapidement. L'optimisation des

conditions de dosages par immunoempreinte Western. mais aussi l'analyse

d'échantilIons provenant de plusieurs temps de croissance des cultures de

B. subtüis permettront sans doute d'en cornaître plus à ce sujet.

Chapitre IV

Conclusion générale.

4.1 Survol des résultats obtenus :

Ce projet de maîtrise a permis d'accumuler des résultats

intéressants. Il est important de rappeler sommairement ces derniers.

Lors d'un essai de surproduction de la CysRS à partir d'une souche

recA* transformée avec le vecteur pYG209 (voir section 3.1.2), nous avons

surproduit un variant de la CysRS qui ne semble pas provoquer d'arrêt de

la croissance après l'induction à i'IFïG. Le séquençage de I'insert du

vecteur à révélé que ce variant possède une délétion de 12 paires de bases

en phase avec la séquence codante. Cette protéine est donc traduite avec

4 acides aminés en moins. Les résidus manquants (par rapport à la

protéine sauvage), &. G,. G,, et Q,, sont situés au milieu de la

séquence primaire. entre les séquences conservées HIGn et KMSKS.

Malheureusement, l'activité enzymatique de ce variant n'a pas été

mesurée. La découverte de ce mutant souligne l'importance d'utiliser une

souche R e d - lors d'expériences visant à exprimer un gène provenant d'un

autre organisme, dont l'effet sur l'hôte est mal connu.

L a pur-cation de la CysRS a permis d'obtenir 14 mg de CysRS

pratiquement purifiée, mais la protéine s'avère sensible à la dégradation,

suite à son passage sur la colonne d'hydroxyapatite. Toutefois, une

demière étape de purification. l'électrophorèse préparathe, permet d'isoler

la forme de la CysRS la moins dégradée, quoiqu'on obtient alors une

protéine dénaturée par le SDS. Comme les protéines que nous avons

cherché à mesurer sont elles aussi dénaturées lors de la préparation des

échantillons aux dosages, cet attribut de la technique s'avère être un

avantage.

Les tests de sensibilité des sérums anti-WsRS ont montré que la

technique de préparation des échantillons d'antigènes par électrotransfert

a donné de meilleurs résultats que la simple injection de l'antigène en

solution. De plus, les anticorps contenus dans les sérums de lapins

permettent de détecter la CysRS et de la quantifier dans des extraits

cellulaires, et ce par comparaison à des quantités connues de la protéine

purifiée. Ces résultats viennent montrer que la technique

d'immunoempreinte Western est utilisable dans le cadre d'une étude des

niveaux intracelidaires d'une protéine donnée.

Une étude préliminaire des niveaux intracellulaires de la CysRS en

milieu minimal Mg-glucose contenant des sources de soufre différentes a

permis de constater que dans ces conditions, on peut obsemer de 80 à 260

ng de cette protéine par mg d'extrait cellulaire. De telles variations ont été

observées pour d'autres aaRS chez E. col& lorsqu'elles sont soumises a la

dérepression par carence de leur acide aminé spécifique.

De I'HisSAT pratiquement pure a été obtenue à la suite d'une

pudcation en deux étapes. Toutefois, les essais de protéolyse de cette

protéine par le facteur Xa, qui avaient pour objectif de la séparer de la

queue d'histidines à l'extrémité N-terminale, n'ont pas fonctionné. Fait

intéressant, ces essais ont montré que 1'HisSAT était très stable à la

température de la pièce. On a donc dû utiliser I'HisSAT comme antigène.

Comme dans le cas de la CysRS. I'électrophorêse préparative a servi à

préparer les échantillons pour l'immunisation, et par la même occasion, a

permis d'obtenir de I'HlsSAT pure. L'immunisation des lapins a permis

d'obtenir des anticorps contre I'HisSAT. Toutefois, ceux-ci n'ont pas

permis la détection de la SAT dans des extraits celiulaires de B. subtilis.

La cause de cet échec n'a pas été identitiée. Elle pourrait s'avérer être

l'absence de cette protéine dans les conditions de cultures testées, ou le

manque de spécificité des sérums de lapins, ou bien êbe un problème

inhérent à la technique de détection elle-même.

4.2 : Perspectives.

La purification de la CysRS n'a pas donné un excellent rendement.

surtout en raison de la seconde chromatographie qui a considérablement

dégradé la CysRS. Si la purification de la CysRS était à refaire. la

chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite devrait être remplacée par

une autre méthode. Peut-être qu'une chromatographie dïntéractions

hydrophobes ou bien d'-té (en utilisant des Ig anti-CysRS) seraient

plus efficaces pour séparer la CysRS des contaminants. tout en affectant

moins son activité.

Les anticorps obtenus ainsi que la technique d'immunoempreinte

Western permettront la poursuite des mesures des niveaux intracellulaires

de la WsRS de Bacülus subtüis 1Al selon différentes conditions de

croissance.

Les sérums obtenus jusqu'à maintenant des lapins immunisés avec

l'HisSAT ne permettent pas de détecter la SAT dans des extraits cellulaires

de B. subtüis. Ii est possible que l'optimisation plus approfondie des

paramètres employés lors de l'imrnunoempreinte Western permettra

d'obtenir un signal spécifique à cette protéine. Un échantillonnage plus

large des conditions de cultures et des phases de croissance pourrait

également nous permettre de découvrir les conditions où cette enzyme est

produite en quantités importantes. Des essais d'immunoprécipitation des

Ig anti-HisSAT provenant des sérums, conjugués à leur protéine cible

pourraient permettre d'obtenir des anticorps plus purs. L'utilisation de

ces derniers lors d'îmmunoempreintes Western devrait résulter en un bruit

de fond beaucoup plus faible, permettant d'identifier un signal spécifique à

la SAT.

Quoiqu'il en soit, I'optimisation de cette technique pour la détection

de la SAT pourra permettre le même genre d'étude des niveaux

intracellulaires que ceux débutés pour la CysRS. Ces deux séries

d'expériences. réalisées en parallèle, vont peut-être révéler l'existence d'un

second mécanisme de régulation de l'expression des gènes cysE et cysS.

En fait, la détermination de l'existence de ce mécanisme constituait le

principal objectif de ce projet de maitrise. Le temps limité des études de

maîtrise n'a permis d'atteindre que partiellement cet objectif. D'un autre

côté, ce projet a permis de développer des outils qui permettront à d'autres

chercheurs d'étudier spécifiquement la question.

Par ailleurs, les anticorps anti-CysRS produits lors de ce projet

pourront aussi être utilisés au cours d'autres études, telles que la

purification rapide de la CysRS. Cette demière, une fois p d é e en

grandes quantités, pourra être utiiisée pour des études cinétiques ou

cristailographiques. La structure tridimensionnelle de cette aaRS de

classe 1 n'a pas été tracée, et pourrait s'avérer d'un grand intérêt pour ce

domaine de recherche, car la séquence primaire de cette enzyme est très

conservée entre des eubactéries éloignées sur le plan taxonomique.

Finalement, il serait intéressant d'étudier plus en profondeur les

propriétés du variant de la WsRS (tronqué de 4 résidus) qu'on a obtenu

accidentellement. Après tout. malgré la croyance populaire, la chance

joue un rôle important dans la recherche scientifique. Il faut savoir en

profiter lorsqu'elle nous sourit.

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