1

1. Les propriétés des biomolécules

Acides aminés, peptides et protéines

Acides nucléiques et ADN

Comparaison de la chimie analytique classique et la chimie bioanalytique

2

1.1 Acides aminés, peptides et protéines

Les peptides et protéines sont constitués d’acides aminés, reliés entre eux par un lien amide.

Les acide aminés:

Les protéines sont constituées d’une vingtaine d’acides α-aminésnaturels. D’autres acides aminés sont aussi retrouvés dans des peptides qui sont biologiquement actifs et dans certaines protéines.

αH2NOH

R2R1

OAcide α-aminé

OH

Oβ

H2Nα

R1 R2

Acide β-aminé

3

Une chaîne de quelques centaines d’acides aminés, dont la masse moléculaire est typiquement < 10 kDa constitue un polypeptide.

Les protéines sont constituées d’un ou plusieurs polypeptides et possèdent des masses moléculaires élevées; la majorité des protéines ayant des masses moléculaires entre 10 et 100 kDa(où 1 kiloDalton (kDa) = 1000 g/mol).

La séquence des acides aminés et leur arrangement spatial déterminent la structure ainsi que la fonction des protéines et peptides dans des processus biologiques.

4

1.1.1 Structure et propriétés des acides α-aminesStructure générale des acides α-aminés naturels:

Les différents groupements latéraux des acides α-aminés naturels varient selon leur grandeur, forme, charge, capacité à créer desponts hydrogène et réactivité chimique.

C

NH2

COOH

R

H

forme neutre

H C

NH3+

COO-

R

forme zwitterioniqueà pH physiologique

groupement latéral

5

Classification des acides α-aminés naturels

+H3N CH C

CH2

O-

O

CH2

CH2

CH2

NH3+

Lysine (Lys; K)

+H3N CH C

CH2

O-

O

CH2

CH2

NH

C

NH2

NH2+

Arginine (Arg; R)

+H3N CH C

CH2

O-

O

+HN

NH

Histidine (His; H)

- Groupement latéral basique: charge positive à pH neutre

6

Acide aspartique (Asp; D)

+H3N CH C

CH2

O-O

CO-

O

+H3N CH C

CH2

O-O

CH2

CO-

O

Acide glutamique (Glu; E)

- Groupement latéral acide: charge négative à pH neutre

- Groupement latéral amide

Asparagine (Asn; N)

+H3N CH C

CH2

O-O

CNH2

O

+H3N CH C

CH2

O-O

CH2

CNH2

O

Glutamine (Gln; Q)

7

- Groupement latéral aliphatique

Glycine (Gly; G)

+H3N CH C

HO-

O+H3N CH C

CH3

O-O

Alanine (Ala; A)

+H3N CH C

CHO-

O

CH3

CH3Valine (Val; V)

+H3N CH C

CH2

O-O

CH CH3

CH3

Leucine (Leu; L)

+H3N CH C

CHO-

O

CH3

CH2

CH3

Isoleucine (Ile; I)

(isomère de Leu)

8

- Groupement latéral aromatique

Phénylalanine (Phe; F)

+H3N CH C

CH2

O-O

+H3N CH C

CH2

O-O

OHTyrosine (Tyr; Y)

+H3N CH C

CH2

O-O

HN

Tryptophane (Trp; W)

9

- Groupement latéral sulfuré

Cystéine (Cys; C)

+H3N CH C

CH2

O-O

SH

+H3N CH C

CH2

O-O

CH2

SCH3

Méthionine (Met; M)

- Groupement latéral hydroxyle

Sérine (Ser; S)

+H3N CH C

CH2

O-O

OH

+H3N CH C

CHO-

O

OHCH3

Thréonine (Thr; T)

10

- Acide aminé secondaire

Proline (Pro; P)

+H2N

C O-O

- Acides aminés modifiés

+H2N

C O-O

OH

+H3N CH C

CH2

O-O

CH-OOC COO-

+H3N CH C

CH2

O-O

O

PO

O--O

4-Hydroxyprolineγ-Carboxyglutamate

O-Phosphosérine

11

Stéréochimie des acides α-aminés

Les acides α-aminés naturels:sont tous chirals (et donc optiquement actifs), à l’exception de la glycine pour laquelle le substituant latéral est un atome d’hydrogènesont tous de configuration “L” selon la convention de Fischer ou “S” selon la notation de Cahn-Ingold-Prelog, à l’exception de la cystéine qui est de configuration “R”.

+H3N COO-CH3C H

NH3+-OOC

CCH3H

L-Alanineou

(S)-Alanine

D-Alanineou

(R)-Alanine

+H3N COO-CHS-H2C H

(R)-Cystéine

C= centre chiral

12

Propriétés acido-basiques des acides α-aminés

Les acides aminés sont des acides polyprotiques.Les acides aminés sont amphotères; ils possèdent à la fois un groupement acide (acide carboxylique, pKa ≈ 1.8 - 2.5) et un groupement basique (amine, pKa ≈ 8.7 - 10.7).

Les groupements latéraux ionisables ont aussi des valeurs de pKa (voir Table 1.1).

H C

NH3+

COOHOH-

H C

NH3+

COO- OH-

R

H3O+

R

H3O+H C

R

NH2

COO-

pH 1 pH 7 pH 11

zwitterion

K1 K2

13

H C

NH3+

COOHK1

R

H C

R

NH3+

COO-

H C

NH3+

R

COOH

H

H+

C

R

NH3+

COO- + H+

K1 =

-log K1=

H C

R

NH3+

COO-

H CNH3

+

R

COOH

- log [H+]-log

pK1= pH

H C

R

NH3+

COO-

H CNH3

+

R

COOH

+ log

14

H C

NH3+

COO-K2

R

H C

R

NH2

COO-

H C

NH3+

R

COO-

H

H+

C

R

NH2

COO- + H+

K2 =

pK2 = -log K2

15

Table 1.1 Valeurs de pKa et pI des acides α-aminés naturels(D.C. Harris, Exploring Chemical Analysis, 2è éd. 2001;

A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

5.97-9.7782.350Glycine (Gly; G)5.65-9.012.17Glutamine (Gln; Q)5.41-8.722.14Asparagine (Asn; N)

3.224.42(γ-COOH)

9.952.23Acide glutamique (Glu; E)

2.873.900 (β-COOH)

10.0021.990Acide aspartique (Asp; D)

10.7612.48(guanidino)

8.9911.823Arginine (Arg; R)

7.586.02 (imidazole)

9.081.7Histidine (His; H)

9.7410.69 (ε-NH3

+)9.082.04Lysine (Lys; K)

pIpKRgroupement latéral

pK2

α-NH3+

pK1

α-COOHAcide α-aminé(abréviations)

166.10-10.6401.952Proline (Pro; P)6.53-9.1002.088Thréonine (Thr; T)5.68-9.2092.187Sérine (Ser; S)5.75-9.052.20Méthionine (Met; M)

5.028.36 (sulfhydryl)

10.771.71Cystéine (Cys; C)5.88-9.332.35Tryptophane (Trp; W)

5.6510.47 (phénol)

9.192.17Tyrosine (Tyr; Y)5.98-9.312.20Phénylalanine (Phe; F)6.02-9.7542.319Isoleucine (Ile; I)5.98-9.7472.329Leucine (Leu; L)5.97-9.7182.286Valine (Val; V)6.02-9.8672.348Alanine (Ala; A)

pIpKR(groupement latéral)

pK2

α-NH3+

pK1

α-COOHAcide α-aminé(abréviations)

17

Exemple 1.1: Les différentes espèces de l’alanine en fonction du pH

H2N CH C

CH3

OH

O α-COOH, pK1 = 2.35

α-NH3+, pK2= 9.87

+H3N CH C

CH3

OH

O

pH 1.3:

+H3N CH C

CH3

OH

O

pH 2.35: 50%

+H3N CH C

CH3

O-O

50%

+H3N CH C

CH3

O-O

pH 4.0:

+H3N CH C

CH3

O-O

pH 7.0:

18

+H3N CH C

CH3

O-O

pH 9.87: 50%

H2N CH C

CH3

O-O

50%

pH 10.9: H2N CH C

CH3

O-O

19

Exemple 1.2: Les différentes espèces de l’acide aspartique en fonction du pH

H2N CH C

CH2

OH

O

C

OH

O

α-COOH, pK1 = 1.99

α-NH3+, pK2= 10.00

β-COOH, pKR = 3.90

pH 1.0: +H3N CH C

CH2

OH

O

C

OH

OpH 2.0: +H3N CH C

CH2

OH

O

C

OH

O

+H3N CH C

CH2

O-O

C

OH

O

50%

50%

pH 3.0: +H3N CH C

CH2

O-O

C

OH

O

20

pH 3.9:

+H3N CH C

CH2

O-O

C

O-O

+H3N CH C

CH2

O-O

C

OH

O

50%

50%

pH 7.0: +H3N CH C

CH2

O-O

C

O-O

pH 10.0: +H3N CH C

CH2

O-O

C

O-O

H2N CH C

CH2

O-O

C

O-O

50%

50%

pH 11.0: H2N CH C

CH2

O-O

C

O-O

21

Pour chaque acide aminé, il existe une valeur spécifique du pH où la charge globale de la molécule est nulle. Cette valeur de pH représente le point isoélectrique où la concentration du zwitterion de l’acide aminé est maximale. Au point isoélectrique, il n’y a pas de migration de l’acide aminé dans un champ électrique appliqué.

Le point isoélectrique (pI) peut être estimé à partir de l’équation de Henderson-Hasselbalch:

où pKi et pKj sont les constantes de dissociation des étapes impliquées.

)p(p21p ji KKI +=

22

Ce calcul est simple pour des acides aminés ayant seulement un groupement amine et un acide carboxylique; pKi et pKj étant les valeurs de pKa pour α-COOH et α-NH3

+, respectivement.

Exemple:

Pour des acides aminés ayant des groupements latéraux ionisables, le calcul du pI est plus compliqué (voir les Table 1.1 et 1.2 pour les valeurs de pI des acides α-aminés naturels et de quelques protéines).

Les différences de pI sont utilisées pour séparer les acides aminés, les polypeptides et les protéines dans un champ électrique (i.e. techniques d’électrophorèse).

( ) 00.6718.9286.221

valine =+=pI

23

% des espèces d’alanine existantes vs. pH

+H3N CH C

CH3

OH

O

H2N CH C

CH3

OH

O+H3N CH C

CH3

O-O

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

50

100

2.35 9.87

pI6.02

% d

’esp

èces

pH(D’après S.N. Eğe, Organic Chemistry, 3è éd., 1994)

24

Courbe de titrage de l’alanine

(D’après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)

25

Exemple 1.3: Évolution des différentes espèces de la lysine en fonction du pH

+H3N CH C

(CH2)4

OH

O

NH3+

H2N CH C

(CH2)4

O-

O

NH3+

+H3N CH C

(CH2)4

OH

O

NH3+

α-COOH, pK1 = 2.04

α-NH3+, pK2= 9.08

ε-NH3+, pKR = 10.69

pI= 9.74

+H3N CH C

(CH2)4

O-

O

NH3+

H2N CH C

(CH2)4

O-

O

NH2

OH-

H3O+

pH 1 pH 7

OH-

H3O+

pH 9.74

OH-

H3O+

pH 12

26

NH

CH C+H3N CH C

(CH2)4

O

NH3+

CH3

O

N CH C

H

OH

OH

NH

CH C+H3N CH C

(CH2)4

O

NH3+

CH3

O

N CH C

H

O-OH

NH

CH CH2N CH C

(CH2)4

O

NH2

CH3

O

N CH C

H

O-OH

Les mêmes notions de propriétés acido-basiques s’appliquent aux peptides:

Lys-Ala-GlypH=1

pH=7

pH=11

27

Table 1.2 Valeurs de pI de quelques protéines(A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

pH < pI:

pH> pI:

protéine chargée positivement

protéine chargée négativement

28

1.1.2 Structure des protéines

1. Structure primaire:

La séquence ou l’ordre d’enchaînement des acides aminés dans uneprotéine (ou polypeptide) définit la structure primaire de la protéine(ou polypeptide). La structure primaire caractérise une protéine de manière univoque. La simple substitution d’un acide aminé pour un autre peut drastiquement affecter l’activité et la fonction d’une protéine, pouvant ainsi causer des maladies et désordres physiologiques.

Les acides aminés sont reliés entre eux par un lien amide:

dipeptide

+OHH2N

O

R1HOH

HN

O

R2H

H

- H2O

liaison peptidique

HN

H2N

O

R1H

OHH R2

O

29

N

O

H

N

O

H

rotation

rigide rotation

α αHN

H2N

O

R1H

OHH R2

O

L’unité peptidique NH-CO est rigide. Les liens de chaque côté du C-αpeuvent tourner (en dedans de contraintes stériques) et jouent un rôle important dans le repliement d’une protéine.

Dû à son caractère de double lien partiel, il n’y a pas de rotationdu lien C-N:

30

Un tétrapeptide de séquence Ser-Ala-Cys-Gly:

Il est peu probable qu’un acide aminé donné excède 10% de la composition totale d’une protéine.

Avec 20 acides α-aminés naturels, il existe un nombre immense de combinaisons et permutations possibles:- Dipeptide: 202= 400 arrangements possibles- Tripeptide: 203= 8000 arrangements possibles - Petite protéine constituée de 100 acides aminés: 20100= 1.27 x 10130

différentes séquences possibles!

acide aminéN-terminal

acide aminéC-terminal

HN

+H3N

O

CH2H

NH

H CH3

OHN

O-

OH

H CH2

O H H

O

SH

squelette

groupement latéral

31

2. Structure secondaire:

La structure secondaire d’une protéine se réfère aux régions d’une protéine dans lesquelles les chaînes peptidiques sont organiséesdans des structures régulières, tels les hélices α et les feuillets plissés β.

Ces structures régulières sont déterminées par la conformation du squelette peptidique; l’influence des groupements latéraux des acides aminés n’est pas tenue en compte.

Les hélices α et les feuillets plissés β résultent de la formation de ponts hydrogène entreles groupements C=O et N-H du squelette peptidique.

HN

O

RH

H R

HN

H R

O H R

δ+

δ−

32

Hélice αCette forme hélicoïdale résulte de la formation de ponts hydrogène entre le groupement C=O du nième

résidu d’acide aminé et le groupement N-H du (n+4)ième résidu.

Chaque tour complet de la spirale est constitué d’environ 3.6 résidus d’acide aminé pour assurer l’alignement des groupements C=O (pointant vers le bas) et N-H (pontant vers le haut).

Les groupements latéraux «R» sont orientés vers l’extérieur, perpendiculairement à l’axe de la spirale.

axe

33

Feuillets plissés β

Dans un feuillet plissé β, deux chaînes peptidiques sont pliées et alignées l’une à côté de l’autre. Le repliement β des chaînes peptidiques est favorisé dans le cas d’acides aminés portant des petits groupement latéraux «R» non-chargés.

Les chaînes peptidiques sont maintenues par des ponts hydrogène.

Les groupements latéraux «R» sont orientés vers l’extérieur, pointant vers le haut et le bas de chaque feuillet.

Les chaînes adjacentes peuvent être alignées, soient dans la même direction (plis parallèle β) ou dans des directions opposées (plis anti-parallèle β) .

34

3. Structure tertiaire:

La structure tertiaire d’une protéine décrit la configuration tridimensionnelle (3-D) d’une chaîne polypeptidique.

Elle inclut la relation entre les différents domaines (hélice α et feuillets plissés β) formés par la structure secondaire de la protéine et les interactions des groupements latéraux «R».

La structure 3-D est thermo-dynamiquement stable dans un domaine restreint de température, pH et force ionique. Au-delà de ce domaine une protéine peut se déplier et perdre sont activité biologique (dénaturation).

Structure 3-D de la ribonucléase H (Escherichia coli) (D’après A. Manz,

N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

35

4. Structure quaternaire:

Une protéine peut être constituée de 2 ou plusieurs chaînes polypeptidiques différentes liées ensemble.

La structure quaternaire décrit comment les différentes chaîneset autres constituants sont liés et interagissent ensemble via des ponts hydrogène, attractionélectrostatique et liens disulfures.

+H3N CH

CH2

COO-

SH

+H3N CH

CH2

COO-

HS

+H3N CH

CH2

COO-

S

+H3N CH

CH2

COO-

S

Cystéine Cystéine Cystine

+

Insuline

(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,Bioanalytical Chemistry, 2004)