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UNIVERSITÉ DU QUÉBEC
MÉMOIRE PRÉSENTÉ À
L'UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À TROIS-RIVIÈRES
COMME EXIGENCE PARTIELLE
DE LA MAÎTRISE EN SCIENCES DE L'ENVIRONNEMENT
PAR
MÉLANIE BOUTOUR
PROTECTION CONTRE LE STRESS PHOTO OXYDANT CHEZ
DES FEUILLES D'ÉRABLE ARGENTÉ (ACER SACCHARINUML.)
GRÂCE À L'OXYDATION DE COMPOSÉS PHÉNOLIQUES
CARACTÉRISÉE PAR VOLTAMMÉTRIE CYCLIQUE
AOÛT 2011
Université du Québec à Trois-Rivières
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REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier le professeur Guy Samson pour son précieux soutien à la
réalisation des expérimentations et à la rédaction de l'article et du mémoire. Je suis aussi
reconnaissante envers le professeur Benoit Daoust pour son aide avec la voltammétrie
ainsi qu'envers le professeur Robert Carpentier et son équipe pour leur appui concernant
les processus de photosynthèse. Finalement, je tiens à souligner la contribution du
CRNSG pour le financement de certains équipements.
TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS ................................................................................................. ii
LISTE DES FIGURES .............................................................................................. v ,
LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................. vüi
RÉsUMÉ..................................................................................................................... ix
CHAPITRE 1 INTRODUCTION ...................................................................................................... 1
1.1 Contexte général et problématique ................ ..................................................... 1
1.2 Objectifs et méthodologie................................................................................... 3
CHAPITRE II , REVUE DE LITTERATURE ......................... .......................................................... 5
2.1 Aperçu des réactions photochimiques de la photosynthèse................................ 5
2.2 La photo inhibition .............................................................................................. . 6
2.3 Degré de photo inhibition estimé par fluorescence chlorophyllienne ................. 7
2.4 Les radicaux libres .............................................................................................. 9
2.5 Mécanismes de photoprotection ........................................................................ . Il
2.5.1 Cycle des xanthophylles .................................................................. 12
2.5.2 Cycle Halliwell-Asada ........................................... .. ....................... 12
2.5.3 Pouvoir antioxydant des composés phénoliques ................................. 13
2.6 Composés phénoliques ....................................................................................... 14
2.6.1 Propriétés des composés phénoliques................................................ 14
2.6.2 Détoxification des radicaux libres par les composés phénoliques ......... 16
2.7 Voltammétrie cyclique................................................................... ... .................. 21
2.7.1 Utilisation de la voltammétrie cyclique pour caractériser l'oxydation in planta des composés phénoliques lors de stress oxydants................ 21
2.7.2 Paramètres de mesure de la voltammétrie .. ........ ............ ........................ 24
CHAPITRE III PROTECTION AGAINST ACUTE PHOTOOXIDATIVE STRESS BY THE OXIDATION OF A POOL OF POLYPHENOLS IN SILVER MAPLE LEA VES (A CER SA CCHARINUM L.) ............... ..................................................... 28
3.1 Résumé en français........ ...................... .......... ............................ .......... ............... 28
3.2 Article.................................................................. ..... .......................................... 29
CHAPITRE IV EFFET DE LA CONCENTRATION ET DE L'AJOUT D'EXTRAIT DE FEillLLES D'ÉRABLE SUR L'OXYDATION DE L'ACIDE ASCORBIQUE ET DE L'ÉPIGALLOCATECIDNE GALLATE MESURÉE PAR ,
IV
VOL T AMMETRIE ................................................................................................... 55
4.1 Introduction............... ....................... ... .... ...... .... .............................. .... ....... ....... .. 55
4.2 Matériel et méthode ............................................................................................ 58
4.2.1 Solutions ........ ................ ........................ ........ ............................... 58
4.2.2 Voltammétrie .................... .... .... ............... ......... ...... ....................... 59
4.3 Résultats................. .... ...... ...... .. ... ... .... ... .... ........... ................. .................. ............ 60
4.3.1 Voltammogrammes de l'acide ascorbique .................. ..... ................ .. 60
4.3.1.1 Voltammogrammes de l'acide ascorbique à différentes concentrations en absence d'extraits de feuilles d'érable argenté....................................................................................... 60
4.3.1.2 Voltammogrammes de l'acide ascorbique à différentes concentrations en présence d'extraits de feuilles d'érable argenté... .. .... ....... .......... ............................... ........... ................... 61
4.3.2 Voltammogrammes du gallate d'épigallocatéchine.................. 63
4.3.2.1 Voltammogrammes du gallate d'épigallocatéchine à différentes concentrations en absence d'extrait de feuilles d'érable argenté ...... ................... ...... .......................................... 63
. 4.3.2.2 Voltammogrammes du gallate d'épigallocatéchine à différentes concentrations en présence d'extrait de feuilles d'érable argenté ................... ..... ....... ... ............. ...................... ... 65
4.4 Discussion.......... ................... ..................................... ... ........ ...... ........................ 67
4.5 Conclusion ................. ...... ... ................. ........ .. .... .... ...... ..... .... ... ... .................... .... 69
CHAPITRE V , , DISCUSSION GENERALE...................................................................................... 71
PERSPECTIVES D' A VENm................................................................................... 74
BIBLIOGRAPIDE..................................................................................................... 75
LISTE DES FIGURES
Figure Page
2.1 Processus de la photosynthèse (Meyer et coll. 2004) ................. ..... ................... 6
2.2 Courbe de fluorescence chlorophyllienne typique (Maxwell & Johnson, 2000). MB = faible lumière modulée; SP = flash de lumière saturante; AL = lumière actinique............................................... ....................... .......... ....... 9
2.3 Cycle de détoxification du peroxyde par l'ascorbate peroxydase (Davey et coll. 2000)......................................................................... ..................... ........ ..... 13
2.4 Pouvoir antioxydant de 112 plantes médicinales chinoises en fonction de leur concentration en composés phénoliques solubles (Cai et coll. 2004). (DW = masse sèche) .................................. ................... .............. ........................ 15
2.5 Structure chimique typique (a) des flavonoïdes (Yamasaki et coll. 1997), (b) des Flavones (Dixon et Paiva 1995) et (c) des catéchines (Kilmartin et Hsu 2003)....................................................................... ............. ................ ........ 16
2.6 Mécanisme hypothétique de la détoxification du peroxyde d'hydrogène par les composés phénoliques (F), via l'enzyme guaïacol peroxydase (vPX) (Yamasaki et coll. 1997)..... ................................................................................ 17
2.7 Schéma de la diffusion du H202 jusque dans l'épiderme où il pourra être détoxifié par les flavonoïdes (Yamasaki et coll. 1997)........ ... ....... ..... ............... 18
2.8 Coupe transversale d'une feuille de Phillyrea latifolia L. acclimatée à l'ombre (à gauche) ou au soleil (à droite). Le jaune indique la présence de flavonoïdes (Tattini et coll. 2000) .................................................................. .... 19
2.9 Graphiques du quenching de la fluorescence (bleu) et de la fluorescence des flavonoïdes Gaune) en fonction de la position (0 : face adaxiale) dans la coupe transversale d'une feuille de Phillyrea latifolia L. acclimatée à l' ombre (en haut) ou au soleil (en bas) suite à un stress photo oxydant (lumière bleue de 2800 )lmol m-2 s-l) (Agati 2007) ...... .... .............................. 20
2.10 Voltammogrammes de la catéchine à différentes concentrations mesurés à 100 mV s-l avec une électrode de carbone de 3 mm à pH de 3,6. Le signal
VI
de base a été soustrait (Kilmartin et coll. 2001a). .................. ..... .................... ... . 23
2.11 Voltammogramme de la lutéoline mesurée à 100 mV s-l avec une électrode de carbone de 3 mm dans un tampon phosphate à pH 7 (Filipiak 2001). ........... 23
2.12 Graphique du courant du pic d'oxydation de la catéchine et de l'acide caféique en fonction de leur concentration. Les voltammogrammes ont été mesurés à 100 mV S-1 avec une électrode de carbone de 3 mm à pH de 3,6 (Kilmartin et coll. 2001a) .................. .......... .... ........ ............ ..... ... ...... ... ..... ......... 25
2.13 Relation linéaire (55 mY/pH) entre le potentiel d'oxydation et le pH de la lutéilone (Filipiak 2001). .... ............... .. ... ..... .......................... ..... ... ... .... ..... ....... .. 26
2.14 Voltammogrammes de lutéoline dans un tampon McTIvain à un pH de 3.0 (courbe 1), un pH de 5.0 (courbe 2) ou un pH de 7.0 (courbe 3) (Filipiak 2001) .............. ....... ....... ................. ....................................... ... ................... ....... .. 26
2.15 Voltammogrammes de la lutéoline (courbe 2), de la quercétine (courbe 3) et d'un mélange de lutéoline et de quercétine (1 :1) (courbe 1) dans un tampon PBS à un pH de 5,1 (Filipiak 2001)................. ........ ............... ....... ........ ........ .. ... 27
4.1 Voltammogrammes de différentes concentrations d'AsA, soit 0,1 mM (courbe continue noire), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges) et 1,25 mM (courbe de traits et pointillés bleus). Le courant a été mesuré à 50 mV S-I par une électrode de carbone vitrifiée de 3 mm de diamètre dans un tampon phosphate 100 mM à un pH final de 5,8 .... 60
4.2 Graphique de la position du pic d'oxydation (potentiel d'oxydation) en fonction de la concentration de l'AsA....................... ... ............ .... ................. ..... 61
4.3 Graphiques (a) du courant du pic d'oxydation et (b) du nombre d'équivalents réducteurs (QO-1200) en fonction de la concentration de l'AsA. a: y = 8,Ox + 1,7; b : y = 86x + 50...................................... ...... ... ................... ... 61
4.4 Voltammogrammes d' extrait de feuilles d'érable argenté en présence de différentes concentrations d'AsA, soit 0,0 mM (courbe vert pâle), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges) et 1,25 mM (courbe de traits longs bleus) ............ ....... .......... ..................... ....... ........... ... .... ... 62
4.5 Graphique de la position du pic d'oxydation (potentiel d'oxydation) en fonction de la concentration de l'ASA, en présence d'extrait de feuilles
vu
d'érable argenté ............................ ...................................................................... 63
4.6 Graphiques (a) du courant du pic d'oxydation et (b) du nombre d'équivalents réducteurs (Qo-12oo) en fonction de la concentration de l'AsA, en présence d'extrait de feuilles d'érable argenté. a: y = 8,6x + 6,1; b : y = 96x + 128 ................................................................................................ 63
4.7 Voltammogrammes de différentes concentrations d'EGCG, soit 0,1 mM (courbe continue noire), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges) et 1,25 mM (courbe de traits et pointillés bleus) ........ 64
4.8 Graphiques de la position du deuxième pic d'oxydation (a) et du troisième pic d'oxydation (b) (potentiel d'oxydation) en fonction de la concentration de l'EGCG .......................................................................................................... 65
4.9 Graphiques (a) du courant du deuxième (cercles pleins) et troisième pic d'oxydation (cercles vides) et (b) du nombre d'équivalents réducteurs (Qo-12oo) en fonction de la concentration de l'EGCG. a: 2ème pic: y = 8,4x + 3,3; 3ème pic: y = 3,Ox + 5,2; b : y = 122x + 36 ................................................. 65
4.10 Voltammogrammes d'extrait de feuilles d'érable argenté en présence de différentes concentrations d'EGCG, soit 0,0 mM (courbe vert pâle), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges), 1,25 mM (courbe de traits longs bleus) et 2,25 mM (courbe d'un trait et deux pointillés noirs) ................................................................................................... 66
4.11 Graphiques du nombre d'équivalents réducteurs (QO-1200) en fonction de la concentration de l'EGCG, en présence d'extrait de feuilles d'érable argenté. y=26x+120 ...................................................................................................... 66
AsA
ATP
EGCG
Fm
Fo
Fv
Ft
Fv/Fm
H20 2
MV
LISTE DES ABRÉVIATIONS
Acide ascorbique
Adénosine triphosphate
Gallate d' épigallocatéchine (de l'anglais epigallocatechin gallate)
Fluorescence chlorophyllienne maximale pour une feuille adaptée à l'obscurité
Fluorescence chlorophyllienne minimale en absence de lumière actinique
Fluorescence variable (Fv = Fm-Fo)
État stationnaire de la fluorescence
Rendement photochimique maximum du PSII
Peroxyde d'hydrogène
Méthylviologène
NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
P680 Chlorophylle--a spéciale du centre réactionnel du PSII
PBS De l'anglais phosphate-buffered saline
Phéo Phéophytine
PSI Photosystème l
PSII Photo système II
02"- Radical superoxyde
102 Oxygène singulet
-OH Radical hydroxyle
QO-1200 Équivalents réducteurs (~C)
QA Plastoquinone A
QB Plastoquinone B
RÉsUMÉ
Problématique
Chez les végétaux, l'excès d' énergie lumineuse absorbée par rapport à la capacité
d'assimilation de la photosynthèse favorise la production de radicaux libres pouvant
causer des dommages oxydants et ainsi diminuer la productivité végétale. Le principal
mécanisme de détoxification des radicaux libres dans les chloroplastes est le cycle
Halliwell-Asada, une voie enzymatique utilisant notamment l'acide ascorbique comme
donneur d'électrons. Plusieurs observations suggèrent l'existence d'une deuxième ligne
de défense contre les dommages oxydants située principalement dans les vacuoles, par
laquelle les composés phénoliques sont oxydés par des peroxydases de classe III pour
détoxifier des radicaux libres. Cependant, l'importance de cette fonction physiologique
des composés phénoliques est toujours matière à débat, principalement à cause de leur
localisation dans les vacuoles, et particulièrement celles des cellules épidermiques, donc
loin du principal site de production de radicaux libres. Aussi, à ce jour aucune étude n'a
démontré une corrélation entre l'oxydation des composés phénoliques et les dommages
oxydants engendrés lors de stress environnementaux.
Objectifs
Afin de démontrer l'implication des composés phénoliques dans la protection contre les
dommages oxydants, le premier objectif de ce projet de maîtrise est de démontrer une
corrélation temporelle entre les dommages photo oxydants induits lors de la
photoinhibition et les changements des propriétés d'oxydoréduction des composés
phénoliques caractérisées par la voltarnmétrie cyclique. Puisque l' interprétation des
résultats de voltarnmétrie peut être hasardeuse pour des mélanges complexes tels que les
extraits de feuille d'érable compte tenu des interactions possibles entre les différents
composés et l'électrode, le second objectif de ce mémoire est de caractériser les
interactions entre les composés présents dans l' extraits de feuilles d' érable argenté et
x
deux antioxydants communs, soit l'acide ascorbique (AsA) et le gallate
d' épigallocatéchine (EGCG).
Méthodologie
Les expérimentations ont été menées sur des feuilles d'érable argenté (Acer
saccharinum L.) développées en plein soleil. Dans une première expérience, les feuilles
récoltées ont été infiltrées avec de l'eau ou une solution de méthylviologène (MV)
(0,5 mM) puis exposées à une intense lumière bleue (2800 Ilmoles photons m-2 S-l)
pendant un temps variant entre 0 et 4 heures. Le degré de photoinhibition des feuilles a
été estimé par le rendement photochimique . maximum du photo système II mesuré par
fluorescence chlorophyllienne (FvlFm) alors que les dommages oxydants ont été estimés
par la diminution de la concentration en chlorophylles a + b. La concentration en
composés phénoliques a été mesurée par réactifs Folin-Ciocalteu et par la mesure de
l'absorbance UV d'un extrait méthanolique de feuille, alors que les propriétés
d'oxydoréduction des composés phénoliques ont été caractérisées par voltammétrie
cyclique. Dans une deuxième expérience visant à mieux interpréter les
voltammogrammes des mélanges complexes de composés phénoliques, les interactions
entre les composés phénoliques présents dans les extraits de feuilles d'érable argenté
ainsi que l'AsA et l'EGCG à différentes concentrations (0,1 mM à 2,25 mM), ont été
caractérisées par voltarnmétrie.
Résultats
Le degré de photo inhibition est plus élevé chez les feuilles infiltrées par le MV que les
feuilles non traitées. Seulement chez les feuilles traitées au MV, l' intense illumination a
causé une diminution de la concentration des composés phénoliques suivie, après deux
heures d' illumination, d'une diminution marquée de la concentration en chlorophylles.
Les voltammogrammes révèlent l'oxydation de composés phénoliques ayant un faible
potentiel d'oxydation (entre 0 et 400 mV) par rapport à électrode de référence Ag/AgCl.
Xl
Les voltammogrammes de l'acide ascorbique ou de l'EGCG purs (sans extrait de
feuilles d'érable) montrent que la hauteur de leur pic d'oxydation ainsi que l'aire sous la
courbe augmentent linéairement avec leur concentration. De plus, l'augmentation de la
concentration déplace leur oxydation vers des potentiels plus élevés. En présence
d'extrait de feuilles d'érable argenté, les composés de ces dernières retardent l'oxydation
de l'AsA (le pic d'oxydation est déplacé vers des potentiels supérieurs), mais n'affecte
pas la relation linéaire entre la quantité de molécules d'AsA oxydées (la hauteur du pic
et l'aire sous la courbe) et leur concentration. Pour l'EGCG en présence de l'extrait de
feuilles d'érable, son oxydation n'est pas seulement retardée, mais aussi fortement
restreinte. La pente de la droite entre la concentration d'EGCG en solution en présence
des composés des feuilles d'érable et la quantité de molécules oxydées correspond à
seulement 25 % de celle mesurée en absence de l'extrait.
Discussion
Nos résultats suggèrent que les dommages photooxydants dans les feuilles d'érable
argenté surviennent après qu'un groupe de composés phénoliques les plus facilement
oxydables aient été employés pour détoxifier les radicaux libres. Le MV a favorisé
l'utilisation du pouvoir antioxydant des composés phénoliques puisque ce traitement
accentue le stress oxydant tout en désactivant le principal mécanisme de protection
(cycle Halliwell-Asada). D'après les composés phénoliques présents habituellement
dans les feuilles d'érable argenté, les spectres d'absorbance UV des extraits à l'étude
(spectres sans chlorophylle) ainsi que les courbes des voltammogrammes, l'EGCG
apparaît être le composé phénolique utilisé dans la protection contre le stress oxydant.
Cependant, un certain décalage a été observé entre nos voltammogrammes et celui de
l'EGCG pure, probablement dû à l'interaction entre les différents composés de l'extrait.
Nous avons d'ailleurs observé que lorsque la concentration de la solution d'AsA ou
d'EGCG augmente, ces composés sont davantage adsorbés sur l'électrode et retardent
ainsi les oxydations subséquentes. Les composés de l'extrait de feuille d'érable argenté
influencent très peu l'oxydation de l'AsA si ce n'est que de la retarder, alors qu'ils
empêchent partiellement l'oxydation de l'EGCG, probablement parce que les composés
de l'extrait interagissent avec l'EGCG rendent ces derniers indisponibles pour
Xll
l'oxydation sur l'électrode. Le voltammogramme fmal d'un mélange n'est donc pas la
somme parfaite des voltammogrammes des différents composés.
Conclusion
À notre connaissance, la voltammétrie cyclique n'avait jamais été utilisée pour l'étude
des stress oxydants en physiologie végétale. Bien que les voltammogrammes soient
difficiles à interpréter pour des mélanges complexes, la voltammétrie nous a permis
d'appuyer l'hypothèse selon laquelle le pouvoir antioxydant des composés phénoliques
est utilisé pour limiter les dommages photo oxydants lorsque le principal mécanisme de
protection ne suffit pas.
Mots-clés
Pouvoir antioxydant, composés phénoliques, acide ascorbique, gallate d'épigallocatéchine, guaïacol peroxydase, stress oxydant, photoinhibition, voltammétrie, cycle Halliwell-Asada
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1 Contexte général et problématique
Les végétaux sont sensibles aux changements des conditions de leur environnement.
Parmi les ressources du milieu, la lumière se distingue des autres (eau, minéraux,
température) par ses larges et rapides variations. Pour survivre sous de telles conditions,
les plantes doivent d'une part avoir une grande efficacité photochimique sous faibles
intensités lumineuses. D'autre part, elles doivent protéger leur appareil photo synthétique
contre les possibles dommages causés par l'absorption d'un excès d'énergie lorsque la
lumière devient trop intense. Ainsi, les plantes utilisent différents mécanismes de
photoprotection pour moduler la proportion de l'énergie lumineuse absorbée qui sera
transformée par des réactions photochimiques en énergie chimique stable (glucides), en
fonction de leur capacité d'assimilation du C02.
Cependant, leurs mécanismes de régulation ont leurs limites. Un excès de lumière
peut survenir pendant plusieurs heures lors des journées ensoleillées, excès qui est
amplifié par des conditions non-optimales telles qu'un déficit hydrique, des basses
températures, etc ... L'énergie lumineuse absorbée génère alors un pouvoir réducteur
(flux d'électrons) supérieur à ce qui peut être utilisé par la phase biochimique de la
photosynthèse (le cycle de Calvin) (Long et coll. 1994). Le pouvoir réducteur en surplus
favorise la production de radicaux libres pouvant causer des photodommages et une
diminution de la photosynthèse (photoinhibition). Ce stress photo oxydant provoque
donc une baisse significative de la productivité végétale. Par exemple, il a été estimé que
lors des journées ensoleillées, la culture du maïs peut subir une diminution de
productivité de 12 % à 30 % pour des températures de 30 oC et 10 oC respectivement
(Zhu et coll. 2004).
Les radicaux libres sont des molécules hautement réactives dont le pOUVOIT
oxydant peut dénaturer les composantes des cellules (Halliwell 2006). Le principal
mécanisme de détoxification des radicaux libres est le cycle Halliwell-Asada (Asada
2
1999). Il s'effectue dans les chloroplastes, directement aux sites de production des
radicaux libres avant que ceux-ci ne diffusent et réagissent avec les composantes
cellulaires. Le cycle Halliwell-Asada est bien caractérisé. Il implique plusieurs enzymes
antioxydantes et des antioxydants solubles (acide ascorbique et gluthatione). En support
au cycle Halliwell-Asada, lorsque celui-ci ne suffit plus à détoxifier les radicaux libres,
plusieurs observations soutiennent que des composés phénoliques pourraient prendre la
relève. Ces composés forment un groupe important de métabolites secondaires dans les
végétaux, tant par leur diversité, leur concentration et leurs fonctions dont possiblement
un rôle photoprotecteur (Edreva 2005). Cependant, l'efficacité du processus de
détoxification par les composés phénoliques n'est toujours pas établie, notamment parce
que les radicaux libres sont principalement produits dans les chloroplastes et les
mitochondries alors que les composés phénoliques s'accumulent principalement dans les
vacuoles des cellules épidermiques. Pour certains auteurs (Yamasaki et coll. 1997), leur
localisation ne serait pas une contrainte au processus de détoxification, car certains
radicaux libres (H202) sont facilement translocables (long temps de vie) et pourraient
donc rejoindre les composés phénoliques jusque dans l'épiderme. De plus, il est déjà
bien connu que les composés phénoliques démontrent une forte capacité antioxydante.
Plusieurs composés phénoliques ont même une capacité antioxydante supérieure, sur une
base molaire, à celle de l'acide ascorbique (Rice-Evans 2001). Cette capacité
antioxydante est responsable, en partie du moins, de leur rôle reconnu dans la prévention
des cancers chez l'humain (Hertog et coll. 1993). Si l'importance de la capacité
antioxydante des composés phénoliques dans notre alimentation est bien reconnue, il est
curieux de constater que l'importance physiologique in planta de cette capacité de
détoxification des radicaux libres par les composés phénoliques demeure l'objet d'un
débat persistant (Hemandez et coll. 2008). Selon Hemandez, la démonstration d'un tel
rôle antioxydant in planta des composés phénoliques nécessite tout d'abord
l'observation d'une corrélation temporelle entre les dommages oxydants et les variations
des caractéristiques des composés phénoliques, ainsi qu'une meilleure caractérisation de
leurs produits d'oxydation lors de stress oxydant.
La compréhension du rôle des composés phénoliques dans la photoprotection de
l'appareil photo synthétique est donc nécessaire et pourrait permettre de minimiser les
3
effets négatifs de la photo inhibition et éventuellement diminuer les pertes de rendement
occasionnées par ce stress.
1.2 Objectifs et méthodologie
. Le principal objectif de ce mémoire est de démontrer l'implication du pOUVOIT
antioxydant des composés phénoliques dans les plantes lors de stress oxydants, en
établissant une corrélation temporelle entre d'une part, les dommages photooxydants
induits lors de la photo inhibition avec d'autre part, les changements de propriétés
d'oxydoréduction des composés phénoliques ce qui, à notre connaissance n'a jamais été
rapporté. Pour ce faire, des feuilles d'érable argenté ont été soumises à une forte
intensité de lumière bleue pendant différentes périodes. Puis, nous avons analysé les
variations temporelles i) de l'efficacité photochimique du photo système II (premier site
de la photoinhibition), ii) des concentrations en chlorophylles (dommages
photo oxydants non-spécifiques de l'appareil photo synthétique) et iii) des propriétés des
composés phénoliques (concentrations et état d'oxydation). De plus, l ' infiltration de
méthylviologène dans les feuilles avant la période de photo inhibition a permis
d'accentuer le stress oxydant d'abord en accélérant la formation de radicaux libres puis
en inhibant un des principaux mécanismes de détoxification des radicaux libres soit le
cycle Halliwell-Asada. Pour démontrer le rôle antioxydant des composés phénoliques
lors d'un stress aigu de photo inhibition, l'hypothèse générale qui devra être vérifiée est
que l'oxydation des composés phénoliques ainsi que la diminution de leur concentration
précèdent l'accélération du taux de dommages oxydant.
Le degré de photo inhibition a été évalué par le rendement photochimique maximal
des photo systèmes II (PSIIs) estimé par fluorescence chlorophyllienne. Aussi, la
concentration en chlorophylles a et b a été mesurée et considérée comme une indication
des dommages oxydants non-spécifiques de l'appareil photosynthétique. De plus, la
concentration en composés phénoliques a été évaluée par un dosage chimique avec le
réactif Folin-Ciocalteu et par des mesures de l'absorbance UV d' extraits méthanoliques
des feuilles d'érable argenté. Quant à la caractérisation des propriétés d'oxydoréduction
des composés phénoliques, nous avons utilisé la voltarnmétrie cyclique pour la première
4
fois, à notre connaissance, dans l'étude des stress oxydants en physiologie végétale. La
voltammétrie cyclique est une méthode largement utilisée en électrochimie pour
caractériser les propriétés d'oxydoréduction de composés purs en solution. Cette
méthode est aussi employée pour estimer le pouvoir antioxydant de produits végétaux
tels que les thés, vins, etc. Cependant, l'interprétation des voltammogrammes de tels
mélanges complexes demeure hasardeuse compte tenu des multiples interactions
pouvant se produire entre les composés en solution et leurs interactions à la surface de
l'électrode. Ainsi, le second objectif de ce mémoire est de caractériser les interactions
entre les composés phénoliques présents dans les extraits de feuilles d'érable argenté
avec deux antioxydants communs, l'acide ascorbique (AsA) et le gallate
d'épigallocatéchine (EGCG, présent en grandes concentrations notamment dans le thé).
CHAPITRE II
REVUE DE LITTÉRATURE
2.1 Aperçu des réactions photochimiques de la photosynthèse
La lumière est vitale aux végétaux puisque sa transformation en énergie photochimique
permet de générer le transport d'électrons et de protons qui résulteront en la synthèse de
molécules énergétiques (ATP et NADPH) permettant de réduire le dioxyde de carbone
(C02) en carbone organique (glucide) lors de la phase biochimique de la photosynthèse.
Tout d'abord, les photons sont absorbés par les pigments photo synthétiques
(chlorophylles et caroténoïdes chez les algues vertes et les plantes supérieures) présents
dans les antennes collectrices (Fig. 2.1). La majeure partie de l'énergie lumineuse
absorbée sera transférée sous forme d'excitons aux centres réactionnels des
photo systèmes l (PSIs) et photo systèmes II (PSIIs) pour être utilisée dans les réactions
photochimiques primaires. Au cours de son transfert vers les centres réactionnels, une
fraction de l'énergie d'excitation sera perdue et réémise sous forme de chaleur ou de
fluorescence. Dans les antennes du PSII, l'énergie d'excitation est canalisée vers la
chlorophylle-a spéciale dénotée P680 au niveau du centre réactionnel. Son excitation
provoque une réaction photochimique primaire, c.-à-d. la photooxydation de P680 en
P680+, et la réduction de l'accepteur primaire d'électron, la phéophytine (Phéo-). Cette
séparation de charges (P680+Phéo-) initie un transfert d'électrons par lequel P680+
regagne un électron en oxydant (photolyse) une molécule d'eau via la tyrozine Z au
niveau du complexe de dégagement d'oxygène. Pendant ce temps, la Phéo- cèdera son
électron aux accepteurs plastoquinones QA et QB. La QB, après avoir accepté deux
électrons et pris deux protons du stroma, se détache de son site et migre dans les
membranes internes des chloroplastes (les thylacoïdes) vers les complexes du
cytochrome b6-f où elle sera oxydée. L'électron est ensuite transféré via la plastocyanine
vers le centre réactionnel du PSI. Grâce à cet électron et à un photon provenant de
l'antenne du PSI, un électron du centre réactionnel du PSI chemine jusqu'à la
ferrédoxine, une protéine présente dans le stroma qui réduira le NADP+ en NADPH à
6
l'aide d 'une enzyme. En plus de produire le NADPH, le transport photo synthétique
d' électrons génère un gradient de protons (~pH) qui s 'accumulent dans le lumen des
thylacoïdes suite à la photolyse de l 'eau (en H+ et O2) et lors de l'oxydation des
plastoquinones au niveau du cytochrome b6-f L 'énergie de ce ~pH est dissipée par le
facteur de couplage (F-ATPase ou ATPsynthase) pour produire des molécules d'ATP.
Les molécules de NADPH et d 'ATP sont ensuite utilisées comme source d' énergie par
le cycle de Calvin afin de réduire le C02 en glucides lors de la phase biochimique de la
photosynthèse (Melis 1999). Ainsi, la phase biochimique de la photosynthèse est
dépendante de la phase photochimique qui lui fournit les molécules de NADPH et
d 'ATP, tandis que la phase photochimique est dépendante de la phase biochimique qui
régénère le NADP+, l'ADP et le phosphate inorganique, essentiels au maintien du
transport photosynthétique d' électrons (Chen et coll. 1992).
DP i@
~ ATP
)
2 11' ____ ~---------------------------'
- LUME ATPase ~~~.~ ____________________ ~p~H5
Figure 2.1 : Processus de la photosynthèse (Meyer et coll. 2004).
2.2 La photoinhibition
Lors de la photosynthèse, les PSIIs sont continuellement endommagés et remplacés .
Lorsque le taux de photo dommages excède le taux de photoréparation, il y a une
accumulation de PSIIs inactifs et donc photo inhibition. Le taux de photo dommages est
directement proportionnel à l'intensité lumineuse absorbée par les PSIIs. La lumière, en
7
particulier les ultraviolets et la lumière bleue, inactive le complexe de dégagement
d'oxygène du PSU en provoquant le relâchement des atomes de manganèse qui y sont
liés. Cette photoinactivation du complexe de dégagement d'oxygène inhibe le transfert
d'électrons de l'eau vers le centre réactionnel. Ceci prolonge le temps de vie de la forme
oxydée de P680 dont l'accumulation augmente les chances que des molécules du PSU
soient endommagées par oxydation (Nishiyama et coll. 2006; Hakala et coll. 2005).
Parallèlement aux photodommages, les PSUs inactifs seront réparés en différentes
étapes. L'étape limitante est le remplacement de la protéine Dl faisant partie du centre
réactionnel du PSU (Allakhverdiev et Murata 2004). Si le taux de photo dommage est
déterminé par le taux d'excitation des PSUs (plus précisément, le taux d'absorption de la
lumière par le complexe de dégagement d'oxygène), le taux de réparation des PSUs
inactifs dépend quant à lui de différents facteurs physiologiques et environnementaux
(Melis 1999). En effet, il est maintenant bien admis que le remplacement de la protéine
DIest accentué par l'augmentation de la production des radicaux libres lors de divers
stress environnementaux comme une sécheresse, de basses températures, une carence
minérale ou un surplus de lumière. Donc, les stress environnementaux augmentent les
risques de photo inhibition non pas en favorisant les photodommages mais plutôt en
ralentissant la réactivation des PSUs (Murata et coll. 2007; Takahashi 2008).
2.3 Degré de photoinhibition estimé par fluorescence chlorophyllienne
Puisque le psn constitue la principale composante de la chaîne photosynthétique à être
affectée par la photo inhibition, la mesure de son efficacité photochimique maximale, soit
la proportion de psns opérationnels, est un bon moyen d'estimer le degré de
photoinhibition de la plante. Une façon rapide et non destructive de déterminer
l'efficacité photochimique maximale des PSUs est la mesure du ratio de fluorescence
chlorophyllienne FvlFm. (Maxwell et Johnson 2000).
Tel que mentionné plus haut, l'énergie lumineuse absorbée par les chlorophylles
peut être utilisée soit lors des réactions photochimiques pour la photosynthèse où être
réémise sous forme de chaleur ou de fluorescence. Lorsqu'une plante saine est adaptée à
l'obscurité, les mécanismes de photoprotection régulant la dissipation de l'énergie sous
8
forme de chaleur sont désactivés (Li et coll. 2002). Dans ces conditions, l'efficacité du
transfert de l'énergie absorbée et de son utilisation par les réactions photochimiques du
PSII est alors maximale tandis que la portion de l'énergie dissipée sous forme de chaleur
et perdue sous forme de fluorescence est minimale. Ainsi, lorsque l'on éclaire une
feuille préalablement adaptée à l'obscurité avec une lumière non-actinique (c.-à-d. d'une
trop faible intensité pour induire la photosynthèse), les PSIIs sont ouverts (c.-à-d tous les
accepteurs d'électrons QA et Qs sont oxydés) et leur efficacité photochimique est
maximale. Dans cet état, la fluorescence chlorophyllienne est minimale (Fo) (Fig. 2.2).
Si on éclaire la plante adaptée à l'obscurité avec une lumière saturante pendant un court
moment (1-2 secondes), les QA deviennent réduites et les PSIIs deviennent fermés
(c.-à-d. incapables de compléter les réactions photochimiques primaires). L'énergie
absorbée par les PSIIs fermés ne pouvant pas passer en photochimie, la fluorescence est
alors maximale (Fm). L'efficacité photochimique maximales des PSIIs peut être estimée
par le paramètre Fv/Fm ((Fm-Fo) /Fm) (Maxwell et Johnson 2000). Le Fv/Fm est
habituellement de 0,83 pour les plants sains. Cette valeur diminuera selon la proportion
des PSIIs endommagés, et donc est représentative du degré de photoinhibition de la
plante.
Si l'on soumet une feuille de façon prolongée à une lumière actinique, les
accepteurs QA initialement réduits seront oxydés progressivement suite à la
« réadaptation» de la feuille à la lumière par la réactivation du cycle de Calvin et
l'ouverture des stomates. De plus, le mécanisme de dissipation de l'énergie par la
chaleur se remet en place (voir section 2.4.1). La portion de l'énergie allant en
photochimie et en dissipation par la chaleur augmente progressivement, se traduisant par
la baisse de la fluorescence.
9
--Fm
Fo 1 SP
~ AL
----i-I .. _-Ft
Figure 2.2: Courbe de fluorescence chlorophyllienne typique (Maxwell & Johnson, 2000). MB = faible lumière modulée; SP = flash de lumière saturante; AL = lumière actinique.
2.4 Les radicaux libres
Les radicaux libres sont des molécules produites par différentes réactions du
métabolisme cellulaire. Ils peuvent avoir des effets néfastes sur l' intégrité des différentes
composantes de la plante à cause de leur forte réactivité. Les radicaux superoxyde (02 '-)
et hydroxyle ('OH) sont extrêmement réactifs, alors que le peroxyde d'hydrogène
(H202) qui est le plus abondant est le moins oxydant.
Depuis longtemps, les radicaux libres ont donc été considérés comme des
sous-produits métaboliques indésirables qui doivent être désactivés pour éviter des
dommages oxydants non-spécifiques dans les cellules. Cette vue un peu simpliste s'est
transformée récemment par les évidences montrant que les radicaux libres peuvent aussi
jouer un rôle important en agissant comme des molécules signal impliquées dans la
régulation de plusieurs processus biologiques, dont la réponse des végétaux aux stress
environnementaux. En effet, une faible augmentation de la concentration des radicaux
libres, notamment le H202, peut induire la tolérance à un stress tandis que de fortes
accumulations peuvent activer le processus de mort cellulaire programmée. Ainsi, la
balance entre l'acclimatation aux stress ou la mort cellulaire dépend d' interactions
complexes entre d'une part la production et l'utilisation du pouvoir réducteur des
10
radicaux libres générés par le flux d'électrons dans les chloroplastes, et d'autre part des
antioxydants qui détoxifient ces radicaux libres et donc influe sur leur pouvoir de
signalisation (Foyer et Noctor 2009; Mittler et coll. 2004).
Le transport d'électron de la photosynthèse est générateur de radicaux libres. Leur
formation s'accélère lorsque le flux d'électrons est supérieur à la capacité d'assimilation
de la photosynthèse c'est-à-dire la capacité du cycle de Calvin à renouveler l'accepteur
terminal d'électrons NADP+ (faible ratio NADP+/NADPH), par exemple lors de certains
stress limitant la capacité d'assimilation du CO2 (basses températures, déficit hydrique,
etc.) et/ou lors d'un excès de lumière. Les transporteurs d' électrons se retrouvent dans
un état réduit et la chaîne photo synthétique devient saturée. La probabilité que le
pouvoir réducteur soit acheminé vers un autre élément que ceux de la chaîne
photo synthétique augmente. Il y a deux principaux sites de formation d'espèces
réactives d'oxygène, soit au niveau du PSII et la réaction de Mehler du côté accepteur du
PSI (Aro et coll. 1993; Forti et coll. 2006).
Dans le premier cas, soit au niveau du PSII, la réduction de la QA se fait plus
rapidement que leur oxydation par la QB. Les QA et les phéophytines ne pouvant être
réoxydées du côté accepteur du PSII, il y aura entrave à la circulation des électrons
subséquents. Lors de la séparation de charge suivante au niveau du PSII, l' électron
produit ne pourra pas aller vers les phéophytines. Les chlorophylles maintenant à l'état
triplet réagiront avec l'oxygène ambiant pour former de l'oxygène singulet e02).
Dans le deuxième cas, les radicaux libres se forment au niveau du passage d'un
électron entre la ferrédoxine du PSI et le NADP+. Les électrons pourront réagir avec
l'oxygène moléculaire pour former des ions superoxydes qui seront en partie
transformés en peroxyde d'hydrogène par la superoxyde dismutase. Ces deux formes
pourront aussi interagir entre elles pour former des radicaux hydroxyles très réactifs.
Les radicaux libres peuvent arracher des électrons aux molécules organiques,
détruisant des composantes de la cellule tels des pigments photo synthétiques. Les
radicaux libres peuvent engendrer des dommages oxydants en cascade et dégrader des
lipides membranaires, des protéines et de l'ADN ce qui pourra entraîner la destruction
des cellules (Halliwell 2006). Le PSII est particulièrement sensible aux radicaux libres.
11
De par leur potentiel oxydant, les radicaux libres inhibent certaines réactions, dont la
synthèse du précurseur de la protéine Dl du centre réactionnel du PSII, puisqu'ils
inhibent l'élongation des peptides durant l'étape de la translation (Takahashi 2008). De
tous les radicaux libres, c'est particulièrement le H202 qui entrave la synthèse de la
protéine Dl (Nishiyama 2001).
Une approche pour étudier les différents aspects de la photo inhibition causée par
les dommages photooxydants est l'utilisation de l'inhibiteur méthylviologène (MV) (le
principe actif de l'herbicide paraquat) puisque l'application d'une solution de MV sur
les feuilles d'une plante favorise les photodommages. Le produit agit doublement sur la
photo inhibition, d'abord en accélérant la formation de radicaux libres lors de la réaction
de Mehler du côté accepteur du PSI, puis en inhibant un des principaux mécanismes de
détoxification des radicaux libres soit le cycle Halliwell-Asada par la désactivation de
l'ascorbate peroxydase (Mano et coll. 2001; Miyagawa et coll. 2000). Le
méthylviologène est d'ailleurs souvent utilisé pour induire un stress photo oxydant qui
s'est révélé être similaire à la photo inhibition naturelle (Allen et coll. 1997).
En bref, les radicaux libres, bien qu'indispensables pour la plante, sont
responsables de la photo inhibition, et donc de la diminution de leur rendement.
2.5 Mécanismes de photoprotection
Les causes de la photo inhibition sont nombreuses et les dommages qu'elle engendre
peuvent être importants, mais il existe des moyens de la prévenir ou d'en limiter les
effets. En effet, au cours de son évolution la plante a développé différents mécanismes
de photoprotection. Sous un excès de radiation lumineuse, la feuille peut éviter le stress
en s'enroulant sur elle-même et en déplaçant les chloroplastes parallèlement à la lumière
incidente afin de minimiser l'absorption de la lumière (Brugnoli & Bjorkman 1992;
Larcher 2003). De plus, une fois l'énergie lumineuse absorbée, l'appareil
photo synthétique peut limiter les dommages potentiels, notamment A) par
l'augmentation de la dissipation de l'énergie sous forme de chaleur (cycle des
xanthophylles) et B) par un système de détoxification des radicaux libres (cycle
Ha1liwell-Asada).
12
2.5.1 Cycle des xanthophylles
La première ligne de défense de la plante contre l'excès de lumière absorbée est la
dissipation, dans les antennes, de l'énergie sous forme de chaleur. Lorsqu'il y a un
surplus d'énergie absorbé, le renouvellement du NADP+ par le cycle de Calvin se fait
plus lentement que leur réduction par les électrons de la chaîne de transport
photosynthétique. La phosphorylation de l'ADP en ATP utilisant le gradient de H+ des
thylacoïdes devient insuffisante ce qui amène une acidification du lumen. Cette acidité
sert de premier signal permettant d'activer le cycle des xanthophylles associées à
l'antenne du PSII. La violaxanthine dé-époxydase provoque de manière réversible, la dé
époxidation de la violaxanthine en anthéraxanthines puis en zéaxanthine (Li et coll.
2002). Cette dernière molécule est beaucoup moins efficace pour transférer l'énergie
d'excitation aux autres pigments de l'antenne des photo systèmes. Elle la dissipe plutôt
sous forme de chaleur, diminuant ainsi la proportion de l'énergie atteignant la voie
photochimique. Puisque ce mécanisme diminue la pression d'excitation sur le PSU, la
formation de radicaux libres est atténuée.
Le cycle des xanthophylles est principalement efficace pour limiter les effets des
variations rapides de lumière. En effet, Külheim et coll. (2002) ont démontré qu'un
mutant Arabidopsis incapable de procéder au cycle des xanthophylles subit plus de
dommage qu'un plant normal lors de variations rapides de l'intensité lumineuse, mais
pas sous une forte intensité si elle est constante. Ces observations impliquent qu'un
mécanisme autre que la dissipation de l'énergie sous forme de chaleur serait responsable
de la protection de la plante contre des conditions chroniques de photo inhibition, soit la
détoxification des radicaux libres.
2.5.2 Cycle Halliwell-Asada
La formation de radicaux libres peut servir de «soupape de sécurité» au surplus
d' énergie en autant que ces radicaux libres soient détoxifiés efficacement. Sinon, leur
accumulation occasionnera des dommages photooxydants. La deuxième ligne de défense
contre l'excès de radiations lumineuses est donc la détoxification de ces radicaux libres.
Pour ce faire, la plante utilise certaines enzymes antioxydantes et des antioxydants
13
présents dans les chloroplastes (Pignocchi et coll. 2003). Le principal mécanisme de
détoxification des radicaux libres est le cycle Halliwell-Asada. Ce procédé, via la
superoxyde dismutase, transforme l'ion superoxyde en peroxyde d'hydrogène (H20 2),
molécule moins toxique pour la cellule. Par la suite, l'ascorbate peroxydase pourra
scinder le H20 2 en eau et en oxygène. L'acide ascorbique (vitamine C) utilisé sera
régénéré par une série de réactions utilisant du NADPH (Fig. 2.3 : Davey et coll. 2000).
L-AA
, MDHA
o As,corba te perœj,.da;se, o .MQnQdehydroascorbate reduct.àsé o Dohyd~Qe.I$CQrha t.e reduc:tase
G) cu u tii. thi,ClnC ,roetueta$~
GSSG,\ NAD PH
2GSH
Figure 2.3: Cycle de détoxification du peroxyde par l' ascorbate peroxydase (Davey et coll. 2000).
2.5.3 Pouvoir antioxydant des composés phénoliques
L'importance du cycle Halliwell-Asada dans la détoxification des radicaux libres
produits dans les chloroplastes n'est plus à démontrer. Cependant, en plus de l'acide
ascorbique et de l'ascorbate peroxydase, il existe dans les feuilles d' autres peroxydases
(peroxydase de classe III, souvent dénotée guaïacol peroxydase) capables de détoxifier
le H20 2 en oxydant d' autres types d'antioxydants, les composés phénoliques (Edreva,
2005). Certains chercheurs ont donc proposé que lorsque le cycle ne suffit plus à
détoxifier dans les chloroplastes les radicaux libres produits lors d'un stress oxydant,
certains d'entre eux (surtout le H202) peuvent diffuser jusqu' aux vacuoles où ils peuvent
14
dégradés dans des réactions impliquant les composés phénoliques et les peroxydases
classe III. Ainsi, les composés phénoliques pourraient avoir un rôle photoprotecteur, non
seulement en raison de leur forte absorption des UV au niveau de l'épiderme, mais aussi
de leur fort pouvoir antioxydant (Edreva 2005).
2.6 Composés phénoliques
2.6.1 Propriétés des composés phénoliques
Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires ayant comme base un cycle
benzoïque avec un ou plusieurs groupements hydroxyle (OH). À cette base peut
s'ajouter plusieurs cycles benzoïques et divers groupements comme des méthyles, des
méthoxys, des amines et des glycosyles. Leur synthèse se fait principalement suite à la
voie de l'acide shikimique par la dé-arnination de la phénylalanine (produisant l'acide
cinnamique précurseur des composés phénoliques) et en faible partie, par la voie de
l'acide malonique (Guidi et coll. 2005). Les composés phénoliques s'accumulent
habituellement dans les vacuoles des cellules où ils sont gardés sous forme réduite. Les
deux principaux groupes de composés phénoliques sont les flavonoïdes et les acides
phénoliques (les acides hydroxybenzoïques et hydroxycinnamiques). Les principales
classes des flavonoïdes sont les flavonols (quercétine, kaempférol), les flavones
(lutéoline), les flavanols (catéchines) et les isoflavones (génistéine). Les acides
phénoliques sont des dérivés d'acide benzoïque (acide gallique) ou des dérivés d'acide
cinnarnique (dont les acides coumarique, férulique, sinapique, qui servent de précurseurs
aux unités de base de la lignine) (Dixon et Paiva 1995).
Les composés phénoliques ont longtemps été considérés comme n'ayant aucun
rôle précis pour la plante. Cependant, nous savons maintenant qu'ils sont importants,
notamment pour la protection de la plante contre les rayons ultraviolets (UV), pour sa
défense (protections chimique et physique) contre les herbivores et les pathogènes ainsi
que pour certaines interactions biotiques comme la dispersion du pollen et des graines
par leur rôle dans la coloration des fleurs et des fruits (Edreva 2005). Une autre propriété
intéressante des composés phénoliques, plus particulièrement ceux de la classe des
flavonoïdes, est leur facilité à céder un électron. Plusieurs de ces composés ont même un
15
pouvoir antioxydant supérieur, sur une base molaire à l' acide ascorbique (Rice-Evans
2001). Ce pouvoir antioxydant pourrait donc être utilisé pour réduire les radicaux libres
et ainsi les rendre non dommageables. Il a d'ailleurs été montré qu' il existe une relation
linéaire entre le pouvoir antioxydant des végétaux et la concentration en composés
phénoliques (Fig. 2.4 : Cai et coll. 2004). Ce pouvoir antioxydant est imputable aux
groupements hydroxyles des composés phénoliques. Leur potentiel de réduction est
fonction de la structure catéchol de l'anneau benzoïque (B), de la position des doubles
liaisons et de la quantité de groupements hydroxyles (Fig. 2.5 : Yamasaki et coll. 1997).
Les composés phénoliques avec un groupement diphénol en position ortho ou para
comme les catéchines ont un potentiel d'oxydation plus faible, donc sont plus facilement
oxydés, que ceux avec des diphénols en position méta ou des phénols seuls comme les
flavones qui sont moins réactives (Kilmartin et coll. 2001a).
20000 ~----------------------~
16000
]2000
8000
4000
y:: 297.96x - 213.78 R'- = 0.9638
o
o (A)112 methanolic extracts O ..... =-=--.,--- ..,----.,.---.,.-----r---'
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0
Total phenolic content (9/100 9 DW)
Figure 2.4: Pouvoir antioxydant de 112 plantes médicinales chinoises en fonction de leur concentration en composés phénoliques solubles (Cai et coll. 2004). (DW = masse sèche).
a)
OH
OH 0
b)
HO
ai 0 flavone
c) OH
H~~OH OH
CatecJün: bond x Epicatechin: bond x ....... "
16
Figure 2.5: Structure chimique typique (a) des flavonoïdes (Yamasaki et coll. 1997), (b) des Flavones (Dix on et Paiva 1995) et (c) des catéchines (Kilmartin et Hsu 2003).
2.6.2 Détoxification des radicaux libres par les composés phénoliques
Lors d'un stress oxydant comme la photoinhibition, il a été proposé que les composés
phénoliques pourraient contribuer à détoxifier les radicaux libres (Takahama, 2004). Les
composés phénoliques joueraient le rôle de donneurs d'électrons et d'un atome
d'hydrogène afin de réduire le peroxyde d'hydrogène pour les scinder en H20 et O2
(Castelluccio et coll. 1995; Yamasaki et coll. 1997). Cette réaction est catalysée par les
peroxydases de classe Ill, le plus souvent dénotée guaïacol peroxydase, qui se retrouvent
dans les vacuoles et l'apoplaste (parois cellulaires) (Almagro et coll. 2009). Les
composés phénoliques qui ont été oxydés dans cette réaction peuvent être réduits par
l'acide ascorbique pour reprendre leur état d'oxydoréduction initial (Fig. 2.6). L'acide
ascorbique pourra être de nouveau réduit à l'aide de l'enzyme dehydroascorbate
réductase pour être réutilisé. Si les composés phénoliques ne sont pas régénérés par
l'acide ascorbique, ils seront polymérisés et seront responsables du noircissement de
l'épiderme observable sous conditions de stress photooxydants (Yamasaki et coll. 1997).
17
H2 0;z-Scavenging Function of Flavonoids
CA$A~ cDHAR
DHA
polymer
Figure 2.6: Mécanisme hypothétique de la détoxification du peroxyde d'hydrogène par les composés phénoliques (F), via l'enzyme guaïacol peroxydase (vPX) (Yamasaki et coll. 1997).
L'utilité du pouvoir antioxydant des composés phénoliques dans la plante (in
planta) n'a pas encore été clairement démontrée, bien qu'il existe des peroxydases de
classe III capables de réduire les H202 en utilisant le pouvoir antioxydant des composés
phénoliques. Cela est ironique puisque la capacité des composés phénoliques à
détoxifier les radicaux libres est déjà démontrée en alimentation, réduisant ainsi les
risques de cancers (Hertog et coll. 1993).
Les réserves de certains chercheurs quant à la pertinence du pouvoir antioxydant
des composés phénoliques in planta reposent en grande partie sur la différence de
localisation entre les principaux sites de production des radicaux libres (chloroplastes,
mitochondries) et le site d'accumulation des composés phénoliques, soit les vacuoles, et
plus particulièrement celles des cellules épidermiques. Cet argument n'est pas irréfutable
car le H20 2 étant peu réactif (long temps de vie), il peut facilement diffuser sur de
longues distances dans la feuille et donc rejoindre les composés phénoliques jusque dans
l'épiderme (Fig. 2.7) (Iriti & Faoro, 2003; Yamasaki et coll. 1997). De plus, comme le
montre la figure 2.8 (Tattini et coll. 2000), les composés phénoliques ne sont pas
confmés à l'épiderme et peuvent aussi s'accumuler jusque dans le mésophylle pour les
plantes adaptées à une forte intensité lumineuse. Aussi, bien que les composés
phénoliques s'accumulent principalement dans des vacuoles, ils sont aussi présents dans
les chloroplastes (Hernandez et coll. 2008); D'après ces observations, la localisation des
18
différents composés dans la plante ne semble pas être un obstacle à ce processus de
détoxification.
hv
Figure 2.7: Schéma de la diffusion du H20 2 jusque dans l'épiderme où il pourra être détoxifié par les flavonoïdes (Yamasaki et coll. 1997).
La synthèse des composés phénoliques se fait durant le développement normal de
la plante, ils sont donc présents de façon constitutive. Cependant, leur concentration peut
augmenter fortement en conditions de stress oxydants comme lors d' excès de radiations
lumineuses, de basses températures, des carences nutritives, d'absorption de métaux
lourds ou d'attaque par des herbivores ou des pathogènes. Cette accumulation en
conditions de stress est une autre observation suggérant que les composés phénoliques
peuvent détoxifier des radicaux libres (Beclanan, 2000; Dixon & Paiva, 1995). De plus,
les composés phénoliques accumulés lors de ces stress ont un pouvoir antioxydant
particulièrement élevé. Par exemple, Tattini et coll. (2004) ont observé que sous de
fortes radiations solaires, l'arbuste Ligustrum vulgare accumule davantage de
quercétine, lutéoline et d'échinacoside, trois composés phénoliques très antioxydants.
19
Figure 2.8: Coupe transversale d'une feuille de Phillyrea latifolia L. acclimatée à l'ombre (à gauche) ou au soleil (à droite) . Le jaune indique la présence de flavonoïdes (Tatti ni et colL 2000).
Une autre observation qUI vient appuyer le rôle antioxydant des composés
phénoliques in planta a été fournie par Agati et colL 2007. Dans la coupe transversale
d'une feuille de Phillyrea lat~foJ;a L. exposée à une fOlie lumière, ces auteurs ont
démontré une relation inverse entre la localisation d'une part des radicaux libres détectés
principalement près de la face abaxiale, (c.-à-d. inférieure; en bleu sur les figures 2.8 et
2.9) et d 'autre part des composés phénoliques situés principalement près de la face
adaxiale (c.-à-d. supérieure; en jaune sur les figures 2.8 et 2.9). ils ont interprété ces
résultats en proposant qu'il y avait peu de radicaux libres en face adaxiale puisque les
composés phénoliques présents en grande quantité les ont détoxifiés. Cependant, cette
conclusion n'est pas clairement démontrée, car une autre raison pourrait contribuer à la
plus faible concentration de radicaux libres dans la face adaxiale. En effet, ces cellules
qui reçoivent la lumière directe du soleil (face ad axiale) sont davantage acclimatées à de
fortes lumières que les cellules situées en profondeur dans le mésophylle puisqu'elle ont
une plus grande capacité photosynthétique et une plus grande dissipation de l'énergie
sous forme de chaleur car elle contiennent plus de xanthophylles. Les cellules en face
adaxiale auraient donc été moins affectées par la lumière projetée de façon uniforme sur
la coupe transversale et auraient donc produit moins de radicaux libres. Justement, lors
de leur essai avec des feuilles d'ombre, toutes les cellules étant acclimatées à de faibles
lumières (adaxiales et abaxiales) ont produit plus de radicaux libres.
20
~ ~ 70 C) -c ::i 1: 60 ni t) 150 -c CI) CI) 50 t) ::l C CT CI)
CI) 40 t) CI)
t) 100 CI) c .... CI)
30 0
t) ::l CI) :::= CI)
"0 .... 50 0 20 '0
.2 c 0
>- 10 > 0- ct! CI) 0 li: c ct! Cl 40 80 120 160
Yo ta Yl (IJm)
~ ~ 45 Cl -C ::l E 40 ni t) 150 -c CI) CI) t) ::l C CT 35
CI)
al t) CI)
t) 100 al C .... al 0 t) 30 ~ CI) al "0 ... 0 50 ·0 ::l 25 c = 0 >- > 0- ct! al u:: c 20 ct! 0 Cl 0 100 200 300
Yo ta y (IJm)
Figure 2.9: Graphiques du quenching de la fluorescence (bleu) et de la fluorescence des flavonoïdes (jaune) en fonction de la position (0 : face adaxiale) dans la coupe transversale d'une feuille de Phillyrea latifolia L. acclimatée à l'ombre (en haut) ou au soleil (en bas) suite à un stress photooxydant (lumière bleue de 2800 ~mol m-2 s - 1) (Agati 2007).
Globalement, les résultats rapportés par ces différentes études suggèrent fortement
que les composés phénoliques peuvent contribuer à la détoxification des radicaux libres
dans les feuilles. Cependant, plusieurs interrogations persistent. Selon Hemândez et coll.
(2008), il manque toujours certaines observations nécessaires à démontrer le rôle
antioxydant in planta des composés phénoliques. Tout d'abord, il importe d'établir une
relation causale entre les stress oxydants et l'accumulation des composés phénoliques en
démontrant une corrélation temporelle entre les dommages oxydants et les variations des
concentrations des composés phénoliques. De plus, les produits d'oxydation des
21
composés phénoliques formés lors de stress oxydants sont encore peu caractérisés.
Mentionnons finalement, que les substrats phénoliques utilisés par les peroxydases de
classe III pour détoxifier le H20 2 demeurent méconnus, et les résultats obtenus avec
certains types de flavonoïdes (quercétine) ne peuvent pas être extrapolés aux autres
composés phénoliques.
2.7 Voltammétrie cyclique
2.7.1 Utilisation de la voltammétrie cyclique pour caractériser l'oxydation in planta des composés phénoliques lors de stress oxydants
Afin de vérifier l'oxydation des composés phénoliques dans les plantes lors d'un stress
photo oxydant, on doit pouvoir observer la variation de leurs propriétés
d'oxydoréduction. Plusieurs des méthodes conventionnelles pour mesurer la
concentration ou le pouvoir antioxydant des composés phénoliques reposent sur leur
habilité à réduire chimiquement un réactif précis (dont le réactif de Folin-Ciocalteu ou le
radical stable ABTS·). Ces méthodes permettent d'estimer de façon globale la
concentration ou le pouvoir antioxydant des composés phénoliques mais ne permettent
pas de caractériser les fmes variations de leur potentiel d'oxydoréduction.
À cette fin, une méthode largement utilisée en électrochimie pour caractériser les
propriétés d'oxydoréduction de composés purs en solution est la voltammétrie cyclique.
Cette méthode est aussi appliquée dans l'estimation du pouvoir antioxydant de mélanges
complexes d'extraits de feuilles de différentes espèces de plantes médicinales (Naik et
coll. 2003) ou de feuilles de morphes différents (feuilles rouges vs vertes) (Neill et coll.
2002), de produits d'origine végétale comme les thés, le vin, ou les jus et même la
capacité antioxydante du plasma sanguin (Chevion et Chevion 2000; Bourassa et coll.
manuscrit en préparation; Kilmartin et coll. 2001a). Cependant, à notre connaissance, la
voltammétrie cyclique n'a jamais été utilisée pour caractériser l'évolution des propriétés
d'oxydoréduction des composés phénoliques dans les plantes à la suite d'un stress
photo oxydant (chapitre 3).
Lors des mesures de voltammétrie, un potentiel variant à un taux fixe
(ex. 50 mV/s) est appliqué aux composés en solution afm d'arracher des électrons aux
22
molécules oxydables. Les électrons sont captés par une électrode de travail,
habituellement en carbone vitrifié, utilisée conjointement avec une contre-électrode en
platine. Ces électrons produisent un courant positif (anodique) qui est mesuré par rapport
à une électrode de référence Ag/AgCl. La hausse de courant produite par l'oxydation des
molécules peut être représentée par un pic sur un graphique du courant en fonction du
potentiel (voltammogramme). La hauteur du pic dépend du nombre d'électrons captés à
un potentiel donné et est donc fonction de la concentration des molécules à l'étude
(Fig. 2.10). Le potentiel d'oxydation représente l'énergie nécessaire pour qu'un électron
soit arraché. Plus il est bas, plus le composé donne facilement l'électron et plus fort est
sa capacité antioxydante. Seulement certaines structures moléculaires permettent de
faibles potentiels d'oxydation vers les 400 mV. Il s'agit, entre autres, des groupements
de deux ou trois phénols en position ortho et para comme la quercétine, l'acide gallique,
l'acide caféique et les épicatéchines (Kilmartin et coll. 2001a). D'autres composés
phénoliques sont oxydés à un plus haut potentiel. La voltammétrie permet de constater
qUe certaines molécules, comme des flavones, sont oxydées à de plus hauts potentiels et
donc moins disponibles pour détoxifier les radicaux libres in vivo, contrairement aux
mesures par dosage avec réactif. Certaines molécules comprennent plusieurs
groupements pouvant être oxydés ce qui se traduit par plusieurs pics de courant
anodique. Pour certaines molécules comme la lutéoline, lorsque le potentiel est inversé,
les formes précédemment oxydées des composés phénoliques sont réduites à leur état
original ce qui crée un courant négatif (cathode). Cette réduction est représentée par un
pic vers le bas sur le voltammogramme (Fig. 2.11 : Filipiak 2001).
23
10~----~------~------~----~
Catechin
5
-·5
·10~----~------~------~----~
100 200 300 400 500
E 1 mV (Ag/Agel)
Figure 2.10: Voltammogrammes de la catéchine à différentes concentrations mesurés à 100 mV S·l avec une électrode de carbone de 3 mm à pH de 3,6. Le signal de base a été soustrait (Kilmartin et coll. 2001a).
0.125x10-5
0.075x1o-5
oC( 0.025x1o-5
-0.025x10-5
-0.075x10-5
-0.125x1o-5+---~_~_-,----,---,---,--~-~--0.300 -0.050 0.200
E/V 0.450 0.700
Figure 2.11: Voltammogramme de la lutéoline mesurée à 100 m V s-l avec une électrode de carbone de 3 mm dans un tampon phosphate à pH 7 (Filipiak 2001).
24
2.7.2 Paramètres de mesure de la voltammétrie
Les courbes des voltammogrammes dépendent des caractéristiques des molécules à
l'étude et des conditions (pH, solvant, force ionique ... ) dans lesquels s'effectuent les
mesures.
D'abord, la hauteur des pics est fonction de la concentration des molécules à
l'étude, mais pas toujours de façon linéaire. Kilmartin et coll. (2001a) ont observé que
pour la catéchine et l'acide caféique, la hauteur du pic d'oxydation (courant) augmente
plus lentement que la concentration lorsque le courant dépasse 2 ~A (Fig. 2.12). De plus,
lorsque la concentration des composés en solution augmente, un plus haut potentiel est
nécessaire pour induire l'oxydation des molécules (Fig. 2.10). Ces phénomènes seraient
attribuables à l'adsorption des molécules et de leurs produits d'oxydation sur l'électrode
de travail ce qui empêche les oxydations subséquentes (Makhotkina et Kilmartin 2010).
Makhotkina et Kilmartin (2009) ont remarqué que l'adsorption des molécules sur
l'électrode ne se produit pas seulement au cours de la mesure, mais dès que l'électrode
entre en contact avec la solution. Par exemple, lorsque l'électrode de travail est plongée
dans une solution de rutine 0,1 mM pendant 30 secondes puis rincée, le
voltammogramme de cette électrode mesurant une solution exempte de composés
phénoliques présente 75 % du signal du voltammogramme de rutine 0,1 mM. Afin
d'avoir une oxydation optimale des composés, les solutions doivent donc être faiblement
concentrées, les mesures doivent être prises peu de temps après que l'électrode de travail
ait été placée dans la solution et l'électrode doit être adéquatement polie après chaque
mesure. Il est aussi nécessaire d'effectuer une courbe de calibration pour chaque
molécule à l'étude dans chacune des conditions de mesure si l'on souhaite estimer la
concentration d'une solution à partir des voltammogrammes.
25
8
6
~ 4 -.. Catechin - 2
0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
[antioxidant] / mM
Figure 2.12: Graphique du courant du pic d'oxydation de la catéchine et de l'acide caféique en fonction de leur concentration. Les voltammogrammes ont été mesurés à 100 m V S-1 avec une électrode de carbone de 3 mm à pH de 3,6 (Kilmartin et coll. 2001a).
Un autre paramètre qui peut influencer les voltammogrammes est le pH de la
solution. Le pH affecte les réactions d'oxydoréduction puisque ces dernières impliquent
la libération ou l'utilisation de protons en plus des électrons (Filipiak 2001). Lorsque le
pH augmente, les potentiels d'oxydation diminuent de façon proportionnelle, mais
suivant une pente différente selon la molécule et le type de tampon utilisé. Par exemple,
la pente du potentiel d'oxydation en fonction du pH est de 55 mY/pH pour la lutéoline
(Fig. 2.13) et de 73 mY/pH pour la quercétine. Bien que ce paramètre influence
grandement le potentiel d'oxydation, son effet est prévisible, ce qui permet de comparer
des voltammogrammes mesurés à différents pH. Toutefois, un autre effet du pH de la
solution qui cette fois ne varie pas de façon linéaire, est la hauteur des pics d'oxydation
ou de réduction (Fig. 2.14). Ainsi, la hauteur des pics diminue ou augmente selon le pH
optimal. Certains pics peuvent même devenir imperceptibles, comme le pic cathodique
de la lutéine à des pH élevés, probablement parce que les o-quinones générées lors de
l'oxydation de la molécule sont instables et ne pourront pas être réduites (Hapiot et coll.
1996).
26
3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Figure 2.13: Relation linéaire (55 mY/pH) entre le potentiel d'oxydation et le pH de la lutéilone (Filipiak 2001).
O.35x1OS
0.30x10-5
O.25x1Q-5
O.2Ox1Q-5
ct 0.15x1OS
-- 0.10x105
0.05x1Q-5
0
-0.05x1OS
-0.1Ox1OS -0.25 0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
E/V
Figure 2.14: Voltammogrammes de lutéoline dans un tampon Mcllvain à un pH de 3.0 (courbe 1), un pH de 5.0 (courbe 2) ou un pH de 7.0 (courbe 3) (Filipiak 2001).
27
Enfm, si la molécule à mesurer fait partie d'un mélange, des interactions peuvent
se produire entre les différents composés et modifier les potentiels d'oxydoréduction et
la hauteur des pics. Par exemple, si on ajoute de la quercétine à la luteoline, les pics de
chacun apparaissent, mais la hauteur des pics d'oxydation n'est pas cumulative et les
pics de réduction diminuent (Fig. 2.15). L'étude des voltammogrammes de deux
composés n'est pas simple, maIS il est encore plus difficile, voire impossible
d' interpréter les voltammogrammes de mélanges complexes comme les extraits de
feuilles.
O.18x1o-5
O.13x1CT5
O.07x1o-5
< O.02x1CT5
-O.03x1o-5
-O.08x10-5
-O.13x1o-5
-0.50 -0.25 0 0.25 0.50 0.75
E/V
Figure 2.15: Voltammogrammes de la lutéoline (courbe 2), de la quercétine (courbe 3) et d'un mélange de lutéoline et de quercétine (1 :1) (courbe 1) dans un tampon PBS à un pH de 5,1 (Filipiak 2001).
CHAPITRE III
PROTECTION AGAINST ACUTE PHOTOOXIDATIVE STRESS BY THE OXIDATION OF A POOL OF POL YPHENOLS IN SILVER MAPLE LEA VES
(ACER SACCHARlNUML.)
3.1 Résumé en français
Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires connus pour leurs
propriétés antioxydantes dans la plante alors que ceux qui ont un pouvoir antioxydant
élevé s'accumulent lors de stress oxydants. En dépit de ces évidences circonstancielles,
le pouvoir antioxydant des composés phénoliques dans la plante reste sujet au débat et
nécessitent davantage de preuves expérimentales. Dans cette étude, nous avons cherché
à caractériser et corréler l'oxydation des composés phénoliques avec les dommages
photo synthétiques induits lors d'une période de forte intensité lumineuse chez des
feuilles d'érable argenté (Acer saccharinum L.) infiltrées ou non par du
méthylviologène (MV). Comme prévu, les résultats montrent que le MV augmente la
photo inhibition du photo système II (diminue le FvlFm). Seulement pour les plants
traités au MV, nous avons observé une petite, mais significative (15 %) diminution de
la concentration des composés phénoliques estimée par absorbance UV et par la
méthode de Folin-Ciocalteu. Cette diminution a lieu dans les premières 60 à 120 min
d'illumination. L'analyse des propriétés d'oxydoréduction de l'extrait méthanolique de
feuille d'érable par voltammétrie cyclique indique que la diminution de la concentration
des composés phénoliques est attribuable à l'oxydation d'un petit groupe de composés
phénoliques ayant un faible potentiel d'oxydoréduction « 400 mV, pH 5,8, mesuré par
rapport à une électrode de référence Ag/AgCI) avec deux pics d'oxydation près de 170
et 350 mV. Ce qui est particulièrement intéressant, c'est que l'oxydation de ce groupe
de composés phénoliques précède l'accélération des dommages non-spécifiques sur
l'appareil photo synthétique estimés par la dégradation de la chlorophylle. Ces
observations suggèrent que ces composés phénoliques seraient utilisés comme
antioxydants et protègeraient la plante contre les dommages photooxydants. Nous
discuterons aussi de la nature des composés phénoliques oxydés suite à l'illumination
des feuilles.
3.2 Article
Protection against acute photooxidative stress by the oxidation of a pool of
polyphenols in silver maple leaves (Acer saccharinum L.)
Mélanie Boutour and Guy Samson *
Groupe de Recherche en Biologie Végétale, Université du Québec à Trois-Rivières,
C.P. 500, Trois-Rivières QC, Canada G9A 5R7
*Corresponding author :
Département de Chimie-biologie,
Université du Québec à Trois-Rivières,
C.P. 500, Trois-Rivières QC, Canada G9A 5R7
Tél. : 819-376-5011, ext. 3374
FAX: 819-376-5084
Email: [email protected]
29
30
Abstract
Polyphenols (PPs) are secondary metabolites reputed to act as antioxidant in plants
since they accumulate under oxidative stress and many of them have strong antioxidant
capacities. Despite these circumstantial evidences, the pp putative antioxidant function
in planta remains a matter of debate and needs to be further supported experimentally.
In this study, we aimed to characterize and correlate the oxidation of PPs with
photooxidative damages induced during intense illumination in silver maple leaves
(Acer saccharinum L.) infiltrated or not with methylviologen (MV). The results showed
that MV enhanced as expected the extent of Photo system II photo inhibition (lower
FvlFm). We detected only in MV-treated leaves small but significant decreases (15%)
of pp concentrations estirnated by UV absorbance of chlorophyll-Iess spectra. These
decreases occurred during the first 60 to 120 min of intense illumination. Analyses by
cyclic voltarnmetry of the redox profile of methanolic leaf extracts indicated that the
lowered concentrations of PPs were due to the oxidation of a small pool of PPs
characterized by low redox potentials « 400 mV, pH 5.8), with oxidation peaks near
170 and 350 m V. Interestingly, the oxidation of that small pool of PPs shortly preceded
the acceleration of non-specific photo damages to the photosynthetic apparatus
estirnated by chlorophylliosses. These observations suggest that a pool of PPs served
as antioxidants that are oxidised prior to the components of the photosynthetic
apparatus, thereby protecting it against photooxidative damage. The nature of the PPs
oxidised in our MV -treated leaves is discussed.
Abbreviations:
AsA, ascorbate; APX, ascorbate peroxidases; Chl, chlorophyll; DHA,
dehydroascorbate; EC, epicatechin; ECG, epicatechin gallate; EGC, epigallocatechin;
EGCG, epigallocatechin gallate; Fv/Fm, the maximum photochemical yield of
photosystem II; GSH, gluthatione; GuPX, guaiacol peroxidases; MDA,
monodehydroascorbate; MV, methylviologen; OEC, oxygen evolving complex; PPs,
polyphenols; PSII and PSI, photosystem II and I; ROS, reactive oxygen species.
31
Introduction
Energy conversion by photosynthetic electron transport chains unavoidably produces
reactive oxygen species (ROS) as byproducts. Under environmental conditions such as
mineraI deficiencies and low temperatures where absorbed light energy exceeds the
capacities of the Calvin cycle and of the regulated non-photochemical energy
quenching, the increased production of ROS may overwhelm the capacity of the
scavenging ROS system. This excess of ROS causes the oxidation of target mo1ecules
leading to the photoinhibition of the photosynthetic apparatus (Foyer et al. 1994, Long
et al. 1994, Murata et al. 2007). Recent results indicate that the extent of
photo inhibition depends on the balance between the rate of photo damages of
photo system II (PSII) and the rate of PSII repair: whereas the rate of PSII photo damage
is linearly related to the amount of absorbed light, PSII repaîr rate is variable as it
decreases in presence of chloroplastic ROS produced under sub-optimal environmental
conditions (Sarvikas et al. 2006, Murata et al. 2007, Takahashi et al. 2010).
Because of their high reactivity, ROS generated under light stress must be
scavenged near their site of production, prior to their diffusion toward target molecules.
To this end, chloroplasts possess efficient stromal and thylakoical scavenging systems.
In brief, superoxide O2'- is disproportionated by superoxide dismutases into hydrogen
peroxide, whose reduction by ascorbate (AsA) is catalyzed by ascorbate peroxidases
(APX). The resulting monodehydroascorbate radical (MDA) is reduced either by
ferredoxin in photo system 1 (PSI) or by NADPH in the stroma in a reaction catalyzed
by MDA reductase. Altematively, MDA may spontaneously disproportionate to
dehydroascorbate (DHA) that will be reduced to AsA by gluthatione (GSH) with the
help of the DHA reductase (Asada 1999).
Complementary to the AsAiGSH scavenging systems, plant polyphenols (PPs)
could also contribute to the photoprotection of the photosynthetic apparatus. This role
is inferred first by the increase of PP content commonly observed in plants under
photoinhibitory conditions (e.g. high light, low temperatures, N deficiency) (Dixon and
Paiva 1995, Edreva 2005), and also, by the spectral properties and antioxidant capacity
of PPs. Sorne PP s, the anthocyanins, are non-photosynthetic pigments that can
accumulate in leaves and stems of sorne species to absorb a fraction of incident light
32
intensity that would be otherwise in excess to the requirements of the light reactions of
photosynthesis. There is however a lasting debate concerning the light screening
function of anthocyanins, which remains unsettled as recent observations strongly
support (Gould et al. 2010) and infer (Nikiforou and Manetas 2010, Nikiforou et al.
2010) this hypothesis.
Concerning the photoprotective function of PPs based on their antioxidant
capacities, it is noteworthy that many PPs are stronger antioxidants than AsA on a
molar basis (Rice-Evans 2001) and close linear correlations between pp concentrations
and total antioxidant capacities in different plant extracts were reported (Cai et al. 2004,
Yaakoubi et al. 2010). AIso, a model was proposed (Yamasaki et al. 1997, Sgherri et al.
2003) where class III peroxidases (guaiacol peroxidases, GuPX) oxidize PPs in cell
vacuoles to scavenge H202 that can diffuse owing to its long lifetime within the cell or
even within the leaf. Then, oxidised PPs can be re-reduced either directly by AsA
(Sgherri et al. 2003) or in a reaction catalyzed by monodehydroascorbate reductase
(Sakihama et al. 2000). Even if most of the PPs in leaves are present in vacuoles of
epidermal cells (Yamasaki et al. 1997), thus far from the main sites of ROS production,
their presence also in chloroplasts is well documented (Saunders and McClure 1976,
Zaprometov and Nikolaeva 2003) and scavenging of singlet oxygen e02) by
chloroplast-located PPs (flavonoids) was demonstrated in cross-sections of Phillyrea
latifolia leaves (Agati et al. 2007).
Despite accumulating observations, the physiological importance of the pp to
scavenge ROS is still a matter of debate (Hemandez et al. 2008, Almagro et al. 2009),
particularly in regard to their ability to protect against photooxidative damages. As
pointed out by Hemandez et al. (2008), observations showing correlations between
oxidative stress occurrence with the changes of pp concentrations and of their oxidation
status are needed to support the relevance of PPs as antioxidants in planta. Therefore,
our objectives in this report were to characterize and correlate the oxidation of PPs with
the photooxidative damages in silver maple leaves infiltrated with and without
methylviologen (MY). Our results indicated that intense illumination of MY -treated
sil ver maple leaves caused the oxidation of a small pool of PPs characterized by low
33
redox potential « 400 mV, pH 5.8) that preceded the acceleration of non-specifie
photo damages estimated from chlorophylliosses.
Material & methods
Silver maple leaves (Acer saccharinum L.) developed under full sunlight were sampled
from trees growing on our campus. Shortly after sampling, leaves were infiltrated under
vacuum with water containing 0 or 0,5 mM MV. Then, leaves with their petiole
maintained in water were exposed to an intense blue light (2800 ~moles photons
m-2 S-l) provided by a 20 x 20 cm LED panel SL 3500-B (PSI Instrument, Czech Rep.).
After different times of illumination, leaves were maintained in the dark for
40 min and then the extent of photo inhibition was estimated by the Chl-a fluorescence
ratio Fv/Fm (corresponding to the maximum photochemical yield of photo system II,
PSII) measured with a Xe-PAM (Walz, Germany). To estimate the extents of
photodamage non-specifie to the PSII reaction centers, leaf chlorophyll a+b were
extracted by two successive incubations of 30 min in pure methanol at 70°C, and their
concentrations measured according to Lichtenthaler (1987).
Concentrations of soluble PPs were frrst estimated from their contribution to the
UV absorbance spectra of the methanolic extracts used to measure the Chls a+b
concentrations. Based on Chl concentrations in each sample and on spectra of pure Chls
a and b previously measured in methanol, the total Chl a+b spectrum was calculated
and subtracted from the crude extract absorption spectrum as in Ounis et al. (2001). The
resulting Chl-Iess spectrum corresponds to the UV absorbance of the PPs, whose
concentration was estimated from the absorbance value at 262 nm.
Concentrations of soluble PPs present in the same leaf samples used to measure
Chl concentrations and UV absorbance spectra were also estimated by the Folin
Ciocalteu colorimetrie method as in Cai et al. (2004). Following the two successive
extractions in 10 ml of methanol at 70°C for 20 min, a third incubation of the leaf
material was made in 50% methanol for 30 min at room temperature. The filtered
extracts were combined and then PPs in a sample were oxidized with 0.2 N Folin
Ciocalteu reagent. Five min later, the reaction was neutralized with saturated sodium
carbonate (200 g L-1). After incubation for 2 hrs at room temperature, the sample was
34
centrifuged and the absorbance was measured at 760 nm. pp quantification was based
on a standard curve made with tannic acid. Results were expressed as mg of tannic acid
equivalent per cm2 of leaf area.
The redox profiles of the soluble PPs in a sample of the same methanolic/water
leaf extracts used in the Folin-Ciocalteu method were characterized by cyclic
voltammetry. Voltammograms were recorded from 70 to 1200 mV at a scanning rate of
50 mV S-1 with a potentiostat (model 362, Princeton Appl. Res. USA), using a glassy
carbon electrode (BAS MF-2012, 3 mm diameter). Before each measurement, the
electrode was gently polished with an aluminum powder solution and then sonicated,
both for 2 min. The potentials were measured versus an Agi AgCI reference electrode
and the CUITent of the buffer solution was subtracted. Samples (2 ml) were placed in a
cell with an equal volume of 100 mM phosphate buffer containing 5 mM KCl. The
fmal pH was adjusted to 5.8. In addition, voltammograms of pure compound solutions
(all from Sigma-Aldrich) were recorded similarly as leaf extracts: catechins and
ascorbate were dissolved in pure methanol and quercetin was dissolved in methanol
with 1.5% acetone.
To detect effects of MV and illumination time on the measured parameters,
ANOVAs were performed with SYSTAT Il (SPSS, Chicago IL). When the MV effect
was significant (p < 0.05), mean comparisons (with and without MV) for each
illumination time were made by a two-sample t-test. The analyses are based on 3 to
6 replicates.
Results
The presence of MV in infiltrated maple leaves significantly increased the extents of
photo inhibition, as seen by the larger decreases of the PSU maximum photochemical
yield (FvlFm) in illuminated MV -treated leaves relative to MV -untreated leaves
(Fig. 1). In the latter, no general photooxidative damages to the photosynthetic
apparatus (non-specific to the PSU reaction centers) were apparent as Chla+b
concentrations remained unaffected by up to 240 min of light treatrnent (Fig. 2). In
MV -treated leaves, there were significant losses of Chla+b, which became apparent
only after the first 2 hrs of illumination.
35
To determine if the intense illumination under our experimental conditions
affected the PPs in silver maple leaves, we first examined the Chl-Iess UV absorbance
spectra of methanolic extracts made from MY -untreated and in MY -treated leaves (see
Material and methods). AlI the calculated UV spectra had a major peak near 278 nm
and a minor one around 350 nm (results not shown), suggesting that the main PPs in
our extracts from silver maple leaves were glycosylated flavanones (Cerovic et al.
2002). pp concentrations in our extracts were estimated by measuring the absorbance at
262 nm, away from the peak at 278 nm to avoid saturation of the signal in sorne
samples. During the photoinhibitory treatment, the concentrations of soluble PPs
remained constant in MV -untreated leaves whereas it decreased slightly but
significantly in MV -treated leaves (Fig. 3A). In those leaves, most of the absorbance
decreased within the first hour of treatment, and thereafter it decreased at a slower rate.
To support these changes in UV absorbance, we also estimated the pp concentrations in
methanol-water extracts made from the same leaves by the Folin-Ciocalteu method.
The results shown in Fig.3B are similar to those observed by the absorbance at
262 nm. However, the ANOVA did not detect significant effect of neither MY nor of
the illumination time on the pp concentrations estimated by the Folin-Ciocalteu
method, even if the values from the MY -treated leaves seemed to decrease during the
first hour by about 15% of the initial value.
The observed decreases of PPs concentrations detected in MY -treated leaves
suggest the oxidation of PPs in those leaves during illumination. To verify this
possibility, we characterized by cyclic voltammetry the redox profiles of samples from
the same extracts used to estimate pp concentration by the Folin-Ciocalteu method.
Fig.4A presents an averaged voltammogram of crude methanolic extracts (pH 5.8)
from untreated silver maple leaves. AlI the voltammograms showed a major oxidation
wave around 600 m V accompanied by minor waves near 170, 350, and 750 m. There
was no reduction wave, indicating that the oxidised PHENs by the electrode rapidly
reacted in solution and could not be re-reduced (Makhotkina and Kilmartin 2009).
Examination of the voltammograms of extracts from leaves infiltrated with or
without MY indicates that the intense illumination affected the redox profiles between
o and 400 m V (i.e. compounds more easily oxidised), but not between 400 and 850 m V
36
(i.e. compounds requiring higher potential to be oxidised, see below) : compared to the
averaged voltammogram from intact leaves (not exposed to high light), 4 hrs of intense
illumination caused a decrease of the current signal profiles between 0 and 400 m V in
extracts from MV -treated leaves exposed to 4 hrs of intense illumination whereas the
current increased slightly in extracts from MV -untreated leaves (Fig. 4B). More
specifically, differences between the voltammograms related to MV-untreated and
MV -treated leaves after 4 hrs of illumination show a main current wave 350 m V and a
minor one near 170 m V (Fig. 4C).
To better quantify the effects of intense illumination and MV on the redox
profiles of leaf extracts, we estimated the amount of reducing equivalents (~C=~As)
having redox potentials between 70 and 400 m V (Q70-400) and those between 400 and
850 m V (Q400-850) by dividing the selected area under the curve (~Am V) with the scan
rate (50 mVs-1) (Kilmartin et al. 2001). In agreement with Fig. 4B, the values ofQ7o-400
significantly decreased during illumination in MV -treated leaves (by about 22%
relative to 0 min) whereas it slightly increased (by about 21 %) in MV-untreated leaves
(Fig. SA). In contrast, the Q400-850 values remained constant during illumination in both
MV -untreated and MV -treated leaves (Fig. SB). It is noteworthy that the Q400-850 values
are about ten times larger than those of the Q70-400.
In attempt to identify the nature of the most likely compound that was oxidised
during the photooxidative stress of silver maple leaves, we measured the
voltammograms of pure solutions of possible antioxidants having among the lowest
redox potentials as found in the literature (Kilmartin et al. 2001): AsA, quercetin (a
flavonol), and 4 different catechins (flavane-3-ols) (Fig. 6). Under our experimental
conditions, AsA (0,1 mM) showed a single oxidation peak near 177 mV whereas the
flavonoids (quercetin and catechins) had two or three peaks. At potentials lower than
400 mV, the oxidation ofthe catechol moiety (2 ORs on the B ring) is associated to the
observed CUITent peaks near 275 m V of quercetin and of epicatechin (EC) whereas for
the epigallocatechin (EGC) and epigallocatechin gallate (EGCG), the frrst current peak
near 200 mV is related to the pyrogallol moiety (3 ORs on the B ring). Interestingly,
EGCG shows also a second peak, at 317 m V, cOITesponding to the oxidation of the
gallate group. In case of the epicatechin gallate (ECG), the oxidations of the gallate and
37
the catechol moieties occur at similar potentials, resulting in a broad oxidation wave
near 350 m V. Concerning the current waves observed at potentials higher than 650 m V
for the five flavonoids, they can be attributed to the oxidation of the resorcinol moiety.
We also measured the voltarnmograms of the hesperitin (and its glycosylated
form hesperidin), that are representative of the flavonones, believed to be the dominant
polyphenol group in our extracts based on their similarities of their UV -absorbance
spectrum. As expected from their chemical structure (presence and absence of the
resorcinol and catechol moieties respectively), we observed only a large current wave
between 650 and 800 for these two compounds (results not shown).
In short, among the different compounds tested, only EGCG displays two
oxidation peaks at low potential (208 and 315 m V), which are close but still different to
the oxidation peaks (170 and 350 m V) of the unknown compound photooxidized in
MV -treated silver maple leaves.
Discussion
Photoprotection of the photosynthetic apparatus is a multifaceted concept, in which
plant PPs may play different roles, notably the scavenging of chloroplastic ROS. We
aimed to better support this function by demonstrating the presence of a temporal
relationship between photooxidative damages and pp oxidation in silver maple leaves
exposed to intense blue light in presence or not of MV. The results presented here
showed that MV enhanced as expected the extent of PSU photo inhibition (lower
FvlFm) and the losses of Chla+b, an indication of general photodamage to the
photosynthetic apparatus. These MV effects were accompanied by a significant
oxidation of a small pool of PPs, as demonstrated by cyclic voltammetry of leaf
extracts. Importantly, most of the PP oxidation occurred during the first 60 or 120 min,
after which the rate of chlorophyll losses markedly increased. These observations
suggest that a pool PPs served as antioxidants that are oxidised prior to the components
of the photosynthetic apparatus, thereby protecting it against photooxidative damage.
The oxidation of PP observed by cyclic voltammetry was supported by the decreases of
PP concentrations estimated by UV- absorbance and by the Folin-Ciocalteu method.
38
Indeed, oxidised pp have lower absorbance peaks in the UV (Timbola et al. 2006) and
of course they cannot reduce the F olin-Ciocalteu reagent (Appel et al. 2001).
These results should be considered in a context where PPs could complement the
antioxidant function of AsA and GSH. OUr photoinhibitory treatment caused the
oxidation of PPs only in leaves treated with MV. The latter is known to intercept
electrons from PSI and to catalyze the photoreduction of O2 (Lawlor 1995). Mano et al.
(2001) demonstrated that the primary effects of MV were the inactivation of the
chloroplastic APX isoforms. Then, rapid accumulation of H20 2 under these conditions
caused the inactivation of superoxide dismutase and NADP+ -glyceraldehyde
3-phosphate deshydrogenase. Interestingly, GuPx and the photosynthetic electron
transport chain (notably Fv/Fm) were by far less sensitive to H202 than the APX
isoforms. This indicates fust that during an acute photooxidative stress induced by
intense light plus MV, both higher production rate ofH202 and the inactivation of APX
provided the conditions in which PPs can act as antioxidants. These observations,
considered in the new paradigm of photo inhibition (Nishiyama et al. 2006, Takahashi
and Murata 2008), also indicate that the larger decreases of Fv/Fm observed in MV
treated silver maple leaves is most likely due to the inactivation of PSII repau
mechanisms by ROS rather than their direct effects on PSII reaction centers.
Besides their role as antioxidants that can contribute to protect the photosynthetic
apparatus against ROS, PPs have also a well-established role as UV -screening in leaf
epidermis. This photoprotective function of PPs was clearly demonstrated by the use of
mutants or transgenic plants having depressed or enriched levels of PPs (flavonoids or
hydroxycinnamic acids), which determined plant' s UV -sensitivity (growth inhibition
and DNA lesions) (reviewed in Edreva 2005). In addition to the protection against these
general UV deleterious effects, PPs in leaf epidermis could play a more specific role by
protecting PSII. Indeed, it was demonstrated that the action spectrum of photo damage
does not correspond to the absorbance spectra of chlorophylls and carotenoids but
rather to that of Mn compounds present in the PSII oxygen evolving complex (OEC):
flat in red and green regions of the spectrum and it increases in the blue to reach a
maximum in the UV (Sarvikas et al. 2006, Murata et al. 2007). Since Mn compounds in
OEC (Sarvikas et al. 2006) and PPs (Cerovic et al. 2002) have sirnilar absorbance
39
spectra, and since pp concentrations in leaves and leaf epidermal UV -absorbance both
increase linearly with the ambient light intensity (Bidel et al. 2007), then we can
suggest that pp accumulation in leaf epidermis is a significant plant response against
blue-UV induced PSI! photodamages.
The use of cyclic voltammetry in this study was useful to characterize the
oxidation of a specific pool of PPs in leaves exposed to acute photooxidative stress.
Firstly, comparison of the voltammograms of methanolic extracts from photoinhibited
leaves infiltrated or not with MV indicated that only PPs with low midpoint redox
potentials « 400 mV) were oxidized in presence of MV. Naturally, these PPs were
more susceptible to oxidation than those having higher redox potentials (400-850 m V).
And since these PPs with high redox potentials were about ten times more abundant
that the low potentials PPs, we may suggest that the high potential PPs correspond to
the larger pool that is located in the epidermis (Yamasaki et al. 1997). Their primary
function would be to shield the mesophyll against the deleterious effects of incident UV
radiations. On the other hand, the small pool of low redox potential PPs would be
present mostly in the mesophyll, where they would be more likely involved in ROS
scavenging.
Secondly, the use of cyclic voltammetry provided a hint about the nature of the
compounds oxidised during the photoinhibitory treatment in MV -treated silver maple
leaves. The difference between the voltammograms from photoinhibited leaves
infiltrated or not with MV indicated that the oxidized PPs were characterised by a main
oxidation peak near 350 m V and a minor one near 170 m V. When compared to the
voltammograms of the main antioxidants in plants known to have the lowest redox
potentials « 400 mV at pH 5.8) (Kilmartin et al. 2001), it appeared that EGCG, with its
two oxidation peaks at 208 and 315 m V, was the closest to our unknown oxidised
compound. Although EGCG is best known to be abundant in tea leaves, its presence in
silver maple leaves is likely. lndeed, the presence of catechins in maple syrup was
reported (Abou-Zaid et al. 2008) and its was recently shown that methyl gallate is a
natural constituent of maple (genus Acer) leaves (Abou-Zaid et al. 2009). AIso,
chemical evidences were provided of the presence in leaves of Acer rubrum L. of
glycosylated O-galloyl moiety. Finally, the maximum UV absorbance of EGCG at
40
275 nm (data not shown) is close to the one observed in the Chl-Iess UV absorbance
spectra of our samples. Besides EGCG, another possibility would be a concomitant
decrease of AsA (oxidation peak at 177 m V) and ECG (broad oxidation peak around
350 mV).
Even though the voltarnmogram of EGCG is the most similar to that of the
unidentified oxidised compound, their oxidation peaks still differ substantially. In
contrast to absorbance spectra, voltarnmograms from complex mixtures like leaf
extracts, teas or wines are not the sum of their different components (Makhotkina and
Kilmartin 2009). Detailed interpretation of those voltarnmograms is complicated
notably by the adsorption of PPs at the electrode surface and by possible interactions in
solution between reduced compounds and those that have been oxidised by the
electrode. For instance, the presence of pp in wines and orange juice impedes the
oxidation at the electrode of AsA, which occurs at an "overpotential" relative to its real
potential (Kilmartin et al. 2008). AIso, sul fur dioxide increased the anodic (oxidative)
current and decreased the cathodic current for different PPs and wines, indicating a
rapid interaction of S02 with the oxidized pp quinones (Makhotkina and Kilmartin
2009).
Cyclic voltammetry is a method that is widely used to characterize the redox
properties of pure compounds and also to estimate the antioxidant capacity of plants
extracts (Naik et al. 2003, Neill et al. 2002a, b) or other complex mixtures such as teas
(Kilmartin and Hsu 2003), wines (Kilmartin et al. 2001), and even human plasma
(Chevion and Chevion 2000). Here we showed that cyclic voltarnmetry can also be
useful in plant stress physiology by characterizing the oxidation of PPs in silver maple
leaves exposed to an acute photo-oxidative stress. It will be interesting in future studies
to characterize the changes of pp redox properties in plants during their acclimation to
chronic and sub-Iethal oxidative stresses. These stresses commonly cause the
accumulation of PPs in plants (Dixon and Paiva 1995), and may also change in their
composition. For instance, in plants exposed to high light, water stress, and/or low
temperatures may preferentially accumulate quercetin (Tartini et al. 2004, Edreva 2005)
or anthocyanins (Close and Beadle 2003). These compounds with their catechol moiety
41
(o-dihydroxy in the B-ring) are strong antioxidants. How these preferential
accumulations affect the overall antioxidant capacity remains to be determined.
Acknowledgments
We are grateful to Dr. Benoit Daoust for helpful discussions concerrung cyc1ic
voltarnmetry. This study was supported by a Discovery Gant from the Natural Sciences
and Engineering Research Council (NSERC) of Canada.
42
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47
Figures legends
Fig. 1. The maximum photochemical yield of photo system II estimated by the ratio
Fv/Fm measured in dark adapted leaves of Acer saccharinum L. infiltrated with 0 mM
(open cirles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after different
illumination times. ANDV A indicates that both factors had significant effects on Fv/Fm
(p:S 0.001). More specifically, mean comparisons (MV-untreated vs MV-treated) made
by two-sample t-tests indicate the presence of significant differences at 60 (p=0.026)
and 240 min (p=0.047) of illumination.
Fig. 2. Chlorophyll a+b concentrations in Acer saccharinum L. leaves infiltrated with
o mM (open circles) and 0.5 mM methyviologen (MV, close circles) after different
illumination times. ANDVA indicates that the MV effect is significant (p :s 0.001).
Mean comparisons (MV-untreated vs MV-treated) made by two-sample t-tests indicate
the presence of significant differences at 240 min of illumination (p=0.011) .
Fig. 3. Concentrations of soluble phenolic compounds of Acer saccharinum L. leaves
infiltrated with 0 mM (open circles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles)
after different illumination times. A) Concentrations estimated by UV absorbance at
262 nm of chlorophyll-Iess spectra. ANDV A indicates that the MV effect is significant
(p = 0.003). Mean comparisons (MV-untreated vs MV-treated) made by two-sample
t-tests indicate the presence of significant differences at 120 min (p=0.006) and
240 min (p=0.006). B) Concentrations estimated according to the Folin-Ciocalteu
method. ANOV A indicates no significant effect of MV and illumination time.
Fig. 4. A) Mean cyclic voltammogram between 0 and 1200m V (background subtracted)
of methanolic extracts from untreated Acer saccharinum L. leaves, measured at a scan
rate of 50 mV S-l with a 3 mm glassy carbon electrode in phosphate buffer, pH 5.8.
B) Mean voltammograms between 0 and 400 m V (background subtracted) of
methanolic extracts from Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM (open
circles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after 240 min of illumination.
C) Difference between the mean voltammograms of methanolic extracts from
48
Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM and 0.5 mM methylviologen after
240 min of illumination.
Fig. 5. Numbers of reducing equivalents A) between 70 and 400 m V (Q70-400) and
B) between 400 and 850 m V (Q4oo-850) calculated from the voltammograms of
methanolic extracts of Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM (open circles)
and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after different illumination times.
ANOVA indicates that the MV effect is significant (p = 0.004) for Q70-400 but not for
Q400-850. Mean comparisons (Q70-400 of MV -untreated vs MV -treated) made by
two-sample t-tests indicate the presence of significant differences at 240 min (p=0.022).
Fig. 6. Mean cyclic voltammograms of 0.1 mM (a) epicatechin, (b) epicatechin gallate,
(c) epigallochatechin, (d) epigallocatechin gallate, (e) ascorbate and (t) quercetin.
Voltammograms were measured at a scan rate of 50 mV S-1 with a 3 mm glassy carbon
electrode in phosphate buffer, pH 5.8. The background was subtracted.
49
1,0
0,8 - ~
0,6 -i
~ E LL -> LL 0,4 .~
0,2 -
0,0 1
a 60 120 180 240
Illumination time (min)
Fig. 1. The maximum photochemical yield of photo system II estimated by the ratio Fv/Fm measured in dark adapted leaves of Acer saccharinum L. infiltrated with 0 mM
(open cirles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after different illumination times. ANOV A indicates that both factors had significant effects on Fv/Fm (p:S 0.001). More specifically, mean comparisons (Mvuntreated vs MV-treated) made by two-sample t-tests indicate the presence of significant differences at 60 (p=0.026)
and 240 min (p=0.047) of illumination. 295x217mm (96 x 96 DPI)
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Illumination time (min)
Fig. 2. Chlorophyll a+b concentrations in Acer saccharinum L. leaves infiltrated with o mM (open circles) and 0.5 mM methyviologen (MV, close circles) after different illumination times. ANOVA indicates that the MV effect is significant (p:::; 0.001).
Mean comparisons (MV-untreated vs MVtreated) made by two-sample t-tests indicate the presence of significant differences at 240 min of illumination (p=0.0 Il).
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(b)
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Illumination time (min)
51
Fig. 3. Concentrations of soluble phenolic compounds of Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM (open circles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after different illumination times. A) Concentrations estimated by UV absorbance at
262 nm of chlorophyll-Iess spectra. ANOVA indicates that the MV effect is significant (p = 0.003). Mean comparisons (MV-untreated vs MVtreated) made by two-sample ttests indicate the presence of significant differences at 120 min (p=0.006) and 240 min
(p=0.006). B) Concentrations estimated according to the Folin-Ciocalteu method. ANOV A indicates no significant effect of MV and illumination time.
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Potential (mV)
52
Fig. 4. A) Mean cyclic voltammogram between 0 and 1200m V (background subtracted) of methanolic extracts from untreated Acer saccharinum L. leaves, measured at a scan rate of 50 m V s-1 with a 3 mm glassy carbon electrode in phosphate buffer, pH 5.8.
B) Mean voltammograms between 0 and 400 m V (background subtracted) of methanolic extracts from Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM (open
circles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after 240 min of illumination. C) Difference between the mean voltammograms of methanolic extracts from
Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM and 0.5 mM methylviologen after 240 min of illumination.
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Illumination time (min)
53
Fig. 5. Numbers of reducing equivalents A) between 70 and 400 m V (Q70-400) and B) between 400 and 850 m V (Q400-850) calculated from the voltammograms of
methanolic extracts of Acer saccharinum L. leaves infiltrated with 0 mM (open circles) and 0.5 mM methylviologen (MV, closed circles) after different illumination times.
ANOVA indicates that the MV effect is significant (p = 0.004) for Q70-400 but not for Q400-850. Mean comparisons (Q70-400 of MV -untreated vs MVtreated) made by two
sample t-tests indicate the presence of significant differences at 240 min (p=0.022). 214x295mm (96 x 96 DPI)
4~----------------------~
3
~2 ::l -ë 1 ~ .... ::l 0 ()
-1
(a) epicatechin
-2~--~--~--~---L--~--~
3.---------------------------, (c) epigallocathechin
2 ~ ::l -ë 1 ~ .... ::l
() 0 ~!.",-----
2~----------------------~ (e) ascorbate
~1 ::l --c ~ ....
<3 0
54
6.----------------------------, 5 (b) epicatechin gallate
4
3
2
o -1
-2~--~--~--~--~---L--~
4~------------------------, (d) epigallocatechin gallate
3
2
o ~:.--------
5.---------------------------,
4 (f) quercetin
3
2
o -1 -1 L..-__ -'---__ -'--__ -'-__ --'-__ --'-__ ---'
o 200 400 600 800 1 000 1200 0
Potential (mV)
200 400 600 800 1000 1200
Potential (mV)
Fig. 6. Mean cyclic voltarnmograms of 0.1 mM (a) epicatechin, (b) epicatechin gallate, (c) epigallochatechin, (d) epigallocatechin gallate, (e) ascorbate and (f) quercetin.
Voltammograms were measured at a scan rate of 50 m V s-1 with a 3 mm glassy carbon electrode in phosphate buffer, pH 5.8. The background was subtracted.
268x293mm (96 x 96 DPI)
CHAPITRE IV
EFFET DE LA CONCENTRATION ET DE L'AJOUT D'EXTRAIT DE FEUILLES D'ÉRABLE SUR L'OXYDATION DE L'ACIDE ASCORBIQUE ET
DE L'ÉPIGALLOCATECHINE GALLATE MESURÉE PAR VOLTAMMÉTRIE
4.1 Introduction
En raison de leur pouvoir antioxydant, les composés phénoliques des plantes présentent
un intérêt en alimentation pour la prévention des cancers et des troubles
cardiovasculaires (Hertog et coll. 1993). En effet, les composés phénoliques contribuent
à la relation inverse entre la consommation de fruits et de légumes et l'incidence de ces
maladies (Foyer et Noctor 2009).
Il est étonnant de constater que malgré l'effet bénéfique reconnu de leur pouvoir
antioxydant sur la santé humaine, il existe toujours un débat sur l' importance
physiologique in planta du pouvoir antioxydant des composés phénoliques dans la
défense des plantes contre les dommages oxydants engendrés lors de stress
environnementaux. Pourtant, il est admis que plusieurs composés phénoliques ont, sur
une base molaire, une capacité antioxydante supérieure à celle de l' acide ascorbique
(Rice-Evans 2001). Il est d'ailleurs bien documenté que la concentration des composés
phénoliques augmente dans les végétaux soumis à divers stress environnementaux
(Dixon et Paiva 1995). De plus, considérant que certaines peroxydases (classe III, ou
guaïacol peroxidase) sont capables de dégrader le H20 2 en utilisant des composés
phénoliques comme donneur d' électrons (c.-à-d. antioxydants) (Almagro et coll. 2009;
Foyer et Noctor 2009), un modèle physiologique a été proposé dans lequel le H20 2 peut
diffuser hors des chloroplastes pour être dégradés dans les vacuoles des cellules du
mésophylle et même de l'épiderme (Sgherri et coll. 2003; Yamasaki et coll. 1997).
Cependant, des revues récentes maintiennent que l' importance physiologique de ces
réactions demeure incertaine (Almagro et coll. 2009; Hermindez et coll. 2008).
Une des évidences expérimentales toujours manquante qui pourrait supporter le
rôle in planta du pouvoir antioxydant des composés phénoliques est la caractérisation
56
des changements de leurs propriétés d'oxydoréduction causés par les stress
environnementaux. Tel que démontré au chapitre précédent, les stress oxydants aigus
peuvent causer une oxydation des composés phénoliques à un taux supérieur à leur re
réduction ou leur resynthèse. Lors de stress chroniques, mais modérés, tels les fortes
intensités lumineuses et le stress hydrique, il y a non seulement une augmentation
globale de la concentration de composés phénoliques dans les plantes (Dixon et Paiva
1995), mais aussi une accumulation de composés comme la quercétine (Tattini et coll.
2004) et les anthocyanines (Gould et coll. 2010), réputées comme excellents
antioxydants de par leur groupement catéchol (o-dihydroxybenzène).
Les méthodes traditionnelles de mesure de la capacité antioxydante comme celles
impliquant le réactif Folin-Ciocalteu ou le radical stable ABTS en équivalent trolox
(TEAC), permettent seulement de mesurer la quantité de composés phénoliques ou de
groupements phénoliques pouvant être oxydés par le réactif utilisé, donc à un potentiel
d' oxydoréduction donné (Appel et coll. 2001). Au contraire, la voltammétrie, encore
peu utilisée en physiologie végétale, est une méthode électrochimique qui permet
d'obtenir un «spectre» des potentiels d'oxydoréduction des différents composés
présents en solution (Chevion et Chevion 2000). La voltammétrie est une méthode
rapide et relativement peu coûteuse par laquelle un courant positif (ou négatif) produit
suite à l'oxydation (ou la réduction) de composés en solution est mesuré selon le
potentiel appliqué sur l'électrode qui varie à un taux constant (ex. 50 mV S-l). La
courbe du courant mesuré en fonction du potentiel appliqué sur l'électrode
(voltammogramme; voir Fig.4a chap.3) montre généralement un ou plusieurs pics
(anodiques) correspondant à l'oxydation d'un composé. La hauteur du pic (~) dépend
du nombre d'électrons captés par l'électrode à un potentiel donné, et est donc fonction
de la concentration du composé oxydé. Quant à la position du pic, elle correspond à son
potentiel d'oxydation (m V), c'est-à-dire le potentiel nécessaire pour qu'un électron soit
transféré. Plus le pic apparaît à un bas potentiel, plus le composé donne facilement un
électron et plus forte est sa capacité antioxydante (Kilmartin 2001 b). Lorsque le
potentiel sur l'électrode est inversé (phase de réduction), les molécules précédemment
oxydées peuvent, dans certains cas (si elles sont suffisamment stables), être réduites à
leur état original ce qui crée du courant négatif (pic cathodique). Pour des
57
voltammogrammes obtenus à partir de solutions contenant un seul composé, la hauteur
des pics anodiques et cathodiques, leur position (potentiel), la différence de potentiel
entre ceux-ci, la hauteur relative de ces pics ainsi que l'aire sous la courbe sont les
principaux paramètres utilisés pour décrire les propriétés d'oxydoréduction du composé
à l'étude (Kilmartin 200lb).
La voltammétrie peut être utilisée non seulement avec des solutions de produits
purs, mais aussi avec des mélanges complexes d'origine végétale tels que les thés
(Bourassa et coll. manuscrit en préparation; Kilmartin et Hsu 2003), vins (Kilmartin et
coll. 2001a) et des extraits de plantes médicinales (Naik et coll. 2003) ou de différents
écotypes (Neill et coll. 2002). Jusqu'à présent, le principal intérêt des
voltammogrammes de telles solutions complexes est l' estimation de leur pouvoir
antioxydant global, estimé à partir de l'aire sous la courbe (correspondant au nombre
d'équivalents réducteurs dans une gamme donnée de potentiels). Cependant, comme il
a été mentionné dans le chapitre 3, il est difficile de faire une analyse détaillée des
voltammogrammes provenant de mélanges puisque la courbe mesurée n'est pas
nécessairement la somme de l'oxydation de chacune des molécules en solution. Des
interactions complexes entre les molécules du mélange peuvent également affecter le
voltammogramme. Par exemple, les molécules oxydées par l' électrode peuvent être re
réduites par des molécules en solutions pour être oxydées à nouveau. De plus, certaines
molécules du mélange peuvent être adsorbées sur l' électrode de travail et créer ainsi
une barrière réduisant l'accès à l'électrode pour d'autres molécules. Les autres
molécules en solution requièrent alors un potentiel plus élevé (sur-potentiel) pour être
oxydées (Makhotkina et Kilmartin 2010). Ce type d'interactions est particulièrement
évident pour l'acide ascorbique lorsqu' il est en présence de composés phénoliques
puisque son oxydation par l' électrode se produit à des potentiels supérieurs à celui
mesuré en absence de tels composés (Makhotkina et Kilmartin 2010). Lorsque
l'oxydation de l'acide ascorbique est mesurée à un potentiel fixe (ex. électrode
spécifique à l'acide ascorbique), la présence de composés phénoliques dans des vins et
jus d'orange entrave son oxydation ce qui diminue le courant et de ce fait, diminue
l'estimation de sa concentration (Kilmartin et coll. 2008).
58
Afin d'interpréter les voltammogrammes de mélanges complexes pour
éventuellement mieux comprendre l'oxydation des composés phénoliques lors d'un
stress oxydant, nous avons voulu caractériser l'importance du sur-potentiel créé par la
présence en solution des composés phénoliques d'un extrait de feuilles d'érable argenté
pour deux antioxydants bien connus, l'acide ascorbique (AsA) et le gallate
d'epigallocatéchine (EGCG). Plus spécifiquement, nous avons tenté de répondre aux
questions suivantes:
• Un tel sur-potentiel diminue-t-illa quantité d'antioxydants pouvant être oxydés
par l'électrode ou retarde-t-il seulement leur oxydation (c.-à-d. déplace
l'oxydation vers des potentiels plus élevés)?
• L'oxydation de l'AsA et celle de l'EGCG sont-elles affectées de la même façon
par la présence des composés phénoliques des feuilles d'érable argenté?
Nos résultats indiquent qu'en estimant le nombre d'équivalents réducteurs, les
composés phénoliques des feuilles d'érable argenté diminuent fortement l'oxydation de
l'ECG alors qu'ils ne font que déplacer l'oxydation de l'AsA vers des potentiels plus
élevés.
4.2 Matériel et méthode
4.2.1 Solutions
L'EGCG et l'AsA ont été dissous dans le méthanol pur. L'EGCG a été choisi puisqu'il
est possiblement le principal composé oxydé chez l'érable argenté lors d'un stress
photo oxydants (chapitre 3). L'AsA a été choisi puisqu'il est facilement oxydable, qu'il
pourrait être impliqué dans la détoxification des radicaux libres et que son oxydation
semble peu affectée par la présence d'autres composés.
Des feuilles d'érable argenté (Acer saccharinum L.) développées en plein soleil
ont été prélevées d'un arbre sur le campus de l'Université du Québec à Trois-Rivières.
0,51 g de feuilles ont été broyées dans de l'azote liquide. Les composés phénoliques ont
été extraits par deux incubations successives dans 1 ° ml de méthanol pur à 70 oC
59
pendant 20 minutes suivi d'une dernière extraction dans du méthanol à 50 % à
température ambiante pendant 30 minutes.
Deux ml de cet extrait de feuilles ont été mélangés à un volume égal de tampon
phosphate 100 mM au pH initial de 5,5 et contenant 5 mM de KCl. Le pH final de cette
solution d'extrait a été ajusté à 5,8 avec du HCl1 N.
4.2.2 Voltammétrie
Les voltammogrammes ont été enregistrés de 0 à 1200 m V à un taux de balayage de
50 mV S-I par un potentiostat de model 362 (Princeton Appl. Res. USA), en utilisant
une électrode de travail en carbone vitrifiée (BAS MF-2012, 3 mm de diamètre) et une
contre-électrode de platine. Le potentiel a été mesuré par rapport à l'électrode de
référence Agi AgCl. Avant chaque mesure, l'électrode de travail a été polie doucement
avec de la poudre d'aluminium en solution, puis a été déposée dans un bain à ultrason
pendant 2 minutes afm d'enlever tout résidu. Les électrodes ont été placées dans la
solution environ 10 secondes avant la mesure. Le courant de la solution tampon a été
soustrait aux voltammogrammes. Les voltammogrammes présentés sont la moyenne de
3 à 4 mesures.
Nous avons examiné l'effet de différentes concentrations (0,1 mM, 0,25 mM,
0,50 mM, 1,25 mM et 2,25 mM) d'AsA et d'EGCG sur la hauteur (courant) et la
position (potentiel) du pic d'oxydation ainsi que sur le nombre d'équivalents réducteurs
(électrons) QO-1200 (J!C) calculés par l'aire sous la courbe entre 0 et 1200 mV divisée par
la vitesse de balayage (50 m V S-I). Nous avons aussi mesuré ces paramètres pour des
solutions d'AsA et d'EGCG ajoutées à un volume égal de l'extrait méthanolique de
feuilles d'érable argenté (section 4.2.1).
60
4.3 Résultats
4.3.1 Voltammogrammes de l'acide ascorbique
4.3.1.1 Voltammogrammes de l'acide ascorbique à différentes concentrations en absence d'extraits de feuilles d'érable argenté
Le voltammogramme de l 'AsA mesuré à un pH de 5,8 présente un seul pic d'oxydation
(Fig. 4.1). Ce pic se déplace de 174 mV jusqu'à 364 mV lorsque la concentration
augmente de 0,1 mM à 0,5 mM, puis reste au même potentiel pour des concentrations
plus élevées (Fig. 4.2) . Il est intéressant de constater que la hauteur du pic d'oxydation
(/lA) et le QO-1 200 sont linéairement corrélés avec la concentration de l'AsA (Fig. 4.3)
avec un R2 de 0,98.
14 ,. 12 1
, AsA 1 \
10 1 ,
,-.., 1
, < 8 , ::l.
1 '-' " ..... -- .... = 6 1 Cà ,.... .... .... $-;
::s 1 /' ---_-:. .... 0 4 U ~ ... --1 / -- ' .... " ...........
2 1 / , ------_. .... -0
-2 0 200 400 600 800 1000 1200
Potentiel (m V)
Figure 4.1: Voltammogrammes de différentes concentrations d'AsA, soit 0,1 mM (courbe continue noire), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges) et 1,25 mM (courbe de traits et pointillés bleus). Le courant a été mesuré à 50 mV S-l par une électrode de carbone vitrifiée de 3 mm de diamètre dans un tampon phosphate 100 mM à un pH final de 5,8.
61
500
400 ,.-..
> • • -5 300 • Q) .p s= 200 Q) +-' 0 0
0.. 100
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 l ,50
Concentration AsA (mM)
Figure 4.2: Graphique de la position du pic d'oxydation (potentiel d'oxydation) en fonction de la concentration de l'AsA.
16
a) pente = 8,0 !lA/mM
,.-.. 12 <: :::1.
'---' +-'
8 ~ .... ;:3 0 U
4
• 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25
Concentration AsA (mM)
1,50
,.-.. U :::1.
'---'
200.-------------------------,
b) pente = 86 !lC/mM
150
:5 100 N
o CI
50
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
Concentration AsA (mM)
Figure 4.3: Graphiques (a) du courant du pic d'oxydation et (b) du nombre d'équivalents réducteurs (Qo-12oo) en fonction de la concentration de l'AsA. a : y = 8,Ox + 1,7; b : y = 86x + 50.
4.3.1.2 Voltammogrammes de l'acide ascorbique à différentes concentrations en présence d'extraits de feuilles d'érable argenté
Pour ce qui est des voltammogrammes de l'AsA mesurés en présence de l'extrait de
feuille d'érable argenté, on remarque que le pic d'oxydation de l'AsA reste visible
quoique moins bien défini, en particulier pour de faibles concentrations (Fig. 4.4). La
présence des composés phénoliques de l'extrait de feuilles d'érable causent un
déplacement d'environ 100 mV du potentiel d'oxydation de l'AsA par rapport aux
62
solutions pures d'AsA (Fig. 4.5). Comme pour l'AsA sans extrait, le potentiel
d'oxydation augmente très peu pour des concentrations supérieures à 0,5 mM.
Dans l'extrait de feuilles d 'érable, le courant du pic d 'oxydation de l'AsA
augmente linéairement avec la concentration, avec une pente de 8,611A mM-l
(Fig. 4.6a) soit légèrement supérieure à la pente pour l'AsA sans extrait d' érable de
8,011A mM-l. De même, les valeurs du Q O-1 200 en présence d 'extrait d'érable varient
linéairement avec la concentration d'AsA ajouté (Fig. 4.6b), avec une pente de
96I1C/mV, soit un peu plus élevé que pour l'AsA sans extrait (86I1C/mV). La présence
des composés phénoliques de l' extrait de feuilles d 'érable augmente le QO-1 200 de l'AsA
d'environ 80 I1C.
1~
16
14
12 ---< 10 ~ '-' ...
8 s:: CI:$
~ 6 0 U
4
2
0
-2 0
1 1
AsA + extrait de feuille ,
" l ' .... -1 .... - - -,-- .... , " ----1 / --------,
• 1 ,/
'1 I/.
200 400
--: ---
600 800 1000 1200
Potentiel (m V)
Figure 4.4: Voltammogrammes d 'extrait de feuilles d' érable argenté en présence de différentes concentrations d 'AsA, soit 0,0 mM (courbe vert pâle), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges) et 1,25 mM (courbe de traits longs bleus).
63
550
500 .--- • • • ~ 450
0 '-'
~ 400 -c::: Q) -0 350 ~
30~{ l' 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 l ,50
Concentration EGCG (mM)
Figure 4.5: Graphique de la position du pic d'oxydation (potentiel d'oxydation) en fonction de la concentration de l'ASA, en présence d' extrait de feuilles d' érable argenté.
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 l ,50
Concentration AsA (mM)
300 ~----------------------~
250
Û 200 ::t '-' 8 150 N
o 0' 100
50
b) pente = 96 IlC/mM
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 l ,50
Concentration AsA (mM)
Figure 4.6: Graphiques (a) du courant du pic d'oxydation et (b) du nombre d'équivalents réducteurs (Qo-12oo) en fonction de la concentration de l'AsA, en présence d' extrait de feuilles d'érable argenté. a: y = 8,6x + 6,1;b:y=96x+128.
4.3.2 Voltammogrammes du gallate d'épigallocatéchine
4.3.2.1 Voltammogrammes du gallate d'épigallocatéchine à différentes concentrations en absence d'extrait de feuilles d'érable argenté
Le voltammogramme de l'EGCG à pH 5,8 présente trois pics d'oxydation (Fig. 4.7).
Les deux premiers pics se déplacent vers des potentiels plus élevés lorsque la
concentration augmente. Le deuxième pic passe de 317 m V pour une concentration de
64
0,1 mM à 400 mV pour une concentration de 1,25 mM, sans plafonner après 0,5 mM
contrairement à l'AsA. Puisque le premier pic se déplace vers le début du deuxième
pic, il se fond au deuxième et devient indéfinissable (Fig. 4.7), il ne sera donc pas
analysé. ÉtonnarruiJ.ent, le potentiel du troisième pic diminue légèrement avec
l'augmentation de la concentration, en passant de 829 mV à 754 mV (Fig. 4.8b).
Comme pour l'AsA, nous avons observé que la hauteur du deuxième pIC
d'oxydation (J..I.A) et le QO-1 200 sont linéairement corrélés avec la concentration de
l'EGCG entre 0,1 mM et 1,25 mM avec un R2 de 0.99 (Fig. 4.9), avec des pentes de
8,4 J..I.AlmV et 126 J..I.C/mV, à peine plus élevée que celle de l'AsA (8,0 J..I.AlmV;
122 J..I.C/mV). Cependant, la hauteur du troisième pic d'oxydation de l'EGCG augmente
rapidement jusqu'à une concentration de 0,25 mM, puis avec une pente beaucoup plus
faible pour des concentrations supérieures.
14
12
10
----<t: 8 ::t ~ - 6 § ~ :::s 0 4 U
2
0
-2 0
'" 1 \ EGCG
1 \ l ,
l '---, 1 " ,
I ~'" , .... -" -. , ~_.... ..... Il Il
200 400 600
Potentiel (m V)
--800 1000 1200
Figure 4.7: Voltammogrammes de différentes concentrations d'EGCG, soit 0,1 mM (courbe continue noire), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges) et 1,25 mM (courbe de traits et pointillés bleus).
65
500 900
450 a) b) 850 ,.-.. >' 400 • > • El • El
::: 350 • ::: 800 • <Il <Il • "'§ • ""§ 300 <Il <Il
750 • ..... ... 0 0 ~ 250 ~
20~{ 1' 70~{ 1' 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
Concentration EGCG (mM) Concentration EGCG (mM)
Figure 4.8: Graphiques de la position du deuxième pic d' oxydation (a) et du troisième pic d'oxydation (b) (potentiel d'oxydation) en fonction de la concentration de l'EGCG.
20~----------------------~
a) pente pic # 2 = 8,4 !lA/mM 16
<' 2; 12 1:1 ~ 8
U
4
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
Concentration AsA (mM)
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
Concentration AsA (mM)
Figure 4.9: Graphiques (a) du courant du deuxième (cercles pleins) et troisième pic d'oxydation (cercles vides) et (b) du nombre d'équivalents réducteurs (QO-1200) en fonction de la concentration de l'EGCG. a: 2èrne pic: y = 8,4x + 3,3; 3èrne pic: y = 3,Ox + 5,2; b : y = 122x + 36.
4.3.2.2 Voltammogrammes du gallate d'épigallocatéchine à différentes concentrations en présence d'extrait de feuilles d'érable argenté
Lorsque l'on ajoute de l'EGCG à de l'extrait de feuilles d'érable, les pics d'oxydation
de l'EGCG ne sont plus distincts (Fig. 4.10). Nous n' avons donc pas été en mesure
d'évaluer les effets de la concentration sur la hauteur des pics ou sur le potentiel
d'oxydation. Il est cependant possible de mesurer la variation du QO-1200. La présence de
l'extrait augmente la valeur initiale du QO-1200 d'environ 80 IlC, puis les valeurs sont
66
linéairement reliées à la concentration de l'EGCG (R2 = 0,80; Fig. 4.11). La pente de
26 f1C/mV est nettement plus faible que pour l'EGCG sans extrait d'érable
(122 f1C/mV).
12
EGCG + extrait de feuille 10 -- - .....
/ " " 8 1 --- ..... -
,-.... , .".,. ..... -< ,.. --~ 6 '-" ..... c:: CIj 1-< 4 ::l 0
U 2
0
-2 0 200 400 600 800 1000 1200
Potentiel (m V)
Figure 4.10: Voltammogrammes d 'extrait de feuilles d'érable argenté en présence de différentes concentrations d 'EGCG, soit 0,0 mM (courbe vert pâle), 0,25 mM (courbe de pointillés verts), 0,50 mM (courbe de traits rouges), 1,25 mM (courbe de traits longs bleus) et 2,25 mM (courbe d'un trait et deux pointillés noirs).
250 ,...-----------....., pente = 26 /lC/mM
200
q 150 '-'
~ . ;; 100 CI
50
0,0 0,5 1.0 1,5 2,0 2,5
Concentration EGCG (mM)
Figure 4.11: Graphiques du nombre d'équivalents réducteurs (QO-1200) en fonction de la concentration de l'EGCG, en présence d'extrait de feuilles d'érable argenté. y = 26x + 120.
67
4.4 Discussion
La voltammétrie cyclique est une méthode commune en électrochimie pour caractériser
les propriétés d'oxydoréduction de composés purs. L'application de cette méthode en
physiologie végétale est prometteuse mais demeure compliquée puisqu'elle est
influencée par certains facteurs dont la concentration des molécules oxydables et
l'interaction entre certaines molécules en solution. En effet, les molécules en solution
ainsi que leurs produits d'oxydation peuvent être adsorbés à l'électrode de travail et
ainsi nuire aux oxydations subséquentes ou encore interagir entre elles et modifier leur
propriété d'oxydoréduction. Il était donc important de mieux caractériser ces effets afm
d'interpréter plus adéquatement les voltammogrammes de mélanges complexes. Ainsi,
nous avons observé que la concentration des composés et la présence de composés
phénoliques de l'extrait de feuille d'érable argenté affectent différemment l'oxydation
de l'AsA et de l'EGCG.
Pour l'AsA, il est difficile d'expliquer pourquoi l'oxydation s'effectue à des
potentiels plus élevés lorsque la concentration augmente entre 0,1 mM et 0,5 mM, alors
qu'elle se stabilise à vers des potentiels de 350 mV pour des concentrations plus
élevées. Il est peu probable que l'adsorption de l'AsA sur l'électrode entrave les
oxydations subséquentes comme pourrait le provoquer l'adsorption d'un composé
életroinactif présent dans un mélange. On peut penser que cette observation pourrait
plus probablement être attribuable à la diffusion des molécules et une accessibilité à
l'électrode plus faciles pour des concentrations plus faible d'AsA, alors qu'à des
concentrations de plus de 0,5 mM cet effet deviendrait négligeable. Cette augmentation
du potentiel d'oxydation n'a toutefois pas d'effet négatif important sur la quantité de
molécules d'AsA oxydées puisqu'elle reste linéairement corrélée avec la concentration
d'AsA en solution.
La présence des composés phénoliques de l'extrait de feuilles d'érable argenté
influence peu l'oxydation de l'AsA si ce n'est que d'augmenter le courant, le QO-1200 et
le potentiel d'oxydation d'une valeur fixe. Comme pour la solution pure, l'oxydation de
l'AsA n'est plus retardée pour des concentrations supérieures à 0,5 mM puisque
l'augmentation du courant et du QO-1200 en fonction de la concentration d'AsA reste
68
pratiquement la même avec ou sans extrait d'érable. Nous pouvons donc en conclure
que la présence des composés de l'extrait n'empêche pas l'oxydation de l'AsA. Au
contraire, la quantité de molécules oxydées augmente légèrement avec la concentration
d'AsA, possiblement parce que l'AsA et certains composés de l'extrait réagissent
ensemble pour être réduits puis être oxydés de nouveau au cours de la lecture du
voltammograrnme. D'après Buetlner (1993), le faible potentiel d'oxydation de l'AsA
lui permettrait de réduire les formes oxydées de certains composés phénoliques afin de
les régénérer et leur permettre de s'oxyder à nouveau. Il serait cependant aussi possible
que l'AsA oxyde une première fois reçoive rapidement un électron d'un composé
phénolique et soit oxydé de nouveau.
Pour l'EGCG en solution, on constate que l'augmentation de sa concentration
cause un déplacement des deux premiers pics d'oxydation de l'EGCG vers des
potentiels supérieurs, possiblement puisque des concentrations plus élevées entraînent
une diffusion plus lente des molécules vers l'électrode comme pour l'AsA. Cependant,
contrairement à l'AsA, le potentiel d'oxydation est retardé même à des concentrations
supérieures à 0,5 mM. La troisième oxydation de l'EGCG ne semble pas être affectée
négativement par l'augmentation de la concentration. Au contraire, cette oxydation
s'effectue à des potentiels plus bas lorsque la concentration augmente. Cela pourrait
être attribuable à des interactions entre l'EGCG ou les produits d'oxydations des deux
premières oxydations qui facilitent la troisième oxydation. Nous avons aussi observé
que l'augmentation de la concentration n'empêche pas l'oxydation totale (Qo-12oo) de
l'EGCG ou la valeur de courant de son deuxième pic d'oxydation. Néanmoins, au-delà
de 0,5 mM, la troisième oxydation ne s'effectue pas en totalité. Il est probable que cette
troisième oxydation soit plus sensible à l'adsorption sur l'électrode de travail. Il serait
aussi possible qu'après la deuxième oxydation, une portion de l'EGCG réagisse avec
certains composés en solution, le rendant ainsi impossible à oxyder une troisième fois.
D'ailleurs, lors de précédentes mesures de voltarnmograrnmes de différentes catéchines
présentes dans le thé qui contient une grande quantité d'EGCG, il a été observé que la
présence de l'a- et la ~- caséines, 2 protéines du lait déplacent les pics d'oxydation vers
des potentiels plus élevés en affectant différemment les pics d'oxydation de l'EGCG.
(Bourassa et coll. manuscrit en préparation).
69
Contrairement à l'AsA, la présence des composés de l'extrait de feuilles d'érable
argenté diminue sensiblement l'oxydation de l'EGCG. Les trois pics d'oxydation
deviennent indiscernables même pour une concentration d'EGCG de 2,25 mM. Il n'est
donc pas possible de vérifier si l'oxydation des composés de l'extrait ou leur interaction
avec l'EGCG influence le potentiel d'oxydation. Cependant, on constate que, outre
l'oxydation d'environ 80 IlC attribuable aux composés de l'extrait, l'oxydation totale
(Qo-12oo) de l'EGCG augmente linéairement avec sa concentration. Cependant,
l'augmentation du QO-1200 pour l'EGCG en présence de l'extrait est 78 % plus faible
qu'en son absence. L'oxydation de l'EGCG est probablement entravée par une
interaction avec les composés de l'extrait le rendant ainsi moins disponible pour
l'oxydation. Il est peu probable que la baisse de l'oxydation de l'EGCG soit attribuable
seulement au ralentillement de la diffusion des molécules d'EGCG vers l' électrode,
puisque dans ce cas, les pics typiques à l'EGCG seraient toujours visibles sur le
voltammogrammes, ce qui n'est pas le cas.
4.5 Conclusion
Nous avons observé que lorsque la concentration de la solution d'AsA ou d'EGCG
augmente, l'oxydation est retardée sans pour autant être limitée. Bien qu'il soit possible
d'estimer la quantité de molécules oxydées avec les voltammogrammes pour la gamme
de concentrations à l'essai, il est préférable d'utiliser des solutions peu concentrées, soit
de moins de 0,5 mM, afm de réduire la variation des potentiels d'oxydation. En
présence des composés de l'extrait de feuille d'érable argenté, l'oxydation de l'AsA est
très peu influencée par l'adsorption sur l'électrode ou par les interactions avec les
molécules du mélange ou leur produit d'oxydation. À l'inverse, l'oxydation de l'EGCG
est considérablement diminuée et modifiée par les interactions avec ces composés.
L'étude de la variation des propriétés d'oxydation de l'EGCG dans un extrait
n'est donc pas facile. Cependant l'oxydation totale estimée par le QO-1200 reste
représentative de la concentration d'EGCQ oxydable dans le mélange. La voltarnmétrie
est donc une méthode intéressante pour l'étude des propriétés d'oxydoréduction de
composés phénoliques suite à leur utilisation lors d'un stress oxydant comme nous
70
l'avons d'ailleurs utilisée pour l'expérimentation présentée au chapitre 3. Il reste
cependant des études supplémentaires à réaliser afm d'obtenir un maxunum
d'information des voltammogrammes de mélanges complexes.
CHAPITRE V
DISCUSSION GÉNÉRALE
Chez les plantes, les composés phénoliques ont les caractéristiques reqmses pour
détoxifier les radicaux libres produits lors d'un stress oxydant. Ils ont un pouvoir
antioxydant suffisant, dans plusieurs cas supérieurs à celui de l' acide ascorbique utilisé
dans le cycle Halliwell-Asada, principal mécanisme de détoxification des radicaux
libres. Cependant, certains détails importants dont leur localisation principalement dans
l'épiderme, leur réaction enzymatique peu caractéristique (plutôt spécifique), l'absence
de relation causale entre leur oxydation et les dommages oxydants, font que plusieurs
auteurs doutent de leur rôle réel d' antioxydant in planta.
Nos expérimentations avaient donc comme objectif principal de vérifier
l'hypothèse selon laquelle les composés phénoliques protègent la plante contre les stress
photooxydants.
Lorsque soumises à de fortes lumières, les feuilles d'érable argenté n'ont pas
présenté de baisse de la concentration en composés phénoliques ou de signes de leur
oxydation qui nous auraient permis de confirmer notre hypothèse. Puisque ces feuilles se
sont développées sous des conditions ensoleillées durant l'été, les 2800 Ilmoles de
photons m-2 S-l auxquels nous les avons exposées pendant 4 heures sont à peine plus
élevées que les 2000 Ilmoles photons m-2 S-l qu'offre une journée ensoleillée. Les
feuilles étant déjà bien acclimatées à ces conditions, le stress appliqué fut de faible
ampleur. La première ligne de défense (Halliwell-Asada) serait donc suffisante pour
protéger ces feuilles contre ce stess photo oxydant.
L'ajout de méthylviologène aux feuilles d'érable argenté a permis d'augmenter la
production de radicaux libres tout en court-circuitant le principal mécanisme de
détoxification. Les composés phénoliques ont donc subi une pression oxydative
supérieure ce qui nous a permis d'observer leur utilisation lors de la détoxification des
radicaux libres. Après deux heures de photo inhibition, les composés phénoliques
72
utilisables ont tous été oxydés. Privée de cette protection, la détérioration de l'état
photo synthétique de la plante s'est accélérée.
L'utilisation de la voltammétrie pour étudier l'état d'oxydoréduction des composés
phénoliques à la suite d'un stress oxydant était une première. C'est un outil rapide et peu
coûteux, mais l'interprétation des voltammogramme peut être hasardeuse pour des
mélanges complexes comme les extraits de feuille. Lorsque nous avons mesuré les
voltammogrammes de différents composés phénoliques ajoutés à un extrait de feuilles
d'érable, nous avons observé qu'il existe des interactions entre les molécules d'un
mélange ainsi qu'entre l'électrode de travail et les molécules en solution ou leur produit
d'oxydation selon le type de molécules et leur concentration. En utilisant les mêmes
paramètres pour chacune des mesures des extraits de feuilles d'érable photo inhibées,
nous avons été en mesure d'observer que certains composés phénoliques ont été oxydés,
probablement suite à leur utilisation pour la détoxification des radicaux libres produits
lors de la photoinhibiton. De plus, ce sont les composés phénoliques facilement
oxydables qui sont impliqués, soit à un potentiel de moins de 400 m V. L'utilisation de la
voltammétrie cyclique a donc été très nécessaire à la validation de nos conclusions et
pourra devenir un outil très utile pour l'étude des stress oxydants. Cependant, les
paramètres de mesures restent à être optimisés. Déjà, nous avons constaté que
l'utilisation d'un extrait de feuilles beaucoup plus dilué aurait permis de favoriser
l'oxydation rapide des composés, rendant ainsi les voltammogrammes mieux définis.
Pour mieux comprendre le mécanisme de protection des composés phénoliques, il
serait important d'identifier le ou les composés phénoliques impliqués dans la protection
contre le stress photooxydant. Par l'examen des voltammogrames de l'extrait d'érable et
de composés phénoliques spécifiques, des spectres d'absorbance UV ainsi que de la
revue de littérature, nous avons pu proposer le gallate d'épigallocatéchine comme étant
le principal composé phénolique qui aurait été oxydé lors de la photo inhibition.
Cependant, cela reste à être validé.
Il serait intéressant d'effectuer les mêmes recherches avec des feuilles d'érable
argenté développées à l'ombre, et ainsi d'observer l'utilisation des composés
phénoliques pour la détoxifications des radicaux libres alors que le cycle Halliwell-
73
Asada est toujours en fonction. Cette étude se rapprocherait davantage des conditions
naturelles et d'un stress chronique plutôt que le stress aigu occasionné par l' infiltration
de méthylviologène. Finalement, afin de bonifier nos résultats et d'entériner notre
hypothèse, il serait pertinent d'effectuer des recherches complémentaires avec des
feuilles d'espèces différentes contenant une variété de concentrations et de types de
composés phénoliques.
PERSPECTIVES D' AVENIR
Notre étude apporte des éléments nouveaux supportant l'hypothèse selon laquelle les
composés phénoliques peuvent être utilisés dans la plante pour détoxifier les radicaux
libres produits lors de stress oxydants comme la photo inhibition. La validation de ce
rôle des composés phénoliques n'est pas seulement pertinente pour la connaissance
physiologique de la plante, mais aussi parce que cela pourrait permettre de renforcer la
protection des plantes cultivées contre la photoinhibition et contre d'autres stress
oxydants pouvant être provoqués notamment par des métaux lourds, des températures
extrêmes ou l'attaque par des pathogènes (Larcher 2003). La protection de la plante
contre l'effet oxydant de ses stress est d'autant plus importante puisqu'ils sont difficiles
à contrôler au champ et peuvent occasionner une perte de rendement importante. Par
exemple, puisque plusieurs cultures québécoises se trouvent à la limite nord de leur
distribution, elles doivent subir des basses températures qui amplifient le phénomène de
la photo inhibition, ce qui peut diminuer leur productivité jusqu'à 30 % (Zhu et coll.
2004). Il serait possible d'augmenter la concentration de composés phénoliques des
plants afm de bénéficier de leur effet protecteur, entre autres par l'application d'acide
salicylique qui est connue pour accélérer leur production, et ainsi minimiser les pertes
de rendement (Chitra et coll. 2008). Afm de vérifier si cette protection est envisageable,
il reste encore plusieurs études à mener, d'abord pour s'assurer que l'application
d'acide salicylique permet d'augmenter la concentration en composés phénoliques sans
avoir des effets négatifs importants sur le rendement de la plante, et ensuite pour
vérifier que ce traitement permet effectivement de diminuer les effets des stress
oxydants aux champs.
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