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INTRODUCTION

Le kiwi ou Actinidia chinensis, communmentappel groseille chinoise, a t probablement

lespce fruitire la plus difficle acclimater endehors de la Chine (Xiaoet al., 1991). Sa culturesest fortement dveloppe au cours des derniresannes et sest impose en tant que culturehorticole importante (Ferguson, 1984).

Pendant longtemps, la culture du kiwi n'aconcern qu'un seul cultivar (Blanchet, 1992) : leHayward obtenu par bouturage classique deplantes en Nouvelle-Zlande (Xiao et al., 1991).Cette varit sadapte mal certaines conditionspdoclimatiques, surtout au froid (Blanchet,1985).De plus, elle ne rsiste pas certains agents

pathognes (Bunker, 1986).

Aussi, pour amliorer le kiwi et obtenir desvarits nouvelles mieux adaptes et plusproductives, on fait appel aux techniques decultures in vitro (Evans & Sharp, 1986 ; Huang &Tan, 1988). Dans ce sens, laction de diversesauxines et cytokinines sur la production depousses feuilles a t tudie partir du tissufoliaire d'Actinidia chinensis (Canhoto &Cruz,1987) et d'Actinidia dliciosa (Predieriet al.,1988).

Cependant, la dsinfection des explants (nuds,entre-nuds ou ptioles prlevs en verger) mis enculture constitue lun des obstacles la russite dela micropropagation in vitro du kiwi grandechelle (Sammarcelli, 1988). Toutefois, les jeunesfeuilles semblent poser le moindre problme (Xiao,1990).

Aussi, ce travail se propose doptimiser lesconditions de dcontamination et les combinaisonshormonales induisant la callogense etl'organogense du kiwi. L'objectif est d'valuer lespotentialits morphogntiques de diversexplants en vue d'avoir des plants acclimats en unminimum de temps.

MATRIEL & MTHODES

1. Matriel vgtal

Le matriel vgtal est collect dans le verger, gde cinq ans, de la Station de la Socit deDveloppement Agricole (SODEA) de SebaAyyoun, Mekns. Des boutures uniformes de

plants de kiwi aussi bien mles (varit Tomuri)

que femelles (varit Hayward) portant quatre cinq bourgeons dormants et une vingtaine defeuilles chacune sont prleves depuis la mi-juilletjusquau dbut septembre. Ce matriel est

subdivis en deux lots : celui des mristmesprlevs partir de bourgeons terminaux caillesprotectrices serres et vertes et un second groupeconstitu par des fragments de ptioles, la base dejeunes feuilles portant un fragment de nervureprincipale et des tronons dentre-nuds. Un seultype dexplants a t prlev en hiver (dcembre) :les bourgeons sur nuds. Dans ce cas, les bouturesdont on a limin les feuilles sont dbites enfragments de 2 3 cm portant chacun un bourgeonaxillaire. Pour chaque essai, il y a au moins 12rptitions par traitement.

2. Dsinfection et prparation des explants

Les dmes mristmatiques tant en principesains (Monette, 1986), une strilisation superficielledes bourgeons avec toutes leurs cailles estralise par immersion dans de lhypochlorite decalcium diffrentes concentrations pendant 20minutes, suivie de 3 rinages leau distillestrile. Ensuite, le mristme est excisaseptiquement sous flux laminaire air strile.

Les fragments de feuilles, ptioles et entre-nuds

sont dabord lavs et brosss soigneusement sousleau courante puis dsinfects lhypochlorite decalcium diffrentes concentrations (1 14%).Lutilit de cette solution strilisante, delagitation et de laddition du Tween 20 a ttudie. Ces traitements sont suivis dune srie de3 5 rinages leau distille strile sous la hotte flux laminaire.

En ce qui concerne les nuds, la mme techniqueest adopte, mais amliore par un badigeonnagesoigneux au mercryl-lauryl avant immersiondans lhypochlorite de calcium. Les nuds sont

ensuite dcorcs sous enceinte strile puis lesbourgeons sont dlicatement isols.

3. Milieux de culture

Pour linduction de la callogense etlorganogense, les explants sont cultivs sur desmilieux de culture MS (Murashige & Skoog, 1962)qui diffrent par la concentration enmacrolements (MS, MS/2 et MS/3) et par laconcentration en saccharose (22,5 et 30 g.l-1). Cesmilieux sont additionns de supplments

organiques, en mg.l-1

: adnine (80),

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MgNaH2PO4.H2O (170), Thiamine (0,4) et I-inositol (100). Les rgulateurs de croissance sontessentiellement reprsents par les auxines et/oules cytokinines diffrentes concentrations

(Wessels et al ., 1984 ; Wiyaporn et al ., 1990)(Tableau 1).

Tableau 1. Composition des milieux de culture

Milieux AIB ANA Kintine Zatine BAP Saccharose(mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (g/l)

M1 1,0 0,4 - - 0,5 30M2 2,0 - - - 1,0 30M3 5,0 0,4 - 1,0 1,0 30M4 10,0 - 2,0 - 2,0 22,5M5 6,0 - 2,0 - 2,0 30

Pour la culture des nuds, deux milieux de baseont t tests : MS et Heller additionns de :I-inositol (100 mg.l-1), thiamine (0,4 mg.l-1), glose(0,7%) et saccharose (4%). Deux combinaisonshormonales ont t testes : [acide naphtalneactique (ANA) : 2 mg.l-1+ kintine : 2 mg.l-1] etzatine : 2 mg.l-1.

Lallongement des pousses noformes sur cals sefait sur un mme milieu compos des lments debase MS additionn de BAP (benzylaminopurine) 3 mg.l-1et de saccharose 20 g.l-1.

Pour lenracinement en milieu liquide (milieu debase MS/2 additionn de 5 mg.l-1 dANA et de20 g.l-1 de sucre), les plantules ont t dposes surdes ponts de papier filtre. Sur milieu solide,lenracinement a t obtenu par inductionracinaire par trempage rapide des plantules 30secondes une minute dans une solution dacideindolyl-actique (AIA) 12 mg.l -1

(Standardi,1983). Les plantules sont ensuitetransfres sur MS/2 additionn de 10 g de sucre,8 g de glose et 5 g de charbon activ (Gui, 1979).

Pour tous les essais, les cultures ont tentreposes dans une chambre de culture sous unclairement de 2000 lux, avec une photopriode de16 heures de lumire suivies de 8 heuresdobscurit, 25 1C.

4. Analyse statistique

Le logiciel STATITCF nous a permis de raliserune analyse de la variance pour les 3 facteurs(milieu, explant et sexe) puis une comparaison desmoyennes pour dterminer les combinaisons de

facteurs optimaux.

RSULTATS & DISCUSSION

1. Protocole de dsinfection

Concernant la culture des mristmes, les cas

dinfection relevs ont t attribus auxcontaminants logeant au niveau des cailles et quiont t vhiculs jusquau dme mristmatiquependant la manipulation. Pour remdier ceproblme, les bourgeons terminaux sont plongs,avant la mise nu du mristme, dans une solutiondhypochlorite de calcium 10% pendant 15 minsuivi de 3 rinages leau strile.

Pour les fragments dorganes et dentre-noeuds,trois facteurs ont t tudis : la concentrationdhypochlorite de calcium, laddition de Tween 20et lagitation de la solution strilisante

(Tableau 2).

Tableau 2. Effet de la concentration dhypo-chlorite de calcium, laddition deTween 20 et de lagitation sur le tauxde dsinfection des explants

Agitation Tween 20 CHC (%) ........Pourcentage dexplants ........Sains Contamins Ncross

2 0 100 010 20 75 5

Sans Sans 14 28 42 301 0 94 6

10 23 67 10Sans Avec 14 33 31 36

1 4 96 08 58 40 2

10 97 0 312 80 0 20

Avec Avec 14 61 0 39

CHC : Concentration dhypochlorite de calcium

En absence dagitation et dagent mouillant(Tween 20), laugmentation de la concentrationdhypochlorite de calcium de 2 14% se traduit par

laugmentation du pourcentage des explants sainsde 0 28%. On note, cependant, une augmentationdexplants ncross (30% en prsence de 14%dhypochlorite de calcium). En absence dagitationet en prsence de Tween 20, on note la mmevolution des pourcentages dexplants sains enfonction des concentrations dhypochlorite decalcium (0 33%).

En prsence de Tween 20 et sous agitation,lhypochlorite de calcium 10% donne lesmeilleurs rsultats (97% dexplants sains et 3%dexplants ncross).

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En ce qui concerne les nuds, la dsinfection parimmersion dans de lhypochlorite de calcium 10%pendant 20 min en prsence de Tween 20 et sousagitation est amliore par un badigeonnage

soigneux au mercryl-lauryl. Ainsi, on passe de 59 80% dexplants sains.

Ceci permet de surmonter le problme queposaient surtout les nuds, entre-nuds etptioles : ces explants ayant une pilositimportante sont directement en contact avec descontaminants du milieu extrieur, contrairementaux mristmes, protgs par les cailles.

2. Caractrisation de la callogense

Quelque soit l'explant de dpart utilis,l'organogense est toujours prcde par unephase de callogense (Hirsch & Fortune, 1990).Surlensemble des milieux expriments, les explantsmis en culture croissent trs rapidement(Watanab & Takahashi, 1987) et produisent unequantit importante de cals (Magdeleine, 1982).Nos rsultats laissent apparatre, en dehors descals cicatriciels qui ne sont pas comptabiliss, deuxtypes de cals. Le premier type est friable, decouleur verte trs claire avec des zonesblanchtres. On ne note aucune volution malgrdes repiquages successifs sur milieu frais. Lesecond type de cals est compact et dense, de couleur

verte plus fonce au centre qu la priphrie. partir de la huitime semaine, on note sur lasurface de ce dernier type de cals etparticulirement sur la bordure, une multitude depoints rouges sur lesquels apparaissent desbourgeons aprs 10 12 semaines.

Un troisime type de cals plus petits ethyperhydriques a t dcrit par Xiaoet al. (1991),mais non observ ici.

Le taux de callogense (nombre de cals sur nombredexplants ensemencs) varie selon le milieu deculture, le type dexplant et le sexe du plant-donneur (Tableau 3).

Le milieu M5est le plus performant avec un taux derussite de 100% dans tous les cas sauf pour lesmristmes des plants femelles (taux de 84%).Concernant leffet de lexplant, le ptiole donne lesmeilleurs rsultats (98% en moyenne pour lesplantes mles et 97% pour les plantes femelles),suivi par lentre-nuds (mle : 95% et femelle :94%), le fragment de feuille (mle : 90% et femelle:86%), puis le mristme (mle : 77% et femelle :

65%).

Tableau 3. Pourcentage dexplants callognes enfonction du milieu de culture, du typeet du sexe de lexplant

Milieux de Mristme Ptiole Feuille Entre-nuds

culture M F M F M F M F Moyenne(%)

M1 67 65 93 92 80 84 90 80 82M2 80 80 100 98 84 78 100 94 90M3 85 80 100 100 100 95 100 100 95M4 85 80 100 100 92 88 100 100 93M5 100 84 100 100 100 100 100 100 98

Moyenne 77 65 98 97 90 86 95 9471 97,5 88 94,5

M: Mle ; F: Femelle

Ainsi, pour chaque type dexplant, milieux et sexesconfondus, le taux de russite est de 97,5% pour lesptioles, 94,5% pour les entre-nuds, 88% pour lesfeuilles et 71% pour les mristmes.

Quant leffet du sexe (ou la varit) du plantdonneur, les explants prlevs partir des piedsTomuri (mles) donnent des taux de russitelgrement suprieurs ceux qui sont enregistrspour les explants issus de pieds Hayward(femelles).

Dans notre cas, le passage par le cal estsystmatiquement observ pour tous les explantsalors que Brossard-Chriqui & Tripathi (1984)rapportent la noformation de pousses feuillesdirectement sur la rgion des nervures, sansformation pralable de cal.

3. Noformation de bourgeons

Aprs dix semaines de culture, sur les cals verts,compacts et partir des points rouges, on distinguede minuscules bourgeons mergeants (Tableau 4).Quatre cinq jours aprs lapparition desbourgeons et au fur et mesure que ceux-ci sedveloppent, on note que la coloration rougedisparat progressivement. La noformation debourgeons a lieu, pour les explants de ptioles,aprs 10 semaines seulement au lieu de 12 pour lesautres explants). Le nombre moyen de bourgeonsforms pour les plantes femelles est aussi le pluslev : 4,75 bourgeons/cal, ce qui est en accord avecles rsultats de Sammarcelli & Legave (1990).Viennent ensuite les feuilles avec 4,48 bourgeons/cal puis les mristmes (3,42) et les entre-nuds(3,32). Pour lensemble des explants, on a not desvaleurs plus importantes pour les explants des

pieds femelles par rapport aux pieds mles.

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Tableau 4. Temps dapparition , nombre depousses par cal pour chaque typedexplant (mle et femelle) dans lemilieu M5

Explants Mristme Ptiole Feuille Entre-nudsM F M F M F M F

Ta* des pousses(semaines) 12 12 10 10 12 12 11 11N. moy. depousses/cal 2,7c 3,47b 4,38a 4,75a 3,56b 4,48a 2,79c 3,32bN. max. depousses/cal 4,0 2,0 10 12 10 14 5 11

* M : Mle ; F : Femelle ; Ta : temps dapparition ; N. moy. : nombremoyen ; N. max. : nombre maximalLes lettres diffrentes sur la mme ligne indiquent que la diffrence

est statistiquement significative au seuil de 5% (Newman & Keuls).

4. Allongement des pousses formes

Pour les quatre explants tudis (mristmes,ptioles, feuilles et entre-nuds) et au premierstade de la caulogense, les pousses feuilles et lesfeuilles formes restaient trs petites etprsentaient des caractres juvniles : feuillestroites, longues et bords dentels. Cescaractres ont t galement observs par Guietal. (1982) sur les plantes rgnres partir deculture dendosperme et par Fraseret al. (1986) sur

les plantes rgnres partir de tissu duconnectif danthres. Le passage sur milieudlongation (MS + BAP 3 mg.l -1+ saccharose 20g.l -1) a t donc ncessaire. Le critredallongement retenu est la longueur de la pousse.Lallongement des pousses, quelque soit le typedexplant et la varit, suit une volution linaire(Figures 1 & 2). Aprs 20 25 jours dincubationsur milieu dlongation, les pousses sont prtes tre transfres sur le milieu denracinement.

Pour les nuds, les bauches de poussesapparaissent aprs 10 jours seulementdincubation aussi bien sur le milieu de base MSque sur celui d'Heller additionns de BAP 2 mg.l-1+ kintine 2 mg.l-1 lobscurit. Ceci serapproche des rsultats de Xiaoet al.(1991) qui ontmontr lefficacit de la combinaison BAP-ANAsuggre par les travaux de Predieriet al. (1988).Maintenues pendant une semaine sur ce mmemilieu, elles atteignent 2 3 cm de hauteur etprsentent des caractres de plantes adultes :feuilles cordiformes lgrement arrondies et bords lisses. Les deux milieux de base, aussi bienMS que Heller, aboutissent aux mmes rsultats.

Toutefois, ils diffrent de ceux qui sont noncs par

Velayandomet al. (1985) qui ont not que laspectdes pousses noformes dpendait du milieu debase utilis. Les pousses caractres juvniles ontt obtenues sur milieu de base MS et celles caractres adultes sur milieu de base Heller.Chaque nud a produit 1, 2 ou 3 pousses. Pour cesdernires, issues de bourgeons axillaires desnuds, le passage sur milieu dlongation na past ncessaire. Ce type dexplant est doncintressant puisquil est plus rapide micropropager.

5. Enracinement et sevrage

Aprs la phase dallongement, les bourgeons ayantatteint environ 3 cm sont exciss partir du cal ettransfrs pour tre enracins soit dans un milieuliquide, soit sur milieu solide .

Dans le milieu liquide (Tableau 5), malgr un

nombre de pousses enracines important (18

Figure 1.volution de la longueur des pousses enfonction du temps (explants des plantesfemelles)

Figure 2. volution de la hauteur des pousses(explants des plantes femelles)

3020100

0

1

2

3

Mristme

Feuille

Entre-nuds

Ptiole

Jours

Longueur (cm)

3025201510500

1

2

3

Mristme

Feuille

Entre-nuds

Ptiole

Jours

Longueur (cm)

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pousses enracines sur 20 pousses utilises, soitun taux de 90%), seules six (33%) supportent letransfert sur tourbe. En effet, les systmesracinaires produits sont trs fragiles : les racines

sont fines, blanchtres et facilement cassantes. Deplus, des cals prolifrent au niveau de la base de laplantule et cela avant lmission de racines.

Tableau 5. Pourcentage de pousses enracines invitro, dans un milieu liquide et surmilieu solide aprs trempage dans unesolution dAIA 12 mg.l-1

Type de Nombre de pousses % Nombre de pousses %milieu enracines dveloppes sur tourbe

Liquide 18 90 6 33,3Solide 20 100 19 95

La seconde technique utilise en milieu solide estde loin la plus performante puisquelle permet letransfert sur tourbe de 19 pousses sur 20 (taux derussite de 95%). De plus, nos rsultats montrentquen ce qui concerne la solution de trempage, ilnest pas ncessaire dutiliser lAIA 20 mg.l-1oulAIB 50 mg.l-1 pendant deux heures, commel'avaient dcrit Xiaoet al. (1991). Le trempage despousses dans une solution dAIA 12 mg.l-1

pendant une minute est suffisant. Le charbonactiv semble avoir une action bnfique sur le

dveloppement du systme racinaire puisquaprs10 jours, les racines sont bien dveloppes etaffleurent la surface du milieu ou contre la paroidu conteneur (Gui, 1979). Aucun changementmorphologique des plantes obtenues na tobserv.

CONCLUSION

Lhypochlorite 10%, en prsence de Tween 20 etsous agitation, permet une dcontamination de97% des explants de kiwi. La callogense et laformation de pousses ont t obtenues pour

lensemble des explants expriments. Sur lemilieu M5(MS + AIB 6,0 mg.l-1+ kintine 2,0

mg.l-1+ BAP 2,0 mg.l-1), le rendement obtenu, etparticulirement pour les explants de ptioles, estde 4,75 bourgeons par cal aprs 10 semaines deculture. Cette mthode pourrait tre applique lamicropropagation de cette plante.

D'autre part, les nuds constituent un matrieltrs intressant. En effet, 15 20 jours seulementsont ncessaires pour multiplier ces explants. Deplus, ce matriel peut tre utilis une priode delanne (dcembre) o les plants de kiwi sont

dormants.

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