UNIVERSIT DE NANTES

FACULT DES SCIENCES ET DES TECHNIQUES

_____

COLE DOCTORALE : VEGETAL, ENVIRONNEMENT, NUTRITION, AGROALIMENTAIRE, MER

Anne 2012

Purification de la chitine par hydrolyse enzymatique partir de coproduits de crevette Penaeus vannamei.

Caractrisations des produits et optimisation du procd ___________

THSE DE DOCTORAT Discipline : Gnie des procds

Spcialit : Biochimie et biotechnologie des produits marins

Prsente

et soutenue publiquement par

Karine LE ROUX

Le 4 mai 2012, devant le jury ci-dessous

Rapporteurs

Examinateurs

M. DESBRIERES Jacques, Professeur Universit de Pau et des Pays de lAdour M. TRYSTRAM Gilles, Professeur AgroParisTech M. HUBERT Antoine, Directeur de la Recherche et de l'Innovation - YNSECT

M. LEGRAND Jack, Professeur Universit de Nantes M. ABDELLAH Arhaliass, Professeur Universit de Nantes M. BERGE Jean-Pascal, Cadre de recherche IFREMER, Nantes M. BARON Rgis (invit), Cadre de recherche IFREMER, Nantes

Directeurs de thse : Jean-Pascal Berg & Abdellah Arhaliass

N attribu par la bibliothque

Ce que signifie le mot recherche ? Vivre pleinement la question

Edgar Morin (1921-)

v

Remerciements

Jadresse tout dabord mes plus chaleureux remerciements Jacques Desbrires, Gilles

Trystram, Antoine Hubert et Jack Legrand, pour avoir accept de participer ce jury de thse.

En premier lieu, je remercie et flicite les initiateurs de ce sujet de thse, pour lequel je garde

un grand intrt au-del de la dmarche formation et pour lequel comme tout doctorant, je

me suis investie corps et me ! Je remercie vivement Rgis Baron pour son encadrement,

ses critiques constructives, son regard mthodique et surtout sa patience pour me rendre plus

rigoureuse. Je tiens exprimer ma reconnaissance Abdellah Arhaliass pour sa confiance au

cours de cette tude, ses encouragements et les opportunits de prsenter ce travail de thse

lors de confrences et sminaires. Je tiens galement remercier vivement Jean-Pascal Berg

pour avoir accept dencadrer cette thse, pour mavoir guide techniquement et mavoir fait

partager ses connaissances, ainsi que davoir su maintenir le cap de ltude lorsque des voies

divergentes taient possibles. Jai galement bnfici de laide et du soutien dEric Leroy,

avec qui les changes ont toujours aboutis un bond en avant.

Merci Patrick Durand pour les informations quil a pu mapporter au dmarrage de la thse.

Il faut bien avouer que la chitine ntait plus beaucoup tudie lIFREMER et par

consquent, la fusion des connaissances de chacun a t trs prcieuse. En premier lieu, Alain

Domard ma transmis lessentiel des points conserver en mmoire lorsquon tudie ce

polymre, je lui en suis trs reconnaissante. Ainsi qu Dominique Gillet et Jean-Pierre Say,

des socits Mahtani et France Chitine, qui mont apport des notions prcieuses lies aux

applications de la chitine et ses drivs, et donc aux exigences concrtes du march. Jai

toujours souhait rechercher en lien directe avec la ralit des ressources disponibles et des

demandes du march. Stphane Trombotto est sans aucun doute la personne qui ma le plus

enseign sur les caractristiques de la chitine et sur ces mthodes danalyse. De plus je lui suis

reconnaissante davoir pris part ltude, via des rsultats de RMN, et jai beaucoup apprci

nos changes.

Parmi les rsultats prsents dans ce manuscrit, une partie non ngligeable naurait pu tre

obtenue sans lquipe du MC2 de lINRA de Nantes. Je tiens donc exprimer mes plus vifs

remerciements Denis Lourdin, Marion de Carvellho, Alain Bulon, Bruno Pontoire et

Arnaud Turbin. Certains rsultats proviennent dune autre unit de lINRA, merci Corinne

Rondeau pour les analyses de RMN en 13

C.

Pour leur aide technique et scientifique, merci galement Michal Paris de lIMN, Virginie

Sylvestre du CEISAM, ainsi que Marie-Madeleine Giraud-Guille de lUniversit de Pierre &

Marie Curie, Emmanuel Belammie de Montpellier, le Dr Varm de Biopolymer, Yves

Grohens de LIMAB et George Choubert, spcialiste en astaxanthine. Je remercie vivement

lancienne quipe de S3D pour leur accueil et les changes humains.

Merci Guillaume Roelens pour son aide prcieuse en ATG et MEB. Merci mes complices

du GEPEA : Benjamin, PEF, Hlne & son mari, le voisin, Luc, Anthony, Julie, Franois,

Anne, JB, Abdul, Seb, Farid, et jen oublie des doctorants et des stagiaires ! Un grand merci

vi

galement Sandrine, Carole & Arnaud. Il est une personne que jaurais tant aim remercier

de son vivant, Maryse, technicienne irremplaable du GEPEA, lincarnation de la bonne

humeur, de la volont et de lefficacit, une profondment belle personne qui sen est alle

trop vite, trop tt et sans crier garde. Merci pour cette leon qui est tombe un moment

crucial.

Un norme remerciement gnral mes collgues du btiment T du centre IFREMER de

Nantes. Plus prcisment, je tiens remercier Isabelle pour sa gestion parfaite, Sylvie pour

son attention, sa confiance et ses connaissances en bibliographie, Franoise pour son nergie,

Fred pour son calme et sa bonne humeur, Sandrine pour sa complicit et son efficacit

exemplaire, Claire pour son volontarisme et ses comptences, JP pour son humour, Camille

pour sa culture gnrale des produits marins et des pays, Monique, Laetitia & Aurlie pour

leur attention et les transmissions dinformations prcieuses, les Christine pour diffrentes

raisons (humaines et techniques), Sylvia, Corinne et Jacqueline pour leur aide, leurs

connaissances en sucres et leur sympathieJojo, triple-J, Marc & Vronique, Mireille, Anne

& Anne vous avez tous apport une pierre agrable mon environnement de travail, tant

pour la bonne humeur que pour les ides en R&D. Je suis galement reconnaissante Claire

Boisset, Christophe Bailly, Nadia Nour et Aurlie Lecolier pour nos diffrents changes.

Merci galement Vincent Lorcy, pour sa participation active aux rsultats au cours de son

stage.

La thse est une succession daventures dans laventure, de grandes victoires autant que de

dceptions et de frustrations, quil est difficile dexpliquer aux non-pratiquants, cest pourquoi

je tiens remercier trs spcialement mes soupapes de scurit, amis et compres : Papa,

Raoul, Emna, Zo et surtout Christelle, Anas, Sabrina, Gatan, Vincent... & lodie, mme si

elle n'est pas doctorante ! Pour nos partages de coup-de-gueule et coup-de-cur merci

Benot, Myriam, Thierry, Marie, David, Aurlien, Dung, Cdric et jen oublie !

Un grand bravo mon entourage qui na pas eu dautre choix que me supporter pendant ces

trois annes ! En particulier Alex, Marielle, mes parents et le reste de ma famille, ainsi que

Tatiana, Katia, Stef, Rachou, Delphine, Sophie, Emilie, Julie, Aurlia, la Dream Team de la

Dfense et celle de Guiss Beach ! Enfin, je mexcuse auprs de tous ceux pour qui je suis

devenue un fantme ces dernires annes c'tait pour cet ouvrage que je vous ddis !

vii

SOMMAIRE

LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... xi

LISTE DES FIGURES........................................................................................................... xii ABREVIATIONS .................................................................................................................. xvi

Introduction .............................................................................................................................. 1 Chapitre 1 Etude bibliographique ....................................................................................... 9

I. Contexte conomique .................................................................................................... 11 I.1. volution du march des produits marins, focus sur les crustacs ................... 11 I.2. Valorisation des coproduits marins : la chitine et ses drivs ........................... 14 I.3. Disponibilit de la chitine, ressource naturelle ................................................. 16

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs ........................................ 17 II.1. Les applications dans le domaine agricole ....................................................... 18

II.2. Les applications dans le domaine du traitement de leau ................................. 18 II.3. Les films de chitine/ chitosan ........................................................................... 18

II.4. Les applications dans les industries alimentaires et dittiques ...................... 19 II.5. Les applications dans le domaine mdical ....................................................... 20 II.6. Autres applications ........................................................................................... 22 II.7. volution des volumes de ventes par domaine dapplication .......................... 22 II.8. Conclusions sur les caractristiques de la chitine et ses applications .............. 23

III. Structure de la matrice chitineuse chez les crustacs ................................................. 23

III.1. La biosynthse de la chitine ............................................................................ 23 III.2. Lorganisation de la cuticule des crustacs .................................................... 24

IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques de la chitine et ses drivs . 28

IV.1. La structure cristalline et lindice de cristallinit ........................................... 29 IV.2. Le degr de polymrisation ............................................................................ 31 IV.3. La masse molaire et la polydispersit des longueurs de chane ..................... 31 IV.4. La solubilit .................................................................................................... 32

IV.5. Le degr dactylation et la rpartition des groupes actyls ......................... 34 V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique ..................................... 35

V.1. Schma gnral ................................................................................................ 35 V.2. La dminralisation .......................................................................................... 36

V.3. La dprotinisation .......................................................................................... 37 V.4. Ltape de blanchiment .................................................................................... 39 V.5. La dsactylation et la dpolymrisation ......................................................... 39

VI. Les traitements biologiques ....................................................................................... 41 VI.1. La voie fermentaire ......................................................................................... 41

VI.2. Dprotinisation et de dminralisation enzymatiques .................................. 43

VI.3. Dsactylation et dpolymrisation enzymatique .......................................... 46

VI.3.1. La dsactylation enzymatique .................................................................... 46 VI.3.2. La dpolymrisation enzymatique ou la chitinolyse ................................... 47

VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins .................................................... 48 VII.1. Valeur ajoute des coproduits marins ........................................................... 48 VII.1.1. Les composs protiques ............................................................................ 49

VII.1.2. Les composs lipidiques ............................................................................ 50 VII.1.3. Les minraux .............................................................................................. 52 VII.2. Lhydrolyse enzymatique des coproduits marins .......................................... 53 VII.3. Les objectifs envisags par cette tude ......................................................... 53

viii

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence .................... 55 I. Mthodes danalyse de la composition des produits ..................................................... 57

I.1. Identification et prparation de la matire premire ......................................... 57 I.2. Matire sche ..................................................................................................... 57

I.3. Teneur en cendres .............................................................................................. 58 I.4. Teneur en lipides ............................................................................................... 58 I.5. Teneur en protines ........................................................................................... 59 I.5.1. Dosage de lazote par Kjeldahl (Crooke et Simpson, 1971) .......................... 59 I.5.2. Mthodes de dosages colorimtriques des protines ...................................... 60

I.5.3. Dosage des acides amins par chromatographie en phase gazeuse ................ 61 I.6. Teneur en rsidus glycosidiques simples .......................................................... 62 I.6.1. Dosage colorimtrique de Dubois et al. (1956) .............................................. 62 I.6.2. Mthode de dosage colorimtrique des osamines .......................................... 62 I.6.3. Dosage des rsidus glycosidiques par chromatographie en phase gazeuse .... 63

I.7. Teneur en chitines ............................................................................................. 64 II. Mthode dextraction de la chitine .............................................................................. 64

II.1. L'extraction chimique ....................................................................................... 64 II.2. L'extraction enzymatique par protolyse acide ................................................ 65

III. Caractrisation qualitative des produits ..................................................................... 66 III.1. Mesure du degr dactylation ........................................................................ 66 III.1.1. Rsonance magntique nuclaire du liquide

1H .......................................... 66

III.1.2. Rsonance magntique nuclaire du solide en 13

C et 15

N ............................ 67

III.1.3. Spectroscopie infrarouge transformation de Fourrier - FTIR ................... 67 III.2. Mesure du degr de polymrisation ................................................................ 68 III.3. Mesure de lindice de cristallinit ................................................................... 69 III.4. Caractrisation des proprits thermiques ...................................................... 70 III.4.1. Analyse thermogravimtrique (ATG) .......................................................... 70

III.5. Lanalyse lmentaire ..................................................................................... 71 III.6. Colorimtrie .................................................................................................... 71

IV. Application, comparaison et slection des mthodes ................................................. 71 IV.1. Composition de la matire premire ............................................................... 72

IV.1.1. Quantification des protines ........................................................................ 72

IV.1.2. Caractrisation complte de la composition de la matire premire ........... 74 IV.2. Composition des produits commerciaux ........................................................ 75

IV.3. Composition des produits de lextraction enzymatique ................................. 76 IV.3.1. Les rsidus insolubles de la cintique de rfrence ..................................... 76 IV.4. Estimation du degr de puret ........................................................................ 77

IV.4.1. Recoupement par lanalyse lmentaire ...................................................... 77 IV.4.2. Recoupement par lanalyse thermogravimtrique ....................................... 82 IV.4.3. Recoupement par RMN et FT-IR ................................................................ 87

IV.5. Estimation du degr dactylation .................................................................. 89 IV.6. Estimation de lindice de cristallinit ............................................................. 91

V. Conclusion sur le choix des mthodes ........................................................................ 92

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide ............. 95 I. Introduction ................................................................................................................... 97

II. Le milieu ractionnel acide .......................................................................................... 97 II.1. Choix de lacide : lacide phosphorique .......................................................... 97 II.2. Effet de lacide sur la dprotinisation et de la dminralisation .................... 97

III. La protase acide ........................................................................................................ 99

III.1. Choix de la protase : la pepsine .................................................................... 99

III.1.1. Activit protolytique ................................................................................ 100 III.1.2. Activit chitinolytique ............................................................................... 102 III.2. Les conditions dhydrolyse par la pepsine pour extraire la chitine .............. 102 III.2.1. Les paramtres du procd tudier ......................................................... 103 III.2.2. Mise en place dun plan dexprience ....................................................... 103

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique .................... 106 IV.1. Rsultats du plan dexprience ..................................................................... 106 IV.2. Rsultats de lanalyse statistique .................................................................. 112 IV.2.1. Degr de dminralisation ......................................................................... 112 IV.2.2. Le degr de dprotinisation ..................................................................... 113 IV.2.3. Estimation du degr de puret ................................................................... 114 IV.2.4. Rcapitulatif des analyses statistiques ....................................................... 115 IV.3. largissement du domaine dtude pour la dprotinisation ........................ 117 IV.3.1. Augmentation de la concentration en pepsine ........................................... 117 IV.3.2. Augmentation de la dure dhydrolyse ...................................................... 119

V. Modlisation .............................................................................................................. 120 V.1. Introduction .................................................................................................... 120 V.2. Modlisation de la dminralisation .............................................................. 122 V.3. Modlisation de la dprotinisation ............................................................... 125

VI. Choix des conditions optimales ............................................................................... 129 VII. Composition de la phase liquide et balance massique ............................................ 130

VII.1. Bilan massique global des minraux ........................................................... 130 VII.2. Bilan massique global des protines ........................................................... 132 VII.3. Bilan massique global des autres composs ................................................ 133

VIII. Extension une autre enzyme et un autre acide .................................................... 134 IX. Conclusions du chapitre 3 ........................................................................................ 139

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction ........................................................................................................................... 143

I. Performances de dminralisation et de dprotinisation ........................................... 145

I.1. Comparaison avec lextraction chimique ........................................................ 145 I.1.1. Degr de dminralisation ............................................................................ 146 I.1.2. Degr de dprotinisation ............................................................................. 147

I.2. Comparaison avec dautres procds dextraction biologique ........................ 148 II. Qualit physico-chimique des produits ..................................................................... 150

II.1. Degr dactylation ........................................................................................ 150 II.2. Degr de polymrisation ................................................................................ 152 II.3. Degr de cristallinit ...................................................................................... 153

II.4. Stabilit thermique ......................................................................................... 154

III. Comparaison des mcanismes dextraction ............................................................. 155 IV. Valorisation de la phase soluble ............................................................................... 157

IV.1. Analyse du poids molculaire des peptides solubles .................................... 157 IV.2. Evolution de llimination des acides amins dans le rsidu solide ............. 161 IV.3. Rsidus glycosidiques .................................................................................. 162 IV.4. Pigments ....................................................................................................... 163

IV.4.1. Quantit de lipides et dastaxanthine dans la phase soluble ...................... 163 IV.4.2. La couleur des rsidus insolubles .............................................................. 165

V. Conclusions du chapitre 4 ......................................................................................... 167

x

Conclusion & Perspectives .................................................................................................. 169

Rfrences ............................................................................................................................. 175 Annexes ................................................................................................................................ 201

xi

LISTE DES TABLEAUX Tab.I.1 : Production de drivs partir de chitine et gamme de prix (Einbu, 2007a) ......................................... 15 Tab.I.2 : Teneur en chitine par espces (Mathur et Narang, 1990 ; Shahidi, 2002) ............................................ 16 Tab.I.3 : Utilisations de la chitine/ chitosan en agroalimentaire (Crini et al. 2009)............................................ 19 Tab.I.4 : Rpartition des applications du chitosan, en tonnes, en 2006 (GIA, 2010) ........................................... 23 Tab.I.5 : Quantits de chitine et de carbonate de calcium (Kurita, 2006) ............................................................ 24 Tab.I.6 : Liste non-exhaustive des solvants de la chitine, (Shahidi, 2002 ; Kumar, 2004 ; Morris 2009) ............ 33 Tab.I.7 : Sites des liaisons lyses en fonction de lenzyme (Rao, 1998)................................................................ 43 Tab.II.1: Caractristiques des principaux dosages colorimtriques des protines (Tyr=tyrosine, Cys=cystine et

Trp=tryptophane, His=histidine, Arg=arginine et Lys=lysine) ........................................................................... 60 Tab.II.2 : Dplacements chimiques des protons et carbones en RMN (Kasaai,2010) .......................................... 66 Tab.II.3 : Pics caractristiques en FT-IR de la chitine (Pawlak et al. 2003) ....................................................... 67 Tab.II.4 : Exemples de le relations employes pour dterminer le DA via la spectroscopie FT-IR ..................... 68 Tab.II.5 : Rsultats de la teneur en protines comparaison des mthodes ........................................................ 72 Tab.II.6 : Composition en acides amins dans la matire premire comparaison entre laboratoires .............. 73 Tab.II.7 : Composition globale des exosquelettes de crevette P. vannamei .......................................................... 74 Tab.II.8 : Comparaison des compositions de la chitine commerciale (% en poids sec) ....................................... 75 Tab II.9 : Comparaison de plages de dgradation thermique de la chitine et des protines selon les tudes ...... 83 Tab.II.10 : Caractristiques des comportements thermiques des produits de diffrents degrs de puret ........... 84 Tab.II.11 : Composition des produits de diffrents degrs de puret (estimation par *CPG, **lavage au NaOH)

.............................................................................................................................................................................. 85 Tab.II.12 : Comparaison des DA, DP, C/N et ICr entre chitine commerciale ....................................................... 93 Tab.III.1 : Composition du substrat t0 de lhydrolyse enzymatique ................................................................... 99 Tab.III.2 : Conditions du plan dexprience : bornes des paramtres tudis ................................................... 104 Tab.III.3 : Description des conditions du plan dexprience .............................................................................. 105 Tab.III.4 : Lgende des rsultats du plan dexprience ...................................................................................... 106 Tab.III.5 : Statistiques appliques au degr de dminralisation ....................................................................... 112 Tab.III.6 : Statistiques appliques au degr de dprotinisation ........................................................................ 113 Tab.III.7 : Statistiques appliques au rapport C/N ............................................................................................. 114 Tab.III.8 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH ..................... 115 Tab.III.9 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH ..................... 116 Tab.III.10 : Comparaison des effets sur les diffrents aspects de lhydrolyse par la pepsine ............................ 116 Tab.III.11 : Impact relatif des variables sur les deux composantes du modle MA ............................................ 122 Tab.III.12 : Impact relatif des variables sur le modle MC ................................................................................. 125 Tab.III.13 : Description dtaille des recherches de modlisation de la dprotinisation ................................. 126 Tab.III.14 : Comparaison des caractristiques des produits insolubles obtenus par hydrolyse enzymatique, par

la pepsine et par lASP, aprs 6 h et 12 h de raction ........................................................................................ 137 Tab.III.15: Rcapitulatifs des performances atteintes aprs 6 h de protolyse acide ......................................... 139 Tab.IV.1 : Comparaison des performances dextraction de la chitine par voies biologiques, Xu et al. 2008 .... 149 Tab.IV.2 : Liste des bactries utilises par les tests dactivits antimicrobienne de la phase soluble ................ 159 Tab.IV.3 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction ... 165 Tab.IV.4 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction ... 165 Tab.IV.5 : Comparaison des performances en purification de chitine en fonction du procd .......................... 168 Tab.IV.6 : Comparaison des performances en purification de chitine en fonction du procd .......................... 168 Tab.IV.7 : Comparaison de la production deffluents chimique en fonction du procd .................................... 168

xii

LISTE DES FIGURES

Fig.1 : Reprsentation gnrale de la chitine comme copolymre de glucosamine et N-

actylglucosamine ................................................................................................................................... 3

Fig.2 : Chitine et drivs de la chitine .................................................................................................... 3

Fig.3 : Evolution du nombre de publication par anne traitant de chitine ou chitosan sur Web

of Science ................................................................................................................................................. 4

Fig.4 : Schma du procd dextraction de linvention dcrite par le brevet FR 11 54580, 24 mai 2011. ........................................................................................................................................................ 7

Fig.I.1 : Rpartition de la consommation moyenne de produits marins par habitant de 2003 2005 . 11

Fig.I.2 : Secteurs approvisionns par la production de poissons dans le monde (sauf Chine) FAO 2009

............................................................................................................................................................... 12

Fig.I.3 : Contribution relative de laquaculture et des captures en mer dans la consommation humaine de PM .................................................................................................................................................... 12

Fig.I.4 : Production de crevettes dans le monde, rpartition entre la pche (P) et laquaculture (A), FAO, 2006 ............................................................................................................................................. 13

Fig.I.5 : Rpartition des pnides leves en aquaculture dans le monde, FAO, 2010 ........................ 13

Fig.I.6 : Ventes de chitine en fonction des zones gographiques (Daprs GIA, 2010) ....................... 15 Fig.I.7 : Procd de fabrication de chitine-glucane par Kitozyme ....................................................... 17

Fig.I.8 : volution des domaines dapplication pour lesquels le chitosan est employ (Daprs GIA, 2010)...................................................................................................................................................... 22

Fig.I.9 : Niveaux hirarchiques dans lorganisation de la cuticule de crabe H. americanus (Raabe, 2005)...................................................................................................................................................... 25

Fig.I.10: (a) Motifs de Bouligand, CT de cuticule de homard en MEB, Raabe, 2006 ; (b)

reprsentations schmatiques de lempilement des fibres, Pillai et al. 2009 ........................................ 25 Fig.I.11 : Structure en nid dabeilles de cuticule de homard en CT par MEB (a) Pillai, 2009 (b) Raabe, 2006 ........................................................................................................................................... 26

Fig.I.12 : Structure de la cuticule normal (a) et dcalcifie (b) par MEB (Raabe, 2005) .................... 26

Fig.I.13: Proposition de structure entre chitine et protines, a) Stankiewicz et al. 1996 b)

Hamodrakas, 2002 ................................................................................................................................ 27

Fig.I.14 : Reprsentation idale de la chitine (a) et son driv obtenu par dsactylation, le chitosan

(b). ......................................................................................................................................................... 28

Fig.I.15: Arrangement des trois formes existantes de chitine : , et (Einbu 2007) ......................... 29 Fig.I.16: Maille cristalline .................................................................................................................... 30

Fig.I.17 : Dispersion des masses molculaires ..................................................................................... 31

Fig.I.18: Schmas de distribution des groupes actyles le long de la chane carbone du chitosan, a)

PA=0: rpartition par blocs uniformes, b) PA=1: rpartition alatoire et c) PA=2: rpartition

alterne entre A et D. ............................................................................................................................ 34

Fig.I.19 : Procd industriel de fabrication de la chitine et de ses drivs (France Chitine) .............. 35

Fig.I.20 : Schma des ractions chimiques de dsactylation et dpolymrisation Sigma-Aldrich, Tutorial .................................................................................................................................................. 39

Fig.I.21: Schma du procd d'hydrolyse enzymatique par Beaulieu, 2009 ......................................... 45

Fig.I.22: Voies enzymatiques de conversion de la chitine en drivs dsactyls et dpolymriss

(Jeon et al. 2000) ................................................................................................................................... 48

Fig.I.23 : Parts (en tonnage) des voies de valorisation de coproduits marins en France, Andrieux,

2004 ....................................................................................................................................................... 48

Fig.I.24 : Mcanismes de digestion et dabsorption des protines par lorganisme ............................ 50 Fig.I.25 : Schma dune membrane cellulaire, rpartition des composs lipidiques ........................... 51 Fig.I.26 : La cuisson des crustacs modifie la conformation des pigments et donc change leur couleur

............................................................................................................................................................... 51

FigI.27 : Cristal de calcite, support de nanocristaux de brushite (Maity et al. 2011) et ciment de

phosphate de calcium appliqu (Callos Bone) ................................................................................... 53

Fig.I.28 : Hypothse de liaison entre chitine et protines proposes par Armenta et Guerrero-

Legarreta (2009) ................................................................................................................................... 54

xiii

Fig.II.1 : Rpartition des parts de produits et coproduits de crevettes (en pourcentage de poids

humide) .................................................................................................................................................. 57

Fig.II.2 : Hydrolyse enzymatique d'exosquelette de crevette par la pepsine en milieu maintenu acide

par H3PO4 .............................................................................................................................................. 65

Fig.II.3 : Spectre 1H RMN de chitosan, 600 MHz, en D2O, 65 C, (Yang et Montgomery, 2000) ... 66

Fig.II.4 : Viscosimtre capillaire dUbbelhode .................................................................................... 69 Fig.II.5 : Dispositif danalyse thermogravimtrique (Source Web, Wikipedia).................................... 70 Fig.II.6 : Composition en acides amins de l'exosquelette de crevette comparaison par laboratoires ............................................................................................................................................................... 73

Fig.II.7 : Principaux composs prsents dans la matire premire en fonction de la catgorie de taille

(n > 3).................................................................................................................................................... 75

Fig.II.8 : Cintique dhydrolyse enzymatique (25 % de pepsine/prot 40 C taille < 1mm) ............ 76 Fig.II.9 : Variations de teneur en azote pour diffrents composs azots (P et Q)............................... 79

Fig.II.10 : Pourcentage de chitine (Q) et de protines (P), minimal (---) et maximal ( ) en fonction de Nt ........................................................................................................................................................... 79

Fig.II.11 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan

massique ; en bleu, via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp dtermin par CPG) .............................................................................................................................. 80

Fig.II.12 : Corrlation entre les mthodes de quantification de la chitine (NaOH= via le traitement

chimique, Bilan = via le bilan massique, N (AE) = via lanalyse lmentaire, Naa = via la composition en acides amins ............................................................................................................... 81

Fig.II.13: Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique (25 % pepsine, 40 C) .................................................................................................................................................... 82

Fig.II.14 : Thermogramme de produits de diffrents degrs de puret (1 C/min) .............................. 84

Fig.II.15 : Relation entre la perte de masse de la 1re

tape et la quantit de protines ....................... 86

Fig.II.16 : Relation entre lestimation du taux de puret et la quantit de protines rsiduelles dune part et ltendue de la premire plage de temprature de dcomposition dautre part ........................ 86 Fig.II.17 : Superposition des spectres RMN

13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la

matire premire, en rouge ................................................................................................................... 87

Fig.II.18 : Spectres de spectroscopie FT-IR de la chitine commerciale Sigma (en bleu), extraite par

voie chimique (en rouge) et enzymatique (en vert) au laboratoire. ...................................................... 88

Fig.II.19 : Superposition des spectres RMN 13

C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la

matire premire, en rouge ................................................................................................................... 90

Fig.II.20 :Spectre RMN 1H de la chitine commerciale.......................................................................... 90

Fig.II.21 : Spectre FT-IR sur le rsidu solide de 6 h lhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C, (analyse mene par le laboratoire BMM) ............................................................................................................ 91

Fig.II.22 : Dconvolution du spectre de diffraction aux rayons X de la chitine commerciale Mahtani 92

Fig.II.23 : Comparaison visuelle entre le produit dextraction chimique (a) et le produit dhydrolyse enzymatique(b) ...................................................................................................................................... 93

Fig.III.1 : Composition des produits traits par lacide phosphorique en fonction du temps .............. 98 Fig.III.2 : Reprsentation schmatique de la pepsine (Source Web, http://dwb4.unl.edu) ................... 99

Fig.III.3 : Mcanisme propos pour la protolyse par les aspartate-protases (Reginald et al. 1974)

............................................................................................................................................................. 100

Fig.III.4 : Conditions de pH (A) et T(B) optimales de protolyse ..................................................... 100

Fig.III.5 : Modle selon Michalis-Menten, de la vitesse de raction en fonction de la consommation

en substrat ........................................................................................................................................... 101

Fig.III.6 : Comparaison sur la chitosanolyse selon 3 protases diffrentes, effet de la concentration en

enzyme (A), du pH (B), de la temprature (C) et de la concentration en substrat (D), Kumar et

Tharanathan 2004 ............................................................................................................................... 102

Fig.III.7 : Reprsentation schmatique dun plan factoriel complet dexprience 2k ......................... 103 Fig.III.8 : Rponses du plan dexprience : analyses de caractrisation des produits dhydrolyse tudies ................................................................................................................................................ 105

Fig.III.9 : Rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience ................ 106 Fig.III.10 : Quantit de minraux limins en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience ............................................................................................................................................................. 107

xiv

Fig.III.11 : Quantit de protines limines en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience ............................................................................................................................................................. 107

Fig.III.12 : Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse plan dexprience ....... 108 Fig.III.13 : Evolution du pourcentage dazote en fonction de la dure dhydrolyse plan dexprience ............................................................................................................................................................. 109

Fig.III.14 : Estimation du degr de puret de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience ...... 109 Fig.III.15 : Estimation de la quantit absolue de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience 110 Fig.III.16 : Degrs dlimination (%) des minraux (a) et des protines (b) en fonction de lexprience ............................................................................................................................................................. 110

Fig.III.1 : Estimation du degr de puret (a) et rapport C/N (b) en fonction de lexprience ............ 111 Fig.III.18 : Reprsentation du degr de dminralisation en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine, 40C, selon lquation III.2 ............................................................................................................................................................. 113

Fig.III.19 : Reprsentation du degr de dprotinisation en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C ............................. 114

Fig.III.20 : Reprsentation du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C .............................................................. 115

Fig.III.21 : Reprsentation du rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C .................................................. 116

Fig.III.22 : Hydrolyse enzymatique par 25 % de pepsine (T 40 C Taille < 1 mm) ........................ 118 Fig.III.23 : Hydrolyse enzymatique par 41 % de pepsine (T40 C Taille < 1 mm) ........................ 118 Fig.III.24 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan

massique ; en bleu, via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp dtermin par CPG) ............................................................................................................................ 119

Fig.III.25 : Comparaison des extractions par 25 % de pepsine entre 6 h et 12 h dhydrolyse (n=3) 119 Fig.III.26 : tapes du mcanisme dhydrolyse enzymatique (Hosseini et al. 2011) ........................... 121 Fig.III.27 : Confrontation entre le modle MA et les mesures observes, sse = 136 et rmse = 1,01 .. 123

Fig.III.28 : Confrontation entre le modle MB et les mesures observes, sse = 205, rmse = 1,21 ..... 124

Fig.III.29 : Confrontation entre le modle C et les mesures observes, sse = 118 et rmse = 0,93 .... 124

Fig.III.30 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1087 et

rmse = 3,14 ......................................................................................................................................... 126

Fig.III.31 : Effets inhibiteur et activateur selon laffinit avec les effecteurs forte (a) ou faible (b) .. 127 Fig.III.32 : Interaction et formation du complexe ENZYME-SUBSTRAT-EFFECTEUR ................... 127

Fig.III.33 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1072 et

rmse = 3,08 ......................................................................................................................................... 128

Fig.III.34 : Reprsentation du prix de vente de la chitine en fonction du cot de production (J) ...... 130

Fig.III.35 : Cintique de la composition de la phase soluble Hydrolyse de rfrence .................... 131 Fig.III.36 : Quantits de minraux dans les phases solubles et insolubles au cours de la raction ... 132

Fig.III.37 : Quantits de protines dans les phases solubles et insolubles au cours de la raction ... 133

Fig.III.38 : Composition de la phase soluble aprs 6 h dextraction enzymatique (cintique de rfrence) ............................................................................................................................................ 133

Fig.III.39 : Caractristiques techniques de lAcide Stable Protase, analyses par Bio-Cat Inc ...... 134 Fig.III.40 : Comparaison du rendement massique (a), de la quantit de minraux rsiduels (b) et des

protines rsiduelles (c) en fonction de lacide employ .................................................................... 135 Fig.III.41 : Composition des rsidus solides de lhydrolyse par 25 % dASP 45 C, pH 2,7 .......... 136 Fig.III.42 : Comparaison des performences dextraction enzymatique selon lacide employ, de part les degrs de dminralisation et de dprotinisation (a), le rendement massique et la quantit de

chitine (b), n=3 .................................................................................................................................... 137

Fig.IV.1 : Consquence de la dminralisation et dprotinisation chimique sur la composition des

produits................................................................................................................................................ 145

Fig.IV.2 : Comparaison des degrs de dminralisation en fonction des procds dextraction ....... 146 Fig.IV.3 : Comparaison des degrs de dprotinisation en fonction du procd dextraction ........... 147 Fig.IV.4 : Degr dactylation des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique 151 Fig.IV.5 : Degr de polymrisation des principales chitines produites par voie enzymatique et

chimique .............................................................................................................................................. 152

xv

Fig.IV.6 : Indice de cristallinit des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique

............................................................................................................................................................. 153

Fig.IV.7 : Profils dATG de la chitine commerciale (Mahtani) et du produit de lextraction enzymatique modle ............................................................................................................................ 154

Fig.IV.8 : Micrographies de MEB du produit de 6 h dhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C ....... 155 Fig.IV.9 : Organisation schmatique de la cuticule de homard, coupe transversale, Raabe et al. 2006

............................................................................................................................................................. 156

Fig.IV.10 : Micrographes de MEB dexosquelettes soit dminraliss (a) ou dprotiniss (b) par traitement chimique ............................................................................................................................. 156

Fig.IV.11 : Schma de la cuticule des crustacs, ep = picuticule, pi = couche pigmentaire, pr =

couche principale, E = cellules pithliales, p.c. = canaux de ports transversaux, i.s. = septum

interprismatique, Giraud-Guille, 1984 ............................................................................................... 157

Fig.IV.12 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par 25 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse ..... 158 Fig.IV.13 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par 41 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse ..... 159 Fig.IV.14 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par 25 % dASP en acide formique 40 C) selon la dure dhydrolyse ..................... 160 Fig.IV.15 : Quantits dacides amins rsiduels dans les produits insolubles de lextraction enzymatique par 25% de pepsine 40C (petite taille) en fonction de la dure dhydrolyse ............. 161 Fig.IV.16 : Rpartition des catgories de rsidus glycosidiques dans la phase soluble des extractions

enzymatiques ....................................................................................................................................... 162

Fig.IV.17 : Carotnodes prsents dans la phase soluble de lhydrolyse 25 % de pepsine, 6 h 40 C. ........................................................................................................................................................ 164

Fig.IV.18 : Comparaison des coefficients de spectrophotomtrie ...................................................... 166

Fig.IV.19 : Chitine obtenue par lavage chimique, par hydrolyse par la pepsine et par lASP (de gauche droite) .................................................................................................................................. 166

Fig.IV.20 : Schma rcapitulatif des tapes du procd de protolyse acide et des analyses

conscutives ......................................................................................................................................... 167

xvi

ABREVIATIONS

AA Acide amin

ABVT Azote basique volatil total

ATG Analyse ThermoGravimtrique

BSA Srum albumine bovine

CHOS Chitooligosaccharides

CPG Chromatographie en phase gazeuse

CS Chitine-synthtase

CT Coupe transversale

Da Dalton

DA Degr dactylation DCO Demande chimique en Oxygne

DD Degr de dsactylation

DCl Deuterated hydrochloric acid

DSC Differential scanning calorimetry

DHA Acide docosahexanoque

DP : Degr de polymrisation

EPA Acide eicosapentanoque

FA ; FD Fraction des units actyles ; Fraction des units actyles

FID Dtection par ionisation de flamme GC/MS Chromatographie en phase Gazeuse-Spectromtrie de Masse

HPLC Chromatographie en phase liquide

JO Journal Officiel

LMWC Chitosan de trs faible masse molaire (oppos HMWC)

MES Matires en suspension

Mdt Milliard de tonnes

Mt Million de tonnes

NMR Rsonnance magntique nuclaire PA Pattern of N-acetylation PER Pourcentage defficacit des protines (Protein Efficiency Ratio)

USD United States Dollar

Abrviations chimiques

CH3COCH3 Actone

(COOH)2 Acide oxalique Ca(H2PO4)2 Bis-dihydrognophosphate de calcium CaHPO4 phosphate de calcium de formule (brushite) Ca3(PO4)2 Tricalcium phosphate CH3COOCH2CH3 thyle-actate

H202 Peroxyde dhydrogne HNO2 Acide nitreux

KBr Potassium bromide

KMnO4 Permanganate de potassium

KNaC4H4O6 Tartrate de sodium et potassium Na2CO3 Carbonate de sodium

NaBH4 Sodium borohydride

NaClO Hypochlorite de sodium

Introduction

Introduction

3

Gnralits

La chitine a t isole pour la premire fois, en 1811, par un chercheur franais, Henri

Braconnot, sur un champignon. Son driv, le chitosan a t dcouvert en 1859 par Charles

Rouget alors quil chauffait la chitine avec du KOH concentr.

Ce polymre est un des plus abondants sur Terre, la fois dans le milieu terrestre et marin. Il

est traditionnellement extrait partir des carapaces des crustacs depuis les annes 70, pour

des domaines dapplication varis, tels que la pharmaceutique, la cosmtique, la dittique et

le traitement des eaux. Il est compos dun squelette carbon linaire, des units de

glucosamine et de N-actylglucosamine (Fig.1).

Fig.1 : Reprsentation gnrale de la chitine comme copolymre de glucosamine et N-actylglucosamine

La chitine et le chitosan sont principalement caractriss par leur degr de polymrisation

(DP), c'est--dire par le nombre dunits qui constituent la chane du polymre, et par leur

degr dactylation (DA), c'est--dire le pourcentage dunits actyles. Ces paramtres

modulent par exemple la densit de charge du polymre, et donc sa solubilit et ses bio-

fonctionnalits. Dautres caractristiques sont parfois mesures en raison de leur influence sur

les proprits du polymre, tels que lindice de cristallinit et la poly-dispersion des units de

glucosamine (Glu) et N-actylglucosamine (NacGlu). Les applications de la chitine et de ses

drivs sont lies leurs proprits et par consquent ces caractristiques (Kasaai, 2010).

Fig.2 : Chitine et drivs de la chitine

Les principaux drivs de la chitine et les mcanismes pour les produire sont schmatiss par

Introduction

4

la figure 2. Par dsactylation, la chitine est convertie en chitosan, tandis que la

dpolymrisation rduit la chitine en oligomres. Si le procd est men son terme, le

polymre est entirement converti en rsidus de Glu ou NacGlu. La dpolymrisation

applique au chitosan produit des oligomres de chitosan puis des units de glucosamine.

La recherche sintresse de plus en plus la chitine et ses drivs

Le nombre de publications sur le thme de la chitine et ses drivs ne cesse de stendre

depuis 1970. Cette anne-l, le nombre de publication portant sur la chitine ou le chitosan

tait de 40, daprs la base Web of Science, alors quil atteint 5 260 en 2011. Avant 1960, le

nombre dtudes publies par an sur ce thme tait infrieur 5. La figure 3 illustre cette

volution. Daprs les conclusions de ces publications, ces produits sont promis un bel

avenir. Leurs proprits biologiques et rhologiques sont encore sous-exploites par rapport

leurs potentiels, par exemple comme films alimentaires. De nombreux laboratoires

sinvestissent dans la mise au point de nouvelles applications, notamment dans le domaine

mdical. De plus, il existe un engouement pour les produits dorigine naturelle et de surcrot

dorigine marine.

Les premiers brevets concernant le chitosan semblent dater des annes 30 (Rigby, 1934 et

1935) et son application concernait la fabrication de biofilms (Shahidi, 2002). Au cours de

lanne 2010, la littrature sur la chitine et le chitosan sest enrichie de nombreuses revues qui

constituent de rels atouts pour la poursuite des tudes dans ce domaine. Les laboratoires

leaders se situent majoritairement en Asie, o se situe galement la majorit de la production

et des applications.

Fig.3 : Evolution du nombre de publication par anne traitant de chitine ou chitosan sur Web of Science

Les enjeux de ltude

La thmatique de cette tude sinscrit dans la valorisation des coproduits de crustacs. La

chitine est lun des constituants majoritaires de lexosquelette des crustacs. Son extraction

est habituellement ralise par traitement chimique. Elle repose principalement sur deux

tapes :

- la dminralisation, par hydrolyse acide, pour liminer les minraux ;

- la dprotinisation, par hydrolyse basique, pour liminer les protines.

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ion

s

Introduction

5

Ce procd chimique consomme de grandes quantits deau et de ractifs (principalement

lacide chlorhydrique, lhydroxyde de sodium et des agents de blanchiment) qui sont nocifs

pour les manipulateurs, les quipements et lenvironnement. De plus, ltape de

dprotinisation basique se fait en gnral chaud et donc ncessite un apport nergtique

consquent. En outre, les tapes de lavage gnrent des volumes trs importants deffluents

pollus, dont le recyclage engendre un cot. Enfin, le procd dextraction chimique risque de

dnaturer la structure de la chitine et ne permet pas la valorisation des autres composs des

coproduits de crustacs, tels que les peptides et les pigments (Crini et al. 2009).

l'inverse, un procd biologique de purification de la chitine rpondrait mieux aux enjeux

actuels de dveloppement durable. Son empreinte sur lenvironnement devrait tre rduite car

les volumes d'effluents chargs en ractifs chimiques sont plus faibles. Ses conditions plus

douces devraient prserver la qualit de la chitine. Enfin elles devraient galement favoriser la

valorisation des autres constituants, prsents dans les coproduits de crustacs. Il sagit

notamment des peptides et des pigments.

Les expriences dextraction de chitine par voie fermentaire et enzymatique seront dcrites au

cours du premier chapitre de ce manuscrit. Par ces voies, les taux de protines et minraux

rsiduels sont plus importants par rapport lemploi de lextraction chimique. Des traitements

complmentaires sont souvent ncessaires pour amliorer le degr de puret en chitine. Enfin,

les temps de raction sont beaucoup plus longs que par la voie chimique.

Lide directrice de ltude

Dans ce contexte, la prsente tude prtend appliquer un traitement enzymatique optimis afin

dextraire la chitine des coproduits de crustacs. Conscients des contraintes conomiques et

environnementales actuelles, le procd dcrit aura pour principe de fusionner les deux

principales tapes de l'extraction de la chitine en une seule tape. Cela a pour consquence

directe une rduction du risque de perte de produit au cours des tapes de lavage et une

rduction de temps par rapport aux prcdents traitements biologiques.

Lide directrice de cette tude est dutiliser des protases mme de fonctionner pH acide,

afin de runir les deux tapes de dminralisation et dprotinisation en une seule tape de

protolyse acide.

Pour favoriser la dminralisation et la dprotinisation, le pH du milieu doit tre proche dun

pH optimis pour raliser ces deux ractions simultanment. De plus il doit prserver

l'intgrit structurelle et fonctionnelle des composs hydrolyss. Enfin, son innocuit doit tre

garantie pour envisager dventuelles applications dans les domaines de lagroalimentaire, de

la nutraceutique et des cosmtiques.

Les objectifs sous-jacents concernent dune part lapproche mthodologique pour caractriser

le substrat et les produits obtenus. Dautre part, une tude des paramtres qui influencent les

performances du procd est ncessaire pour son optimisation.

Introduction

6

Prsentation des objectifs et organisation du manuscrit

Le premier chapitre situe le contexte de la filire des coproduits marins sur le march actuel et

retrace ltat de lart concernant la chitine et ses drivs. Un accent particulier est port sur le

lien entre les caractristiques de la chitine ou de ses drivs et leurs proprits. Notre sujet

sinscrivant dans une rflexion sur la valorisation maximale des coproduits de crustacs,

lexploitation des autres composs prsents (protines, minraux et pigments) est galement

tudie.

La caractrisation de la matire premire, de la chitine commerciale et des produits issus du

procd enzymatique est ncessaire. Elle consiste dterminer la composition de ces produits

et leurs caractristiques physico-chimiques. Au cours du chapitre 2, plusieurs mthodes sont

compares et discutes. Elles font face la difficult de sparer la chitine et les protines. Une

stratgie analytique est mise en uvre pour estimer au mieux la composition des produits et le

degr de puret en chitine (ou linverse son degr dimpurets). Cette stratgie permet

destimer les performances du procd.

Le chapitre 3 traite des paramtres influenant les performances de lextraction enzymatique.

Ils permettent doptimiser et de contrler les conditions du procd. Les paramtres tudis

sont la temprature, la concentration en enzymes et la taille des fragments de matire

premire. Un plan dexprience est ralis pour suivre les cintiques de dminralisation et de

dprotinisation. Daprs les rsultats obtenus, le domaine dtude est tendu, notamment

avec laugmentation de la concentration en enzyme. Un travail est alors entrepris pour

modliser les cintiques de dminralisation et de dprotinisation. Sur la base du modle

retenu, un travail prliminaire doptimisation du procd est engag. Il permet didentifier nos

conditions de rfrence. Lutilisation dune autre enzyme et dun autre acide est explore. Une

validation du bilan massique des deux phases issues de lhydrolyse enzymatique est propose.

Ce procd de purification de la chitine en une seule tape par voie enzymatique, a fait lobjet

dun dpt de brevet (FR 11 54580 ; Fig.4).

Le chapitre 4 compare les performances du nouveau procd par rapport l'extraction

chimique traditionnelle, sur la base de critres de caractrisation tels que les degrs

dactylation et de polymrisation, ainsi que lindice de cristallinit. La structure des rsidus

solides, supposs tre majoritairement de la chitine, est observe par microscopie balayage

lectronique. Une analyse plus fine des composs solubiliss par lhydrolyse enzymatique est

ensuite propose.

La dernire partie soulignera les principales conclusions apportes par ce travail.

Introduction

7

Fig.4 : Schma du procd dextraction de linvention dcrite par le brevet FR 11 54580, 24 mai 2011.

Chapitre 1 Etude bibliographique

I. Contexte conomique

11

I. Contexte conomique

I.1. volution du march des produits marins, focus sur les crustacs

Le march des produits aquatiques ne cesse daugmenter lchelle internationale. La forte

hausse de la demande est principalement lie laugmentation de la consommation humaine.

Elle reprsentait 0,7 Kg par habitant en 1970 tandis quelle a atteint 7,8 Kg par habitant en

2008, soit une augmentation de 6,6 % par an (FAO, 2010).

La consommation de produits marins est ingalement rpartie sur la surface de la plante,

comme le montre la figure I.1 (FAO, 2008).

Fig.I.1 : Rpartition de la consommation moyenne de produits marins par habitant de 2003 2005

Cette rpartition ingale est le reflet de valeurs traditionnelles et culturelles, de la disponibilit

en ressources marines et de critres socio-conomiques. La consommation est la plus leve

au Groenland et au Japon. Elle est la plus faible en Afrique. Elle est importante en Asie-

Indonsie-Ocanie, en Europe Occidentale, en Amrique du Nord, Centrale et sur la cte

chilienne.

La consommation humaine de produits marins a atteint 72,1 Mt en 2006. Son augmentation

suit celle de la population. Les utilisations non-alimentaires ont augment jusqu la fin des

annes 90 (Fig.I.2) et contribue leffort de pche mondial. La principale utilisation non-

alimentaire est la production de fourniture pour lalimentation animale, notamment pour

laquaculture.

Chapitre 1 Etude bibliographique

12

Fig.I.2 : Secteurs approvisionns par la production de poissons dans le monde (sauf Chine) FAO 2009

La hausse de la production sexplique par la progression de la production aquacole depuis le

milieu des annes 80. Cette part de laquaculture doit tre pondre par la place de lAsie,

notamment la Chine, dont la production de poissons dlevage prsente une forte ascension

depuis les vingt dernires annes (Fig.I.3. FAO, 2009).

Fig.I.3 : Contribution relative de laquaculture et des captures en mer dans la consommation humaine de PM

Avant la crise de 2009, laugmentation de la consommation tait particulirement marque

pour les crustacs, principalement la crevette. La consommation mondiale est passe de

0,4 kg/hab en 1961 1,6 kg/hab en 2005. Aujourdhui, la crevette est la premire valeur

change parmi les produits marins. Sa production annuelle mondiale tait estime plus de

6 Mt en 2005. La rgion Asie-Pacifique, et notamment la Chine, la Thalande, le Vietnam,

lIndonsie et lInde, est la principale productrice, totalisant prs de 88 % des productions

(FAO, 2009 ; GLOBEFISH, 2011). Les exportations de crevettes atteignent 14 milliards de

dollars par an, soit 16 % des produits marins.

I. Contexte conomique

13

La part de laquaculture reprsente 70 % de la production mondiale de crevettes et plus

gnralement 76 % pour lensemble des crustacs (FAO, 2006). Cependant, la rpartition

entre laquaculture et la pche de crevettes est trs ingale selon la rgion du globe (Fig.I.4).

Fig.I.4 : Production de crevettes dans le monde, rpartition entre la pche (P) et laquaculture (A), FAO, 2006

Les crevettes sont gnralement traites aux mtabisulfites la sortie de leau, pour viter leur

dgradation et le noircissement des carapaces par oxydation, (Chantereau, 1991). Elles sont

vendues soit fraches, soit congeles, cuites ou marines. De plus, elles sont proposes

entires ou dcortiques. En 2010, la plus forte augmentation tait la part des crevettes cuites

et dcortiques. Gnralement, cette forme de produit est destine une post-transformation,

telle que la fabrication de brochettes de la mer ou de plats prpars.

Lune des espces de crevette les plus commercialises est la crevette tropicale, dite crevette

patte blanches, Penaeus vannamei. lorigine, elle tait cultive uniquement sur la cte

Pacifique de lAmrique latine. Depuis sa production sest tendue. Elle a atteint 67 % de la

production mondiale en 2008 (FAO, 2010), soit 70 % des pnides (Fig. I.5). La

consommation de P. vannamei est trs prise. Elle a augment de 58 % en Asie et de 211 %

en Amrique latine entre 2001 et 2006.

Fig.I.5 : Rpartition des pnides leves en aquaculture dans le monde, FAO, 2010

Chapitre 1 Etude bibliographique

14

Laugmentation de la production des crustacs entrane une augmentation du volume de leurs

coproduits1. Des plateformes de dcorticage de crevettes existent notamment au Maroc et en

Asie. Leur principale voie de valorisation est la production de chitine, lun des composs

majoritaires des cuticules de crustacs.

I.2. Valorisation des coproduits marins : la chitine et ses drivs

Les coproduits marins dsignent les parties (de poissons, cphalopodes, crustacs, etc.) issues

dun procd de transformation pour la consommation humaine (filetage, viscration,

ttage, pelage ou cuisson). Il sagit des peaux, artes, ttes, queues, ou carapaces. Leur

valorisation nest pas une proccupation rcente. Ils font lobjet dune attention particulire

du fait de la valeur ajoute quils apportent aux procds industriels classiques (Cf. section

VIII).

Valorisation des coproduits de crustacs : la production de chitine

Les coproduits de crustacs reprsentent plus de 60 % du poids frais (Wang et al. 2011). Ce

volume constitue une ressource abondante de chitine. Ce polysaccharide ancien constitue

lexosquelette des crustacs. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs ne

cessent de stendre (Cf. section III).

La production de chitine se situe en majorit en Asie-Pacifique. Les coproduits de crustacs y

sont disponibles et la lgislation lie au retraitement des effluents est peu contraignante. En

2004, on rpertoriait 63 producteurs de chitine ayant une place importante sur le march, dont

la moiti en Asie (Montfort-Windels, 2004). Le Japon est le premier producteur (FAO, 2009).

Pour la plupart des applications, la chitine nest pas utilise directement. Elle est convertie,

principalement en chitosan et chitooligosaccharides (Fig.2, p3). La production de chitine tait

de lordre de 25 000 tonnes en 2006, dont prs de 8 000 tonnes pour sa conversion en chitosan

(GIA, 2010). En 2000, 10 000 tonnes de chitine taient produites (Kurita, 2006), dont prs de

6 667 T pour la fabrication de glucosamine, 2 667 T pour le chitosan et 1 000 T pour les

oligosaccharides. Le march de la chitine na cess de crotre comme en tmoigne la figure

I.6. Les ventes de chitine ont atteint prs de 25 000 tonnes en 2006 (GIA, 2010).

1 Les coproduits se dfinissent comme tant la matire issue du processus de fabrication dun produit principal.

Tout comme le produit fini principal, les coproduits doivent se soumettre une rglementation spcifique pour

tre utiliss directement ou indirectement dans lindustrie

I. Contexte conomique

15

Fig.I.6 : Ventes de chitine en fonction des zones gographiques (Daprs GIA, 2010)

Daprs la figure I.6, le Japon domine nettement le march de la chitine. Il participe 61 %

des ventes mondiales. Les perspectives annonces lhorizon 2015 maintiennent globalement

ces carts entre les rgions. La production de chitine atteindrait prs de 63 000 tonnes (GIA,

2010).

En 2006, 60 % de la chitine a t convertie en glucosamine. Ceci place la glucosamine au

premier rang des volumes de ventes. Le second driv est le chitosan, dont la part des ventes

reprsente prs de 34 %. Cependant, ces chiffres masquent des disparits rgionales. Par

exemple, en Asie-Pacifique la mme anne, la part du chitosan est suprieure celle de la

glucosamine (50 % contre 46 %). Au contraire, le Japon consomme 25 % de chitosan contre

plus de 66 % de glucosamine. Les perspectives tendent vers une trs lgre diminution de la

part des autres drivs au profit de la glucosamine et du chitosan (GIA, 2010).

LAsie produit de la chitine un cot trs comptitif. En Chine, 90 % de ce cot correspond

au prix des matires premires et des ractifs (CCM International, 2009). Le tableau I.1

montre les diffrences de prix en fonction des catgories de drivs de chitine (Einbu, 2007a).

Drivs Production (T) Chitine consomme (T) Prix du march (USD/Kg)

Glucosamine Chitosan

Oligosaccharides N-actylglucosamine

4 500 3 000 500 100

9 000 4 000 1 000 200

7 35 10 100 50 100 20 140

Tab.I.1 : Production de drivs partir de chitine et gamme de prix (Einbu, 2007a)

Le principal critre qui dfinit le prix est le taux de puret, lui-mme li au procd

dextraction de la chitine. Einbu (2007a) rapporte des prix bien plus levs pour des drivs

de trs forts degrs de puret, de lordre de 10 000 USD/Kg pour des oligosaccharides ultra-

purs et 50 000 USD/Kg pour le chitosan. Les prix de la N-actylglucosamine obtenue par voie

chimique et par voie enzymatique sont de lordre de 20 USD/Kg et de 100 140 USD/Kg

respectivement.

0

5000

10000

15000

2001 2002 2003 2004 2005 2006

Ve

nte

(e

n t

on

ne

s)

USA

Canada

Japon

Europe

Asie-Pacifique

Reste

Chapitre 1 Etude bibliographique

16

I.3. Disponibilit de la chitine, ressource naturelle

La chitine est lun des polymres naturels les plus abondants sur le globe avec la cellulose

(Khanafari et al. 2008). Ces deux polysaccharides sont similaires du point de vue de leur

structure et leurs fonctionnalits. La chitine entre dans la composition de la cuticule des

arthropodes et de certains mollusques (les cphalopodes), dans la paroi de certains

microorganismes tels que les micro-algues et les moisissures. Les teneurs en chitine varient

dune espce lautre. Le tableau I.2 montre les carts qui existent selon les ressources

disponibles pour produire la chitine.

Source Teneur en chitine

(en % mat sec)

Source

Teneur en chitine (en % mat sec)

Arthropodes 2 72 Crabes Chinoecetes opilio 26,6 Mollusques 6 40 Crevettes Pandallus borealis 17,0 Ponophores 33 Crevettes Cangron cangron 33 Cnidaires (capsules ufs) 3 30 Crevettes Penaeus monodon 3 30 Annlides 0,2 38 Ecrevisses Procamborus darkia 0,2 38 Brachiopodes 4 29 Bouquet 4 29 Champignons 2,9 20,1 Plume de calmar 2,9 20,1 Algues/ Lichen Faible Krill Euphasia superba Faible

Tab.I.2 : Teneur en chitine par espces (Mathur et Narang, 1990 ; Shahidi, 2002)

La production naturelle de chitine est estime plus dun milliard de tonnes par an, jusqu

2,3 milliard de tonnes par an selon Jeuniaux (1991). 1 328 Mt proviennent de ressources

marines (Cauchie, 2000), dont 29,9 Mt des crustacs, 1,4 Mt des mollusques et 0,7 Mt des

calmars (Synowiecki et Al-Khateeb, 2003).

Les ressources pour la production de chitine

Les sources privilgies pour la production de chitine sont les coproduits de crustacs, en

particulier les crevettes et les crabes. Cependant, le choix de la matire premire est li

lactivit locale. Certaines zones gographiques privilgient dautres ressources, telles que les

krills ou les bouquets. Les plumes de calmar sont parfois exploites pour extraire de la chitine

. Cette structure est diffrente de la chitine extraite des crustacs (Cf. section III). Leurs

proprits sadressent des applications technologiques spcifiques (Cf. section V). Des

tudes ont galement t menes sur la chitine des ponges telles que Verongula gigantea et

sur la chitine de tubes digestifs de vers telles que Riftia pachyptila (Ehrlich et al. 2007).

La biomasse des microorganismes constitue une quantit de chitine abondante. Parmi eux, on

peut citer les levures, les moisissures, certains ciliates, les algues appartenant aux

chrysophytes et certaines bactries dont les streptomyctes (Kim, 2010). Lavantage dune

telle production repose sur la matrise de la culture des microorganismes. La production de

chitine peut tre complmentaire la production dacide citrique de mycelium dAspergillus

niger (Cai et al. 2006). Une entreprise belge, Kitozyme, ne en dcembre 2000, propose des

drivs de chitine-glucanes (complexe de chitine ramifi avec des units de glucanes) obtenus

partir de paroi dAspergillus Niger (Fig.I.7).

I. Contexte conomique

17

Fig.I.7 : Procd de fabrication de chitine-glucane par Kitozyme

Le rendement en chitine varie en fonction de lespce entre 9 35 % par rapport la biomasse

sche. Le chitosan peut galement tre produit partir de moisissures telles que Rhizopus et

Mucor (Nadarajah et al. 2001).

Louvrage de Kim (2010) inventorie les avantages et les inconvnients des productions

partir des microorganismes. La matrise et la rapidit de leur croissance constituent les

principaux avantages. Cependant le rendement en chitine est seulement de 8,5 19,6 % et

celui en chitosan de 1 4 % par rapport au poids sec de la biomasse.

Dautres ressources terrestres ont galement t explores. Des tudes se sont intresses la

production de chitine partir de champignons (Zhang et al. 2000 ; Wu et al. 2004 ; Yen et

Mau 2007), de vers soie et dabeilles (Nemtsev et al. 2004 ; Paulino et al. 2006). Les larves

de vers sont composes de 24 % de chitine et les tonnages disponibles lis lindustrie de la

soie, plusieurs milliers de tonnes par an, justifieraient leurs exploitations (Zhang et al. 2000).

De mme, les abeilles exploites pour la production de miel ont t proposes comme

ressource pour lextraction de chitine en Russie (Nemtev et al. 2004).

Enfin, des fermes ou des cultures sur milieux synthtiques ont t labores pour diffrentes

espces telles que Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Trametes versicolor, Armillaria

mellea et Pleurotus ostreatus (Pochanavanich et Suntornsuk, 2002 ; Yen et Mau, 2007, Di

Mario et al. 2008). Le rendement en chitine atteint 8,5 16,9 % et celui en chitosan entre 1 et

4 % par rapport la biomasse sche.

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

La chitine est naturelle, non-toxique, biodgradable et versatile. Son utilisation repose

principalement sur sa capacit former des matrices et ses activits biologiques intressantes

(Goycoolea et al. 1999).

Le caractre poly-cationique de trs forte densit de charge du chitosan est souvent lorigine

de ses proprits. En effet, il favorise la formation de complexes poly-lectrolytes et ainsi la

capacit former des matrices (Shahidi, 1999). De plus, les drivs de la chitine possdent

des activits biologiques comme hypo-cholestrolmique, antioxydant, anti-tumoral,

antimicrobien, anti-hypertensive, antidiabtique et favorisant le systme immunitaire (Kim,

2010). Ces domaines dapplication vont tre dtaills ci-dessous, par ordre croissant de grade

technologique.

Chapitre 1 Etude bibliographique

18

II.1. Les applications dans le domaine agricole

La chitine sert de substrat aux microorganismes producteurs de chitinase et danthraquinone

par Morinda citrifolia par exemple (Dornenburg et Knorr, 1994). De plus, la chitine et ses

drivs jouent un rle dliciteur sur les plantes. Il consiste favoriser la production de

mtabolites secondaires qui renforcent les dfenses immunitaires. Les drivs de chitine

stimulent par exemple la production de lenzyme phnylalanine ammonia-lyase (PAL) et de la

tyrosine ammonia-lyase (TAL), qui interviennent dans la synthse de composs du systme

de rsistance contre les pathognes (Khan et al. 2003 ; Kim et al. 2005). Par consquent, de

meilleurs rendements de germination et de rcolte sont obtenus (Crini et al. 2009 ; Rabea et

al. 2003). Enfin, les produits chitineux apportent de lazote ( 7 %) lorsquils se dcomposent,

contribuant lenrichissement du sol et de la plante.

II.2. Les applications dans le domaine du traitement de leau

Des rductions de 70 98 % de la teneur en MES (matire en suspension, responsable de la

turbidit) et de 55 80 % la demande chimique en oxygne (DCO) ont t observes pour le

traitement des eaux uses (Jun et al. 1994) en utilisant du chitosan comme floculant.

Du fait de leur forte densit de charge, les drivs de chitine sont capables dinteragir avec les

MES, les microorganismes et les ions mtalliques (Taboada, 2003 ; Cardenas, 1876). Cette

proprit est utilise pour piger les composs dangereux, pour les liminer ou les doser

(Camci-Unal et Pohl, 2010 ; Skorik et al. 2010). Guibal et al. (1994) ont tudi limpact des

caractristiques des drivs du chitosan et de leur environnement (lumire, gaz) sur leur

capacit dadsorption avec les ions uranyle. Le chitosan est galement employ pour recycler

les effluents de lindustrie textile en retenant des pigments (Yap et al. 2008).

Le chitosan peut tre utilis de plusieurs faons, la principale tant comme floculant (Crini,

2009). Les collodes en suspension, les mtaux lourds, les colorants des eaux de teintureries

(Hsien et Rorrer, 1995) ou encore les molcules aromatiques et phnoliques (No et Meyers,

2000 ; Krajewska, 2005) sagglomrent avec le chitosan et les flocs sont retenus par filtration.

Les flocs de chitosan rduisent de 50 % les MES (Rhee et al. 1998). Un autre mode daction

consiste intgrer le chitosan directement dans la composition des membranes de filtration.

Lencapsulation denzyme par des matrices chitineuses est une piste tudie pour le traitement

de leau. Miao et al. (2000) ont montr la capacit du chitosan associ la glutaraldhyde

immobiliser la peroxydase extraite de raifort. Cette enzyme est employe pour liminer les

phnols des effluents de raffineries (Lu et al. 2010).

II.3. Les films de chitine/ chitosan

Les films de chitine et de chitosan sobtiennent par leur dissolution dans une solution acide.

La teneur en humidit du polysaccharide doit tre faible pour russir le film.

Du point de vue de leurs caractristiques mcaniques, les films de chitine ne peuvent pas subir

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

19

dlongation. Ceux base de chitosan peuvent tre tirs deux fois seulement. Ces proprits

mcaniques peuvent tre amliores par modification du chitosan (par ramification) ou par

des ajustements de formulation. Par exemple, le chitosan-poly(vinyl-alcool) prsente une

meilleure rsistance mcanique, stabilit et capacit dlongation (Nakano, 2007).

Les produits cosmtiques

Beaucoup dapplications dans le domaine cosmtique reposent sur ces proprits filmognes.

Des principes actifs peuvent tre pigs dans des films ou des billes de chitosan. Ces principes

actifs sont librs au contact de la peau par leffet de la diminution du pH. Les produits le plus

couramment rencontrs sont des soins pour la peau, contre lacn et pour les cheveux,

notamment pour leur souplesse. Cette application repose sur les proprits lectrostatiques du

chitosan (Rinaudo, 2006)

II.4. Les applications dans les industries alimentaires et dittiques

Plusieurs proprits de la chitine ou de ses drivs sont exploites dans le domaine de

lagroalimentaire. Elles sont rsumes dans le tableau I.3 :

Applications Rle

Prservation de la qualit des aliments Films comestibles Additif alimentaire

Nutraceutique (complments nutritifs)

Recyclage des effluents

Antimicrobien Antioxydant

Structurant Texturant, mulsifiant Ajoute arme et couleur Fibres Hypocholestrolmiant Contre lintolrance au lactose Rduction de labsorption des lipides

Tab.I.3 : Utilisations de la chitine/ chitosan en agroalimentaire (Crini et al. 2009)

Les films alimentaires base de drivs de chitine sont la fois une barrire physique et

biologique contre les flores daltration et les contaminations extrieures. Le chitosan serait

plus efficace que les CHOS dans ce domaine, cependant les tudes ne sont pas unanimes. Tsai

et al. (2004) montrent que le chitosan a un effet inhibiteur sur des pathognes tels que

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella enterica

serovar Typhi. linverse, Kittur et al. (2005) et Kumar et al. (2005) ont montr que les

CHOS taient plus actifs. Lin et al. (2009) expliquent cette contradiction par le rle dominant

du degr dactylation par rapport celui du degr de polymrisation. Ceci illustre bien quel

point les caractristiques des drivs de la chitine influent sur leurs proprits.

Ces films alimentaires sont galement antioxydants (Jeon et al. 2002). Kim et Thomas (2007)

ont montr un rsultat positif contre loxydation des lipides. Cette proprit est lie la

prsence de deux groupes hydroxyles, en C-3 et C-6 (Cf. Fig.1). Ils attirent fortement les

atomes dhydrogne en les dtournant des lipides (Je et al. 2004 ; Park et al. 2004). Il est

Chapitre 1 Etude bibliographique

20

possible de raliser des films alimentaires comestibles grce au chitosan (De Moura et al.

2009 ; Cardenas et al. 2008).

Le chitosan et la glucosamine sont commercialiss comme complments alimentaires. Les

proprits revendiques reposent sur leur pouvoir antioxydant et leur capacit faire perdre

du poids. Le chitosan agirait comme film intestinal et comme fibre. Il inhiberait labsorption

des lipides et des sucres (Ylitalo et al. 2002), ou activerait directement le dstockage des

lipides (Helgason, 2008). Les oligomres du chitosan semblent galement prvenir les risques

de diabte (Kumar et Tharanathan, 2004).

Les CHOS serraient galement intressants comme prbiotiques. Des rsultats prometteurs

ont t obtenus par Pan et al. (2009) avec des chitooligosaccharides de 90 % de DD et de 3

6 DP.

Les utilisations comme auxiliaires technologiques

Du point de vue technique, le chitosan constitue un agent de clarification, par exemple pour

lindustrie du vin (Chatterjee et al. 2004). Il permet dviter lemploi du collagne, qui suscite

la crainte des consommateurs depuis la crise de Creutzfeld-Jacob. Une rduction jusqu 95 %

de la turbidit a t observe aprs utilisation de la chitine-glucane (Kim, 2010). De plus, le

rle antioxydant des drivs de la chitine est exploit pour stabiliser les polyphnols du vin, et

ainsi prserver sa couleur et ses armes. Ils sont employs pour capter les mtaux lourds par

bio-adsorption, tels que le Cadmium, le Fer et le Plomb (Bornet et Teissedre, 2008). Dautres

applications existent, telles que lutilisation du chitosan pour recouvrir des fruits et lgumes

aprs leur rcolte ou lors du procd de fabrication du caf (Scheruhn, 1999).

Les limites et les risques dallergies

Des cas dallergies ont t rapports. Les procds de fabrication et le degr de purification de

la chitine peuvent tre mis en cause puisque les allergnes incrimins seraient des agents

chimiques tels que les mtabisulfites, des amines biognes ou des rsidus protiques tels que

la trompomyosine (Lopata, 2010). La chitine dclenche galement des ractions immunitaires

qui peuvent aboutir des ractions a