4éme année génie des Industries Alimentaires

Année Universitaire: 2014-2015

Chargé de Cours: DR. MAATOUK Imed

Evaluation de la contamination d’une matrice alimentaire en mycotoxines : cas de l’ochratoxine A

GENERALITES

L’ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine (métabolite secondaire) produite par des champignons du genre Aspergillus et Penicillium, sous l’effet de certaines conditions de température et d’humidité. Elle contamine les denrées alimentaires destinées à l'homme ou aux animaux d'élevage. Outre ses multiples effets toxiques (tératogènicité, carcinogènicité, mutagènicité et immunosuppression), sa néphrotoxicité semble être l’effet prédominant. De plus, elle est considérée comme étant l’agent causal de la Néphropathie Endémique des Balkans (NEB) ainsi que des tumeurs du tractus urinaire.

L’ochratoxine A (OTA) a été découverte pour la première fois en 1965 (Van Der Merwe et al., 1965) à l’occasion d’une recherche systématique de mycotoxines. Elle est constituée d’une molécule de L-phénylalanine engageant son groupement amine dans une liaison pseudo-peptidique avec le groupement carboxyle en C7 de la 7-carboxy-3-méthyl-5-chloro-8-hydroxy-3,4-dihydroisocoumarine (Figure 1).

Figure 1. : Structure chimique de l’ochratoxine A (C20H18ClNO6 ; PM : 403,82)

C’est un composé cristallin incolore, de poids moléculaire 403,8 et de formule brute C20H18ClNO6.

A pH acide, l’OTA est soluble dans les solvants organiques polaires et peu solubles dans l’eau. A pH alcalin, elle est soluble et stable dans le bicarbonate de sodium 0,1 M et dans les solutions alcalines en général. Ces propriétés sont utilisées pour l’extraction et la purification de l’OTA à partir de divers types d’échantillons. L’OTA absorbe la lumière Ultra-Violette. Dans le méthanol, le maximum d’absorption est à 333 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 5500. Dans le bicarbonate de sodium, 0,1 M pH 7,4, le maximum d’absorption est à 378 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 14700.

1

Partie phénylalanin

e

Partie isocoumarinique

En milieu acide, l’OTA présente des propriétés de fluorescence (longueur d’onde d’émission = 365 nm), cette fluorescence est verte à 365 nm alors qu’en milieu alcalin, elle est bleue. Cette propriété est mise à profit pour sa détection et son dosage

I. Extraction et purification de l’ochratoxine A à partir d’une matrice alimentaire (Farine de blé)

A. Principe général d’extraction et d’analyse quantitative des mycotoxines

Les méthodes analytiques pour le dosage des mycotoxines sont fondées sur plusieurs facteurs. Aucune méthode n’est directement applicable à tous les types de mycotoxines. Les paramètres primordiaux dans un schéma analytique sont la nature chimique de la ou des mycotoxines d’intérêt, ses groupes fonctionnels mais aussi le type de matrice dans laquelle elles sont recherchées.

Les aspects majeurs de l’analyse comprennent l’extraction à partir de la matrice, la purification et la concentration de l’extrait, la détection qualitative et quantitative des mycotoxines.

De manière générale, la première étape d’extraction de la mycotoxine à partir de la matrice broyée, s’effectue dans un solvant organique aqueux (Scott, 1995). Les solvants utilisés dans l’extraction des mycotoxines peuvent être le méthanol, le toluène, l’acétonitrile, l’acétate d’éthyl, et le chloroforme. L’utilisation d’un mélange d’eau et de solvant organique permet en humidifiant le substrat d’augmenter la pénétration du solvant. La phase aqueuse est généralement acidifiée afin de casser les interactions entre la ou les toxines et les constituants de l’échantillon tels que les protéines. L’utilisation de sels inorganiques permet de diminuer la formation d’émulsion durant l’extraction lors de cette première étape.

D’autres composés peuvent être présents et interférer, par la suite, dans l’analyse chromatographique des mycotoxines. Une étape de purification à partir de l’extrait filtré estalors d’autant plus nécessaire que l’on cherche à atteindre des seuils de quantification le plus bas possible. Cette étape peut être réalisée soit par :

- Partage liquide-liquide (LLP),

- Extraction sur phase solide (SPE),

- Extraction sur colonne d’immunoaffinité (IAC).

La dernière étape est l’analyse par chromatographie des échantillons. Plusieurs techniques peuvent être utilisées :

- Chromatographie en couche mince (CCM ou TLC),

- Chromatographie liquide de haute performance (HPLC) couplée à un détecteur UV ou à un détecteur de fluorescence.

- Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ou HPLC couplée à l’ionisation par electrospray (ESI).

B. Extraction de l’ochratoxine A à partir de la farine de Blé

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1. Matériel

Farine de blé

Papiers filtre

Eprouvettes de 100 ml

Erlenmeyers de 250 ml

Tubes à centrifuger de 50 ml

Tubes eppendorfs de 1,5 ml

Ballons d’évaporation de 50 et 100 ml

Tubes à essaies

Centrifugeuse

Evaporateur rotatif

Seringues et Filtres seringues de 0,45 µm

2. Réactifs et produits chimiques

Chloroforme

Hexane

Acide sulfurique (0,1 M)

Méthanol

Toluéne

Acétate d'éthyle

Acide formique

3. Mode opératoire

10 g de la farine du blé est mis en agitation mécanique pendant 30

minutes en présence d’un mélange de 30 ml du chloroforme et 2,5 ml de

d’acide sulfurique 0,1 M. Le mélange est ensuite filtré et 10 ml du filtrat

est prélevé pour être évaporé à sec à 60°C. Le résidu est reconstitué dans

500 µl du méthanol (vortex 1 min). l’extrait méthanolique subit une

délipidation par 1ml de hexane. Après centrifugation (6000 rpm, 20 min),

la phase organique inférieure est récupérée et filtré sur un filtre de 0,45

µm préalablement conditionné avec du méthanol.

AVERTISSEMENT 1:

3

- L'ochratoxine A provoque des lésions au niveau des

reins et du foie et elle est probablement cancérigène.

Respecter les précautions de sécurité lors des

manipulations de ces composants ; éviter notamment

toute manipulation du produit sous une forme sèche,

du fait de sa nature électrostatique qui peut

occasionner une dispersion et une inhalation. Il

convient de décontaminer la verrerie avec une solution

d'hypochlorite de sodium à 4 %.

- Utiliser une hotte d'extraction en bon état de marche.

Éviter le contact avec la peau, les yeux et les voies

respiratoires.

II. Détection et quantification de l’ochratoxine A par Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

1. Principe général

Plusieurs protocoles sont développés par l’AOAC (1995) (Official Methods 973.37 et

975.38), notamment pour la recherche de l’OTA. La chromatographie sur Couche Mince

(CCM) est l’une des méthodes utilisées dans la détection et la quantification de l’OTA. Ainsi,

la détection et la quantification de la mycotoxine peuvent se réaliser sous lampe UV ou,

mieux, par fluorescence. La lecture peut se faire visuellement par comparaison des intensités

avec des solutions étalons ou bien grâce à un lecteur de fluorodensitométrie (excitation : 310-

340 nm, émission : 440-475 nm). La fluorescence de l’OTA peut être renforcée, elle vire au

bleu intense en présence de vapeurs d’ammoniac ou par vaporisation d’une solution basique

(soude, bicarbonate).

2. Mode opératoire de la CCM

Les extraits alimentaires obtenus sont chromatographiés (volume du dépôt de 10 µl)  sur

gel de silice (plaque de Gel de Silice) avec un solvant de migration : Toluène : acétate

d’éthyl : Acide formique (6 : 3 : 1). Le temps de migration est égal à 1h30. Après migration, la

plaque est séchée à l’air ambiant sous hôte. Les tâches fluorescentes de l’OTA (bleu-vert) sont

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visualisées sous UV (lampe UV (366 nm)). Pour chaque tâche visualisée, on détermine le RF

ou mobilité relative ( rapport entre la distance de migration (Dm) de la tâche fluorescente et la

distance du front du solvant (Df)).

RF= Dm/Df

AVERTISSEMENT 2:

- La migration se déroule sous hotte vue que le toluène est cancérogène ;

- Le niveau du solvant de migration est inférieur à celui de dépôt, pour que

le solvant entraîne avec lui le produit déposé lors de sa migration sur la

plaque ;

3. Dosage spectrophotomètrique

Après révélation des spots de l’OTA, on procédé à quantifier la toxine par méthode

spectrophotométrique comme suit :

- Grattage des tâches visualisées sur la plaque du Silice ;

- Solubilisation (Silice + OTA) dans 1ml de MeOH avec un coup de vortex afin

d’augmenter le contact de l’OTA avec le MeOH ;

- Centrifugation pendant 5 minutes à 13000 tours/min pour précipiter la Silice ;

- La lecture de la DO à 330 nm sera déterminée dans une cuve de 1 ml de Quartz par

spectrophotomètre UV/Visible.

Après établissement de la courbe étalon exprimant la DO en fonction des concentrations

connues (5 ; 10 ; 100 ; et 500 ppb) de l’OTA, on déterminera la quantité de l’OTA dans les

extraits alimentaires obtenus.

4. Expression des résultats :

1- Etablir la courbe d’étalonnage DO= f([OTA]) et déterminer la concentration de

l’OTA en ng/ml dans les extraits analysés.

2- Exprimer la concentration de l’OTA en µg/kg dans les extraits analysés.

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Chromatographie sur couche mince (CCM)

3- Calculer le rendement de la méthode d'extraction sachant que la solution de

dopage utilisée pour la contamination artificielle de la farine de Blé est de 50

µg /kg.

Rendement (%)= [OTA]Exp/[OTA]Théorique*100

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