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LABORATOIRE DE CHIMIE BIOANALYTIQUE, DE TOXICOLOGIE ET
DE CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE Directeur : Professeur Jacques Dubois – PROMOTEUR
LABORATOIRE DE BIOCHIMIE MEDICALE Directeur : Professeur Yves Mardens – CO-PROMOTEUR
DETECTION ET QUANTIFICATION DE
DEGATS OXYDATIFS A L'ADN CELLULAIRE.
ROLE PHOTOSENSIBILISANT DES
PORPHYRINES ENDOGENES
par
Pierre DUEZ
Pharmacien
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade de Docteur en
Sciences Pharmaceutiques
Bruxelles, Septembre 2001
Remerciements
Toute ma gratitude va au Professeur Michel HANOCQ qui m’a proposé, il y a bien
longtemps déjà, de partager avec lui une expérience de coopération au développement. Celle-
ci a profondément marqué mon approche du métier de pharmacien, du métier de chercheur,
du métier d'enseignant. Depuis nos essais d’électrodialyse jusqu’à sa relecture attentive de ce
document, je le remercie d'avoir porté aux nombreux travaux menés sous sa direction des
moyens matériels appréciables mais aussi toute son attention, ses conseils, sa compétence
scientifique, son enthousiasme et ses coups de sang légendaires.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Professeur Jacques DUBOIS dont l'amitié m'a
permis de revenir dans le service et de réaliser ce travail; son acharnement a contribué à
mettre en place une infrastructure et des moyens matériels dont nous profitons tous. Je
n'oublie pas qu'à travers de grandes et de petites expériences, vingt ans de longues discussions
scientifiques nous ont amenés à développer de nombreux travaux, théories et projets.
Je remercie tout particulièrement le Professeur Yves MARDENS qui m'a accueilli dans
son Laboratoire à une période extrêmement difficile pour moi. Alors même que j'envisageais
de changer complètement d'activité, il m'a permis de reprendre confiance. C'est inestimable...
Il a apporté toute son énergie à la lecture et à la correction de ce manuscrit. J'ose espérer que
sa rigueur se reflète dans la version finale.
Mes remerciements vont également au Professeur Léopold MOLLE pour son
enseignement et surtout pour son dynamisme et son enthousiasme; les projets de coopération
qu'il a initiés attestent d'un profond sens humain. Il n'a pas ménagé sa peine à essayer de nous
le communiquer.
Une partie de ce travail n'aurait pas été possible sans l'aide de ceux et celles qui ont
aimablement mis à ma disposition du matériel et/ou des logiciels; je remercie M. le Professeur
J.-P. DEHAYE du service de Biochimie Générale, M. le Professeur A. MOËS du Service de
Galénique, M. le Professeur M. VAN DAMME du Service de Toxicologie, M. le Professeur
VANDER DONCKT du service de Chimie Organique Physique et Mme le Dr L. DE
CLERCQ des Laboratoires Estée Lauder. Les cellules de mélanome HBL nous ont été
i
généreusement fournies par M. le Professeur G. GHANEM, Directeur du Laboratoire
d'Oncologie et de Chirurgie Expérimentale de l'Institut Bordet, dont les conseils sont
appréciés.
Je remercie vivement Mme le Professeur M. Kirsch-Volders et Mlle M. De Boek pour
leur introduction aux arcanes de l'essai comète, Mme I. SENTE pour son assistance avec le
détecteur à barrettes d'électrodes, M. le Professeur J.P. DEHAYE et le Mme le Dr N. CHAÏB
pour leur aide dans les mesures de fluorescence, M. le Professeur J.-M. KAUFMANN pour
nous avoir permis d'obtenir un détecteur ampérométrique et M. R. VANDELOISE pour le
relevé des spectres de lampes .
Un travail de thèse apparaît comme une activité essentiellement solitaire. Cette expérience
permet cependant des interactions fascinantes avec d’autres personnalités dont on apprend
d’autant plus que l’on partage. J'ai essayé de partager mais j’ai surtout beaucoup appris de
tous ceux que j'ai croisés au cours de cette "carrière" déjà longue et que je me permettrai de
citer.
Le Dr Alain KUMPS n'a pas ménagé sa peine à me faire acquérir des notions de chimie
clinique, de chromatographie gazeuse, de spectrométrie de masse, de statistique et de marche
à pied. Je lui dois d'avoir été accueilli dans le Laboratoire de Biochimie Médicale, une étape
déterminante. Merci.
Que les doctorants du service – Lassina BADOLO, Muriel BALTES, Sylvianne
BIDOUIL, Gilles DEHON, Eric KINNAERT et Issa SOME – soient remerciés pour avoir
recréé une ambiance chaleureuse et amicale dans le laboratoire. Leur compagnie sympathique
a rendu supportables les interminables analyses chromatographiques. Un merci particulier à
Issa et Lassina qui m'ont réellement remis le pied à l'étrier pour initier ce travail. Ma
sympathie à Muriel qui supporte le désordre que je fais régner partout où je passe.
J'exprime tous mes remerciements à l'équipe technique du Laboratoire de Chimie
Bioanalytique, de Toxicologie et de Chimie Physique Appliquée. Sans Didier COLSON,
Marianne HELSON, Touria LAMKAMI, Dominique MERTENS, Dora OOMEN et Liliane
RICHIL, ce travail n'aurait pas été possible. Merci pour l'ambiance sympathique qu'ils font
régner. Salut également à Sergio PAREDES et à Marianne TRIBOUT.
ii
Merci aussi à l'équipe technique du Laboratoire de Biochimie Médicale. Sans les
encouragements incessants de Janine GENIN et de Kanzengelele (Chrétienne) KALWELE, je
n'aurais pu mener à bien cette thèse.
Une pensée amicale pour tous les chercheurs de l'Institut de Pharmacie qui m'ont
témoigné leur amitié, plus particulièrement pour Bertrand BLANKAERT, Lucette
BOUILLARD, Katrina GROSFILS, Elie KABRE, Naïma et Mourad METIOUI, Stéphanie
POCHET et Olivier VOSTERS.
Je suis assez ancien dans l'Institut pour me souvenir d'une autre génération de chercheurs,
Sylvie CHAMART, Christine DE SMET, Danielle LUCAS, Eric SCHENKEL, Bernard
VINCKE mais aussi du personnel technique de jadis, Pierre THIELEMANS, Christine
ALVOET and, last but not least, Aristotélis LIVADITIS. Si par hasard ils tombent sur ces
lignes, qu'ils sachent que les bons souvenirs sont toujours là. Salut également à Valérie
BERLAIMONT et Jean-Pierre TASSIN.
Au cours de mon travail chez Schering-Plough, j'ai eu l'occasion d'avoir des supérieurs qui
m'ont accordé une extrême souplesse d'horaire; je remercie le Dr J.-P. OSSELAERE,
M. P. DE POURCQ et Mme B. SCHOCKAERT, grâce à qui j'ai pu mener de front un travail
dans l'industrie et une activité scientifique. Merci également à ma collègue Chantal HUBER
qui m'a permis de comprendre que je n'étais peut-être pas vraiment fait pour les Affaires
Réglementaires…
Merci à mon papa, à ma maman, à ma p'tite sœur.
Merci, enfin et surtout, à Nicole et Quentin.
Je dédie ce travail à M. Jean MAINIL et au Dr Nestor CHAMOLES.
"Est-ce que le monde est sérieux ?" Francis Cabrel
iii
Liste des abréviations
8-nitrodG 8-nitro-2'-désoxyguanosine
8-oxodG 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine
8-oxoG 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine
A adénine ou adénosine (en fonction du contexte)
ACTH corticotropine
ADN acide désoxyribonucléique
ADP adénosine-5'-diphosphate
AP abasique (apurique et apyrimidique)
AP-1 complexe de protéines activatrices 1
ara-C 1-β-D-arabinofuranosyl cytosine
ARN acide ribonucléique
ATP adénosine-5'-triphosphate
BCC carcinome basocellulaire
BER réparation par excision de base (base excision repair)
C cytosine ou cytidine (en fonction du contexte)
CAT catalase
CLHP chromatographie liquide à haute performance
CMM mélanome malin cutané
CpC dinucléotide cytosine-cytosine (dans l'ADN)
CpG dinucléotide cytosine-guanine (dans l'ADN)
CpT dinucléotide cytosine-thymine (dans l'ADN)
CV% coefficient de variation
dA 2'-désoxyadénosine
δ-ala acide δ-aminolévulinique
dC 2'-désoxycytidine
dG 2'-désoxyguanosine
DOVA acide 4,5-dioxovalérique
dT 2'-désoxythymidine ou thymidine
EC détection électrochimique
EDTA éthylènediaminetétraacétate
EMS éthylméthanesulfonate
ESCODD European Committee for Oxidative DNA Damage
FAD flavine-adénine-dinucléotide
FaPy formamidopyrimidine
G guanine ou guanosine (en fonction du contexte)
GC chromatographie gazeuse
GC-MS chromatographie gazeuse couplée à une détection de masse
GSH glutathion réduit
iv
GSSG glutathion oxydé
GSH-Px glutathion peroxydase
HH protéine sonic hedgehog
HIV virus d'immunodéficience humaine
HMB hydroxyméthylbilane
HNE 4-hydroxy-2-nonénal
HpD dérivé d'hématoporphyrine
HPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase
IL interleukine
LC-MS-MS chromatographie liquide couplée à 2 détecteurs de masse placés en tandem
m moyenne
MDA malondialdéhyde
MED dose érythémale minimale (minimal erythemal dose)
MSH mélanotropine
m-THPC meta-(tétrahydroxyphényl)-chlorine
ΜΤΤ Microculture Tetrazolium Test
n.d. non déterminé
NADH nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite)
NADPH nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (forme réduite)
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
NER réparation par excision de nucléotides (nucleotide excision repair)
NF-κB facteur nucléaire κB
PG prostaglandine
PPIX protoporphyrine IX
PTC protéine patched
ROS espèce réactive de l'oxygène (reactive oxygen species)
s écart étalon
s% coefficient de variation
SCC carcinome spinocellulaire
SEM erreur standard de la moyenne
SMO protéine smooth
SOD superoxyde dismutase
SPF facteur de protection solaire
T thymine
TNF facteur de nécrose tumorale (tumoral necrosis factor)
TpT dinucléotide thymine-thymine (dans l'ADN)
UDP uridine-5'-diphosphate
UV - UVA - UVB - UVC
ultraviolet - 315 à 400 nm - 290 à 315 nm - 100 à 290 nm
v
TABLE DES MATIERES
1. Introduction ............................................................................................................................1 1.1 Intérêt et buts du travail ....................................................................................................2 1.2 Les dommages à l'ADN....................................................................................................3
1.2.1 Introduction ...............................................................................................................3 1.2.2 Les altérations spontanées de l'ADN.........................................................................5 1.2.3 Les altérations environnementales de l'ADN : les agents physiques ........................9 1.2.4 Les altérations environnementales de l'ADN : les agents chimiques ......................14 1.2.5 La réparation des dégâts à l'ADN............................................................................17 1.2.6 La structure de la chromatine et les dégâts à l'ADN ...............................................22
1.3 Les espèces réactives de l'oxygène et les dommages oxydatifs à l'ADN.......................26 1.3.1 Introduction .............................................................................................................26 1.3.2 Propriétés fondamentales de l'oxygène ...................................................................26 1.3.3 Les principales sources physiologiques d'espèces réactives de l'oxygène ..............31 1.3.4 Protections cellulaires antioxydantes.......................................................................34 1.3.5 Le stress oxydatif.....................................................................................................35 1.3.6 Dégâts oxydatifs aux lipides et aux protéines .........................................................36 1.3.7 Dégâts oxydatifs aux acides nucléiques: Généralités ..............................................38 1.3.8 Dégâts oxydatifs aux acides nucléiques: les bases oxydées ....................................41 1.3.9 Dégâts oxydatifs aux acides nucléiques: les autres types de lésions.......................47 1.3.10 Stress oxydatif et pathologies ................................................................................49 1.3.11 Les biomarqueurs du stress oxydatif .....................................................................49
1.4 La lumière et la peau ......................................................................................................54 1.4.1 La lumière................................................................................................................54 1.4.2 La peau humaine......................................................................................................56 1.4.3 Le rayonnement solaire ...........................................................................................58 1.4.4 Le soleil et la peau...................................................................................................60
1.5 La mutagenèse et la carcinogenèse en rapport avec les dommages à l'ADN.................71 1.5.1 La carcinogenèse, un processus multi-étapes ..........................................................71 1.5.2 Lésions à l'ADN et mutations..................................................................................73 1.5.3 Le gène et la protéine p53 .......................................................................................75 1.5.4 La mutagénicité des bases oxydées .........................................................................79 1.5.5 La photocarcinogenèse ............................................................................................80
2. Matériel et méthodes ............................................................................................................90 2.1 Méthodes et Modèles biologiques utilisés in vitro .........................................................91
2.1.1 Réactifs et matériel ..................................................................................................91 2.1.2 Lignées cellulaires et conditions de culture.............................................................91 2.1.3 Mesures de phototoxicité au moyen du test MTT (Microculture Tetrazolium Test) ..................................................................................................................................94
2.2 Dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine par chromatographie liquide haute performance couplée à une détection électrochimique.........................................................98
2.2.1 Détecteur ampérométrique et coulométrique ..........................................................98 2.2.2 Réactifs et matériel ..................................................................................................99 2.2.3 Dosage de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire........................................................103
vi
2.3 Induction et photoactivation des porphyrines endogènes.............................................105 2.3.1 Réactifs et matériel ................................................................................................105 2.3.2 Méthode d'induction des porphyrines....................................................................113 2.3.3 Dosage fluorimétrique des porphyrines intra- et extra-cellulaires ........................113 2.3.4 Dosage des protéines .............................................................................................114 2.3.5 Examen en microscopie de fluorescence...............................................................115 2.3.6 Irradiation UVA et visible .....................................................................................115
2.4 L'Essai "Comète" (single cell gel electrophoresis) ......................................................116 2.4.1 Réactifs et matériel ................................................................................................116 2.4.2 Mode opératoire.....................................................................................................118 2.4.3 Mesure des comètes...............................................................................................119
2.5 Méthodes statistiques....................................................................................................122
3. Résultats et Discussion : Développement et validation du dosage de la 8-oxo-7,8- dihydro-2'-désoxyguanosine dans l'ADN cellulaire ...............................................................123
3.1 Introduction : les méthodes de dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxodG) ...........................................................................................................................124 3.2 Développement du dosage de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire par CLHP couplée à une détection électrochimique............................................................................125
3.2.1 Choix des conditions chromatographiques............................................................125 3.2.2 Digestion enzymatique ..........................................................................................130 3.2.3 Extraction de l'ADN cellulaire ..............................................................................134
3.3 Validation de la méthode analytique ............................................................................136 3.3.1 Spécificité ..............................................................................................................136 3.3.2 Linéarité.................................................................................................................143 3.3.3 Exactitude ..............................................................................................................174 3.3.4 Précision ................................................................................................................184 3.3.5 Sensibilité ..............................................................................................................191 3.3.6 Seuils de détection et de quantification .................................................................196 3.3.7 Robustesse .............................................................................................................198 3.3.8 Stabilité des analytes .............................................................................................200 3.3.9 Validation inter-laboratoires..................................................................................204
3.4 Discussion et conclusion ..............................................................................................205 3.4.1 Intérêt du dosage de la 8-oxodG............................................................................205 3.4.2 Intérêt de la méthode validée.................................................................................210 3.4.3 Conclusions ...........................................................................................................211
4. Résultats et Discussion : Photoactivation des porphyrines endogènes et induction de 8-oxodG .............................................................................................................................212
4.1 Induction des porphyrines endogènes...........................................................................213 4.1.1 Généralités sur les porphyrines .............................................................................213 4.1.2 Résultats : Spectroscopie de fluorescence .............................................................219 4.1.3 Résultats : Cinétique d'induction ...........................................................................226 4.1.4 Résultats : Microscopie de fluorescence ...............................................................227 4.1.5 Discussion et conclusion .......................................................................................228
4.2 Résultats : Porphyrines et Dégâts Photodynamiques aux acides nucléiques................229 4.2.1 Induction de bases oxydées ...................................................................................229 4.2.2 Paramètres impliqués dans la photooxydation de l'ADN......................................231
vii
4.3 Résultats : Tests de cytotoxicité MTT..........................................................................235 4.4 Discussion.....................................................................................................................237
4.4.1 La problématique de la carcinogenèse solaire, des UVA et de la 8-oxodG ..........237 4.4.2 Porphyrines et dommages à l'ADN .......................................................................241 4.4.3 Implications possibles de l'effet photodynamique mis en évidence......................245
4.5 Conclusion ....................................................................................................................247
5. Résultats et Discussion : Essai "comète"et photoactivation des porphyrines endogènes..248 5.1 L'essai comète...............................................................................................................249
5.1.1 Principe..................................................................................................................249 5.1.2 Mécanisme.............................................................................................................250 5.1.3 Applications de l'essai comète...............................................................................250
5.2 La place de l'essai comète dans les tests de génotoxicité .............................................251 5.2.1 Génotoxiques et tests de génotoxicité ...................................................................251 5.2.2 Les différents tests de génotoxicité .......................................................................252
5.3 Validation de l'essai comète .........................................................................................256 5.3.1 Reproductibilité .....................................................................................................257 5.3.2 Mise en évidence de quelques effets génotoxiques décrits ...................................264 5.3.3 Différence de sensibilité entre les mesures comète et CLHP................................270 5.3.4 Conclusion.............................................................................................................271
5.4 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Reproductibilité inter-électrophorèses et mise en évidence d'un effet...................................................................272
5.4.1 Protocoles mis en oeuvre.......................................................................................272 5.4.2 Etude de reproductibilité .......................................................................................273 5.4.3 Analyse de tendance ..............................................................................................301
5.5 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Utilisation d'endonucléases spécifiques. ..............................................................................................310
5.5.1 Les endonucléases utilisées ...................................................................................310 5.5.2 Protocole................................................................................................................311 5.5.3 Purines et pyrimidines oxydées .............................................................................312 5.5.4 Photoproduits dimères ...........................................................................................317
5.6 Discussion : la lumière et l'essai comète ......................................................................320 5.6.1 Formation de cassures de chaînes par une irradiation lumineuse..........................320 5.6.2 Dégâts oxydatifs, dimères de pyrimidine et irradiation lumineuse .......................322 5.6.3 Essai comète et bronzage artificiel ........................................................................323 5.6.4 Essai comète et effet photodynamique des porphyrines........................................324
5.7 Conclusions ..................................................................................................................325 5.7.1 L'essai comète........................................................................................................325 5.7.2 Effet photodynamique des porphyrines endogènes ...............................................327
6. Résultats et Discussion : Essai "comète"et photoactivation des porphyrines endogènes - Application à une lignée de mélanome humain .................................................328
6.1 Induction des porphyrines endogènes...........................................................................329 6.1.1 Spectroscopie de fluorescence...............................................................................329 6.1.2 Cinétique d'induction de la fluorescence intracellulaire........................................331 6.1.3 Microscopie de fluorescence .................................................................................331 6.1.4 Conclusion.............................................................................................................333
viii
6.2 Cytotoxicité du traitement photodynamique ................................................................333 6.3 Résultats de l'essai comète............................................................................................335
6.3.1 Mise en évidence d'un effet génotoxique de référence..........................................335 6.3.2 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Analyse de tendance ....335
6.4 Discussion et conclusions.............................................................................................340 6.4.1 Mélanocytes et cassures de chaînes UV-induites ..................................................340 6.4.2 Effet pro-oxydant des mélanines ? ........................................................................341 6.4.3 Mélanome et porphyrines ......................................................................................342 6.4.4 Conclusions ...........................................................................................................343
7. Conclusions générales ........................................................................................................344 7.1 Propos du travail...........................................................................................................345 7.2 Validation des méthodes analytiques ...........................................................................345
7.2.1 La méthode de dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine ..................345 7.2.2 L'essai comète........................................................................................................345
7.3 Effet photodynamique des porphyrines endogènes ......................................................346 7.4 Conclusions ..................................................................................................................347
8. Bibliographie ......................................................................................................................348
ix
1. Introduction
1
1.1 INTERET ET BUTS DU TRAVAIL
Les données acquises au cours des 15 dernières années montrent que l'ADN est une cible
primordiale de nombreux agents chimiques et physiques. Les mécanismes de défense
cellulaire sont en fait suppléés par les mécanismes de réparation de l'ADN et ce, dans une
proportion auparavant insoupçonnée. Il est à présent certain que, dans le processus de
carcinogenèse, l'induction de nucléotides modifiés, au potentiel mutagène établi, soit une des
causes majeures de la phase d'initiation.
L'étiologie des cancers cutanés non-mélanomes apparaît liée à l'exposition solaire et les
UVB (290-315 nm) en semblent la cause principale; leur énergie est directement absorbée par
les chromophores nucléotidiques pour induire des dimères cyclobutanes et des photoproduits
(6-4), hautement mutagènes. La contribution des UVA (315-400 nm) au processus
cancérigène n'est cependant pas négligeable, la fluence solaire augmentant considérablement
avec la longueur d'onde. Comme l'ADN n'absorbe quasi pas dans les UVA, les propriétés
mutagènes de cette bande de longueurs d'onde seraient en fait médiées par des espèces
réactives de l'oxygène, induites par la photoactivation de molécules endogènes non encore
identifiées. Bien que moins efficaces d'un facteur 1000 par rapport aux UVB, les UVA sont
également un carcinogène complet, à la fois initiateur et promoteur; ce seraient même les
principaux responsables des mélanomes.
Nous proposons d'examiner dans 2 modèles cellulaires in vitro si les porphyrines
endogènes sont des photosensibilisants capables de médier un stress oxydatif au niveau de
l'ADN. Après induction de leur synthèse et photoactivation par une source UV identique à
celles employées dans les salons de beauté, deux paramètres de l'oxydation de l'ADN ont été
détectés et quantifiés, (i) une base oxydée, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine, par
chromatographie liquide haute performance avec détection ampérométrique; et (ii) la
proportion de cassures de chaînes et de sites abasiques, par essai comète.
Ce travail tente de mettre en évidence un mécanisme possible d'initiation de la
cancérogenèse cutanée par le soleil, afin que les informations obtenues puissent contribuer à
une prévention plus efficace de ce problème de santé publique, devenu majeur dans nos
sociétés obsédées par le soleil et le bronzage.
2
1.2 LES DOMMAGES A L'ADN
1.2.1 Introduction
L'ADN est habituellement perçu comme une biomolécule stable, support inaltérable de
l'information génétique, qui se transmet fidèlement de génération en génération. La réalité est
cependant beaucoup plus complexe. L'ADN est en fait une molécule très réactive, à la
structure primaire dynamique et sujette à des modifications constantes. Sa réplication elle-
même est loin d'être exempte d'erreurs et la fidélité de l'information génétique transmise est
due bien plus à d'extraordinaires mécanismes de réparation et de correction d'erreurs qu'à
l'intangibilité de la molécule elle-même.
A côté de transformations de grande échelle, comme la transposition de gènes, l'ADN
subit des altérations au niveau des nucléotides, à la fois dans leur séquence et dans leur
structure chimique. Certaines erreurs peuvent être dues à l'instabilité inhérente aux liens
chimiques spécifiques des nucléotides, d'autres peuvent être introduites par les mécanismes de
réplication, de recombinaison et de réparation. L'ADN est également sensible à certains
agents physiques, à certains métabolites normaux de l'organisme ou de formes vivant en
symbiose avec celui-ci, ainsi qu'à de multiples composés chimiques, pour la plupart d'origine
environnementale.
Toutes les modifications1 de la structure moléculaire du matériel génétique sont
considérées sous le terme collectif de "dommages à l'ADN" et sont habituellement réparties
en deux classes majeures, "dommages spontanés" et "dommages environnementaux". La
frontière entre ces deux classes est cependant floue et certaines modifications chimiques
"spontanées" ne peuvent être distinguées de celles induites par interaction avec des agents de
l'environnement. Le terme "spontané" signifie parfois simplement qu'un coupable
environnemental n'a pu être mis en évidence.
Bien que tous les composants primaires de la molécule ADN (bases, sucres et liens
phosphodiesters) soient susceptibles d'être endommagés, cette introduction sera focalisée sur
les bases qui constituent le support signifiant de l'information (Figure 1.2-1).
Les réactions qui seront évoquées sont généralement plus efficientes pour l'ADN simple-
brin que pour l'ADN duplex. Le Tableau 1.2-1 présente un exemple de ce phénomène pour
1 Note : le plan de cette Section 1.1 est basé en partie sur celui adopté dans l'ouvrage "DNA repair and mutagenesis" (Friedberg et al., 1995)
3
Figure 1.2-1 : Les quatre bases principales de l'ADN
N
N N
N
NH2
1
23
4
56
7
8
9
Adénine
H2N
HN
N N
N
Guanine
O
1
23
4
56
7
8
9
HN
N
O
CH3
O
Thymine
12
34
5
6
N
N
NH2
O
Cytosine
12
3
45
6
Purines Pyrimidines
des réactions spontanées que peuvent subir les bases. Dans une cellule vivante, la plupart du
génome est probablement en permanence dans une configuration double-brin, si ce n'est lors
de dénaturations transitoires localisées, par exemple lors des processus de réplication, de
recombinaison ou de transcription. Cet ADN temporairement dénaturé pourrait donc être un
site privilégié pour une réaction chimique ou physique (Halliwell, 1998a; Halliwell et
Gutteridge, 1999; Marnett, 2000).
Tableau 1.2-1 : Temps requis pour une seule réaction spontanée (pH 7.4 et 37°C)
Temps pour une réaction (h) (a)
Réaction ADN simple-brin (2 x 106 bases(b))
ADN double-brin (1 x 106 paires de bases)
Dépurination 2.5 10
Dépyrimidination 50.8 200
Désamination de la cytosine 2.8 700
Désamination de l'adénine 140 n.d.
(a) Calculé à partir des constantes de vitesse des réactions (b) Rappelons que le génome d'une cellule mammifère contient environ 3 x 109 paires
de bases (Sambrook et al., 1989) (Friedberg et al., 1995)
4
Il faut cependant remarquer que les phénomènes de compactage de l'ADN dans les
nucléosomes ainsi que le reploiement de la chromatine influencent l'ensemble de ces réactions
(cf § 1.2.6.2 ).
1.2.2 Les altérations spontanées de l'ADN
1.2.2.1 Le mésappariement de base ("mismatch")
Le mésappariement de bases lors de la synthèse semiconservatrice représente la principale
source d'altération de l'ADN lors du métabolisme normal. La différence d'énergie libre entre
l'appariement avec la base complémentaire et le mésappariement est équivalente à l'énergie
d'un lien hydrogène, soit seulement 20kJ/mole. En l'absence d'autres facteurs cellulaires, ces
facteurs énergétiques correspondraient à une fréquence d'erreur potentielle de 1 à 10% par
nucléotide; la fréquence de mutation spontanée lors de la réplication est en réalité moindre de
6 à 9 ordres de grandeur logarithmique. En fait, comme démontré chez Escherichia coli, le
réplisome, un complexe entre ADN polymérases et protéines accessoires, apporte une
contribution significative à la fidélité de réplication en combinant une sélection stricte des
bases à une relecture-excision des nucléotides nouvellement insérés; les bases voisines
semblent également jouer un rôle dans ces mécanismes de relecture (Nelson et Cox, 2000).
Les cellules eucaryotes contiennent au moins 5 ADN polymérases2 qui ont également une
fonction performante de relecture-excision des bases nouvellement insérées. De plus,
l'utilisation d'amorces ARN pour l'initiation de la synthèse permettrait d'assurer l'intégrité du
message génétique, de par l'excision ultérieure des séquences d'initiation, susceptibles de
contenir un nombre élevé d'erreurs (Nelson et Cox, 2000).
1.2.2.2 Le réarrangement tautomère des bases
Chacune des quatre bases peut subir un réarrangement transitoire spontané de ses liaisons
pour former un isomère de structure ou tautomère, ce qui altère sa faculté à former des liens
hydrogènes (les fonctions amines, peuvent se réarranger sous leur forme tautomère rare imine
NH et les fonctions cétones peuvent passer en configuration énol; cf Figure 1.2-2). D'autres
causes possibles de mésappariement ont été proposées, comme une rotation de 180° des bases
autour du lien glycosidique (passage en configuration syn) ou l'inclusion d'une molécule d'eau
pour jouer un rôle de pont.
2 Les polymérases α démarreraient la réplication de l'ADN alors que les polymérases δ, et peut-être ε, en continueraient la synthèse. La polymérase β est largement impliquée dans les phénomènes de réparation et la γ, présente dans les mitochondries, assure la réplication de l'ADN mitochondrial (Halliwell et Gutteridge, 1999).
5
Figure 1.2-2 : Mésappariements induits par les formes tautomères des bases
(Friedberg et al., 1995) Lors de la réplication, il est possible qu'une base, qui se trouverait sous une forme
tautomère rare dans la chaîne d'ADN répliquée, induise un mésappariement et donc une
mutation ponctuelle dans la chaîne fille. La réelle contribution de ces scénarios aux altérations
spontanées de l'ADN reste cependant inconnue (Venkateswarlu et Leszczynski, 1998).
1.2.2.3 La désamination de bases
Quatre des bases normales de l'ADN (cytosine, adénine, guanine, mais aussi la 5-
méthylcytosine) portent des groupes amines exocycliques. Une désamination spontanée, pH-
et temperature-dépendante, peut se produire, résultant en la conversion de la base affectée en,
respectivement, uracile, hypoxanthine, xanthine et thymine (Friedberg et al., 1995; Nelson et
Cox, 2000). Certaines de ces lésions sont mal-codantes, elles peuvent résulter en
l'incorporation d'une base non correcte lors de la réplication semiconservatrice. Pour la
cytosine, il a été démontré que la désamination peut être augmentée par des facteurs stériques
ou chimiques tels que les dimères cyclobutanes UV-induits, les agents intercalants ou la
6
présence d'une base mésappariée ou alkylée en face de la cytosine (Viswanathan et al., 1999).
De tels facteurs affectent vraisemblablement les autres bases d'une façon similaire.
Les désaminations spontanées peuvent également être catalysées par certains agents
chimiques, notamment le NO (Wink et al., 1991).
Figure 1.2-3 : Principaux produits formés à partir de la désamination des bases de l'ADN
N
N N
N
NH2
1
23
4
56
7
8
9
Adénine
H2N
HN
N N
N
Guanine
O
1
23
4
56
7
8
9
HN
N
O
CH3
O
Thymine
N
N
NH2
O
Cytosine
12
3
45
6
HN
N
NH2
O
5-méthyl-Cytosine
12
34
5
6
N
N N
N
O
Hypoxanthine
O
HN
NH
N
N
Xanthine
O
HN
N
O
O
Uracile
CH3
D'après (Friedberg et al., 1995)
1.2.2.4 Perte de bases - Dépurination et dépyrimidination
Ces réactions sont bien connues en milieu acide mais mal caractérisées en milieu neutre.
Elles se produiraient par protonation de la base, suivie d'un clivage du lien glycosidique, ce
qui résulte en un site abasique. Le lien phosphodiester se rompt alors lentement en donnant
naissance à une cassure de chaîne. De tels sites abasiques sont sensibles à un traitement par un
alcali fort qui génère des lésions simple-brins pouvant être mises en évidence; ces sites sont
7
dits alcali-labiles. Chez les mammifères, les pertes ont été extrapolées à 10000 purines et à
plusieurs centaines de pyrimidines par cellule par cycle cellulaire (cf Tableau 1.2-1).
1.2.2.5 Dommages oxydatifs
L'attaque par les espèces réactives de l'oxygène (reactive oxygen species ou ROS) est une
source majeure de dégâts spontanés à l'ADN mais aussi aux autres biomolécules que sont les
lipides, les protéines et les glucides.
Les radicaux oxygénés ont des sources intra- et extracellulaires variées. Les "fuites"
d'électrons associées à la réduction de l'oxygène en eau au long de la chaîne respiratoire
mitochondriale en constituent certainement la source intracellulaire principale. Les réactions
peroxysomales et microsomales, la synthèse enzymatique du NO•, le métabolisme associé à la
phagocytose, certaines enzymes oxydantes et certaines réactions d'auto-oxydation sont
d'autres sources endogènes d'espèces réactives de l'oxygène (Sahnoun et al., 1997; Halliwell
et Gutteridge, 1999). Le Tableau 1.2-2 détaille la structure des différents ROS ainsi que leur
temps de demi-vie; celui-ci se corrèle bien entendu à la réactivité de la molécule.
Tableau 1.2-2 : Structure des principales espèces réactives de l'oxygène
Espèces réactives de l'oxygène Temps de demi-vie à 37°C (sec)
Radicalaires
O2• - anion superoxyde 10-6 (destruction enzymatique)
HO2• radical hydroperoxyle faible (destruction enzymatique)
•OH radical hydroxyle 10-9
ROO• radical peroxyle de 10-2 à quelques secondes
RO• radical alkoxyle 10-6
Non-radicalaires
H2O2 peroxyde d'hydrogène faible (destruction enzymatique)
HOCl acide hypochloreux faible (destruction enzymatique) 1O2 oxygène singulet 10-5 - 10-6
ONOO- peroxynitrite 0.05 – 1
O3 ozone n.d.
O2 oxygène moléculaire > 102
ROOH peroxyde de lipide > 102
(Sies, 1993; Yu, 1993; Halliwell et Gutteridge, 1999)
8
L'attaque radicalaire de l'ADN produit un ensemble complexe de lésions. L'attaque du
squelette osidique mène à des cassures de chaînes et des pertes de bases; l'attaque des bases
puriques et pyrimidiques résulte en bases oxydées qui peuvent soit bloquer la réplication, soit
mener à des mésappariements, donc à des mutations ponctuelles. Les radicaux oxygénés
peuvent aussi agir en facteurs clastogéniques, c'est-à-dire causer des fragmentations de
chromosomes. Il semble en outre que les ROS puissent induire dans les cellules mammifères
un facteur clastogénique diffusible et transmissible, un mélange complexe de substances
capable de déclencher ce phénomène dans d'autres cellules que celles touchées par les espèces
réactives (Friedberg et al., 1995; Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999; Marnett,
2000).
Les sources extracellulaires de ROS incluent les radiations ionisantes et lumineuses
(principalement les UVA), la chaleur ainsi que de nombreux composés chimiques.
En raison de son importance pour notre travail, ce sujet sera développé de manière
approfondie dans la section 1.2.
1.2.3 Les altérations environnementales de l'ADN : les agents physiques
Depuis le début de la vie sur notre planète, les radiations ionisantes et ultraviolettes ont été
une source de dégâts à l'ADN des organismes vivants et probablement un des moteurs mêmes
de leur évolution. L'utilisation relativement récente des radiations ionisantes à des fins
médicales, énergétiques et militaires en augmente cependant considérablement le risque
d'exposition environnementale. De même, la modification des styles de vie et le recours au
bronzage artificiel accroissent l'exposition aux UV d'une grande partie de la population.
1.2.3.1 Les radiations ionisantes
1.2.3.1.1 Source des dégâts à l'ADN
Ces radiations causent des dommages aléatoires à tous les composants cellulaires et
induisent des dégâts considérables à l'ADN, qui peuvent être de type direct ou indirect. Alors
que les effets directs résultent de l'interaction directe entre la radiation et l'ADN, les effets
indirects sont dus à l'interaction entre l'ADN et diverses molécules excitées ou ionisées
induites par le transfert d'énergie. En effet, dans les cellules vivantes, l'ADN se trouve dans un
environnement composé d'eau, d'ions et de nombreuses molécules qui sont autant de sources
possibles d'espèces excitées. Cette multiplicité de réactifs et de mécanismes de réactions
potentiels explique la grande diversité de lésions qui peuvent être induites (Halliwell, 1998b).
9
De par la prédominance de l'eau dans les systèmes biologiques, les espèces réactives
principales 3 sont formées par sa radiolyse (80 % de l'énergie ionisante) :
2 H2O H2O+ + e- + H2O*
H2O+ + H2O •OH + H3O+
H2O* •OH + H• •OH + •OH H2O2
e-aq + O2 O2
• -
2 O2• - + 2H+ O2 + H2O2
Rappelons que le peroxyde d'hydrogène génère des radicaux hydroxyles par la réaction de
Fenton, catalysée par les métaux :
H2O2
Mn+ M(n +1) +
•OH + OH-
Et, en fait, la majorité des dégâts indirects à l'ADN apparaît médiée par les radicaux
hydroxyles. Ceux-ci seraient responsables d'environ 65 % des dégâts contre 35 % dus à
l'ionisation directe de la molécule (Halliwell, 1998b; Halliwell et Gutteridge, 1999). De
nombreux aspects qui seront évoqués dans le chapitre consacré aux radicaux libres
s'appliquent donc aux dommages radio-induits.
1.2.3.1.2 Dégâts aux bases et au squelette osidique
En ce qui concerne les bases, il y a apparition de bases oxydées, de dimères et de dérivés
cyclisés (Frenkel et al., 1981; Dizdaroglu, 1985; Halliwell, 1998b). La formation de
dommages groupés est caractéristique des lésions radio-induites; il semble qu'un seul impact
énergétique puisse générer plusieurs réactions radicalaires dans le voisinage proche. La
densité locale de dégâts dépend du rayonnement, mais également des dimensions spatiales des
molécules d'ADN compactées. Une base altérée peut également résulter en une labilisation,
puis une rupture de la liaison base-sucre, générant un site abasique alcali-labile.
Les dommages à la chaîne osidique de l'ADN résultent en cassures simple-brins et double-
brins, ces dernières contribuant majoritairement à l'effet létal des radiations (Sahnoun et al.,
1997; Halliwell, 1998b; Halliwell et Gutteridge, 1999).
10
3 Note : H2O* est un état excité de l'eau
Bien que les études manquent sur le sujet, il est possible que les dimérisations de bases
permettent la formation de liens croisés entre brins d'ADN complémentaires; de même, la
génération de dimères thymidine-tyrosine pourrait entraîner des liaisons ADN-protéines.
1.2.3.2 Les radiations UV
L'influence de la lumière UV, ressentie par tous les organismes à la surface de la terre, a
de formidables conséquences biologiques, à la fois favorables et néfastes.
Le spectre UV est conventionnellement divisé en 3 zones, appelées UVC (100 à 290 nm),
UVB (290 à 315 nm) et UVA (315 à 400 nm); en raison de l'absorption drastique des UVC
par les couches supérieures de l'atmosphère, ceux-ci sont pratiquement absents du
rayonnement solaire à la surface de la terre. Bien que certains auteurs fixent la limite entre
UVB et UVA à 320 nm (cf § 1.3.4.2.7), le présent travail adopte la limite recommandée par la
Commission Internationale de l'Eclairage, soit 315 nm (Commission Internationale de
l'Eclairage, 1970).
Les lésions les plus importantes produites par une irradiation UVC ou UVB sont
certainement les dimères pyrimidines et les photoproduits 6-4 (Figure 1.2-4) (Strickland et al.,
1988). Ces modifications de bases contribueraient significativement. à la carcinogenèse
solaire dont la problématique sera abordée en détails dans les sections 1.3 et 1.4.
Figure 1.2-4 : Principaux photoproduits formés à partir de pyrimidines adjacentes
NH
N
O
O
S
NH
O
O
NH
N
O
O
NH
N
O
O
UVCUVB
Thymines adjacentes Dimère cyclobutanethymine-thymine
NH
N
O
O
NH
N
NH2
O
NH
N
O
O
N
N
O
UVCUVB
Thymine et cytosineadjacentes
Photoproduit (6-4)thymine-cytosine
HO
S
P
N
P
S S
PP
S S
PP
S S
PP
NH
N
O N
313 nm
Dewarpyrimidone
HO
S S
PP
N
O
O
Adapté de (Bootsma et al., 2001)
11
1.2.3.2.1 Les dimères pyrimidines cyclobutanes
Quand l'ADN est exposé à des radiations proches de son maximum d'absorption,
~ 260 nm (UVC), une pyrimidine absorbe un photon, passe à un état excité et réagit ensuite
avec une pyrimidine adjacente en formant une structure cyclique à 4 atomes; celle-ci résulte
de la saturation de leurs doubles liaisons respectives en 5,6 (Beissert et Granstein, 1995). La
structure formée par cette cycloaddition photochimique est appelée un dimère dipyrimidique
ou encore un dimère pyrimidine cyclobutane. Bien qu'il y ait 12 formes isomères théoriques
possibles, il ne s'en forme que 4 en quantités significatives, dans les configurations cis-syn,
cis-anti, trans-syn et trans-anti (Khattak et Wang, 1972). Les possibilités de reploiement de
l'ADN simple-brin permettent la formation de dimères entre pyrimidines non-adjacentes.
Figure 1.2-5 : Deux des principaux isomères de dimères dipyrimidiques et leur orientation
tridimensionnelle dans l'ADN de forme B
(Friedberg et al., 1995)
Le processus de cyclisation est influencé par la composition et la séquence en bases de
l'ADN et n'est donc pas un phénomène entièrement aléatoire; les cytosines méthylées sont un
site préférentiel de cette réaction (Mitchell, 2000). La cyclisation est réversible mais déplacée,
proportionnellement à l'intensité du rayonnement UV, vers la formation du dimère et ce
jusqu'à un état d'équilibre .
Ces dimères sont traditionnellement considérés encombrants et strictement non-codants,
12
ce qui conduirait à une déformation importante de la double hélice et à l'arrêt obligatoire de la
réplication. Des études thermodynamiques et spectroscopiques fines ont cependant montré
qu'un dimère dithymine cys-syn n'introduit que peu de distorsions dans l'hélice de l'ADN-B et
peut même s'apparier de manière correcte avec 2 adénines; le même dimère en configuration
trans-syn introduit quant à lui d'importantes perturbations dans la chaîne de l'ADN (Taylor et
al., 1990).
1.2.3.2.2 Les lésions pyrimidine(6-4)pyrimidone
Une irradiation UV de l'ADN peut également induire une lésion alcali-labile en une
cytosine, et beaucoup plus rarement en une thymine, localisée en 3' d'une pyrimidine; il s'agit
d'un photoproduit (6-4), appelé dimère pyrimidine(6-4)pyrimidone, une dipyrimidine non-
cyclobutane. Dans l'ADN irradié par les UV se retrouvent des produits (6-4) de TC, CC, plus
rarement TT, mais jamais CT. Comme pour les dimères cyclobutanes, les cytosines méthylées
sont un site préférentiel de cette réaction (Mitchell, 2000). Ces photoproduits (6-4) sont
générés de manière moins efficace que les dimères de pyrimidine (~15 %) (Peak et Peak,
1989) mais les fréquences relatives varient considérablement suivant les séquences d'ADN
(de 5.4 % à 276 %) (Mitchell et Nairn, 1989). Ils induisent une bien plus importante distorsion
de la double hélice. Une irradiation à 313 nm de ces produits génère un isomère Dewar
pyrimidinone (Figure 1.2-4) (Mitchell et Nairn, 1989).
1.2.3.2.3 Les hydrates de pyrimidines
Sous UV, l'addition d'une molécule d'eau sur la double liaison 5-6 de la cytosine génère un
dérivé 5,6-dihydro-6-hydroxy, l'hydrate de cytosine. La stabilité de cet hydrate est nettement
accrue lorsque la base est incorporée dans l'ADN et cette lésion pourrait être le photoproduit
monomère majeur de la désoxycytosine. Ce dérivé peut subir une désamination hydrolytique
en uracile. Le photoproduit 5-methylcytosine hydrate peut également subir une désamination
en thymidine hydrate instable qui se transformerait en thymine, générant une mutation
ponctuelle (Vairapandi et Duker, 1994).
1.2.3.2.4 Les thymine glycols
Une saturation photochimique de la double liaison 5-6 de la thymine résulte en thymine
glycols, un ensemble de bases oxydées majeures formées notamment par les radiations
ionisantes (cf Section 1.2).
1.2.3.2.5 Les lésions de purines
Des lésions complexes, dont certaines ne sont pas encore caractérisées, peuvent être
induites dans des purines, particulièrement si elles sont en position 3' de deux ou plusieurs
13
pyrimidines. Ces bases modifiées sont reconnues par des enzymes de réparation, ce qui
suggèrerait leur importance biologique (Friedberg et al., 1995).
1.2.3.2.6 Les liens croisés et les cassures de chaînes
Une irradiation UVC peut générer quelques cassures de chaînes, qui semblent avoir peu
de conséquences biologiques, ainsi que des liens croisés ADN – protéines; si la molécule
d'ADN est à l'état sec, très fortement compactée ou dans des conformations très particulières,
les UVC peuvent également induire des liens croisés ADN – ADN.
Dans les cellules eucaryotes, l'ADN nucléaire est en contact étroit avec des protéines
chromosomales, au sein de la chromatine; une telle proximité des protéines favorise
l'établissement de liens croisés ADN – protéines. La nature chimique de ces liens est encore
mal connue mais certains photosensibilisants peuvent catalyser ce type de réaction.
La fréquence des cassures de chaînes et des liens croisés ADN – protéines augmente de
manière drastique avec la longueur d'onde.
1.2.3.2.7 Les réactions photosensibilisées
A côté de toutes les photolésions de l'ADN qui résultent de l'absorption directe des
photons par les bases, des réactions de photosensibilisation peuvent se produire. Dans ce cas,
les photons sont absorbés par d'autres espèces moléculaires, les photosensibilisants. Ceux-ci
transfèrent ensuite leur énergie, soit directement aux bases nucléiques (Photosensibilisation
de Type I) (Lamola et Yamane, 1967), soit à l'oxygène, résultant notamment en oxygène
singulet, une réaction appelée effet photodynamique (Photosensibilisation de Type II)
(Halliwell et Gutteridge, 1999). Le spectre possible de dommages oxydatifs à l'ADN induits
par ces réactions de type II sera présenté dans la section 1.2; les mécanismes de
photosensibilisation seront détaillés dans la section 1.3.
1.2.4 Les altérations environnementales de l'ADN : les agents chimiques
Après de premières études à visées militaires et chimiothérapeutiques, le domaine des
altérations chimiques à l'ADN a connu une forte extension, probablement motivée par les
exigences du public devenu méfiant à l'encontre des risques carcinogènes et mutagènes
environnementaux.
La formation de liens covalents entre les bases de l'ADN et différents types de composés
conduit à un type de lésions appelées les adduits à l'ADN. Ces adduits peuvent impliquer des
constituants cellulaires comme les protéines ou des intermédiaires métaboliques, mais aussi
de nombreux xénobiotiques parmi lesquels des médicaments, des cosmétiques, des polluants
14
ou encore des composés issus de l'alimentation. Quelques exemples seront abordés, soit pour
leur représentativité, soit pour leur importance dans ce travail.
1.2.4.1 Les agents alkylants
Les alkylants sont des composés électrophiles de structures variées qui ont une affinité
pour les centres nucléophiles des macromolécules organiques. La plupart de ces composés
sont des carcinogènes reconnus. Cependant, certains intermédiaires métaboliques, comme la
S-adénosyl-méthionine, sont également capables d'alkyler l'ADN; dans ce cas, il s'agit d'une
fonction cellulaire normale qui présente une importance physiologique.
Les sites d'alkylation potentiels des bases nucléiques sont variés, mais ne présentent pas
tous la même réactivité. De plus, leur localisation n'est pas aléatoire; elle dépend de l'agent
alkylant, de la séquence en bases et de l'encombrement stérique, qui est fonction de la
conformation de l'hélice d'ADN (Pieper, 1998).
L'alkylation de la base labilise son lien N-glycosidique, ce qui peut entraîner la formation
de sites abasiques alcali-labiles; le lien phosphodiester peut également être alkylé en un
phosphotriester (Pieper, 1998).
Les alkylants peuvent être classés en agents monofonctionnels et bifonctionnels (Lawley,
1995). Ces derniers portent 2 groupes réactifs, sont donc potentiellement capables de réagir
avec 2 sites dans l'ADN et de générer des liens croisés, soit au sein du même brin d'ADN
(liens croisés intra-caténaires), soit entre les 2 brins complémentaires (liens croisés inter-
caténaires). Ces derniers empêchent la séparation des 2 brins, bloquant de fait la réplication et
la transcription, et sont employés en chimiothérapie anti-cancéreuse (moutardes azotées, cis-
platine,…). Ce type de composés peut également induire des liens croisés ADN – protéines.
1.2.4.2 Les agents intercalants de type psoralène
Ces furocoumarines possèdent une configuration tricyclique plane qui peut s'intercaler
dans l'ADN; par irradiation UVA, elles forment un adduit covalent avec les pyrimidines,
principalement par addition sur la double liaison 5-6 de la thymine. Les molécules totalement
planes (par exemple, le 8-methoxypsoralène) présentent une géométrie idéale qui leur permet
de réagir avec une pyrimidine à chaque bout de la molécule, et ce par 2 absorptions
indépendantes de photons UV. Elles peuvent donc générer des liens croisés inter-caténaires
qui induisent une forte distorsion et un déroulement partiel de l'hélice d'ADN (Gruenert et al.,
1985).
15
1.2.4.3 Les composés activés par métabolisation
Un ensemble de composés relativement non polaires peut subir une activation
métabolique en formes électrophiles capables de réagir avec les centres nucléophiles de
l'ADN, devenant par là-même des mutagènes et des carcinogènes puissants. Les enzymes
impliquées dans une telle activation de carcinogènes sont notamment les cytochromes P450,
les glutathion S-transférases, les sulfotransférases, les acétyltransférases, les UDP-
glucuronosyltransférases, les enzymes catalysant les réactions d'adénosylation et de
méthylation (Halliwell et Gutteridge, 1999).
Le benzo[a]pyrène (Leadon et al., 1995), le paraquat (Peter et al., 1992; Gupta et al.,
1997), les aflatoxines (Friedberg et al., 1995) et les nitrosamines (Bartsch et al., 1989) sont
des exemples classiques de ce type d'activation métabolique.
A titre d'illustration, nous présenterons le schéma d'activation postulé pour la N-nitroso-
diméthylamine (Figure 1.2-6). L'hydroxylation d'un des carbones α de la molécule et sa
désalkylation en diazonium sont catalysées par différentes isoformes du cytochrome P450. Le
composé résultant, l'ion méthylcarbonium, est un puissant agent alkylant (Rowland, 1988).
Pour ces nitrosamines, une activation indépendante des cytochromes P450 a également été
décrite, qui requiert soit l'intervention de radicaux hydroxyles, soit une photolyse par les
radiations UV (Bartsch et al., 1989).
Figure 1.2-6 : Activation métabolique de la N-nitroso-diméthylamine
N N
OH3C
H3C
N N
OH3C
HOH2C
N N
OH3C
H
+ HCHO
N NOHH3C
CH3+
+ N2
Hydroxylationenzymatique
D'après (Rowland, 1988)
16
1.2.4.4 L'incorporation d'analogues de bases nucléiques
Il a été démontré in vitro que certains désoxynucléotides endommagés pouvaient être
incorporés dans l'ADN au cours de la réplication d'une chaîne intacte. D'autre part, une
enzyme spécifique, qui dégrade la désoxyguanosine triphosphate hydroxylée en position 8
(8-oxodGTP), a été récemment mise en évidence, ce qui semble indiquer l'existence d'un
mécanisme visant à détruire ce nucléotide oxydé avant son incorporation dans l'ADN (Wani
et al., 1998). La pertinence et l'importance biologique éventuelle de ces phénomènes restent
cependant à étudier.
1.2.4.5 Adduits divers
Des adduits volumineux ont été détectés dans le foie de patients souffrant de la maladie de
Wilson (accumulation de cuivre) et d'hémochromatose (accumulation de fer), mais n'ont pu
être identifiés (Carmichael et al., 1995). De grandes quantités d'adduits lipophiles à l'ADN ont
été récemment mises en évidence par 32P – CLHP (Yang et al., 1998).
1.2.5 La réparation des dégâts à l'ADN
La tâche à assurer par les mécanismes de réparation est immense; il s'agit en effet de
surveiller en continu, dans chaque noyau de l'organisme, les 2 mètres de la double hélice de
l'ADN, soit 3 x 109 paires de bases, à la recherche de lésions chimiquement très variées et
présentes à l'état de traces (Bootsma et al., 2001). Plusieurs mécanismes extrêmement
efficaces ont été mis en évidence, à la fois chez les procaryotes, les eucaryotes et les
mammifères (Tchou et al., 1991; Bjoras et al., 1997; Boiteux et Radicella, 1998; Jaiswal et al.,
1998; Moller et Wallin, 1998; Bootsma et al., 2001) (Tableau 1.2-3).
Tableau 1.2-3 : Les principaux mécanismes de réparation des dommages à l'ADN
Type de lésion Mécanisme de réparation
Modification de bases (alkylation, oxydation, formation d'un adduit,…)
réversion directe excision de bases excision de nucléotides réparation post-réplication
Liens croisés intracaténaires réversion directe excision de nucléotides
Liens croisés intercaténaires excision de nucléotides recombinaison
Cassures mono-brins ligation
Cassures double-brins ligation recombinaison
17
1.2.5.1 La réparation par réversion directe
Il s'agit du mécanisme le plus simple; la liaison entre la base et l'adduit est brisée par une
enzyme de manière directe. Les enzymes impliquées dans ces mécanismes sont :
• les photolyases qui réparent les dimères cyclobutanes et les dérivés (6-4) UV-induits.
De manière originale, l'énergie nécessaire à la rupture du lien covalent est fournie à
l'enzyme par une ré-irradiation à une longueur d'onde supérieure (300 à 600 nm); il
s'agit donc d'une photoréactivation enzymatique via un cofacteur catalytique FAD et
un chromophore capteur de lumière. L'existence de ce mécanisme chez les humains
reste controversée (Thoma, 1999).
• la O-6-méthylguanine-DNA-méthyltransférase et la N-méthylpurine-DNA-
glycosylase qui réparent les bases méthylées (Pieper, 1998).
1.2.5.2 La réparation par excision de bases (base excision repair, BER)
Ce mécanisme est un des plus importants (Wilson et Thompson, 1997); il permet en effet
de réparer une série de lésions, incluant les sites abasiques, les cytosine et 5-méthyl-cytosine
désaminées, les bases oxydées (Boiteux et Radicella, 1999) et, dans une moindre mesure, les
lésions d'alkylation, à condition que le groupement alkyle ne soit pas trop volumineux
(Wilson et Singhal, 1998). Il remplace de 1 à 5 bases dans le brin lésé.
Quatre types d'enzymes interviennent successivement :
• les ADN-glycosylases qui identifient la lésion et rompent le lien N-glycosidique,
générant un site apurinique ou apyrimidique (AP); plusieurs enzymes ont été
identifiées et présentent des spécificités différentes (Tableau 1.2-4);
• l'AP-endonucléase qui catalyse la rupture du lien phosphodiester du côté 5', générant
un 5'-désoxyribose-phosphate et un résidu 3'-OH; chez les mammifères, il n'existe
qu'une seule AP-endonucléase;
• les ADN-polymérases; la longueur du fragment synthétisé varie en fonction des
polymérases impliquées et 2 mécanismes peuvent être distingués, short patch repair
et long patch repair;
• les ADN-ligases qui scellent le fragment nouvellement incorporé.
Le BER est extrêmement efficace et rapide; les cinétiques d'excision de quelques bases
oxydées ont notamment été mesurées dans des lymphoblastes humains préalablement traités
par du peroxyde d'hydrogène (Tableau 1.2-5) (Jaruga et Dizdaroglu, 1996).
18
Tableau 1.2-4 : Spécificité de quelques ADN-glycosylases
Enzyme Substrats
uracile-ADN-glycosylase uracile
3-méthyladénine-ADN-glycosylase 3-méthylpurines, 7-méthylpurines, bases éthylées, hypoxanthine, éthénoadénine
pyrimidine hydrate-ADN-glycosylase pyrimidines oxydées
formamidopyrimidine-glycosylase formamidopyrimidines, 8-oxodG
thymine mismatch-ADN-glycosylase thymine et uracile dans T:G et U:G
D'après (Wood, 1996)
Tableau 1.2-5 : Demi-vie de bases oxydées dans l'ADN cellulaire humain
Bases très rapidement excisées
Demi-vie (min)
Bases à excision plus lente
Demi-vie (min)
8-oxodA 12 FaPy-guanine 34 5-hydroxy-cytosine 12 8-oxodG 55 5-hydroxy-uracile 8.5 xanthine 38 5-hydroxyméthyl-uracile 11 FaPy-adénine 62
D'après (Jaruga et Dizdaroglu, 1996)
1.2.5.3 La réparation par excision de nucléotides (nucleotide excision repair, NER)
Ce mécanisme permet la réparation d'un nombre remarquable de lésions qui n'ont entre
elles aucun rapport de structure; pour agir, il nécessite à la fois une distorsion structurale et
une modification chimique dans les bases. Le NER intervient pour de nombreuses adduits qui
déforment la double hélice, par exemple les adduits formés avec des carcinogènes comme le
benzo[a]pyrène. Il peut également réparer des adduits avec de petits composés chimiques, les
photolésions du type dimère de pyrimidine et photoproduits 6-4 ainsi que les liens croisés
inter-caténaires. In vitro, il nécessite une trentaine de polypeptides (Moggs et Almouzni,
1999) qui interviennent dans un mécanisme fort semblable au précédent, si ce n'est qu'il y a
remplacement, non plus de 1 à 5 bases, mais bien de 25 à 30.
Les mécanismes exacts du NER ne sont pas encore élucidés; suivant différentes
conceptions, les protéines pourraient agir au sein d'un énorme complexe "réparosome" ou
interviendraient les unes après les autres (Batty et Wood, 2000).
19
Le processus, qui est régulé par des phosphorylations réversibles (Moggs et Almouzni,
1999), se déroule en 5 étapes4 :
• la reconnaissance de la lésion et de la déformation structurale;
• le changement de conformation; le brin d'ADN à exciser se relâche et se
décomplémentarise par l'intermédiaire de 2 hélicases;
• la double incision; une incision se produit de part et d'autre de la lésion, à une
distance de 2 à 8 nucléotides du côté 3' et 15 à 24 nucléotides du côté 5';
• l'excision du fragment lésé; les protéines intervenues ne se dissocient pas du
fragment excisé.
• la synthèse et le scellage en place du nouveau fragment.
Au moins 2 voies de réparation, en partie communes, ont été mises en évidences. Pour
l'ensemble du génome, la réparation génomique globale, telle que décrite ci-dessus, assure le
processus. Son efficacité varie fortement en fonction de la lésion, de sa localisation dans le
génome, de la conformation de la chromatine et de la phase du cycle cellulaire. Pour les gènes
structurellement actifs, la réparation couplée à la transcription élimine les lésions dans le
brin transcrit, directement pendant la transcription. Une réparation rapide et efficace est donc
possible pour résoudre le problème urgent que peut poser à la cellule le besoin de transcrire
un ADN endommagé. L'ARN-polymérase II assurerait la détection initiale de la lésion
lorsque son processus de transcription est bloqué par un site lésé; le déplacement de la
polymérase est alors requis pour que la réparation soit assurée (Bootsma et al., 2001). Pour
beaucoup de lésions, ce processus est plus rapide que le mécanisme global.
1.2.5.4 La réparation post-réplication des mésappariements de bases (mismatch repair)
Une série d'ADN-polymérases "à fidélité faible" a été récemment mise en évidence
(polymérases η, ξ, θ, ι, κ, λ, µ, Eso1p, hRev1); ces enzymes sont capables de répliquer l'ADN
malgré la présence d'une lésion. Elles agissent seules ou en concert pour répliquer un ADN
endommagé et diffèrent dans leur spécificité vis-à-vis d'un substrat. Par rapport aux
polymérases de réplication classiques, qui ont une fidélité d'environ 10-5 à 10-7, celles-ci se
4 Note : l'importance du NER dans les mécanismes de défense anti-cancéreux a été mise en évidence chez des patients atteints de xeroderma pigmentosum, une affection génétique rare autosomique récessive caractérisée par des déficiences dans cette voie de réparation. Ces patients présentent un taux extrêmement élevé de cancers cutanés induits par le soleil (1000 fois supérieur à la normale). Sept groupes complémentaires (de A à G) qui sont déficients dans différents gènes peuvent être distingués. Ces gênes codent, notamment, pour les protéines XPA à XPG requises pour la réparation par excision de nucléotides; les groupes A et B sont également déficients dans la réparation des gènes à haut degré de transcription. Un autre groupe de patients (variant XP) est déficient en une protéine qui permet la réplication semi-conservatrice à partir de sites endommagés (réparation post-réplication), la polymérase η (Bootsma et al., 2001; Cleaver et al., 2001).
20
caractérisent par une fidélité de l'ordre de 10-2 seulement. Ce qui pose pas mal de questions
quant à leur contribution aux mécanismes de réplication de l'ADN (Cleaver et al., 2001).
Quand l'ADN a pu être répliqué malgré une lésion, le mécanisme de réparation des
mésappariements peut intervenir. Il élimine ainsi les appariements incorrects qui peuvent
survenir suite à des délétions, des transversions, des bases lésées ou des erreurs des ADN-
polymérases. Cette réparation fait intervenir un grand nombre de protéines interagissant entre
elles; les étapes principales sont en fait très mal connues chez les mammifères.
1.2.5.5 La ligation des fragments mono-brins
Les ADN-ligases I et III sont mises en jeu pour recoller les fragments mono-brins qui sont
formés par hydrolyse du lien phosphodiester au niveau des sites abasiques, mais aussi par les
différents mécanismes de réparation que nous venons de voir.
1.2.5.6 La réparation des fragments double-brins
Les fragments double-brins sont parmi les lésions les plus problématiques; elles peuvent
mener à des cassures et à des réarrangements de chromosomes, à un processus prolifératif ou
à la mort cellulaire (Rathmell et Chu, 1998). Leur réparation est particulièrement délicate car
les ADN-polymérases ne peuvent tirer que peu d'information du brin complémentaire pour
reconstituer le puzzle (Haaf et al., 1999; Raderschall et al., 1999).
Deux mécanismes de réparation ont cependant été mis en évidence, la recombinaison
homologue (le double-brin est reconstruit à partir de l'information du chromosome
homologue) et la recombinaison non homologue (des complexes enzymatiques alignent et
recollent les fragments à assembler) (Rathmell et Chu, 1998; Haber, 2000).
1.2.5.7 La réparation des liens croisés inter-caténaires
Cette réparation combine 2 des mécanismes que nous venons de décrire, la réparation par
excision de nucléotides et la recombinaison. Elles procède en 3 étapes :
• Une incision dans la même chaîne, de chaque côté du lien croisé, génère deux
"trous", donc un fragment de nucléotides qui reste accroché au brin complémentaire
par le lien croisé et les liens hydrogènes.
• La recombinaison du brin lésé avec une chaîne homologue forme un intermédiaire
triple-brin; il y a ensuite excision du fragment comportant le lien croisé.
• Le brin complémentaire sert alors de modèle pour la synthèse du fragment manquant.
21
1.2.6 La structure de la chromatine et les dégâts à l'ADN
1.2.6.1 Structure de la chromatine
Dans les cellules eucaryotes, les molécules d'ADN sont organisées d'une manière bien
spécifique avec des protéines histones et non-histones pour former la chromatine, ce qui
permet un compactage d'un facteur ~10.000 de la double hélice de l'ADN dans les
chromosomes. L'ADN est associé aux histones pour s'organiser en nucléosomes, des unités
répétitives d'environ 200 paires de bases (160 à 260 suivant les organismes et les tissus),
enroulées à raison de ± 150 paires de bases autour d'octamères histones (association de 2
copies de chacun des histones H2A, H2B, H3 et H4), et ancrées par ± 50 bases sur l'histone
H1 (linker region ou région d'ancrage). Grâce à l'histone H1, les nucléosomes s'empileraient
en une fibre dite fibre de 300 Å. (Figure 1.2-7)
Figure 1.2-7 : Schéma des liaisons ADN/histone et fibre de 300 Å
(Calladine et Drew, 1997)
L'ensemble de ces opérations ne permet cependant qu'un compactage total d'un facteur
~ 40 et les niveaux d'organisation supérieure sont encore fort mal connus. Ils font intervenir
notamment de petites protéines dites High-Mobility Group (Calladine et Drew, 1997; Nelson
et Cox, 2000).
22
Dans l'ADN chromosomique, il y a une hétérogénéité structurelle prononcée de la
composition et de la séquence des nucléotides, mais aussi de l'activité fonctionnelle. La
majorité des gènes est inactivée par un ensemble de protéines qui élaborent avec les
nucléosomes un complexe répresseur. Une fraction mineure des gènes est cependant
continuellement transcrite ou toujours prête pour la transcription; leur structure peut inclure
des protéines histones acétylées ou ADP-ribosylées, des nucléosomes altérés dans la région
promotrice, un déploiement de la chromatine, une perte ou un réarrangement de nucléosomes
dans la région transcrite ou même une densité régionale particulière en ARN polymérase
(Moggs et Almouzni, 1999; Thoma, 1999). Certaines régions peuvent également s'associer
avec des protéines spécifiques, ce qui permet la régulation de l'expression de gènes. La
position du nuclésome sur la séquence d'ADN pourrait jouer un rôle fondamental dans
l'expression ou la répression d'un gène. A cette hétérogénéité structurelle et fonctionnelle se
superpose également une variabilité temporelle qui reflète les propriétés dynamiques de la
chromatine au cours du cycle cellulaire (Thoma, 1999).
Les déformations structurelles de l'ADN nucléosomal, sa mobilité et sa flexibilité
suggèrent une tendance à accommoder des lésions variées ainsi qu'une tolérance envers les
interactions avec certains agents chimiques et protéiques. L'impact des contraintes
structurelles des nucléosomes sur la formation des dégâts et leur réparation ainsi que l'impact
des lésions de l'ADN sur la structure et la position des nuclésomes restent des questions
fondamentales (Thoma, 1999).
1.2.6.2 Chromatine et dégâts à l'ADN
L'ADN des régions d'ancrage est sensible à la digestion par certaines nucléases; en
mesurant les dommages à l'ADN avant et après digestion enzymatique, les dégâts peuvent
donc être grossièrement localisés. Il apparaît que certaines formes de dommages ne sont pas
aléatoires quant à leur localisation dans le nucléosome. Ceci pourrait refléter des problèmes
d'accessibilité aux groupements réactifs des bases ou des problèmes d'encombrement stérique
pour la formation de certains adduits volumineux (Tableau 1.2-6) (MacLeod, 1995).
1.2.6.2.1 L'exemple des dégâts oxydatifs
L'étude in vitro des dégâts provoqués par des réactifs de type Fenton (Enright et al., 1992)
a montré que les dommages oxydatifs, cassures double-brins et 8-oxodG, dépendent à la fois
du réactif et de la région nucléosomale. Sur des fondements stériques, il est donc possible que
les changements structuraux de la chromatine qui accompagnent la transcription favorisent
l'accès aux gènes actifs d'attaques potentiellement mutagènes (Enright et al., 1996).
23
Tableau 1.2-6 : Distribution des lésions à l'ADN dans les nucléosomes
Type de dégâts
Examples
Taille de l'adduit et/ou distorsion de la
double hélice
Distribution dans les
nucléosomes
Radiations UVC et UVB
dimères cyclobutanes photoproduits (6-4)
++ +++
Aléatoire Région d'ancrage
Chimiques encombrants
N-acetoxy-2-acétylaminofluorène aflatoxine b1 benzo[a]pyrène
+++ Région d'ancrage
Petits agents alkylants
diméthylsulfate, méthylméthane sulfonate méthylnitrosourée, diméthylnitrosamine
+ +
Aléatoire Région d'ancrage
Radiations ionisantes
rayons X, rayons γ + Région d'ancrage (?)
Chimiques radio-mimétiques
bléomycine + Région d'ancrage
Agents formant des liens croisés
cis-dichloroplatine (II), psoralène +++ Région d'ancrage
D'après (Smerdon et Thoma, 1998)
1.2.6.2.2 L'exemple des photolésions dimères
En ce qui concerne les dégâts UV-induits, la flexibilité de l'ADN conditionnerait en fait la
possibilité de dommage (Thoma, 1999) et les séquences favorisant les courbures et les
déroulements constitueraient des sites préférentiels. Les dimères de pyrimidine sont répartis
uniformément dans le nucléosome, alors que les photoproduits (6-4) se concentrent
principalement dans les régions d'ancrage; cette différence de distribution pourrait être due à
la forte distorsion de chaîne que provoquent ces derniers, distorsion qui pourrait être rendue
localement difficile par l'enroulement autour des histones (Smerdon et Thoma, 1998; Thoma,
1999). Il est également possible que ce soient les nucléosomes qui changent de position suite
à l'induction d'un dommage; les octamères histone pourraient soit glisser le long de la
séquence d'ADN, soit se dissocier pour se réassembler à une autre position. Ce mouvement
permettrait de déplacer les adduits volumineux, qui provoquent de fortes distorsions de
chaîne, vers la zone d'ancrage (Schieferstein et Thoma, 1998; Thoma, 1999), un moyen très
simple de libérer les chaînes (Moggs et Almouzni, 1999)
Les dimères de pyrimidine présentent une distribution non aléatoire, avec une périodicité
de 10.3 paires de bases qui reflète la périodicité de l'enroulement de l'hélice d'ADN dans les
nucléosomes. Les zones éloignées du squelette histone semblent les plus exposées aux
24
dégâts UV. Par contre, et de manière inattendue, la distribution des lésions (6-4) est cette fois
parfaitement aléatoire (Friedberg et al., 1995; Smerdon et Thoma, 1998); il apparaît donc que
les nucléosomes peuvent tolérer la perte d'énergie entraînée par des lésions volumineuses qui
causent des distorsions sévères de l'ADN.
Une distribution hétérogène des lésions à l'ADN dépend aussi des protéines qui lui sont
liées; il n'y a pas de règle et la situation dépend des régions d'ADN et des protéines
constituant les complexes.
1.2.6.3 Chromatine et réparation
La structure de la chromatine influence également la réponse cellulaire aux dégâts subis;
elle conditionne en fait l'accessibilité des dommages aux mécanismes de détection de lésion et
de réparation, notamment les photolyases et les protéines du complexe NER (réparation par
excision de nucléotides) (Thoma, 1999). De sorte qu'un dommage donné pourrait être
particulièrement aisé et rapide à réparer si les mêmes mécanismes d'encombrement ou
d'hydrophobicité conditionnaient la position du dégât et l'accessibilité aux enzymes de
réparation (Pendrys, 1983; Schieferstein et Thoma, 1998; Thoma, 1999; O'Connor et al.,
2000).
1.2.6.3.1 La réparation par excision de nucléotides (NER)
Il semble que la phase de reconnaissance soit rapide dans les régions d'ancrage et procède
par glissement ou déploiement/reploiement de la fibre d'ADN pour le reste de la chromatine.
La reconnaissance serait plutôt tridimensionnelle (les enzymes en solution "plongent" sur une
lésion) que linéaire (les enzymes scannent toute la chaîne d'ADN à la recherche d'une lésion),
mais les 2 processus sont probablement concomitants. Les étapes suivantes ont besoin de
beaucoup plus de place, au moins 100 paires de bases (Moggs et Almouzni, 1999); celle-ci
pourrait provenir de la dynamique naturelle de la chromatine et d'un remodelage enzymatique.
Après réparation, les fragments d'ADN nouvellement insérés se trouvent
préférentiellement dans les régions d'ancrage (1/2 vie, 20 min) (Moggs et Almouzni, 1999) et
"migrent" au cours du temps pour finir distribués de manière homogène dans les
nucléosomes. Ce qui suppose une maturation de la chromatine, vraisemblablement en
plusieurs étapes, pour terminer la réparation (Smerdon et Thoma, 1998; Moggs et Almouzni,
1999; Thoma, 1999).
Rappelons que le NER est intimement lié à la transcription, elle-même fortement
dépendante de la structure de la chromatine. C'est notamment le cas pour la réparation des
25
photoproduits UV qui dépend du statut transcriptionnel des séquences à réparer (Pfeifer,
1997) et présente un caractère non aléatoire (Nakagawa et al., 1998).
1.2.6.3.2 La réparation par excision de bases (BER)
A notre connaissance, aucune corrélation n' a encore été démontrée entre le BER et la
structure de la chromatine. Pour certaines lésions (thymine glycols), mais pas pour d'autres, le
BER est lié à la transcription.
1.3 LES ESPECES REACTIVES DE L'OXYGENE ET LES DOMMAGES OXYDATIFS A L'ADN
1.3.1 Introduction
L'histoire géologique nous montre que la vie serait survenue sur notre planète, il y a quatre
milliards d'années, dans des conditions d'absence quasi totale d'oxygène. Un milliard d'années
plus tard, l'évolution du processus de la photosynthèse dans les algues bleues commençait à
générer de l'oxygène, transformant en un laps de temps relativement court la composition de
l'atmosphère. La filtration des UV, par l'oxygène mais aussi par la couche d'ozone générée
dans la stratosphère, a probablement permis aux organismes vivants de quitter la mer pour
lentement coloniser les terres (Figure 1.3-1).
Cette montée d'oxygène dans l'atmosphère a aussi probablement représenté une source de
dégâts considérables aux formes de vie anaérobies primitives. Certaines ont dû s'adapter,
inventer des moyens de défense appropriés et in fine évoluer pour tirer parti de cette molécule
omniprésente, en l'utilisant comme siphon d'électrons. Au cours de la respiration aérobie,
l'énergie provenant de la réduction de l'oxygène en eau est ainsi récupérée dans la molécule
hautement énergétique qu'est l'ATP.
Bien qu'indispensable à la vie aérobie, l'oxygène reste cependant un toxique ubiquiste
auquel tous les êtres vivants sont exposés de manière massive; certains auteurs vont même
jusqu'à le qualifier de polluant atmosphérique génotoxique majeur….(Halliwell et Gutteridge,
1999).
1.3.2 Propriétés fondamentales de l'oxygène
1.3.2.1 Oxygène moléculaire et oxygène singulet
Suivant la définition très large proposée par Halliwell et Gutteridge (Halliwell et Gutteridge,
1999), un radical libre est toute espèce chimique capable d'existence indépendante et qui
26
Figure 1.3-1 : Evolution de la teneur en oxygène dans l'air
(Wayne et Wayne, 1996)
comprend un ou plusieurs électrons non appariés. Le Tableau 1.3-1 nous montre que la forme
la plus stable de l'oxygène, la molécule diatomique, répond à cette définition. Elle possède en
effet 2 électrons non appariés, localisés dans 2 orbitales anti-liantes π* 2p différentes et
portant des spins identiques; il s'agit de l'état basal appelé aussi état triplet5 (Halliwell et
Gutteridge, 1999).
Si cet oxygène tente d'arracher une paire d'électrons (oxydation) à une autre molécule ou
atome, ces 2 électrons doivent également être de spins anti-parallèles pour entrer dans les 2
orbitales π* 2p. Cependant une paire d'électrons d'une orbitale atomique ou moléculaire ne
peut, de par le principe d'exclusion de Pauli, remplir ce critère. Cette importante restriction de
spin sur le transfert d'électrons amène l'oxygène à plutôt accepter les électrons un par un, ce
5 Les termes singulet et triplet proviennent du comportement magnétique des lignes du spectre d'émission de l'oxygène. L'oxygène triplet est paramagnétique car les champs magnétiques de ses 2 électrons célibataires sont orientés dans la même direction; les 2 électrons interagissent avec le champ magnétique externe et chaque raie du spectre d'émission se divise en trois raies contiguës. L'oxygène singulet est diamagnétique, les champs magnétiques des 2 électrons appariés s'annulant; les raies d'émission restent donc inchangées en présence d'un champ magnétique externe ((Sahnoun et al., 1997).
27
qui interdit ou ralentit sa réactivité vis-à-vis des non-radicaux. Par contre, un apport d'énergie
(22.4 kcal), via une molécule photo-excitée, peut amener les 2 électrons π* 2p en anti-
parallèle dans la même orbitale; l'oxygène est alors à l'état singulet 1∆g O2, une espèce non-
radicalaire mais extrêmement réactive (Figure 1.3-2). Ce phénomène est connu sous le terme
réaction de photosensibilisation de Type II. Un autre état singulet, l'état 1Σg+ O2, qui permet
également de lever la restriction de spin, peut aussi être formé (37.5 kcal); mais cet état est
fortement instable et se dégrade en 1∆g O2 qui est habituellement la seule espèce oxygène
singulet considérée en biologie, sous le symbole 1O2 (Floyd, 1993; Sahnoun et al., 1997;
Halliwell et Gutteridge, 1999).
Tableau 1.3-1 : Occupation des orbitales moléculaires de l'oxygène, de l'anion superoxyde, de
l'anion peroxyde et de l'oxygène singulet
Oxygène triplet (3Σg- O2)
Anion superoxyde
(O2• -)
Anion peroxyde(O2
2-) Oxygène singulet
(1∆g O2) Oxygène singulet
(1Σg+ O2)
π* 2p ↑ ↑ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑ ↓
π* p ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓
σ 2p ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓
σ* 2S ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓
σ 2S ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓
σ* 1S ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓
σ 1S ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓ ↑↓
D'après (Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999)
Figure 1.3-2 : Réactivité de l'oxygène avec les molécules biologiques
↑↑ Oxygène moléculaire
(Etat triplet)
+ ↑↓
Molécules biologiques (Etat singulet)
Pas de réaction (Eq.1)
↑↑ Oxygène moléculaire
(Etat triplet)
+
Energie (23 kcal)
↑↓ Oxygène singulet (Eq. 2)
↑↓ Oxygène singulet
+ ↑↓
Molécules biologiques (Etat singulet)
Oxydation (Eq. 3)
D'après (Floyd, 1993)
28
1.3.2.2 Espèces semi-réduites de l'oxygène
Les espèces réactives intermédiaires entre les 2 états redox extrêmes que sont l'oxygène et
l'eau (Figure 1.3-3) sont formées en très faibles quantités dans les systèmes biologiques.
Figure 1.3-3 : Chimie de l'oxygène; transferts d'électrons et de protons
(les potentiels redox sont rapportés à l'électrode normale d'hydrogène)
O2
•- -- •- --
Ces espèc
• l'anion su
traverser l
• le peroxy
• et le radic
molécule Le supero
1
- -
réaction, très
activation enz
e
O2
pKa H+
4.8
HO2•
es semi-réduit
peroxyde, O2•-
es membranes
de d'hydrogène
al hydroxyle,
proche de son
xyde
60 mV +
peut se t
efficace à pH
ymatique par
O2• - + O
e-
O2
pKa H+
> 16 HO2
-
pKa H+
11.8
H2O2
es de l'oxygène
, espèce chargé
via les canaux
, H2O2, qui pa•OH, qui réagit
site de formati
+ 816 mV
½ O2 + 2e- + 2H
940 mV
ransformer par
acide, est pratiq
la superoxyde
2• - + 2H+
e-
O + O
pKa H+ pKa H+ 11.9 > 16
• -
e
s
t
o
-
+
+
d
d
e
HO + HO
pKa H+ 14
H2O
HO• -
D'apr
sont :
négativement
ioniques
se aisément les
rès rapidement
n
460 mV
+
ismutation en p
uement inexista
ismutase.
H2O2
e-
HO
ès (Pierre, 1995)
au pH physiologique qui peut
membranes
et sans distinction avec toute
1770 mV
eroxyde d'hydrogène; cette
nte à pH neutre et requiert une
+ O2
(Eq. 4)
29
Le superoxyde est un excellent réducteur; il est notamment capable de réduire certains
métaux, tels le fer(III) ou le cuivre(II) :
O2
• - + M(n+1)+ O2 + M n+ (Eq. 5)
Le peroxyde d'hydrogène, quant à lui, réagit facilement avec un métal, par exemple le
fer(II), pour former le radical hydroxyle (Réaction dite de Fenton) :
H2O2 + M n+ OH- + •OH + M(n+1)+ (Eq. 6) Le bilan de ces 2 réactions s'établit comme suit (Réaction dite de Haber-Weiss) :
O2• - + H2O2
Métal
OH- + •OH + O2
(Eq. 7)
Le mécanisme de ces réactions est mal connu et passe vraisemblablement par la formation
de complexes intermédiaires; des espèces de type ferryl (fer(IV)) telles que (Fe=O)2+ sont
souvent proposées, mais n'ont pas été mises en évidence de manière concluante (Halliwell et
Gutteridge, 1999). Le métal agit comme catalyseur et est donc requis en quantités très faibles;
dans les cellules, le fer actif du point de vue redox est probablement en traces sous la forme
d'un complexe de poids moléculaire faible. Ces métaux sont également capables de catalyser
la décomposition des peroxydes organiques en radicaux alkoxyles et peroxyles :
ROOH + M n+ RO• + M(n+1)+ + OH- (Eq. 8)
ROOH + M(n+1)+ ROO• + M n+ + H+ (Eq. 9)
Le radical hydroxyle, par des réactions qui sont pratiquement diffusion-contrôlées, ajoute
ou soustrait un atome d'hydrogène aux biomolécules cibles pour former un autre radical; par
exemple :
RH + •OH HR•OH (Eq. 10)
RH + •OH R• + H2O (Eq. 11)
R'H + R• R' • + RH (Eq. 12) Si l'oxygène est présent, il peut réagir avec certains radicaux libres pour former des
radicaux, par exemple peroxyles :
30
R• + O2 ROO• (Eq. 13)
ROO• + R'H ROOH + R' • (Eq. 14)
Dans tous les cas (Eq. 10 à 14), une réaction en chaîne peut être initiée, menant à d'autres
radicaux; chaque hydroperoxyde formé peut également réagir en présence d'un métal comme
le fer ou le cuivre pour produire d'autres radicaux, propageant également la réaction. Ces
dégâts sont particulièrement importants quand ils se produisent dans les lipides insaturés des
membranes biologiques; une telle réaction mène à une véritable amplification d'une attaque
radicalaire, la peroxydation lipidique.
La localisation des dégâts oxydatifs aux biomolécules, lipides, protéines, ADN et ARN,
dépendrait largement de la proximité d'un métal ou de sa liaison à un site spécifique de la
molécule.
1.3.2.3 Le peroxynitrite
Le peroxynitrite ONO2-, formé par le couplage entre l'oxyde nitrique NO• et le superoxyde
O2•- a pour forme protonée l'acide peroxynitreux, ONO2H (pKa, 6.8). La vitesse de cette
réaction est 3.5 fois supérieure à la décomposition de O2•- catalysée par la superoxyde
dismutase (Burney et al., 1999). Le NO• et le superoxyde étant produits par les macrophages
et les neutrophiles, ONO2- est susceptible d'être produit en grandes quantités dans les sites
inflammatoires. Il y a différentes sources exogènes de peroxynitrite, incluant la fumée de
cigarette et l'exposition des nitrates aux UVC ou aux radiations ionisantes.
ONO2- est un oxydant très puissant, il peut capter 1 ou 2 électrons et est capable d'oxyder
les lipides, les protéines et l'ADN; il est diffusible et peut être pris en charge par certains
systèmes de transport. Il est capable de réagir par lui-même, mais aussi de générer par
décomposition (temps de ½ vie à 37°C de ONO2H, 1 s) des radicaux très réactifs, parmi
lesquels le radical hydroxyle (Douki et Cadet, 1996). Sa décomposition est fortement
accélérée en présence de CO2.
1.3.3 Les principales sources physiologiques d'espèces réactives de l'oxygène
Les sources exogènes d'espèces réactives de l'oxygène ont été envisagées dans la Section
1.1; rappelons que celles-ci peuvent être d'origine physique, mais aussi chimique.
1.3.3.1 La phosphorylation oxydative mitochondriale
De 85 à 90 % de l'oxygène consommé par les animaux est utilisé par les chaînes
respiratoires mitochondriales, un ensemble de transporteurs d'électrons qui sont soit mobiles,
soit liés aux membranes internes. Chacun de ces éléments a son propre potentiel redox, ce qui
permet une réduction contrôlée de l'oxygène en eau à partir des électrons générés par le
métabolisme énergétique cellulaire, notamment le cycle de de Krebs. Une partie des électrons
31
est cependant perdue en cours de route, aboutissant à la formation de O2• - (Nivière et
Fontecave, 1995). Le devenir de ce superoxyde reste un point de controverse; il aurait
apparemment peu de chances d'échapper aux superoxydes dismutases de l'organite de sorte
que le peroxyde d'hydrogène mitochondrial dériverait entièrement de ce superoxyde. Les
mitochondries peuvent également générer des radicaux hydroxyles.
L'ADN mitochondrial, qui représente chez l'homme 16569 paires de bases pour 37 gènes,
serait ainsi une cible privilégiée des attaques oxydatives. Cette hypothèse a conduit à une
tentative d'explication des modifications subies par l'organisme au cours du vieillissement
(Ames, 1989; Halliwell et Gutteridge, 1999). De par l'exposition continue de cet ADN à des
conditions pro-oxydantes, il pourrait en effet y avoir une accumulation de mutations qui
résulterait en des mitochondries incapables d'assurer suffisamment d'ATP pour un
métabolisme cellulaire correct.
En cas d'hypoxie suivie d'une réoxygénation brutale, par exemple lors d'une ischémie-
reperfusion, la chaîne de transport d'électrons ne peut absorber l'afflux d'oxygène trop brutal
et réduit celui-ci directement en superoxyde qui sera transformé par dismutation, directe ou
enzymatique, en peroxyde d'hydrogène. Si cet afflux massif de ROS dépasse les défenses
antioxydantes de la cellule, des dégâts à d'autres constituants cellulaires deviennent
inévitables (Nivière et Fontecave, 1995; Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.2 Les complexes enzymatiques du réticulum endoplasmique
Le réticulum endoplasmique, une structure cytoplasmique constituée d'une membrane en
un feuillet continu, extrêmement replié et soudé à la membrane nucléaire externe, comprend
un système de chaîne de transport d'électrons, les complexes enzymatiques cytochromes P450
et b5. Des fuites d'électrons, à la fois au niveau des cytochromes et de la réductase, peuvent
générer le superoxyde et le peroxyde d'hydrogène (Nivière et Fontecave, 1995; Sahnoun et
al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.3 La phagocytose et l'explosion respiratoire
Les membranes plasmiques de cellules spécialisées, principalement les leucocytes,
comportent un système complexe de transport d'électrons. Celui-ci permet de générer de
grandes quantités de superoxyde pendant le processus phagocytaire, un mécanisme de défense
essentiel contre les microorganismes. Après l'ingestion de particules opsonisées dans des
vésicules formées à partir de la membrane plasmatique, la NADPH oxydase est rapidement
activée, suivie d'une rapide explosion respiratoire qui génère du superoxyde, du peroxyde
32
d'hydrogène et, via la réaction de Haber-Weiss (Eq. 7) catalysée par un métal, le radical
hydroxyle. Par l'action de la myéloperoxydase, de l'hypochlorite est également produit:
H2O2 + Cl- Myélo-Px
HOCl + OH-
(Eq. 15)
Une partie de ces ROS est libérée dans le milieu extra-cellulaire, ce qui permettrait
d'expliquer les dégâts tissulaires observés durant les processus inflammatoires ainsi que les
effets anti-inflammatoires de la superoxyde dismutase (Nivière et Fontecave, 1995; Sahnoun
et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.4 Les réactions oxydasiques des peroxysomes
Bien que le peroxyde d'hydrogène cellulaire soit formé en majeure partie par la
dismutation des radicaux superoxydes, il peut également résulter de la réduction à 2 électrons
de l'oxygène par diverses oxydases6. La plupart de ces enzymes sont localisées dans les
peroxysomes où de grandes concentrations de catalase ont été également mises en évidence.
Ces petits organites catalysent des réactions d'oxydation qui permettent une détoxification au
niveau du foie et des reins; elles participent également à la β-oxydation des acides gras.
La compartimentation de ces réactions protège en grande partie la cellule des ROS
générés; des quantités significatives de peroxyde d'hydrogène peuvent cependant passer dans
le compartiment cytoplasmique (Floyd, 1993; Nivière et Fontecave, 1995; Sahnoun et al.,
1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.5 Les réactions cytoplasmiques
Certaines des enzymes oxydatives sont également présentes dans le cytoplasme;
l'importance physiologique d'éventuelles fuites de ROS au niveau de ces enzymes reste fort
controversée (Halliwell et Gutteridge, 1999).
Des molécules endogènes et exogènes variées, ascorbate, glutathion, pyrogallol,
catécholamines et flavines réduites subissent une autooxydation, résultant en une production
de superoxyde. En présence de thiols ou d'ascorbate, le fer(III) peut être réduit en fer(II) qui
peut s'autooxyder en produisant du superoxyde. L'importance réelle de ces phénomènes in
vivo est cependant obscure (Halliwell et Gutteridge, 1999).
33
6 Entre autres la xanthine oxydase, la glutathion oxydase et la monoamine oxydase
1.3.4 Protections cellulaires antioxydantes
La compartimentation en organites spécialisés et la séquestration des métaux représentent
certainement les premières défenses cellulaires. Celles-ci sont complétées par toute une
panoplie d'antioxydants enzymatiques et non-enzymatiques dont la fonction essentielle vise à
éliminer les espèces réactives de l'oxygène ainsi que leurs précurseurs.
1.3.4.1.1 Les antioxydants enzymatiques
Les superoxydes dismutases, SOD, accélèrent considérablement la dismutation de l'anion
superoxyde :
O2• - + O2
• - SOD 2 H+
H2O2 + O2
(Eq. 16)
La catalase dégrade le peroxyde d'hydrogène :
2 H2O2 CAT
2 H2O + O2
(Eq. 17)
La glutathion peroxydase (GSH-Px) réduit le peroxyde d'hydrogène en eau en utilisant le
glutathion réduit, GSH, comme donneur d'électrons :
H2O2 + 2 GSH GSH-Px
2 H2O + GS-SG
(Eq. 18)
1.3.4.1.2 Les antioxydants non-enzymatiques
Une littérature abondante détaille de nombreuses molécules aux propriétés antioxydantes
(Nivière et Fontecave, 1995; Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999); la plupart
de ces substances montrent également une activité antimutagène et anticarcinogène dans
nombre de modèles (Hartman et Shankel, 1990). Les antioxydants non-enzymatiques les plus
importants sont le glutathion, les tocophérols (vitamine E), l'ascorbate et l'acide urique.
1.3.4.1.3 La troisième ligne de défense antioxydante
En raison de leur importance pour la régénération des fonctions cellulaires après une
attaque oxydative, les mécanismes d'élimination et de réparation des biomolécules oxydées
sont considérés comme une véritable troisième ligne de défense antioxydante (Yu, 1993).
Cette classe comprend les enzymes lipolytiques et protéolytiques, mais aussi les systèmes de
réparation de l'ADN. Les lipides et protéines oxydés constituent d'excellents substrats
enzymatiques qui sont dégradés préférentiellement.
34
1.3.5 Le stress oxydatif
L'exposition à l'oxygène ainsi que sa métabolisation résultent donc dans la formation de
sous-produits, des espèces toxiques semi-réduites, qui sont à l'origine d'un stress oxydatif.
Celui-ci est fréquemment défini comme un déséquilibre entre les attaques par les espèces
réactives de l'oxygène et les défenses antioxydantes (Nivière et Fontecave, 1995; Sahnoun et
al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999). Un stress oxydatif est généralement la conséquence
d'un excès de production d'espèces réactives de l'oxygène; il peut également survenir lors
d'une déplétion en antioxydants, par exemple en cas de malnutrition (Sahnoun et al., 1998).
Le stress imposé peut être considéré comme un potentiel de dégâts oxydatifs, P°. Des
défenses antioxydatives, capables d'empêcher ou de réduire l'accumulation de ces sous-
produits toxiques, sont cependant apparues au cours de l'évolution de sorte que le potentiel de
dégâts oxydatifs soit opposé par la capacité de défense oxydative du système, Ac.
Ces 2 procédés opposés sont en équilibre dynamique suivant l'équation (Floyd, 1993) :
P°
Ac
(Eq. 19)
En fait, il semble que le potentiel de dégâts oxydatifs soit toujours supérieur à la capacité
de défense de sorte qu'une faible quantité de ROS échappe en permanence aux défenses
cellulaires; soit P'° cette fraction de ROS :
P'° = P° - Ac
(Eq. 20)
L'existence de cette fraction est actuellement quasi certaine. Toutes les méthodes
analytiques montrent en effet, sauf artefacts multiples, qu'il existerait, dans toutes les cellules
à tout moment, une quantité basale de protéines et de bases nucléiques oxydées. D'autre part,
il est bien connu que les cellules âgées accumulent un pigment formé de lipides et de
protéines oxydées, la lipofuscine. Il semble donc y avoir une certaine tolérance de la nature à
l'égard des oxydations; il est en fait probable que la dépense d'énergie requise pour bloquer
tout événement oxydatif serait tout simplement trop élevée. De plus, un faible flux d'espèces
oxydées semble indispensable pour initier ou relayer une série d'évènements comme le
développement ou la différenciation cellulaire (Floyd, 1993; Mossman, 2000).
Toutes ces observations reflètent en fait l'existence continue d'oxydations mais indiquent
aussi que la réparation par les différents mécanismes n'est jamais complète. De sorte que la
quantité de dégâts présente à un moment donné reflète un niveau d'équilibre qui serait la
résultante du taux de formation moins le taux de réparation et de dégradation responsables de
35
l'élimination du dommage. Ainsi, pour une macromolécule oxydée Box dont le produit de
dégradation est A (Floyd, 1993) :
B P'°
R Box
Dox A
(Eq. 21)
le taux de formation de Box est gouverné (i) par la quantité de ROS toxiques qui ont échappé
aux systèmes de défense, P'°; (ii) par le taux de réparation de la macromolécule oxydée, R; et
(iii) par le taux de dégradation de cette macromolécule oxydée en ses éléments de base, Dox.
En ce qui concerne les protéines, la dégradation protéolytique de la molécule oxydée est
probablement le facteur le plus important; cette fonction serait assurée par les protéasomes,
des complexes protéasiques multicatalytiques. Une certaine fonction de régénération serait
assurée par les protéines dites de stress (heat shock proteins). Pour l'ADN en revanche, ce
sont les facteurs de réparation qui jouent un rôle primordial (Floyd, 1993).
1.3.6 Dégâts oxydatifs aux lipides et aux protéines
Le mécanisme chimique des dégradations provoquées par les radicaux oxygénés est
complexe et pas toujours complètement élucidé.
1.3.6.1 Les lipides
Les acides gras polyinsaturés sont particulièrement sensibles à la peroxydation en raison
de leurs hydrogènes bis-allyliques facilement oxydables (Figure 1.3-4).
Figure 1.3-4 : Une partie de la structure d'un acide gras polyinsaturé
C H HC
C H H
CHH C
Hydrogènes bis-allyliques
En fonction du nombre d'insaturations de la structure lipidique, la peroxydation conduit à
la formation de différents hydroperoxydes (ROOH) suivant des réactions analogues aux
équations 10 à 14. Ces derniers, du fait de leur instabilité se fragmentent, notamment en
présence d'ions de métaux de transition, en composés de masses moléculaires plus faibles,
comprenant des aldéhydes, des acides et des traces d'hydrocarbures, éthane, pentane,… Parmi
les aldéhydes, une très large place a été initialement donnée à un dialdéhyde tricarboné, le
malondialdéhyde (MDA), un mutagène reconnu. En fait cet aldéhyde serait produit en
36
beaucoup moins grande quantité que les hydroalkénals, comme le 4-hydroxy-2-nonénal
(HNE), le composé le plus toxique produit à partir des lipides (Sahnoun et al., 1997;
Halliwell et Gutteridge, 1999; Marnett, 2000).
La peroxydation lipidique semble être à la fois un mécanisme d'amplification et de
déplacement d'une attaque radicalaire locale, permettant une "action à distance" de ROS
extrêmement réactifs, notamment les radicaux •OH. Les hydroperoxydes lipidiques et leurs
produits de dégradation sont toxiques pour les cellules. Il semble toutefois qu'une
peroxydation massive soit le plus souvent un événement tardif qui accompagne la mort
cellulaire plutôt qu'une cause de cette mort. Les dégâts aux protéines et à l'ADN semblent en
effet présenter plus d'importance que la peroxydation lipidique dans le processus de mort
cellulaire (Halliwell et Chirico, 1993; Marnett, 2000).
Les isoprostanes, une famille de composés apparentés aux prostaglandines, sont formés au
cours de la peroxydation lipidique d'acides gras insaturés comme l'acide arachidonique (Bachi
et al., 1996; de Zwart et al., 1999).
Le cholestérol des membranes cellulaires et des lipoprotéines peut également être oxydé
pendant la peroxydation lipidique, générant un ensemble complexe de produits dont la toxicité
reste l'objet de controverses (Geiger et al., 1997; de Zwart et al., 1999).
1.3.6.2 Les protéines
De nombreuses protéines peuvent subir des dommages considérables sans que leur
fonction en soit altérée; par exemple, l'activité d'une enzyme ne sera réellement réduite que
lorsque le dégât sera porté sur un acide aminé proche de son site actif (Floyd, 1993; Nivière et
Fontecave, 1995; Halliwell et Gutteridge, 1999). D'autre part, il a été montré in vitro qu'une
oxydation sévère peut induire des modifications physico-chimiques importantes, résultant en
une fragmentation, une agrégation et une susceptibilité plus élevée à la protéolyse (Yu, 1993).
A côté d'une oxydation générale des protéines et des acides aminés, qui mène à l'accumulation
de carbonyles et de peroxydes, une attaque radicalaire peut mener à :
• l'oxydation réversible des groupes thiols,
• l'oxydation de la méthionine en sulfoxyde et en sulfone,
• l'oxydation des acides aminés cycliques, tryptophane, phénylalanine, tyrosine,
histidine et proline
La susceptibilité d'une protéine à une attaque oxydative dépend donc de sa composition en
acides aminés, de la quantité et de la position des acides aminés fragiles mais aussi de sa
structure tertiaire, qui conditionne l'accès à un site donné et, éventuellement, la facilité de
37
réparation des dégâts. Outre une attaque radicalaire directe sur les protéines, une attaque
indirecte peut être causée par les produits terminaux de la peroxydation lipidique (MDA et
HNE) (Mahmoodi et al., 1995).
Avec l'âge, il semble que se produise une accumulation de protéines oxydées qui
entraîneraient des dysfonctionnements biochimiques, cellulaires et physiologiques (Ames,
1989). Des protéines oxydées sont en outre susceptibles d'être reconnues comme étrangères
par le système immunitaire, menant à la formation d'anticorps qui peuvent entraîner des
phénomènes d'auto-immunité.
1.3.7 Dégâts oxydatifs aux acides nucléiques: Généralités
Les radicaux oxygénés peuvent interagir avec l'ADN, à la fois au niveau des bases
nucléiques et du squelette désoxyribose-phosphate, pour produire des bases altérées, des sites
abasiques, des cassures de chaînes et des liens croisés ADN-ADN et ADN-protéines (Cadet et
al., 1995). D'autre part, l'oxydation des lipides et des protéines peut également générer des
intermédiaires qui forment des adduits à l'ADN (Agarwal et Draper, 1992; Marnett, 2000).
Tableau 1.3-2 : Réactivité avec l'ADN des espèces impliquées dans le stress oxydatif
Espèce réactive Réaction avec l'ADN 1O2 Oxyde la guanine •OH Oxyde les bases et les sucres H2O2 Oxyde l'adénine O2
• - et HO2• Pas de réactivité détectable
RO• et ROO• Oxyde les sucres O3 Oxyde les bases ONOO- Oxyde les bases et les sucres Radicaux cationiques purines et pyrimidines Hydratation et déprotonation Ions de type ferryl (fer(IV)) Oxyde les bases et les sucres
D'après (Cadet et al., 1995)
1.3.7.1 L'oxydation des bases
Jusqu'au milieu des années 1980, l'attention des chercheurs s'est portée sur les dégâts à
l'ADN induits par des xénobiotiques tels que les hydrocarbures polycycliques, les amines
aromatiques ou les nitrosamines. Des méthodes sensibles, telles que le post-marquage au 32P
en chromatographie couche mince, ont été développées pour détecter et quantifier les adduits
à l'ADN de ces composés. Ces méthodes ont notamment permis de tester la relation entre
38
niveau d'adduit et pouvoir cancérigène. En l'absence de traitement, aucun de ces adduits
fortement apolaires n'était détecté et l'opinion générale estimait que l'ADN génomique
d'animaux ou d'humains normaux n'était pas endommagé (Marnett, 2000). La radiobiologie
avait bien caractérisé une panoplie de produits de dégradation obtenus par irradiation X ou γ
de l'ADN, mais ces produits étaient considérés comme une source forcément mineure de
dégâts, guère plus qu'un simple bruit de fond induit par les rayonnements cosmiques
(Ward, 1988). Les seuls dégâts spontanés admis étaient les désaminations, dépurinations et
dépyrimidations évoquées dans la Section 1.1 de ce travail.
Des essai de caractérisation d'adduits polaires ont cependant entraîné une modification
des éluants employés pour séparer les adduits marqués au 32P; ces nouvelles conditions
chromatographiques ont révélé des composés polaires inconnus dans l'ADN des rongeurs et
des humains non traités (Randerath et al., 1986), composés qui variaient en fonction du tissu,
de l'espèce, du genre, de l'alimentation,… A la même époque, (i) l'excrétion urinaire de bases
oxydées (les glycols de thymine et thymidine ainsi que le 5-hydroxyméthyl-uracile) a été mise
en évidence chez différentes espèces (Cathcart et al., 1984; Adelman et al., 1988; Ames,
1989); (ii) une méthode très sensible a été proposée (Floyd et al., 1986) pour le dosage d'une
base oxydée, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine, la 8-oxodG, qui s'est révélée un
biomarqueur de choix; et, (iii) une méthode de chromatographie gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse a permis la détection simultanée non ambiguë de toute une série de
bases oxydées (Dizdaroglu, 1986). Bien que les premiers résultats, surtout ceux obtenus par
GC-MS, aient, depuis lors, fait l'objet de beaucoup de critiques, ils ont permis une prise de
conscience de l'existence de dégâts oxydatifs endogènes aux bases de l'ADN (Marnett, 2000).
1.3.7.2 L'importance des altérations oxydatives spontanées
A partir de l'excrétion urinaire de certaines bases oxydées, Ames a tenté une estimation
grossière de l'ampleur des dégâts oxydatifs à l'ADN (Ames, 1989). Un homme normal excrète
dans les urines environ 100 nmoles par jour des 3 bases thymine glycol, thymidine glycol et
5-hydroxyméthyl-uracile. Cette excrétion traduirait une moyenne d'environ 103 thymines
oxydées par jour pour chacune des 6 x 1013 cellules de l'organisme. Comme ces produits ne
représentent que 3 bases oxydées sur environ 20 connues, le nombre de chocs oxydatifs à
l'ADN par cellule et par jour pourrait être supérieur à 104.
39
Les dégâts oxydatifs à l'équilibre pour une cellule humaine moyenne7 ont également été
estimés (Floyd, 1995) (Tableau 1.3-3).
Tableau 1.3-3 : Métabolisme de l'oxygène et dégâts oxydatifs. Estimation pour une cellule humaine moyenne7
Métabolisme de l'oxygène Dégâts oxydatifs à l'équilibre pour une cellule
(steady state)
Une cellule moyenne cuboïde Volume, 103 µm³ Masse, 1 ng
Protéines 0.9 % de l'O2 consommé 4 x 108 protéines oxydées
Flux d'oxygène ~ 1012 O2 par cellule par jour
ARN 0.03 % de l'O2 consommé 1.4 x 107 lésions pour l'ARN total par jour
Production de H2O2 3 x 109 H2O2 par cellule par heure
ADN 0.008 % de l'O2 consommé 2 x 104 lésions par génome par jour 2 x 105 nucléotides remplacés par génome par jour
(Floyd, 1995; Newcomb et Loeb, 1998)
La proportion entre bases altérées et autres types de dégâts (cassures de chaînes et liens
croisés) a été évaluée in vitro par oxydation avec le peroxyde d'hydrogène. Une extrapolation
in vivo, à partir des données d'excrétion de thymines modifiées, a permis d'évaluer chez
l'homme une incidence spontanée de 7 à 14 cassures simple-brins, 3 cassures double-brins et
3 liens croisés inter-brins par cellule et par jour (Bernstein et Gensler, 1993).
L'ensemble de ces calculs suppose évidemment que la plus grande partie des bases
excrétées provienne des mécanismes de réparation de l'ADN oxydé, et non de sources
exogènes comme l'alimentation ou la flore intestinale (Halliwell et Aruoma, 1991); la
supposition d'une origine endogène semble cependant raisonnable (Ames, 1989). Remarquons
que la contribution de l'ADN libéré par les cellules mortes n'est pas prise en compte
(Halliwell et Aruoma, 1991).
7 Pour autant qu'une telle cellule existe; l'apport et la consommation en oxygène dépendent évidemment du type cellulaire et des conditions physiologiques…
40
1.3.8 Dégâts oxydatifs aux acides nucléiques: les bases oxydées
En raison de l'importance de la guanine pour notre travail, ses schémas d'oxydation seront
considérés en détails. Pour les autres bases, nous nous contenterons de présenter les produits
d'oxydation et de référer aux publications originales pour l'explication des schémas.
1.3.8.1 Les réactions de la guanine
Parmi les composants de l'ADN, la guanine est la cible préférentielle des réactions de
photosensibilisation de Type I (soustraction d'un seul électron ou d'un hydrogène) et la seule
cible significative des réactions de Type II (médiées par l'oxygène singulet 1O2). La guanine,
une base nucléique très sensible aux dégâts oxydatifs, se décompose suivant des schémas
complexes (Figure 1.3-5).
1.3.8.1.1 Oxydation par le radical •OH et oxydations mono-électroniques
L'attaque par le radical •OH de la 2'-désoxyguanosine ainsi que l'oxydation mono-
électronique (par exemple lors d'une photo-oxydation directe de Type I) aboutissent aux
mêmes produits principaux, un dérivé imidazole-4-one (dérivé 5), instable, et son produit
d'hydrolyse-réarrangement, une oxazolone (dérivé 6). Ces réactions procèdent via un radical
oxydant neutre (dérivé 3) qui existe sous plusieurs formes tautomères; celui-ci subit une
dégradation impliquant l'ouverture du noyau pyrimidine au niveau de la liaison C5-C6,
l'addition d'un oxygène moléculaire, l'addition d'une molécule d'eau sur la double liaison
N7-C8 et un réarrangement complexe. Lorsque le nucléoside est exposé aux radicaux •OH en
solution aqueuse aérée, la 8-oxodG (dérivé 8, formé à partir de l'addition du radical hydroxyle
en C8 au lieu de C4) n'est qu'un composé mineur (< 3 %); dans ces conditions, le dérivé
formamidopyrimidine (dérivé 9) n'est absolument pas formé.
Par contre, dans l'ADN bicaténaire, le rendement en 8-oxodG augmente (~ 50 %) aux
dépens de l'oxazolone et de son précurseur (dérivés 6 et 5; ~ 30 %); la formamidopyrimidine
(dérivé 9), est alors générée par l'ouverture du cycle imidazole en C8-N9, à raison d'environ
20 %. De même, dans les oxydations mono-e-, l'inclusion de la guanine dans un ADN
bicaténaire favorise la formation de 8-oxodG à partir du radical cationique (dérivé 2).
1.3.8.1.2 Oxydation par les réactfs de type Fenton
Lors de l'oxydation par les réactifs de type Fenton (H2O2 + ascorbate + fer(II)), la
répartition des produits d'oxydation change entièrement. La réduction du composé 3 est alors
favorisée; la formation de 8-oxodG (dérivé 8) est ainsi considérablement augmentée par
rapport aux dérivés 5 et 6 qui ne se forment quasi plus.
41
Figure 1.3-5 : Voies d'oxydations principales de la guanine dans les nucléosides et l'ADN
H2N
HN
N N
N
H2N
N
N N
N
O•
H2N
HN
N N
N
O•
H2N
H •N
N N
N
O
H2N
HN
N N
HN
H2N
HN
N NH
CHO
HN
H2N
HN
N N
N
H2N
HN
N N
N
N
N O
H2N
NH
5
N
O OH2N
H2N
NH
6
3
2 4
1
10
7
89
+
OHO
O
OO
O
OHO
O
•OH
H
•OH
•OH
1O2
- H• antioxydant
- H+ - H2O
H2O, O2
H2O
Réactionsmono-e-
Réduction Oxydation
1
23
4
56
7
8
9
D'après (Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1997)
1. 2'-désoxyguanosine 2. radical cationique 3. radical oxydant guanilyl 4. radical hydroxylé en C4 5. 2-amino-5-[(2-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)amino]-4H-imidazole-4-one 6. 2,2-diamino-4-[(2-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)amino]-5(2H)-oxazolone 7. radical 8-hydroxy-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosyl 8. 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine ( = 8-oxodG) 9. dérivé formamidopyrimidine 10. 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-désoxyguanosine
42
1.3.8.1.3 Oxydation par 1O2
Le traitement de la 2'-désoxyguanosine par l'oxygène singulet induit 2 produits principaux
d'oxydation, les diastéréoisomères 4R* et 4S* de la 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-
désoxyguanosine (dérivés 10); le mécanisme passerait vraisemblablement par l'addition de 1O2 sur la guanine pour former un 4,8-endoperoxyde instable. La 8-oxodG (dérivé 8) est
également formée, mais seulement dans un rapport de 1 à 7 par rapport aux diastéréoisomères
(Cadet et al., 1997).
Dans l'ADN bicaténaire cependant, la formation des diastéréoisomères est empêchée et la
8-oxodG devient, une fois de plus, le produit d'oxydation majeur. Notons que cette 8-oxodG
est près de 100 fois plus réactive envers 1O2 que la guanine elle-même; ses produits
d'oxydation principaux sont, dans l'ordre décroissant d'importance (Cadet et al., 1997) : acide
cyanurique et/ou son précurseur > oxazolone (dérivé 6) > diastéréoisomères (dérivés 10).
1.3.8.1.4 Oxydation par ONO2-
Au niveau du nucléoside, l'attaque par le peroxynitrite induit la formation de l'oxazolone
(dérivé 6), des isomères de la 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (dérivés 10)
(Douki et Cadet, 1996), de la 8-oxodG (dérivé 8) et de la 8-nitrodG (Burney et al., 1999). Au
niveau de l'ADN, certains auteurs (Douki et Cadet, 1996) n'ont pu mettre en évidence comme
guanines oxydées que l'oxazolone et pas la 8-oxodG. Des études plus récentes ont cependant
montré l'induction de 8-oxodG; celle-ci étant beaucoup plus réactive envers le peroxynitrite
que la dG, des doses trop élevées de ONOO- auraient empêché sa détection dans les premières
séries d'expériences (Burney et al., 1999).
1.3.8.1.5 Conclusion
Des modifications marquées dans les rendements de dégradation de la guanine sont
observées suivant que celle-ci est sous forme nucléosidique libre ou incorporée dans un ADN
double-brins; ces modifications sont probablement dues à l'empilement des bases dans l'ADN
mais aussi, peut-être, à la présence de cations liés (Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1999).
La 8-oxodG peut être considérée comme un marqueur ubiquitaire du stress oxydatif au
niveau de l'ADN; il s'agit en effet du produit de dégradation principal de la guanine, formé à
la fois par le radical •OH, par les oxydations mono-électroniques, par l'oxygène singulet et par
le peroxynitrite. Sa mise en évidence ne peut cependant permettre la caractérisation du
mécanisme d'une attaque radicalaire.
43
1.3.8.2 Les réactions de l'adénine
N
N N
N
NH2
1
23
4
56
7
8
9
N
N N
HN
NH2
N
N N
N
NH2
N
N N
N
OH
1
2 4
3
O
O
H2O2
•OH
Oxydationmono-e-
D'après (Cadet et al., 1995; Douki et Cadet, 1996)
1. 2'-désoxyadénosine 2. 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyadénosine ( = 8-oxodA) 3. inosine 4. 2'-désoxyadénosine N1-oxyde
44
1.3.8.3 Les réactions de la thymine
HN
N
O
CH3
O
1
HN
N
O
CH3
O
2
HN
N
O
CH2
O
4
H
OH•
•
HN
N
O
CH3
O
5
HN
N
O
CH2OOH
O
7
OH
H
OOH
HN
N
O
CH3
O
8
OH HN
N
O
CH3
O
9
OH
H
OHO
HN
N
OCH2OH
O
12
HN
N
O
CHO
O
13
HN
N
CH3OH
O
O
10
HNC
H
O
11
•OH
O2 O2•-, H+ O2 O2
•-, H+
35 %60 % 5 %
12
34
5
6
HN
N
O
CH3
O
3
H
OH
•
HN
N
O
CH3
O
6
H
OH
OOH
O2 O2•-, H+
HN
N
O
CH3
O
14
Oxydationmono-e- +
•
D'après (Wagner et al., 1990; Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1997)
1. thymidine 2. radical réducteur C-6 3. radical oxydant C-5 4. radical aromatique 5. 6-hydroperoxy-5-hydroxy-5,6-dihydrothymidine 6. 5-hydroperoxy-6-hydroxy-5,6-dihydrothymidine 7. 5-hydroperoxymethyl-2'-désoxyuridine 8. acide 1-(2-désoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-5-hydroxy-5-methylbarbiturique 9. 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrothymidine 10. 1-(2-désoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-5-hydroxy-5-methylhydantoïne 11. N-(2-désoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl) formamide 12. 5-hydroxymethyl-2'-désoxyuridine 13. 5-formyl-2'-désoxyuridine 14. radical cationique
45
1.3.8.4 Les réactions de la cytosine
N
N
NH2
O
1•OH
12
34
5
6
N
N
NH2
O
10
Oxydationmono-e- +
•
HN
N
O
O
5
OH
OH
HN
N
H
OH
O
O
7
HNC
H
O
8
N
N
NH2
O
4
OH
N
N
NH2
O
2
H•
N
N
NH2
O
3
H
OH
•
N
NOH
OH
O
6
NH2C
NHC
NH
O
O
9
HN
N
O
O
11
NH2CO
H2O, e-
H2OO2
H
OH
H
D'après (Wagner et al., 1990; Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1997)
1. 2'-désoxycytidine 2. Radical C-6 3. Radical C-5 4. 5-hydroxy-2'-désoxycytidine 5. 5,6-dihydroxy-2'-désoxyuridine 6. N-(2-désoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)- 1-carbamoyl-4,5-dihydroxy-
imidazolidine-2-one 7. N-(2-désoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-5-hydroxy-hydantoïne 8. N-(2-désoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl) formamide 9. N-(2-désoxy-D-erythro-pentosyl)-biuret 10. Radical cationique 11. 2'-désoxyuridine
46
1.3.9 Dégâts oxydatifs aux acides nucléiques: les autres types de lésions
1.3.9.1 Les lésions doubles
Des lésions doubles, appelées dégâts en tandem, formées suite à un seul événement
radicalaire, peuvent apparaître. Ainsi, les composés formylamine/8-oxoG et 5-
(uracilyl)methyl/guanine oxydée ont été mis en évidence après attaque par, respectivement, •OH et photo-oxydation de Type I. D'autres dégâts en tandem médiés par •OH incluent les
nucléosides cyclopurines qui comportent une lésion, à la fois au niveau du sucre et de la base
(Cadet et al., 1999).
1.3.9.2 Les cassures de chaînes
1.3.9.2.1 Les cassures de chaînes provenant d'une attaque directe
Les attaques radicalaires, notamment •OH et ONOO-, peuvent former un radical au niveau
du désoxyribose. Celui-ci se fragmente de différentes façons, menant à une cassure de chaîne,
à un sucre lésé alcali-labile ou à un relargage de la base nucléique pour former un site
abasique, lui aussi alcali-labile (Halliwell et Aruoma, 1991; Burney et al., 1999).
1.3.9.2.2 Les cassures de chaînes provenant d'un mécanisme indirect
Il est également possible qu'un stress oxydatif enclenche au niveau de la cellule une
séquence d'évènements qui mène à une augmentation du calcium libre intra-cellulaire et à une
activation d'endonucléases calcium-dépendantes (Ueda et Shah, 1992). Celles-ci
fragmenteraient alors l'ADN dans un mécanisme semblable à celui de l'apoptose (Halliwell et
Aruoma, 1991).
1.3.9.3 Les liens croisés ADN-protéines
Rappelons que le traitement de la chromatine par des radiations ionisantes et par des
réactifs de type Fenton provoque des liens croisés ADN-protéines (cf Section 1.1)
1.3.9.4 Les adduits avec des produits de la peroxydation lipidique
Si les aldéhydes générés par une peroxydation lipidique se trouvent à proximité de l'ADN,
ils peuvent se combiner avec certaines bases. Des adduits entre le malondialdéhyde (MDA) et
l'adénine, la guanine et la cytosine ont été mis en évidence (Agarwal et Draper, 1992;
Marnett, 1999) (Figure 1.3-6). L'adduit MDA-guanine subit une ouverture de cycle rapide et
quantitative dans l'ADN bicaténaire, mais pas dans l'ADN simple-brin. Quand l'ADN portant
l'adduit à cycle ouvert, N2-propényl-dG, est dénaturé, le cycle se referme, reformant l'adduit
MDA-guanine, et ainsi de suite à chaque cycle de dénaturation-renaturation. Cet adduit est
47
également un réactif électrophile envers les amines, pouvant mener à des liens croisés ADN-
ADN ou ADN-protéines.
Le 4-hydroxy-2-nonénal peut former un époxyde en 2,3 qui forme des éthéno-adduits avec
l'adénine, la guanine et la cytosine (Chung et al., 1999; Marnett, 1999) (Figure 1.3-7).
L'acroléïne et le crotonaldéhyde peuvent réagir avec la guanine pour former des hydroxy-
propano-désoxyguanosines (Marnett, 2000) (Figure 1.3-7).
Figure 1.3-6 : Adduits formés entre le malondialdéhyde (MDA) et les nucléosides de l'ADN
H
H
O
O H
H
O
HO
ADN
N
N N
N
Adduit MDA-dG
O
N
HN
N N
N
N H
H
O
H
H
N
N
N H
H
O
H
H
O
HN
N N
N
O
NH
O
Adduit MDA-dA Adduit MDA-dC
β-hydroxyacroléïneMDA
N2-oxopropényl-dG D'après (Marnett, 2000)
48
Figure 1.3-7 : Autres adduits formés entre les produits de la peroxydation lipidique et les
nucléosides de l'ADN
N
N N
N
Ethéno-dG
O
N
N N
NN
NO
Ethéno-dA Ethéno-dC
N N
N
N N
N
O
NH
OH
H3C
HN
N
N N
N
O
NH
OH
N
N N
N
O
NH
HO
Hydroxy-propano-désoxyguanosines D'après (Marnett, 2000)
1.3.10 Stress oxydatif et pathologies
De nombreuses études expérimentales et épidémiologiques impliquent le stress oxydatif
dans le vieillissement, la carcinogenèse mais aussi dans une série de processus pathologiques,
notamment inflammatoires, qui sont repris en partie dans le Tableau 1.3-4. Nous n'avons pas
la place dans ce travail de développer ces multiples aspects et nous n'aborderons que la
problématique stress oxydatif – lésion à l'ADN – mutagenèse – carcinogenèse (Section 1.4).
1.3.11 Les biomarqueurs du stress oxydatif
A côté de méthodes instrumentales (Punchard et Kelly, 1996) principalement utilisées in
vitro (résonance de spin d'électron8, résonance magnétique nucléaire, radiolyse pulsée), de
nombreuses méthodes biochimiques permettent la mise en évidence d'une attaque radicalaire;
un travail considérable a résulté dans le développement de biomarqueurs fiables de
l'exposition à des conditions pro-oxydantes. Ces marqueurs permettent nombre d'études, à la
fois in vitro et in vivo, et ce, dans des domaines très variés. Ceux-ci concernent par exemple
les conditions et mécanismes du stress oxydatif, les défenses cellulaires, les mécanismes de
réparation, la nutrition, la génotoxicologie, le biomonitoring environnemental et humain.
8 Couplée à des techniques de spin trapping pour les études in vivo
49
Tableau 1.3-4 : Quelques maladies dans lesquelles le stress oxydatif est ou serait impliqué.
Neurologie • maladies
neurodégénératives (Parkinson; Alzheimer)
• lipofuscinose céroïde neuronale
• traumatisme • ischémie cérébrale • trisomie 21
Système pulmonaire • hyperoxie • bronchite chronique • emphysème • mucoviscidose • pneumoconiose • sarcoïdose • tabagisme
Système cardio-vasculaire • athérosclérose • ischémie-reperfusion
Rhumatologie • syndrome de Raynaud • arthrite rhumatoïde • synovite inflammatoire
Tractus gastro-intestinal • pathologies
inflammatoires (Crohn) • pancréatite • éthylisme • ischémie hépatique
Intoxications • éthylisme
Maladies rénales • néphropathies • hémodialyse
Muscles • dystrophie musculaire • exercice
Maladies endocriniennes • diabète
Pathologies infectieuses • fièvre hémorragique • parasitologie • infection HIV • septicémie • otite moyenne • méningites
Dermatologie • radiations solaires et
ionisantes • photosensibilisation • maladies génétiques
(xéroderma pigmentosum; porphyries)
Ophtalmologie • rétinopathies • vitréopathies • cataracte
Surcharges en métaux • cuivre (maladie de
Wilson) • fer (hémochromatose)
Carences alimentaires • sélénium • vitamine E
Exposition aux radiations ionisantes • accidentelle ou militaire • traitement médical
D'après (Gutteridge et Halliwell, 1994; Sahnoun et al., 1998)
Les biomarqueurs classiques sont les antioxydants cellulaires enzymatiques et non-
enzymatiques, tels que les tocophérols, le glutathion réduit, les superoxyde dismutases, les
glutathion peroxydases ou les catalases. Ces marqueurs mesurent la capacité à réagir à des
conditions oxydantes mais ne donnent quasi pas d'information sur les dégâts subis par la
cellule, le tissu ou l'organisme. Les dommages réels sont en fait reflétés par les biomolécules
et une série de lésions oxydatives ont été proposées en tant que biomarqueurs invasifs ou non-
invasifs (Kinter, 1995; de Zwart et al., 1999). Un schéma général pour la validation
biologique des biomarqueurs d'exposition (Taioli et al., 1994) et un modèle décisionnel pour
leur sélection et leur évaluation ont également été proposés (Stevens et al., 1991).
50
Bien que les techniques chromatographiques soient communément appliquées à la
détermination des biomarqueurs de dégâts oxydatifs aux biomolécules, il n'y a que quelques
méthodes pour lesquelles des données très partielles de validation analytique aient été
publiées. Notamment pour des marqueurs de la peroxydation lipidique (Tomita et al., 1990;
Morrow et Roberts, 1991; Wieland et al., 1992; Luo et al., 1995; de Zwart et al., 1997;
Stashenko et al., 1997; Basu, 1998; Cighetti et al., 1999), pour des adduits à l'ADN (Takeuchi
et al., 1994; Povey et Cooper, 1995; Farooq et al., 1997; Doerge et al., 1998; Przybyszewski
et al., 1998) et pour l'essai comète (single-cell gel electrophoresis) (Collins et al., 1997b;
Belpaeme et al., 1998; Gedik et al., 1998).
De nombreuses questions sur les performances analytiques de ces méthodes restent donc
sans réponse et la fiabilité de certaines données publiées peut certainement être mise en doute
(Cadet et al., 1998).
1.3.11.1 Les biomarqueurs de la peroxydation lipidique
Comme nous l'avons vu, les lipides insaturés des membranes sont habituellement
considérés comme la première cible des oxydants; leur peroxydation génère des alcanes
volatiles ainsi que des aldéhydes relativement stables de poids moléculaires faibles.
La disparition des diènes conjugués peut être suivie par la mesure de l'absorbance UV à
234 nm (Esterbauer et al., 1989). Un index total de peroxydation est couramment mesuré par
une colorimétrie des chromophores formés par réaction des aldéhydes et autres produits de
dégradation avec l'acide thiobarbiturique (Halliwell et Chirico, 1993). Les aldéhydes
individuels peuvent être également mesurés, principalement par GC (Frankel et al., 1989) et
GC-MS (de Zwart et al., 1999), mais aussi par HPLC après dérivation, par exemple avec
l'acide thiobarbiturique (Kinter, 1995) ou la 2,4-dinitrophénylhydrazine (Werner et al., 1990;
Halliwell et Chirico, 1993). L'excrétion pulmonaire des alcanes est utilisée pour estimer le
stress oxydatif au niveau d'un organisme entier (de Zwart et al., 1999).
La plupart de ces méthodes analysent les produits terminaux de la peroxydation lipidique.
Des produits intermédiaires, tels que les hydroperoxydes de lipides insaturés et d'esters de
cholestérol, sont fort spécifiques d'une attaque oxydative, mais ils sont plus rarement mesurés,
soit par iodométrie, HPLC (Wieland et al., 1992) ou GC-MS (Thomas et al., 1991; Turnipseed
et al., 1993). Une déconvolution des spectres UV entre 210 et 300 nm permet le suivi
simultané des hydroperoxydes, du 7-cétocholestérol ainsi que des aldéhydes conjugués et non
conjugués (Pinchuk et Lichtenberg, 1996).
51
Les biomarqueurs probablement les plus spécifiques sont les prostaglandines du type F2
isoprostane; celles-ci sont en effet quasi-exclusivement dérivées de l'acide arachidonique par
une voie oxydative indépendante des cyclooxygénases (Morrow et al., 1990). Elles peuvent
être analysées par GC-MS après silylation (Kinter, 1995) et par immunodosages (de Zwart et
al., 1999).
Lorsque des cellules sont incubées in vitro en présence d'acide cis-parinarique, un acide
gras exogène, polyinsaturé et fluorescent (Drummen et al., 1999; van den Berg, 1999), ou
d'undécylamine-fluorescéine (Makrigiorgos et al., 1997), ces marqueurs s'incorporent dans les
lipides cellulaires. Comme leur fluorescence diminue en cas d'oxydation, ce sont des
indicateurs sensibles de la peroxydation lipidique.
De grandes quantités d'adduits lipophiles à l'ADN ont été récemment mises en évidence
par 32P – HPLC (Yang et al., 1998) et pourraient être des marqueurs prometteurs.
1.3.11.2 Les biomarqueurs de l'oxydation des protéines
Le contenu total en carbonyles des protéines est un indicateur présumé de dégâts
oxydatifs; ces carbonyles sont formés par oxydation des chaînes latérales des acides aminés
ou par réaction avec des produits d'oxydation des sucres ou des lipides. Ces carbonyles
peuvent être estimés par une simple mesure en spectrophotométrie UV (de Zwart et al., 1999),
par immunologie (Buss et al., 1997) ou par HPLC après réaction avec la 2,4-
dinitriphénylhydrazine (Shacter et al., 1996). Un couplage de ce réactif avec un anticorps
permet même un marquage in situ des protéines oxydées (Smith et al., 1998). Une réduction
des carbonyles avec un réactif boro[3H]hydrure permet une mesure sensible de la radioactivité
incorporée dans les acides aminés (Winter et Liehr, 1991). La mesure des thiols protéiques,
par exemple en spectrométrie visible après condensation avec l'acide 5,5'-dithio-bis-(2-
nitrobenzoïque) (Soszynski et Bartosz, 1997), permet également une estimation du dommage
oxydatif.
Plusieurs protéines et acides aminés oxydés, hydroxylés ou nitrés ont été utilisés comme
biomarqueurs, par exemple, les hydroperoxydes et hydroxydes de protéines (Dean et al.,
1996), les adduits protéine-3,4-dihydroxyphénylalanine (Dean et al., 1996), l'ortho-tyrosine et
la dityrosine (Huggins et al., 1993; Daneshvar et al., 1997), ou encore l'acide 5-hydroxy-2-
amino-valérique, un marqueur de l'oxydation de l'arginine et de la proline (Ayala et Cutler,
1996); ils sont mesurés par diverses techniques chromatographiques et immunologiques.
52
D'autres marqueurs sont moins activement étudiés car ils nécessitent encore des méthodes
de quantification adéquates. C'est le cas des adduits ADN-protéines, par exemple ceux induits
par des produits de la peroxydation lipidique (Younes, 1995); il en va de même pour
l'expression de divers peptides ou protéines, comme les molécules d'adhésion (Treina et al.,
1996).
1.3.11.3 Les biomarqueurs de l'oxydation de l'ADN
Les acides nucléiques sont une cible majeure des modifications oxydatives, certainement
pas du point de vue quantitatif, mais bien du point de vue biologique. L'impact des oxydations
au niveau de l'ARN doit encore être évalué, mais il est à présent bien établi que certaines
modifications de l'ADN peuvent être hautement mutagènes, résultant en transitions, en
transversions, cassures de chaînes, délétions,… Quelques-unes des lésions que nous venons
de passer en revue sont certainement d'excellents biomarqueurs, non seulement de l'exposition
à des conditions pro-oxydantes, mais surtout du risque carcinogène (Halliwell, 1998a).
Les dégâts oxydatifs à l'ADN (Frenkel et Klein, 1993) ont été quantifiés par des méthodes
immunologiques (Snopov et al., 1995; Mistry et al., 1999) et par chromatographie des bases
modifiées après digestion acide ou enzymatique, notamment par GC-MS (Dizdaroglu, 1994),
HPLC (Maidt et Floyd, 1996), électrophorèse capillaire (Le et al., 1998), post-marquage 32P et
fluorescence (Randerath et al., 1992). La 8-oxodG, un des marqueurs les plus utilisés (Kasai,
1997), sera présentée en détails dans la section 3 de ce travail.
Les cassures simple-brins et doubles-brins sont mesurées par différentes méthodes qui
seront décrites dans la Section 5.2.2.3. Les liens croisés ADN-protéines peuvent être
quantifiés par des méthodes de précipitation sélective (Voitkun et Zhitkovich, 1999).
1.3.11.4 Autres biomarqueurs reflétant un dégât oxydatif
Les différents organes, foie, poumon, peau, le sang, le plasma… émettent une faible
quantité de lumière, appelée la chemiluminescence; celle-ci est due aux ROS et aux radicaux
lipidiques. Certains phénomènes biologiques, comme la phagocytose, sont également
accompagnés d'une émission de lumière, concomitante à la production de ROS. Cette lumière,
après une éventuelle amplification par des agents chimiques comme le luminol et la
lucigénine, peut être mesurée par un système photomultiplicateur (Vladimorov, 1996; Parij,
1999).
Bien qu'il ne puisse être considéré comme un marqueur stable de dégâts oxydatifs, le
peroxyde d'hydrogène a été mesuré, lors d'études cliniques, dans l'air exhalé, les urines et la
salive (de Zwart et al., 1999).
53
Sous l'attaque du radical •OH, le désoxyribose forme du malondialdéhyde qui est alors
condensé avec l'acide thiobarbiturique pour former un chromogène, mesurable en
spectrophotométrie visible. Cette méthode est utilisée pour doser le radical •OH, bien que sa
spécificité ne soit probablement pas absolue et que d'autres ROS puissent entrer en jeu
(Halliwell et Gutteridge, 1999; Parij, 1999).
Des xénobiotiques sont employés comme marqueurs sensibles de la génération des ROS
(Kaur et Halliwell, 1996). Ainsi, sous l'action des •OH, le salicylate se transforme en acides
2,3-dihydroxybenzoïque et 2,5-dihydroxybenzoïque. Le dérivé 2,5-dihydroxy pouvant être
formé par les cytochromes P450, seul le dérivé 2,3-dihydroxy est considéré en tant que
biomarqueur; celui-ci peut être mesuré de manière sensible par HPLC avec détection
électrochimique . De même, la phénylalanine s'hydroxyle en ortho- et méta-tyrosine, l'aniline
en ortho- et para-aminophénol, le phénol en hydroquinone et catéchol (Radzik et al., 1983), le
terephtalate en 2-hydroxyterephtalate fluorescent (Qu et al., 2000). Des indicateurs dont la
fluorescence change en fonction de l'état d'oxydation ont été également proposés (Rosenkranz
et al., 1992; Wang et Joseph, 1999; Chen et Gee, 2000).
1.4 LA LUMIERE ET LA PEAU
1.4.1 La lumière
Pour l'ensemble du spectre électromagnétique (Figure 1.4-1), l'énergie d'une onde est une
fonction inverse de sa longueur d'onde :
E = h.ν = h.c λ
Dans cette équation, E est l'énergie, h la constante de Planck (6.63 x 10-34 joules.sec-1), ν la
fréquence de l'onde, c la vitesse de la lumière dans le vide (3 x 108 m/sec) et λ la longueur
d'onde.
Aux longueurs d'onde les plus courtes (rayons X et γ), la radiation électromagnétique a
tendance à se comporter comme une particule, alors qu'aux longueurs d'onde élevées, elle a
plutôt le comportement d'une onde. Les portions visibles et UV occupent une position
intermédiaire et présentent à la fois des propriétés d'onde et de particule (photon). Comme
toutes les ondes électromagnétiques, les ondes de lumière peuvent interférer entre elles, se
polariser et se courber légèrement pour passer un angle. Ces propriétés permettent de filtrer la
54
Figure 1.4-1 : Spectre électromagnétique et pénétration de la lumière à travers la peau
UVVis
Rayons Rayons Infrarouge Micro- Ondes γ X ondes radio
U V B
λ 10-9 10-7 7 x 10-7 10-3 1 m
UVC UVA Visible IR
290 315 400 700 nm
Stratum corneum Epiderme Derme
D'après (James, 1991; Kornhauser et al., 1991; Nelson et Cox, 2000)
lumière par longueur d'onde ou de l'amplifier de manière cohérente, comme dans un laser. La
propagation de la lumière est modélisée comme un rayon suivant une ligne droite et les
lentilles et miroirs redirigent ces rayons suivant des trajectoires prévisibles. Dans un système
optique macroscopique et non cohérent, tel que nous l'avons employé dans ce travail, les
ondes lumineuses sont distribuées aléatoirement et il y a un nombre suffisant de photons pour
que les effets ondulatoires puissent être considérés insignifiants (Ryer, 1997).
La plupart des effets photobiologiques montrent une réciprocité entre les temps
d'exposition et l'intensité du rayonnement. La réponse dépend du nombre total de photons et
non de la vitesse à laquelle ils sont reçus. Cependant, pour les phénomènes dans lesquels des
processus de réparation entrent en jeu et pour les doses massives, cette réciprocité peut ne
plus être vérifiée (Kochevar, 1992).
55
1.4.2 La peau humaine
La peau est un organe hétérogène constitué de 2 couches principales, le derme et
l'épiderme, sous-tendues par une épaisseur variable de graisses sous-cutanées, l'hypoderme.
Sa structure anatomique (Figure 1.4-2) varie fortement selon la zone du corps, l'âge, l'état
de santé, notamment en ce qui concerne l'épaisseur des différentes couches et leurs propriétés
physiologiques. Le collagène est le principal constituant de la matrice extracellulaire.
1.4.2.1 L'épiderme
Il s'agit d'un épithélium stratifié non vascularisé dans lequel plusieurs couches sont
distinguées du point de vue histologique; à savoir, depuis la base, le stratum basale (couche
basale), le stratum spinosum (couche de Malpighi), le stratum granulosum (couche
granuleuse) et le stratum corneum (couche cornée). Son épaisseur varie de 40 µm (paupières)
à 1.6 mm (plante des pieds).
Figure 1.4-2 : Vue d'ensemble de la peau
(Shier et al., 1996)
56
Les kératinocytes, cellules nucléées métaboliquement actives, se différencient et se
kératinisent au cours d'une évolution de 28 jours environ. Les cellules sont continuellement
formées (épidermopoïèse) dans la couche basale, à la jonction dermo-épidermique. En
migrant d'une couche à l'autre, la kératinisation, processus lié au métabolisme lipidique,
progresse. Les cellules perdent finalement leur noyau et leurs lipides, s'aplatissent et
durcissent pour former les cornéocytes, cellules polyhédriques riches en kératine, de 30 à 50
µm de long sur 0.2 à 2 µm d'épaisseur, à la membrane extrêmement résistante. Au niveau du
stratum disjunctum, les cellules cornées finissent par desquamer. L'ensemble de la couche
cornéee contribue à contrôler l'hydratation de la peau et le transport percutané. Les substances
hydrosolubles et les lipides de l'épiderme et des glandes cutanées se retrouvent à la surface de
la peau, sous une forme plus ou moins émulsifiée (Langguth et al., 1991).
Intercalés entre les kératinocytes de la couche basale, les mélanocytes étendent leurs
dendrites. Ils relarguent dans les kératinocytes voisins des mélanosomes, vésicules contenant
des pigments, les mélanines. Ces pigments protecteurs sont à la fois un filtre de densité
neutre, capable d'atténuer les radiations solaires depuis les UV jusqu'aux confins du visible
(Bickers, 1998), et un échangeur d'électrons qui permet de piéger les espèces réactives de
l'oxygène (Pathak, 1986).
Les cellules de Langerhans sont les principales cellules dendritiques de la peau. Elles
dérivent de la moelle osseuse et contiennent des granules cytoplasmiques distincts, les
granules de Birbeck (Muller et al., 1992). Etalant de longs dendrites, elles sont réparties dans
les cellules épidermiques (stratum spinosum) à raison d'environ 2 %. Elles sont spécialisées
dans la présentation des antigènes dans le cadre de la réponse immunitaire médiée par les
lymphocytes T (Bayerl et al., 1999). D'autres types de cellules dendritiques, récemment mises
en évidence, joueraient également un rôle important dans les réponses immunitaires (Meunier,
1999).
Les cellules de Merkel (stratum granulosum) sont des récepteurs à la douleur, au prurit et
à la température.
Un trafic permanent des lymphocytes T entre la peau et la circulation systémique, et donc
l'équilibre entre activation et tolérance immunitaire, dépend de nombreux facteurs, notamment
de médiateurs solubles (intégrines, sélectines et cytokines) qui seraient en partie régulés via
les cellules dendritiques (Stevens et Bergstresser, 1999).
57
1.4.2.2 Le derme et l'hypoderme
Le derme forme la masse principale de la peau et lui assure résistance et élasticité. Il
supporte et lie la couche épidermique; son épaisseur varie de 3 à 5 mm. Ses papilles
augmentent la surface de contact entre les 2 tissus, assurant la cohésion de l'ensemble et
l'alimentation de l'épiderme. Le derme est un tissu essentiellement non cellulaire, constitué
d'une matrice dense de tissu conjonctif, fibreux et élastique, le collagène, imbriqué dans des
glycosaminoglycanes et des protéoglycanes. Il comprend des fibroblastes, des histiocytes, les
corpuscules de Meissner (sensation du toucher), les corpuscules de Pacini (capteurs de
pression et de vibration) et des mastocytes. Ces derniers jouent un rôle dans le déclenchement
de réactions allergiques. La matrice enrobe également des fibres nerveuses, des capillaires
sanguins, des vaisseaux lymphatiques, les glandes sudoripares, de même qu'une partie de
l'appareil pilosébacé.
L'hypoderme n'a qu'une frontière floue avec le derme. Il est formé de tissu conjonctif
lâche dont les mailles enserrent des amas d'adipocytes; il est à l'origine du tonus cutané et
forme un manteau d'isolation thermique et de protection mécanique. Dans l'hypoderme se
trouvent des vaisseaux sanguins et lymphatiques, des muscles et les follicules pileux
(Langguth et al., 1991; Magee, 1991; Bickers, 1998).
1.4.3 Le rayonnement solaire
Bien que l'énergie émise par le soleil corresponde pratiquement à tout le spectre
électromagnétique, seule une étroite portion du rayonnement arrive à la surface de la terre.
Cette fraction correspond à une partie des ultraviolets (depuis environ 290 nm), au visible et
aux infra-rouges proches. L'ozone stratosphérique, qui se forme par interaction de l'oxygène
avec les rayonnements inférieurs à 100 nm, absorbe l'énergie incidente entre 120 et 310 nm,
ce qui permet de filtrer efficacement les radiations les plus énergétiques (Figure 1.4-3).
Les mesures du flux solaire montrent cependant que les doses d'UVB qui arrivent à la surface
du sol peuvent varier jusqu'à un facteur 20. Cette variabilité est en partie liée à des effets
saisonniers, au trajet optique de la lumière dans les couches d'ozone et d'air, à l'altitude, à la
latitude, à la quantité de nuages, de brouillard et de pollution (Bickers, 1998). Une réduction
drastique de l'ozone atmosphérique, telle qu'actuellement observée9, devrait avoir des
conséquences biologiques importantes qui semblent enfin préoccuper les décideurs politiques.
Bien que la distribution des longueurs d'onde solaires dépende fortement de la latitude, les 9 Aux latitudes moyennes de l'hémisphère nord, la diminution d'ozone par décennie est actuellement estimée à 6 à 7 % en hiver et 2 à 3 % en été (Diffey, 1999).
58
Figure 1.4-3 : Spectre de l'énergie solaire reçue à la surface de la terre avec les principales bandes d'absorption atmosphériques (O2, O3 et H2O).
(Kornhauser et al., 1991)
fluences10 en UVA sont généralement 10 à 50 fois supérieures à celles des UVB (El-Ghorr et
Norval, 1999) et beaucoup plus constantes au cours de la journée et des saisons (Gasparro et
al., 1998). Les nuages atténuent les UVB et UVA de 25 à 35 % mais ils absorbent beaucoup
plus les infrarouges, diminuant la sensation d'avertissement par la chaleur au niveau cutané.
Ils augmentent de la sorte les risques de surexposition aux UV (Diffey, 1999).
La composante du spectre solaire photobiologiquement active à la surface de la terre
inclut les longueurs d'onde de 290 à 700 nm. Bien que la portion infrarouge induise
principalement un effet thermique, elle est susceptible d'interférer avec la réponse
physiologique aux longueurs d'onde plus basses (Menezes et al., 1998).
10 cf Section 2.3.1.4
59
1.4.4 Le soleil et la peau
" A la fois bienfaisant et cruel, l'astre du jour a toujours été l'objet de vénération, par
exemple dans l'ancienne Egypte. Le dernier culte en date est celui, né il y a peu, du
bronzage, c'est-à-dire du hâle érigé en signe de bonne santé, de bien-être matériel et
de dynamisme de bon aloi." (Bertrand, 1992)
De fait, les modes de vie se sont nettement modifiés au cours des dernières décennies. Un
surplus de loisirs passés en "vacances ensoleillées", le recours au bronzage artificiel, la
mauvaise utilisation des produits solaires et le port de vêtements réduits à leur plus simple
expression entraînent des expositions au soleil plus fréquentes et plus longues (Diffey, 1999).
1.4.4.1 Pénétration de la lumière à travers la peau
La réponse de la peau vis-à-vis d'une radiation électromagnétique est variable suivant la
longueur d'onde et la dose reçue. La transmission des rayons lumineux (Figure 1.4-1) dépend
de nombreux paramètres, parmi lesquels la couleur de la peau, l'épaisseur et l'état de
l'épiderme ainsi que le spectre d'absorption, la concentration et la distribution des
chromophores dans les différentes couches cutanées. D'éventuelles expositions solaires
antérieures peuvent également jouer un rôle, ainsi que certains états pathologiques altérant
l'intégrité du revêtement épidermique tels que brûlures ou psoriasis (Kornhauser et al., 1991).
La peau est un milieu non homogène constitué de plusieurs couches qui présentent des
propriétés optiques propres et une distribution particulière de chromophores. Le stratum
corneum transmet les longueurs d'onde de 250 à 3000 nm. Une partie de l'énergie (4 à 7 %)
est perdue par réflexion; l'acide urocanique11, déposé à la surface de la peau par la
perspiration, ainsi que les lipides excrétés dans le sébum peuvent réduire fortement cette
transmission. Une autre partie du rayonnement, principalement pour les longueurs d'onde les
plus basses, est dispersée et absorbée par les chromophores endogènes, à savoir, les mélanines,
l'acide urocanique, les protéines, les lipides et les dérivés de cholestérol. Dans l'épiderme, les
40 % des UVB qui ont pu traverser la couche cornée sont absorbés quasi totalement par les
mêmes chromophores auxquels s'ajoutent les acides nucléiques des cellules vivantes. Des
mesures d'induction de dimères cyclobutanes dans l'ADN ont cependant montré qu'un
rayonnement de 300 nm était atténué de seulement 2.5 % par couche cellulaire traversée sans
qu'un gradient de dégâts s'établisse dans l'épaisseur de l'épiderme (Chadwick et al., 1995);
11 formé par désamination enzymatique de l'histidine
60
celui-ci n'offre en définitive que peu de protection contre les UVB à la couche basale
germinative (Therrien et al., 1999).
Les UVA sont également atténués par de nombreux chromophores, incluant le NADPH, le
NADH, les tétrahydroptérines et les flavines (Kornhauser et al., 1991; Kochevar, 1992). Pour
les radiations visibles, les chromophores majeurs sont la mélanine et l'hémoglobine mais la
protoporphyrine IX, la bilirubine et les carotènes absorbent également. Il y a une véritable
fenêtre optique pour les radiations de 600 à 1300 nm, ce qui pourrait avoir des conséquences
biologiques importantes. La peau est un organe principal de thermorégulation; elle est donc en
contact étroit avec le sang et tous les métabolites exogènes et endogènes sont susceptibles
d'être activés par la lumière. La totalité du sang passe au niveau de la peau en 20 min
(Kornhauser et al., 1991; Beissert et Granstein, 1995), ce qui correspond au temps requis pour
recevoir de 1 à 2 MED12, le midi en été au Royaume-Uni (Duthie et al., 1999).
1.4.4.2 Effets des rayons solaires sur la peau
Une exposition solaire provoque différentes réactions de la peau qui peuvent être classées
par rapport à leur ordre chronologique d'apparition (Heenen, 2000) :
• des lésions à l'ADN; une biopsie 15 minutes après l'exposition montre que des
phénomènes de réparation sont déjà effectifs; en fait, 24 h après exposition
à 1 MED d'UVB, 50 % de l'ensemble des cellules de la peau et 75 % des cellules de
Langerhans présentent encore des dimères cyclobutanes dans leur ADN (Vink et al.,
1994);
• une régulation positive des facteurs de transcription AP-1, p53 et NF-κB, dans les 15 à
30 minutes suivant l'irradiation (Young, 1999);
• un érythème, dû majoritairement aux UVB et dépendant en partie des lésions à l'ADN
(Young, 1999);
• une pigmentation, liée de manière encore incomprise à l'érythème mais aussi aux
lésions à l'ADN (Young, 1999);
• une hyperplasie, un épaississement de la couche cornée qui serait en fait une
cicatrisation réparatrice après la mort apoptotique des cellules lésées; ce phénomène
commence quelques heures après l'irradiation et persiste plusieurs semaines (Young,
1999).
12 MED = minimal erythemal dose, la dose minimale de radiation UV qui induit un rougissement de la peau perceptible 24 h après l'exposition. Une MED correspond à 21 mJ/cm² pour le spectre d'un simulateur solaire.
61
Les effets de l'irradiation solaire et des UV sur la peau sont très nombreux (Tableau 1.4-1)
et, malgré un nombre considérable d'études, encore relativement peu connus. Ils sont
extrêmement complexes et dépendent des doses reçues pour les différentes composantes du
spectre UV. Les effets de ces composantes peuvent en effet être médiés par différents
mécanismes qui agiraient en synergie et/ou en antagonisme (El-Ghorr et Norval, 1999). Les
études menées avec des lampes de spectre bien défini permettent d'élucider certains points et
d'attribuer certains effets à des bandes précises de longueurs d'onde mais la compréhension du
problème global reste encore fragmentaire.
Tableau 1.4-1 : Effets des rayons UV sur la peau
nmUVB
290 – 315UVA2
315 – 340UVA1
340 – 400
Bénéfices
Bronzage ++ + + Synthèse de vitamine D3 ++ - -
Risques
Erythème ++ + - Photolésion de l'ADN ++ + - Cancers cutanés ++ + ? Vieillissement ++ + - Immunosuppression ++ + - Réactions photodynamiques Type II - + ++ Lucites + + ++
D'après (Bertrand, 1992)
Les spectres des lampes employées, les filtres et monochromateurs, les niveaux d'énergie,
les temps d'exposition, les conditions d'irradiation et même les radiomètres diffèrent fortement
d'une étude à l'autre. Il n'est donc guère étonnant que les données publiées apparaissent
parfois contradictoires. A notre connaissance, il n'y a début de standardisation des méthodes
que dans les 2 domaines qui comportent un intérêt notable pour l'industrie cosmétique, à
savoir la mesure in vivo du facteur de protection solaire (SPF, sun protection factor)
(Chardon, 1997) et l'étude in vitro de la phototoxicité (Spielmann et al., 1994).
1.4.4.2.1 Effets aigus des rayons solaires : le"coup de soleil"
Le coup de soleil résulte habituellement d'une exposition de la peau aux rayons UV. La
symptomatologie apparaît dans un délai de 4 à 24 h et, sauf en cas de réaction sévère, se
résorbe entre 48 et 72 heures (Tableau 1.4-2). Les altérations cutanées vont de l'érythème
62
modéré, suivi d'une desquamation rapide, à la douleur, à l'œdème, à la sensibilité douloureuse
au toucher et aux phlyctènes, qui résultent d'expositions plus prolongées. Des symptômes
généraux (fièvre, frissons, faiblesse, choc) semblables à ceux d'une brûlure thermique peuvent
apparaître si la surface corporelle est atteinte sur une grande partie, ou encore être liés à un
coup de chaleur ou à un épuisement par la chaleur (Berkow et al., 1992).
Tableau 1.4-2 : Réponses cutanées à une irradiation UV (érythème et bronzage) Radiation solaire UVA UVB UVC PUVA (a)
(psoralène+UVA)
Erythème
Dose relative 1 1000 1 0.5 – 1 5 – 100
MED 15 - 30 min 30 - 60 J/cm² 30 - 60 mJ/cm² 15 - 30 mJ/cm² 0.1 - 10 J/cm² Temps (heures)
- début - pic - fin
4 – 6 24 72
< 1
6 – 12 24
6
24 72
4 6
12 - 36
12 – 24 48 – 72
> 96
Pigmentation
Dose relative 1 500 1 Pas de pigmentation 5 - 100 Temps (heures)
- début - persistance
Immédiate et 72 h
+++
Immédiate
++
72
+++
- -
Variable
+++
(a) Effets variables avec la dose et la voie d'administration
(De Leo, 1992)
Le mécanisme du coup de soleil n'est pas encore connu avec précision. La cible cellulaire
principale est probablement le kératinocyte, mais le chromophore n'est pas déterminé (De
Leo, 1992). D'après les spectres d'action, il s'agirait principalement de l'ADN avec induction
de dimères cyclobutanes et de photoproduits (6-4); la réponse érythémale serait en fait initiée
par la réparation des photoproduits (6-4) (Young, 1999). Ceci suggère que l'érythème pourrait
être un indicateur clinique des photodégâts à l'ADN; il faut cependant rappeler que des doses
sub-érythémales sont effectives dans l'induction de ces dommages (Young, 1999).
Le spectre d'action pour l'érythème implique à la fois les UVB et les UVA; les UVB
seraient 1000 fois plus efficaces, mais, dans certaines conditions d'exposition,notamment le
midi, les UVA sont reçus en doses très importantes qui agissent en synergie avec les UVB.
Dans les coupes histologiques d'un épiderme irradié par les UVB, des "sunburn cells",
kératinocytes fortement endommagés et entrés en apoptose, sont visibles dans les 30 minutes
qui suivent l'exposition et atteignent un maximum dans les 24 h (Bayerl et al., 1999). Les
corps apoptotiques formés par les sunburn cells peuvent soit migrer "passivement" à travers
63
l'épiderme et desquamer, soit être phagocytés par les kératinocytes intacts adjacents, les
cellules de Langerhans et les macrophages (Bayerl et al., 1999).
Les UVA produisent moins de kératinocytes endommagés que les UVB, mais leur action
sur l'endothélium vasculaire est plus intense. Sous irradiation UVB et UVA, les kératinocytes,
mais aussi les mastocytes, libèrent des médiateurs de l'inflammation, histamine,
prostaglandines (PG), interleukines (IL) et bradykinine (Bickers, 1998). Tous ces médiateurs
contribuent à dilater les vaisseaux et à en augmenter la perméabilité. L'IL-6 apparaît comme
un médiateur principal de la réaction coup de soleil avec un pic à 12 h et une persistance passé
72 h (Murphy, 1999).
1.4.4.2.2 Le bronzage
Le bronzage, coloration accrue de la peau après exposition au soleil, est biphasique. Il
commence par une pigmentation immédiate qui s'affaiblit rapidement jusqu'au développement
d'une pigmentation retardée persistante (Tableau 1.4-2). La réponse primaire est due aux
photons UVA et procède probablement par oxydation de la mélanine déjà présente dans
l'épiderme; la réponse retardée est due principalement aux UVB qui induisent une
augmentation du nombre de mélanocytes ainsi qu'une redistribution et une mélanisation
accrue des mélanosomes. Le degré de réponse pigmentaire dépend principalement du
phototype et de la dose de radiation (De Leo, 1992).
La mélanogenèse serait en fait initiée par l'excision des photodégâts à l'ADN (Eller et al.,
1996; Gilchrest et Eller, 1999; Young, 1999).
La régulation biochimique du mélanocyte apparaît extrêmement complexe; elle est
modulée par un grand nombre de médiateurs produits par les cellules de l'épiderme et du
derme (cytokines, lymphokines, prostaglandines, vitamines et facteurs de croissance).
Certains de ces signaux régulent le type et la quantité de mélanine produite, d'autres affectent
la croissance, la dendricité, la migration ou la survie des mélanocytes (Hearing, 1999). Chez
l'homme, l'influence des hormones mélanotropes sur la réponse pigmentaire reste contestée.
Les radiations UV induisent cependant (i) la synthèse par les mélanocytes et les kératinocytes
de la mélanotropine (MSH) et de la corticotropine (ACTH) à partir de pro-opiomélano-
corticotropine; et (ii) la régulation positive de leur récepteur mélanocytaire, le MC1R (Suzuki
et al., 1999).
1.4.4.2.3 Effets chroniques des rayons solaires
Une exposition chronique au soleil provoque un vieillissement de la peau. Epaississement,
rides, élastose, télangiectasie et altérations de la pigmentation sont les conséquences néfastes
64
les plus habituelles. Le derme est le site principal des dégâts chroniques associés au soleil qui
seraient principalement le fait des UVA. Sa teneur en collagène diminue alors qu'augmentent
les fibres élastiques (élastine, fibrilline et desmosine), les glycosaminoglycanes, le nombre de
fibroblastes et de mastocytes; le taux en liens croisés du collagène s'élève. Un épaississement
de l'épiderme et une augmentation des kystes dermiques sont également observés. Des lésions
kératosiques précancéreuses (kératose actinique ou solaire) constituent une conséquence
fréquente de plusieurs années d'exposition excessive (Berkow et al., 1992).
Le photovieillissement prématuré de la peau serait dû en grande partie à des ROS, induits
par les UVA via un chromophore photo-excité. Les chromophores endogènes possibles
incluent le NADH/NADPH, le tryptophane, la riboflavine et les porphyrines mais aussi une
transition photochimique mineure de l'acide trans-urocanique qui produirait du 1O2 (Hanson
et Simon, 1998).
1.4.4.2.4 Action sur le système immunitaire
Une immunosuppression intense peut être induite par une seule exposition à des doses
élevées d'UVB (Dandie et al., 1998), et ce aussi bien pour l'hypersensibilité immédiate13 et
retardée14 (El-Ghorr et Norval, 1999) que pour l'immunosurveillance vis-à-vis des cancers
UV-induits (Cruz, 1992). La suppression de l'hypersensibilité de contact est à la fois locale15,
via une action sur les cellules dendritiques, mais aussi systémique16, via la libération de
médiateurs solubles (Meunier, 1999). Les UVA induisent une inhibition locale, mais pas
d'inhibition systémique; cet effet étant aboli par les tocophérols, il a été attribué à la
génération d'espèces réactives de l'oxygène (Halliday et al., 1998).
Ces phénomènes d'immunosuppression, extrêmement complexes, font intervenir des
aspects cellulaires et moléculaires que nous ne pouvons détailler dans ce travail (Figure
1.4-4). Ils joueraient un rôle considérable dans la possibilité de croissance des cancers UV-
induits (Finlay-Jones et Hart, 1998; Duthie et al., 1999; Murphy, 1999).
A côté de tous ces aspects cellulaires et moléculaires, les photodégâts directs à l'ADN
seraient, d'après les études sur rongeurs, un évènement critique dans l'immunosuppression
(Meunier et al., 1998; Vink et al., 1998). De fait, l'élimination des dégâts cyclobutanes
restaure la réponse immunitaire (Vink et al., 1998) et un traitement topique avec des enzymes
13 Mise en évidence par l'application d'un haptène sur la peau 14 Mise en évidence par injection sous-cutanée d'un antigène 15 Application d'un haptène sur la peau irradiée 16 Application d'un haptène sur la peau à un site distant du site d'irradiation
65
de réparation immédiatement après irradiation semble empêcher la migration des cellules de
Langerhans (Dandie et al., 2000). Les études sur l'homme manquent cependant pour
confirmer cette hypothèse (Duthie et al., 1999).
Figure 1.4-4 : Mécanismes potentiels d'immunosuppression
UV
Mastocyte Cellule de Langerhans
Mélanocyte
Kératinocyte
TNFα
TNFα
IL-1
IL-1ra > IL-1
IL-15 IL-10IL-10 mRNA
IL-12, IL-18
Monocyte Macrophage
Monocyte Macrophage
Cellule T Natural
killer cell
cis-UCA
Trans-UCA
LAK Th1 cytokines
Direct ou via PGE2 (kératinocytes, mastocytes)
CD4 + T Th2 cytokines
CD4+ > CD8+
EPIDERME
?
• Migration vers les ganglions lymphatiques
• Faculté de présentation d’antigène altérée
D'après (Duthie et al., 1999)
1.4.4.2.5 Action sur la transduction des signaux intra-cellulaires
L'exposition aux UV est bien connue pour modifier la transcription de gènes et nombre
des effets cliniques observés résultent probablement de modifications à ce niveau. Les effets
sur plus de 100 gènes mammifères sont documentés, à la fois in vitro et in vivo (Applegate et
al., 1998; Young, 1999; Katiyar et al., 2000). Les mécanismes, cascades d'évènements
moléculaires fort complexes initiées par l'absorption des UV et la génération de ROS,
commencent à être partiellement élucidés, principalement in vitro (Figure 1.4-5).
Les principaux facteurs de transcription induits par les UV sont AP-1 (Wisdom, 1999), p53
(Meek, 1998; Young, 1999) et NF-κB (Piette et al., 1997).
66
Figure 1.4-5 : Schéma simplifié des évènements cellulaires reliant un stress UV à la transcription de gènes
(Young, 1999)
1.4.4.2.6 Réactions de photosensibilisation
Une molécule de photosensibilisant passe à un état excité singulet en absorbant un photon
d'énergie égale à celle séparant son état de base de l'état excité (Figure 1.4-6). La molécule
excitée, d'une durée de vie très courte (< 10 nsec), peut dissiper l'énergie acquise sous forme
de chaleur et/ou de lumière (fluorescence) et retourner à son état de base. Elle peut aussi se
transformer par inversion de spin d'électron en un autre état excité, d'énergie intermédiaire,
donc plus stable (quelques µsec), l'état triplet. Cet état triplet, caractérisé par la présence
de 2 électrons de même spin, peut également retourner à son état de base en émettant un
photon (phosphorescence). Les 2 états excités peuvent aussi donner naissance à des
photoproduits issus d'une isomérisation, d'une fragmentation, d'un réarrangement ou de
réactions intermoléculaires (Kornhauser et al., 1991; Ito et Kawanishi, 1997b). L'état singulet
n'a guère le temps de rencontrer d'autres molécules et initiera plutôt des réarrangements de
structure du chromophore. La durée de vie plus longue de l'état triplet lui permet de diffuser et
de réagir avec des constituants cellulaires (photosensibilisation de Type I) et avec de
67
l'oxygène (photosensibilisation de Type II). Cette réaction formera principalement de
l'oxygène singulet 1O2 mais aussi de faibles quantités d'anion superoxyde O2•-.
De fait, bien que les sensibilisants endogènes de la peau ne soient pas encore déterminés
avec précision, les radiations solaires et UVA grèvent sévèrement les défenses antioxydantes
cutanées, à la fois enzymatiques et non-enzymatiques (Fuchs et al., 1989; Fuchs et Packer,
1990; Dubertret, 1996) induisant une peroxydation lipidique (Tirache et Morliere, 1995) et
des dégâts oxydatifs à l'ADN (Douki et al., 1999).
Figure 1.4-6 : Interconversions entre les états électroniques d'une molécule sous l'action de la
lumière
(Kochevar, 1992)
1.4.4.2.7 Dégâts au niveau de l'ADN
La déconvolution des spectres d'action pour les dégâts à l'ADN montre que les radiations
inférieures à 327 nm ont une action essentiellement de "type UVC" (dommages directs), alors
que les radiations de longueurs d'onde supérieures à 347 nm ont des "effets UVA" (dommages
oxydatifs) purs. Entre ces limites, les dégâts à l'ADN sont de type mixte UVC/UVA, le
rapport dépendant de la longueur d'onde (Peak et Peak, 1989). Une irradiation solaire induira
donc une grande variété de dégâts, modulée par des synergies et des antagonismes entre les
composantes chromatiques. La différence classique pour le public entre "UVB dangereux" et
"UVA sans risques" est donc un leurre, que la limite arbitraire entre ces bandes soit fixée à
315 ou à 320 nm…
68
1.4.4.2.7.1 Les dommages directs
Rappelons que ces dégâts induits au niveau des sites dipyrimidiques, dimères
cyclobutanes et de photoproduits (6-4), ainsi que la possibilité de former des liens croisés
ADN - protéines ont été largement détaillés dans la Section 1.1 de ce travail (Figure 1.4-7).
Ces photodégâts ont un rôle central dans l'irradiation solaire et sont probablement la cause
principale de l'érythème, de l'immunodépression, de la mélanogenèse et de la carcinogenèse
(Malorni et al., 1996).
Figure 1.4-7 : Les photoréactions au niveau de l'ADN
450
250
300
350
400
λ(nm)
Chromophoreprimaire Mécanisme Dégâts à
l'ADN
DNADimères cyclobutanesPhotoproduits (6-4)+ isomères DewarDimères thymidine-adénine
Composécarbonyle
Type I(transfert d'e-)
Photo-sensibilisant
1sens 3sens
TypeII
O21 Modification de guanine
(5'-G-3')
O2•-
H2O2
•OHCassures de chaîneBases oxydées(A~T~C~G)
Cassures de chaîneBases oxydées(T>G>C>>A)
Type I(transfert d'e-)
Modification de guanine(5'-GG-3')
O2
majeur
mineur
fer
cuivre
Photoaddition - dimérisation
Modification de guanine
hydrates de cytosine
Transfert d'e-
Photohydratation
majeur
D'après (Cadet et al., 1997; Ito et Kawanishi, 1997b)
1.4.4.2.7.2 Les réactions photosensibilisées
Certains photosensibilisants peuvent faciliter la formation de dimères cyclobutanes et de
photoproduits (6-4) par un mécanisme de Type I (Figure 1.4-7). C'est le cas par exemple lors
de l'irradiation de l'ADN à des longueurs d'onde proches de 300 nm en présence
d'acétophénone ou de dihydroxyacétone (Lamola et Yamane, 1967). Un mécanisme similaire
peut également induire un attachement covalent base pyrimidique – acide aminé, donc
69
probablement des liens croisés ADN – protéines. Les guanines situées en 5' d'une guanine ou,
dans une bien moindre mesure, en 5' d'une adénine, sont également sensibles à une oxydation
par ce mécanisme (Ito et Kawanishi, 1997b); l'oxydation de cette guanine semble favorisée
par un effet d'empilement qui modifierait sensiblement son potentiel d'ionisation.
Les photosensibilisations de Type II (1O2) ont été présentées en détails dans la Section
1.2; il y attaque sélective des guanines. Une voie mineure procède par la formation de O2•- et
sa dismutation en H2O2. En présence de fer(II), il y a formation de •OH qui provoque des
cassures de chaînes et attaque sans distinction les 4 bases; en présence de cuivre(II), il y a
également des cassures de chaînes mais, par contre, les dégâts au niveau des thymines et des
guanines sont nettement plus fréquents (Ito et Kawanishi, 1997b).
1.4.4.2.8 Généralités sur les cancers cutanés
La fréquence des carcinomes basocellulaires (BCC) et spinocellulaires (SCC) cutanés
chez les sujets de race blanche au teint clair est directement liée à l'ensoleillement annuel de la
région. Ces lésions sont habituelles chez les adeptes du soleil et les personnes travaillant en
extérieur (agriculteurs, marins). Les carcinomes basocellulaires sont le plus souvent
accessibles à un traitement chirurgical radical et ne métastasent généralement pas (< 0.5 %),
augurant d'un pronostic favorable (Lacour, 1999). Les carcinomes spinocellulaires se
développent généralement sur des lésions cutanées précurseurs (dysplasies, kératoses
actiniques, lésion inflammatoire chronique) et sont observés en zones photo-exposées (visage,
mains). Leur traitement chirurgical pose peu de problèmes à un stade initial mais, de par leur
propension à l'extension locorégionale et métastatique, le pronostic est défavorable à un stade
plus avancé (Descamps, 1999).
L'incidence du mélanome malin cutané (CMM) augmente également avec la durée
d'exposition au soleil, mais la relation est moins évidente que pour les autres cancers
(Berkow et al., 1992; Bickers, 1998). Le risque de mélanome n'est en général pas corrélé avec
une accumulation d'expositions au soleil mais bien avec les séquelles d'une exposition solaire
brutale dans l'enfance ou l'adolescence (Buzzell, 1993; Bickers, 1998). Deux types de CMM
peuvent être opposés, d'une part le mélanome se développant sur un nævus d'autre part le
mélanome "primitif" sans lésion pigmentaire préexistante (Dréno, 1999). Ce sont des tumeurs
variables dans leur taille, leur forme, leur couleur (habituellement pigmentée) et dans leur
tendance à l'invasion et aux métastases. Seuls le dépistage précoce par inspection et la
pratique d'une biopsie afin d'apprécier histologiquement l'épaisseur des mélanomes apportent
la garantie d'un traitement efficace et d'un pronostic optimal (Berkow et al., 1992). En effet, le
type de mélanome compte moins pour le taux de survie que l'épaisseur de la tumeur au
70
moment du diagnostic. Le mode de dissémination du mélanome malin est à la fois
lymphatique et sanguin; les métastases cutanées et viscérales sont difficiles à traiter et
résultent en un taux de mortalité considérable (Dréno, 1999).
1.5 LA MUTAGENESE ET LA CARCINOGENESE EN RAPPORT AVEC LES DOMMAGES A L'ADN
La mise en évidence de toute une série d'adduits et lésions à l'ADN (Sections 1.1 et 1.2)
pose un certain nombre de questions qui restent pour la plupart sans réponse :
• Quelles sont les lésions qui présentent un risque pour la cellule ?
• Une lésion donnée est-elle en relation avec un risque de mutagénicité et/ou de
létalité ?
• Y a-t-il un seuil de risque ou une relation "dose – quantité de lésion – risque" ?
• Quelle est l'importance de la localisation de la lésion ?
• Quel est le rôle des mécanismes de détection et de réparation de la lésion ?
• Un stress ou une lésion peut-il induire des facteurs de transcription ? Leur
induction est-elle périphérique ou, au contraire, centrale à la réponse cellulaire ?
• Y a-t-il des lésions marqueurs d'un risque ?
Bien qu'il y ait sans doute beaucoup de mécanismes communs, la situation dépend
largement du problème envisagé. Il est évident qu'une lésion rare, mal détectée, mal réparée,
mutagène et située sur un gène essentiel présentera un risque beaucoup plus grand qu'un
adduit abondant à travers tout le génome mais efficacement réparé. Il est en fait parfaitement
possible qu'une lésion "exotique", rare mais dévastatrice, n'ait pas encore été mise en
évidence; les méthodes actuelles les plus sensibles permettent, dans le meilleur des cas, de
détecter une base modifiée pour 107 à 108 bases normales, ce qui n'est peut-être pas encore
suffisant…
1.5.1 La carcinogenèse, un processus multi-étapes
La croissance et la différenciation cellulaire dépendent de l'action coordonnée de gènes
promouvant (proto-oncogènes), inhibant (gènes suppresseurs de tumeur) ou régulant (gènes
des cyclines et protéines apparentées) le cycle cellulaire. La progression tumorale serait la
conséquence d'une cascade d'évènements successifs, en fait une accumulation de lésions
71
Figure 1.5-1 : Modélisation des différentes étapes de la carcinogenèse
Carcinogène
Initiation (génétique, irréversible)
Promotion (épigénétique, réversible)
Progression maligne (génétique, irréversible)
Pas de modification phénotypique Phénotype tumoral
Promoteur
D'après (Soufir et Basset-Seguin, 1999)
génétiques, liée à l'évolution clonale et à la sélection. Différents types d'altérations peuvent
s'observer, comme par exemple l'inhibition des gènes suppresseurs17 ou l'activation des proto-
oncogènes18 (Weinstein et al., 1995; Soufir et Basset-Seguin, 1999).
La carcinogenèse est donc un processus multi-étapes (Figure 1.5-1) associé à
l'accumulation de mutations et/ou à l'expression anormale de gènes : (i) au cours de
l'initiation, une seule cellule, qui subit un événement carcinogène, peut se développer en
formant un clone cancéreux; (ii) la promotion est une phase réversible dans laquelle
l'existence stable de la prolifération clonale cancéreuse dépend généralement d'un agent
agissant à un niveau épigénétique, par altération des voies de transduction de signaux, de
l'expression de gènes ou de la différenciation cellulaire; et (iii) la progression correspond à la
croissance irréversible des cellules altérées et à leur évolution ultérieure vers des phénotypes
hétérogènes d'autonomie et de résistance. Dans ce processus multi-étapes, un agent promoteur
est administré après l'exposition à l'agent carcinogène; à l'inverse, la cocarcinogenèse
implique l'exposition simultanée à un agent carcinogène et à un agent qui potentialise l'effet
carcinogène. Bien que de tels processus puissent être expérimentalement bien définis, la
situation est certes plus complexe dans le monde réel où l'exposition à des mélanges divers
d'initiateurs et de promoteurs est continue et répétée. Il est donc probable que se succèdent
plusieurs cycles de dégâts à l'ADN, d'expansion clonale et de promotion de tumeur (Berkow
et al., 1992; Weinstein et al., 1995; Owens et al., 1999).
17 Les mutations les plus souvent impliquées en cancérogenèse humaine se situent au niveau des gènes suppresseurs p53 et p16 18 L'activation des proto-oncogènes ras est l'anomalie la plus fréquente dans les tumeurs solides
72
Il est habituel de classer les composés chimiques suivant la terminologie classique en
"initiateurs", "promoteurs", "carcinogènes complets" et "progresseurs"; mais ces distinctions
deviennent floues en regard de la faculté de certains composés à agir par altération de l'ADN
et/ou augmentation de la prolifération cellulaire. Une classification différente a donc été
proposée, qui se base à la fois sur la propriété des carcinogènes à interagir ("génotoxique") ou
pas ("non-génotoxique") avec l'ADN et sur leurs propriétés prolifératives. Un non-génotoxique
agit par augmentation de la prolifération cellulaire soit par interaction avec un récepteur
cellulaire spécifique19 soit par un mécanisme non spécifique qui peut être (i) un stimulus
mitogène direct; (ii) une toxicité suivie d'une régénération; ou (iii) l'interruption d'un processus
physiologique. Tous ces mécanismes peuvent également être induits par un génotoxique, ce qui
contribue alors à en renforcer les effets (Cohen et Ellwein, 1990).
1.5.2 Lésions à l'ADN et mutations
1.5.2.1 Types de mutations
Les mutations les plus fréquentes dues à l'exposition à un agent mutagène chimique ou
physique sont les mutations ponctuelles; elles résultent de la substitution d'une paire de bases
ou de l'addition / délétion d'un petit nombre de paires de bases (Tableau 1.5-1). D'autres types
de mutations (délétions, insertions, duplications et inversions), de même que les
réarrangements de chromosomes, impliquent de grandes pièces d'ADN. Bien que la relation
entre les dégâts à l'ADN et ces macro-événements soit moins claire, ils peuvent contribuer à
ce type de mutation de par les cassures de chaîne, primaires ou secondaires, qu'ils provoquent.
Les mutations complexes, impliquant de multiples changements de séquence, pourraient
Tableau 1.5-1 : Nomenclature des mutations ponctuelles
Type Mutation Bases substituées
Transition Purine purine Pyrimidine pyrimidine
G A, A G C T, T C
Transversion Purine pyrimidine Pyrimidine purine
G T, G C, A T, A CT A, T G, C A, C G
Frameshift ± (3n ± 1) où n est un nombre entier Décalage du cadre de lecture
(Friedberg et al., 1995)
19 par exemple, les esters de phorbol, les hormones
73
résulter d'un seul événement mutagène qui provoquerait un glissement de l'ADN pendant sa
réplication (Weinstein et al., 1995).
Une substitution de base20 dans la région codante d'un gène peut influencer la protéine
codée à des degrés variés. Une mutation dans une zone non-codante du génome peut
également induire des effets biologiques importants, par exemple au niveau des introns, d'une
origine de réplication de l'ADN ou des séquences promotrices ou régulatrices d'un gène.
1.5.2.2 Etude des spectres mutationnels
Pour un agent mutagène donné, les études sur bactéries, levures et cellules mammifères
permettent de déterminer les sites de mutation d'un ADN endommagé ainsi que leur nature
moléculaire. Le couplage de ces données à la chimie de la lésion et à sa distribution dans
l'ADN permet d'apprécier quels agents chimiques ou physiques sont pré-mutagènes ainsi que
le type de mutation entraînée. La plupart des carcinogènes causent cependant une variété de
lésions chimiques, certaines abondantes, d'autres fort rares; il n'est donc guère aisé de
confirmer par ces méthodes si une lésion suspectée pré-carcinogène l'est réellement. Ces
hypothèses peuvent être testées par la construction et la transfection de molécules d'ADN
portant un adduit bien défini dans une séquence précise (site-specific adducts); les effets
biologiques de la lésion étudiée et l'influence du contexte de la séquence peuvent alors être
évalués sans ambiguïté (Friedberg et al., 1995). Le même type de plan expérimental permet
d'étudier les mécanismes de discrimination des ADN polymérases (Wilson et Singhal, 1998;
Efrati et al., 1999) ainsi que les spécificités des endonucléases de réparation et donc la
"réparabilité" d'une lésion donnée (Boiteux et al., 1998; Karahalil et al., 1998). Ces études
n'en sont toutefois qu'à leurs débuts car elles représentent un travail considérable, exigeant
une maîtrise en chromatographie, en biologie moléculaire et, surtout, en synthèse chimique.
1.5.2.3 Les mutations "signatures"
Une littérature abondante détaille, notamment sur cellules mammifères, les effets
mutagènes des agents qui endommagent l'ADN, incluant les radiations ionisantes et
ultraviolettes, le stress oxydatif et de nombreux chimiques. Ces études supposaient
initialement que les processus mutationnels pourraient laisser des empreintes et signatures
facilement reconnaissables, permettant de leur attribuer un effet carcinogène donné. Mais les
niveaux de complexité se sont avérés beaucoup plus subtils qu'envisagé (Friedberg et al.,
1995; Weinstein et al., 1995; Halliwell et Gutteridge, 1999), notamment : (i) les effets induits
20 mutation silencieuse, missense ou non-sens
74
par la séquence primaire et la structure secondaire de l'ADN, par la chromatine, mais aussi
par le statut trancriptionnel des gènes; (ii) l'efficacité et les cinétiques de réparation; (iii) les
facteurs qui déterminent les préférences d'insertion de base; (iv) l'efficacité de réplication by-
pass d'une lésion; (v) le type d'ADN-polymérase qui réplique le gène étudié; (vi) la
contribution éventuelle des mutations non attribuables à la lésion étudiée; (vii) les multiples
adduits de certains carcinogènes (notamment les alkylants) qui peuvent avoir des spécificités
mutationnelles propres et être substrats de mécanismes de réparation différents; et (viii)
l'induction de mutations similaires par différents types d'agents carcinogènes.
Tableau 1.5-2 : Quelques exemples de mutations "signatures"(a) Agent Base substituée Mutation signature
Hydrocarbure polycyclique aromatique (type benzo[a]pyrène)
purine T G:C T:A et A:T T:A
Amine hétérocyclique et aromatique (type 1-nitropyrène)
G T G:C T:A
Agent alkylant (type éthyl méthanesulfonate)
G A G:C A:T
Espèces réactives de l'oxygène : - 8-oxodG - réactifs type Fenton (H2O2 + métal)
G T C T C T
G:C T:A G:C A:T (aux sites dipyrimidiques)
UVB : - dimères cyclobutanes et/ou photoproduits (6-4)
C C C T et C T C T
G:C A:T (aux sites dipyrimidiques)
(a) Cette table ne reprend que les types de mutations les plus fréquentes induites par ces agents; d'autres types de mutations (autres substitutions, frameshifts, délétions,…) peuvent apparaître, par exemple en fonction du contexte de la séquence
D'après (Weinstein et al., 1995)
En dépit de ces limitations, l'identification de mutations "signatures" (Tableau 1.5-2) et les
nombreux spectres de mutation générés ont contribué à la connaissance de processus
moléculaires de carcinogenèse. Les mutations rencontrées dans certains gènes d'un type donné
de cancer humain peuvent même parfois donner une piste sérieuse quant à la classe d'agent
carcinogène impliquée dans l'induction de ce cancer (Weinstein et al., 1995).
1.5.3 Le gène et la protéine p53
La protéine p53, un facteur de transcription, est probablement le point central de la réponse à
une attaque génotoxique. Cette protéine intègre l'identification d'un génome non-permissif
75
avec l'exécution de réponses cellulaires qui mènent à la réparation ou à l'élimination d'une
cellule endommagée (Moll et Schramm, 1998). La p53 présente de multiples sites de
phosphorylation, substrats de kinases et de phosphatases qui, en fonction de la nature du
signal activateur, coopèrent pour moduler la liaison à l'ADN, donc le type de réponse. Des
mécanismes d'O-glycosylation et -acétylation pourraient également intervenir (Meek, 1998).
1.5.3.1 Activation de p53 par la lumière
Une irradiation solaire, UVA, UVB ou UVC résulte en une augmentation du taux de la
protéine p53 et de son affinité envers l'ADN. L'accumulation induite par les UVB est
homogène dans tout l'épiderme, sans montrer de gradient avec la profondeur; ce qui
correspond en fait à la distribution des dimères cyclobutanes évoquée plus avant
(Section 1.3.4.1). Par contre, sous UVA, l'accumulation de p53 se fait uniquement dans la
Figure 1.5-2 : Activités biologiques de la protéine p53 en réponse à des dégâts à l'ADN
Activation de protéines kinases ? DNA activated protein kinase ? ATM
p53 activée
p53
MDM2
Apoptose
Reconnaissance de l'ADN endommagé et réparation
Arrêt en G1
+p53p p
MDM2
p
Dégâts à l'ADN
p21, GADD45, IGF-BP3
bax, fas, IGF-BP3,
autres gènes ?
Répression transcriptionnelle de facteurs de survie
Non - transcriptionnel
D'après (Meek, 1998; Moll et Schramm, 1998)
76
couche basale; ce qui impliquerait dans l'induction de p53 un photosensibilisant présent dans
les cellules de cette couche (Young, 1999).
1.5.3.2 Activités biologiques de la protéine p53
1.5.3.2.1 La protéine p53 et les dommage à l'ADN : maintien de l'intégrité génomique
De nombreux génotoxiques induisent la p53 mais les cassures de chaînes, notamment
double-brins, semblent les signaux les plus effectifs pour cette induction. Les conditions de
stress (hypoxie, privation de sérum, chaleur) induisent également une réponse p53.
En cas de dégâts à l'ADN, 2 réponses principales sont médiées (Figure 1.5-2) :
• L'arrêt du cycle cellulaire : L'arrêt transitoire des progressions G1 vers S et G2
vers M est essentiel pour empêcher la réplication d'un ADN endommagé (arrêt en
G1) et la ségrégation de chromosomes endommagés (arrêt en G2); il permet la
réparation de l'ADN endommagé avant ces décisions cellulaires critiques, limitant
la propagation d'erreurs génétiques. Le rôle de la p53, bien établi en ce qui
concerne l'arrêt en G1, semble une réponse universelle; son rôle dans l'arrêt en G2,
moins évident, dépendrait du type cellulaire.
• L'apoptose : L'apoptose protège les cellules de la conversion maligne et affecte
négativement la survie de cellules tumorales déjà initiées, comme par exemple les
cellules dysplasiques des kératoses solaires. Cette voie, et donc la présence d'une
p53 phénotypiquement intacte (type sauvage), apparaît critique pour l'éradication
de certaines lignées de cellules tumorales par les thérapies génotoxiques
(radiations et agents cytotoxiques). L'induction d'apoptose est contre-balancée par
le transcript du gène bcl-2 et il semble qu'un équilibre entre l'expression du p53 et
du bcl-2 soit un point central dans la détermination de la réponse apoptotique à un
stress donné (Wang et al., 1998).
Quand la fonction p53 est perdue, les cellules ne sont pas réparées ou éliminées mais
procèdent à la réplication de l'ADN endommagé, ce qui peut résulter en une accumulation de
mutations, de ré-arrangements chromosomiques et en une aneuploïdie (Moll et Schramm,
1998).
77
1.5.3.2.2 Autres rôles de la protéine p53
La protéine p53 est un suppresseur de tumeur (Moll et Schramm, 1998).
Elle régule également la duplication des centrosomes, vitale pour la fidélité mitotique; p53
et son régulateur négatif MDM2 agiraient de manière concertée dans le développement
embryonnaire (Meek, 1998; Moll et Schramm, 1998).
1.5.3.3 Mutations du gène p53 dans les cancers humains
Une inactivation fonctionnelle de la p53 est l'événement le plus fréquent observé dans les
tumeurs humaines, à raison d'au moins 50 % de tous les cancers. La délétion d'un allèle
accompagnée d'une mutation missense21 dans le domaine central de liaison à l'ADN de l'allèle
restant est classique (77 % des mutations) avec des hot-spots dans 4 zones hautement
conservées au cours de l'évolution. Ces hot-spots correspondent aux résidus en contact direct
avec l'ADN ou critiques pour le reploiement correct de la protéine. Ces mutations résultent
dans la plupart des cas en une protéine à demi-vie plus élevée qui s'accumule dans le
cytoplasme, suggérant que les p53 mutés pourraient à la fois avoir perdu leur fonction de
Tableau 1.5-3 : Spectre mutationnel du gène p53 dans les cancers humains Type de cancer Substitution de base
prévalente Inducteur(s) supposé(s)
Colon G A inconnu
Ovaire, cerveau, colo-rectal
C T G G
désamination (spontanée ou induite) de la 5-méthyl-cytosine au niveau des dinucléotides CpG (a) pour former la thymine
Ovaire G A inconnu
Poumon G T fumée de tabac (ex. polycycliques aromatiques), ROS (8-oxodG)
Foie G T alimentaire (ex. aflatoxines)
Sein G T inconnu
Peau C C C T et C T C T
UVB (b)
(a) La méthylation enzymatique de la cytosine au niveau de ces dinucléotides est influencée par l'oxydation (ROS) et la méthylation (alkylants) de la guanine (b) Ces mutations pourraient être également dues à des ROS, notamment via la 8-oxodG; de plus, une des cytosines hot-spot est incluse dans un dinucléotide CpG dont la méthylation-désamination pourrait également expliquer la mutation C T
D'après (Weinstein et al., 1995; Moll et Schramm, 1998)
21 Une mutation missense modifie un codon de telle façon que l'acide aminé spécifié ne soit plus le même.
78
suppresseur de tumeur et gagné une fonction tumorigène (Weinstein et al., 1995; Moll et
Schramm, 1998).
L'analyse du type de mutation missense révèle des différences en fonction du site tumoral;
le profil mutationnel de p53 apparaît donc comme un exemple possible d'épidémiologie
moléculaire, basée sur les mutations "signatures" capables d'indiquer l'origine probable de
certaines tumeurs (Tableau 1.5-3).
Ces données suggèrent qu'une mutagenèse à la fois environnementale et endogène est
opérationnelle dans la formation des tumeurs humaines; l'importance relative de ces sources
de mutation dépend du site du cancer, donc de son exposition aux agents externes et de ses
facultés de réparation.
1.5.4 La mutagénicité des bases oxydées
Le potentiel mutagène et donc carcinogène de toute base modifiée est reflété par ses
propriétés mal-codantes; elles peuvent mener à des mutations, soit directement, soit au cours
de tentatives cellulaires pour les répliquer ou les réparer (Floyd, 1990; Halliwell et Gutteridge,
1999).
L'étude du spectre mutationnel (cf § 1.4.2.2) du stress oxydatif a permis d'identifier une
série de mutations dont les plus fréquentes sont les transitions C T et les transversions
G T et G C. Aucune de ces mutations n'est cependant exclusive du stress oxydatif; elles
peuvent en effet provenir de causes variées, comme des erreurs de polymérases, des
désaminations spontanées (cytosine vers uracile ou 5-méthyl-cytosine vers thymine) ou d'un
mésappariement de certains adduits base - carcinogène (Halliwell et Gutteridge, 1999). Une
mutation tandem observée au niveau des dinucléotides CpC TpT est, par contre, hautement
spécifique de 2 stress génotoxiques, les UVB et les ROS (cf Tableau 1.5-2).
L'induction de mutations G T est en accord avec la grande sensibilité de la guanine vis-
à-vis des ROS et semble indiquer un rôle important de la 8-oxodG, son produit d'oxydation
majoritaire dans l'ADN. Ainsi, dans des cellules exposées au 1O2, dont la guanine est la seule
cible significative, G T est la mutation la plus commune.
Rappelons cependant que tous les paramètres détaillés au § 1.4.2.3 influencent également
le spectre mutationnel induit par les espèces réactives de l'oxygène (Halliwell et Gutteridge,
1999) en agissant par exemple sur le degré d'exactitude des polymérases qui répliquent le
gène lésé.
79
Seules quelques bases oxydées ont été étudiées (Tableau 1.5-4) (Olinski et al., 1998;
Halliwell et Gutteridge, 1999), mais elles montrent effectivement une capacité de
mésappariement certaine, entraînant donc des mutations missense.
Tableau 1.5-4 : Quelques mutations entraînées par les bases oxydées
Base oxydée Base substituée Mutation entraînée
thymine glycols (a) (b) T A T:A A:T
8-oxo-guanine (a) G T G:C T:A
8-oxo-adénine (a) A C A:T C:G
formamidopyrimidines (Fapy-guanine et Fapy-adénine)
bloquent la réplication
2-hydroxy-adénine A C A T
A:T C:G A:T T:A
5-hydroxy-cytosine C T C G
C:G T:A C:G G:C
(a) La base modifiée s'apparie cependant majoritairement à la base normale (b) Ces bases peuvent aussi bloquer la réplication
D'après (Olinski et al., 1998; Halliwell et Gutteridge, 1999)
1.5.5 La photocarcinogenèse
1.5.5.1 Carcinomes basocellulaires et spinocellulaires
Depuis les premières évidences d'une relation entre l'exposition au soleil et le
développement de cancers de la peau, publiées à partir d'observations sur des marins et des
viticulteurs en 1894 et 1896 (Urbach, 1999), de très nombreux travaux ont permis une
meilleure connaissance des mécanismes de photocarcinogénicité.
Un large consensus reconnaît que le risque de carcinomes spinocellulaires (SCC) est
proportionnel à la dose UV accumulée au cours d'une vie. Dans un modèle animal (souris
nues albinos), une exposition journalière aux UV à des doses suffisamment élevées (mais bien
inférieures au seuil érythémal) induit des tumeurs chez 100 % des sujets et une relation de
réciprocité inverse dose-temps est vérifiée jusqu'à l'étendue de vie des animaux (de Gruijl,
1996).
En ce qui concerne les carcinomes basocellulaires (BCC), il n'y a pas de bon modèle
animal mais l'épidémiologie montre qu'ils partagent de nombreux facteurs de risque des SCC.
Une étiologie commune vis-à-vis des radiations solaires est donc habituellement postulée,
bien qu'il y ait des différences essentielles dans la relation entre ces 2 carcinomes et les UV.
80
En effet, il n'y a pas pour les BCC de relation directe avec la dose UV cumulée au cours de la
vie et les tumeurs apparaissent sur des sites irrégulièrement exposés au soleil. Leur étiologie
pourrait donc ressembler plus à celle des mélanomes (CMM) qu'à celle des SCC (de Gruijl,
1996)
1.5.5.1.1 Spectre d'action
Un spectre d'action montre la dépendance d'un effet photobiologique donné vis-à-vis de la
longueur d'onde (Young, 1999). Les premiers spectres d'action générés attestaient que seuls
les UVB et C étaient carcinogènes. Il a ensuite été prouvé que les UVA pouvaient également
induire des cancers cutanés, mais avec une efficacité 1000 fois moindre que celle des UVB
(Figure 1.5-3).
Figure 1.5-3 : Comparaison des spectres d'action pour l'érythème et la carcinogenèse
(____) Dose érythémale minimale 24 h après irradiation (MED) (----) Photocarcinogenèse : données obtenues sur souris nues albinos et
corrigées pour la transmission de la peau humaine (de Gruijl et al., 1993)
(Urbach, 1999)
Il apparaît que les spectres d'action pour l'érythème et la carcinogenèse diffèrent fortement
au-dessus de 320 nm. Les auteurs soulignent toutefois que ce spectre d'action établi pour la
carcinogenèse est relativement imprécis au-dessus de 340 nm; une extension dans le visible
81
est probable mais les données manquent au-dessus de 390 nm (de Gruijl et al., 1993).
Soulignons que les UVA sont bien des carcinogènes complets, jouant un rôle à la fois
d'initiateur et de promoteur (de Laat et al., 1997). Leur contribution à la carcinogenèse
cutanée est estimée à environ 10 à 20 %, s'ajoutant de manière arithmétique aux UVB
(photo-addition) (Kelfkens et al., 1990). Aucune donnée n'est encore disponible quant à la
contribution éventuelle de doses massives additionnelles de lumière visible, telles que reçues
par exposition au soleil ou en salon de bronzage (Pflaum et al., 1994; Duez et al., 2001).
1.5.5.1.2 Données concernant le gène p53
1.5.5.1.2.1 Spectres mutationnels
Des mutations du gène p53 sont présentes dans 30 à 50 % des carcinomes spino- et
basocellulaires (Soufir et Basset-Seguin, 1999). La plupart des publications soulignent une
prédominance de mutations UV-spécifiques mais ne présentent que des données partielles.
Nous avons donc exploré la base de données des mutations p53 somatiques compilée par
l'International Agency for Research on Cancer (IARC) (Hainaut et al., 1998) afin de vérifier
sur des données extensives cette présence de mutations signatures UV. La version DataR4,
mise à jour de juillet 2000, a été téléchargée (IARC, 2001) et importée dans Access; nous
avons alors comptabilisé et représenté graphiquement (Figure 1.5-4) les types de mutations
pour les tumeurs (i) de la sous-topographique "skin"; et (ii) de l'ensemble de la base de
données, les tumeurs de la catégorie "skin" étant exclues. Pour les tumeurs de la peau, nous
voyons nettement une prédominance de mutations ponctuelles C T, mais surtout une
prédominance des mutations tandem, principalement aux sites dipyrimidiques CpC. Ces
mutations sont effectivement considérées comme des marqueurs de mutations UV, bien
qu'elles puissent être également induites par le stress oxydatif (cf Tableau 1.5-2).
Ces lésions du p53 surviennent probablement à un stade précoce de la carcinogenèse; elles
sont en effet présentes au niveau des lésions débutantes telles que la maladie de Bowen et les
kératoses actiniques (Soufir et Basset-Seguin, 1999).
82
Figure 1.5-4 : Types de mutation du gène p53 dans les tumeurs somatiques
Tous
Tous
Cancers de la peau (n = 615)
T t3.0
missense0.02%
G t14.
G t5.3
Ponctuelle 87.1%
Insertion 2.6%
Délétion 9.1%
Tandem 0.7%
Complexe 0.5%
Complexe 0.5%
Délétion 5.4%
Insertion 2.0%
Ponctuelle 75.3%
Tandem 16.9%
1%
CC to TT
cMutations ponctuelles : ancers sauf cancers de la peau
(n = 11676)
Tous c
ancers sauf cancers de la peau(n = 13403)
c
G to A28.7%
T to G2.6%T to C
3.7%o A%
o T2%
o C%
C to G3.9%
C to T21.0%
Non caractérisé
0.1%
C to A3.2%
A to C1.6%
A to G9.4%
A to T3.2%
T to A3.0%
G t7%
G to5.0
a
Non caractérisé
63%
CC to TT36%
Mutations ponctuelles : Cancers de la peau
(n = 463)
T to G4.3%
T to C5.4%
o T
C%
C to G3.7%
C to T39.3%
C to A3.5%
A to C1.7%
A to G3.5%A to T3.0%
G to A21.0%
Mutations tandem : ncers sauf cancers de la peau
(n = 97)
Mutations tandem : Cancers de la peau
(n = 104)
CC to TTAA to TT
AC to GT
AT to TA
CA to TG
CC to AG
CC to AT
CC to GT
CC to TA
CC to TG
CG to TA
CG to TC
CT to GG
CT to TC
GA to CC
GA to CT
GC to AA
GC to AT
GG to AA
GG to AT
GG to CT
GT to AC
GT to TG
TA to GG
TG to AA
TG to CA
TG to GT
Non caractérisé
60%
83
1.5.5.1.2.2 Présence de clones de kératinocytes mutés dans la peau humaine normale
Chez des individus normaux, des "îlots" (patches) clonaux de 60 à 3000 kératinocytes
présentant un p53 muté ont été mis en évidence avec une fréquence élevée (jusqu'à 4 % des
cellules dans les zones exposées au soleil). Ces îlots montent généralement en cône à partir
des compartiments présumés de cellules-souches, la jonction dermo-épidermique (Figure
1.5-5) et les follicules pileux. Ils sont plus fréquents et plus grands dans la peau exposée au
soleil; des mutations fréquentes sont observées aux sites dipyrimidiques, C T et CpC
TpT. Ce ne sont jamais des mutations silencieuses, ce qui indique que les cellules mutées au
niveau de sites essentiels du p53 possèderaient un avantage compétitif par rapport à leurs
voisines à p53 de type sauvage. Cet avantage semble stimulé par une exposition solaire et une
telle promotion pourrait être due à une sélection des cellules mutées par déficit d'apoptose
UV-induite; elle est réversible, la densité d'îlots étant indépendante de l'âge du sujet (Jonason
et al., 1996).En accord avec la théorie de cancérogenèse multi-étapes (§ 1.4-1), ces îlots
pourraient représenter une population stable de cellules mutantes non-cancéreuses,
susceptibles d'évoluer plus avant sous des impacts génétiques supplémentaires (Jonason et al.,
1996).
Figure 1.5-5 : Clone conique de kératinocytes p53-mutés
Vue latérale d'une coupe épidermique. Reconstruction dans l'axe Z d'images acquises en microscopie confocale après immuno-marquage fluorescent. L'apex du cône se trouve au bas de l'image, dans le plan de la surface basale. De tels cônes marquent souvent un angle par rapport à la verticale. (Jonason et al., 1996)
1.5.5.1.3 La voie de signalisation "sonic hedgehog"
Des données récentes montrent que la voie de signalisation sonic hedgehog pourrait être
importante dans l'oncogenèse des carcinomes basocellulaires (Soufir et Basset-Seguin, 1999).
84
Figure 1.5-6 : La voie de signalisation sonic hedgehog
(Aszterbaum et al., 1999)
Patched (PTC) est une protéine avec 12 domaines transmembranaires (Figure 1.5-6) qui
inhibe smoothed (SMO), une autre protéine à 7 domaines transmembranaires. Lorsque la
protéine soluble sonic hedgehog (HH) se fixe sur PTC, l'inhibition est levée permettant
l'activation des composants intracellulaires de la voie de signalisation, ce qui résulte (i) en
activations transcriptionnelles (notamment du gène ptc qui code pour patched), via les
facteurs de transcription Gli; et (ii) en prolifération cellulaire (Soufir et Basset-Seguin, 1999).
Dans les BCC, mais pas dans les SCC, cette voie semble activée en permanence, notamment
via des mutations inhibitrices de patched mais aussi des mutations activatrices de smoothened
ou de hedgehog (Tableau 1.5-5) (Aszterbaum et al., 1999; Wikonkal et Brash, 1999).
Tableau 1.5-5 : La voie sonic hedgehog et les carcinomes basocellulaires (BCC) Particularité % des BCC dans lesquels cette
particularité est observée % Mutations type UV
( et )
Dysrégulation positive de toutes les composantes de la voie sonic hedgehog > 95 % ---------
Gène PTC (patched) 27 % C T : 38 % CpC TpT : 10 %
Gène smo (smoothed) 6 - 13 % n.d.
Gène HH (sonic hedgehog) 2 % n.d.
D'après (Aszterbaum et al., 1999; Daya-Grosjean et Sarasin, 2000)
85
Des essais d'altération des gènes codant pour les protéines de cette voie de signalisation
ont permis de reproduire, sur modèles animaux, une pathologie ressemblant au BCC.
1.5.5.1.4 Autres mécanismes moléculaires impliqués
1.5.5.1.4.1 Le gène inhibiteur d'apoptose bcl-2
Alors que les UVB induisent p53 sans effet sur bcl-2, les UVA régulent négativement
l'expression de bcl-2 sans effet sur p53. Les cinétiques sont également différentes, les UVB
agissant en 12 à 24 h, les UVA en 4 h (Wang et al., 1998). L'équilibre entre p53 et bcl-2, qui
joue un rôle important dans l'induction de l'apoptose, apparaît donc modulé à la fois par les
UVB et les UVA, et ce, vraisemblablement par des mécanismes différents.
Les BCC sont des tumeurs à croissance lente caractérisées par une surexpression de la
protéine bcl-2 et la perte de la protéine pro-apoptotique bax (Tomkova et al., 1998); ils
pourraient résulter d'une augmentation de la survie cellulaire plutôt que d'un processus
prolifératif. Les SCC par contre présentent fréquemment des altérations de la protéine p53 et
une surexpression de la cycline D; ces tumeurs se caractérisent par une hyperprolifération
cellulaire (Teraki et Shiohara, 1999).
1.5.5.1.4.2 Les mécanismes de réparation de l'ADN
Les maladies génétiques connues sous le nom de xeroderma pigmentosum se traduisent
par une forte sensibilité au soleil et un risque 1000 fois plus élevé de développer un cancer
cutané. Elles sont dues à des anomalies dans le mécanisme de réparation par excision de
nucléotides (cf Section 1.1.5.3), ce qui tend à démontrer une forte implication de la réparation
de l'ADN dans la protection contre les cancers induits par le soleil (Bootsma et al., 2001). Il
semble en outre que la réparation de l'ADN puisse être en défaut chez des patients présentant
un BCC précoce et chez des individus normaux âgés (Kraemer, 1997).
1.5.5.1.4.3 Les eicosanoïdes et les protéinases
Les eicosanoïdes (acide arachidonique, prostaglandines et leucotriènes), médiateurs
majeurs de l'inflammation induits par l'exposition aux UV (Section 1.3.4.2) mais aussi par les
esters de phorbol, semblent essentiels aux mécanismes de promotion. Les protéinases
cutanées, induites par les UV via différents facteurs de transcription (Section 1.3.4.2.5),
pourraient contribuer à la propagation des cellules tumorales (Kraemer, 1997).
1.5.5.1.4.4 L'immunosuppression
Rappelons que la surveillance immunitaire, un mécanisme essentiel pour repérer et
détruire les cellules tumorales, est sévèrement déprimée lors de l'exposition aux UV
(Section 1.3.4.2.4).
86
1.5.5.1.4.5 Autres gènes impliqués
L'incidence et la localisation des BCC ont été associées avec des polymorphismes au
niveau des gènes de la glutathion synthétase et des cytochrome P450. Les proto-oncogènes
ras semblent agir dans les mécanismes de promotion, mais pourraient également interagir
avec la voie sonic hedgehog (§ 1.4.5.1.3) (Aszterbaum et al., 1999; Rees, 2001). L'induction
d'apoptose par la voie Fas/Fas-L pourrait jouer un rôle dans certaines régression spontanées
de BCC (Teraki et Shiohara, 1999).
1.5.5.2 Les mélanomes
En dépit de nombreuses études, l'étiologie du mélanome malin cutané (CMM) reste
obscure. L'épidémiologie indique une relation complexe avec le soleil et l'importance des
expositions épisodiques plutôt que chroniques (Setlow, 1996; Weinstock, 1996; Urbach,
1999).
1.5.5.2.1 Spectre d'action
Le spectre d'action n'a été relevé que sur un seul modèle animal, un hybride d'un poisson
du genre Xiphophorus (Setlow et al., 1993). Ces poissons sont en fait hétérozygotes pour un
gène suppresseur de tumeur qui, une fois inactivé, permet à un mélanome de se développer.
Ce modèle très sensible présente une réponse linéaire avec la dose de lumière; il mesurerait
principalement l'initiation du processus tumoral (Setlow, 1996).
A toutes les longueurs d'onde étudiées, une activité significative est observée; la fluence
solaire augmentant avec la longueur d'onde, les UVA apparaissent comme la bande spectrale
la plus efficace pour l'induction de mélanome chez Xiphophorus (Figure 1.5-7). Si le spectre
d'action pour le CMM humain était exactement similaire à celui-ci 22, 90 % des effets
inducteurs de mélanome seraient dus aux radiations UVA et visibles contre seulement 10 %
aux UVB.
Cette étude, bien que fortement controversée, est appuyée par différentes données
épidémiologiques qui suggèrent que les UVA sont mélanomagéniques (Moan et al., 1999). En
effet, l'incidence des CMM, au contraire des BCC et SCC, ne montre quasi pas de gradient de
latitude23 pour des populations comparables; ce qui se corrèle en fait à un gradient de latitude
beaucoup plus faible pour les radiations UVA et visibles que pour les UVB (Setlow, 1996;
Moan et al., 1999).
22 Ce qui reste à démontrer, étant donné la distance phylogénétique le séparant du modèle 23 "Gradient de latitude" signifie qu'une relation peut être établie entre le paramètre observé et une latitude géographique décroissante
87
Figure 1.5-7 : Spectre d'action pour l'induction de mélanome (modèle Xiphophorus)
Spectres du graphe (A) multipliés par le spectre midsummer sunlight et normalisés à 302 nm
Spectres normalisés à 302 nm
(Setlow, 1999)
La question reste ouverte à ce jour; un auteur a même proposé il y a peu que le mélanome
pourrait ne pas être causé par la lumière mais plutôt par la température corporelle qui serait
elle-même corrélée avec le faible gradient de latitude observé ??? (Christophers, 1998).
1.5.5.2.2 Données concernant le p53
Le génotype du p53 dans le mélanome présente une image complexe et encore
controversée. Les mutations dans la région codante du gène sont détectées de manière
irrégulière aussi bien dans les mélanomes primaires et métastatiques (2-25 %) que dans les
lignées cellulaires (10-30 %); la détection du gène type sauvage est beaucoup plus fréquente.
Une surexpression de p53 est en fait observée (i) restreinte aux lésions malignes; et
(ii) focalisée en îlots de cellules p53-positives parmi des amas de cellules p53-négatives, la
proportion d'îlots p53-positifs augmentant avec la progression. Ces constatations surprenantes
indiquent que l'expression d'un p53 type sauvage confèrerait aux cellules de mélanome un
avantage sélectif qui pourrait contribuer à l'instabilité génétique et aux métastases; ce qui ne
pourrait s'expliquer que par des mutations dans certaines des voies effectrices de p53 (Albino
et Fountain, 1996).
88
1.5.5.2.3 Autres mécanismes moléculaires impliqués
1.5.5.2.3.1 La régulation du cycle cellulaire
De nombreuses altérations chromosomiques, notamment au niveau du chromosome 1
(~ 80 %) ont été mises en évidence dans les mélanomes (Albino et Fountain, 1996; Kamb et
Herlyn, 2001) résultant en une perte ou une expression anormale de régulateurs du cycle
cellulaire.
1.5.5.2.3.2 Les cytokines
Les mélanomes augmentent leurs facultés d'invasion et de prolifération dans le derme en
altérant leur expression de molécules d'adhésion, de protéinases, de cytokines, de récepteurs
et de ligands; certains de ces facteurs sont secrétés de manière autocrine et sont des
stimulateurs puissants de prolifération cellulaire.
Le caractère invasif du mélanome correspond également à l'acquisition génétique d'une
résistance envers des facteurs inhibiteurs de transit et de croissance sécrétés par les
fibroblastes et les cellules infiltrées (Albino et Fountain, 1996).
89
2. Matériel et méthodes
90
2.1 METHODES ET MODELES BIOLOGIQUES UTILISES IN VITRO
2.1.1 Réactifs et matériel
Tous les milieux, sérums et réactifs pour culture cellulaire, le PBS (phosphate buffer
saline sans hydrogénocarbonate), la solution de Bleu Trypan et la solution de trypsinisation
(EDTANa2H2 0.1 g/l et trypsine 0.25 g/l dans le PBS) ont été obtenus chez Gibco Life
Technologies (Paisley, Ecosse). Les sérums bovins, d'origine sud-américaine, ont été
décongelés, décomplémentés par chauffage à 56°C pendant 30 min, et recongelés à -20°C en
parties aliquotes de 50 ml.
Les cellules sont maintenues dans un incubateur à 37°C, en atmosphère humide (assurée
par une solution de thiomersal 2 mg/l), sous un mélange gazeux de 5 % de dioxyde de
carbone dans l'air. L'ensemble des manipulations est réalisé sous flux laminaire (classe 100)
dans des conditions aseptiques.
Les boîtes de culture (boîtes aérées de 75 cm² et de 25 cm²) proviennent de chez Orange,
les boîtes de culture à 96 puits à fonds ronds et à fonds plats de chez Falcon (Beckton-
Dickinson, USA), le diméthylsulfoxyde (DMSO, 99.5 %) de chez Vel (Belgique), le MTT
(bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium) de chez Sigma (USA), la
solution antiseptique (mélange éthanol:éther, 97.1:2.9, v/v) de chez Stella (Belgique). Les
autres réactifs sont de qualité pour analyse et proviennent soit de chez Merck (Allemagne) ou
de chez Aldrich (USA)
Les mesures spectrophotométriques sont réalisées à l'aide d'un lecteur de microplaques
Labsystems iEMS reader/dispenser MF (Labsystems, Finlande).
2.1.2 Lignées cellulaires et conditions de culture
2.1.2.1 La lignée P388D1
2.1.2.1.1 Description
Cette lignée cellulaire a été isolée (Dawe et Potter, 1957) à partir d'un néoplasme
lymphoïde (P388) induit sur des souris DBA/2 par le méthylcholanthrène. Les cellules P388
du 49ème passage i.p. sur souris ont été maintenues pendant une longue période de temps sans
passage; elles se sont morphologiquement altérées vers des formes amoeboïdes contenant
beaucoup de vacuoles cytoplasmiques. La culture, retransférée in vivo sur souris, a induit une
tumeur présentant ces caractéristiques altérées. Une culture in vitro stable a été initiée à partir
de cette tumeur, sous le nom P388D1. Ce sont des cellules qui adhèrent sur le verre et le
91
plastique et sont capables de phagocyter des particules de carbone et de polystyrène (Dawe et
Potter, 1957; Koren et al., 1975). Elles présentent en fait des caractéristiques semblables à
celles des macrophages et sont capables d'une activité effectrice anticorps-dépendante
(formation de rosette et lyse) (Koren et al., 1975). La lignée P388 a été utilisée par le National
Cancer Institute en tant que modèle in vivo pour la sélection de molécules anticancéreuses.
Son utilisation in vitro s'avérant problématique en raison de la difficulté à maintenir ses
caractéristiques au cours du temps, il a été proposé de les remplacer par les P388D1 qui sont
plus stables (Arnould et al., 1990).
La lignée que nous avons employée a été obtenue auprès de l'American Type Culture
Collection (lignée ATCC CCL-46); une banque de lignée a été réalisée au Laboratoire par
cryogénation dans du milieu de culture complet (cf § 2.1.2.1.2 ) additionné de 9 % de sérum
et de 10 % de DMSO (Badolo, 1999).
2.1.2.1.2 Conditions de culture
Les cellules P388D1 sont maintenues en conditions de croissance logarithmique, en
suspension dans un milieu constitué de RPMI 1640 supplémenté de tampon HEPES24
(10 mM), de pénicilline (100 U/ml), de streptomycine (100 U/ml) et de sérum fœtal de bœuf
(9 %). Les passages sont réalisés 2 fois par semaine par transvasement direct d'environ
1.5 x 106 cellules dans 30 ml de milieu complet (boîtes de 75 cm²). Seuls les passages 3 à 35
sont utilisés, de manière à éviter tout effet du DMSO utilisé lors de la congélation et à
prévenir une dérive éventuelle des caractéristiques de la lignée. L'absence de mycoplasmes a
été vérifiée à 2 reprises au cours de ce travail par l'Institut National de Recherches
Vétérinaires (Bruxelles, Belgique).
2.1.2.2 La lignée HBL
2.1.2.2.1 Description
HBL (Ghanem et al., 1988) est une lignée humaine de mélanome établie et caractérisée
par le Laboratoire d'Oncologie et de Chirurgie Expérimentale de l'Institut Bordet (Bruxelles,
Belgique). Les cellules nous ont été fournies sous forme d'une culture à quasi-confluence
(identifiée en tant que "HBL-96").
24 acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-piperazineéthanesulfonique
92
2.1.2.2.2 Conditions de culture
Les cellules HBL sont maintenues en culture dans le milieu HAM F-10 supplémenté de
pénicilline (100 U/ml), de streptomycine (100 U/ml), de kanamycine (100 µg/ml) et de sérum
fœtal de bœuf (4.5 %) et de sérum de veau nouveau-né (4.5%). Les boîtes de culture sont
examinées 2 fois par semaine. En fonction de la densité cellulaire, le milieu est simplement
renouvelé ou la culture est subdivisée (soit environ une fois par semaine mais, en tous cas,
avant confluence) : les cellules sont rincées à 2 reprises par 3 ml de la solution de
trypsinisation, additionnées de 1 ml de la même solution, laissées en contact à température
ambiante jusqu'à décrochage (2 à 6 min), additionnées de 30 ml de milieu complet et
subdivisées, en fonction de la densité cellulaire, en 2 à 4 boîtes. Le travail a été relativement
court (moins de 30 semaines) avec cette lignée et aucune banque n'a été créée dans notre
Laboratoire. L'absence de mycoplasmes est régulièrement contrôlée par le Laboratoire
donneur (Mycoplasma T.C., Gen-Probe, USA); elle a été vérifiée une fois au cours de ce
travail par l'Institut National de Recherches Vétérinaires (Bruxelles, Belgique).
2.1.2.3 Choix des modèles cellulaires
Le choix des modèles cellulaires devait prendre en compte les facteurs suivants :
• la possibilité de maintenir le modèle in vitro de manière continue;
• la stabilité des caractères de la lignée pendant la durée du travail;
• les grandes quantités de cellules requises pour l'analyse de la 8-oxodG par HPLC
(~ 107 cellules par test);
• le fait que, in vivo, les cellules puissent se retrouver au niveau de la peau et/ou
subir une irradiation UVA;
• une limitation pratique car le travail est réalisé par un seul expérimentateur.
Les P388D1 répondent à l'ensemble de ces critères; il s'agit d'une lignée mammifère, en
suspension, continue, stable et de croissance rapide. C'est un lymphocyte de type macrophage,
donc susceptible in vivo d'être irradié, au niveau de la circulation périphérique (§ 1.3.4.1), et
même de migrer vers la peau.
Le mélanome humain HBL est une lignée continue et stable. Il nous a permis de tester
notre hypothèse sur une cellule de la peau humaine particulièrement concernée par les UVA.
Ce modèle n'a cependant pu être utilisé pour les dosages de 8-oxodG car il s'agit de cellules
adhérentes, ne se prêtant donc guère à une culture de masse aisée.
93
2.1.3 Mesures de phototoxicité au moyen du test MTT (Microculture Tetrazolium Test)
2.1.3.1 Principe du test
Le test de cytotoxicité MTT considère que le point final de la vie cellulaire correspond à
l'arrêt de la respiration aérobie, mesurée par un simple test colorimétrique de l'activité
mitochondriale (Mosman, 1983). Les cellules métaboliquement actives réduisent un dérivé de
tétrazolium, dans notre cas le 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium, en bleu
de formazan insoluble dans l'eau (Figure 2.1-1). La dissolution des cristaux de formazan dans
le DMSO donne alors une solution dont la coloration bleu-violet est directement
proportionnelle au nombre de cellules vivantes (Arnould et al., 1990). Cette relation suppose
que la quantité et l'activité de l'enzyme soient constantes ou distribuées de manière gaussienne
au sein de la population et que les substances testées ne modifient pas ces paramètres. Elle est
en outre influencée par la densité des cellules dans le milieu de culture, probablement via une
modulation de l'activité enzymatique de la chaîne respiratoire en fonction de la phase de
croissance (Gerlier et Thomasset, 1986). Les conditions optimales, telles que déterminées
pour nos 2 lignées (Arnould et al., 1990; Badolo, 1999; Kinnaert, 2001), ont été appliquées
dans ce travail.
Figure 2.1-1 : Structure du MTT et mécanisme de réduction
N+N
N
N
S
N
CH3
CH3
NN
N
HN
S
N
CH3
CH3
+ H+ + 2 e-
MTT Formazan
2.1.3.2 Mode opératoire
2.1.3.2.1 Protocole
Les tests se font en quadriplicat sur une même plaque de culture à 96 puits, ce qui permet,
par plaque, de tester 9 concentrations d'un toxique sur 2 lignées ou de 2 toxiques sur une seule
lignée (Figure 2.1-2). Les cellules sont (i) dispensées dans les puits à la dilution optimale et
laissées au repos dans l'incubateur pendant 24 h; (ii) mises en présence des dilutions du
produit à tester et replacées dans l'incubateur pour le temps testé; et (iii) irradiées à 4°C sous
94
lumière visible ou UVA et replacées dans l'incubateur pendant 45 h. La proportion de cellules
mortes est alors déterminée à l'aide du test MTT.
Une plaque est préparée dans les mêmes conditions en remplaçant la phase d'irradiation
par un séjour de même durée à 4°C, dans l'obscurité ("sham irradiation").
2.1.3.2.2 Préparation des cellules (Jour 0)
2.1.3.2.2.1 Lignée P388D1
A partir d'une culture de 3 à 4 jours, 250 µl de suspension homogène sont prélevés,
additionnés de 250 µl de solution de Bleu Trypan; après homogénéisation, 30 µl de mélange
sont transférés dans une chambre de comptage de Neubauer. Le comptage des cellules
vivantes, c'est-à-dire des cellules excluant le colorant, est réalisé sur les 4 zones de 16 carrés
et la moyenne M des 4 valeurs exprime le nombre de cellules pour 0.1 µl de mélange. Le
nombre de cellules par ml de la suspension initiale est donc égal à :
2 x M 104 cellules /ml soit 2 x M 106 cellules /ml 100
Les cellules nécessaires à l'expérimentation envisagée sont prélevées et centrifugées
(900 g, 2 min); le culot est remis en suspension dans un volume de milieu frais de manière à
obtenir une densité de 105 cellules/ml. Cette suspension sera distribuée de manière homogène
dans une plaque de 96 puits à fonds ronds, à raison de 200 µl par puits, soit 2 x 104 cellules,
en excluant la colonne 1 qui servira de "blanc". La plaque multipuits ainsi préparée est alors
placée dans l'incubateur pendant 22 à 26 h.
2.1.3.2.2.2 Lignée HBL
A partir d'une culture de 3 à 4 jours, les cellules sont décrochées par trypsinisation,
comme décrit au § 2.1.2.1.2 , et la suspension obtenue est centrifugée (450 g, 2 min). Les
culots provenant d'un nombre de boîtes suffisant pour l'expérimentation envisagée sont
combinés et remis en suspension25 dans un volume de milieu frais estimé suffisant pour
obtenir une densité approximative de 106 cellules/ml. Un comptage des cellules en présence
de Bleu Trypan est réalisé (cf § 2.1.3.2.2.1 ) et la densité de la suspension est alors ajustée à
6 x 104 cellules/ml. Cette suspension sera distribuée de manière homogène dans une plaque de
96 puits à fonds plats, à raison de 200 µl par puits, soit 1.2 x 104 cellules, en excluant la
colonne 1 qui servira de "blanc". La plaque multipuits ainsi préparée est alors placée dans
l'incubateur pour 22 à 26 h.
25 Cette remise en suspension nécessite une dizaine d'aspiration/dispensation à l'aide d'une propipette
95
2.1.3.2.3 Mise en contact des cellules avec les substances à tester (Jour 1)
Toutes les solutions sont réalisées dans le milieu de culture. La solution-mère de la
substance à tester est préparée extemporanément et diluée dans une "plaque de préparation"
(dilutions géométriques successives) suivant le schéma présenté à la Figure 2.1-2.
Figure 2.1-2 : Configuration de la "plaque de préparation" des solutions de toxiques
Colonnes
Rangées 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Test 1 A à D
Bla
nc
Sol.-
mèr
e
Dil.
1/2
Dil.
1/4
Con
trôle
Dil.
1/8
Dil.
1/1
6
Dil.
1/3
2
Con
trôle
Dil.
1/6
4
Dil.
1/1
28
Dil.
1/2
56
Test 2 E à H
Bla
nc
Sol.-
mèr
e
Dil.
1/2
Dil.
1/4
Con
trôle
Dil.
1/8
Dil.
1/1
6
Dil.
1/3
2
Con
trôle
Dil.
1/6
4
Dil.
1/1
28
Dil.
1/2
56
A l'aide d'une pipette multi-canaux, 50 µl sont prélevés de chaque puits, colonne par colonne,
et transférés vers les puits correspondants de la plaque de culture cellulaire, en mélangeant par
aspiration/dispensation. Pour éviter toute contamination, le travail est effectué dans l'ordre
suivant : colonnes 1, 5, 9 et ensuite de la solution toxique la plus diluée (colonne 12) vers la
plus concentrée (colonne 2). La plaque de culture est alors replacée dans l'incubateur pour le
temps testé (généralement, 3 h).
2.1.3.2.4 Irradiation UVA et visible (Jour 1)
Après incubation, les plaques sont entourées de ruban adhésif, transférées dans un bain-
marie à 4°C dans la chambre froide, exposées aux sources lumineuses décrites au § 2.3.1.4 ,
ramenées en salle de culture et rapidement décontaminées à l'aide d'un chiffon imbibé de
solution antiseptique; le ruban adhésif retiré, les plaques sont replacées dans l'étuve pour 45 h.
2.1.3.2.5 Mesure MTT (Jour 3)
Après centrifugation des plaques (400 g, 2 min), le surnageant des puits est aspiré avec
précautions et remplacé par 200 µl de solution de MTT dans le PBS (0.5 mg/ml). Après 2 h
d'incubation, la solution MTT est aspirée avec précaution et 150 µl de DMSO sont distribués
dans les puits. Après agitation (vortex, 700 rpm, 15 min) et dissolution complète des cristaux,
les mesures d'absorbance à 540 nm et 620 nm sont réalisées dans les 30 min. Le bruit de fond
est minimisé en retranchant la mesure A620 nm de la mesure A540 nm en chaque point (∆abs);
96
la moyenne des mesures de la colonne 1 ("blanc") est également retranchée de chaque mesure.
La proportion de cellules vivantes par puits est donc calculée :
% cell. vivantes = ∆abs puits - (∆abs moyen "blanc") * 100 (∆abs moyen "contrôle") - (∆abs moyen "blanc")
2.1.3.3 Traitement des résultats
Les courbes "survie cellulaire" en fonction du "logarithme de concentration du
cytotoxique" ont été ajustées aux points expérimentaux en minimisant une fonction coût à
l'aide d'un logiciel original (FADHA) basé sur un simplex modifié (Dubois et al., 1989).
L'algorithme consiste à choisir 2N points dans un espace à N dimensions (N = nombre de
paramètres), à calculer la fonction coût pour ces 2N points, puis à rechercher d'autres points
dans cet espace, à l'aide de transformations géométriques élémentaires. Après chaque
transformation, la fonction coût est recalculée et le point le plus mauvais est remplacé par un
point meilleur, de sorte que l'algorithme converge vers un point correspondant à la valeur la
plus faible de la fonction coût. Lorsqu'une solution optimale a été trouvée, l'algorithme remet
cette solution en question en "explosant", c'est-à-dire en recommençant la procédure à partir
d'autres points (2N-1) de l'espace. La nouvelle solution trouvée est comparée à la précédente
et le processus recommence jusqu'à ce que le seuil de précision fixé soit atteint (différence
entre 2 solutions ~ 10-8); la convergence vers la meilleure solution est alors assurée, quels que
soient la dispersion et le nombre de points expérimentaux et ce, indépendamment de
l'initialisation des paramètres (Abi Khalil et al., 1986; Dubois et al., 1989).
La fonction coût évaluée a la forme :
( )∑ −=n
iiii WmmpF .)(
2
dans laquelle p représente le point de l'espace pour lequel la fonction coût est évaluée, n le
nombre de points, mi la mesure expérimentale à la concentration Ci, im la mesure calculée à la
concentration Ci et Wi le poids attribué à la mesure mi.
Nous avons pu ajuster les points de toutes nos expériences positives à un modèle sigmoïde
simple (Gompertz, ordre 1), de la forme :
CkeNN .. −°=
dans laquelle C représente la concentration testée, N le pourcentage de cellules vivantes à la
concentration C, N° le pourcentage de cellules vivantes à la concentration 0 et k un paramètre.
Afin de pouvoir juger arbitrairement de la qualité de l'ajustement, la valeur N° n'est pas fixée
97
à 100 %, mais est considérée comme un second paramètre à optimiser (Abi Khalil et al., 1986;
Dubois et al., 1989).
2.2 DOSAGE DE LA 8-OXO-7,8-DIHYDRO-2'-DESOXYGUANOSINE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE COUPLEE A UNE DETECTION ELECTROCHIMIQUE
2.2.1 Détecteur ampérométrique et coulométrique
Nous avons employé au cours de ce travail 2 types de détecteurs, ampérométrique et
"coulométrique26". Les systèmes ampérométriques comportent une électrode de travail plane
en carbone vitreux montée dans une configuration de type "flux tangentiel" (Figure 2.2-1);
bien que l'efficacité de ce type de détecteur ne soit que de 5 à 10 %, ils présentent un courant
résiduel faible, ce qui permet d'obtenir un rapport signal-bruit optimal et donc une très haute
sensibilité.
Figure 2.2-1 : Cellules de détection ampérométrique employées dans ce travail
Cellule TL-5A Cellule CC-5
Les systèmes coulométriques sont constitués d'une électrode de carbone poreux à travers
laquelle passe l'entièreté de l'effluent chromatographique. Leur efficacité est proche de 100 %
et ils sont donc théoriquement 10 à 20 fois plus sensibles que les autres détecteurs
26 La terminologie employée par le fabriquant n'est pas correcte; il s'agit en réalité d'un détecteur ampérométrique à haut degré de conversion.
98
ampérométriques; ils présentent cependant un courant résiduel important, ce qui réduit cet
avantage de sensibilité à seulement un facteur 2 ou 3. La combinaison en série de plusieurs
cellules forme une barrette d'électrodes (coularray) qui permet une détection à plusieurs
potentiels simultanés (Figure 2.2-2).
Figure 2.2-2 : Cellule de détection coulométrique et barrette d'électrodes (4 électrodes de
travail)
2.2.2 Réactifs et matériel
2.2.2.1 Réactifs
Les réactifs suivants sont obtenus chez :
Merck (Allemagne) le NaH2PO4.2 H2O (p.a.) le méthanol (p.a., distillé avant emploi) l'urée (très pur) le dodécylsulfate de sodium (p.a.) l'acétate de sodium (p.a.) le MgCl2 (Ph.Eur.) l'acide acétique 96% (p.a.) le NaCl (p.a.) le glutathion réduit (p.a.) l'acétone (p.a.)
Aldrich (USA) l'alcool isoamylique (Grade Bioch.) le peroxyde d'hydrogène (solution aqueuse à 3 %)
Sigma (USA) l'ADN de sperme de saumon la nucléase P1 (Penicillium citrinum; EC 3.1.30.1) la désoxyribonucléase I (bovine pancreas; EC 3.1.21.1) la RNase A (bovine pancreas, heat-inactivated; EC 3.1.27.5) la catalase la 2'-désoxyguanosine (dG) la 2'-désoxyadénosine (dA) la 2'-désoxycytidine (dC) la thymidine (T), la guanosine (G) et l'adénosine (A) la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxodG) le mésylate de déferoxamine (95 %) le chlorhydrate de DL-histidine
Calbiochem (USA) la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine (8-oxoG)
99
Böhringer Mannheim (Allemagne)
la solution de protéinase K (Tritirachium album; EC 3.4.21.14) la solution de phosphatase alcaline (calf intestine; EC 3.1.3.1) la solution d'ARN 16S- et 23S-ribosomial (E. coli)
UCB (Belgique) le saccharose (tout pur) le citrate tri-sodique (Ph.Eur.)
Lab-Scan (Belgique) le chloroforme (p.a.)
Carlo Erba (Italie) le LiCl (99 %) Stella (Belgique) la solution antiseptique (mélange éthanol:éther, 97.1:2.9, v/v)
Janssen (Belgique) le Tris base27 (Bioch. Grade)
Chemie KG Keppler + Reiff (Allemagne)
l'EDTANa2H2
L'eau "Millipore", utilisée pour préparer toutes les solutions, est de l'eau désionisée,
distillée et passée sur un système de purification à 4 cartouches (Millipore, USA).
2.2.2.2 Matériel
Le système de chromatographie liquide haute performance (CLHP) est constitué des
éléments suivants (2 détecteurs sont couplés en série, UV puis électrochimique) : (i) une
pompe modèle 305 couplée à un module manométrique 805 (Gilson, France); (ii) un injecteur
Rheodyne 7125 avec boucle d'injection de 200 µl (USA); (iii) une cartouche précolonne
Ultrasphere C1828 (15 x 4.6 mm i.d.) (Alltech, USA); (iv) une colonne Ultrasphere C18
(particules sphériques de 5 µm, 250 x 4.6 mm i.d.) (Beckmann, USA), entourée d'une jaquette
d'eau maintenue à 30°C; les premiers essais de séparation ont cependant été réalisés à l'aide
d'une colonne µ-Bondapak C18 (particules irrégulières de 10 µm; 30 cm x 3.9 mm i.d.)
(Waters, USA) et d'une colonne Chrompack C18 (particules irrégulières de 5 µm; 2 cartouches
de 10 cm x 2.3 mm i.d. en série) (Chrompack, The Netherlands); (v) un détecteur UV
Holochrome HM (245 nm, 0.5 AUFS) (Gilson, France); (vi) un détecteur ampérométrique
constitué d'un bloc d'électrodes TL-5A (comprenant une électrode de carbone vitreux, une
électrode de référence Ag/AgCl et une contre-électrode en acier inoxydable; cf Figures 2.2-7
et 2.2-8) (BAS, USA) couplé à une unité ampérométrique A.S.I. ED-110 (Tacussel, France)
(+700 mV vs Ag/AgCl; 0.2 à 0.5 nA fond d'échelle); et (vii) une carte d'acquisition de
données 2 x 2 canaux, pilotée par un logiciel d'intégration sous Windows 3.11 (Borwin,
France).
27 Tris = tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 28 C18 = Silice greffée de chaînes hydrocarbonées octadécyles
100
Quelques analyses ont été réalisées en utilisant les détecteurs suivants : (i) un détecteur
UV à barrette de diodes modèle 168, interfacé au système d'intégration Gold sous GEM
(Beckman, USA); (ii) un détecteur ampérométrique constitué d'un bloc d'électrodes CC-5
(comprenant une électrode double en carbone vitreux connectée en mode série, une électrode
de référence Ag/AgCl et une contre-électrode en acier inoxydable, cf Figures 2.2-2 2.2-3)
couplé à une unité ampérométrique LC-4 (BAS, USA) (+700 mV vs Ag/AgCl; 0.1 à 0.5 nA)
Figure 2.2-3 : Géométrie des cellules ampérométriques employées dans ce travail
Entretoise Electrode auxiliaireElectrode de travail
TL-5A
CC-5
Entretoise Electrode auxiliaireElectrode de travail
TL-5A
CC-5
fond d'échelle); ce système peut travailler avec une contre-pression élevée et est donc
connecté avant le détecteur UV; et (iii) un détecteur ampérométrique de type Coularray (ESA,
USA) équipé de 4 électrodes en série, associées à des électrodes de référence en palladium et
des contre-électrodes en platine.
2.2.2.3 Conditions chromatographiques
La phase mobile isocratique, constituée d'un mélange de 92.5 % de tampon aqueux
(NaH2PO4.2 H2O 0.05 M, EDTA 1 mM, pH "tel quel", 5.45) et de 7.5 % de méthanol, est
filtrée sur une membrane de Téflon 0.45 µM (Sartorius, USA) et soigneusement dégazée dans
un bain ultrason. Le débit est de 1 ml/min; la température de la colonne est de 30°C; 100 µl
sont injectés.
Le bloc d'électrodes TL-5A ou CC-5 est démantelé tous les 3 à 4 jours et soigneusement
rincé à l'eau "Millipore" et au méthanol; l'électrode de travail est délicatement polie avec un
papier à longues fibres imbibé de méthanol, ce qui permet de compenser la faible diminution
de signal observée au cours du temps. Aucun polissage alumine n'a été requis au cours des 4
101
années d'utilisation du système. Trois électrodes de référence, conservées en suspension dans
une solution de NaCl 3M, sont utilisées en rotation, tous les 3 à 4 jours.
2.2.2.4 Synthèse de la 8-oxodG
Lorsque nous avons entamé ce travail, la 8-oxodG n'était pas commercialement
disponible; aussi avons-nous réalisé un essai de synthèse par oxydation de la dG et ce, dans 2
buts : (i) développer la séparation chromatographique entre dG et 8-oxodG sous détection
UV, afin de situer le pic de base oxydée avant toute tentative de branchement du détecteur
électrochimique; et (ii) isoler la 8-oxodG par chromatographie liquide afin de pouvoir
l'employer en tant qu'étalon.
Cette synthèse est basée sur la réaction d'Udenfriend, décrite pour l'hydroxylation de
nombreux composés aromatiques (Udenfriend et al., 1954; Kasai et Nishimura, 1984); il s'agit
d'une réaction de type Fenton (ferII, EDTA et oxygène), catalysée par l'acide ascorbique. Nous
avons opté pour la variante proposée par Kasai (Kasai et Nishimura, 1984) qui permet de
réaliser la synthèse de la 8-oxodG en présence uniquement de perhydrol et d'acide ascorbique
sans ajouter d'ions métalliques; elle présente un rendement inférieur mais facilite les étapes de
purification ultérieures (Frenkel et al., 1991). Le mécanisme de la réaction n'est pas connu
avec certitude, mais le radical •OH est certainement impliqué (Kasai et Nishimura, 1984). Il
semble que des ions métalliques en traces amorceraient une réaction de Fenton, l'acide
ascorbique permettant de recycler l'ion métallique oxydé (Eq. 2.2-4) (Halliwell et Gutteridge,
1999).
H2O2 + Mn+
•OH + OH- + M(n+1)+
Dix mg de dG sont incubés un
14 mM en acide ascorbique, 0.13
perhydrol par 50 µg de catalase (1
(évaporateur rotatif sous vide), ad
Le surnageant est décanté, évapor
sensibilité appliquée aux détecteur
Cette synthèse nous a fourni su
chromatographique dG – 8-oxodG
Acide ascorbique
e nuit à 37°C dans 10 ml d'une solution 50 mM en H2O2,
M en phosphate, pH 6.8. Après destruction de l'excès de
h à 37°C), la solution est concentrée à environ 2 ml
ditionnée de 2 volumes d'acétone et laissée une nuit à 4°C.
é à sec, repris dans 5 ml d'eau et dilué en fonction de la
s de CLHP.
ffisamment de 8-oxodG pour mettre au point la séparation
en détection UV (cf Section 3.2.1.1). Nos projets de
102
purification par CLHP semi-préparative de la 8-oxodG sont devenus inutiles de par la
commercialisation de ce nucléoside.
2.2.2.5 Préparation des solutions étalons
Les solutions aqueuses de 8-oxodG et de dG sont préparées et diluées en prenant des
précautions de nettoyage et de rinçage afin d'éviter toute trace de métal qui pourrait catalyser
l'oxydation de la dG. Une solution de travail, contenant environ 4 pmoles de 8-oxodG et
20 nmoles de dG, est préparée par combinaison et dilutions de 2 solutions mères (~ 1.40 mg
de 8-oxodG29 dans 10 ml et ~ 12.70 mg de dG30 dans 50 ml). Cette solution et toutes les
dilutions intermédiaires sont aliquotées et congelées à –20°C; chaque solution n'est
décongelée qu'une seule fois, juste avant l'emploi.
La contamination en 8-oxodG de la dG utilisée pour la préparation des étalons est
déterminée par CLHP en préparant des dilutions individuelles des 2 solutions mères; cette
contamination est d'environ 1.7 par 105 dG, ce qui n'est pas négligeable en regard du niveau
de 8-oxodG dans l'étalon (~ 20 par 105 dG).
2.2.2.6 Préparation des solutions d'extraction et de digestion
• Tampon H : une solution 300 mM en saccharose, 25 mM en Tris et 2 mM en EDTA,
pH 7.3
• Tampon HM : une solution 300 mM en saccharose, 25 mM en Tris, 2 mM en EDTA,
6 mM en glutathion réduit, 2 mM en mésylate de déferoxamine et 8mM en DL-
histidine, pH 7.3
• Tampon DES : une solution 1M en LiCl, 2M en urée, 50 mM en Tris, 5 mM en EDTA
et 2 % en dodécylsufate de sodium, pH 8.0
• Solution d'acétate de sodium : une solution 3M en acétate de sodium, pH 7.0
• Tampon TE : une solution 10 mM en Tris et 1 mM en EDTA, pH 7.4
• Solution de digestion : une solution 0.5 M en acétate de sodium et 0.11 M en MgCl2,
pH 5.1
• Solution de nucléase P1 : 400 U/ml dans l'eau (conservation, environ 3 mois à 4°C)
2.2.3 Dosage de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire
L'extraction et la digestion de l'ADN cellulaire sont adaptées de (Maidt et Floyd, 1996),
avec quelques modifications, notamment au niveau des tampons et de la séquence des 29 Mr = 283.2 30 Mr = 267.2
103
opérations; tout le travail est réalisé sous conditions d'éclairage faible de manière à éviter une
photooxydation éventuelle. Une validation complète de la méthode d'analyse fait l'objet de la
Section 3 de ce travail.
2.2.3.1 Conservation des échantillons
Après le traitement génotoxique étudié, les cellules sont transférées dans un tube Falcon
de 15 ml, lavées à 2 reprises par 1/2 volume de PBS31, transférées à l'aide de 1 ml de PBS
dans un microtube de 1.5 ml, centrifugées (900 g, 2 min), décantées, délicatement
superposées de 250 µl de tampon HM et congelées à -80°C pendant maximum 3 semaines.
Lors de la validation, certains essais ont été réalisés avec un tampon de congélation ne
contenant pas d'antioxydant (tampon H).
2.2.3.2 Extraction de l'ADN
Un culot cellulaire correspondant à environ 107 cellules, conservé à –80°C sous tampon
HM (cf § précédent), est rapidement dégelé, mis en suspension (vortex), additionné de 5 µl de
protéinase K et de 250 µl de tampon DES et incubé à 55°C pendant 2 h. La solution visqueuse
est alors extraite à 2 reprises par 500 µl d'un mélange glacé de chloroforme : alcool
isoamylique (24 : 1) (15 min d'agitation, 5 min de centrifugation à 1800 g). Le surnageant
final, ainsi que tout matériel visqueux adhérant à l'interface, est alors transvasé dans un
microtube32 de 2 ml et additionné de 33 µl de la solution d'acétate de sodium et de 1 ml
d'éthanol 94° glacé; le tube est lentement mélangé par retournement jusqu'à apparition du
filament d'acides nucléiques et incubé 1 h à -20°C. Après centrifugation (1800 g, 5 min), le
culot est rincé 2 fois par de l'éthanol 70° et 1 fois par de l'éthanol 94° (suspension dans 500 µl
de solvant glacé et 2 min de centrifugation à 1800 g), séché 5 à 10 min sous un courant doux
d'azote, mis en suspension dans 250 µl de tampon TE et laissé dissoudre à 4°C pendant
maximum une nuit.
2.2.3.3 Digestion enzymatique de l'ADN
La solution d'ADN dans le tampon TE (cf § précédent) est additionnée de 25 µl de
solution de digestion, dénaturée (100°C pendant 5 min, puis 0°C pendant 5 min), additionnée
de 4 U de nucléase P1 et incubée à 37°C pendant 1 h; après addition de 8 µl de Tris 1 M et de
2 U de phosphatase alcaline, la solution est réincubée à 37°C pendant 1 h. Après addition de
31 Mise en suspension dans 1/2 volume de PBS et centrifugation (900 g, 2 min) 32 Les tubes sont préalablement lavés (2 rinçages avec la solution antiseptique, 2 rinçages à l'eau, 2 rinçages avec la solution antiseptique) et séchés à t° ambiante
104
4 µl d'acide acétique 5.8 M, la solution est maintenue à 4°C à l'obscurité pendant un
maximum de 8 h avant chromatographie (injection de 100 µl).
2.2.3.4 Induction de bases oxydées
Lors de l'étude de validation, nous avons besoin de cellules dans lesquelles la 8-oxodG est
induite à différents taux. Les cellules P388D1 nécessaires à l'expérimentation sont prélevées,
dénombrées et centrifugées (900 g, 2 min) comme au § 2.1.3.2.2.1 ; le culot cellulaire est lavé
2 fois par 1/2 volume de PBS et remis en suspension dans un volume de PBS de manière à
obtenir une densité de 107 cellules/400 µl. Les cellules sont transférées dans une boîte de Pétri
de 30 mm de diamètre, additionnées de H2O2 jusqu'à 20 mM et exposées sans couvercle aux
UVC (tube germicide Sylvania G8T5 placé à 5 cm de la surface du liquide; t° ambiante; 2 à
15 min). Il y a notamment photolyse du perhydrol et génération de radicaux hydroxyles qui
attaquent les biomolécules cellulaires (Halliwell et Gutteridge, 1999) :
H2O2
UVC
2 •OH
Les cellules sont alors immédiatement traitées comme décrit au § 2.2.3.1 en remplaçant le
tube Falcon par un microtube de 1.5 ml.
2.3 INDUCTION ET PHOTOACTIVATION DES PORPHYRINES ENDOGENES
2.3.1 Réactifs et matériel
2.3.1.1 Réactifs
Le chlorhydrate d'acide δ-aminolévulinique (δ -ala), le réactif de Folin et l'albumine
bovine fraction V 96 % (réf. A-4503) proviennent de chez Sigma (USA). Les autres réactifs
sont de qualité pour analyse et proviennent soit de chez Merck (Allemagne) ou de chez
Aldrich (USA). Les porphyrines sont extraites par un mélange HClO4 1 M : méthanol (1 : 1).
2.3.1.2 Matériel
Les mesures spectrophotométriques UV/visible sont réalisées sur un spectrophotomètre
Ultrospec (Pharmacia, Suède). Les spectres UV du polyéthylène et du milieu de culture ont
été relevés sur un spectrophotomètre à barrette de diodes (Hewlett-Packard). Les mesures et
spectres de fluorescence sont réalisées sur un Luminescence Spectrometer Aminco-Bowman
Series 2 (Sim Aminco, USA). Dans certaines expériences, les cellules ont été lysées à l'aide
d'une sonde ultrasons Soniprep 150 (Sanyo Gallenkamp PLC, Royaume-Uni).
105
2.3.1.3 Microscopie
Le microscope utilisé est un Axiovert S100TV (Zeiss, Allemagne), équipé en
épifluorescence ( lampe xénon); une roue à filtres Lambda 10-2 (Sutter, USA) dotée d'un
obturateur rapide permet la sélection des filtres d'excitation. L'objectif utilisé est de type
NéoFluar, 25 x à immersion (Zeiss, Allemagne). La caméra couplée au microscope est une
Hamammatsu Orca-2 (capteur CCD 12 bits refroidi à –50°C), pilotée par le logiciel AQM
(Kinetic Imaging, Royaume-Uni). Pour l'examen des porphyrines, les longueurs d'onde
d'excitation, du miroir dichroïque et d'émission sont respectivement (nm) 425 ± 20, 460 et 590
(long pass) (Gaullier et al., 1995); les filtres de densité neutre sont de type 0.06 (6 % de
transmission) et 0.25 (25 % de transmission) (Zeiss, Allemagne).
2.3.1.4 Sources lumineuses
2.3.1.4.1 Mesure des intensités lumineuses
2.3.1.4.1.1 Définitions
Les conditions d'irradiation sont en fait définies par 3 paramètres, (i) le spectre de la
source, qui dépend des caractéristiques propres de la lampe; (ii) le débit de fluence, l'énergie
radiante, traversant une petite cible sphérique imaginaire transparente contenant le point
considéré, par unité de surface et par unité de temps; pour une lampe donnée, il dépend de la
distance à la source et de l'angle incident et s'exprime en W/m² ou en mW/cm² (IUPAC,
1996); et (iii) le temps d'exposition.
La fluence, l'énergie reçue par unité de surface, exprimée en Joules/m² (J/m²) ou en
millijoules/cm² (mJ/cm²) prend en compte les 2 derniers paramètres; elle est en effet égale au
produit du débit de fluence par le temps d'exposition exprimé en secondes (IUPAC, 1996).
Comme les réponses photobiologiques dépendent principalement du nombre de photons reçus
et non de l'intensité du rayonnement (réciprocité des effets, cf § 1.3.1), la "dose de lumière"
est en fait caractérisée par la fluence.
2.3.1.4.1.2 Choix d'un appareil de mesure
Les systèmes de mesure actuels consistent d'un boîtier et d'une tête de mesure dont les
caractéristiques dépendent de la source à mesurer. Trois grands types de détecteurs sont
utilisés (James, 1991; International Light, 1999; Ophir, 2000): (i) les détecteurs
calorimétriques dans lesquels l'énergie est absorbée, ce qui provoque une augmentation de
température, convertie en signal électrique par un thermocouple; ces détecteurs présentent une
réponse quasi indépendante de la longueur d'onde; (ii) les photodiodes qui convertissent
directement les photons reçus en courant électrique; ils montrent une réponse fortement
106
dépendante de la longueur d'onde et doivent être fabriqués, filtrés et calibrés pour des sources
ou des bandes de longueurs d'onde précises; et (iii) les détecteurs pyroélectriques qui
mesurent l'apparition de charges de surface sur un cristal qui présente un dipôle permanent,
dont le degré de polarisation varie avec la température; ils ne peuvent voir que des signaux
pulsés et nécessitent un mécanisme obturateur de type chopper à l'entrée.
En fonction des activités prévues dans le laboratoire, l'appareil de mesure devait pouvoir
mesurer des tubes fluorescents UVA, UVB et UVC, des lampes visibles et une lampe au
xénon filtrée à travers un monochromateur. Afin d'éviter l'achat de plusieurs tête de mesure
différentes, notre choix s'est porté sur un détecteur de type thermopile, un détecteur
calorimétrique formé de thermocouples empilés, à la réponse quasi indépendante de la
longueur d'onde (Figure 2.3-1).
Figure 2.3-1 : Courbe de réponse du détecteur thermopile
Détecteur thermopile
(Ophir, 2000)
Ce détecteur présente cependant de gros inconvénients. Il est sensible aux infrarouges et il
réagit à la chaleur dégagée par les lampes ou par l'expérimentateur; il continue notamment à
enregistrer un signal (thermique) élevé lorsqu'il est exposé à une lampe chaude éteinte…
Comme il n'existe pas de filtre infrarouge transparent aux UV, nous avons choisi de mesurer
les intensités à travers une boîte de culture contenant 6 ml de milieu complet; ceci permet une
filtration efficace de la chaleur tout en présentant l'avantage de mesurer la dose totale de
lumière (UVB, UVA et visible) qui arrive réellement au niveau des cellules. Le détecteur
reste cependant sujet à une forte dérive thermique et, après quelques minutes de mesures, le
thermopile s'échauffe et enregistre un bruit de fond élevé; après 5 minutes de mesure, un
107
repos d'au moins 2 heures permet de retrouver le "zéro" calibré précédemment dans
l'obscurité.
Le détecteur utilisé pour l'ensemble de ces expériences est un Nova display, couplé à une
tête Thermopile Surface Absorber 2A (Ophir Optronics, USA); c'est un absorbeur large, dans
la gamme 190 à 20000 nm (60 µW à 2 W; temps de réponse, 1.2 s) (Figure 2.3-1).
2.3.1.4.2 Source UVA
La lampe UVA, construite au laboratoire, est constituée de 4 tubes fluorescents typiques
des lampes à bronzer les plus employées (Diffey, 1999); il s'agit de tubes Cleo 15 W (28.8 cm
x 16 mm diam.) (Philips, Hollande), montés en parallèle sur un support (les 4 tubes sont
alignés et espacés de 4 cm) et alimentés par des ballasts standards de 36W/40W combinés
avec un starter S10. La lampe est placée à 23.4 cm au-dessus de la couche de cellules
irradiées; le débit de fluence est mesuré au niveau des cellules, à travers une boîte de culture
contenant 6 ml de milieu complet, à l'aide de la sonde thermopile décrite au § 2.3.1.4.1.2 .
2.3.1.4.2.1 Spectre de la lampe UVA
Le spectre de la lampe fourni par le fabriquant est présenté en Figure 2.3-2. Nous avons
confirmé ce spectre en cours de travail par un relevé sur un spectrographe Oriel couplé à une
barrette de diodes Instaspec. La calibration de longueur d'onde a été réalisée grâce à une
lampe au xénon, un filtre interférentiel HBW 10 nm et un monochromateur Oriel.
Ce spectrographe nous a permis de contrôler la longueur d'onde des bandes d'émission;
sans calibration au niveau intensité, il n'a cependant pu nous fournir un spectre correct des
intensités relatives des différentes longueurs d'onde.
La lampe Cleo offre un spectre continu de 300 à 425 nm, avec un maximum à environ
354 nm; elle exhibe en fait les raies du mercure à environ 365, 406, 436, 546, 580 et 630 nm.
Elle présente un rapport d'émission UVB/UVA de 1.2 % (données du fabriquant).
2.3.1.4.2.2 Débit de fluence
Comme il est fortement recommandé de s'assurer de l'uniformité de la radiation par
rapport au champ exposé (James, 1991), nous avons réalisé une mire (7 x 5 carrés de 4 cm de
côté) afin de caractériser l'hétérogénéité spatiale et temporelle du débit de fluence. Cette mire
a été centrée sous la lampe et les mesures ont été réalisées dans les mêmes conditions que
pour les cellules (sonde thermopile centrée dans le carré de mesure, à 23.4 cm de la lampe, à
travers une boîte de culture contenant 6 ml de milieu complet). La Figure 2.3-3 présente les
résultats obtenus à 3 reprises au cours de ce travail (mesures espacées d'environ 6 mois). La
108
forme des boîtes de culture est matérialisée dans une configuration d'irradiation typique de
celles que nous avons réalisées.
Figure 2.3-2 : Spectre d'émission des tubes Cleo
(Philips, 2000)
Figure 2.3-3 : Distribution spatiale du débit de fluence sous la lampe UVA (mW/cm²)
(3 mesures espacées de 6 mois)
Coordonnées 1 2 3 4 5 6 7
A
0.194 0.158 0.203
0.263 0.233 0.275
0.294 0.280 0.312
0.306 0.305 0.324
0.285 0.289 0.304
0.243 0.239 0.253
0.170 0.167 0.186
B
0.234 0.184 0.232
0.300 0.264 0.308
0.348 0.315 0.358
0.351 0.337 0.370
0.326 0.321 0.345
0.286 0.271 0.289
0.200 0.194 0.212
C
0.243 0.190 0.243
0.313 0.264 0.312
0.362 0.324 0.364
0.372 0.345 0.378
0.344 0.329 0.351
0.288 0.277 0.292
0.215 0.199 0.218
D
0.222 0.167 0.223
0.298 0.233 0.281
0.342 0.283 0.332
0.352 0.298 0.346
0.325 0.282 0.321
0.275 0.242 0.268
0.198 0.173 0.196
E 0.186 0.122 0.180
0.247 0.179 0.229
0.283 0.215 0.266
0.289 0.231 0.279
0.273 0.219 0.263
0.224 0.185 0.219
0.169 0.134 0.160
Tube 1
Tube 2
Tube 3
Tube 4
109
Comme le montre cette figure, la fluctuation spatiale est supérieure à la fluctuation
temporelle; cette dernière est probablement due à des difficultés à repositionner la lampe
exactement au même endroit et à la même hauteur. En moyennant la surface des boîtes par
carré avec le débit de fluence auquel ce carré est exposé, nous pouvons estimer un débit de
fluence moyen à environ 0.31 mW/cm². La dispersion spatiale observée est inévitable et
comparable à des dispersions publiées (James, 1991).
2.3.1.4.3 Source Visible
La lampe visible, construite au laboratoire, est constituée de 3 lampes à filament de
tungstène Spotone R95 de 75W (Philips, Hollande), montées en forme de trèfle sur un support
(les 3 spots sont arrangés en cercle et se touchent aux extrémités). La lampe est placée à
50.6 cm au-dessus de la couche de cellules irradiées; le débit de fluence est mesuré au niveau
des cellules, à travers une boîte de culture contenant 6 ml de milieu complet, à l'aide de la
sonde thermopile décrite au § 2.3.1.4.1.2 .
2.3.1.4.3.1 Spectre de la lampe visible
Le spectre de la lampe fourni par le fabriquant est présenté en Figure 2.3-4. Nous avons
confirmé ce spectre en cours de travail comme décrit au § 2.3.1.4.2 .
Cette lampe offre un spectre continu commençant à 370 nm et se continuant au-delà de
850 nm; l'émission est très faible en-dessous de 400 nm et maximale à environ 725 nm.
2.3.1.4.3.2 Débit de fluence de la lampe visible
La distribution de débit de fluence a également été mesurée pour la lampe visible en
procédant comme décrit au § 2.3.1.4.2 . La Figure 2.3-5 présente les résultats obtenus à 2
reprises au cours de ce travail (mesures espacées d'environ 6 mois); la forme des boîtes de
culture est matérialisée dans une configuration d'irradiation typique de celles que nous avons
réalisées.
Nous pouvons tirer les mêmes conclusions que pour la lampe UVA. En moyennant la
surface des boîtes par carré avec le débit de fluence auquel ce carré est exposé, nous pouvons
estimer un débit de fluence moyen à environ 11.9 mW/cm².
110
Figure 2.3-4 : Spectre d'émission typique d'une lampe incandescente de type similaire au Spotone
(Philips Lighting, 1992)
Figure 2.3-5 : Distribution spatiale du débit de fluence sous la lampe visible (mW/cm²)
(2 mesures espacées de 6 mois)
Coordonnées 1 2 3 4 5 6 7
A
7.82 7.70
10.01 9.54
11.74 11.54
12.06 11.69
10.10 9.76
7.88 7.78
6.10 6.05
B
8.58 8.53
11.97 11.52
13.72 13.53
13.51 13.35
11.75 11.60
9.84 9.59
7.51 7.28
C
7.45 7.22
10.85 10.30
13.52 13.34
14.22 13.93
12.76 12.65
10.47 10.22
7.98 7.73
D
6.12 6.35
9.65 9.67
13.25 13.12
13.86 13.66
12.10 11.79
9.85 9.34
7.09 6.96
E 5.36 5.68
8.77 8.71
11.01 11.04
11.07 10.46
9.25 8.78
7.12 7.01
4.82 5.04
111
2.3.1.4.4 Transmission optique du polyéthylène, du milieu de culture et du filtre utilisé
Sont présentés ci-dessous (Figure 2.3-6) les spectres de transmission du polyéthylène des
boîtes ainsi que du milieu de culture de la lignée P388D1 (milieu prélevé 24 h après mise en
culture de 5 x 106 cellules/6 ml; trajet optique, 1 cm).
Certains essais ont été réalisés en posant sur les boîtes un filtre Hoya UV-34 (Newport
Industrial Glass, USA) de 3 mm d'épaisseur, de manière à éliminer toute trace d'UVB dans le
spectre émis par la source UVA (Figure 2.3-7)
Figure 2.3-6 : Spectres de transmission du polyéthylène des boîtes de culture et du milieu
112
Figure 2.3-7 : Spectre de transmission du filtre Hoya UV-34
(Newport Industrial Glass, 1994)
2.3.2 Méthode d'induction des porphyrines
Les cellules P388D1 ou HBL nécessaires à l'expérimentation sont prélevées, dénombrées
et centrifugées comme décrit au § 2.1.3.2.2 . Le culot cellulaire est remis en suspension dans
un volume de milieu complet de manière à obtenir une densité (i) de 0.83 x 106 cellules/ml
(lignée P388D1); ou (ii) de 0.125 x 106 cellules/ml (lignée HBL). Pour la plupart des
expériences, 6 ml de cette suspension sont transférés dans une boîte de culture de 25 cm².
Pour certaines expériences sur les cellules HBL, 15 ml sont transférés dans une boîte de
culture de 75 cm². Après un repos de 22 à 26 h dans l'incubateur, les boîtes sont additionnées
de 100 µl (boîtes de 25 cm²) ou de 300 µl (boîtes de 75 cm²) d'une solution aqueuse
extemporanée d'acide δ-aminolévulinique (δ-ala) et replacées dans l'incubateur pour le temps
de chargement requis.
2.3.3 Dosage fluorimétrique des porphyrines intra- et extra-cellulaires
L'extraction des porphyrines par un mélange HClO4 1 M : méthanol (1 : 1) (Quintanilla-
Vega et al., 1995) monomérise les agrégats de porphyrines, ce qui permet une mesure fiable
en fluorescence (Gomer et al., 1985). Comme nous sommes intéressés par une mesure relative
(vérification de l'induction de porphyrines et cinétique d'évolution des porphyrines totales) et
non pas absolue, les résultats sont simplement exprimés en unités de fluorescence par mg de
protéines.
113
2.3.3.1 Lignée P388D1
Les cellules, chargées en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 , sont immédiatement centrifugées
(900 g, 2 min). Le culot, lavé 2 fois par 1/2 volume de PBS33, et le milieu de culture sont
congelés à -20°C jusqu'à extraction (maximum 2 semaines). Après décongélation (10 à
15 min à t° ambiante), le culot cellulaire est additionné de 1 ml du mélange d'extraction, agité
(vortex) et centrifugé (1800 g, 2 min); 1 ml de milieu de culture est traité de la même manière.
Les surnageants sont transférés dans le fluorimètre pour mesures et relevés de spectres.
Dans le but de relever les spectres de fluorescence à pH physiologique, quelques culots
décongelés sont repris dans 1 ml de PBS et soniqués (2000 W, 30 s); les milieux de culture
correspondants sont dilués 1/2 dans le PBS.
2.3.3.2 Lignée HBL
Après chargement des cellules en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 (boîtes de 75 cm²), le
milieu de culture est soutiré et congelé. Le tapis de cellules est rincé par 2 x 5 ml de PBS,
additionné de 800 µl de mélange d'extraction, soigneusement raclé à l'aide d'un grattoir stérile
et récupéré dans un microtube de 2 ml. Cette opération est renouvelée et les 2 solutions sont
combinées et centrifugées (1800 g, 2 min); les surnageants sont conservés à -20°C pendant 2
semaines.
Après décongélation, 1 ml du milieu de culture est additionné de 1 ml du mélange
d'extraction, agité (vortex) et centrifugé (1800 g, 2 min). Le surnageant ainsi que l'extrait
cellulaire sont transférés dans le fluorimètre pour mesures et relevés de spectres.
2.3.4 Dosage des protéines
Le dosage des protéines a été réalisé suivant la méthode photométrique de Lowry (Lowry
et al., 1951) telle que modifiée par Peterson (Peterson, 1977).
2.3.4.1 Préparation des solutions étalons et des réactifs
Les solutions étalons sont préparées par dilution d'une solution stock d'albumine bovine
Fraction V (10 mg/ml), de manière à réaliser un étalonnage dans la gamme de 0 à 200 µg/ml.
La solution de lyse est une solution de dodécylsulfate de sodium (0.2 %) dans du NaOH
0.2 M. Le réactif CTC est une solution de Na2CO3 (10 % m/v), de CuSO4.5H20 (0.1 % m/v) et
de tartrate sodico-potassique (0.2 % m/v). Le réactif A est un mélange équivolumes de réactif
33 Mise en suspension dans 1/2 volume de PBS et centrifugation (900 g, 2 min)
114
CTC, de dodécylsulfate de sodium (10 %), de NaOH (0.8 M) et d'eau. Le réactif B est le
réactif de Folin, dilué 1/6 dans l'eau.
2.3.4.2 Dosage
Le culot résiduel d'extraction des porphyrines (§ 2.3.3 ) est additionné de 0.5 ml de
solution de lyse, incubé à 60°C pendant une heure et additionné de 0.5 ml d'eau (Quintanilla-
Vega et al., 1995). Vingt cinq et 50 µl de cette solution sont alors dilués à 1ml avec de l'eau.
Un ml de cet extrait cellulaire ou de solution étalon est additionné de 1 ml de réactif A,
incubé 10 min à t° ambiante, additionné de 0.5 ml de réactif B et immédiatement mélangé
(vortex). Après 30 min d'incubation, l'absorbance est mesurée à 750 nm contre un blanc
réactif préparé dans les mêmes conditions en remplaçant la solution de protéines par de l'eau.
2.3.5 Examen en microscopie de fluorescence
2.3.5.1 Lignée P388D1
Les cellules, chargées en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 , sont étalées sur une lame de
microscope, couvertes d'une lamelle et examinées en immersion; afin de ralentir le bleaching
de la fluorescence, un filtre de densité neutre (Zeiss, 0.25) est incorporé sur le trajet optique
d'excitation.
2.3.5.2 Lignée HBL
Les cellules sont ensemencées sur une lame de microscope dans une boîte de Pétri,
laissées 24 h dans l'incubateur et chargées en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 . La lame est
soigneusement extraite de la boîte de Pétri, couverte d'une lamelle et examinée en immersion.
L'étalement important des cellules, et donc leur épaisseur très mince, se traduit par un
bleaching rapide, nécessitant un filtre de densité neutre plus important (Zeiss, 0.06). Ce filtre
ne laisse cependant pas passer suffisamment de lumière pour un examen direct de la
fluorescence et l'acquisition d'image nécessite des temps de pose de plusieurs secondes. Afin
de permettre la visualisation des contours cellulaires, l'image obtenue sera donc combinée
avec une image de microscopie visible et ce, à l'aide du logiciel Kromascan (Kinetic Imaging,
Royaume-Uni).
2.3.6 Irradiation UVA et visible
2.3.6.1 Pour les mesures de 8-oxodG (lignée P388D1)
Les cellules une fois chargées en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 , les boîtes de culture de
25 cm² sont fermées hermétiquement, transférées dans un bain-marie à 4°C dans la chambre
115
froide et exposées aux sources lumineuses décrites au § 2.3.1.4 pendant le temps requis. Les
cellules sont alors immédiatement traitées comme décrit au § 2.2.3.1 .
2.3.6.2 Pour le test "comète"
2.3.6.2.1 Lignée P388D1
Les cellules une fois chargées en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 , les boîtes de culture de
25 cm² sont fermées hermétiquement, transférées dans un bain-marie à 4°C et exposées aux
sources lumineuses décrites au § 2.3.1.4 pendant le temps requis. Les cellules sont alors
transférées dans un tube Falcon de 15 ml, lavées par 3 ml de PBS34 et remises en suspension35
dans 5 ml de PBS dont 15 µl (~ 3 x 104 cellules) sont coulés dans 300 µl de gel d'agarose à
point de fusion bas comme décrit dans le § 2.4.2.1 .
2.3.6.2.2 Lignée HBL
Les cellules une fois chargées en δ-ala comme décrit au § 2.3.2 , les boîtes de culture de
25 cm² sont fermées hermétiquement, transférées dans un bain-marie à 4°C et exposées aux
sources lumineuses décrites au § 2.3.1.4 pendant le temps requis. Les cellules sont alors
rincées à 2 reprises par 1 ml de la solution de trypsinisation, additionnées de 0.5 ml de la
même solution, laissées en contact à température ambiante jusqu'à décrochage (2 à 6 min) et
additionnées de 3 ml de PBS contenant 10 % de sérum fœtal de bœuf . Les cellules sont
ensuite transvasées dans un tube Falcon de 15 ml, lavées par 3 ml de PBS36 et remises en
suspension21 dans 1 ml de PBS dont 15 µl (~ 3 x 104 cellules) sont coulés dans 300 µl de gel
d'agarose à point de fusion bas comme décrit dans le § 2.4.2.1 .
Ce procédé de décrochage, validé en collaboration avec Mrs. G. Dehon et E. Kinnaert,
n'induit pas de cassures de chaînes (Thèses en cours de réalisation).
2.4 L'ESSAI "COMETE" (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS)
2.4.1 Réactifs et matériel
2.4.1.1 Réactifs
Les agaroses à point de fusion bas et normal (electrophoresis grade) ainsi que la solution
de bromure d'éthidium à 10 mg/ml sont obtenus chez Gibco Life Technologies (Ecosse); le
NaOH (p.a.), le KCl (p.a.) et le Triton X-100 (pour GC) proviennent de chez Merck,
34 Mise en suspension dans le PBS et centrifugation (900 g, 2 min) 35 Cette remise en suspension nécessite quelques opérations d'aspiration/dispensation à l'aide d'une pipette automatique; il est indispensable de procéder en douceur pour éviter toute fragmentation d'ADN 36 Mise en suspension dans le PBS et centrifugation (450 g, 2 min)
116
Allemagne, les lames de microscope (26 x 76 mm) et les couvre-lames (24 x 50 mm) de chez
Vel (Belgique). Les enzymes Endonucléase III (Endo III) et Formamidopyrimidine
glycosylase (FPG) ont été obtenues auprès du Dr Andrew Collins (Rowett Research Institute,
Aberdeen, Ecosse) et l'enzyme T4 endonucléase V auprès du Dr Karel Angelis (Institut de
Botanique Expérimentale de l'Académie Tchèque des Sciences, Praha, République Tchèque).
Ces enzymes, fournies sous forme d'extraits protéiques partiellement purifiés afin d'éliminer
les activités nucléasiques non spécifiques (Angelis et al., 1999), ont été employées aux
dilutions recommandées par leurs producteurs. Les autres réactifs ont été décrits
précédemment (§ 2.2.2.1 ).
2.4.1.2 Préparation des solutions et des lames de microscope
• Le tampon de lyse est une solution 2.5 M en NaCl, 10 mM en Tris et 100 mM en
EDTA, pH 10.0.
• La solution de lyse est un mélange Tampon de lyse : DMSO : Triton X-100 (89 : 10 :
1, v/v); elle est préparée journellement et équilibrée à 4°C avant emploi.
• La solution de dénaturation alcaline est une solution environ 0.3 M en NaOH (19.2 g
pour 1.6 litres) et 1 mM en EDTA; la quantité nécessaire à une électrophorèse est
préparée extemporanément.
• Le tampon de neutralisation est une solution 0.4 M en Tris, pH 7.5.
• Une solution d'agarose à point de fusion bas à 0.8 % dans le PBS est dispensée en
fractions de 300 µl dans des microtubes de 1.9 ml. Quelques heures avant emploi, les
gels sont liquéfiés par chauffage à 60°C et équilibré à 37°C.
• La solution de digestion enzymatique est une solution 0.1 M en KCl, 0.5 mM en
EDTA et 40 mM en HEPES contenant 0.2 mg/ml d'albumine.
• Les solutions d'enzymes Endo III et T4 endonucléase V telles que reçues sont
dégelées, dispensées en fractions de 2 µl et stockée à –80°C. Les solutions d'emploi
sont préparées par addition à une de ces parties aliquotes de 2 ml de solution de
digestion enzymatique; si nécessaire, elles peuvent être dispensées en fractions de
320 µl et stockées à –80°C.
• La solution d'enzyme FPG telle que reçue est dégelée, dispensée en fractions de 2 µl et
stockée à –80°C. La solution intermédiaire est préparée par addition à une de ces
parties aliquotes de 198 µl de solution de digestion enzymatique contenant 10 % de
glycérol; elle est alors dispensée en fractions de 10 µl et stockée à –80°C. La solution
117
d'emploi est préparée par addition à une de ces parties aliquotes de 300 µl de solution
de digestion enzymatique.
• La solution d'emploi de bromure d'éthidium (20 µg/ml) est préparée par dilution de la
solution stock.
• Les lames de microscope sont pré-traitées (couche d'accrochage) par immersion rapide
dans une solution 1 % d'agarose à point de fusion normal (maintenue à environ 70°C)
et séchées à température ambiante pendant une nuit.
2.4.1.3 Matériel
La cuve d'électrophorèse est une Horizon 20-25 (Gibco Life Technologies, Ecosse),
maintenue à environ 18°C par un bain d'eau. Le générateur de tension est un Power Pac 200
de Bio-Rad (Etats-Unis).
Le système de microscopie et d'analyse d'images a été décrit au § 2.3.1.3 . Pour le
bromure d'éthidium, les longueurs d'onde d'excitation, du miroir dichroïque et d'émission sont
respectivement (nm) 540 ± 12.5, 565 et 605 ± 27.5. L'acquisition et l'analyse d'images sont
réalisées à l'aide du logiciel dédié Komet 4.0 (Kinetic Imaging, Royaume-Uni).
2.4.2 Mode opératoire
2.4.2.1 Préparation des lames
L'ensemble des opérations s'effectue sous lumière inactinique; un maximum de 24 lames
peut être traité par électrophorèse.
Un mélange de 300 µl de la solution d'agarose à point de fusion bas et de 15 µl d'une
suspension de cellules individualisées (environ 3 x 104 cellules, cf § 2.3.6.2 ) est
immédiatement coulé sur une lame de microscope, superposé d'un couvre-lame et déposé sur
une plaque de métal maintenue sur glace fondante. Après solidification du gel, le couvre-lame
délicatement enlevé, la lame est immergée dans la solution de lyse et maintenue à 4°C
pendant au minimum 1 h, au maximum 4 semaines.
Les lames sont retirées de la solution de lyse, rincées rapidement à 2 reprises par la
solution de dénaturation, soigneusement disposées côte à côte dans le bac d'électrophorèse et
immergées dans la solution de dénaturation. Après 40 min, une tension de 25 V (soit
0.7 V/cm, le courant étant rapidement ajusté à 300 mA par ajout ou retrait de solution) est
appliquée pendant 20 min.
Les lames sont enlevées de la cuve, essuyées au verso, rincées par le tampon de
neutralisation (3 x 5 min), essuyées au verso, immergées pendant 10 min dans de l'éthanol
118
absolu refroidi à –20°C et séchées à température ambiante pendant une nuit. Elles peuvent
alors être stockées plusieurs mois à l'abri de la poussière et de l'humidité.
Pour la mesure en microscopie de fluorescence, les lames sont réhydratées par 200 µl
d'eau (10 min sous couvre-lame), additionnées de 10 µl de solution de bromure d'éthidium
(10 min sous couvre-lame), rincées à 5 reprises à l'eau, essuyées au verso, additionnées de
100 µl d'eau, couvertes d'un couvre-lame et placées à 4°C jusqu'à lecture.
2.4.2.2 Traitement par les endonucléases de réparation
Après retrait de la solution de lyse (cf § précédent), les lames sont essuyées au verso,
rincées par la solution de digestion enzymatique (3 x 5 min), essuyées au verso, additionnées
de 50 µl de la solution d'endonucléase d'emploi, couvertes d'un couvre-lame et incubées sur
un bain-marie maintenu à 37°C. Le couvre-lame est enlevé délicatement, les lames sont
rincées rapidement à 2 reprises par la solution de dénaturation et disposées dans le bac
d'électrophorèse comme décrit au § précédent.
2.4.2.3 Organisation pratique du travail
Chaque point expérimental consiste en 2 lames de microscope sur chacune desquelles 50
comètes sont mesurées. Afin de minimiser les variations expérimentales (voir Section 5.3.1),
les lames sont réparties aléatoirement sur l'ensemble des électrophorèses nécessitées par
l'expérience et mesurées en aveugle dans un ordre également aléatoire.
2.4.3 Mesure des comètes
2.4.3.1 Paramètres géométriques37
Les pionniers de l'essai comète mesuraient simplement le rapport Fx / F0, dans lequel Fx
représente l'intensité de la fluorescence à x µm du centre de la comète et F0 la fluorescence au
centre de la tête, x étant choisi pour optimiser le rapport Fx / F0 de contrôles positifs (Ostling
et Johanson, 1984). Le tail length (longueur de queue) qui apparaît proportionnel à l'intensité
des stress appliqués (Singh et al., 1988) est un paramètre "visuel", mesurable sans
instrumentation particulière et qui a été fort employé. Il est cependant relativement imprécis à
estimer et, de plus, à partir d'une certaine dose, il "sature" et la taille de la queue reste
constante. Le rapport diamètre de tête / longueur de queue a également été proposé (Olive,
1989). L'introduction d'analyse d'images a permis de proposer la notion de tail moment
(moment de queue), initialement défini comme le produit du tail DNA (proportion d'ADN
37 Certains paramètres mesurés dans l'essai comète apparaissant ambigus en fonction des auteurs, nous avons conservé la terminologie anglaise.
119
dans la queue) par le tail length (Olive et al., 1990); il est à présent connu sous le nom de
extent tail moment. Ce paramètre présente l'avantage de tenir compte à la fois du plus petit
fragment ayant migré (distance de migration, mesurée par le tail length) mais aussi des
fragments simplement étirés (ADN présent dans toute la queue, ou tail DNA). En raison de la
difficulté à apprécier le tail length, une définition du moment plus proche de la définition
mécanique a ensuite été proposée; il s'agit du Olive tail moment, le produit du tail DNA et de
la distance séparant les centres de masse de la tête et de la queue (Hellman et al., 1995).
Figure 2.4-1 : Exemples de comètes (essai comète en milieu fortement alcalin)
Cellules P388D1 non stressées Cellules P388D1 stressées (Ethylméthylsulfonate, 2 mM, 6 h)
CA
TH
OD
E
T Q
T Q
AN
OD
E
T : Centre de masse de la tête Q : Centre de masse de la queue
Divers paramètres géométriques ont également été proposés, comprenant le comet length
(Kent et al., 1995), le leading edge moment (Bocker et al., 1997), le tail inertia qui tient
également compte de la forme de la comète (Hellman et al., 1995) et le comet moment qui
envisage la comète dans sa globalité (Kent et al., 1995).
La plupart des études se basent en fait sur le tail DNA ou sur une variante du tail moment,
la définition de ce dernier pouvant varier suivant l'auteur.
120
2.4.3.2 Mesure par le logiciel Komet
Le logiciel est basé sur l'analyse du profil d'intensité intégrée. A l'exception de la surface
de la comète qui est mesurée directement à partir des données de l'image, tous les paramètres
estimés sont basés sur les intensités de fluorescence intégrées dans la direction verticale
(perpendiculaire à la direction d'électrophorèse) (Figure 2.4-2).
Figure 2.4-2 : Profils d'intensité calculés par le logiciel Komet
Le profil "cell" est mesuré dans la ROI (region of interest), un rectangle qui encadre la
comète; le profil est délimité à gauche comme à droite à partir de seuils fixés par l'utilisateur.
Du profil "cell", est soustrait le profil "background", mesuré dans un petit rectangle parallèle
à la ROI et encadrant une zone vierge. A partir du point d'intensité maximale du profil comet
obtenu, le profil gauche de la tête (head) est dessiné vers la gauche; le profil droit de la tête
est simplement la symétrie du profil gauche. Le profil de la queue (tail) est calculé par simple
soustraction de ce profil head à partir du profil comet.
Le logiciel calcule alors 35 paramètres répartis en 2 groupes : (i) les mesures
géométriques et densitométriques pures sur tous les profils; et (ii) les paramètres dérivés qui
sont communément employés pour l'interprétation des données.
Ces 35 paramètres sont mesurés pour 2 x 50 comètes dans chaque expérience, ce qui noie
vite l'expérimentateur dans un flot de chiffres. L'utilité pratique de tous les paramètres
121
mesurés est loin d'être avérée et nous avons tenu compte dans l'ensemble de nos travaux des 2
paramètres dérivés les plus communément employés, le tail DNA et le Olive tail moment.
2.4.3.3 Options appliquées au logiciel Komet
La caméra est pilotée en mode 12 bits; les temps de pose varient de 20 à 100 ms suivant
l'intensité de la coloration (réglage standardisé pour tous les opérateurs). Les paramètres sont
réglés comme suit; seuls les head threshold et tail threshold sont régulièrement ajustés en
fonction de l'image à mesurer :
• Head threshold : entre 1 et 5
• Smoothing value : 1
• Tail break length : 10
• Tail threshold : 5 à 20
• Background height : 20
• Saturation limit : 10
• Saturation : 4095
• Fluorescence : on
• Autobackground : on
• Stop on saturation : on
• Head symmetry : on
• Tail from centre of cell : off
2.5 METHODES STATISTIQUES
Les méthodes statistiques sont décrites dans les sections 3 à 6, juste avant les résultats
qu'elles concernent. Les calculs ont été effectués à l'aide du tableur Excel de Microsoft en
programmant les fonctions requises à partir des fonctions statistiques du module de base.
Certains tests ont été réalisés à l'aide des logiciels spécialisés Analyse-it et Systat, ce qui
est chaque fois clairement indiqué dans le texte.
Pour l'ensemble des tests, le niveau de signification retenu correspond au seuil 0.05.
122
3. Résultats et Discussion :
Développement et validation du dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-
2'-désoxyguanosine dans l'ADN cellulaire
123
3.1 INTRODUCTION : LES METHODES DE DOSAGE DE LA 8-OXO-7,8-DIHYDRO-2'-DESOXYGUANOSINE (8-oxodG)
Depuis l'introduction du dosage de la 8-oxodG par CLHP couplée à une détection
électrochimique (CLHP-EC) (Floyd et al., 1984), ce composé est devenu un biomarqueur de
choix et a fait l'objet de nombreuses études analytiques. Pratiquement toutes les méthodes ont
été appliquées, incluant la LC-MS (Dizdaroglu et al., 2001), la LC/MS/MS (Ravanat et al.,
1998a), la GC-MS (Dizdaroglu, 1994), l'électrophorèse capillaire (Guarnieri et al., 1994; Poon
et al., 1995), les techniques immunologiques (Degan et al., 1991; Musarrat et Wani, 1994;
Yarborough et al., 1996; Sato et al., 1998), l'immuno-cytologie (Nehls et al., 1997), le post-
marquage en fluorescence (Sharma et al., 1990) et en 32P (Cadet et al., 1992). Les résultats
sont rapportés en nmoles 8-oxodG par mg d'ADN ou, plus souvent, en 8-oxodG par 105 dG.
L'élution alcaline (Pflaum et al., 1997), le déroulement alcalin (akaline unwinding)
(Czene et Harms Ringdahl, 1995), l'électrophorèse (Muller et al., 1998) et l'essai comète
(Evans et al., 1995; Collins et al., 1997c) ont été également appliqués pour mesurer les
fragmentations d'ADN après traitement par la FPG, une glycosylase qui enlève presque
spécifiquement la 8-oxodG pour former un site AP hydrolysé en milieu alcalin. Ces méthodes
plus douces détectent des taux de 8-oxodG sensiblement inférieurs à ceux mis en évidence par
les autres techniques; mais les essais de comparaison CLHP-EC / comète-FPG ne montrent en
fait aucune corrélation (Gedik et al., 1998). D'une part, il se peut que les étapes d'extraction
et/ou de digestion de l'ADN soient sujettes à des artefacts oxydatifs, générant la 8-oxodG via
une réaction de type Fenton. D'autre part, il est possible que les méthodes FPG sous-estiment
les taux de 8-oxodG; en effet, cette enzyme ne révèle les lésions groupées que comme une
seule fragmentation et il se peut que des lésions lui soient inaccessibles en fonction du
contexte de séquence (ESCODD, 2001).
En fait, à l'heure actuelle, le débat reste largement ouvert quant aux taux de base de la
8-oxodG dans l'ADN cellulaire (ESCODD, 2001).
Il est en tout cas acquis que les résultats GC-MS publiés pendant plusieurs années sont
entachés d'un facteur d'erreur de 100 à 10000 (Cadet et al., 1998; Dizdaroglu, 1998). Ceci
était dû à l'étape de silylation à haute température; une dérivation à température ambiante
(England et al., 1998) et en présence d'un réducteur (Jenner et al., 1998) ou de pyridine
(Rodriguez et al., 2000) élimine totalement cet artefact. Nos essais préliminaires en GC-MS
ont cependant montré que la technique restait fort capricieuse et générait des artefacts
oxydatifs qui nous semblent toujours difficiles à contrôler.
124
3.2 DEVELOPPEMENT DU DOSAGE DE LA 8-oxodG DANS L'ADN CELLULAIRE PAR CLHP COUPLEE A UNE DETECTION ELECTROCHIMIQUE
Lorsque nous avons commencé ce travail, de nombreuses publications avaient abordé le
problème du dosage de la 8-oxodG, présentant des solutions contradictoires et des jugements
parfois péremptoires reposant sur peu de preuves analytiques. Le cas de la GC-MS évoqué ci-
dessus est un exemple extrême de la confusion qui pouvait régner dans la littérature.
Le développement de la méthode et la justification de nos choix analytiques ne pouvant
être présentés qu'à travers une discussion des données existantes, nous avons choisi de
rassembler ici les résultats et leur discussion.
3.2.1 Choix des conditions chromatographiques
3.2.1.1 Séparation
La plupart des méthodes publiées séparent les nucléosides sur une colonne octadécyle
composée de particules de 5 à 10 µm (Frenkel et Klein, 1993; Helbock et al., 1998). La
séparation des nucléotides, beaucoup plus polaires, requiert un contre-ion de type
tétrabutylammonium et un gradient de pH peu compatible avec une détection électrochimique
à haute sensibilité (Werner, 1993).
La plupart des méthodes procèdent en conditions isocratiques. Les phases mobiles utilisées
consistent en un tampon aqueux contenant de 5 à 10 % de solvant organique, méthanol ou
acétonitrile; les tampons diffèrent quant à leur composition en sels et leur pH varie de 4 à 6
suivant les auteurs. Après examen des conditions publiées, nous avons retenu la
phase mobile la plus simple (Bonatti et al., 1994), constituée d'un mélange de 90 % de tampon
aqueux (NaH2PO4.2H2O 0.05 M, pH 5.5) et de 10 % de méthanol. Nous avons cependant
ajouté 1 mM d'EDTANa2H2 au tampon aqueux. Cet agent complexant est en effet
recommandé pour la détection électrochimique car il permet de minimiser les fluctuations de
ligne de base et de réduire le pic d'injection, phénomènes attribués au relargage de traces
d'ions métalliques par l'appareillage (Verbiese-Genard, 1984).
Nous avons utilisé cette phase mobile pour tester différentes colonnes C18 utilisées dans
le laboratoire et ce, sous détection UV, afin de pouvoir établir les paramètres
chromatographiques avant toute tentative de branchement du détecteur électrochimique. Nous
avons donc oxydé un étalon de dG (§ 2.2.2.4) pour générer suffisamment de 8-oxodG pour
125
Figure 3.2-1 : Comparaison de 3 colonnes C18 pour la séparation dG – 8-oxodG38
dés
oxyg
uano
sine
dG dG dG dG
8-oxodG
8-oxodG 8-oxodG
dés
oxyg
uano
sine
oxy
dée
dés
oxyg
uano
sine
oxy
dée
dés
oxyg
uano
sine
oxy
dée
(A) Waters µBondapak C18 (B) Chrompack C18
(C) Beckmann Ultrasphere ODS
10 µm; 30 cm x 3.9 mm i.d. 5 µm; 20 cm x 3 mm i.d. 5 µm; 25 cm x 4.6 mm i.d. (1 ml/min) (0.6 ml/min) (1 ml/min)
Phase mobile : 95 % de tampon aqueux (0.05 M en NaH2PO4.2H2O et 1 mM en EDTANa2H2) et 5 % de
méthanol; détection UV, 260 nm, 50 mV fond d'échelle; 1 cm = 10 min
126
38 Remarque : la mise au point a été étalée sur plusieurs semaines; les quantités injectées et les rapports 8-oxodG/dG diffèrent entre le tracé (A) et les tracés (B) et (C).
une détection UV. La Figure 3.2-1-A montre que cette oxydation induit effectivement
l'apparition d'un pic après la dG (Kasai et Nishimura, 1984; Frenkel et al., 1991). L'identité de
ce pic sera par la suite confirmée par une injection d'un étalon de 8-oxodG de pureté certifiée
sous détection électrochimique. Sur la colonne µBondapak, les 2 pics, symétriques et
parfaitement résolus, apparaissent cependant fort près du pic d'injection; nous n'avons pu les
reculer que modestement par diminution de la teneur en méthanol de la phase mobile (Figure
3.2-1-A) jusqu'à 2.5 %. La colonne Chrompack ne sépare pas les 2 pics qui, de plus,
présentent un tailing important (Figure 3.2-1-B). Cette observation confirme en fait d'autres
séparations peu satisfaisantes observées au laboratoire avec ce matériel. La colonne
Beckmann nous a, par contre, apporté toute satisfaction, à savoir des pics symétriques,
parfaitement résolus et présentant un temps de rétention satisfaisant (Figure 3.2-1-C),
modulable par des variations faibles de la teneur en méthanol.
A l'exception de l'adénine, les valeurs de pKa des nucléobases sont hors de la zone de pH
optimale de la silice (pH 2 – 7) et l'influence du pH sur la séparation est donc minimale
(Werner, 1993). Nous avons rapidement testé la zone de pH 4 à 6 sans observer de
modification importante dans les temps de rétention et la séquence d'élution des nucléosides
ainsi que dans la réponse électrochimique de la 8-oxodG39; nous avons donc éliminé l'étape
d'ajustement de pH du tampon et travaillons au pH du mélange NaH2PO4 - EDTANa2H2
(pH ~ 4.5).
L'injection d'extraits biologiques d'acides nucléiques a confirmé que la colonne Beckmann
Ultrasphere ODS, associée à une phase mobile constituée de 92.5 % de tampon aqueux
(0.05 M en NaH2PO4.2H2O et 1 mM en EDTANa2H2) et 7.5 % de méthanol, convenait
parfaitement à la résolution de la dG et de la 8-oxodG dans ces mélanges complexes. Les
temps de rétention montrant une forte dépendance de la température, nous avons choisi de
thermostatiser la colonne légèrement au-dessus de la température ambiante, à 30°C.
3.2.1.2 Détection
3.2.1.2.1 Choix du potentiel de travail
La plupart des méthodes emploient soit une détection ampérométrique sur carbone
vitreux, soit une détection coulométrique. En fonction du matériel et de notre expérience,
nous nous sommes orienté vers la première option. Nous avons choisi le potentiel de
39 Les études de voltamétrie en fonction du pH sur électrode de carbone vitreux montrent que le courant d'oxydation généré par la 8-oxodG disparaît à pH < 2 et augmente fortement pour les pH supérieurs à 10; une forte adsorption s'observe à partir de pH 9 (Oliveira Brett et al., 2000).
127
travail, 700 mV, à partir du voltamogramme hydrodynamique établi dans nos conditions
chromatographiques, et ce à 2 concentrations (Figure 3.2-2).
Figure 3.2-2 : Voltamogrammes hydrodynamiques établis pour la 8-oxodG
(A) 2 pmoles 8-oxodG
0.0 E+0
5.0 E+4
1.0 E+5
1.5 E+5
0 200 400 600 800 1000
Potentiel (mV)
C
oura
nt (u
nité
s ar
bitra
ires
)
(B) 45 pmoles 8-oxodG
0 E+0
1 E+6
2 E+6
0 200 400 600 800 1000
Potentiel (mV)
C
oura
nt (u
nité
s ar
bitra
ires)
n =3; les barres correspondent à l'étendue des valeurs. Colonne Beckmann Ultrasphere ODS 5 µm; 25 cm x 4.6 mm i.d.; phase mobile, 92.5 % de tampon aqueux (0.05 M en NaH2PO4.2H2O et 1 mM en EDTANa2H2) et 7.5 % de méthanol; 1 ml/min; 30°C; cellule BAS TL-5A; potentiels vs Ag/AgCl.
128
3.2.1.2.2 Comportement électrochimique de la 8-oxodG
Les purines substituées s'oxydent aisément sur une électrode de carbone vitreux. Les
groupements polaires influencent fortement le potentiel anodique en fonction de la position de
substitution dans la séquence suivante : C8 >> C2 ~ C6; la formation d'un lien glycosidique en
N9 augmente le potentiel d'oxydation du noyau d'environ 300 mV. Les effets marqués des
substituants permettent par exemple les dosages voltamétriques d'analogues nucléosidiques en
présence de leurs produits de dégradation (Kenley et al., 1985).
La Figure 3.2-3 (Goyal et al., 1997) présente les voltamogrammes de la guanosine (G) et
de la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine (8-oxoG); le pic IA observé pour la guanosine correspond
à l'oxydation de 8-oxoG, ce qui a permis aux auteurs de conclure que l'oxydation de G passe
en fait par la 8-oxoG et que celle-ci, une fois générée à l'électrode, s'oxyde immédiatement
dans une réaction quasi-réversible (Goyal et al., 1997). La coulométrie de G et 8-oxoG
démontre l'implication de respectivement 4 et 2 électrons dans le processus d'oxydation
(Goyal et al., 1997).
Figure 3.2-3 : Voltamogrammes de la guanosine (a) et de la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine (b)
enregistrés sur 2 électrodes (voltammétrie cyclique, pH 5.9, 0.25 mM, 50 mV/sec)
L'analyse des produits
(Figure 3.2-4) : (i) à pH 3
Graphite pyrolytique
finaux d'oxydation de G
, la formation d'un dimère
Carbone vitreux
(Goyal et al., 1997)
et de 8-oxoG (Goyal et al., 1997) montre
et de 2 produits secondaires; (ii) à pH 7,
129
la formation d'un seul produit, la guanidinohydantoïne. Le ribose n'intervenant pas dans le
mécanisme supposé d'oxydation, il nous semble fort probable que la 8-oxodG s'oxyde suivant
le même schéma.
Figure 3.2-4 : Produits d'oxydation de la guanosine et de la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine à
l'électrode de carbone vitreux
H2N
HN
N N
HN
Ribose
8-oxo-7,8-dihydro-guanosine
O
HN
NH2
NH
NH
HNO
H2N
HN
N
2-amino-4,5,6-trioxypyrimidine
O
NH2
NH
NN
N
RiboseDimère (majeur)
O
H2N
HN
N NH
N
O
O
O
O
H2N C NH-Ribose
O
pH 7
pH 3
urée riboside5-guanidinohydantoïne
O
O
H2N
HN
N N
N
RiboseGuanosine
O
1
23
4
56
7
8
9
D'après (Goyal et al., 1997)
3.2.2 Digestion enzymatique
Plusieurs conditions opératoires ont été proposées pour la digestion enzymatique de
l'ADN (Dizdaroglu, 1985; Floyd et al., 1986; Frenkel et al., 1991; Claycamp, 1992; Frenkel et
Klein, 1993; Harris et al., 1994). Elles diffèrent dans (i) la séquence des opérations (digestion
et déphosphorylation séquentielle ou simultanée); (ii) la combinaison d'enzymes de digestion
(DNase I, combinée ou pas avec une dénaturation thermique, suivie par un traitement par la
nucléase P1; dénaturation thermique et nucléase P1) et de déphosphorylation
(phosphodiestérase de serpent; phosphatase alcaline ou acide; combinaison des
phosphodiestérases I et II et de la phosphatase alcaline); (iii) le cofacteur métallique (Zn++ ou
Mg++), la température (37 ou 70°C) et le pH (5.4 ou 7.0) de la digestion par la nucléase P1; et
(iv) l'élimination ou pas des enzymes avant injection dans le chromatographe.
130
En raison des nombreux artefacts oxydatifs décrits, nous avons développé la méthode la
plus douce et la plus simple possible. Cependant, la nucléase P1 étant une nucléase simple-
brins (active à la fois sur l'ADN et sur l'ARN), elle requiert une dénaturation thermique
préalable de l'ADN. D'après la littérature, les 2 nucléosides seraient stables à 100°C pendant
au moins 15 min (Floyd et al., 1990).
3.2.2.1 Méthode retenue : Conditions de digestion et stabilité des bases étudiées
Nous avons opté pour une digestion séquentielle : dénaturation à 100°C pendant 5 min,
digestion en nucléotides monophosphates par 4 unités40 de nucléase P1 à pH 5.4 et 37°C en
présence de Mg++ pendant 1 h, digestion en nucléosides par 2 unités41 de phosphatase alcaline
à pH 8.4 et 37°C pendant 1 h, acidification à pH 4.7 par addition d'acide acétique et injection
dans le chromatographe.
Tableau 3.2-1 : Comparaison de différentes conditions de digestion
% recouvré (n = 6; moyenne ± écart étalon)
Echantillon Conditions de digestion dG
(5 nmoles) p(a) 8-oxo-dG
(11 pmoles) p(a)
pH 5.4 (1 h) 98.7 ± 1.5 0.08 ns 100.6 ± 3.8 0.70 ns
pH 5.4 (2 h) 101.5 ± 2.4 0.12 ns 95.8 ± 3.3 0.009 **
pH 7.0 (1 h) 99.1 ± 1.8 0.27 ns 100.0 ± 2.6 0.97 ns
Solution aqueuse d'étalons
pH 7.0 + DNase I (1 h) 101.8 ± 2.9 0.12 ns 98.2 ± 4.0 0.23 ns
Quantité mesurée (n = 6; moyenne ± écart étalon) Echantillon Conditions de digestion
nmoles dG p(b) 8-oxodG / 105 dG p(c)
pH 5.4 (1 h) 107.6 ± 2.7 13.5 ± 0.6
pH 5.4 (2 h) 106.7 ± 3.2 13.5 ± 0.3
pH 7.0 (1 h) 95.4 ± 11 13.3 ± 0.6
ADN de sperme de saumon (185 µg)
pH 7.0 + DNase I (1 h) 110.1 ± 1.4
0.009 **
13.4 ± 0.5
0.85 ns
(a) probabilité du test comparant la moyenne recouvrée à 100 % (test t de conformité de la moyenne ou one-sample t-test) (b) probabilité du test de Kruskal-Wallis comparant les niveaux mesurés suivant les 4 méthodes de digestion (c) probabilité du test ANOVA comparant les niveaux mesurés suivant les 4 méthodes de digestion
40 Une unité libère 1.0 µmole/min de nucléotides solubles dans l'acide à partir d'ARN à pH 5.3 à 37°C 41 Une unité hydrolyse 1 µmole/min de 4-nitrophényl-phosphate à 37°C
131
Au moment de notre mise au point, peu d'auteurs avaient réellement comparé les
conditions opératoires. Seule Frenkel a rapporté qu'un traitement par la nucléase P1 à pH 5.4
peut être une source de perte de 8-oxodG, évitable à pH 7.0; de plus, l'addition de DNase I
semble susceptible d'améliorer les rendements de digestion (Frenkel et al., 1991). Nous avons
donc comparé la digestion d'étalons aqueux et d'ADN de sperme de saumon à ces 2 pH, en
présence et en l'absence de DNase I (Tableau 3.2-1).
Dans ce tableau, nous remarquons (i) qu'un traitement trop long d'étalons aqueux par la
nucléase P1 à pH 5.4 induit effectivement une perte significative en 8-oxodG; (ii) que la
digestion de l'ADN est légèrement moins efficace et surtout moins reproductible à pH 7.0; la
teneur en 8-oxodG étant exprimée par rapport à la dG, sa mesure n'est cependant pas affectée
par ce phénomène; et (iii) l'ajout de DNase I n'apporte rien.
3.2.2.2 Nucléase P1 : quantité et stabilité
La nucléase P1 est achetée sous forme d'une poudre lyophilisée que nous reconstituons
dans de l'eau et conservons à 4°C. Le lot A, dissous depuis 3 mois au moment de l'expérience,
contient 247 U/mg; le lot B, dissous extemporanément, contient 408 U/mg.
Nous avons digéré des aliquotes de 184 µg d'ADN de sperme de saumon suivant la
méthode retenue en comparant les 2 lots d'enzyme que nous avons testés à différents taux
(Figure 3.2-5).
Figure 3.2-5 : Digestion d'ADN de sperme de saumon (184 µg) par 2 lots de nucléase P1.
0
20
40
60
80
100
120
140
2.47 4.08 2.04 3.05 4.07 5.09 Lot A (247 U/mg) Lot B (408 U/mg)
Unités de Nucléase P1 (2 lots)
dG (n
mol
es)
0
5
10
15
20
8-oxodG par 10
5 dG
dG8-oxodG
Les barres correspondent aux étendues des valeurs (n = 3).
• lot A (247 U/mg; reconstitué depuis 3 mois) • lot B (408 U/mg; reconstitué extemporanément)
132
Il apparaît donc qu'une solution aqueuse de nucléase P1 est stable à 4°C pendant au moins
4 mois, sans perte apparente d'efficacité; pour 184 µg d'ADN, une quantité de 2 U apparaît
suffisante. Nous obtenons pour nos extraits biologiques environ 100 µg d'ADN et entre 100 et
200 µg d'ARN; en ajoutant 4 U de nucléase P1 dans notre mélange de digestion, nous
conservons donc une marge de sécurité.
3.2.2.3 Elimination des protéines enzymatiques
Plusieurs méthodes d'élimination des enzymes ont été proposées, incluant une
précipitation par solvant suivie d'une évaporation à sec (Frenkel et al., 1991; Muniz et al.,
1995; Douki et al., 1997; Ni et al., 1997), une extraction des nucléosides par le chloroforme
(Kohda et al., 1990; Morin et al., 1998), une ultracentrifugation (Verna et al., 1998) ou une
ultrafiltration (Shigenaga et al., 1990; Morin et al., 1998). Toute étape additionnelle pouvant
être une source d'oxydation artefactuelle de la dG, nous avons d'abord testé l'injection du
milieu de digestion non purifié et n'avons en fait rencontré aucune interférence
chromatographique ou électrochimique due à ces enzymes, pour peu que la colonne de garde
soit remplacée tous les 3 à 4 mois.
3.2.2.4 Discussion et conclusion
Une heure de digestion avec 4 unités de nucléase P1 s'est avérée suffisante pour tous les
échantillons testés jusqu'à présent, incluant de l'ADN de sperme de saumon et des extraits de
cellules stressées et non stressées, en présence d'ARN. Aucun pic tardif n'a été détecté dans
nos chromatogrammes UV, ce qui indique un processus de digestion efficace (Frenkel et al.,
1991). Pour certaines conditions de stress (H2O2 + UVC), nous avons cependant observé un
petit massif de pics, détectables uniquement en électrochimie, apparaissant de manière
reproductible à environ 160 min.
Depuis notre travail, il est apparu que (i) la phosphatase acide ne devrait pas être
employée; son site catalytique comporte du fer qui induit la formation de 8-oxodG (Moller et
al., 1998); (ii) la combinaison de 2 enzymes (nucléase P1 et phosphatase alcaline) est aussi
efficace pour l'analyse de la 8-oxodG que la combinaison de 4 enzymes (nucléase P1,
phosphodiestérases I et II et phosphatase alcaline) (Ravanat et al., 1998b; Wood et al., 2000;
Dizdaroglu et al., 2001); et (iii) la cinétique enzymatique de la nucléase P1 peut être modifiée
par la présence de lésions dans l'ADN, mais elle parvient à couper au niveau de la plupart des
modifications connues, à l'exception notable des lésions formamido (Falcone et Box, 1997)
133
3.2.3 Extraction de l'ADN cellulaire
3.2.3.1 Choix des conditions opératoires
Les méthodes d'extraction décrites commencent généralement par une lyse des cellules en
présence de protéinase K (Maidt et Floyd, 1996) ou de pronase E (Finnegan et al., 1995)
suivie par une étape de purification et de précipitation (éthanol ou isopropanol).
Une lyse de 2.5 h à 55°C en présence d'urée, de SDS et de protéinase K nous est apparue
suffisante pour dégrader la matrice cellulaire. Un traitement prolongé, préconisé par certains
auteurs (Zhang et al., 1997a), n'est pas nécessaire.
Les méthodes de purification peuvent être groupées en 5 catégories :
(i) extraction des solutions d'ADN par du phénol, du chloroforme et de l'alcool
isoamylique (Fraga et al., 1990; Shigenaga et al., 1990; Laws et Adams, 1996;
Gupta et al., 1997);
(ii) extraction par du chloroforme et de l'alcool isoamylique (Maidt et Floyd, 1996);
(iii) précipitation en 2 étapes avec un lavage intermédiaire par l'éthanol ("méthode
pronase") (Adachi et al., 1995; Finnegan et al., 1995);
(iv) extraction en phase solide sur des résines échangeuses d'ions (Kvam et Tyrrell,
1997a), sur hydroxyapatite (Floyd et al., 1986) ou, plus récemment, sur iodure de
sodium ("méthode chaotropique") (Nakae et al., 1995; Helbock et al., 1998); et
(v) extraction par un automate dédié (Yamamoto et al., 1992), éventuellement sous
atmosphère d'hélium ou d'argon (Wilson et al., 1993; Takeuchi et Morimoto, 1994;
Nakajima et al., 1996).
L'extraction au phénol a fait l'objet de pas mal de débats dans la littérature, la pureté et
l'état d'oxydation du réactif jouant probablement un rôle dans l'oxydation artefactuelle de la
dG (Claycamp, 1992; Haegele et al., 1994; Harris et al., 1994; Shigenaga et al., 1994;
Finnegan et al., 1995; Helbock et al., 1998). Cette étape n'étant pas indispensable, nous avons
préféré éviter de travailler avec un réactif aussi peu fiable. Nos essais préliminaires avec la
"méthode pronase" n'ont montré aucun avantage, en terme de rendement d'extraction, de
formation éventuelle d'artefact (Tableau 3.2-2) ou de vitesse de travail. De plus, la remise en
solution de l'ADN avant la seconde étape de précipitation requiert un temps considérable. En
ce qui concerne la méthode NaI que nous n'avons pas encore pu évaluer, ses auteurs
revendiquent un recouvrement plus constant d'ADN, moins d'oxydation artefactuelle et une
extraction plus rapide (Nakae et al., 1995; Helbock et al., 1998). Une validation de ce procédé
134
n'est cependant pas disponible et l'impact réel de la méthode sur les taux de 8-oxodG reste par
ailleurs controversé (Haegele et al., 1998). L'extraction de l'ADN est en effet relativement
variable avec la méthode liquide/liquide que nous utilisons, mais cette variabilité peut être
compensée par l'utilisation de dG comme étalon interne.
Tableau 3.2-2 : Extraction par 2 méthodes de purification de l'ADN :
• extraction liquide/liquide avec du chloroforme : alcool isoamylique (24:1), suivie d'une précipitation par l'éthanol
• double précipitation par l'éthanol Les échantillons ont été séparés en 2 parties aliquotes qui ont été extraites par chacune des méthodes. Résultats d'une seule expérience.
Cellules P388D1 Extraction liquide/liquide Double précipitation par l'éthanol
µg ADN extrait (a)
8-oxodG par 105 dG
µg ADN extrait
(a) 8-oxodG
par 105 dG
Non stressées 89 0.9 95 0.7
Non stressées 66 1.0 70 0.9
+ H2O2 20 mM+ UVC 5 min 78 29.5 93 28.9
+ H2O2 20 mM+ UVC 10 min 138 35.2 80 33.1
+ H2O2 20 mM+ UVC 15 min 65 41.7 68 41.0
+ UVA 15 min 87 0.9 125 1.0
(a) Estimé à partir de l'absorbance UV à 260 nm (1 A260 = 50 µg/ml d'ADN)
Un traitement RNase (par la RNase A, éventuellement combinée avec la RNase T1) est
fréquemment appliqué pendant la phase de lyse (Maidt et Floyd, 1996) ou en étape finale
additionnelle (Fiala et al., 1989; Beehler et al., 1992; Laws et Adams, 1996; Verna et al.,
1998). Dans nos mains, la digestion RNase A pendant la lyse s'est avérée peu efficace. Les
bases de l'ARN n'interférant ni avec la digestion de l'ADN ni avec la chromatographie, cette
étape a été simplement supprimée comme proposé précédemment (Haegele et al., 1994).
3.2.3.2 Discussion et conclusion
En conclusion, la méthode retenue42, classique, a pu être appliquée à l'entièreté de ce
travail sans rencontrer de problème particulier.
Elle est vraisemblablement, comme l'ensemble des méthodes, soumise à des artefacts
oxydatifs (cf § 3.4.1). Ceux-ci semblent cependant relativement bien contrôlés, les taux de
42 Lyse des cellules en présence d'urée, de SDS et de protéinase K; purification par extraction liquide/liquide avec un mélange chloroforme : alcool isoamylique; précipitation par acétate de sodium et éthanol; lavage.
135
base de 8-oxodG étant reproductibles et proches des taux rencontrés dans nombre de
publications.
Signalons 2 méthodes originales qui présentent cependant certains défauts :
(i) une élimination enzymatique de la guanine par la guanase pour réduire les artefacts
oxydatifs (Herbert et al., 1996). Cette méthode requiert cependant une double injection de
l'échantillon pour mesurer, d'une part la guanine, d'autre part la 8-oxodG après action de la
guanase; de plus, la 8-oxodG serait également substrat de la guanase (Helbock et al., 1998).
(ii) un traitement élégant consistant à exciser l'ADN par l'endonucléase FPG pour libérer
la 8-oxodG qui, après séparation de l'ADN, est mesurée par chromatographie (Jaruga et al.,
2000; Rodriguez et al., 2000). Cette méthode, qui permet d'obtenir des taux de base
extrêmement faibles pour des échantillons non stressés, présente cependant le même
inconvénient potentiel que les techniques FPG décrites au § 3.1, à savoir que toutes les lésions
ne sont peut-être pas accessibles à l'enzyme.
3.3 VALIDATION DE LA METHODE ANALYTIQUE
La méthode de dosage de la 8-oxodG dans l'ADN de cellules en culture a été validée
suivant le Guide de validation analytique de la SFSTP (Caporal-Gautier et al., 1992), aux
points de vue spécificité, linéarité, précision, exactitude, robustesse, stabilité des analytes et
seuils de détection et de quantification.
Nous avons délibérément choisi de réaliser cette étude sur des échantillons de cellules
sévèrement stressées (20 mM H2O2 + UVC). Ces conditions extrêmes induisent en effet de
nombreuses lésions oxydatives aux bases, mais aussi des liens croisés ADN-protéines et des
lésions dipyrimidines, dimères cyclobutanes et photoproduits (6-4). Ceci nous permet donc
d'assurer la capacité de la méthode CLHP à mesurer de manière fiable les bases 8-oxodG et
dG dans un ADN portant une grande variété de lésions.
La définition, éventuellement le protocole particulier suivi, l'analyse statistique, les
résultats et leur discussion seront présentés pour chacun des paramètres de validation évalués.
3.3.1 Spécificité
3.3.1.1 Définition
La spécificité d'une méthode représente sa faculté à mesurer sans équivoque l'analyte en
présence des autres constituants, des impuretés et des produits de dégradation qui peuvent être
présents dans la matrice de l'échantillon (Commission of the European Communities -
Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
136
3.3.1.2 Protocole
3.3.1.2.1 Détection UV
Les pics UV de l'ADN ont été identifiés par co-injection d'étalons de pureté certifiée et
d'un échantillon biologique stressé. Leur identité et pureté ont été vérifiées à l'aide d'un
détecteur à barrette de diodes par un algorithme basé sur une analyse factorielle évolutive
(window evolving factor analysis). Cette méthode réalise une série d'analyses en composantes
principales (PCA)43 à partir des données d'une petite matrice de dimension constante se
déplaçant parallèlement à l'élution du pic44. Les valeurs propres de chaque PCA sont portées
en fonction du temps et, à chaque instant, le nombre de valeurs propres qui émergent
significativement du bruit de fond correspond au nombre de composés en coélution à cet
endroit du pic. L'analyse factorielle évolutive tire profit, à la fois, de l'information spectrale
classique et de l'information complémentaire contenue dans l'agencement des spectres en
fonction du temps de rétention; elle permet donc de spécifier si un pic est "pur", mais aussi à
quel moment les impuretés surviennent dans le pic, et ce, en temps réel (Gilliard, 1993).
Cette méthode, implémentée dans le logiciel du détecteur Gold, présente l'avantage certain
d'être applicable sans connaissance préalable des spectres UV des composants.
Les conditions optimales permettant d'assigner la pureté des pics ont été observées
(Gilliard et al., 1993), à savoir une vitesse d'acquisition des données de 1 HZ et une
absorbance maximale de 0.4 AU. Les coefficients de corrélation croisée (cross-correlation
coefficients) ont été déterminés grâce au logiciel Gold entre 200 et 400 nm pour chaque paire
de pics assignés.
Les pics de l'ARN ont été identifiés en comparant les temps de rétention avec ceux de pics
obtenus par digestion d'un ARN ribosomal du commerce.
3.3.1.2.2 Détection électrochimique
Les pics de la 8-oxodG et de la 8-oxoG ont été identifiés par co-injection d'étalons de
pureté certifiée. L'identité et la pureté du pic de 8-oxodG ont été déterminées par la
comparaison des rapports de signaux mesurés à différents potentiels pour un échantillon
43 Dans une analyse en composantes principales, les spectres, signaux mesurés en fonction de c longueurs d'onde et de p temps, sont représentés dans une matrice D. Comme les variables sont corrélées, le rang de D, la dimension de l'espace dans laquelle l'ensemble des éléments de D coexistent, est en relation directe avec le nombre de composés présents dans le "spectro-chromatogramme". Si un pic est pur, une seule composante principale (un seul vecteur, caractérisé par une "valeur propre") suffit à rendre compte de la variabilité observée dans les données; en cas de co-élution de 2 composés, 2 vecteurs orthogonaux deviennent nécessaires pour décrire la matrice, et ainsi de suite (Gilliard, 1993). 44 Avec un pas de 5, par exemple, la PCA portera sur les spectres 1 à 5, puis 6 à 10, puis 11 à 15, etc…
137
stressé. Un essai d'établissement de voltamogramme hydrodynamique a également été tenté à
l'aide d'un détecteur de type Coularray.
3.3.1.3 Résultats
3.3.1.3.1 Détection UV
3.3.1.3.1.1 Analyse factorielle évolutive
L'analyse factorielle évolutive (Figure 3.3-1) ne démontre pas d'interférence dans les pics
de guanosine, 2'-désoxyguanosine, thymidine, adénosine et 2'-désoxyadénosine. Par contre,
les pics pour la cytidine, l'uridine et la 2'-désoxycytidine ne sont pas mono-composants; ils
co-éluent ou éluent dans le pic d'injection. Leur résolution est possible (Zhao et al., 1994),
Figure 3.3-1 : Chromatogramme UV des nucléosides obtenus par digestion enzymatique des
acides nucléiques. Cellules P388D1 stressées (20 mM H2O2 + 10 min UVC)
-0.1
0.1
0.3
0.5
0 5 10 15 20
Temps (min)
Sign
al (A
.U.)
2
1
3 4 5
Détection UV; 245 nm; 0.5 AUFS
1 = guanosine 2 = 2'-désoxyguanosine 3 = thymidine 4 = adénosine 5 = 2'-désoxyadénosine
Le graphique sous le chromatogramme est une présentation visuelle en temps réel de l'homogénéité des pics telle que mesurée par le détecteur à barrette de diodes. Le nombre de lignes horizontales représente le nombre de composés détectés par l'algorithme d'analyse factorielle évolutive; une seule ligne horizontale indique un pic homogène, mono-composant.
138
mais inutile pour l'analyse qui nous préoccupe; elle exigerait des temps d'analyse
sensiblement plus longs ou un système gradient que nous préférons éviter en détection
électrochimique.
3.3.1.3.1.2 Coefficients de corrélation spectrale
Pour les différentes bases dont les pics sont purs, le Tableau 3.3-1 montre une excellente
corrélation croisée entre les spectres UV d'étalons de pureté certifiée et d'extraits cellulaires.
Tableau 3.3-1 : Coefficients de corrélation croisée entre les spectres UV (200 à 400 nm)
d'étalons et d'extraits cellulaires. Résultats d'une seule expérience.
Pic Comparaison avec le pic de même temps de rétention provenant de :
Cellules P388D1 non stressées
Cellules P388D1 stressées
(H2O2 + UVC 10 min)
guanosine ARN ribosomal 0.999963 0.999874
2'-désoxyguanosine dG étalon 0.999998 0.999992
thymidine dT étalon 0.999998 0.999998
adénosine ARN ribosomal 0.999989 0.999982
2'-désoxyadénosine dA étalon 0.999994 0.999998
3.3.1.3.2 Détection électrochimique
3.3.1.3.2.1 Rapport de pics à différents potentiels
Le Tableau 3.3-2 montre les rapports de pic obtenus à différents potentiels pour un étalon
et pour un extrait de cellules stressées. Le chromatogramme électrochimique obtenu à partir
de cellules stressées est présenté en Figure 3.3-2.
Tableau 3.3-2 : Identification de la 8-oxodG dans des cellules soumises à un stress oxydatif. Rapports de pics à différents potentiels.
(n = 3; entre parenthèses, étendue des valeurs)
Potentiels (mV)
8-oxodG étalon
Cellules stressées (H2O2 + UVC 10 min)
700 / 650 1.11 (1.07– 1.14) 1.15 (1.12 – 1.20)
700 / 600 1.45 (1.38 – 1.51) 1.44 (1.43 – 1.50)
700 / 550 3.00 (2.89 – 3.12) 3.03 (2.76 – 3.24)
700 / 500 4.00 (3.83 – 4.63) 4.09 (3.61 – 5.49)
650 / 600 1.31 (1.22 – 1.40) 1.27 (1.20 – 1.32)
600 / 550 2.47 (2.40 – 2.60) 2.16 (1.98 – 2.34)
600 / 500 3.40 (3.16 – 3.87) 3.05 (2.58 – 3.97)
550 / 500 1.38 (1.28 – 1.54) 1.41 (1.21 – 1.87)
139
Figure 3.3-2 : Chromatogramme électrochimique des nucléosides obtenus par digestion enzymatique des acides nucléiques. Cellules P388D1 stressées (20 mM H2O2 + 10 min UVC)
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
0 5 10 15 20
Temps (min)
Sign
al (n
A)
1 2
Détection ampérométrique; 700 mV vs Ag/AgCl; 2 nAFS
1 = 8-oxo-7,8-dihydro-2'-guanosine (8-oxoG) 2 = 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxodG) (environ 6 pmoles injectées)
L'établissement du rapport de pics à différents potentiels est particulièrement fastidieux
car, à chaque variation de potentiel, un temps très long est requis pour stabiliser la surface de
l'électrode. En outre, le signal pour un échantillon non stressé est si faible que nous n'avons
pas réussi à le détecter à des potentiels inférieurs à 700 mv, ce qui nous a empêché d'établir
l'identité et la pureté du pic.
3.3.1.3.2.2 Essais sur détecteur à barrette d'électrodes
Nous avons essayé d'établir un voltamogramme hydrodynamique pour des échantillons
non stressés sur un détecteur à barrette d'électrodes. La Figure 3.3-3 présente les
chromatogrammes (i) d'une solution étalon contenant 20 nmoles de dG et 4 pmoles de
8-oxodG; (ii) d'une solution étalon contenant 2.5 nmoles de dG et 500 fmoles de 8-oxodG; et
(iii) d'un extrait biologique obtenu à partir de cellules non stressées (environ 100 fmoles,
comme déterminé par ampérométrie). Ces chromatogrammes ont été enregistrés à 4 potentiels
140
simultanés45, 250, 275, 300 et 325 mV; cependant, l'électrode 4 (325 mV), vraisemblablement
défectueuse, s'est comportée de manière erratique pendant ces essais.
Figure 3.3-3 : Chromatogramme des nucléosides obtenus par digestion enzymatique des
acides nucléiques. Détecteur à barrette d'électrodes. Potentiels : (1) 250 mV; (2) 275 mV; (3) 300 mV; (4) 325 mV
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0-20
-10
0
10
Retention time (minutes)
Response (nA)
4
21
3
5
45 Les potentiels d'un détecteur "coulométrique" sont fixés par rapport à une électrode solide ddonc différents des potentiels ampérométriques fixés par rapport à une électrode Ag/AgCl.
Etalon 4 pmoles8-oxodG
Etalon 00 fmoles8-oxodG
141
e palladium et sont
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
-4.0
-2.0
0.0
2.0
4.0
Retention time (minutes)
Response (nA)
4
21
Extrait biologique blanc 100 fmoles 8-oxodG
3
Ces essais nous ont permis de constater que la distribution des potentiels sur plusieurs
électrodes dilue en fait le signal qui sombre rapidement dans le bruit de fond. Il n'apparaît
donc pas possible d'établir un voltamogramme ou de mesurer des rapports de potentiel pour
des taux aussi faibles sur un Coularray, du moins sur le matériel que nous avons testé.
3.3.1.4 Discussion et conclusion
Pour un biomarqueur, il n'est généralement pas possible de reconstituer une matrice ne
contenant pas l'analyte. L'étude de la spécificité repose donc entièrement sur la sélectivité du
détecteur et, en fonction de la méthode de détection, l'homogénéité du pic chromatographique
est plus ou moins facile à vérifier. Dans nos conditions, la méthode d'extraction étant
relativement spécifique des acides nucléiques et les pics dus à l'ARN n'interférant, ni avec la
8-oxodG, ni avec la dG, nous ne présumions aucune interférence de la matrice cellulaire.
En détection UV, en fonction de la similarité spectrale et de la résolution
chromatographique, l'analyse factorielle évolutive peut détecter entre 0.3 et 9 % d'impuretés
(Gilliard et al., 1993). Notre étude démontre donc que les pics de guanosine, 2'-
désoxyguanosine, thymidine, adénosine et 2'-désoxyadénosine sont essentiellement
homogènes, même pour un échantillon sévèrement stressé.
En détection ampérométrique, l'étude de sélectivité, basée sur le rapport des pics
enregistrés à différents potentiels, présente de nombreuses limitations : (i) elle ne peut, dans le
meilleur des cas, détecter que de 5 à 10 % d'impuretés; (ii) elle est inapplicable à des taux très
142
faibles d'analytes, tels que mis en évidence dans un échantillon non stressé; et (iii) elle exige
des quantités importantes de matériel biologique. Nos données montrent que, même si le
faible pic observé dans les échantillons blanc n'est pas pur, le composé apparaissant suite au
stress oxydatif appliqué est bien la 8-oxodG.
3.3.2 Linéarité
3.3.2.1 Définitions
La linéarité d'une méthode analytique est sa capacité à obtenir des résultats proportionnels,
directement ou par une transformation mathématique bien définie, à la concentration de
l'analyte dans l'échantillon et ce, à l'intérieur d'un certain intervalle (Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994). La linéarité
réfère à la réponse globale du système (NCCLS, 1992).
3.3.2.2 Protocole
Les courbes concentration – réponse du détecteur ont été déterminées pour des solutions
aqueuses et un extrait d'acides nucléiques enrichi en dG, T, dA et 8-oxodG et ce, à 8 niveaux
de concentration sur 4 jours. L'extrait d'acides nucléiques a été préparé à partir de 5 x 10
cellules P388D1 non stressées, par simple montée en échelle de la méthode appliquée en
routine; cet extrait a été repris dans 9.25 ml de tampon TE et aliquoté en 36 microtubes de
220 µl; ceux-ci ont été enrichis, stockés à 4°C, digérés enzymatiquement et analysés suivant
notre protocole général. La mesure de la linéarité en présence de la matrice cellulaire permet
également la détermination de l'exactitude.
8
3.3.2.2.1 Solutions d'enrichissement
Les concentrations des solutions d'enrichissement ont été choisies à partir d'un pré-test de
linéarité. Une solution-mère est préparée par pesée d'environ 5.5 mg de dG, 5.1 mg de dC,
4.9 mg de dT et 5.5 mg de dA, ajout de 1350 µl d'une solution environ 11.3 µM de 8-oxodG
et addition d'eau ad 5.0 ml. A partir des dilutions détaillées au Tableau 3.3-3, les solutions
aqueuses et ADN sont enrichies comme suit :
- solution aqueuse : 269 µl d'eau + 30 µl d'enrichissement
- solution ADN : 220 µl de solution aliquote d'ADN + 30 µl d'enrichissement 46
L'extrait d'ADN provenant de 5 x 108 cellules est repris dans 9.25 ml, dispensé en parties
aliquotes de 220 µl qui sont additionnées de 30 µl de solution d'enrichissement. Dans le
procédé à valider, la digestion enzymatique porte sur un extrait provenant de 10 cellules 7
46 Après digestion enzymatique, le volume total de la solution ADN sera de 299 µl
143
repris dans 250 µl. La quantité d'acides nucléiques dans chaque tube est donc très proche de
celle réalisée en routine; elle équivaut à :
cellules1018.1soitcellules220.025.91050 7
8
×××
Cette concentration a été choisie afin d'évaluer la linéarité dans les conditions extrêmes
pouvant être retrouvée en pratique; 20 % de variation globale sont en effet tout à fait possibles
en raison d'une inexactitude dans le comptage de cellules et/ou d'une fluctuation dans le
rendement d'extraction de l'ADN.
Tableau 3.3-3 : Dilution des solutions d'enrichissement et ajouts réalisés Enrichissement dans 30 µl
A partir de
+ µl d'eau 8-oxodG (pmoles)
Dilution
µl (a) dG (nmoles)
T (nmoles)
dA (nmoles)
Solution 1 --- --- 94.04 121.14 130.65
Solution 2 Sol. 1 150 94.66 93.18
Solution 3 400 300 53.74 70.32 74.66
Sol. 1 300 35.26 45.43 48.99
Solution 5 Sol. 1
--- 123.05
500 72.34 100.50
Sol. 1 69.22
Solution 4 500 46.15
150 750 15.67 20.51 20.19 21.78
Solution 6 Sol. 5 100 3.13 4.04 4.36
Solution 7 Sol. 5 900 2.05 2.02
Solution 8 200 800 0.63 0.82 0.87
(a) Ces valeurs d'enrichissements tiennent compte de la 8-oxodG qui contamine la dG
400 4.10
100 1.57 2.18
Sol. 6 0.81
3.3.2.2.2 Conditions chromatographiques
Tous les chromatogrammes ont été enregistrés dans les conditions de routine avec pour
détecteur électrochimique la cellule TL5A. Le système est laissé sous flux la nuit, à un débit
de 0.2 ml/min, détecteur coupé, afin d'éviter tout problème de cristallisation dans
l'appareillage.
3.3.2.3 Etude de la linéarité
Pour chaque jour, les droites D1 et D2, correspondant l'une aux solutions aqueuses, l'autre
aux solutions ADN, ont été calculées par régression linéaire. Les pentes (a1 et a2), les
ordonnées à l'origine (b1 et b2) et les coefficients de détermination (R²) ont été calculés pour
chacune des droites selon les équations classiques.
144
3.3.2.3.1 Conditions d'application
La méthode des moindres carrés non pondérée suppose quelques conditions d'application :
• les indéterminations ne portent que sur les termes dépendants
• la distribution des erreurs sur les variables dépendantes doit être normale ou
proche de la normale
• les erreurs résiduelles sont aléatoires, indépendantes, de moyenne nulle et de
variances identiques (condition d'homogénéité des variances ou homoscédasticité)
De par la nature des erreurs dans un dosage chromatographique, nous avons considéré
dans ce travail que les observations se distribuaient a priori selon une courbe gaussienne ou
proche de la gaussienne
3.3.2.3.2 Liste des symboles
Les symboles utilisés sont ceux de (Caporal-Gautier et al., 1992)
x ij valeur brute indépendante Yij Variable transformée
valeur brute dépendante y ij Y
Yj
m
x
y
moyenne générale des valeurs Y des k groupes
ij
moyenne des valeurs Y de chaque groupe j j indice de groupe ij
i indice des valeurs individuelles dans le groupe j
s écart étalon
k nombre de groupes CV coefficient de variation
nombre d'observations du groupe j s² variance nj
n nombre moyen de valeurs par groupe s²max variance la plus élevée
N nombre total d'observations y dans l'ensemble des k groupes
Sx écart étalon estimé de la variable x ij ij ij
m moyenne de n valeurs du groupe j j Sy écart étalon estimé de la variable y j ij ij
moyenne des moyennes m de groupes R coefficient de corrélation j
moyenne générale des valeurs x des k groupes
R² coefficient de détermination ij
moyenne générale des valeurs y des k groupes
ij ddl nombre de degrés de liberté
risque de première espèce α
3.3.2.3.3 Calcul de la droite de régression
La méthode des moindres carrés permet de calculer :
( ) ( )( )∑ ∑
∑ ∑
= =
= ==k
1j
2n
1iij
ijk
1j
n
1iij
j
j
x-x
y-y.x-xb • la pente :
• l'ordonnée à l'origine : x.bya −=
145
• la covariance : ( ) ( )
1N
y-y.x-xySx
ijk
1j
n
1iij
ijij
j
−=∑∑
= =
• le coefficient de corrélation : ijij
ijij
Sy.SxySxR =
• le coefficient de détermination : R²
Les calculs sont effectués à l'aide du tableur Excel, par la fonction "DROITE.REG" qui,
sous sa forme matricielle, nous fournit les données principales. L'exactitude des calculs a été
vérifiée manuellement à l'aide de quelques exemples.
3.3.2.3.4 Comparaison de l'ordonnée à l'origine avec zéro
Pour chacune des droites établies, nous avons calculé :
• s²R : ( ) ( )
2N
x-x.by-y²s
k
1j
n
1i
2ij
2k
1j
n
1i
2ij
R
jj
−
−=
∑ ∑∑∑= == =
• la variance de l'ordonnée à l'origine: ( )
+=
∑ ∑= =
k
1j
n
1i
2ij
Rj
x-x
²xN1.²sa²s
• le rapport : saa
t calc =
Si le t ainsi calculé est inférieur au t lu dans la table de Student pour le seuil 0.05 et
(N – 2) ddl, l'ordonnée à l'origine n'est pas significativement différente de 0 au seuil 0.05.
Alternativement, la probabilité exacte du t calculé est obtenue par la fonction
"LOI.STUDENT" du tableur Excel.
(0.05; N-2)
3.3.2.3.5 Comparaison des pentes de la "droite aqueuse" et de la "droite ADN"
Afin de pouvoir utiliser des étalons préparés dans l'eau pour la quantification dans un
échantillon, il faut démontrer que le dosage dans l'eau est comparable à celui réalisé dans un
échantillon, donc que les pentes b et b des 2 droites ne diffèrent pas significativement. 1 2
Nous avons donc calculé :
• la variance de chaque pente : ( )∑ ∑
= =−
=k
1j
nj
1i
2ij
R
xx
²sb²s
146
• le rapport :
21
21calc
b²sb²sbb
t+
−=
Si le t ainsi calculé est inférieur au t(0.05; N1+N2 - 4) lu dans la table de Student pour le seuil
0.05 et (N1 + N2 – 4) ddl, les 2 pentes ne sont pas significativement différentes au seuil 0.05.
Alternativement, la probabilité exacte du t calculé est obtenue par la fonction
"LOI.STUDENT" du tableur Excel.
3.3.2.3.6 Test d'homogénéité des variances intra-groupe
Les tests "existence d'une pente significative" et "validité de la droite de régression (défaut
d'ajustement)" sont basés sur des procédures ANOVA; celles-ci sont connues pour être
relativement robustes vis-à-vis de leurs critères d'application. Cependant, en chromatographie,
les études de linéarité qui englobent un domaine expérimental étendu peuvent présenter des
coefficients de variation homogènes et donc une forte hétéroscédasticité, les variances étant
alors concentration-dépendantes. Afin de vérifier si les variances sont homogènes ou pas,
nous avons utilisé le test de Cochran, tel que recommandé par le National Committee for
Clinical Laboratory Standards américain (NCCLS, 1992).
On calcule donc :
• l'inégalité : )1n;k;(nj
1jj
C²s
max²sC −α
=
<=
∑
La variable C est simplement le rapport de la plus grande variance sur la somme de
l'ensemble des variances des k groupes j. Si l'inégalité est vérifiée avec C(0.05; k; n - 1) lu dans la
table de Cochran, les variances des différents groupes j ne sont pas significativement
différentes au seuil 0.05.
En cas de variances non homogènes, nous avons procédé à une transformation
logarithmique des données, transformation recommandée dans le cas de variances
concentration-dépendantes (Caporal-Gautier et al., 1992; NCCLS, 1992).
3.3.2.3.7 Test de signification statistique de la pente
Ce test consiste à comparer les variations dues à la régression à la variation résiduelle, qui
provient des erreurs expérimentales et d'ajustement. La "variation de régression" est attribuée
entièrement à la régression de y par rapport à x, alors que l'autre composante mesure
l'inaptitude de la réponse y à tomber exactement sur la droite de régression (NCCLS, 1992).
147
La variation totale est donc répartie suivant le tableau d'analyse de variance ci-dessous
(Tableau 3.3-4).
Tableau 3.3-4 : Test de signification statistique de la pente Source de variation ddl Somme des carrés Variance F calculé
( )∑ ∑ ∑= =
−=k
1j
nj
1i
2ij yy²T
( )∑ ∑=
−=k
1j
2jj xx.n.²b²I ∑= ²I²s I
∑ ∑ ∑−= ²I²T²R2N²R
²s I −= ∑
R
I
²s²sF =
Variation totale N - 1
Variation due à la régression 1
Variation résiduelle N - 2
Si le F calculé est supérieur au F tabulaire F(α; 1; N - 2), on conclut à l'existence d'une pente
significative, donc à une dépendance linéaire, au seuil de probabilité considéré. La probabilité
exacte du F calculé est obtenue par la fonction "LOI.F" du tableur Excel.
Remarquons que ce F calculé est en fait directement affiché par Excel, si les données
statistiques de la formule "DROITEREG" sont présentées sous leur forme matricielle.
3.3.2.3.8 Test de validité de la droite de régression : test du défaut d'ajustement
Ce test permet de comparer les erreurs expérimentales (S²E) et d'ajustement (S² ) qui
forment la variation résiduelle. La première composante mesure l'inaptitude à répéter de
manière identique les résultats pour un taux donné en analyte; la seconde composante est
appelée le défaut d'ajustement (lack of fit). Si les données sont significativement non linéaires
l'erreur due au défaut d'ajustement sera significativement supérieure à l'erreur expérimentale
pure (NCCLS, 1992). La variation résiduelle est donc répartie suivant le tableau d'analyse de
variance ci-dessous (Tableau 3.3-5).
I
Tableau 3.3-5 : Test de validité de la droite de régression Source de variation ddl Somme des carrés Variance F calculé
( )∑ ∑∑= =
−=k
1j
nj
1i
2jij yy²E
kN²E
²s E −= ∑E
L
²s²sF =
∑ ∑ ∑−= ²E²R²L2k²L
²s L −= ∑
Erreur expérimentale N - k
Variation résiduelle k - 2
148
Si le F calculé est inférieur au F tabulaire F(α; k - 2; N - k), l'ajustement est considéré comme
valide, au seuil de probabilité considéré. La probabilité exacte du F calculé est obtenue par la
fonction "LOI.F" du tableur Excel.
Remarquons que cette valeur F calculée est identique à la valeur G de la note de guidance
" Evaluation of the linearity of quantitative analytical methods" proposée par le NCCLS
(NCCLS, 1992). Nous avons testé les limites de cette méthode d'évaluation de la linéarité. Il
apparaît notamment que, dans les cas où la précision expérimentale est excellente, la
répartition de la variation résiduelle en erreur et en défaut d'ajustement n'a que peu de
signification; par exemple, le déplacement d'un seul point sur 30 peut suffire à complètement
modifier les conclusions d'un test. La note de guidance du NCCLS est consciente de cet état
de choses et conclut que l'évaluation visuelle de la linéarité reste la meilleure technique
(NCCLS, 1992).
3.3.2.4 Résultats
3.3.2.4.1 Linéarité du dosage de la 8-oxodG
3.3.2.4.1.1 Données et graphiques
Le Tableau 3.3-6 présente les données mesurées respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". La Figure 3.3-4 présente les données sous forme de 4
graphiques portant, par jour, les points expérimentaux et les 2 droites de régression. Nous
constatons de visu une très bonne corrélation entre la réponse électrochimique et les quantités
ajoutées ainsi qu'un excellent parallélisme entre les droites obtenues en milieu aqueux et en
milieu biologique. Les Figures 3.3-5 et 3.3-6 présentent les données des 4 jours, pour,
respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique, ainsi que les
droites moyennes sur lesquelles a porté l'étude de linéarité.
Les Figures 3.3-5 et 3.3-6 montrent que le signal électrochimique baisse de jour à jour.
En fait, notre habitude de laisser le système sous flux la nuit (§ 3.3.2.2.2), donc de passer de la
phase mobile à faible débit sur la surface de l'électrode hors potentiel, induit un effet de
passivation qui provoque une réduction générale des courants d'oxydation le jour suivant. Un
simple polissage avec du méthanol suffit cependant à restaurer le signal d'origine. Nous
avons, par la suite, arrêté le flux pendant la nuit, ce qui nous a permis de maintenir le signal
électrochimique relativement constant de jour à jour; ce phénomène, identique pour les 2
cellules électrochimiques, sera démontré par la seconde étude de linéarité sur le détecteur CC-
5 (§ 3.3.2.6).
149
Tableau 3.3-6 : Données de l'étude de linéarité pour la 8-oxodG
Signal pour 1 nAFS :
Enrichissement pmoles
injectées dans 100 µl
Jour La solution aqueuse
La solution ADN
1 31.45 1 1235136 1249151 2 1178250 1185659 3 1115368 1155828 4 1030183 1086940
2 24.19 1 958236 975115 2 876459 890544 3 843470 849729 4 780226 799355
3 17.97 1 712761 2 660008 656934 622479 636301 4 598295 591420
4 11.79 1 465597 425458 430707
3 411883 4 388858 387320
5
703628
3
450363 2
410059
5.24 1 198811 215187 2 202199 193256 3 187984 191908 4 179777 175707
6 1.05 42075 46585 44417 40955 38396 41810 41410 44792
7 0.52 1 20581 22813 2 22080 23503 3
1 2 3 4
20747 25574 4 18750 25268
8 0.21 1 10064 15547 2 11225 13741 3 10712 15918 4 11766 14939
ADN blanc (non enrichi)
---- 1 ---- 4299 ---- 2 ---- 6457 ---- 3 ---- 9836 ---- 4 ---- 9813
150
Figure 3.3-4 : Droites de régression journalières pour la 8-oxodG ( : solution aqueuse; : solution ADN)
Jour 1
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Solution aqueuse
Solution ADN
Jour 2
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Solution aqueuse
Solution ADN
Figure 3.3-5 : 8-oxodG. Solutions aqueuses. Points expérimentaux mesurés pendant
Jour 3
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Solution aqueuse
Solution ADN
Jour 4
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Solution aqueuse
Solution ADN
les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.990)
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
151
Figure 3.3-6 : 8-oxodG. Solutions ADN. Points expérimentaux mesurés pendant
les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.991)
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
alJour 1Jour 2Jour 3Jour 4
3.3.2.4.1.2 8-oxodG : Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro
Le Tableau 3.3-7 montre que les ordonnées à l'origine ne sont pas significativement
différentes de 0, qu'il s'agisse de la "droite aqueuse" ou de la "droite ADN".
Tableau 3.3-7 : Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro t (0.05; 6) = 2.447; t (0.05; 7) = 2.365 "Droite aqueuse" (n = 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a -2091 1869 878 6061
sa 3639 5868 3395 3267
t calculé 0.575 0.318 0.259 1.855
p 0.586 NS 0.761 NS 0.805 NS 0.113 NS
"Droite ADN" (n = 9) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
3899 1050 3302
3313 6690
1.18 0.244 0.436 0.491
p 0.278 NS 0.814 NS 0.676 NS 0.638 NS
a 2918
sa 4296 6725
t calculé
152
3.3.2.4.1.3 8-oxodG : Comparaison des pentes
Comme les Figures 3.3-5 et 3.3-6, le Tableau 3.3-7 montre que les pentes des "droites
aqueuses" ainsi que celles des "droites ADN" diffèrent sensiblement de jour à jour. Cette
variation de pente peut être attribuée au stockage des échantillons avant l'analyse. En effet, la
dG s'oxyde lentement en 8-oxodG (cf § 3.3.8). Cet artefact, conjugué à la passivation de
l'électrode (cf § 3.1.1.4.1.1) explique vraisemblablement le léger basculement des pentes
observé dans notre étude.
Par contre, au sein du même jour, la "droite aqueuse" et la "droite ADN" sont parallèles,
au seuil 0.05 pour les jours 1, 2 et 3; au seuil 0.01 pour le jour 4.
Tableau 3.3-7 : Comparaison des pentes des droites de régression t (0.05; 64) = 1.998
Jour 2
(0.05; 12) = 2.178; t (0.05; 13) = 2.160; t (0.05; 14) = 2.145; t "Droite aqueuse" (n = 8 + 8) Jour 1 Jour 3 Jour 4
1.000 0.999 1.000 1.000
b 39431
36838 35095 32464
sb 226 365 211 203
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calculé 6.03 4.13 8.97
p 5 x 10-05 *** 0.001 ** 1 x 10-06 ***
"Droite ADN" (n = 9 + 9) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 1.000 1.000 0.999 0.999
b 39626 37132 35817 33600
sb 219 284 442 444
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calculé 6.96 2.51 3.54
p 7 x 10-6 *** 0.025 * 0.003 **
Comparaison entre "Droite ADN" et "Droite aqueuse" (n = 8 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calculé 0.621 0.635 1.47 2.33
p 0.545 NS 0.536 NS 0.164 NS 0.037 *
Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et "Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 36)
t calculé 0.612
p 0.543 NS
R²
153
3.3.2.4.1.4 8-oxodG : Tests pour la linéarité de la "droite aqueuse"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.469 •
• C (0.05; 8; 3) = 0.4377
Comme le Ccalculé est supérieur au Ctabulé, les variances ne peuvent être considérées
homogènes au seuil de probabilité 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dépendantes;
nous avons donc procédé à une transformation log – log des données afin de rendre les
variances homogènes pour la suite des tests.
b. Test de signification statistique de la pente
Après transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur
tabulaire :
• F = 10585
•
•
calculé
F (0.05; 1; 30) = 4.171
p du Fcalculé = 8 x 10-40
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 4.967 •
•
3.3.2.4.1.5
F (0.05; 6; 24) = 2.508
• p du Fcalculé = 0.002
Nous concluons à l'existence d'une association linéaire significative seulement au
seuil 0.001. Rappelons les considérations développées sur ce test de défaut d'ajustement
(§ 3.3.2.3.7). Dans le cas présent, la transformation des données a fortement réduit les écarts
entre les valeurs, "augmentant" artificiellement leur précision et mettant en défaut le test.
L'examen visuel des données nous permet cependant d'affirmer, sur base non statistique, que
la relation linéaire existe.
8-oxodG : Tests pour la linéarité de la "droite ADN"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.405 •
• C (0.05; 9; 3) = 0.4027
154
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 4569 •
•
•
F (0.05; 1; 34) = 4.130
p du Fcalculé = 8 x 10-38
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
• F = 0.305
•
•
calculé
F (0.05; 7; 27) = 2.373
p du Fcalculé = 0.945
Comme le Fcalculé est inférieur au Ftabulé, , nous concluons à l'existence d'une association
linéaire significative.
3.3.2.4.2 Linéarité du dosage de la 2'désoxyguanosine
3.3.2.4.2.1 Données et graphiques
Le Tableau 3.3-8 présente les données mesurées respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". Les Figures 3.3-7 et 3.3-8 présentent les données des 4
jours, pour, respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique,
ainsi que les droites moyennes sur lesquelles a porté l'étude de linéarité.
L'enrichissement numéro 1 étant trop élevé, un plafonnement du pic était manifeste dans
les "solutions ADN"; ces points n'ont donc pas été considérés.
155
Tableau 3.3-8 : Données de l'étude de linéarité pour la 2'désoxyguanosine
Signal pour 1 AFS :
Enrichissement nmoles
injectées dans 100 µl
Jour La solution aqueuse
La solution ADN
1 41.16 1 224275 267365 2 215986 241211 3 216732 253741 4 208681 256108
2 31.66 1 163756 231806 2 156656 208053
157679 3 216248 4 154900 219978
3 23.52 1 119888 200921 2 115995 194544 3 114643 170570 4 115724 192549
4 15.43 1 77214 150479 2 75498 146222 3 75020 127748 4 75987 143353
5 6.86 1 34901 105070 2 34485 100984 3 34851 102059 4 33916 91513
6 1.37 1 6829 51697 2 6818 70445 3 6835 56780 4 6680 70234
7 0.69 1 3360 43036 2 3426 69255 3 3510 56388 4 3303 68768
8 0.27 1 1296 67979 2 1267 59577 3 1276 66886 4 1296 59068
---- 1 ---- 45800 ---- 2 ---- 45148 ---- 3 ---- 65516
ADN blanc (non enrichi)
---- 4 ---- 54159
156
Figure 3.3-7 : 2'désoxyguanosine. Solutions aqueuses. Points expérimentaux mesurés pendant les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.998)
0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 µl)
Sign
alJour 1Jour 2Jour 3Jour 4
Figure 3.3-8 : 2'désoxyguanosine. Solutions ADN. Points expérimentaux mesurés pendant
les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.975)
0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
157
3.3.2.4.2.2 2'désoxyguanosine : Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro
Le Tableau 3.3-9 montre que l'ordonnée à l'origine n'est pas significativement différente
de 0 pour la "droite aqueuse". La dG endogène étant en quantité fort importante, ce test est
forcément négatif pour la "droite ADN".
Tableau 3.3-9 : 2'désoxyguanosine. Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro t (0.05; 6) = 2.447 "Droite aqueuse" (n = 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a -1870 -1326 -1453 -643
sa 1918 1845 2019 987
t calculé 0.975 0.719 0.720 0.651
p 0.367 NS 0.499 NS 0.499 NS 0.539 NS
"Droite ADN" (n = 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 52262 60791 59532 59876
sa 5510 5236 3588 2854
t calculé 9.49 11.61 16.60 20.98
p 1. 10-5 *** 2 x 10-5 *** 3 x 10-6 *** 8 x 10-7 ***
3.3.2.4.2.3 2'désoxyguanosine : Comparaison des pentes
Comme le montre le Tableau 3.3-10, toutes les droites sont de pentes parallèles et il n'y a
ni effet "jour", ni effet "matrice", au seuil de probabilité de 0.05.
158
Tableau 3.3-10 : 2'désoxyguanosine. Comparaison des pentes des droites de régression t (0.05; 12) = 2.178; t (0.05; 60) = 2.000 "Droite aqueuse" (n = 8 + 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 0.998 0.998 0.998 0.999
b 5345 5132 5144 5007
sb 91 88 96 47
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calculé 1.681 0.091 1.280
p 0.119 NS 0.929 NS 0.225 NS
"Droite ADN" (n = 8 + 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 0.979 0.973 0.986 0.992
b 5999 5112 4836 5271
sb 363 345 236 188
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
1.771 0.658 1.439
p 0.102 NS 0.523 NS 0.176 NS
Comparaison entre "Droite ADN" et "Droite aqueuse" (n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calculé 1.747 0.057 1.205 1.362
p 0.106 NS 0.955 NS 0.251 NS 0.198 NS
Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et "Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 32)
t calculé 0.909
p 2.000 NS
t calculé
3.3.2.4.2.4 2'désoxyguanosine : Tests pour la linéarité de la "droite aqueuse"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.657 •
• C (0.05; 8; 3) = 0.4377
Comme le Ccalculé est supérieur au Ctabulé, les variances ne peuvent être considérées
homogènes au seuil de probabilité 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dépendantes;
nous avons donc procédé à une transformation log – log des données afin de rendre les
variances homogènes pour la suite des tests.
159
b. Test de signification statistique de la pente
Après transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur
tabulaire :
Fcalculé = 134756 •
•
•
F (0.05; 1; 30) = 4.171
p du Fcalculé = 2 x 10-56
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 6.035 •
•
3.3.2.4.2.5
F (0.05; 6; 24) = 2.508
• p du Fcalculé = 0.0006
Nous concluons à l'existence d'une association linéaire significative seulement au
seuil 0.0006. Rappelons les considérations développées sur ce test de défaut d'ajustement
(§ 3.3.2.3.7). Dans le cas présent, la transformation des données a fortement réduit les écarts
entre les valeurs, "augmentant" artificiellement leur précision et mettant en défaut le test.
L'examen visuel des données nous permet cependant d'affirmer que la relation linéaire existe.
2'désoxyguanosine : Tests pour la linéarité de la "droite ADN"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.229 •
• C (0.05; 8; 3) = 0.4377
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 1164 •
•
•
F (0.05; 1; 30) = 4.171
p du Fcalculé = 1.5 x 10-25
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
160
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 1.317 •
•
•
F (0.05; 6; 24) = 2.508
p du Fcalculé = 0.288
Comme le Fcalculé est inférieur au Ftabulé, , nous concluons à l'existence d'une association
linéaire significative.
3.3.2.4.3 Linéarité du dosage de la thymidine
3.3.2.4.3.1 Données et graphiques
Le Tableau 3.3-11 présente les données mesurées respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". Les Figures 3.3-9 et 3.3-10 présentent les données des 4
jours, pour, respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique,
ainsi que les droites moyennes sur lesquelles a porté l'étude de linéarité.
Tableau 3.3-11 : Données de l'étude de linéarité pour la thymidine
Signal pour 1 AFS : Enrichissement
nmoles injectées
dans 100 µlJour La solution
aqueuse La solution
ADN 1 40.51 1 68034 88184 2 64402 78281
66296
1 80051
3 86655 4 63000 92375
2 31.17 53036 2
49584 65515 3 49345 67333
4 49084 76065
3 23.15 1 40113 68000 2 37462 67680 3 37841 67287 4 37266 63371
4 15.19 1 26032 56051 2 25003 53956 3 24270 42935 4 24963 52572
161
Tableau 3.3-11 (Suite) : Données de l'étude de linéarité pour la thymidine
Signal pour 1 AFS : Enrichissement
nmoles injectées
dans 100 µlJour La solution
aqueuse La solution
ADN 5 6.75 1 11962 42323 2 11425 40133
2281
3 11228 40001 4 11056 33706
6 1.35 1 18727 2 2122 26669 3 2130 19166 4 2187 30053
7 0.68 1 1042 15025 2 1088 30886 3 1120 20485 4 1082 29820
8 0.27 1 406 30262 2 453 20348 3 387 28454 4 369 21803
---- 1 ---- 17487 ---- 2 ---- 16815 ---- 3 ---- 29092
ADN blanc (non enrichi)
---- 4 ---- 19747
Figure 3.3-9 : Thymidine. Solutions aqueuses. Points expérimentaux mesurés pendant les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.998)
0.E+00
1.E+04
2.E+04
3.E+04
4.E+04
5.E+04
6.E+04
7.E+04
8.E+04
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
162
Figure 3.3-10 : Thymidine. Solutions ADN. Points expérimentaux mesurés pendant les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.942)
0.E+00
1.E+04
2.E+04
3.E+04
4.E+04
5.E+04
6.E+04
7.E+04
8.E+04
9.E+04
1.E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
3.3.2.4.3.2 Thymidine : Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro
Le Tableau 3.3-12 montre que l'ordonnée à l'origine n'est pas significativement différente
de 0 pour la "droite aqueuse". Le dT endogène étant en quantité fort importante, ce test est
forcément négatif pour la "droite ADN".
Tableau 3.3-12 : Thymidine. Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro t (0.05; 6) = 2.447; t (0.05; 7) = 2.365 "Droite aqueuse" (n = 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 203 278 -33 342
sa 245 208 298 301
t calculé 0.828 1.334 0.110 1.135
p 0.439 NS 0.231 NS 0.916 NS 0.300 NS
"Droite ADN" (n = 9) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 21345 24767 24486 24263
sa 3088 3167 2973 1628
t calculé 6.913 7.821 8.237 14.907
p 2 x 10-4 *** 1 x 10-4 *** 8 x 10-5 *** 1 x 10-6 ***
163
3.3.2.4.3.3 Thymidine : Comparaison des pentes
Comme le montre le Tableau 3.3-13, toutes les droites sont de pentes parallèles et il n'y a
ni effet "jour", ni effet "matrice", au seuil de probabilité de 0.05.
Tableau 3.3-13 : Thymidine. Comparaison des pentes des droites de régression t (0.05; 12) = 2.178; t (0.05; 13) = 2.160; t (0.05; 14) = 2.145; t (0.05; 64) = 1.998 "Droite aqueuse" (n = 8 + 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 1.000 1.000 1.000 0.999
b 1690 1590 1620 1564
sb 12 10 14 15
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calculé 6.470 1.705 2.712
p 3.E-05 *** 0.114 NS 0.019 *
"Droite ADN" (n = 9 + 9) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 0.940 0.902 0.906 0.976
b 2001 1577 1513 1693
sb 207 212 199 109
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calculé 1.432 0.219 0.795
p 0.174 NS 0.830 NS 0.440 NS
Comparaison entre "Droite ADN" et "Droite aqueuse" (n = 8 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calculé 1.499 0.062 0.535 1.175
p 0.158 NS 0.951 NS 0.602 NS 0.261 NS
Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et "Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 36)
t calculé 0.134
p 0.893 NS
3.3.2.4.3.4 Thymidine : Tests pour la linéarité de la "droite aqueuse"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.451 •
• C (0.05; 8; 3) = 0.4377
164
Comme le Ccalculé est supérieur au Ctabulé, les variances ne peuvent être considérées
homogènes au seuil de probabilité 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dépendantes;
nous avons donc procédé à une transformation log – log des données afin de rendre les
variances homogènes pour la suite des tests.
b. Test de signification statistique de la pente
Après transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur
tabulaire :
Fcalculé = 46424 •
•
•
F (0.05; 1; 30) = 4.171
p du Fcalculé = 2 x 10-49
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 1.910 •
•
3.3.2.4.3.5
F (0.05; 6; 24) = 2.508
• p du Fcalculé = 0.120
Nous concluons à l'existence d'une association linéaire significative au seuil 0.05.
Thymidine : Tests pour la linéarité de la "droite ADN"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.207 •
• C (0.05; 9; 3) = 0.4027
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 551 •
•
•
F (0.05; 1; 34) = 4.130
p du Fcalculé = 1 x 10-22
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
165
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 1.538 •
• F (0.05; 7; 27) = 2.373
• p du Fcalculé = 0.197
Nous concluons à l'existence d'une association linéaire significative au seuil 0.05.
3.3.2.4.4 Linéarité du dosage de la 2'-désoxyadénine
3.3.2.4.4.1 Données et graphiques
Le Tableau 3.3-14 présente les données mesurées respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". Les Figures 3.3-11 et 3.3-12 présentent les données des 4
jours, pour, respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique,
ainsi que les droites moyennes sur lesquelles a porté l'étude de linéarité.
Tableau 3.3-14 : Données de l'étude de linéarité pour la 2'-désoxyadénine
Signal pour 1 AFS : Enrichissement
nmoles injectées
dans 100 µlJour La solution
aqueuse La solution
ADN 1 43.70 1 137898 183561 2 133288 162285 3 132796 178479 4 131142 189395
2 33.61 1 109839 166371 2 100091 140796 3 101827 144513 4 112123 159692
3 24.97 1 82783 137272 2 74195 132962
3 136386 4 81151 128795
4 16.39 1 52364 110130 2 50836 109674 3 51530 91363 4 50422 107852
5 7.28 1 23957 82779 2 22890
80047 3 23709 83341
4 21941 70397
76406
166
Tableau 3.3-14 (Suite) : Données de l'étude de linéarité pour la 2'-désoxyadénine
Enrichissement nmoles
injectées dans 100 µl
Jour Signal pour 1 AFS :
6 1.46 1 4357 40460 2 4605 57658 3 4641 45631 4 4248 61720
7 0.73 1 2224 35544 2 2324 60303
3 1979 46577 4 2121 60442
8 0.29 1 826 59530 2 810 50515 3 741 58264 4 889 49681
---- 1 ---- 39297 ---- 2 ---- 37677 ---- 3 ---- 58592
ADN blanc (non enrichi)
---- 4 ---- 48275
Figure 3.3-11 : 2'-désoxyadénine. Solutions aqueuses. Points expérimentaux mesurés pendant les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.997)
0.0E+00
2.0E+04
4.0E+04
6.0E+04
8.0E+04
1.0E+05
1.2E+05
1.4E+05
1.6E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
167
Figure 3.3-12 : 2'-désoxyadénine. Solutions ADN. Points expérimentaux mesurés pendant les 4 jours et droite de régression moyenne. (R² = 0.963)
0.0E+00
2.0E+04
4.0E+04
6.0E+04
8.0E+04
1.0E+05
1.2E+05
1.4E+05
1.6E+05
1.8E+05
2.0E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3Jour 4
3.3.2.4.4.2 2'-désoxyadénine : Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro
Le Tableau 3.3-15 montre que l'ordonnée à l'origine n'est pas significativement différente
de 0 pour la "droite aqueuse". Le dA endogène étant en quantité fort importante, ce test est
forcément négatif pour la "droite ADN".
Tableau 3.3-15 : 2'-désoxyadénine. Comparaison des ordonnées à l'origine avec zéro t (0.05; 6) = 2.447; t (0.05; 7) = 2.365 "Droite aqueuse" (n = 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 292 237 514 200
sa 839 576 441 1965
t calculé 0.349 0.411 1.165 0.102
p 0.739 0.696 0.288 0.922
"Droite ADN" (n = 9) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 44270 52447 52171 52318
sa 4704 4448 4609 2196
t calculé 9.410 11.790 11.319 23.824
p 3 x 10-5 7 x 10-6 9 x 10-6 6 x 10-6
168
3.3.2.4.4.3 2'-désoxyadénine : Comparaison des pentes
La comparaison des pentes montre une différence significative entre les pentes des
"droites aqueuses" (Tableau 3.3-16); le faible écart-étalon sur les pentes est responsable de ce
phénomène; un examen visuel des droites ne présente en fait pas de différence flagrante. Les
"droites aqueuses" et "droites ADN" sont parallèles et il n'y a donc pas d'effet "matrice", au
seuil de probabilité de 0.05.
Tableau 3.3-16 : 2'-désoxyadénine. Comparaison des pentes des droites de régression t (0.05; 12) = 2.178; t (0.05; 13) = 2.160; t (0.05; 14) = 2.145; t (0.05; 64) = 1.998 "Droite aqueuse" (n = 8 + 8) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 0.999 1.000 1.000 0.995
b 3207 3015 3033 3134
sb 38 26 20
Jour 3 / Jour 4
88
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3
t calculé 4.231 0.567 1.115
p 1 x 10-3 *** 0.581 NS 0.287 NS
"Droite ADN" (n = 9 + 9) Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R² 0.965 0.950 0.946 0.989
b 3744 2951 2919 3167
sb 292 276 286 136
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calculé 1.973 0.082 0.783
p 0.069 NS 0.936 NS 0.447 NS
Comparaison entre "Droite ADN" et "Droite aqueuse" (n = 8 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calculé 1.823 0.228 0.398 0.204
p 0.091 NS 0.823 NS 0.697 NS 0.841 NS
Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et "Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 36)
t calculé 0.552
0.583p NS
169
3.3.2.4.4.4 2'-désoxyadénine : Tests pour la linéarité de la "droite aqueuse"
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.572 •
• C (0.05; 8; 3) = 0.4377
Comme le Ccalculé est supérieur au Ctabulé, les variances ne peuvent être considérées
homogènes au seuil de probabilité 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dépendantes;
nous avons donc procédé à une transformation log – log des données afin de rendre les
variances homogènes pour la suite des tests.
b. Test de signification statistique de la pente
Après transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur
tabulaire :
Fcalculé = 40923 •
•
•
F (0.05; 1; 30) = 4.171
p du Fcalculé = 1 x 10-48
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
• F = 1.132
•
3.3.2.4.4.5 2'-désoxyadénine : Tests pour la linéarité de la "droite ADN"
calculé
F (0.05; 6; 24) = 2.508
• p du Fcalculé = 0.374
Nous concluons à l'existence d'une association linéaire significative au seuil 0.05.
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons à la valeur tabulaire :
•
•
Ccalculé = 0.190
C (0.05; 9; 3) = 0.4027
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
• Fcalculé = 881
170
F (0.05; 1; 34) = 4.130 •
• p du Fcalculé = 7 x 10-26
Comme la probabilité du Fcalculé est extrêmement faible, nous concluons à l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validité de la droite de régression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 1.213 •
• F (0.05; 7; 27) = 2.373
• p du Fcalculé = 0.330
Nous concluons à l'existence d'une association linéaire significative au seuil 0.05.
3.3.2.4.5 Résumé de l'étude de linéarité
Pour résumer les principales conclusions de cette étude, le Tableau 3.3-17 compare les
caractéristiques et résultats des tests statistiques pour les "droites aqueuses moyennes" et
"droites ADN moyennes".
3.3.2.5 Discussion et conclusion
Afin de prendre en compte tous les paramètres analytiques, les protocoles recommandent
d'enrichir en analytes aussi tôt que possible dans la procédure. Comme des bases nucléiques
extractibles ne peuvent être introduites de manière exacte dans les lysats cellulaires47, nous
avons décidé d'enrichir de l'ADN extrait juste avant l'étape de digestion enzymatique. Les
solutions d'ADN sont cependant relativement visqueuses et leur dispensation en aliquotes s'est
avérée particulièrement délicate. Ainsi, pour les bases normales, dont les taux endogènes sont
élevés par rapport aux enrichissements, ces variations inévitables dans la dispensation de
l'ADN se reflètent dans les courbes de calibration "droites ADN" et dans leurs coefficients de
détermination. Ce problème n'est quasi pas apparent pour la 8-oxodG dont le taux endogène
est similaire aux enrichissements les plus bas.
Même dans ces conditions peu favorables, nous pouvons conclure que la méthode
d'analyse présente une excellent linéarité. En pratique quotidienne, la quantification des
échantillons est donc réalisée à partir de 2 étalons injectés en duplicata.
47 Le problème se posait principalement pour la 8-oxodG.
171
Tableau 3.3-17 : Résumé de l'étude de linéarité
Base Zone de concentration (a)
8-oxodG 0.2 – 32 pmoles
dG 0.3 – 41 nmoles
dT 0.3 – 41 nmoles
dA 0.3 – 44 nmoles
Solutions aqueuses
n 32 32 32 32
Coefficient de détermination R² 0.990 0.998 0.998 0.997
Ord. origine ± écart étalon 1679 ± 10391 -1323 ± 980 197 ± 276 311 ± 677
Pente ± écart étalon 35957 ± 647 5157 ± 47 1616 ± 13 3097 ± 30
p du test de Cochran (homoscédasticité)
p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05
Transformation éventuelle log - log log - log log - log log - log
p du test pour l'existence d'une pente
8 x 10-40 *** 2 x 10-56 *** 2 x 10-49 *** 1 x 10-48 ***
p du test de défaut d'ajustement 0.002 ** 0.0006 *** 0.120 NS 0.374 NS
Solutions ADN
n 36 32 36 36
Coefficient de détermination R² 0.993 0.975 0.942 0.963
Ord. origine ± écart étalon 4441 ± 8174 58115 ± 2360
non
24223 ± 1335 51265 ± 2154
Pente ± écart étalon 36473 ± 540 5304 ± 155 1607 ± 68 3038 ± 102
p du test de Cochran (homoscédasticité)
p > 0.05 NS p > 0.05 NS p > 0.05 NS p > 0.05 NS
Transformation éventuelle non non non
p du test pour l'existence d'une pente
8 x 10-38 *** 1.5 x 10-25 *** 1 x 10-22 *** 7 x 10-26 ***
p du test de défaut d'ajustement 0.945 NS 0.288 NS 0.197 NS 0.330 NS
p du test pour le parallélisme de la "droite aqueuse" et de la "droite ADN"
0.543 NS 2.000 NS 0.893 NS 0.583 NS
(a) enrichissement pour 100 µl
3.3.2.6 Linéarité de la 8-oxodG sur le détecteur CC-5
Pour la 8-oxodG, la zone inférieure de cette étude de linéarité (200 fmoles) est supérieure
à notre "limite de quantification"; en effet, les extraits d'échantillons non stressés nous
amènent à injecter des quantités de l'ordre de 100 fmoles, qui devient donc notre limite
obligée.
En cours de travail, nous avons eu l'occasion de transférer notre méthode sur un détecteur
ampérométrique légèrement plus sensible, le détecteur CC-5; nous avons profité de l'occasion
pour réaliser une courte étude de linéarité sur étalons aqueux aux niveaux bas de
172
concentration. Entre les jours d'injection, le flux a été coupé de manière à éviter une
passivation de l'électrode.
3.3.2.6.1 Résultats
Le Tableau 3.3-18 et la Figure 3.3-13 présentent les résultats sur 3 jours d'analyse. Le
Tableau 3.3-19 résume les paramètres de la droite moyenne.
Tableau 3.3-18 : Etude de linéarité pour la 8-oxodG sur le détecteur électrochimique CC-5
Signal pour 1 nAFS
Quantité injectée (pmoles)
Jour 1 Jour 2 Jour 3
4.196 314640 305516 346694
1.574 121098 114549 126586
1.049 83179 75343 81195
0.525 47587 42075 38094
0.262 23698
12100
19763 19788
0.105 8698 8497
Figure 3.3-13 : 8-oxodG. Solutions aqueuses. Points expérimentaux mesurés pendant les 3 jours et droite de régression moyenne.
(R² = 0.994)
0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
3.0E+05
3.5E+05
4.0E+05
0 1 1 2 2 3 3 4 4 5
Enrichissement (pmoles / 100 µl)
Sign
al
Jour 1Jour 2Jour 3
173
Tableau 3.3-19 : Résumé de l'étude de linéarité sur détecteur CC-5
0.1 – 4.2 pmoles
Base Zone de concentration (a)
8-oxodG
Solutions aqueuses
n 18
Coefficient de détermination R² 0.994
Ord. origine ± écart étalon 1193 ± 2683
p du test de Cochran (homoscédasticité)
Pente ± écart étalon 76412 ± 1416
p < 0.05
Transformation log - log
p du test pour l'existence d'une pente
1 x 10-18 ***
p du test de défaut d'ajustement 0.780 NS
3.3.2.6.2 Conclusion
Cette courte étude nous permet de constater que le détecteur CC-5 présente également une
réponse linéaire, qui se poursuit au moins jusqu'à 100 fmoles. Le problème de passivation de
l'électrode (§ 3.3.2.4.1.3) semble entièrement résolu lorsque le flux chromatographique est
coupé entre les séquences d'analyse.
3.3.3 Exactitude
3.3.3.1 Définition
L'exactitude exprime l'étroitesse de l'accord entre la valeur qui est acceptée comme vraie
et la valeur trouvée. Elle est le plus souvent exprimée en terme de pourcentage de
recouvrement par le dosage de quantités d'analyte connues ajoutées (Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
3.3.3.2 Protocole
3.3.3.2.1 Calcul des taux de recouvrement
Les résultats obtenus lors de l'étude de linéarité ont permis d'évaluer la validité des droites
mesurées en solution aqueuse et en présence de la matrice biologique et de les comparer;
l'exactitude est estimée sur base des données obtenues en présence de la matrice biologique
("droite ADN") par rapport au système de référence considéré, la droite d'étalonnage réalisée
en milieu aqueux ("droite aqueuse").
174
Pour chaque point expérimental, nous avons donc effectué le changement de variable
suivant :
%mentenrichisse
100.xb
ayYj
blanc1
1ii
−
−=
Dans cette équation, rappelons que Yi représente le taux de recouvrement, a1 et b1 sont les
coefficients de régression de la "droite aqueuse" considérée48, yi le signal mesuré pour le
niveau de concentration considéré (enrichissementj) et xblanc le niveau endogène estimé à
partir de la "droite ADN" par la méthode des ajouts dosés49.
3.3.3.2.2 Test de validité des moyennes
Après avoir vérifié l'homoscédasticité par le test de Cochran (§ 3.3.2.3.5), nous avons
testé la validité des moyennes en comparant les erreurs inter-groupes et les erreurs intra-
groupes. Les variances ont donc été réparties suivant le Tableau 3.3-20.
Tableau 3.3-20 : Test pour la validité des moyennes
F calculé Source de variation ddl Somme des carrés Variance
Variation totale N - 1 ( )∑ ∑∑= =
−=k
1j
nj
1i
2ij YY²T
Variation intra-groupes N - k ( )∑ ∑
=−=
k
1j
2jjj YY.n.²b²E
kN²E
²s E −= ∑
Variation inter-groupes k - 1 ∑ ∑ ∑−= ²E²T²C
1k²C
²s C −= ∑
E
C
²s²sF =
Si le F calculé est inférieur au F tabulaire F(α; k - 1; N - k), les moyennes sont considérées
comme valides, au seuil de probabilité considéré car les variations des observations entre les
différents groupes sont dues aux erreurs expérimentales. La probabilité exacte du F calculé est
obtenue par la fonction "LOI.F" du tableur Excel.
48 "Droite aqueuse du jour" pour la 8-oxodG, de manière à tenir compte du phénomène de passivation de l'électrode; "droite aqueuse moyenne" pour les autres bases 49 Nous avons préféré estimer le taux endogène par la méthode des ajouts dosés; en effet, la précision sur les mesures blanc est médiocre en raison (i) pour la 8-oxodG, de signaux extrêmement proches de la limite de détection; et (ii) pour les autres bases, du problème de dispensation de la solution visqueuse d'ADN.
175
3.3.3.2.3 Calcul du recouvrement moyen
La moyenne, l'écart étalon et l'intervalle de confiance du recouvrement ont été calculés
pour tous les niveaux d'enrichissement considérés.
L'intervalle de confiance est calculé classiquement :
Ns.t )1N;( −α±
3.3.3.3 Résultats
3.3.3.3.1 Dosage de la 8-oxodG
3.3.3.3.1.1 Données
Le Tableau 3.3-21 présente les données transformées.
Tableau 3.3-21 : Taux de recouvrement pour la 8-oxodG
Enrichissement pmoles ajoutéesdans 100 µl Jour Taux de recouvrement
(%) 1 31.45 1 100.59 2 102.14 3 104.54 4 105.71
2 24.19 1 102.04 2 99.67
100.81 17.97 1
3 99.84 4
3 99.05 2
100.06 11.79 1
98.89 3 100.57
4 4 99.75 2 98.62 3 98.59 99.17 4
5 5.24 1 103.30 2
98.93 3 103.24
4 98.78 6 1.05
1 108.62 2 100.31 3 108.26
4 109.22
176
Tableau 3.3-21 (Suite) : Taux de recouvrement pour la 8-oxodG
Enrichissement pmoles ajoutéesdans 100 µl Jour Taux de recouvrement
(%) 0.52
2 110.24 3 (127.26) 4 103.72
8 0.21 1 2 (149.23) 3 (189.42) 4
7 1 102.22
(167.67)
(107.55)
3.3.3.3.1.2
Les points obtenus pour l'enrichissement 8 s'écartent fortement de 100 %, ce qui peut
s'expliquer par la variabilité dans la dispensation de l'ADN. Cet enrichissement est en effet
particulièrement faible (210 fmoles), proche du taux de base; ce niveau de concentration ne
sera donc pas pris en compte pour la suite de l'étude.
Le point "127.26" de l'enrichissement 7 semble être une valeur aberrante. La taille de
l'échantillon (n = 4) est trop faible pour tester cette valeur (Kringle, 1994). Nous l'écartons
néanmoins pour la même raison que ci-dessus.
Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.364 •
• C(0.05; 7; 3) = 0.4800
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de validité des moyennes
Le F de Fischer est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 2.427 •
• F(0.05; 6; 21) = 2.573
• p du Fcalculé = 0.063 NS
Nous concluons que les variations entre les observations des différents groupes sont bien
dues à l'erreur expérimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
• Recouvrement moyen = 102.11
Ecart étalon = 3.54 •
177
•
• Intervalle de confiance du biais = de 0.7 à 3.5
Intervalle de confiance (p = 0.05) = de 100.7 à 103.5
(p = 0.05)
Le biais, bien que statistiquement significatif au seuil 0.05, est peu important; en effet,
avec un écart étalon de 3.54, la limite supérieure de confiance du biais est inférieure à s, c'est-
à-dire à la répétabilité de la méthode.
3.3.3.3.2 Dosage de la 2'-désoxyguanosine
3.3.3.3.2.1 Données
Le Tableau 3.3-22 présente les données transformées.
Tableau 3.3-22 : Taux de recouvrement pour la 2'-désoxyguanosine
Enrichissement nmoles ajoutéesdans 100 µl Jour Taux de recouvrement
(%) 2 31.66 1 106.82 2 92.27 3
4 1
97.29 99.58
3 23.52 118.33 2 113.07 3 93.31 4 111.43
4 15.43 1 116.94 2 111.59 3 88.38 4 107.98
5 6.86 1 134.73 2 123.18 3 126.22 4 96.41
6 1.37 1 (-80.78) 2 (184.23) 3 (-8.93) 4 (181.26)
7 0.69 1 (-406.39) 2 (334.83) 3 (-28.92) 4 (321.05)
8 0.27 1 (746.89) 2 (153.07) 3 (669.64) 4 (117.10)
178
Les points obtenus pour les enrichissements 6 à 8 s'écartent fortement de 100 %, ce qui
peut s'expliquer par la variabilité dans la dispensation de l'ADN. Ces enrichissements sont en
effet faibles, proches du taux de base endogène; ces niveaux de concentration ne seront donc
pas pris en compte pour la suite de l'étude.
3.3.3.3.2.2 Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.469 •
• C(0.05; 4; 3) = 0.6841
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de validité des moyennes
Le F de Fischer est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 2.111 •
• F(0.05; 3; 12) = 3.490
• p du Fcalculé = 0.152 NS
Nous concluons que les variations entre les observations des différents groupes sont bien
dues à l'erreur expérimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
• Recouvrement moyen = 108.6
•
•
Le biais, statistiquement significatif au seuil 0.05, est certainement dû aux problèmes de
dispensation des solutions aqueuses d'ADN (colloïde réversible fortement visqueux).
Ecart étalon = 13.36
Intervalle de confiance (p = 0.05) = de 101.5 à 115.7
• Intervalle de confiance du biais (p = 0.05) = de 1.5 à 15.7
3.3.3.3.3 Dosage de la thymidine
3.3.3.3.3.1 Données
Le Tableau 3.3-23 présente les données transformées.
179
Tableau 3.3-23 : Taux de recouvrement pour la thymidine
Enrichissement nmoles ajoutéesdans 100 µl Jour Taux de recouvrement
(%) 1 40.51 1 95.04 2 79.92 3 92.71 4 101.44
2 31.17 1 107.41 2 78.55 3 82.16 4 99.50
3 23.15 1 112.38 2 111.53 3 110.48 4 100.01
4 15.19 1 122.59 2 114.05 3 69.17 4 108.42
5 6.75 1 150.02 2 129.96 3 128.75 4 71.07
6 1.35 1 (-330.95) 2 (32.90) 3 (-310.86) 4 (187.97)
7 0.68 1 (-1001.11) 2 (452.24) 3 (-500.84)
4 (354.56) 8 0.27 1 (987.70) 2 (-1283.41) 3 (573.41) 4 (-950.13)
Les points obtenus pour les enrichissements 6 à 8 s'écartent fortement de 100 %, ce qui
peut s'expliquer comme précédemment (cf §3.3.3.3.2 ).
180
3.3.3.3.3.2 Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.572 •
• C(0.05; 5; 3) = 0.5981
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
b. Test de validité des moyennes
Le F de Fischer est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 1.376 •
• F(0.05; 4; 12) = 3.056
• p du Fcalculé = 0.289 NS
Nous concluons que les variations entre les observations des différents groupes sont bien
dues à l'erreur expérimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
• Recouvrement moyen = 103.3
Ecart étalon = 13.36 •
• Intervalle de confiance (p = 0.05) = de 93.5 à 113.0
• Intervalle de confiance du biais (p = 0.05) = de - 6.5 à 13.0
Il n'y a aucun biais dans la détermination de dT; l'imprécision relative (14 %) est due aux
problèmes de dispensation des solutions visqueuses d'ADN.
3.3.3.3.4 Dosage de la 2'désoxyadénosine
3.3.3.3.4.1 Données
Le Tableau 3.3-24 présente les données transformées.
Les points obtenus pour les enrichissements 6 à 8 s'écartent fortement de 100 %, ce qui peut
s'expliquer comme précédemment (cf §3.3.3.3.2 ).
181
Tableau 3.3-24 : Taux de recouvrement pour la 2'désoxyadénosine
Enrichissement nmoles ajoutéesdans 100 µl Jour Taux de recouvrement
(%) 1 43.70 1 95.17 2 79.45 3 91.41 4 99.48
2 33.61 1 107.21 2 82.64 3 86.21 4 100.79
3 24.97 1 106.69 2 101.12 3 105.55 4 95.73
4 16.39 1 109.10 108.20 2 3 72.12 4 104.61
5 7.28 1 124.22 2 112.10 3 126.71 4 69.32
6 1.46 1 (-317.01) 2 (64.21) 3 (-202.39) 4 (154.25)
7 0.73 1 (-851.98) 2 (245.70) 3 (-362.81) 4 (251.86)
8 0.29 1 (528.59) 2 (-470.63) 3 (388.23) 4 (-563.03)
3.3.3.3.4.2 Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homogénéité des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Ccalculé = 0.564 •
• C(0.05; 5; 3) = 0.5981
Comme le Ccalculé est inférieur au Ctabulé, les variances peuvent être considérées homogènes
au seuil de probabilité 0.05.
182
b. Test de validité des moyennes
Le F de Fischer est calculé et comparé à la valeur tabulaire :
Fcalculé = 0.694 •
• F(0.05; 4; 12) = 3.056
• p du Fcalculé = 0.608 NS
Nous concluons que les variations entre les observations des différents groupes sont bien
dues à l'erreur expérimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
• Recouvrement moyen = 98.9
Ecart étalon = 15.3 •
• Intervalle de confiance (p = 0.05) = de 91.7 à 106.1
• Intervalle de confiance du biais (p = 0.05) = de - 8.3 à 6.1
Il n'y a aucun biais dans la détermination de dA; l'imprécision relative (15 %) est due aux
problèmes de dispensation des solutions visqueuses d'ADN.
3.3.3.3.5 Résumé de l'étude d'exactitude
Afin de résumer les principales conclusions de cette étude, le Tableau Tableau 3.3-25
compare les résultats obtenus pour les différentes bases.
Tableau 3.3-25 : Résumé de l'étude relative à l'exactitude 8-oxodG dG dT dA
Niveau enrichi
(pmoles)
Taux de recouvrt
% (m ± s)
Niveau enrichi
(nmoles)
Taux de recouvrt
% (m ± s)
Niveau enrichi
(nmoles)
Taux de recouvrt
% (m ± s)
Niveau enrichi
(nmoles)
Taux de recouvrt
% (m ± s)
31.45 103 ± 6 41.16 (plafonne) 40.51 92 ± 9 43.70 91 ± 9
24.19 101 ± 9 31.66 99 ± 6 31.17 92 ± 14 33.61
120 ± 34
107 ± 7
n 28
94 ± 12
17.97 100 ± 7 23.52 109 ± 11 23.15 109 ± 6 24.97 102 ± 5
11.79 99 ± 8 15.43 106 ± 13 15.19 104 ± 24 16.39 99 ± 18
5.24 101 ± 9 6.86 120 ± 17 6.75 7.28 109 ± 27
1.05
0.52 112 ± 7
16 20 20
p du test de Cochran p > 0.05 NS p > 0.05 NS p > 0.05 NS p > 0.05
p du test de validité des moyennes
NS
0.063 NS 0.152 NS 0.289 NS 0.608 NS
intervalle de confiance du biais
0.7 à 3.5 1.5 à 15.7 - 6.5 à 13.0 - 8.3 à 6.1
183
3.3.3.4 Discussion et conclusion
Le taux de recouvrement moyen est proche de 100 % pour les 4 bases étudiées. Les écarts
étalons relativement élevés observés pour dG, dT et dA, ainsi que le biais de dG proviennent
de la précision de la méthode mais surtout de la difficulté inhérente à une dispensation
correcte des solutions visqueuses d'ADN.
Même dans ces conditions peu favorables, la méthode permet d'obtenir une exactitude
largement acceptable.
3.3.4 Précision
3.3.4.1 Définition
La précision, ou fidélité, d'une procédure d'analyse exprime l'étroitesse de l'accord entre
les résultats de tests individuels lorsque la procédure est appliquée de manière répétée sur des
prises d'essai multiples d'un échantillon homogène. La précision dépend de facteurs tels que
l'opérateur, l'équipement, l'environnement, le temps et les réactifs. Elle peut être étudiée à
2 niveaux : (i) la répétabilité "intra-jour", qui exprime la précision sous les mêmes conditions
opératoires pendant un intervalle de temps court; et (ii) la reproductibilité, qui exprime la
variabilité "inter-jours", ou "totale" (Caporal-Gautier et al., 1992; Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
3.3.4.2 Protocole
3.3.4.2.1 Préparation des échantillons
Ces paramètres ont été étudiés sur des échantillons de cellules P388D1 "blancs"50 et
stressées à 3 niveaux différents; les cellules ont été exposées aux UVC à 3 temps d'irradiation
différents (5, 10 et 15 min) en présence de 20 mM d'H2O2, dispensées en parties aliquotes
d'environ 107 cellules et stockées à –20°C sous tampon H. Tous les échantillons ont été
analysés au cours de 4 jours différents en triplicate (3 répétitions du processus analytique
complet, y compris l'extraction de l'ADN). Après les 2 premiers jours, l'électrode a été polie
avec du méthanol pour vérifier que l'état de surface de l'électrode51 n'influait pas sur les
résultats analytiques.
50 Non stressés 51 Cette expérience a été réalisée avant de découvrir l'origine de l'effet de passivation de l'électrode
184
3.3.4.2.2 Analyse des résultats
Notre schéma expérimental offre l'avantage d'estimer plusieurs composantes de
l'imprécision en poolant plusieurs spécimens et jours d'analyse, et ce par une analyse de
variance.
3.3.4.2.2.1 Conditions d'application
Les conditions d'application de l'analyse de variance sont les suivantes : (i) toutes les
observations sont statistiquement indépendantes l'une de l'autre; (ii) chaque observation
provient d'une population de distribution normale ou proche de la normalité; et (iii) chaque
observation a la même variance de population (homoscédasticité).
De par la nature des erreurs dans un dosage chromatographique, nous avons considéré
dans ce travail que les observations se distribuaient a priori de manière normale ou proche de
la normale. Le nombre d'observations par groupe (3) nous semble trop faible pour tester
l'homogénéité des variances, aussi supposerons-nous une homoscédasticité.
3.3.4.2.2.2 Liste des symboles
Soient I jours, J spécimens (niveaux de concentration) et K réplicats par échantillon.
On définit : 1. la moyenne de chaque échantillon : K
xx
K
1kijk
.ij
∑==
2. la moyenne de chaque jour : JK
xx
J
1j
K
1kijk
..i
∑ ∑= ==
3. la moyenne de chaque spécimen : IK
xx
I
1i
K
1kijk
.j.
∑∑= ==
4. la moyenne globale : IJK
x...x
I
1i
J
1j
K
1kijk∑ ∑ ∑
= = ==
3.3.4.2.2.3
Analyse de variance 2 facteurs
Les données ont été analysées pour la dG, la 8-oxodG et le rapport 8-oxodG par 105 dG
par une analyse de variance à 2 facteurs (2-way analysis of variance) avec 2 effets aléatoires,
jour et spécimen (ou niveau de stress) qui a permis de répartir les variances selon le Tableau
3.3-26 (Kleinbaum et Kupper, 1978).
185
Tableau 3.3-26 : Analyse de variance 2 niveaux appliquée à l'étude de la précision
Source de variation
ddl Somme des carrés Carré moyen F calculé (a)
Variation due au jour I - 1 ( )∑ ∑
=−=
I
1i
2..i ...xx²D
1I²D
²s D −= ∑ I
D
²s²s
Variation due au spécimen J - 1 ( )∑ ∑
=−=
J
1j
2.j. ...xx²S
I
S
²s²s
Interaction jour X spécimen (I - 1)(J - 1) ∑∑ ∑ ∑ ∑ −−−= ²R²S²D²T²I
)1I)(1J(²I
²s I −−= ∑ R
I
²s²s
Variation résiduelle IJ(k - 1) ( )∑ ∑ ∑
= =−=
I
1i
J
1j
2...ij x.x²R
)1K(IJ²R
²s R−
= ∑
Variation totale IJK - 1 ( )∑ ∑ ∑ ∑= = =
−=I
1i
J
1j
K
1k
2ijk ...xx²T
1J²S
²s S −= ∑
1IJK²T
²s T−
= ∑
(a) Comme nous considérons 2 effets aléatoires, les 2 premières statistiques F sont calculées par rapport à la
variance de l'interaction (Kleinbaum et Kupper, 1978).
Les composantes de la variance représentent l'incrément de la variance totale résultant du
facteur considéré; elles sont calculées comme suit (Anderson et Bancroft, 1952; Kleinbaum et
Kupper, 1978) :
• Composante jour = JK²S²S ID −
• Composante spécimen = IK²S²S IS −
Composante interaction = K²S²S rI − •
• Composante résiduelle = S²R
Ce qui permet d'estimer les coefficients de variation et donc la précision analytique
(Anderson et Bancroft, 1952) :
• CV% (Précision intra-jour) = ...x
100*résiduelleComposante
CV% (Précision totale) =...x
100*jours-interComposanterésiduelleComposante + •
186
3.3.4.3 Résultats
3.3.4.3.1 Données
Le Tableau 3.3-27 présente les données des dosages dans l'ADN cellulaire; les résultats
sont exprimés en pmoles de 8-oxodG, en nmoles de dG et en 8-oxodG par 105 dG.
Tableau 3.3-27 : Résultats des dosages dans l'ADN cellulaire
Echantillon 8-oxodG
(pmoles/100 µl) dG
(nmoles/100 µl) 8-oxodG
par 105 dG
Jour 1 Blanc - 1 0.14 16.59 0.83
Blanc - 2 0.17 16.73 1.03
Blanc - 3 0.16 16.97 0.97
5 min - 1 3.50 15.76 22.22
5 min - 2 3.36 15.48 21.68
5 min - 3 3.29 15.45 21.28
10 min - 1 5.16 14.19 36.34
10 min - 2 5.10 14.74 34.58
10 min - 3 5.50 15.25
36.07
15 min - 1 6.69 14.80 45.18
15 min - 2 6.48 14.45 44.88
15 min - 3 6.90 15.73 43.91
Jour 2 Blanc - 1 0.16 14.57 1.12
Blanc - 2 0.15 14.63 1.01
Blanc - 3 0.15 16.73 0.88
5 min - 1 3.26 15.00 21.75
5 min - 2 3.11 14.50 21.45
5 min - 3 3.56 16.14 22.04
10 min - 1 5.31 14.69 36.11
10 min - 2 5.51 15.15 36.39
10 min - 3 5.53 15.87 34.81
15 min - 1 7.37 16.16 45.62
15 min - 2 7.08 15.67 45.22
15 min - 3 7.21 16.24 44.38
Jour 3 Blanc - 1 0.15 17.07 0.87
Blanc - 2 0.23 17.05 1.33
Blanc - 3 0.10 10.66 0.93
187
Tableau 3.3-27 (Suite) : Résultats des dosages dans l'ADN cellulaire
Echantillon 8-oxodG
(pmoles/100 µl) dG
(nmoles/100 µl) 8-oxodG
par 105 dG
Jour 3 5 min - 1 3.60 17.19 20.96
(suite) 5 min - 2 3.54 16.92 20.92
5 min - 3 3.34 15.96 20.94
10 min - 1 5.60 16.03 34.94
10 min - 2 5.67 16.43 34.48
10 min - 3 5.90 16.41 35.95
15 min - 1 6.63 15.59 42.54
15 min - 2 7.81 17.50 44.62
15 min - 3 6.45 15.28 42.22
Jour 4 Blanc - 1 0.17 15.28 1.08
Blanc - 2 0.18 14.30 1.27
Blanc - 3 0.15 12.13 1.24
5 min - 1 2.67 11.25 23.77
5 min - 2 3.63 15.76 23.04
5 min - 3 3.72 17.09 21.75
10 min - 1 4.68 14.34 32.62
10 min - 2 5.32 15.14 35.12
10 min - 3 5.41 15.38 35.17
15 min - 1 7.42 16.55 44.85
15 min - 2 6.91 15.91 43.43
15 min - 3 7.25 16.34 44.38
3.3.4.3.2 Analyse de variance pour la 8-oxodG
Le Tableau 3.3-28 présente l'analyse de variance pour le dosage de la 8-oxodG exprimée
en pmoles de 8-oxodG par 100 µl de milieu de digestion (ce qui correspond à 3.35 x 107
cellules). Nous observons l' effet "spécimen" attendu, mais ni effet "jour", ni interaction "jour
X spécimen".
188
Tableau 3.3-28 : Analyse de variance pour la 8-oxodG (exprimée en pmoles/100 µl )
Source de variation ddl Somme des
carrés Carré moyen F Probabilité du F observé Signification Variance CV %
Jour 3 0.31 0.10 1.07 0.410 NS 0.001 0.68
Spécimen 3 314.04 104.68 1066.50 8 x 10-12 *** 8.72 74.04
J X S 9 0.88 0.10 1.17 0.347 NS 0.005 1.72
Résidu 32 2.69 0.08 0.08 7.27
Totale 47 317.93
• CV% intra-jour = 7.27 %
• CV% total = 7.29 %
3.3.4.3.3 Analyse de variance pour la dG
Le Tableau 3.3-29 présente l'analyse de variance pour le dosage de la dG exprimée en
nmoles de dG par 100 µl de milieu de digestion (ce qui correspond à 3.35 x 107 cellules).
Nous n'observons ni effet "spécimen", ni effet "jour", ni interaction "jour X spécimen". Il n'y a
donc aucun effet du stress étudié sur l'extractabilité de l'ADN.
Tableau 3.3-29 : Analyse de variance pour la dG (exprimée en nmoles/100 µl )
Source de variation ddl Somme des
carrés Carré moyen F Probabilité du F observé Signification Variance CV %
Jour 3 6.70 2.23 1.02 0.429 NS 0.003 0.44
Spécimen 3 2.85 0.95 0.43 0.734 NS -0.10 -----
J X S 9 19.71 2.19 1.12 0.379 NS 0.08 1.79
Résidu 32 62.75 1.96 1.96 9.05
Totale 47 92.01
• CV% intra-jour = 9.05 %
• CV% total = 9.05 %
3.3.4.3.4 Analyse de variance pour la 8-oxodG par 105 dG
Le Tableau 3.3-30 présente l'analyse de variance pour le dosage de la 8-oxodG exprimée
en 8-oxodG par 105 dG. Comme le montrent les coefficients de variation, la précision est
nettement améliorée par l'emploi de dG comme étalon interne, ce qui permet d'éliminer le
paramètre du rendement de l'extraction d'ADN.
189
Tableau 3.3-30 : Analyse de variance pour la 8-oxodG (exprimée en 8-oxodG par 105 dG )
Source de variation ddl Somme des
carrés Carré moyen F Probabilité du F observé Signification Variance CV %
Jour 3 4.84 1.61 1.30 0.333 NS 0.03 0.79
Spécimen 3 3407.02
2.26 *
12731.06
12697.41 4232.47 4.6 x 10-14 *** 352.60 73.39
J X S 9 11.18 1.24 0.044 0.23 1.88
Résidu 32 17.63 0.55 0.55 2.90
Totale 47
• CV% intra-jour = 2.90 %
• CV% total = 2.98 %
Nous observons l'effet "spécimen" attendu, mais pas d'effet "jour". Avec la précision
améliorée, nous constatons à présent une légère interaction jour X spécimen (p = 0.044).
L'examen des données nous montre que cette interaction devrait être principalement due aux
échantillons blanc, peut-être à cause d'une oxydation artefactuelle en cours de stockage
(l'étendue de variation des données varie de 0.83-1.03, jour 1; 0.88-1.12, jour 2; 0.87-1.33,
jour 3; 1.08-1.24, jour 4; n = 3).
Figure 3.3-14 : Relation entre le contenu en 8-oxodG et le niveau de stress (temps
d'irradiation UVC en présence de 20 mM H2O2). Les points représentent la moyenne (n = 12, excepté pour le temps 2 min, où n = 3) et les barres l'écart étalon.
0
10
20
30
40
0 4 8 12 1
Temps d'irradiation (min)
8-ox
odG
/ 10
5 dG
6
190
La Figure 3.3-14 met en évidence la précision par rapport aux niveaux de 8-oxodG induits
par les conditions de stress appliquées.
3.3.4.4 Discussion et conclusion
A notre connaissance, jusqu'à ce travail, pratiquement aucune donnée n'a été publiée quant
à la précision du dosage de la 8-oxodG. Les seules données disponibles, obtenues sur des
échantillons non stressés, font état d'une variation d'environ 14 %, mais aucune analyse
statistique n'a été entreprise (Takeuchi et al., 1994).
Le dosage de la dG n'est influencé par aucun des facteurs étudiés, "spécimen" (niveau de
stress) et "jour d'analyse". D'autre part, le dosage de la 8-oxodG permet de différencier les
niveaux de stress des différents échantillons sans influence du facteur "jour d'analyse". Le
calcul des résultats en "8-oxodG par 105 dG" permet de réduire la variabilité d'extraction de
l'ADN et de ramener la précision à un excellent niveau (CV %, ~ 3 %). Si nous considérons
que le plus gros de la variation rencontrée dans l'analyse des bases provient de l'extraction de
l'ADN, une variation globale de 7 à 9 % dans le recouvrement de l'ADN peut être estimée, le
taux de recouvrement étant indépendant du niveau de stress et du jour d'analyse.
Ce travail indique également que les nombreuses modifications de l'ADN induites par un
traitement agressif, oxydation et irradiation UVC, n'empêchent pas la digestion par la
nucléase P1. Ce résultat est important car , lorsque nous avons commencé cette étude,
l'efficacité de cette enzyme était fréquemment mise en doute dans la littérature, notamment
lors de la controverse née de la discordance entre les résultats obtenus par HPLC-EC et GC-
MS (Cadet et al., 1998; Dizdaroglu, 1998; Dizdaroglu et al., 2001).
3.3.5 Sensibilité
3.3.5.1 Définition
La sensibilité est la capacité de la méthode à réagir à de faibles variations de la
concentration en analyte. Il s'agit de la variation minimale qu'il faut imposer à la grandeur à
déterminer (la concentration en analyte) pour obtenir une variation significative du signal
mesuré (Caporal-Gautier et al., 1992).
3.3.5.2 Protocole
La sensibilité a été estimée à partir des résultats bruts de l'étude de précision.
Une sensibilité en rapport avec les mesures de routine a été déterminée, c'est-à-dire que le
signal brut du détecteur a été d'abord corrigé par le signal d'un étalon externe de 8-oxodG
(moyenne de 4 injections); ceci permet de moduler les variations jour à jour de la réponse
191
électrochimique et de tenir compte de la passivation de l'électrode. Comme il est impossible
d'introduire des taux connus de 8-oxodG dans l'ADN cellulaire, la grandeur "concentration en
analyte" a été estimée à partir des données du premier jour de l'étude de précision; nous avons
ainsi considéré que le premier essai triplicate dosait de manière exacte les différentes
concentrations. Cette supposition raisonnable est confortée par la bonne répétabilité du
processus analytique.
3.3.5.3 Calcul
La courbe "réponse du détecteur" en fonction de "concentration"et la variabilité totale ont
été calculées à partir des données des 3 jours suivants pour estimer la sensibilité; celle-ci est
calculée à partir de la pente (b) de la courbe et de l'écart étalon du signal (SE) estimé à partir
d'une analyse de variance identique à celle de l'étude de précision.
La sensibilité, la variation minimale de concentration en analyte qui donne une variation
détectable du signal, est alors calculée :
Sensibilité = bSE
Une sensibilité statistiquement significative, c'est-à-dire la variation minimale de
concentration en analyte qui donne une variation statistiquement significative du signal, est
alors calculée en accord avec (Caporal-Gautier et al., 1992) :
Sensibilité = [ ] bS.2.t t E2/1
1)-N ;1(1)-N /2;1( β−+ α−
3.3.5.4 Résultats
3.3.5.4.1 Données
Le Tableau 3.3-31 présente les résultats bruts qui ont permis de calculer la sensibilité. Les
Figures 3.3-15 et 3.3-16 présentent les courbes "signal" en fonction de "concentration".
192
Tableau 3.3-31 : Résultats bruts de l'étude de précision (Concentrations estimées à partir du jour 1; Signaux obtenus aux détecteurs, jours 2 à 4)
Concentration (pmoles inj) Jour dG
(signal) 8-oxodG (signal)
8-oxodG (signal corr. par un étalon externe(a))
8-oxodG (signal corr. par un
étalon externe et par dG)
0.16 2 143044 15726 0.131 9.179E-07
143581 14230 0.119 8.275E-07
164259 14162 0.118 7.198E-07
3 167586 14396 0.088 5.227E-07
167323 21927 0.133 7.974E-07
104625 9576 0.058 5.570E-07
4 147010 15075 0.094 6.422E-07
137576 16611 0.104 7.561E-07
116682 13718 0.086 7.362E-07
3.38 2 114266 108534 0.906 7.930E-06
110468 103457 0.864 7.819E-06
122909 118276 0.987 8.034E-06
3 123541 164433 1.001 8.099E-06
121629
114731
161643 0.984 8.086E-06
152622 0.929 8.094E-06
4 82851 117901 0.738 8.911E-06
116056 160064 1.002 8.637E-06
125848 163903 1.026 8.155E-06
5.25 2 111911 176449 1.473 1.316E-05
115390 183378 1.531 1.327E-05
120901 183774 1.534 1.269E-05
3 115209 255697 1.556 1.350E-05
118089 258643 1.574 1.333E-05
117940 269302 1.639 1.389E-05
4 105604 206213 1.291 1.223E-05
111533 234511 1.468 1.317E-05
113312 238584 1.494 1.318E-05
(a) Le standard externe est une solution aqueuse de 8-oxodG injectée à 4 reprises chaque jour
193
Tableau 3.3-31 (Suite) : Résultats bruts de l'étude de précision
Concentration (pmoles inj) Jour dG
(signal) 8-oxodG (signal)
8-oxodG (signal corr. par un
étalon externe)
8-oxodG (signal corr. par un
étalon externe et par dG)
6.69 2 123092 245198 2.047 1.663E-05
119317 235610 1.967 1.649E-05
123683 239693 2.001 1.618E-05
3 112059 302788 1.842 1.644E-05
125767 356388 2.169 1.724E-05
109839 294553 1.792 1.632E-05
4 121870 327214 2.049 1.681E-05
117161 304624 1.908 1.628E-05
120364 319785 2.002 1.664E-05
Figure 3.3-15 : Signal corrigé par l'étalon externe en fonction de la quntité injectée de 8-oxodG
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Quantité injectée (pmoles)
Sign
al c
orrig
é pa
rle
sta
ndar
d ex
tern
e
194
Figure 3.3-16 : Signal corrigé par l'étalon externe et par le signal de dG en fonction de la quantité injectée de 8-oxodG
0.0E+00
2.0E-06
4.0E-06
6.0E-06
8.0E-06
1.0E-05
1.2E-05
1.4E-05
1.6E-05
1.8E-05
2.0E-05
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Quantité injectée (pmoles)
Sign
al c
orrig
é pa
rle
sta
ndar
d ex
tern
e et
par
dG
3.3.5.4.2 Calcul de la sensibilité
La sensibilité a été calculée en exprimant le paramètre à déterminer, la concentration, en
8-oxodG et en 8-oxodG par 105 dG; l'influence de la correction du signal mesuré par l'étalon
de dG, déterminé en détection UV, a également été envisagée (Tableau 3.3-32).
Tableau 3.3-32 : Sensibilité du processus analytique entier
Régression "concentration" en fonction du "signal" (n = 36) Expression de la
concentration (x) Variance r² Pente
Sensibilité Sensibilité
statistiquement significative
8-oxodG (pmoles)
Le signal (y) est :
8.03 x 10-3 0.285 0.31 pmoles 8-oxodG 1.65 pmoles 8-oxodG
8.76 x 10-14 0.9963 2.44 x 10-6 0.12 pmoles 8-oxodG 0.64 pmoles 8-oxodG
8-oxodG par 105 dG
Le signal (y) est :
•
•
8.03 x 10-3 0.9833 0.042 2.13 8-oxodG par 105 dG
11.15 8-oxodG par 105 dG
8.76 x 10-14 0.9970 3.61 x 10-7 0.82 8-oxo-dG par 105 dG
4.31 8-oxodG par 105 dG
• 0.9829
•
corrigé par l'étalon externe (8-oxodG)
corrigé par l'étalon externe (8-oxodG) et l'étalon interne (dG)
corrigé par l'étalon externe (8-oxodG)
corrigé par l'étalon externe (8-oxodG) et l'étalon interne (dG)
195
3.3.5.5 Discussion et conclusion
La sensibilité statistiquement significative représente 1.65 pmoles de 8-oxodG injectées,
ce qui correspond à 11.15 8-oxodG par 105 dG; lorsque le signal électrochimique est corrigé
pour le recouvrement de l'ADN en utilisant dG comme étalon interne, la sensibilité est
sensiblement réduite, passant à 0.64 pmoles de 8-oxodG injectées, ce qui correspond à 4.31
8-oxodG par 105 dG.
3.3.6 Seuils de détection et de quantification
3.3.6.1 Définitions
Le seuil de détection est la plus petite quantité d'une substance à examiner dans un
échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme une valeur exacte. Le seuil de
détection est généralement un paramètre des essais limites.
Le seuil de quantification est la plus petite quantité d'une substance à examiner dans un
échantillon pouvant être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une précision
et une exactitude définies (Caporal-Gautier et al., 1992; Commission of the European
Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
Ces paramètres n'ont pas été investigués pour la dG; en effet, les quantités à détecter dans
les échantillons sont toujours fort importantes, largement supérieures aux limites analytiques.
3.3.6.2 Résultats et discussion
La limite inférieure de détection de la 8-oxodG a été définie classiquement comme la
quantité injectée donnant un rapport signal-bruit de 3, soit 0.05 pmoles ou 50 fmoles (Figure
3.3-17). La limite inférieure de quantification (n = 8; CV = 20 %) a été estimée au niveau du
signal le plus bas que nous ayons obtenu dans un échantillon non stressé, soit 0.1 pmoles ou
100 fmoles.
Bien que ces données soient du même ordre que la plupart de celles renseignées par les 28
laboratoires participant au projet ESCODD SCODD, 2001) ou celles
52 (Tableau 3.3-33) (E
rencontrées dans la littérature [limite de détection, 20 (Floyd et al., 1986; Laws et Adams,
1996), 40 (Schilderman et al., 1993), 70 (Rosen, 1997) et 250 (Herbert et al., 1996) fmoles],
certains auteurs présentent des limites impressionnantes qui nous sont tout à fait hors
d'atteinte [1.76 fmoles détectées avec (Adachi et al., 1995) ou sans (Nakae et al., 1995)
algorithme de réduction du bruit de fond].
52 ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage): projet européen de comparaison inter-laboratoires des méthodes de dosage de la 8-oxodG (cf § 3.3.9)
196
Figure 3.3-17 : Tracé typique obtenu pour une quantité de 50 fmoles de 8-oxodG.
-0.15
-0.1
-0.05
0 5 10
Temps (min)
Sign
al (n
A)
8-oxo-dG
Tableau 3.3-33 : Limites de détection telles que renseignées par les différents laboratoires participant au projet ESCODD.
Méthode analytique Limite de détection de la
8-oxodG Définition de la limite
CLHP- ampérométrie 50 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- ampérométrie 30 fmoles
CLHP- ampérométrie 1 nM
CLHP- coulométrie 50 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 30 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 75 fmoles Rapport signal / bruit > 5
CLHP- coulométrie 0.001 µM Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 16 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 20 fmoles Un pic clairement séparé de la ligne de base
CLHP- coulométrie <1 nM Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 1.25-2.5 fmoles (en fonction du bruit)
Rapport signal / bruit > 5
197
Tableau 3.3-33 (suite): Limites de détection telles que renseignées par les différents laboratoires participant au projet ESCODD.
Méthode analytique Limite de détection de la
8-oxodG Définition de la limite
CLHP- coulométrie 35 fmoles Rapport signal / bruit > 2
CLHP- coulométrie 10 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 0.1 nM Rapport signal / bruit > 5
CLHP- coulométrie 100 fmoles Dernier point de la courbe de calibration. Rapport signal / bruit satisfaisant
CLHP- coulométrie 50 fmoles %CV de réplicats < 10% Ecart statistiquement significatif entre 2 concentrations (p<0.05)
CLHP- coulométrie 0.1 nM Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 18 fmoles Basé sur rapport signal / bruit
CLHP- coulométrie 60 fmoles Un pic clairement séparé de la ligne de base
CLHP- coulométrie 15 fmoles Rapport signal / bruit > 5
CLHP- coulométrie 100 fmoles Rapport signal / bruit > 1.2
CLHP- coulométrie 20 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulométrie 50 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP-MS/MS 3.5 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP-MS/MS 2.5 fmoles Rapport signal / bruit > 3
GC/MS 50 fmoles
GC/MS n.a. Rapport signal / bruit > 2
GC-MS 1 fmoles Rapport signal / bruit > 3
3.3.7 Robustesse
3.3.7.1 Définition
La robustesse d'une procédure d'analyse est sa capacité à rendre des résultats exacts en
présence de faibles changements de conditions expérimentales susceptibles de se produire
dans l'utilisation de cette procédure (Caporal-Gautier et al., 1992; Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
3.3.7.2 Protocole
La robustesse a été classiquement étudiée par un plan factoriel en testant 4 paramètres
(Caporal-Gautier et al., 1992). Une variation expérimentale (2 niveaux) des paramètres
susceptibles de varier en routine et qui pourraient s'avérer critiques a été réalisée : (i) le
contenu en 8-oxodG de l'ADN (cellules exposées à 20 mM H2O2 sous irradiation UVC de 5 et
15 min); (ii) le contenu en méthanol de la phase mobile de CLHP (7.0 et 8.0 %); (iii) la
198
température de la colonne chromatographique (25°C et 35°C); et (iv) la quantité d'ADN
digérée et injectée (ADN de 107 et de 2 x 107 cellules). Une série de 8 analyses a permis de
tester ces 4 paramètres, l'interaction triple des 3 premiers paramètres étant affectée au
quatrième (aliasing). Les intervalles de confiance sont alors calculés pour la valeur "effet du
paramètre" à un niveau de probabilité de 0.05. Si cet intervalle de confiance contient zéro,
l'effet de ce paramètre ou de cette interaction est considéré comme nul. Si zéro est à l'extérieur
de l'intervalle, le résultat de la mesure est influencé par la variation des paramètres en cause.
3.3.7.3 Résultats
Le Tableau 3.3-34 présente les résultats de l'étude de robustesse.
Tableau 3.3-34 : Robustesse du procédé analytique
Echantillon Paramètre Interactions Résultat 8-oxodG / 105 dG
(a) B (b) C (c) D (d) A X B A X C B X C
1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 13.70
2 1 -1 -1 1 -1 -1 1 49.91
3 -1 1 -1 1 -1 1 -1 14.73
4 1 1 -1 -1 1 -1 -1 51.85
5 -1 -1 1 1 1 -1 -1 15.72
6 1 -1 1 -1 -1 1 -1 53.05
7 -1 1 1 -1
8 1
17.80
-1 -1 1 13.91
1 1 1 1 1 1 45.66
Effet du paramètre -0.78 -0.23 -0.81 -0.59 -0.53 -1.52
Intervalle de confiance (e) de : à :
1.79 33.82
-16.80 15.24
-16.25 15.78
-16.83 15.21
-16.60 15.43
-16.55 15.49
-17.54 14.50
NS NS NS Signification statistique (e) S NS NS NS
A
(a) Niveau de stress (H2O2 + UVC pendant 5 et 15 min) (b) % de méthanol dans la phase mobile (7 et 8 %) (c) t° de la colonne (25 et 35°C) (d) ADN de 107 et de 2 x 107 cellules(e) p = 0.05
199
3.3.7.4 Discussion et conclusion
Le seul paramètre significatif est en fait le "niveau de stress"; la méthode est donc robuste
face à de faibles variations dans les paramètres étudiés, à savoir le contenu en méthanol de la
phase mobile, la température de la colonne et la quantité d'ADN digérée.
3.3.8 Stabilité des analytes
3.3.8.1 Définition
Pour les biomarqueurs du stress oxydatif, un paramètre de validation supplémentaire
s'impose; il convient en effet de démontrer qu'il n'y a pas une production artefactuelle de ce
marqueur en cours de stockage, d'extraction et d'analyse.
3.3.8.2 Protocole
Une démonstration complète exigerait que le véritable taux de base de la 8-oxodG soit
établi par une méthode définitive, qui reste un défi analytique considérable et l'objet de
nombreuses controverses (Collins et al., 1996; Collins et al., 1997a; Cadet et al., 1998;
Dizdaroglu, 1998; Halliwell et Gutteridge, 1999). Nos avons donc étudié les sources possibles
d'artefact oxydatif de notre méthode.
Le processus analytique, relativement long, ne peut être réalisé en une seule journée de
travail; nous avons donc étudié les points d'arrêt possibles dans le processus ainsi que leur
effet sur le taux en dG oxydée : (i) stockage entre préparation de l'échantillon et extraction de
l'ADN; (ii) stockage entre extraction de l'ADN et digestion enzymatique; et (iii) stockage
entre digestion enzymatique et analyse CLHP.
3.3.8.3 Résultats
Le Tableau 3.3-35 démontre l'effet de suspension du processus analytique sur les taux
mesurés en 8-oxodG. Il s'avère qu'un stockage prolongé à chacune des différentes étapes tend
à augmenter l'oxydation artefactuelle de la dG. Soulignons notamment que le stockage entre
digestion enzymatique et chromatographie ne doit pas être prolongé, même à –20°C.
La chromatographie peut cependant être réalisée le jour de digestion avec une excellente
stabilité (Tableau 3.3-36).
200
Tableau 3.3-35 : Influence du stockage à différents points du processus analytique
Conditions de stockage
Stockage avant extraction
Stockage entre extraction et
digestion
Stockage entre digestion
enzymatique et chromatographie Echantillon
Tampon H à -20°C
Tampon TE à 4°C
Mélange de digestion à -20°C
8-oxodG par 105 dG
(étendue des valeurs; n = 3)
une nuit une nuit non (a) 0.83 – 1.03
une nuit une nuit 1 jour 0.69 – 0.95
une nuit une nuit 3 jours 1.48 – 3.19
une nuit 2 jours non 0.88 – 1.12
une nuit 4 jours non 1.00 – 1.35
2 jours une nuit non 0.87 – 1.33
2 jours 4 jours non 1.08 – 1.27
6 jours une nuit non 1.81 – 2.13
Cellules non stressées
8 jours une nuit non 1.65 – 2.09
une nuit une nuit non 24.9 – 25.3
une nuit 2 jours non 25.6 (b)
2 jours une nuit non 24.1 – 25.5
2 jours 4 jours non 24.6 – 25.8
6 jours une nuit non
8 jours 25.7 – 26.7
25.1 – 26.4
Cellules stressées (5 min H2O2 + UVC)
une nuit non (a) "non" signifie que la chromatographie est réalisée le jour de la digestion, avec stockage sur glace, dans l'obscurité.
(b) Une seule valeur disponible
Tableau 3.3-36 : Influence du stockage entre digestion enzymatique et chromatographie. Données d'une seule expérience représentative.
Étalon aqueux
(rapport du signal 8-oxodG / dG) Echantillon stressé
(rapport du signal 8-oxodG / dG) Temps entre la fin de la digestion enzymatique et l'injection (h) Stockage à 4°C Stockage à 25°C Stockage à 4°C Stockage à 25°C
8.59 8.59 1.83 1.83
2 8.65 8.46 1.85 1.86
4
8.56 8.55 1.82 1.80
6 8.50 8.57 1.84 1.82
8 8.74 8.70 1.82 1.87
Moyenne 8.61 8.57 1.83 1.84
écart étalon 0.09 0.08 0.01 0.03
CV (%) 1.05 0.99 0.67 1.58
0
201
Après extraction, précipitation et lavage, les fibres d'ADN doivent être complètement
dissoutes dans le tampon TE avant digestion enzymatique; cette étape exigeant plusieurs
heures, l'extrait peut être laissé à 4°C une nuit, ce qui permet la chromatographie le jour de la
digestion. Ce stockage ne devrait toutefois pas être prolongé au-delà de 2 jours.
Alors que l'analyse par elle-même (extraction, digestion et chromatographie) peut être
aisément réalisée en 2 jours complets, un plan expérimental exige souvent que les échantillons
biologiques soient stockés un certain temps avant analyse. Le Tableau 3.3-35 montre qu'un
stockage de plus de 2 jours à –20°C sous tampon H augmente le taux en 8-oxodG
d'échantillons non stressés. Une tendance similaire est également observée dans les
échantillons stressés, mais à un degré moindre. Des essais de stockage à –80°C avec addition
d'antioxydants à des doses qui réduisent drastiquement le taux de 8-oxodG dans l'analyse de
l'ADN de fibroblastes (Kvam et Tyrrell, 1997a, b) (tampon HM, contenant glutathion,
déferoxamine et histidine) n'ont pas amélioré la stabilité (après 3 à 4 jours de stockage, le taux
de 8-oxodG par 10 dG était de 1.6 ± 0.3; n = 7; une forte augmentation du niveau de base,
comparé aux données du Tableau 3.3-35).
5
Nous avons alors réalisé que toutes ces données ont été obtenues lors de l'addition
"brutale" de tampon de stockage aux cellules compactées par centrifugation. Cette addition
provoque une mise en suspension partielle et une dispersion certaine des cellules dans le
tampon. Un essai de dispersion complète des cellules dans le tampon par agitation au vortex
et stockage à –80°C montre une oxydation sévère en seulement une nuit; de plus, cet effet ne
peut être empêché par les antioxydants (Tableau 3.3-37). Cependant, lorsque des cellules
compactées sont délicatement superposées d'un tampon HM et stockées à –80°C, des niveaux
sensiblement réduits en 8-oxodG peuvent être mesurés (Tableau 3.3-37). La meilleure
protection pour l'ADN semble donc de demeurer empaqueté dans les cellules.
53
Bien que nous n'ayons pas testé d'autres variations dans la composition de ce tampon,
celui-ci peut probablement être optimisé; à notre connaissance, la littérature ne fournit aucune
indication sur ce point.
53 Lors de la dispensation du tampon, le jet plus ou moins vigoureux de la micro-pipette atteint le culot
202
Tableau 3.3-37 : Influence du stockage entre préparation de l'échantillon et extraction.
Stockage pré-extraction (a) Traitement avant congélation Conditions de
congélation Temps
8-oxodG par 105 dG
(étendue des valeurs)
n
une nuit Mise en suspension dans le tampon de stockage Tampon HM(b) à -80°C une nuit 2.31 – 2.50 3
une nuit 0.42 1
2 jours 0.28 – 0.70 2
6 jours
2
9 jours
0.33 – 0.47
0.53 – 0.67 2
7 jours 0.61 – 0.75
0.23 – 0.45 2
Compactage par centrifugation et superposition délicate du tampon de stockage
Tampon HM(b) à -80°C
15 jours 2
Tampon H à -80°C 2.29 – 2.78 3
3.3.8.4
(a) Entre extraction et digestion, stockage à 4°C sous tampon TE, une nuit; chromatographie le même jour que la digestion enzymatique avec stockage intermédiaire sur glace dans l'obscurité
(b) Le tampon HM est le tampon H supplémenté de 4 mM de glutathion réduit, de 2 mM de déferoxamine et de 8 mM d'histidine
Discussion et conclusion
3.3.8.4.1 Formation artefactuelle de la 8-oxodG pendant le stockage
Une conservation prolongée des échantillons à chacune des étapes du processus est
susceptible d'entraîner l'oxydation de la dG et représente probablement une source majeure de
problèmes; remarquons que la plupart des articles publiés ne mentionnent ni le plan
d'exécution du travail, ni les temps ou conditions de conservation des échantillons.
La génération de 8-oxodG à partir du stockage avait déjà été démontrée (Wilson et al.,
1993; Helbock et al., 1998), mais une séquence d'opérations susceptible de résoudre le
problème n'a pas été étudiée. La chélation des métaux par la déferoxamine a été proposée
pour augmenter la stabilité des nucléosides digérés (Shigenaga et al., 1994), mais aucune
donnée n'est disponible au-delà de 48 h.
Le plan expérimental proposé dans ce travail, pratique, garantit une minimisation effective
des artefacts oxydatifs.
3.3.8.4.2 Formation artefactuelle de la 8-oxodG pendant le traitement des échantillons
Un travail considérable est encore requis pour clarifier les taux de 8-oxodG dans des
échantillons non stressés ainsi que les mécanismes de sa formation en cours de travail et de
stockage. Des opérations triviales, commises par inadvertance, induisent la formation de
8-oxodG, ce qui peut être difficile à mettre en évidence. Nous avons pu, par exemple,
observer une contamination des solutions digérées par les ions métalliques relargués par
203
l'aiguille d'une seringue de chromatographie âgée; ceci résulte en une augmentation rapide,
continue et extrêmement sévère de la 8-oxodG que nous avons pu suivre par injections
répétées de la solution.
Une étude récente a conclu que l'oxydation de la dG en cours de travail pouvait être
réduite par (i) l'utilisation de chimiques à taux faibles en métaux de transition; (ii) un travail à
basse température; (iii) des temps d'incubation limités; et (iv) l'addition d'un antioxydant de
type nitroxyde à toutes les étapes. Les 3 premières recommandations sont déjà appliquées
dans notre protocole qui résulte en niveaux de blanc comparables à ceux atteints dans cette
étude (Hofer et Moller, 1998).
Comme nous l'avons vu dans notre discussion des tests basés sur les essais FPG (§ 3.1), il
est possible que toutes les méthodes d'extraction induisent une oxydation artefactuelle sévère.
Soulignons cependant que si les techniques glycosylases approchent les taux cellulaires réels,
ceux-ci seront nettement inférieurs aux performances de détection des méthodes
électrochimiques actuelles, qui sont cependant considérables. Seules les méthodes LC-MS-
MS peuvent espérer approcher de telles valeurs, mais à condition de disposer de quantités
considérables de matériel biologique (Ravanat, 2001) (~ 250 µg d'ADN par injection, soit 5 à
10 fois plus que dans notre procédure).
Signalons qu'une méthode originale vient d'être développée (Douki et al., 2001), qui
permet d'introduire un véritable étalon interne de 8-oxodG dans l'ADN cellulaire. Le
traitement des cellules par un endopéroxyde synthétisé à base d'isotope 18O2 permet de former
de la 8-oxodG marquée isotopiquement, distinguable en spectrométrie de masse de la
8-oxodG formée artefactuellement. A l'aide de cet étalon interne, les méthodes d'extraction de
l'ADN cellulaire vont enfin pouvoir être comparées de manière objective; nous collaborons à
cette étude programmée pour janvier 2002.
3.3.9 Validation inter-laboratoires
Nous participons au programme ESCODD, dans le cadre du programme "Quality of life
and management of living ressources (1998 to 2002)"; contrat d'action concertée N° QLK1-
1999-00568; coordinateur, Dr A. Collins, Rowett Research Institute, U.K. Il s'agit d'une
comparaison inter-laboratoire des méthodes chromatographiques développées pour l'analyse
de la 8-oxodG, dans le but d'établir le taux basal réel de l'ADN en ce nucléotide oxydé. Ce
programme en cours nous permet de comparer les résultats obtenus par notre méthode à ceux
d'autres équipes.
204
3.4 DISCUSSION ET CONCLUSION
3.4.1 Intérêt du dosage de la 8-oxodG
Comme nous l'avons vu dans la Section 1.2, la 8-oxodG, biomarqueur ubiquiste du stress
oxydatif au niveau de l'ADN, est formée à la fois par les radicaux hydroxyles, les oxydations
mono-électroniques, l'oxygène singulet et le peroxynitrite.
3.4.1.1
Le Tableau 3.4-1 (Kasai, 1997) donne une idée des très nombreuses études réalisées sur
l'induction de ce marqueur. Nous n'avons guère la place de développer ici toutes les études qui
se sont ajoutées depuis, mais nous avons pu compiler une revue exhaustive des effets pro-
oxydants des radiations lumineuses au niveau de la guanine (Duez et al., 2001) qui sera
présentée plus avant.
Le taux d'excrétion urinaire de la 8-oxodG est mesuré dans des études de biomonitoring
qui tentent d'évaluer le stress oxydatif global de l'organisme humain en réponse à différentes
conditions environnementales (Shigenaga et al., 1989; Loft et Poulsen, 1998; Poulsen et al.,
1998)
Conformation de la 8-oxodG
3.4.1.1.1 En solution aqueuse
Dans sa forme monomère en solution aqueuse, le produit majeur d'oxydation de la guanine
présente 4 tautomères principaux dont la forme (6,8-dicéto-) est prédominante (Figure 3.4-1 ,
forme 8OG1). Afin de refléter cette réalité, le nom "8-hydroxy-2'-désoxyguanosine (8-
OHdG)" initialement donné au nucléoside oxydé tombe en désuétude. Les calculs
thermodynamiques ont montré que ces transitions tautomères sont bien des processus permis
et indiquent la séquence suivante de stabilité : 8OG1 > 8OG2 >>> 8OG3 > 8OG4 (Gu et
Leszczynski, 1999). Les données obtenues en RMN montrent la présence d'environ 15 % de
tautomères mineurs, principalement la forme 8OG2 pour laquelle une
implication dans le mésappariement de base (cf § 1.1.2.2) et l'induction de mutations pourrait
être également concevable (Venkateswarlu et Leszczynski, 1998; Gu et Leszczynski, 1999).
3.4.1.1.2 Dans l'ADN
Une étude RMN n'a pas montré de modifications structurales globales lors de l'inclusion
de 8-oxodG:dC dans un dodécanucléotide auto-complémentaire. La guanine prend, comme en
solution aqueuse, la forme (6,8-dicéto-). La configuration la plus stable de 8-oxodG dans la
paire de bases est en anti et l'appariement 8-oxodG:dC se fait en conformation Watson-Crick
205
Tableau 3.4-1 : Quelques conditions capables d'induire la 8-oxodG (Etudes sur animaux et études cliniques)
Espèce animale Organe Traitements induisant la 8-oxodG
Rat rein bromate de potassium, nickel, cuivre, cobalt, nitrilo-triacétate de fer, adriamycine, streptozotocine, benzo[a]pyrène
foie cuivre, cobalt, ciprofibrate, simfibrate, di(2-éthylhexyl)phtalate, di(2-éthylhexyl)adipate acétoxime, ménadione, acides perfluorooctanoïque et perfluorodécanoïque, nitroalkanes, cyclopentanone oxime, aflatoxine B1, 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine, 2-amino-3[8-diméthylimidazo-4,5-f]quinoxaline, N,N'-diphényl-p-phénylènediamine, mélange de pesticides, N-nitrosodiéthylamine
glande mammaire
diméthylhydrazine
poumon
acides gras insaturés
pancréas 4-hydroxyaminoquinoline 1-oxyde
colon
silice
urine 2-nitropropane, paraquat, hydroquinone
Souris foie rayons X, lutéoskyrine, fer, aroclor, azidothymidine, tétrachloro-p-hydroquinone, pentachlorophénol, phénytoïne, haloacétate,
poumon nitrosamine, fumée de diesel,
peau esters de phorbol, UV, 7,12-diméthylbenz[a]anthracène
moelle osseuse benzène
Poisson foie créosotes, nitrofurantoïne, H2O2, sédiments contaminés
Hamster rein diéthylstilboestrol, estradiol
foie estradiol
Etudes chez l'homme Organe Conditions induisant la 8-oxodG
foie hépatite chronique
rein carcinome rénal
poumon et muqueuse orale
cigarette
estomac Helicobacter pylori
sein cancer
cerveau vieillissement, Parkinson,
sérum et/ou cellules sanguines
cigarette, radiations ionisantes, amiante, maladie auto-immune, exercice, charbon, vieillissement, anémie de Fanconi, diabète
urine maladie granulomateuse chronique, vieillissement, cigarette, exercice, benzène, fumée de diesel, fibrose kystique, cancer, silice
sperme acide ascorbique, cigarette
D'après une revue par (Kasai, 1997)
206
Figure 3.4-1 : Les 4 tautomères principaux de la guanine en solution aqueuse
H2N
HN
N NH
HN
O
O1
23
4
56
7
8
9
H2N
HN
N
O
OH
H2N NH
OH
OH
NH
N
H2N NH
HN
OH
ON
N
N
8OG1 (85 %) 8OG3
8OG2 8OG4
N
N
D'après (Oliveira Brett et al., 2000)
via 3 liens hydrogènes (Figure 3.4-2) (Oda et al., 1991). Des simulations informatiques ont
également montré que la 8-oxodG peut être accommodée dans une séquence de bases normale
(Ninaber et Goodfellow, 1998).
Le même travail mené sur une paire 8-oxodG:dA montre que la 8-oxodG existe sous forme
de 2 tautomères qui sont en équilibre et s'échangent lentement. Comme précédemment, le
composant majeur est la forme (6,8-dicéto-) mais la base est ici en configuration syn. Celle-ci,
probablement favorisée par l'encombrement stérique entre base et glucide et par une répulsion
de charges, permet la formation de liens hydrogènes (Figure 3.4-2) favorables à une paire de
bases qui s'empile sans problème dans l'hélice (Kouchakdjian et al., 1991; Ninaber et
Goodfellow, 1998). Il semble que la conformation de la base vis-à-vis du groupement
glucidique dépend de nombreuses interactions locales qui favorisent un basculement (flip) de
la base via les liens hydrogènes (Ninaber et Goodfellow, 1998).
Les calculs et l'expérience ont montré que les séquences 5'-dGdG-3' étaient
particulièrement sujettes à l'oxydation, le dG situé en 5' d'un autre dG étant le plus facilement
oxydé. Il a même été suggéré que les attaques oxydantes "glisseraient" le long de la chaîne
d'ADN pour aboutir sur ces séquences. Cet effet serait dû à l'empilement de dG et à des
interactions électrostatiques qui modifieraient sensiblement le potentiel d'ionisation de la base
en 5', l'orbitale moléculaire occupée la plus haute, riche en énergie, se concentrant sur cette
base (Prat et al., 1998). Le calcul montre également que la 8-oxodG d'une séquence
5'-(8-oxodG)dG-3' serait plus facile à oxyder que la 8-oxodG isolée (Prat et al., 1998).
207
Figure 3.4-2 : Appariement normal 8-oxodG:dC (anti-anti) et mésappariement 8-oxodG:dA (syn-anti)
N
NH
N
N
N
N
O
O
N
HH
N
N
O
O
NH
H
N
N
N
H
H
N
H
H
O
H
N
N
N
NH
H
H
H
1
23
4
56
78
9
HH
dC
8-oxodG dA
5'
3'
5'
3'
8-oxodG
H
3.4.1.2 Réparation et mutagénicité de la 8-oxodG
3.4.1.2.1 Réparation
Les études sur E. coli ont permis de mettre en évidence un système de réparation de la
8-oxodG par excision de bases (BER, cf § 1.1.5.2). Ce mécanisme repose sur 2 protéines
(Figure 3.4-3) dont les homologues ont été identifiés chez les eukaryotes : (i) une 8-oxodG
glycosylase/AP lyase, clonée chez E. coli (FPG)54, la levure (yOGG1) et l'homme (hOGG1)55;
et (ii) une adénine-DNA glycosylase/AP lyase qui élimine les adénines mésappariées (dA:dG,
dA:8-oxodG et dA:dC), MutY, dont une activité analogue a été mise en évidence chez
l'homme (hMutY dans les mitochondries et protéine non identifiée dans le noyau) (Boiteux et
Radicella, 1999; Le Page et al., 1999). Des données récentes montrent cependant que la
réparation de la 8-oxodG est nettement moins performante que celle d'autres lésions
54 L'activité principale de FPG s'exerce sur les paires de bases 8-oxodG:dC 55 Curieusement l'enzyme humaine présente 2 mécanismes réactionnels : (i) une activité glycosylase/lyasique envers les paires de bases 8-oxodG:dC et une activité glycosylase seule envers les mésappariement 8-oxodG:T > G > A (Bjoras et al., 1997)
208
Figure 3.4-3 : Réparation de la 8-oxodG chez E. coli
(Boiteux et Radicella, 1999)
endogènes fréquentes (dA:U et dA:site AP) (Cappelli et al., 2000). Chez l'homme, une voie de
réparation alternative a également été mise en évidence (Jaiswal et al., 1998)
Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER, cf § 1.1.5.3) est plutôt
adapté à la réparation d'adduits volumineux qui déforment l'hélice; il est cependant capable de
reconnaître et de réparer de petits adduits comme la 8-oxodG ou les glycols de thymine. Chez
E. coli en tous cas, le NER semble plutôt fonctionner en back-up du BER pour la réparation
des guanines oxydées (Le Page et al., 1999). Chez l'homme, il s'agit d'une voie mineure de
réparation de ces lésions (Bohr et al., 1998).
3.4.1.2.2 Mutagénicité
3.4.1.2.2.1 Données in vitro
Des réactions d'extensions d'amorces ont permis de montrer que, in vitro, les ADN
polymérases ne sont pas bloquées par la 8-oxodG et peuvent incorporer à la fois l'adénine et la
cytosine en face d'une guanine oxydée (Tableau 3.4-2). De plus, il semble que la
configuration syn:anti ressemble suffisamment à une paire de bases Watson-Crick pour que
l'activité de relecture/excision de pol I et pol III soit incapable de retirer une adénine
mésincorporée en face d'une 8-oxodG (Shibutani et al., 1991; Le Page et al., 1998).
Il apparaît donc que, en fonction de la polymérase impliquée, la formation d'une paire de
bases 8-oxodG(syn):dA(anti) puisse provoquer une mutagenèse en cours de réplication (Le
Page et al., 1998).
209
Le contexte de la séquence de bases encadrant la lésion influe sur la réparation et les
mésappariements, ce qui commence à peine à être envisagé; dans certaines séquences, la
combinaison d'une réparation inefficace et d'un mésappariement important pourrait augmenter
de 100 à 1000 fois le potentiel mutagène de la 8-oxodG (Hatahet et al., 1998).
Tableau 3.4-2 : Incorporation in vitro de nucléotides en face d'une 8-oxodG
Polymérase étudiée Base incorporée (rapport dC/dA)
polymérases associées à la réplication (pol α, pol δ, pol III)
1/200 à 1/3
Polymérases associées à la réparation (pol β, pol I)
4/1 à 7/1
D'après (Shibutani et al., 1991)
3.4.1.2.2.2 Données ex vivo
A l'aide de vecteurs plasmidiques, la spécificité et la fréquence de mutation de 8-oxodG
ont été étudiées chez des procaryotes et des eucaryotes. Les mutations prédominantes sont des
transversions G:C T:A. Cependant, la base oxydée s'est avérée faiblement mutagène in
vivo avec, dans chaque cas, une fréquence mutationelle inférieure à 7 %, ce qui suggère
l'existence de mécanismes intra-cellulaires capables de corriger la lésion (Le Page et al., 1998;
Tan et al., 1999). En fait, chez les mammifères, les cinétiques de réparation des paires de
bases 8-oxodG:dA et 8-oxodG:dC sont fort différentes; 8-oxodG:dA est répliquée avant
réparation alors que 8-oxodG:dC est réparée avant réplication. La réplication de 8-oxodG:dA
peut donc procéder avant réparation complète, ce qui se traduit par une incorporation d'un T
en face du A, donc par une transversion G T (Le Page et al., 1999).
3.4.2 Intérêt de la méthode validée
A notre connaissance, notre validation du dosage de la 8-oxodG dans l'ADN de cellules en
culture est la première étude de validation publiée pour un biomarqueur du stress oxydatif
(Duez et al., 2000b). Les performances analytiques que nous avons étudiées sont la
spécificité, la linéarité, l'exactitude, la précision, la robustesse, la stabilité des analytes et les
seuils de détection et de quantification.
L'identité et la pureté des pics de dG et de 8-oxodG a été contrôlée dans des échantillons
sévèrement stressés. Nous avons montré que le niveau de stress ne gêne ni l'extraction ni la
digestion enzymatique de l'ADN. Il est à présent acquis que l'expression des résultats
relativement à l'étalon interne qu'est la dG améliore significativement la précision et la
210
sensibilité du dosage. La méthode est robuste vis-à-vis de petites variations des conditions
chromatographiques et le plan d'exécution des opérations proposé dans ce travail minimise la
formation artefactuelle de l'analyte. Il reste cependant indispensable que des blanc adéquats
soient inclus dans chaque série de dosages de manière à pouvoir détecter la formation
éventuelle d'artefacts.
3.4.3 Conclusions
La validation des méthodes analytiques, largement reconnue comme le meilleur garde-fou
contre la production de données non fiables, devient peu à peu une exigence absolue dans de
nombreux domaines. A travers la détermination de la 8-oxodG, une base modifiée qui
présente un risque mutagène non négligeable, nous avons illustré dans ce travail les étapes
requises pour appliquer le concept de validation analytique à un marqueur du stress oxydatif.
Les limitations de la méthode ont été soulignées, notamment la difficulté à assurer
l'identité du pic de 8-oxodG aux basses concentrations, la problématique de la formation
d'artefacts et la détectabilité "limitée" de la méthode (50 fmoles injectées).
En nous basant sur les données obtenues, mais en gardant à l'esprit les limitations
soulignées, nous concluons que la méthode analytique est des plus fiables. Le dosage de la
8-oxodG par CLHP couplée à une détection électrochimique fournit des données consistantes
qui permettent de détecter dans l'ADN cellulaire de manière sûre une augmentation de ce
biomarqueur.
211
4. Résultats et Discussion :
Photoactivation des porphyrines endogènes et induction de 8-oxodG
212
4.1 INDUCTION DES PORPHYRINES ENDOGENES
Nous avons induit la synthèse des porphyrines endogènes par incubation des cellules avec
l'acide δ-aminolévulinique. Comme nous le détaillons dans le paragraphe ci-dessous (§ 4.1.1
), cette méthode, fort utilisée dans le cadre de la thérapie photodynamique, permet une
synthèse effective des porphyrines en contournant le rétrocontrôle négatif exercé par l'hème.
4.1.1 Généralités sur les porphyrines
Les porphyrines sont des molécules caractérisées par un macrocycle de 20 atomes de
carbone et de 4 atomes d'azote. La nomenclature exacte de cette classe de molécules s'avérant
excessivement complexe, une nomenclature semi-systématique, basée sur une douzaine de
noms triviaux, est toujours acceptée (Milgrom, 1997). De petites variations sur le même cycle
tétrapyrrolique mènent à une extraordinaire diversité de molécules.
La fonction principale des porphyrines consiste à lier des ions métalliques qui sont ainsi
au centre d'évènements biochimiques fondamentaux. En effet, de par les modifications de
potentiel redox induites par le ligand porphyrine et son environnement protéique, le système
biologique peut utiliser à son profit les propriétés redox et de coordination du métal.
4.1.1.1 Biosynthèse de l'hème et des porphyrines
4.1.1.1.1 Voie de biosynthèse
Dans les tissus mammifères, la biosynthèse de l'hème procède en 8 étapes enzymatiques
distribuées entre les mitochondries et le cytosol (Figure 4.1-1).
La première enzyme, la δ-aminolévulinate synthase (ALA synthase), catalyse la
condensation de la glycine et du succinylCoA pour former l'acide δ-aminolévulinique (δ-ala).
La seconde, la δ-aminolévulinate déshydratase (ALA déshydratase), catalyse la condensation
de 2 molécules de δ-ala pour former le porphobilinogène (PBG). Quatre molécules de PBG
s'assemblent pour former le tétrapyrrole uroporphyrinogène III en 2 étapes catalysées
respectivement par l'hydroxyméthylbilane synthase (HMB synthase) (condensation tête-à-
queue de 4 molécules de PBG par une série de désaminations pour former un tétrapyrrole
linéaire) et l'uroporphyrinogène III synthase (URO synthase)56. La cinquième enzyme,
l'uroporphyrinogène décarboxylase (URO décarboxylase), catalyse le retrait séquentiel des 4
groupements carboxyliques des chaînes latérales acétates pour former le coproporphyrinogène 56 L'URO synthase catalyse également, par une voie mineure, la formation de l'isomère uroporphyrinogène I. Celui-ci est également un substrat pour l'URO décarboxylase qui forme alors le coproporphyrinogène I, un apparent "cul-de-sac" métabolique.
213
III. Ce composé entre alors dans la mitochondrie où la coproporphyrinogène oxydase (Copro
oxydase) catalyse la décarboxylation de 2 des 4 acides propioniques en vinyles pour former le
protoporphyrinogène IX. Ce composé est oxydé en protoporphyrine IX (PPIX) par la
protoporphyrinogène oxydase (Proto oxydase) qui enlève 6 atomes d'hydrogène. La
ferrochélatase insère alors dans le cycle un ion ferreux pour former l'hème (Milgrom, 1997;
Desnick, 1999).
4.1.1.1.2 Sites de synthèse et régulation
La moelle osseuse et le foie sont les sites principaux de synthèse mais toutes les cellules
de l'organisme sont capables de fabriquer l'hème nécessaire à leurs besoins.
Les 8 enzymes agissent de concert, mais le matériel génétique est dispersé sur différents
chromosomes. L'étape limitante de la synthèse se situe au niveau de l'ALA synthase dont 2
formes distinctes, "érythrocytaire" et "non-érythrocytaire", sont encodées par des gènes
séparés.
Dans le foie et la plupart des autres tissus, mais pas dans les cellules érythrocytaires, un
rétrocontrôle négatif est exercé par l'hème; celui-ci diminue la stabilité de l'ARN messager
codant pour l'ALA synthase et interfère avec la translocation mitochondriale de la protéine.
L'ALA synthase hépatique est régulée de manière coordonnée avec la synthèse des
cytochromes P450 et réagit aux mêmes inducteurs (Kennedy et Pottier, 1992; Desnick, 1999).
Lors de la différenciation des cellules érythrocytaires, les activités des enzymes de la
biosynthèse de l'hème augmentent de manière coordonnée. L'ALA synthase érythrocytaire est
encodée sur le chromosome X et exprimée à plus haut niveau que l'enzyme hépatique. De fait,
dans l'érythrocyte en développement, la régulation de l'HMB synthase pourrait être l'étape
limitante. De plus, un mécanisme de contrôle spécifique régule le transport intracellulaire du
fer (Kennedy et Pottier, 1992; Moore, 1993; Desnick, 1999).
4.1.1.2 Les porphyries
Les porphyries sont des affections résultant de perturbations dans la voie de biosynthèse
de l'hème. Elles sont habituellement classées, en fonction du site primaire de surproduction et
d'accumulation des précurseurs ou des porphyrines elles-mêmes, en "hépatiques"
(symptomatologie principalement neuro-viscérale) et "érythropoïétiques" (avec surtout une
photosensibilisation cutanée). Il peut cependant y avoir des traits communs dans certains
types d'affections (Tableau 4.1-1). Les hormones stéroïdes, certains médicaments et
l'alimentation influencent la voie de biosynthèse, précipitant ou aggravant la sévérité de
certaines porphyries. Les porphyries correspondent donc à des maladies écogéniques, dans
214
lesquelle des facteurs génétiques, physiologiques et environnementaux (le soleil)
interagissent.
Figure 4.1-1 : Voie de synthèse des porphyrines
(Desnick, 1999)
215
Tableau 4.1-1 : Classification des porphyries
Type / Porphyrie Enzyme déficiente
Mode de transmission(a)
Photo- sensibilité
Symptômes Neuro-
viscéraux Signes biochimiques(b)
Porphyries hépatiques Urine Fèces
Déficience en δ-ala déshydratase
ALA déshydratase
AR − + δ-ala, COPRO III
---
Porphyrie intermittente aiguë HMB synthase AD − + δ-ala, PBG ---
Coproporphyrie héréditaire COPRO oxydase AD + + δ-ala, PBG, COPRO III
COPRO III
Porphyrie variegata PROTO oxydase AD + + δ-ala, PBG, COPRO III
COPRO III, PP IX
Porphyrie cutanée tardive URO décarboxylase
AD + − URO I, 7-carboxylate porphyrine
ISOCOPRO
Porphyries érythropoïétiques
Porphyrie érythropoïetique congénitale
URO synthase AR +++ − URO I COPRO I
Protoporphyrie érythropoïétique Ferrochélatase AD + − −−− PP IX
(a) AR, autosomique récessive; AD, autosomique dominante; XLR, récessive liée à X. (b) δ-ala, acide δ-aminolévulinique; PBG, porphobilinogène; COPRO I, coproporphyrine I; COPRO III, coproporphyrine III; ISOCOPRO, isocoproporphyrine; URO I, uroporphyrine I; PPIX, protoporphyrine IX
D'après (del C. Battle, 1993; Desnick, 1999)
Les porphyrinogènes, incolores et non fluorescents, sont les intermédiaires
biosynthétiques alors que les porphyrines, à l'exception de la PPIX, ne sont que des produits
secondaires qui ont échappé à la voie de biosynthèse par oxydation irréversible du
porphyrinogène correspondant. Elles ne possèdent pas de fonction biologique mais sont
responsables, de par leur couleur pourpre et leur fluorescence, de l'apparence spectaculaire de
l'urine57 et des érythrocytes ainsi que des problèmes de photosensibilité de certains patients
(Milgrom, 1997; Desnick, 1999).
4.1.1.3 Utilisation des porphyrines en thérapie et diagnostic photodynamique
Le terme de thérapie photodynamique (PDT) a été initialement imaginé par von Tappeiner
en 1907 pour décrire une application clinique de l'illumination d'une tumeur photosensibilisée
par de l'éosine; l'utilisation des porphyrines en administration systémique a déjà été proposée
pour cet usage en 1913 (Szeimies et al., 1996).
57 C'est ainsi que Hippocrate aurait été le premier à décrire un cas de porphyrie, en l'an – 480 (Rimington, 1993).
216
4.1.1.3.1 Thérapie et diagnostic photodynamique
La PDT est en fait un procédé en 2 étapes qui utilise une combinaison de médicament et
de lumière pour induire une destruction tissulaire localisée. Un photosensibilisant est d'abord
administré par voie intraveineuse, orale ou topique et s'accumule dans le tissu cible. Cette
molécule, non toxique dans son état natif, est ensuite activée par la lumière pour devenir
cytotoxique et dégrader le tissu. L'efficacité de la majorité de ces agents repose sur la
présence d'oxygène et la formation d'espèces réactives via un processus de Type II. Deux
mécanismes agissent en concert pour assurer une sélectivité à ce processus : (i) l'agent
photodynamique, choisi pour être préférentiellement capté et/ou retenu par le tissu cible,
souvent un tissu néoplasique; et (ii) l'irradiation lumineuse, restreinte à la zone visée. La
technique est également appliquée à la détection de tissu cancéreux; il s'agit alors de
diagnostic photodynamique (PDD) (Nishioka, 1998).
Les propriétés curatives de la PDT seraient en fait dues à plusieurs phénomènes : (i) la
mort directe des cellules tumorales; (ii) la destruction ou l'occlusion du tissu vasculaire
alimentant la tumeur; (iii) la libération de médiateurs de l'inflammation et le recrutement vers
le site tumoral de cellules inflammatoires qui contribuent à la destruction de la tumeur; et
(iv) une réaction immunitaire envers la tumeur traitée, mécanisme qui contribuerait au
contrôle à long terme de la tumeur (Dougherty et al., 1998).
La PDT est cependant sévèrement restreinte dans son champ d'application, à la fois par la
profondeur de pénétration limitée de la lumière dans les tissus, par la dépendance du
phénomène vis-à-vis de l'oxygène et par une inhomogénéité de distribution du
photosensibilisant dans la tumeur. Les zones profondes, ischémiques ou hypoxiques ne sont
quasi pas touchées par ce procédé qui semble réservé à des destructions de tissu superficiel,
utiles néanmoins en dermatologie, gastro-entérologie, urologie et pneumologie (Dougherty et
al., 1998; Moan et al., 1998; Nishioka, 1998).
4.1.1.3.2 Dérivés d'hématoporphyrine et Photofrin®
Une précipitation en milieu acide de préparations brutes d'hématoporphyrine a fourni un
mélange complexe de porphyrines (monomères, dimères et oligomères), le hematoporphyrin
derivative (HPD) qui a été fort utilisé; sa purification partielle a permis d'obtenir le
Photofrin®, qui est devenu le photosensibilisant le plus employé en pratique clinique
(Dougherty et al., 1998). Ce dérivé est capté de manière efficace par les tumeurs mais son
administration systémique conduit à une photosensibilité cutanée prolongée; les patients
217
courent en effet le risque de réactions phototoxiques sévères et ce, pendant plusieurs semaines
(Szeimies et al., 1996).
Les mécanismes qui président à la distribution préférentielle des porphyrines dans les
tumeurs sont encore peu connus et pourraient dépendre de certaines caractéristiques des tissus
tumoraux, comme par exemple l'expression de récepteurs protéiques de densité faible58, un
pH inférieur, la présence de macrophages, un large espace interstitiel, un tissu vasculaire
perméable, un drainage lymphatique compromis, un collagène nouvellement synthétisé58 ou
une densité importante en lipides… (Dougherty et al., 1998).
L'emploi du Photofrin® requiert des fluences de 50 à 500 J/cm² de lumière rouge;
l'hyperthermie induite peut contribuer à l'effet photodynamique. Pour des applications ne
nécessitant pas une pénétration tissulaire profonde (~ 1.5 mm), une irradiation à 410 nm est
cependant plus efficace que 630 nm (Dougherty et al., 1998).
4.1.1.3.3 L'acide δ-aminolévulinique
Pour pallier les effets secondaires des dérivés de type Photofrin®, l'administration d'acide
δ-aminolévulinique (δ-ala ), un précurseur métabolique de la synthèse des porphyrines situé
après l'étape rétro-contrôlée par l'hème, est à présent largement appliquée.
L'administration, topique59, orale ou systémique (Calzavara-Pinton et al., 1996; Szeimies
et al., 1996), de δ-ala induit en fait cette voie de biosynthèse avec accumulation de
protoporphyrine IX (PPIX) car la conversion de PPIX en hème apparaît relativement lente.
Bien que toutes les cellules semblent capables de synthétiser l'hème, la PPIX s'accumule
principalement dans les tissus de surface (épiderme, conjonctive, muqueuses, surfaces
séreuses, endomètre, urothélium) ou dans des tissus capables de sécréter vers des surfaces
(glandes salivaires, sébacées et mammaires, foie, vésicules séminales). Par contre, les tissus
majeurs d'origine mésodermique (muscles, tissus connectifs, cartilage, moelle osseuse, sang)
ne développent pas de fluorescence significative après une seule dose de δ-ala in vivo.
Remarquons cependant que, in vitro, ces cellules deviennent généralement capables
d'accumuler la PPIX.
Il semble donc que, en fonction du type cellulaire ou de l'environnement, les cellules
puissent différer dans leur capacité à synthétiser l'hème ou à capter le δ-ala ; il est également
possible que certains mécanismes de rétro-contrôle ou certaines cinétiques enzymatiques en
amont de la ferrochélatase soient spécifiques (Kennedy et Pottier, 1992). Un taux faible de fer
58 Qui lie les porphyrines 59 La pénétration à travers une couche cornée tumorale est particulièrement efficace
218
libre intra-cellulaire semble un élément essentiel à la production de PPIX (Pourzand et al.,
1999) ce qui est démontré par des expériences conduites en présence de chélateurs (Chang et
al., 1997).
La biosynthèse de PPIX après administration de δ-ala est particulièrement active dans les
cellules tumorales, ce qui offre un moyen de localiser (PDD) ou de détruire (PDT)
sélectivement ces cellules par photoactivation. Les raisons de cette sélectivité, qui n'est
cependant pas absolue (Martin et al., 1995; Messmann et al., 1998), restent encore obscures.
Différentes sources lumineuses visibles ont été décrites pour les applications cliniques de
PDT, incluant des sources non-cohérentes, filtrées ou non, et des sources cohérentes (laser
argon 630 et 635 nm). Les fluences appliquées vont de 15 à 250 J/cm² (Szeimies et al., 1996).
4.1.1.3.4 Photosensibilisants de nouvelle génération
Les profils d'efficacité et de sécurité de la technique (Fuchs et al., 2000) semblent corrects
et devraient être encore améliorés par les modalités de traitement en développement (choix de
longueur d'onde, protocoles d'irradiation, développement de nouveaux sensibilisants et
d'adjuvants (Langer et al., 1999), amélioration de l'administration des photosensibilisants)
(Dougherty et al., 1998).
Une recherche active dans ce domaine a notamment permis de développer de nouveaux
photosensibilisants chimiquement purs, présentant un maximum d'absorption vers 650 nm et
n'induisant quasi pas de photosensibilité cutanée. Différents composés sont en phase d'étude
clinique, parmi lesquels des ester de δ-ala (Peng et al., 1996), le dérivé de benzoporphyrine
monoacide A, le mono-aspartyl-chlorine e6, l'étiopurpurine d'étain, le texaphyrine de lutécium
et les phthalocyanines (He et al., 1998; Nishioka, 1998).
4.1.2 Résultats : Spectroscopie de fluorescence
D'après la littérature, une incubation avec l'acide δ-aminolévulinique permettrait d'induire
à la fois un dérivé insoluble dans l'eau, la PPIX, et des composés solubles, probablement les
uro- et/ou coproporphyrines (Dietel et al., 1996). Nous avons donc procédé à un examen
spectroscopique du lysat cellulaire et du milieu de culture.
4.1.2.1 Fluorescence intracellulaire
Les spectres de fluorescence ont été relevés à pH physiologique sur un lysat brut obtenu
par sonication des cellules dans le PBS. Un relevé systématique a montré l'apparition d'une
fluorescence dans les cellules incubées en présence de δ-ala (Figure 4.1-2). Nous avons pu
établir les maxima d'excitation et d'émission à, respectivement, 413 et 636 nm, en accord avec
219
les spectres de fluorescence publiés pour la PPIX (Gomer et al., 1985; Quintanilla-Vega et al.,
1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997).
Figure 4.1-2 : Spectroscopie de fluorescence intracellulaire
Mesures dans le PBS 650 mV; 5 nm/s Spectres d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 16 nm Spectres d'émission : bande passante excitation, 2 nm; bande passante émission, 2 nm
Spectres d'excitationP388D1 "blanc"
0
2
4
6
8
10
300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
Sign
al
650 nm675 nm700 nm725 nm750 nm
Spectres d'excitationP388D1 + δ-ala 1 mM (6 h)
0
2
4
6
8
10
12
300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
Sign
al
650 nm675 nm700 nm725 nm750 nm
220
Spectres d'émissionP388D1 "blanc"
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
550 600 650 700 750 800 850
λ (nm)
Sign
al326 nm338 nm351 nm364 nm376 nm413 nm
Spectres d'émissionP388D1 + δ-ala 1 mM (6 h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
550 600 650 700 750 800 850
λ (nm)
Sign
al
326 nm338 nm351 nm364 nm376 nm413 nm
En milieu HClO4 aqueux 1 M : méthanol60 (1 : 1, v/v), ces maxima passent à,
respectivement, 408 et 604 nm, avec apparition d'un second maximum d'émission à 664 nm
(Figure 4.1-3), ce qui est également en accord avec les caractéristiques spectrales de la PPIX
(Gomer et al., 1985; Quintanilla-Vega et al., 1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997).
60 Pour les dosages, les porphyrines sont extraites dans ce milieu qui assure une monomérisation des agrégats.
221
Figure 4.1-3 : Spectroscopie de fluorescence intracellulaire Mesures dans le mélange HClO4 aqueux 1 M : méthanol (1 : 1, v/v) 650 mV; 5 nm/s Spectre d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm Spectres d'émission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm
Spectres d'excitation - P388 D1λ émission = 604 nm
0
0.1
0.2
300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
Sign
al Blancd-ala 300 µM (3 h)
Blanc
δ-ala 300 µM (3 h)
Spectres d'émission - P388 D1λ excitation = 406 nm
0
0.1
0.2
550 600 650 700 750 800 850
λ (nm)
Sign
al Blancd-ala 300 µM (3 h)
Blanc
δ-ala 300 µM (3 h)
4.1.2.2 Fluorescence extracellulaire
Les spectres de fluorescence ont été relevés à pH physiologique sur un milieu de culture
dilué par du PBS. Un relevé systématique a montré l'apparition d'une fluorescence dans les
cellules incubées en présence de δ-ala (Figure 4.1-4). Nous avons pu établir les maxima
d'excitation et d'émission à respectivement 399 nm et 620 nm; un second maximum
d'émission se devine vers 675 – 680 nm. Ces données sont en accord avec les spectres de
222
fluorescence publiés pour les porphyrines solubles, uro- et/ou coproporphyrines (Gomer et al.,
1985; Quintanilla-Vega et al., 1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997).
Figure 4.1-4 : Spectroscopie de fluorescence extracellulaire
650 mV; 5 nm/s Spectres d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 16 nm Spectres d'émission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm
Spectres d'excitationMilieu P388D1 "blanc"
0
0.5
1
1.5
2
300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
Sign
al
610 nm620 nm636 nm650 nm675 nm700 nm725 nm750 nm
Spectres d'excitationMilieu P388D1 + δ-ala 1 mM (6 h)
0
0.5
1
1.5
2
300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
Sign
al
610 nm620 nm636 nm650 nm675 nm700 nm725 nm750 nm
223
Spectres d'émissionMilieu P388D1 "blanc"
0
0.1
0.2
550 600 650 700 750 800 850
λ (nm)
Sign
al400 nm470 nm
Spectres d'émissionMilieu P388D1 + δ-ala 1 mM (6 h)
0
0.1
0.2
550 600 650 700 750 800 850
λ (nm)
Sign
al 400 nm470 nm
En milieu HClO4 aqueux 1 M : méthanol (1 : 1, v/v), ces maxima passent à,
respectivement, 404, 603 et 660 nm (Figure 4.1-5), ce qui est également en accord avec les
caractéristiques spectrales des porphyrines hydrosolubles (Quintanilla-Vega et al., 1995;
Dietel et al., 1996).
224
Figure 4.1-5 : Spectroscopie de fluorescence extracellulaire Mesures dans le mélange HClO4 aqueux 1 M : méthanol (1 : 1, v/v)
650 mV; 5 nm/s Spectres d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm Spectres d'émission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm
Spectres d'excitation - Milieu P388 D1λ émission = 602 nm
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
Sign
al Blancd-ala 300 µM (3 h)
Spectres d'émission - Milieu P388 D1λ excitation = 405 nm
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
550 600 650 700 750 800 850
λ (nm)
Sign
al Blancd-ala 300 µM (3 h)
Blanc
δ-ala 300 µM (3 h)
Blanc
δ-ala 300 µM (3 h)
4.1.2.3 Discussion
Les pics de fluorescence intracellulaire observés dans les échantillons blanc sont a priori
étonnants; en effet, les seuls fluorophores endogènes sont le tryptophane (λexc. 275 nm; λém.,
350 nm), le NADH (λexc. 340 nm; λém., 470 nm), les flavines (λexc. 450 nm; λém., 520 nm)et
les porphyrines (λexc. 405 nm; λém., 635 nm) (Stepp et al., 1998). Un examen attentif montre
que les pics importants observés sont exactement (i) dans un rapport 1/2 avec la longueur
225
d'onde d'émission pour les spectres d'excitation ; et (ii) dans un rapport 2/1 avec la longueur
d'onde d'excitation pour les spectres d'émission . Il s'agit en réalité d'un défaut inhérent à tous
les systèmes monochromateurs; les répliques d'ordre n de la longueur d'onde fixée sont
également sélectionnées. Les filtres qui auraient pu permettre de pallier à cet inconvénient
n'étaient cependant pas disponibles au moment de nos mesures.
4.1.3 Résultats : Cinétique d'induction
4.1.3.1 Fluorescence intracellulaire
La cinétique de fluorescence, mesurée sur 8 heures d'incubation avec 1 mM de δ-ala,
montre un plateau dans la production de PPIX; ce plateau est déjà atteint après
approximativement 2 heures d'incubation (Figure 4.1-6). Nous remarquons que pratiquement
aucune fluorescence n'est induite par une concentration en δ-ala de 100 µM.
Figure 4.1-6 : P388D1 + δ-ala : Cinétique d'apparition de la fluorescence intracellulaire (PPIX). Mesures dans le mélange HClO4 aqueux 1 M : méthanol (1 : 1, v/v)
0
0.5
1
1.5
0 2 4 6 8
Temps d'incubation (h)
Sign
al /
mg
prot
éine
s
1 mM300 µM100 µM
Concentration en δ -ala
Les points représentent la moyenne et les barres correspondent à l'étendue des valeurs (n = 3) (pour les données obtenues à 100 µM, les barres sont inférieures à la taille du point). 650 mV; acquisition de 1 point/s pendant 20 s; λ excitation, 406 nm (bande passante, 4 nm); λ émission, 604 nm (bande passante, 8 nm).
226
4.1.3.2 Fluorescence extracellulaire
La cinétique de fluorescence, mesurée sur 8 heures d'incubation avec 1 mM de δ-ala,
montre une excrétion continue de porphyrines solubles (Figure 4.1-7). Nous remarquons que
pratiquement aucune fluorescence n'est induite par une concentration en δ-ala de 100 µM.
Figure 4.1-7 : P388D1 + δ-ala : Cinétique d'apparition de la fluorescence extracellulaire
(porphyrines solubles). Mesures après dilution dans le mélange HClO4 aqueux 1 M : méthanol (1 : 1, v/v)
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8
Temps d'incubation (h)
Sign
al /
mg
prot
éine
s
1 mM300 µM100 µM
Concentration en δ -ala
Les points représentent la moyenne et les barres correspondent à l'étendue des valeurs (n = 3) (pour les données obtenues à 100 µM, les barres sont inférieures à la taille du point). 650 mV; acquisition de 1 point/s pendant 20 s; λ excitation, 405 nm (bande passante, 4 nm); λ émission, 602 nm (bande passante, 4 nm).
4.1.4 Résultats : Microscopie de fluorescence
La Figure 4.1-8 montre une image en microscopie de fluorescence de cellules P388D1
incubées pendant 3 h avec 300 µM de δ-ala. La fluorescence apparaît répartie de manière
diffuse dans l'ensemble du cytosol avec des spots intenses et une délimitation nette de la
membrane plasmique. La zone noire observée dans la plupart des cellules correspondrait,
d'après les données de la littérature, au noyau cellulaire (Moan et al., 1990; Gaullier et al.,
1995; Krammer et Überriegler, 1996).
227
Figure 4.1-8 : Image obtenue en microscopie de fluorescence. Cellules P388D1 incubées en
présence de δ-ala (300 µM, 3 h).
Objectif 25 X à immersion; les longueurs d'onde d'excitation, du miroir dichroïque et d'émission sont, respectivement, 425 ± 20 nm, 460 nm et 590 nm (long pass); un filtre de densité neutre (Zeiss, 0.25) est incorporé sur le trajet optique d'excitation.
4.1.5 Discussion et conclusion
L'incubation des cellules P388D1 avec l'acide δ-aminolévulinique induit l'apparition d'une
espèce fluorescente intracellulaire, avec un plateau entre 2 et 4 h d'incubation, ainsi que
l'excrétion continue d'une seconde espèce fluorescente. Les données spectrales, obtenues à la
fois à pH physiologique et en milieu HClO4 : méthanol, sont en accord avec celles publiées
pour la protoporphyrine IX (espèce intracellulaire) et les porphyrines hydrosolubles (espèces
228
excrétées, uro et/ou coproporphyrines), suggérant que le traitement appliqué induit bien les
composés escomptés.
Il nous semble peu probable que les porphyrines solubles puissent être synthétisées à
partir de la PPIX en excès. Leur formation par oxydation des porphyrinogènes correspondants
et leur excrétion pourrait être due à des "fuites" dans le cycle de synthèse de l'hème, la
coordination des cinétiques enzymatiques n'étant peut-être pas absolue dans ces conditions
extra-physiologiques. La régulation des enzymes du cycle de synthèse de l'hème apparaît en
fait extrêmement complexe et commence à peine à être étudiée (Afonso et al., 1999).
4.2 RESULTATS : PORPHYRINES ET DEGATS PHOTODYNAMIQUES AUX ACIDES NUCLEIQUES
4.2.1 Induction de bases oxydées
Pour la première fois, nous montrons que l'activation photodynamique des cellules traitées
par l'acide δ-aminolévulinique induit la formation de 8-oxodG et de 8-oxoG, et ce aussi bien
pour les radiations UVA que les radiations visibles (Figure 4.2-1).
Figure 4.2-1 : Production de guanines oxydées par irradiation lumineuse.
Chromatogramme CLHP après digestion enzymatique des acides nucléiques.
Cellules P388D1 incubées en présence de δ-ala (1 mM, 3 h) et irradiées pendant 30 min (4°C; 560 mJ/cm² pour la lampe UVA; 21.4 J/cm² pour la lampe visible). Conditions chromatographiques validées dans la Section 3. Détection ampérométrique sur carbone vitreux (700 mV vs Ag/AgCl).
229
4.2.1.1 Identification de la 8-oxodG
L'identité du pic de la 8-oxodG a été confirmée par co-injection avec un étalon et par
comparaison des rapports de signaux acquis à différents potentiels (Tableau 4.2-1).
Tableau 4.2-1 : Identification de la 8-oxodG dans des cellules P388D1 soumises à un des
stress photooxydants étudiés (δ-ala, 1 mM, 3 h suivi de 30 min d'irradiation UVA , 560 mJ/cm²) .
Rapports de pics à différents potentiels. (n = 3; moyennes; entre parenthèses, étendue des 3 x 3 valeurs)
Potentiels
(mV) 8-oxodG
étalon Cellules stressées
(δ-ala + UVA)
700 / 650 1.10 (1.02– 1.15) 1.03 (1.00 – 1.06)
700 / 600 1.49 (1.30 – 1.70) 1.46 (1.41 – 1.51)
700 / 550 2.35 (1.94 – 2.90) 2.57 (2.41 – 2.84)
650 / 600 1.36 (1.19 – 1.58) 1.42 (1.37 – 1.47)
650 / 550 2.14 (1.78 – 2.69) 2.51 (2.34 – 2.76)
600 / 550 1.59 (1.21 – 2.11) 1.77 (1.64 – 1.96)
4.2.1.2 Photooxydation de l'ADN et de l'ARN
Le pic attribué à la 8-oxoG sur le chromatogramme (Figure 4.2-1) est bien un pic de
l'ARN; il disparaît en effet complètement lorsque les acides nucléiques sont traités par un
mélange RNase A et RNase T1 et purifiés par précipitation avant l'étape de digestion par la
nucléase P1. L'identité du pic a été confirmée par co-injection avec un étalon depuis peu
disponible commercialement.
La méthode étant entièrement optimisée pour l'analyse de la dG et de la 8-oxodG, le pic de
la guanosine plafonne dans la plupart des échantillons, ce qui rend toute mesure du rapport
8-oxoG/105 G impossible. Comme il nous semblait que le pic de 8-oxoG était toujours
beaucoup plus élevé que le pic de 8-oxodG, nous avons dosé les 4 bases G, dG, 8-oxoG et
8-oxodG dans quelques échantillons afin de vérifier ce phénomène (Tableau 4.2-2).
L'ARN apparaît en effet systématiquement plus sensible à la photooxydation que l'ADN.
230
Tableau 4.2-2 : Comparaison de la photooxydation de l'ADN (8-oxodG) et de l'ARN (8-oxoG) après induction des porphyrines dans les cellules P388D1.
Source de lumièreEchantillon (a) n (b) Temps d'irradiation (min)
8-oxodG par 105 dG (c)
8-oxoG par 105 G (c,d)
Contrôle 6 --- --- 0.49 ± 0.17 0.55 ± 0.17 NS
Lumière visible 4 visible 30 2.11 ± 0.48 8.15 ± 0.28 ***
Lampe UVA 1 UVA 5 0.70 2.90
1 UVA 20 2.66 11.20
1 UVA 30 4.54 24.30
1 UVA 40 5.68 21.72
3 UVA 60 10.37 ± 2.19 26.61 ± 0.53 **
Cellules contrôle + milieu traité (e) 3 UVA 60 0.79 ± 0.16 1.03 ± 0.15 NS
Cellules traitées + milieu contrôle (e) 3 UVA 60 5.74 ± 0.40 25.86 ± 2.04 **
4.2.2
(a) Les cellules P388D1 ont été incubées en présence de δ-ala (1 mM, 3 h) (b) Irradiation à 4°C (0.31 mW/cm² pour la lampe UVA; 11.9 mW/cm² pour la lampe visible)(c) Moyenne ± écart étalon (d) Test t de Student pour la différence entre l'induction de 8-oxodG et de 8-oxoG
(***, p< 0.001; **, p < 0.01; NS, p > 0.05)
(e) Les échantillons ont été préparés et irradiés comme décrit en 4.2.2.3
Paramètres impliqués dans la photooxydation de l'ADN
4.2.2.1 Influence de la température d'irradiation et du temps de chargement en acide δ-aminolévulinique
Nous nous attendions à ce que l'oxydation de l'ADN soit température-dépendante. En
effet, les taux de 8-oxodG sont la résultante de 3 mécanismes différents, dont les cinétiques
sont probablement influencées par la température, à savoir (i) la photodestruction de la PPIX;
(ii) la resynthèse continue de porphyrines en cours d'irradiation; et (iii) l'excision de la base
oxydée par les mécanismes cellulaires de réparation 61.
Lorsque nous irradions à 4°C, l'oxydation de l'ADN dépend du temps de chargement en
acide δ-aminolévulinique (Figure 4.2-2), en accord avec la cinétique d'induction de PPIX de
la Figure 4.1-6. 61 Remarquons que le base excision repair, le mécanisme principal de réparation des lésions 8-oxodG, est bien température-dépendant mais reste en partie fonctionnel à 4°C. A partir de mesures d'incision, l'étape limitante des mécanismes de réparation, Hjertvik et al ont montré que, entre 37°C et 4°C, la vitesse d'incision de bases méthylées passe d'environ 6000 à 300 cassures simple-brin par cellule par minute (Hjertvik et al., 1998).
231
Figure 4.2-2 : Influence du temps de chargement en acide δ-aminolévulinique (1 mM). Irradiation à 4°C
0
1
2
3
4
5
Contrôle 1 3 5
Temps de chargement (h)
8-ox
odG
par
105 d
G
Non irradiéUVAVisible
NS NSNS
*
**
***
***
***
***
Cellules P388D1 incubées en présence de δ-ala (1 mM, 3 h) et irradiées pendant 30 min (4°C; 560 mJ/cm² pour la lampe UVA; 21.4 J/cm² pour la lampe visible). Les points représentent la moyenne et les barres correspondent à la SEM (n = 6). Test t de Student pour la différence vis-vis des contrôles respectifs (***, p< 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05)
Nos essais de traitement à 37°C marquent une tendance similaire mais se sont avérés peu
reproductibles. Cette forte variabilité est due à une importante condensation observée à
l'intérieur des boîtes de culture pendant l'irradiation à cette température. A 4°C par contre, la
faible condensation qui se forme en début d'irradiation disparaît en quelques minutes.
Comme nous n'avons pu résoudre le problème de manière satisfaisante, nous avons
poursuivi le reste du travail en irradiant à 4°C.
4.2.2.2 Influence de la dose de lumière et de la concentration en acide δ-
aminolévulinique
La formation de 8-oxodG croît avec la dose de lumière, celle-ci étant modulée par le
temps d'irradiation (Figure 4.2-3). Cette augmentation pourrait être due à la plus grande
probabilité qu'une cellule individuelle en suspension absorbe la lumière au fur et à mesure de
232
Figure 4.2-3 : Influence du temps d'irradiation (dose de lumière) sur la production de 8-oxodG
0
4
8
12
16
0 20 40 60
Temps d'irradiation (min)
8-ox
odG
par
105 d
G
Lumière visible (11.9 mW/cm²) UVA (0.31 mW/cm²)
Cellules P388D1 incubées en présence de δ-ala (1 mM, 3 h) et irradiées (4°C). Les points représentent la moyenne et les barres correspondent à l'étendue des valeurs (n = 3).
Figure 4.2-4 : Influence de la concentration en acide δ-aminolévulinique sur la production de 8-oxodG
0
2
4
6
0 500 1000 1500 2000
Dose en acide δ-aminolévulinique (µM)
8-ox
odG
par
105 d
G
Lumière visible (11.9 mW/cm²) UVA (0.31 mW/cm²)
Cellules P388D1 incubées en présence de δ-ala (1 mM) et irradiées. (4°C; 30 min, correspondant à 560 mJ/cm² pour la lampe UVA et 21.4 J/cm² pour la lampe visible).Les points représentent la moyenne et les barres correspondent à l'étendue des valeurs (n = 3).
233
l'irradiation; elle pourrait également suggérer une vitesse faible de photodestruction de la
PPIX ou une resynthèse continue de porphyrines fraîches à partir de l'acide δ-
aminolévulinique présent dans le milieu de culture.
Nous n'avons pas mis en évidence d'effet de la concentration en acide δ-aminolévulinique
dans le domaine étudié (300 à 1600 µM) (Figure 4.2-4).
4.2.2.3 Influence des porphyrines intra- et extracellulaires
L'influence des porphyrines intracellulaires et des porphyrines excrétées dans le milieu de
culture a été étudiée en croisant avant irradiation le surnageant de cellules contrôles et de
cellules chargées en acide δ-aminolévulinique (Figure 4.2-5).
Le surnageant des cellules traitées par δ-ala ne présente pas d'effet photodynamique sur
les cellules contrôles (Figure 4.2-6). L'effet de l'irradiation lumineuse sur les cellules chargées
en δ-ala est systématiquement inférieur à l'effet observé en présence du milieu de chargement;
ce qui pourrait s'expliquer par une synthèse réduite en PPIX pendant l'irradiation dans le
milieu contrôle au fur et à mesure de la déplétion en δ-ala intracellulaire.
Figure 4.2-5 : Protocole appliqué pour étudier l'influence des porphyrines intra- et
extracellulaires
δ-ala Contrôle δ-ala1mM 1mM
Pré-incubation (3h)Centrifugation
Croisement des milieuxde culture
Mise en suspensionIrradiation UVAAnalyse 8-oxo-dG
δ-ala Contrôle δ-ala1mM 1mM
Pré-incubation (3h)Centrifugation
Croisement des milieuxde culture
Mise en suspensionIrradiation UVAAnalyse 8-oxo-dG
234
Figure 4.2-6 : Effet photodynamique des porphyrines intra- et extracellulaires
0
5
10
0 10 20 30 40 60Temps d'irradiation (min)
8-ox
odG
par
105 d
G
Cellules Traitées + Milieu TraitéCellules Traitées + Milieu ContrôleCellules Contrôle+ Milieu Traité
Cellules P388D1 incubées en présence de δ-ala (1 mM, 3 h) et irradiées après l'échange des milieux de culture décrit en Figure 4.2-5 (30 min; 4°C; 0.31 mW/cm² pour la lampe UVA; 11.9 mW/cm² pour la lampe visible). Les points représentent la moyenne et les barres correspondent à l'étendue des valeurs (n = 3).
4.3 RESULTATS : TESTS DE CYTOTOXICITE MTT
Les courbes de survie ont été établies pour l'effet létal de différentes doses de δ-ala
combinées avec des irradiations UVA et visibles, et ce dans les conditions suivantes : 3 h de
chargement en δ-ala et 30 min d'irradiation à 4°C (soit 560 mJ/cm² pour la lampe UVA et
21.4 J/cm² pour la lampe visible) (Figure 4.3-1). Une comparaison avec les Figures 4.2-2 et
4.2-4 montre que, pour des combinaisons de lumière et de δ-ala induisant une faible mortalité
cellulaire, des dommages significatifs sont induits dans l'ADN.
235
Figure 4.3-1 : Cytotoxicité de l'acide δ-aminolévulinique combiné avec des radiations UVA et visibles
0
50
100
10 10
Co
% c
ellu
les
viva
ntes
0
50
100
10 10
Co
% c
ellu
les
viva
ntes
Cellules P388D1 incubées en présence lumière visible 30 min, soit 21.4 J/cm²).expériences en quadruplicat (les points
Irradiation UVAIrradiation UVA
0 1000 10000
ncentration en δ-ala (µM)
e
Irradiation visibleIrradiation Visibl0 1000 10000
ncentration en δ-ala (µM)
de δ-ala (3 h) et irradiées (4°C; UVA 30 min, soit 560 mJ/cm²; Les courbes ont été ajustées à l'ensemble des résultats de 2 ● et ○ représentent, respectivement, les expériences 1 et 2).
236
4.4 DISCUSSION
4.4.1 La problématique de la carcinogenèse solaire, des UVA et de la 8-oxodG
Comme nous l'avons souligné dans l'introduction (Section 1.4), le potentiel carcinogène
de la lumière solaire serait principalement une conséquence de l'excitation directe des
chromophores de l'ADN par les UVB pour former des photoproduits dimères au niveau des
sites dipyrimidiques (Peak et Peak, 1989). Les UVA sont cependant des carcinogènes
complets, jouant un rôle à la fois d'initiateur et de promoteur (de Laat et al., 1997). Leur
contribution à la carcinogenèse cutanée (10 à 20 %) s'ajouterait de manière arithmétique à
celle des UVB (Kelfkens et al., 1990).
Les radiations UVA génèrent des modifications oxydatives dans l'ADN, incluant cassures
de chaînes, sites abasiques et liens croisés (Peak et Peak, 1989) mais aussi une base oxydée, la
8-oxodG (Tableau 4.4-1). Ces propriétés mutagènes sont médiées par des radicaux libres et
l'implication majeure de l'oxygène singulet (1O2), probablement formé via un mécanisme de
photosensibilisation de Type II, a été établie (Kelfkens et al., 1990; Kvam et Tyrrell, 1997b).
Une contribution du radical hydroxyle (•OH) (Rosen et al., 1996) n'a pu être exclue (Kelfkens
et al., 1990) ou confirmée (Kvam et Tyrrell, 1997b). Les photosensibilisants endogènes
impliqués dans la génération du 1O2 ne sont cependant pas encore identifiés. A partir de
données spectroscopiques, le NADP, le NADPH, la bilirubine (Rosenstein et al., 1983), les
porphyrines (Cadet et al., 1997; Pflaum et al., 1998) et la riboflavine (Yamamoto et al., 1992)
ont été suspectés mais aucune indication de leur possible implication dans un événement
carcinogène n'a encore été rapportée in vivo.
Outre ces effets initiateurs, rappelons que les UVA peuvent également induire certaines
voies de signalisation intracellulaires ainsi que des facteurs de transcription impliqués
notamment dans la prolifération et la différenciation (cf § 1.3.4.2.5).
237
Tableau 4.4-1 : Données publiées quant à la photoinduction de la 2'-désoxyguanosine dans l'ADN
Source de lumière principale(a)
Type d'échantillon
Dose de lumière appliquée (J / cm²)
8-oxodG dans l'ADN
(8-oxodG/105 dG)
Références
ADN en solution 0.1 - 2.5 17 - 2200 (Wei et al., 1996; Zhang et al., 1997a; Zhang et al., 1997b; Wei et al., 1998a; Wei et al., 1998b)
UVC
Cellules in vitro (Hela et CHO) 0.001 - 1 0.6 - 22 (Zhang et al., 1997a; Douki et al., 1999)
ADN en solution 2.5 - 30 18 - 140 (Zhang et al., 1997a; Zhang et al., 1997b; Liu et al., 1998)
Cellules in vitro (cellules épidermiques de souris 291.09; cellules épithéliales de rat ARL-18; cellules Hela; carcinome epidermoïde humain A431)
0.2 - 20 0.16 - 4.6 (Beehler et al., 1992; Rosen et al., 1996; Zhang et al., 1997a; Liu et al., 1998)
Kératinocytes BALB/c MK-2 0.1 - 0.75 2 - 27.1 (Stewart et al., 1996)
Cellules CHO 0.025 - 0.15 1.1 - 1.6 (Douki et al., 1999)
Animaux (b) (épiderme) 2 - 5 (c)
(chronique) 5.9 - 8.8 (Wei et al., 1998b)
UVB
Homme (épiderme) 2 x MED (d) Taux élevés détectés (immunomarquage)
(Ahmed et al., 1999)
ADN en solution 0.1 - 40 3.5 - 77 (Ito et al., 1993; Arimoto-Kobayashi et al., 1997; Ito et Kawanishi, 1997a; Wamer et al., 1997; Zhang et al., 1997a; Zhang et al., 1997b; Liu et al., 1998)
Cellules épithéliales de rat ARL-18
0 - 20 2 - 3.75 (Rosen et al., 1996)
Fibroblastes de peau humaine CRL 1634
0 - 80 1.5 - 7.8 (Wamer et Wei, 1997)
Fibroblastes primaires de peau humaine FEK4
0 - 120 5 - 17 (Kvam et Tyrrell, 1997b)
Cellules lymphoblastoïdes humaines TK6 en croissance exponentielle
Pas d'effet
Cellules Hela
Cellules de carcinome epidermoïde humain A431
(Liu et al., 1998)
• à confluence (e)
0 - 120
3.5 - 6
(Kvam et Tyrrell, 1997b)
Cellules de mélanome humain (GLL19) en croissance exponentielle
0 - 120 4.8 - 13.8 (Kvam et Tyrrell, 1997b)
0 - 120 (Kvam et Tyrrell, 1997b)
0 - 40 2 - 3.5 (Zhang et al., 1997a)
Cellules épithéliales de rat ARL-18
0 - 20 Aucun effet sans photosensibilisant
(Verna et al., 1998)
UVA
0 - 2.5 Aucun effet sans photosensibilisant
• en croissance exponentielle
238
Tableau 4.4-1 (Suite) : Photoinduction de la 2'-désoxyguanosine dans l'ADN
1 - 4.7
UVA (suite) Cellules CHO 0 - 100
0 - 100
1 - 2.9
(Douki et al., 1999) (Douki et al., 1999)
ADN en solution n.a.(f) 230 (Mauthe et al., 1995) Lumière visible
Cellules in vitro (lymphome de souris L5178Y; fibroblastes embryonnaires de poumon humain VA13; embryon de cobaye; carcinome mammaire humain MCF-7)
n.a.(f) Aucun effet sans photosensibilisant
(Yamamoto et al., 1992; Mauthe et al., 1995)
ADN en solution 1.68 684 (Fischer-Nielsen et al., 1992) UVC + UVB + UVA
Cellules CHO V79 4.56 10 - 13 (Fischer-Nielsen et al., 1993)
UVA + UVB Animaux (b) (épiderme) 33.5 2 - 6 (c)
(chronique)
11.3 6 - 15
(Hattori-Nakakuki et al., 1994; Hattori et al., 1996)
Lumière solaire
Cellules CHO 160 - 460 2 - 21 (Douki et al., 1999)
• UVL9 (déficientes en réparation par excision de nucléotides)
• AT3-2 (réparation-compétentes)
(a) Les conditions expérimentales (bandes UV, lampes, filtres, radiomètres et lignées cellulaires) varient selon les auteurs; les caractéristiques sont détaillées dans chaque référence.
(b) Souris nues (c) Dose totale (d) MED = dose minimale érythémale (e) Les auteurs ont également déterminé sur ce modèle le spectre d'action pour la formation de 8-oxodG
(irradiation avec des longueurs d'onde quasi- monochromatiques) (f) n.a. : données non disponibles
Le spectre d'action pour la formation de la 8-oxodG dans l'ADN a été déterminé62 sur des
fibroblastes humains primaires à confluence (Figure 4.4-1) (Kvam et Tyrrell, 1997b).
Ces données, ajustées par la fluence solaire des différentes bandes de longueur d'onde,
montrent que les radiations UVA (au-dessus de 334 nm) et visibles courtes causent
pratiquement toute l'oxydation de la guanine par la lumière solaire (Figure 4.4-2).
62 Par CLHP avec détection électrochimique
239
Figure 4.4-1 : Spectre d'action : rendements relatifs en 8-oxodG et en dimères bipyrimidiques
● Rendements relatifs en 8-oxodG
□ Rendements relatifs en dimères bipyrimidiques ••• Spectre d'action pour la carcinogenèse cutanée humaine (c
Les données sont calculées pour la couche basale de l'épiderme humain (70 µm épLes spectres pour la carcinogenèse et les dimères bipyrimidiques sont normalisés àpour la 8-oxodG est normalisé pour que les rendements en dimères et en 8-oxodG
Figure 4.4-2 : Spectre d'action : vitesses de production comparées de 8-oxbipyrimidiques
● Vitesse de production de 8-oxodG à 1 h p.m.
Vitesse de production de 8-oxodG à 9 h a.m. □ Vitesse de production des dimères bipyrimidiques à 1 h p.
Vitesse de production des dimères bipyrimidiques à 9 h a.
Les données sont calculées pour la couche basale de l'épiderme humain (70 µm épsolaire mesuré en juillet à Albuquerque, Nouveau-Mexique. Les spectres sont normalisés à 1 pour la 8-oxodG à 405 nm
(Kvam et Tyrrell, 1997)
f Fig. 1.4-4)
aisseur) 1 à 302 nm; le spectre soient égaux à 365 nm
odG et des dimères
(Kvam et Tyrrell, 1997)m. m.
aisseur) et un spectre
240
La phase de croissance des cellules influence de manière diverse l'induction de 8-oxodG
par les UVA (Kvam et Tyrrell, 1997b) (Tableau 4.4-1), ce qui indique que d'autres facteurs
non encore identifiés participent probablement au phénomène. Le spectre d'action pour
l'induction de lésions reconnues par la FPG 63 a également été établi sur des cellules
mammifères; ce spectre montre 2 zones de dégât maximal, de 290 à 315 nm et de 400 à 450
nm, avec un minimum à environ 350 nm (cf Section 5.6.2).
Le rôle de la 8-oxodG et des autres bases oxydées vis-à-vis de la carcinogenèse solaire
reste cependant incertain (Kvam et Tyrrell, 1997b; Douki et al., 1999); les spectres
mutationnels (cf § 1.4.3.3) indiquent en effet une contribution mineure des lésions oxydatives
au processus global de mutagenèse UV. Même dans la région UVA, un rôle majeur peut être
attribué aux lésions dipyrimidiques, qui mènent à des transitions G:C A:T, alors que la
mutation signature attendue pour la 8-oxodG et certaines autres lésions oxydatives, la
transversion G:C T:A, ne représente qu'une fraction des mutations induites (Kvam et al.,
1994). De plus, bien que les dimères bipyrimidiques et la 8-oxodG soient induits à des
vitesses similaires par l'ensemble du spectre solaire (Douki et al., 1999), la base oxydée
pourrait être réparée de manière plus efficace; elle est en effet excisée à un taux 1.5 fois
supérieur à celui des dimères (Reardon et al., 1997).
4.4.2 Porphyrines et dommages à l'ADN
Le présent travail montre que l'activation lumineuse des porphyrines dérivées de l'acide δ-
aminolévulinique induit des dégâts oxydatifs à l'ADN cellulaire, dégâts qui dépendent
essentiellement de la dose de lumière. Les radiations UVA et visibles sont toutes deux
photoactives; les 2 sources utilisées dans ce travail émettant en partie dans la bande de Soret
des porphyrines, aux alentours de 410 nm. Ce chromophore majeur pourrait être impliqué
dans l'effet observé (Pflaum et al., 1998), en accord avec les spectres d'action pour l'induction
de 8-oxodG dans l'ADN cellulaire (Kvam et al., 1994; Kielbassa et al., 1997) (§ 4.4.1).
Rappelons que les porphyrines ont longuement été suspectées d'être des
photosensibilisants endogènes (del C. Battle, 1993; Pflaum et al., 1994; Friedberg et al., 1995;
Cadet et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999). A partir de descriptions de phénotypes
cellulaires malins mais aussi d'études menées sur le comportement métabolique général des
cellules cancéreuses, il a même été proposé que les troubles et anomalies du métabolisme de
63 FPG : formamidopyrimidine glycosylase; cette endonucléase reconnaît principalement les purines oxydées, induisant des cassures de chaîne mesurées par élution alcaline dans les études mentionnées ici.
241
l'hème puissent constituer une lésion générale initiatrice de la carcinogenèse (del C. Battle,
1993).
4.4.2.1 Porphyrines et dommages aux acides nucléiques
Les dommages induits par une irradiation lumineuse des porphyrines ont été
principalement étudiés pour des composés exogènes sur de l'ADN en solution (Moan et al.,
1990; Kvam et al., 1994).
La photoactivation des dérivés d'hématoporphyrine (HpD) provoque des cassures simple-
brin et des sites alcali-labiles (Moan et al., 1990); différents dérivés de porphyrines, qu'ils se
lient ou pas à l'ADN, induisent la photodégradation de la guanine pour former une série de
photoproduits, parmi lesquels la 8-oxodG (Kvam et al., 1994). La lumière combinée au HpD
n'induit cependant des dégâts que dans l'ADN simple-brin, ce qui a été expliqué par le fait que
ces dérivés ne se lient pas à l'ADN (Kawanishi et al., 1986). Le compactage dans la
chromatine protégeant l'ADN des dégâts oxydatifs (Enright et al., 1996), l'ARN et l'ADN
simple-brin, formé localement par le déploiement de la double-hélice pendant la transcription
et la réplication, pourraient donc être d'importantes cibles. Nos résultats (Figure 4.2-1 et
Tableau 4.2-2) montrent que l'ARN est effectivement plus sensible à la dégradation
photodynamique que l'ADN. Cependant, la plupart de l'ARN étant cytosolique plutôt que
nucléaire, nos données pourraient simplement indiquer que les espèces oxydantes sont
générées principalement dans le cytosol.
Bien qu'une plus grande sensibilité de l'ARN aux dégâts oxydatifs induits par les UVA ait
déjà été rapportée (Wamer et Wei, 1997), aucune conséquence biologique n'a été décrite.
Selon nous, il est probable que les cassures de chaînes concomitantes à l'attaque oxydative
mènent simplement à une inactivation de l'ARN oxydé et à sa dégradation.
Seules les porphyrines qui se lient aux cellules sont capables de sensibiliser celles-ci. Les
uroporphyrines, qui sont hydrosoluble et capables de générer du 1O2 par photoactivation, n'ont
aucune activité photosensibilisante (Moan et al., 1990). Ceci est en accord avec nos données
qui montrent que les porphyrines solubles excrétées dans le milieu de culture n'induisent pas
de dégât photodynamique à l'ADN cellulaire (Figure 4.2-6).
4.4.2.2 Localisation intracellulaire des porphyrines et dommage à l'ADN
Après synthèse dans la mitochondrie, la PPIX se relocalise dans le cytoplasme, se lie aux
membranes mais ne s'accumule pas dans le noyau (Gaullier et al., 1995; Krammer et
Überriegler, 1996) (Figure 4.1-8).
242
Pour le HpD exogène, la fluorescence porphyrique est visible au niveau de la membrane
nucléaire, alors que le noyau lui-même n'exhibe aucune fluorescence significative (Moan et
al., 1990). Des échanges de chromatides sœurs et des aberrations chromosomiques ont été
induites par photoactivation du HpD; les chromosomes sont principalement endommagés au
niveau des régions télomèrique et centromérique qui sont supposées être en contact avec la
membrane nucléaire (Moan et al., 1990). Au cours de la phase initiale d'exposition à la
lumière, il est possible que le HpD puisse en fait se relocaliser dans le noyau (Moan et al.,
1988; Krammer et Überriegler, 1996). Une telle relocalisation, qui a également été proposée
pour les phthalocyanines (He et al., 1998) et démontrée pour la meta-(tétrahydroxyphényl)-
chlorine (Rousset et al., 2000) n'a pas été encore mise en évidence pour la PPIX. A l'heure
actuelle, nous ne pouvons donc préciser si l'effet photodynamique que nous montrons est
direct (génération de 1O2 à proximité de l'ADN) ou indirect (amplification des radicaux
générés par la péroxydation lipidique de la membrane nucléaire). Des évènements purement
cytosoliques sont effectivement capables d'induire des mutations, un mécanisme médié par
des espèces radicalaires (Wu et al., 1999).
Comme la PPIX est synthétisée dans les mitochondries, il est possible qu'une partie,
peut-être même la majorité, des dégâts 8-oxodG soit en fait localisée dans l'ADN
mitochondrial (ADNmt). Cet ADN représente environ 1 % de l'ADN total et son
recouvrement par les méthodes d'extraction de l'ADN nucléaire (ADNn) est estimé à environ
70 %, ce qui implique une contamination faible d'ADNmt dans l'ADNn (Richter et al., 1988).
Cependant, l'extraction de l'ADNmt pour les études de dégâts oxydatifs représente encore un
défi considérable, de nombreux artéfacts se rencontrant au cours de l'isolation de l'organelle;
les valeurs publiées relatives aux dégâts oxydatifs de base de l'ADN mitochondrial varient
d'un facteur supérieur à 60000 (Beckman et Ames, 1999) et les conséquences biologiques de
son oxydation sont encore largement inconnues.
Afin de vérifier si l'ADN nucléaire est bien touché par le phénomène de photooxydation
de la PPIX, nous avons donc préféré procéder à des mesures de type comète qui seront
présentées dans le chapitre 5 de ce travail.
4.4.2.3 Activité pro-oxydante de l'acide δ-aminolévulinique
Différentes études ont démontré que l'acide δ-aminolévulinique est, par lui-même, un pro-
oxydant capable d'endommager l'ADN (clivage et production de 8-oxodG) et de générer un
produit de dégradation alkylant. Ses propriétés pro-oxydantes permettraient notamment
d'expliquer les syndromes neurologiques qui se manifestent lors d'une déficience en activité
243
de l'HMB synthase, déficience observée dans certaines porphyries (Tableau 4.1-1), dans les
intoxications au plomb et la tyrosinémie de Type I. De plus, les attaques oxydantes et
alkylantes de l'ADN par l'acide δ-aminolévulinique pourraient élucider les propriétés
carcinogènes du plomb (Monteiro et al., 1989; Hermes-Lima et al., 1991; Fraga et al., 1994;
Hiraku et Kawanishi, 1996; Neal et al., 1997; Douki et al., 1998).
Le δ-ala augmente la production d'espèces réactives de l'oxygène et la peroxydation
lipidique (Monteiro et al., 1989; Hermes-Lima et al., 1991); il inhibe la prolifération cellulaire
et affecte le rapport GSH/GSSG et l'activité de la catalase (Neal et al., 1997). Les propriétés
oxydantes de l'acide δ-aminolévulinique vis-à-vis de l'ADN ont d'abord été mises en évidence
sur de l'ADN isolé, mais seulement en présence de CuII et, dans une moindre mesure, en
présence de FeII (Fraga et al., 1994; Hiraku et Kawanishi, 1996); l'ADN simple-brin s'avère
plus sensible que l'ADN duplex. Le traitement de rats par l'acide δ-aminolévulinique induit la
formation de 8-oxodG dans le foie (Fraga et al., 1994). L'acide δ-aminolévulinique pourrait en
fait promouvoir sa propre auto-oxydation par le fer; il est en effet capable de relarguer du fer
de la ferrritine (Oteiza et al., 1995) et un traitement chronique de rats par le δ-ala mobilise le
fer dans le cerveau et le foie (Demasi et al., 1996).
Au point de vue mécanistique, l'oxydation catalysée par les métaux convertit le δ-ala en
acide 4,5-dioxovalérique (DOVA); à concentration élevée, 2 molécules de δ-ala peuvent
également se condenser spontanément en un dérivé dihydropyrazine qui s'oxyde en présence
de CuII en une pyrazine (Hiraku et Kawanishi, 1996). Ces processus d'oxydation majeur et
mineur résulteraient en ROS capables d'endommager l'ADN. Le DOVA est en outre un
alkylant efficace de la guanine, au niveau du nucléoside et de l'ADN (Douki et al., 1998).
Dans l'ensemble de nos expériences, nous n'avons mis en évidence aucune toxicité de
l'acide δ-aminolévulinique dans des conditions d'obscurité, que ce soit en terme de
cytotoxicité (aucun effet jusque 6 mM, 48 h) ou de dommages oxydatifs à l'ADN. Il est
cependant possible qu'une accumulation de δ-ala entame les défenses antioxydantes de la
cellule et qu'un traitement pro-oxydant additionnel, l'irradiation de la PPIX induite, finisse par
totalement dépasser ces capacités de défense. Les dégâts à l'ADN pourraient donc provenir,
non pas directement de l'effet photodynamique, mais plutôt d'une surcharge générale en
espèces radicalaires.
244
4.4.3 Implications possibles de l'effet photodynamique mis en évidence
4.4.3.1 La carcinogenèse solaire
La régulation fine de la synthèse de l'hème est encore largement inconnue, si ce n'est le
rétro-contrôle bien connu exercé par l'hème sur l'ALA synthase (§ 4.1.1.1.2). Par exemple, les
différences observées dans la synthèse de porphyrines à partir de δ-ala exogène64, en fonction
du tissu ou du statut prolifératif des cellules sont encore inexpliquées (Dougherty et al., 1998);
de même, les phases de synthèse physiologique de l'hème et les facteurs déclenchants ne sont
toujours pas identifiés. Les schémas complexes de régulation, différents en fonction des
conditions d'obscurité ou d'éclairage et qui commencent à peine à être élucidés (Afonso et al.,
1999), pourraient peut-être présenter une implication dans la carcinogenèse solaire.
Des études précédentes (Pflaum et al., 1994; Pflaum et al., 1998), basées sur l'élution
alcaline après FPG, ont en effet montré que les dégâts photooxydatifs à l'ADN dépendent du
type cellulaire et pourraient se corréler avec le taux basal en porphyrines; la génotoxicité de la
lumière visible, mesurée par l'induction des micro-noyaux, et la cytotoxicité ne deviennent
significatives qu'après induction de la synthèse des porphyrines.
Nous formons l'hypothèse qu'une cellule de la couche basale de la peau en phase active de
synthèse d'hème serait susceptible, suite à une exposition solaire naturelle ou artificielle, de
subir une photooxydation de PPIX, accompagnée de la production d'espèces radicalaires et de
dommages oxydatifs à l'ADN. En l'absence de production d'hème, et donc de rétro-contrôle,
la synthèse endogène d'acide δ-aminolévulinique ne serait pas un facteur limitant65; ce qui
pourrait donc impliquer une synthèse et une photodégradation continues de la PPIX, les
dégâts à l'ADN croissant avec la dose de lumière et finissant par excéder les capacités de
réparation cellulaires.
4.4.3.2 La thérapie photodynamique (PDT)
L'utilisation clinique des thérapies photosensibilisantes a mené à une série d'études de
génotoxicité. Les investigations menées sur la PDT à base de HpD et de phthalocyanines ont
montré que la mutagénicité varie en fonction du locus du gène cible étudié (Deahl et al.,
1993), de la dose de PDT, de la nature du photosensibilisant, du délai entre l'addition du
photosensibilisant et l'application de lumière (He et al., 1998), des capacités de réparation
64 Différences mises à profit en thérapie et diagnostic photodynamique (cf § 4.1.1.3.3) 65 C'est aussi le cas pour notre modèle expérimental dans lequel le δ-ala est continuellement disponible pendant l'irradiation
245
cellulaires, du statut p53 (Evans et al., 1997) et de la sensibilité de la cellule aux effets létaux
du traitement (Ramakrishnan et al., 1989).
Une revue exhaustive (Fuchs et al., 2000) des données obtenues pour les porphyrines
mène à la conclusion que le risque réel d'un carcinome de la peau secondaire à un traitement
PDT topique semble très faible. Les auteurs mettent en balance le potentiel génotoxique et les
propriétés pro-oxydantes évidentes de cette thérapie avec les propriétés antioxydantes et
antimutagènes des porphyrines elle-mêmes. Tout semble indiquer que, lorsque la dose
combinée de porphyrine et de lumière est suffisante pour tuer effectivement les cellules, la
probabilité de maintenir des dommages génétiques serait extrêmement faible. Cette revue
souligne également le manque de preuves pouvant indiquer un taux élevé de cancer en cas de
syndrome de photosensibilisation porphyrique dû à une accumulation cutanée de PPIX; il
semble que la réaction à la lumière de ces patients soit telle qu'ils subissent en fait une
véritable thérapie photodynamique qui détruit les cellules photoactivées.
Ceci pourrait ne pas être le cas pour des dosages photodynamiques plus faibles qui
pourraient être rencontrés dans des cellules, normales ou prédisposées au cancer66, qui
synthétiseraient des taux physiologiques de PPIX sous des conditions normales ou excessives
d'exposition solaire.
Bien qu'une thérapie potentiellement carcinogène soit acceptable pour le traitement de
cancers, l'application de la PDT à d'autres pathologies telles que les infections bactériennes
(van der Meulen et al., 1997) ou l'acné (Ramstad et al., 1997) mérite certainement des études
risque-bénéfice poussées.
4.4.3.3 Le diagnostic photodynamique
La photoactivation (le plus souvent par les UVA) des porphyrines induites par
administration de δ-ala permet une détection in situ des tumeurs, une voie de recherche
activement poursuivie (Dougherty et al., 1998). Comme nous l'avons souligné, il y a
cependant une forte variation de la synthèse des porphyrines en fonction du tissu ou de la
tumeur et la spécificité de la détection est plus ou moins absolue.
En fonction de l'organe, des longueurs d'onde employées, de la fluence, des schéma
d'administration de lumière et d'acide δ-aminolévulinique, un risque de dommage oxydatif à
l'ADN de cellules normales ou pré-cancéreuse ne peut être exclu. Cei devrait évidement être
investigué.
66 Par exemple les cellules dont le p53 est inactivé par une mutation; rappelons que des îlots clonaux de telles cellules sont fréquents dans les zones exposées au soleil (§ 1.4.5.1.2.1)
246
4.5 CONCLUSIONS
Une revue globale de la mutagenèse solaire montre que la problématique est
extraordinairement complexe. Les lésions oxydatives monomères semblent n'avoir que des
conséquences mineures dans le phénomène (cf § 4.4.1) mais leur implication ne peut
cependant être exclue (Kvam et Tyrrell, 1997b; Douki et al., 1999). De fait, certains
mécanismes de mutation, induites de manière plus efficace par les UVA et la lumière visible
que par les UVB et UVC, restent en partie inexpliqués, notamment au niveau des paires de
bases A:T (Kvam et Tyrrell, 1997b).
Même si le rôle de la 8-oxodG elle-même s'avérait mineur dans la mutagenèse solaire,
rappelons que cette base est avant tout considérée comme un biomarqueur sensible; elle
indique que les défenses cellulaires ont été suffisamment malmenées pour que l'ADN soit
oxydativement endommagé. Sa présence prouve dès lors qu'il est tout à fait possible que
d'autres bases oxydées, lésions monomères ou tandem, peut-être non encore mises en
évidence, soient induites.
L'implication de la photodestruction de la PPIX sur les dégâts à l'ADN demande que la
régulation fine de la synthèse de l'hème soit mieux connue pour en établir les phases dans le
cycle cellulaire. Ceci permettrait notamment d'évaluer le risque d'exposition solaire à des
moments peut-être cruciaux.
247
5. Résultats et Discussion :
Essai "comète"et photoactivation des porphyrines endogènes
248
5.1 L'ESSAI COMETE
5.1.1 Principe
L'essai comète, qui fait partie des méthodes d'estimation de cassures de chaînes, se réalise
en plusieurs étapes :
(i) les cellules sont soumises au traitement à évaluer; elles sont ensuite séparées sous
forme d'une suspension de cellules individualisées, rincées et coulées sur une lame
de microscope dans un gel d'agarose à point de fusion bas;
(ii) les lames sont traitées par une solution de lyse, contenant une concentration élevée
en sel et un détergent;
(iv)
(iii) elles sont alors rincées et placées dans une solution de dénaturation au pH requis
pour le test de manière à permettre un déroulement et une dénaturation de l'ADN,
soumises à une électrophorèse, rincées et séchées;
après fixation d'un fluorophore, les structures obtenues, qui présentent une forme de
comètes, c'est-à-dire de noyaux munis d'une "queue" s'étalant vers l'anode (Figure
5.1-1), sont examinées en microscopie de fluorescence et mesurées grâce à un
logiciel d'analyse d'images.
Figure 5.1-1 : Exemples de comètes (essai comète en milieu fortement alcalin)
Cellules P388D1 non stressées Cellules P388D1 stressées (Ethylméthylsulfonate, 2 mM, 6 h)
CA
TH
OD
E
T Q
T Q
AN
OD
E
T : Centre de masse de la tête Q : Centre de masse de la queue
249
En fonction du pH de la solution de dénaturation/électrophorèse, 3 types d'essai comète
sont distingués : (i) une solution "neutre" (en fait, pH 7.5 à 9.5) relâche les super-hélices des
nucléoïdes et permet la migration des fragments double-brins (Ostling et Johanson, 1984); (ii)
une solution "faiblement alcaline"(pH 12.1) dénature l'ADN, permettant la migration des
fragments simple-brins; et (iii) une solution "fortement alcaline"(pH > 13) révèle les sites
alcali-labiles sous forme de cassures supplémentaires (Fairbairn et al., 1995).
5.1.2 Mécanisme
La fragmentation induirait un état de relaxation des super-hélices d'ADN qui, sous l'effet
du champ électrique, s'étirent et/ou migrent vers l'anode et ce, d'autant plus que la densité de
cassures de chaînes est élevée.
En milieu neutre, les fragments double-brins restent accrochés à des structures
nucleoïdiques. Une seconde électrophorèse, perpendiculaire à la première, ne montre aucune
migration provenant de la queue initiale; seuls des fragments provenant de la tête sont libérés
dans la direction perpendiculaire. Les fragments double-brins ne font donc que s'étirer
(Klaude et al., 1996). En milieu alcalin par contre, une seconde électrophorèse montre une
migration, à la fois à partir de la tête et de la queue. Il semble donc qu'il existe 2 types de
fragments mono-brins, des fragments de petite taille, capables de se déplacer librement, et des
fragments de grande taille, en partie non individualisés et enchevêtrés au niveau du noyau, qui
ne peuvent que s'étirer (Klaude et al., 1996).
La plupart des agents génotoxiques induisant 5 à 10000 fois plus de cassures simple-brins
que double-brins, l'introduction de la technique alcaline a permis d'atteindre une sensibilité
nettement supérieure (Singh et al., 1988).
La signification biologique des lésions simple-brins observées n'est cependant pas connue;
la plupart sont rapidement réparées et ne sont pas significativement létales ou mutagènes
(Rojas et al., 1999). Les effets biologiques induits par une fragmentation double-brins sont
plus sévères que ceux provoqués par des cassures simple-brins, la réparation s'avérant
nettement plus délicate (Olive et al., 1991).
5.1.3 Applications de l'essai comète
L'essai comète connaît de plus en plus d'applications dans des domaines divers; il a été
appliqué en génotoxicité (Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999), en écotoxicologie (Cotelle
et Ferard, 1999), en biomonitoring (Kassie et al., 2000; Moller et al., 2000), en radiobiologie
(Olive, 1999), à l'étude des mécanismes de réparation (Speit et Hartmann, 1995; Alapetite et
250
al., 1997), à l'étude des agents alkylants (Monteith et Vanstone, 1995) et des agents oxydants
(Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999), à l'étude de formation de liens croisés (Pfuhler et
Wolf, 1996), à la détection de l'apoptose (Fesus et al., 1991); son utilisation a également été
proposée en thérapeutique pour mettre en évidence des sous-populations de cellules
résistantes ou hypoxiques (Olive et al., 1990; Olive et al., 1998).
Une revue récente, très complète, recense les nombreux agents testés par le test comète
pour leur génotoxicité (Rojas et al., 1999); ceux-ci incluent notamment des métaux, des
pesticides, des opiacés, des nitrosamines, des agents anticancéreux. L'essai est apparemment
très (trop ?) sensible; environ 85 % des agents testés donnent en effet une réponse positive
dont la signification biologique reste obscure (cf § 1.4.2.1). Remarquons cependant un biais
certain de publication, beaucoup plus de génotoxiques que de non-génotoxiques ayant été
testés à ce jour.
5.2 LA PLACE DE L'ESSAI COMETE DANS LES TESTS DE GENOTOXICITE
5.2.1 Génotoxiques et tests de génotoxicité
Un génotoxique est habituellement défini comme "un agent qui induit une réponse
positive dans un essai biologique dont le point final est génétique" (Brusick, 1994). Cette
définition, qui considère que tous les types de dégâts à l'ADN se traduisent par une
génotoxicité, n'est cependant pas indicatrice d'un risque. Il s'agit simplement d'un moyen
pratique de classer les composés en 2 groupes, "génotoxique" et "non-génotoxique" (Brusick,
1994).
La génotoxicité, telle que définie ci-dessus, semble être une propriété assez générale des
composés chimiques. Elle doit donc être évaluée globalement, à partir d'un faisceau de
preuves; une conclusion ne peut être basée que sur un profil de réponses obtenu à travers une
batterie de tests. Comme il est fréquent que l'ensemble des tests réalisés diverge quant à
l'indication du risque, l'appréciation du danger posé par un composé ne peut alors reposer que
sur une interprétation raisonnée de l'ensemble des preuves (Brusick, 1994; IARC, 1999;
Muller et al., 1999; Albertini et al., 2000) .
La complexité du problème est immense et les autorités réglementaires tentent de mettre
au point une évaluation du danger en définissant (i) une batterie type de tests qui permettrait
de classer les produits; mais surtout (ii) une stratégie permettant d'adapter et de compléter
cette batterie pour confirmer ou infirmer un risque impliqué par des résultats douteux ou
251
positifs (Brusick, 1994; EEDP, 1995; Rueff et al., 1996; IARC, 1999; Kim et Margolin, 1999;
Marzin, 1999; Muller et al., 1999; Waters et al., 1999; Albertini et al., 2000).
Le problème reste entier pour les mécanismes épigénétiques de carcinogénicité qui ne sont
généralement pas évalués dans ces tests (IARC, 1999; Tsuda et al., 1999).
5.2.2 Les différents tests de génotoxicité
Les tests de génotoxicité peuvent être groupés en 3 catégories : (i) les indicateurs
généraux du potentiel génotoxique, qui incluent les test bactériens de mutagénicité, les tests
de dommages à l'ADN, les méthodes cytogénétiques et les tests pour l'induction d'enzymes
microsomiales; (ii) les biomarqueurs de l'exposition d'organismes entiers à des agents
génotoxiques (cf § 1.2.9); et (iii) les intégrateurs des effets génotoxiques, qui évaluent un
point final sur des organismes entiers, lésions cancéreuses chez les adultes et morphologies
aberrantes d'embryons ou de larves (EEDP, 1995).
Nous n'aborderons dans ce travail que la première catégorie d'indicateurs, les tests de
génotoxicité in vitro à court terme, qui seront rapidement décrits.
5.2.2.1 Les tests de mutagénicité
5.2.2.1.1 Test bactérien de Ames
Ce test mesure la fréquence de réversion de mutation de souches de Salmonella
typhimurium auxotrophes pour l'histidine, en présence et en l'absence de S9, un système
d'activation microsomial mammifère. Une base de données considérable est établie pour ce
test de mutagénicité, certainement le plus employé au monde et récemment adapté à l'échelle
de micro-méthode (Marzin, 1999). En fonction de la souche employée, des mutations par
substitution de base et de décalage du cadre de lecture (frameshift) peuvent être détectées
(Brusick, 1994; EEDP, 1995).
5.2.2.1.2 Test bactérien Mutatox®
Ce test mesure la réversion du caractère luminescent d'une souche de Vibrio fischeri dont
la luminescence a été abolie par une mutation (EEDP, 1995).
5.2.2.1.3 Mouse lymphoma assay
Une mutation forward de cellules murines L5178Y hétérozygotes au niveau du locus
thymidine kinase (Tk+/-) vers un génotype homozygote Tk-/- permet à celles-ci de pousser en
présence de 5-trifluoro-thymidine, un analogue de thymidine toxique pour l'hémizygote
(Brusick, 1994).
252
5.2.2.1.4 Test HPRT
Une mutation forward de lymphocytes au niveau du gène codant pour l'hypoxanthine-
guanine phosphoribosyltransférase (HPRT) rend ces cellules résistantes à l'analogue 6-
thioguanine; ce gène, localisé sur le chromosome X, répercute diverses mutations, incluant
des substitutions de paires de bases, des délétions et des recombinaisons de chromosomes
hétérologues (Albertini et al., 2000).
5.2.2.2 L'estimation des dommages primaires à l'ADN
5.2.2.2.1 Mesure d'adduits à l'ADN
Tous les adduits à l'ADN décrits dans la partie 1.1 et 1.2 de ce travail peuvent être
mesurés à l'aide de nombreuses méthodes analytiques; l'adduit 8-oxodG que nous avons
envisagé est un des adduits principaux, indicateur d'un stress oxydatif au niveau de l'ADN.
5.2.2.2.2 Unscheduled DNA synthesis
Ce test mesure l'incorporation de thymidine tritiée au cours des processus de réparation de
l'ADN après lésion génotoxique.
5.2.2.2.3 Détection d'ADN endommagé
Le "test 3-D" utilise de l'ADN plasmidique adsorbé sur des plaques multi-puits. Après
traitement génotoxique, l'ADN est soumis à l'action d'un extrait protéique reproduisant
diverses réactions de réparation en présence de désoxynucléotides monophosphates
digoxygénylés. L'incorporation des désoxynucléotides marqués est ensuite mesurée par
chimioluminescence. Une variante procède de même sur des cellules en culture, lysées in situ
après le traitement génotoxique (Marzin, 1999).
5.2.2.3 L'estimation des dommages primaires à l'ADN par mesure de la fragmentation
5.2.2.3.1 L'essai comète
L'essai comète fait partie de ces méthodes qui permettent la quantification (i) de cassures
de chaînes primaires, directement induites par une attaque génotoxique; (ii) de cassures de
chaînes secondaires, apparaissant au cours des phénomènes de réparation; et (iii) de
nombreuses autres lésions qui peuvent être transformées en cassures de chaîne par des
moyens chimiques (certaines lésions, comme les sites AP, peuvent être révélées par un
traitement fortement alcalin) ou enzymatiques (les enzymes de réparation excisent
spécifiquement certaines lésions, générant soit un site AP, soit une cassure) (Epe et Hegler,
1994). En fonction du pH, les techniques permettent également la distinction entre
fragmentations double-brins (milieu proche de la neutralité) et simple-brins (milieu alcalin,
dénaturation des chaînes d'ADN).
253
5.2.2.3.2 La sédimentation en gradient de sucrose
Les molécules d'ADN sédimentant à des vitesses différentes en fonction de leur taille, la
fragmentation peut être évaluée par des méthodes de centrifugation en gradient de sucrose.
La technique est cependant sujette à de nombreux artéfacts, dont certains dépendent des
propriétés physiques de l'ADN lui-même (Ahnstrom, 1988).
5.2.2.3.3 le "DNA unwinding"
Après déroulement en milieu alcalin, les fragments d'ADN sont séparés en fonction de
leur taille par chromatographie sur hydroxyapatite (Ahnstrom, 1988; Chicca et al., 1996).
5.2.2.3.4 La cytométrie de flux
L'acridine orange émet une fluorescence, verte lorsqu'elle est liée par de l'ADN double-
brin et orange par de l'ADN simple-brin; les 2 fluorescences sont mesurées grâce à un
cytomètre de flux (Rydberg, 1984).
5.2.2.3.5 L'élution sur filtre
Les cellules sont lysées sur un filtre polymère et éluées par des solutions de différents pH;
les profils d'élution en fonction du temps permettent d'estimer la fragmentation (Kohn et al.,
1976; Ahnstrom, 1988; Munzer et al., 1988; Epe et Hegler, 1994).
5.2.2.3.6 Les techniques visco-élastiques
La viscosité de l'extrait d'ADN, fonction de la fragmentation, est mesurée par des
méthodes physiques (Ahnstrom, 1988).
5.2.2.3.7 L'électrophorèse en champ pulsé
Un champ pulsé à travers une série d'électrodes disposées géométriquement permet une
haute résolution des fragments d'ADN de masse moléculaire élevée (Ahnstrom, 1988)
(Frenkel et Klein, 1993; Smeets et al., 1993). Elle convient mieux à l'étude des fragmentations
double-brins que l'électrophorèse à courant fixe (Frenkel et Klein, 1993; Yu et Anderson,
1997)
5.2.2.3.8 La sédimentation de nucléoïdes
En fonction de l'état de fragmentation de l'ADN, qui conditionne le reploiement de la
double hélice, les nucléoïdes, structures nucléaires obtenues par lyse ménagée des cellules,
sédimentent de manière différente en gradient de sucrose (Ahnstrom, 1988).
5.2.2.3.9 La technique "halo"
Après lyse ménagée des cellules coulées dans un gel d'agarose, les nucléoïdes se relâchent
pour former un halo autour d'un noyau dense d'ADN. En fonction de la fragmentation, le halo
254
sera plus important. C'est une technique similaire à un essai comète dont on omettrait la phase
d'électrophorèse (Thomas et Thomas, 1989; Wang et al., 1997; Sestili et Cantoni, 1999).
5.2.2.4 Les analyses cytogénétiques
Ces tests permettent la mise en évidence d'aberrations chromosomiques (i) dans la
structure des chromosomes; ces effets clastogéniques sont induits par une attaque directe de
l'ADN, une réplication sur une matrice (template) endommagée ou une interférence dans la
synthèse de l'ADN; et (ii) dans le nombre des chromosomes; aneuploïdie et polyploïdie sont
induites par des dégâts aux éléments associés au faisceau mitotique, des dommages aux sous-
structures chromosomiques, des altérations physiologiques et des dégâts mécaniques
(Albertini et al., 2000).
5.2.2.4.1 Les aberrations chromosomiques
Les cellules sont bloquées en métaphase par addition de colchicine, fixées sur lames,
colorées par du Giemsa et examinées au microscope pour repérer les aberrations
chromosomiques telles que cassures, délétions ou aneuploïdie. Un marquage par hybridation
avec des sondes fluorescentes (FISH) permet de localiser les lésions et d'améliorer
sensiblement la qualité de la détection. La fréquence maximale d'aberrations chromosomiques
est observée dans les cellules en métaphase de la première génération après exposition au
toxique (Albertini et al., 2000).
5.2.2.4.2 Les micronoyaux
Les micronoyaux sont des particules intracellulaires, contenant de l'ADN nucléaire et
détectables par examen microscopique; leur taille est définie entre 1/20 et 1/5 d'un noyau et
elles peuvent par exemple contenir un chromosome ou un morceau de chromosome (Muller et
al., 1999). Ils sont mis en évidence par un blocage de la mitose par la cytochalasine-B avant la
cytocinèse, ce qui génère donc des cellules binucléées.
Cette technique, fortement utilisée, est en cours de validation au niveau international.
Couplée aux techniques FISH, elle permet la mise en évidence de clastogènes et d'aneugènes
ainsi que l'estimation de paramètres fondamentaux comme le retard de mitose (fréquence de
cellules binucléées), l'apoptose (fréquence de noyaux condensés), la fragmentation et/ou perte
de chromosome et la non-disjonction de chromosomes.
5.2.2.4.3 Les échanges de chromatides sœurs
Les échanges de chromatides sœurs sont des échanges réciproques d'ADN entre les loci
apparemment identiques des 2 chromatides sœurs d'un chromosome dupliqué. Bien que la
fréquence d'échanges de chromatides sœurs soit augmentée par un génotoxique qui induit des
255
dommages capables d'interférer avec la réplication, leur mécanisme de formation reste
inconnu et leur signification biologique obscure (Albertini et al., 2000).
5.2.2.5 Les tests de transformation cellulaire
Ces tests évaluent les transformations histologiques qui accompagnent la carcinogenèse;
ils se pratiquent par exemple sur des lignées de fibroblastes murins (C3H, Balb/3T3) ou des
cellules d'embryon de hamster (SHE).
5.2.2.6 Un exemple de batterie de tests
Dans le cadre de ICH (International conference on harmonisation of technical
requirements for registration of pharmaceuticals for human use), un effort a été entrepris en
vue d'un consensus sur une batterie minimale de tests et une stratégie d'évaluation. La batterie
actuellement obligatoire pour les médicaments comprend (i) un test de mutation sur bactérie;
(ii) un test in vitro, soit une évaluation cytogénétique des dégâts chromosomiques dans une
lignée cellulaire mammifère, soit un mouse lymphoma assay; et (iii) un test in vivo des
dommages chromosomiques aux cellules hématopoïétiques (Muller et al., 1999).
5.3 VALIDATION DE L'ESSAI COMETE
La technique comète étant implantée dans le laboratoire au cours du présent travail, nous
avons donc décidé de procéder à une validation de la méthode afin d'assurer la qualité des
données générées. Remarquons cependant qu'une validation classique ne s'applique pas à ce
type de mesures. En effet, les paramètres estimés, le Olive tail moment et le tail DNA, sont
dérivés de mesures semi-quantitatives et relatives (§ 2.4.3.1); pour chaque cellule mesurée, ils
dépendent notamment d'un rapport de signaux de fluorescence.
D'autre part, un goupe de travail (Comet assay working group), composé de spécialistes
du domaine, n'a pas pu déduire une méthode plus appropriée qu'une autre parmi les
différentes variantes publiées; il conclut simplement que "la méthode employée devrait
pouvoir détecter des agents étalons à des doses appropriées" (Tice et al., 2000).
Nous avons donc étudié sur notre modèle cellulaire P388D1 les point suivants :
1. la reproductibilité de la mesure brute
2. la possibilité de mettre en évidence dans notre laboratoire les effets décrits dans la
littérature pour quelques génotoxiques, incluant notamment des composés
photooxydants
256
3. la différence de sensibilité entre les mesures comète et CLHP en évaluant les
échantillons dont les taux de 8-oxodG ont été modulés pour la validation du
dosage CLHP (§ 2.2.4.4).
Une fois ces points acquis, nous avons étudié sur les mêmes cellules P388D1 traitées par
l'acide δ-aminolévulinique et la lumière le problème de reproductibilité inter-électrophorèses
ainsi que celui de la mise en évidence statistique d'un effet. Ces résultats font l'objet du § 5.4.
5.3.1 Reproductibilité
L'étude67 a été réalisée en considérant la séquence typique des opérations d'une mesure de
comète (les paramètres d'acquisition de la caméra sont réglés pour chaque lame de manière
standardisée, en fonction de l'intensité de la coloration) :
• l'opérateur positionne une cellule dans la region of interest (cf § 2.4.4.4.2) en
manipulant les commandes de la platine du microscope et règle la focale qui lui
semble donner la meilleure mise au point;
• la caméra acquiert l'image et la place en mémoire;
• le logiciel mesure les paramètres comètes et présente visuellement le résultat de la
mesure (Figure 2.4-2);
• si l'opérateur n'accepte pas le résultat proposé, il modifie les seuils head threshold
et/ou tail threshold et remesure les paramètres sur l'image acquise.
Pour étudier l'ensemble du processus, nous avons évalué la reproductibilité de mesure :
(i) d'une image acquise;
(ii) d'une même comète acquise lors de chaque mesure;
(iii) d'une même comète acquise en conditions réelles, c'est-à-dire en déréglant et en
re-réglant pour chaque mesure les coordonnées de la platine du microscope
(écarter l'image de la region of interest et l'y ramener) ainsi que la focale;
(iv) d'une série de comètes par plusieurs opérateurs entraînés.
Pour les 3 premiers points étudiés, les paramètres head threshold et tail threshold ont été
ajustés avant de commencer les mesures qui ont été ensuite acceptées telles quelles, sans
modifier aucun paramètre, de manière à tester la reproductibilité du système; des mesures qui
auraient été normalement rejetées68 en pratique courante sont donc incorporées dans les
67 Nous remercions Mme M. Bette et M. G. Dehon de nous avoir apporté leur aide pour ces mesures 68 Un examen des profils d'intensité (§ 2.4.3.2) permet d'estimer visuellement si la mesure est satisfaisante.
257
résultats. Pour la comparaison inter-opérateurs, chacun a reçu pour consigne de mesurer en
conditions réelles et d'appliquer les paramètres de mesure qui lui semblent les plus adéquats
en fonction de son expérience.
5.3.1.1 Reproductibilité de la mesure brute d'une image acquise
Une image acquise a été mesurée à 20 reprises par le logiciel Komet, et ce pour une
cellule "contrôle" (non endommagée) et pour 2 cellules présentant respectivement environ 35
et 80 % d'ADN dans la queue. (Tableau 5.3-1).
Tableau 5.3-1 : Paramètres principaux mesurés par le logiciel Komet sur une image acquise
Cellule 1 Cellule 2 Cellule 3
Mesure Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surfacede la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
1 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
2 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
2 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
4 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
5 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
6 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
7 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
8 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
9 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
10 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
11 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
12 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
13 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
14 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
15 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
16 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
17 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 20.86 64.47
18 3008.55 20.86 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47
3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
20 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
m 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
s 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CV % 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
19
Pour une image placée en mémoire, le logiciel est parfaitement reproductible, quel que
soit le niveau de dommages mesuré.
258
5.3.1.2 Reproductibilité de la mesure brute d'une même image acquise lors de chaque mesure
Une image a été acquise et mesurée à 20 reprises par le logiciel Komet, et ce pour une
cellule "contrôle" (non endommagée) et pour 2 cellules présentant respectivement environ 35
et 80 % d'ADN dans la queue. (Tableau 5.3-2).
Tableau 5.3-2: Paramètres principaux mesurés par le logiciel Komet sur une image acquise
lors de chaque mesure
Cellule 1 Cellule 2 Cellule 3
Mesure Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surfacede la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
1 3151.99 0.79 2105.59 22.34 0.14 3808.3 38.41 36.55 4.84 80.28 50.25 20.96
2 3018.74 0.87 25.38 0.17 3969.24 38.52 61.42 4.93 2129.11 80.8 51.78 21.61
2 3454.02 0.91 35.03 0.18 3510.45 38.34 38.58 4.68 2144.52 81.04 55.84 20.8
4 2998.1 0.63 14.72 0.1 3940.24 38.68 48.73 4.87 2043.93 79.79 50.25 21.25
5 3300.13 0.91 26.4 0.18 3493.99 38.82 36.04 4.79 2255.56 82.08 47.21 20.66
6 3313.45 0.95 3848.01 29.44 0.19 39.17 37.56 4.92 2494.63 80.4 69.54 22.14
7 3094.77 0.86 21.83 0.15 3696.48 33.98 35.03 4.48 2205.4 78.13 50.76 19.73
8 3651.28 1.17 34.01 0.26 3529.26 33.99 33.5 4.44 2264.71 77.29 50.76 20.33
9 3454.28 1.06 26.4 0.2 3776.43 39.21 41.62 4.92 2279.6 79.63 59.9 21.09
10 3110.7 0.83 25.38 0.15 3752.39 39.34 42.13 4.9 2154.45 81.52 47.21 21.13
11 3460.55 1.06 30.46 0.22 3716.33 39.38 38.07 4.87 2145.83 78.76 51.27 19.97
12 3157.21 0.79 25.38 2203.31 0.12 4003.21 39.67 59.9 5.04 82.85 67.51 20.96
13 3593.8 81.49 1.25 35.53 0.26 3972.64 34.83 59.9 4.65 2120.22 48.73 21.43
14 3282.36 0.78 18.27 0.14 3712.41 39.56 36.55 4.8 2061.44 79.97 50.76 21.13
15 2762.69 0.61 14.72 0.1 3777.21 35.05 34.01 4.6 2156.54 80.12 47.72 21.24
16 3176.55 0.73 23.86 2329.24 0.14 3669.3 35.19 45.69 4.57 80.97 62.44 21.78
17 3494.51 1.05 29.44 0.21 3883.81 35.51 37.06 4.64 2183.97 79.23 48.22 20.78
18 3704.31 1.18 31.98 0.26 3918.3 40.28 61.42 4.98 2195.21 80.69 68.53 21.02
19 3506.01 0.91 25.38 0.19 3893.21 35.62 60.41 4.72 2187.37 80.87 47.72 21.47
20 3327.56 0.97 24.37 0.19 4124.96 35.82 57.36 4.86 2237.27 81.55 67.51 21.37
m 3300.65 0.92 26.02 0.18 3799.81 37.47 45.08 4.78 2194.90 80.37 54.70 21.04
s 243.06 0.18 5.94 0.05 170.71 2.16 10.74 0.17 100.60 1.34 8.02 0.57
CV % 7% 19% 23% 6% 28% 4% 24% 4% 5% 2% 15% 3%
Pour des mêmes comètes acquises et mesurées, les performances du système sont
nettement inférieures; ce problème, apparent lors du travail courant, nécessite de fréquents
ajustements de l'utilisateur. Le paramètre le plus affecté est le tail length, ce qui se reflète sur
le Olive tail moment. Les performances sont les moins bonnes dans le cas de cellules non
endommagées.
259
5.3.1.3 Reproductibilité de la mesure brute d'une image acquise en conditions réelles
Une image a été acquise en déréglant et en re-réglant pour chaque mesure la focale ainsi
que les coordonnées de la platine du microscope et mesurée à 20 reprises par le logiciel
Komet, et ce pour une cellule "contrôle" (non endommagée) et pour 2 cellules présentant
respectivement environ 35 et 80 % d'ADN dans la queue. (Tableau 5.3-3).
Tableau 5.3-3 : Paramètres principaux mesurés par le logiciel Komet sur une image acquise
lors de chaque mesure
Cellule 1 Cellule 2 Cellule 3
Mesure Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surfacede la
comète
Olive Tail
Moment
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
1 3240.56 1.61 36.55 0.27 3803.6 4.89 37.37 44.16 3154.6 84.29 55.84 25.81
2 3320.51 0.79 30.96 0.18 3786.88 34.88 34.01 4.59 3537.1 82.58 73.1 25.42
2 3555.39 1.76 34.52 0.32 3929.79 36.52 40.1 4.8 3349.51 83.95 56.35 24.48
4 3332.52 1.18 25.89 0.21 3556.7 36.93 34.52 4.64 3308.75 83.06 54.82 24.9
5 3426.32 1.07 29.44 0.2 3888.77 34.81 45.69 4.51 3225.14 83.89 52.79 25.51
6 3196.92 0.77 38.07 0.15 4474.02 36.31 57.87 5.17 3242.65 87.28 58.38 26.64
7 3532.14 1.44 38.07 0.32 3770.94 35.86 33.5 4.68 3173.93 85.37 62.94 25.96
8 3620.71 1.44 26.4 0.29 3746.38 37 34.52 4.62 3442.78 81.99 50.76 22.91
9 3410.64 1.02 37.06 0.23 4315.95 40.96 67.51 5.25 3136.31 84.12 55.33 25.81
10 3527.69 1.31 36.55 0.33 3917.25 39.14 35.03 4.95 3014.3 84.54 52.79 25.78
11 3604.25 1.32 34.52 0.23 3761.27 39.48 37.06 4.94 2985.03 86.83 54.31 26.68
3192.74 0.63 0.12 3723.91 36.86 41.62 4.66 (a)
3694.65 1.56 33.5 0.34 4126.27 34.11 37.06 4.83
14 3361.26 1.04 32.49 0.18 4103.54 36.65 53.81 4.95
15 3767.54 1.95 43.65 0.52 3851.93 39.91 36.04 4.9
16 3543.63 1.26 21.32 0.27 3798.37 39.04 37.06 4.81
17 3761.01 1.65 42.64 0.48 3679.49 35.15 33.5 4.53
18 3755.79 1.31 41.62 0.36 3885.38 42.13 33.53 4.53
19 3371.45 1.01 42.13 0.21 3753.43 37.87 37.06 4.67
20 3310.84 1.18 30.46 0.23 3786.35 37.22 37.06 4.7
3476.33 1.27 34.65 0.27 36.98 40.97 4.78 3233.65 84.35 57.04 25.45
s 186.78 0.34 5.98 0.10 219.69 1.99 9.09 0.21 168.60 1.63 6.22 1.06
CV % 5% 27% 4% 17% 38% 6% 5% 22% 4% 5% 2% 11%
12 37.06
13
m 3883.01
(a) Cette mesure est beaucoup plus longue à réaliser que celles des Tableaux 5.3-1 et 5.3-2; pour des cellules aussi endommagées, le bleaching nous a empêché de réaliser plus de 11 mesures
Nous arrivons au même type de conclusion que précédemment; la mise au point manuelle
et optique des comètes n'ajoute quasi rien à la variabilité de l'acquisition d'image.
260
5.3.1.4 Reproductibilité inter-opérateurs de la mesure brute
Une série de 10 images différentes a été acquise par 3 opérateurs, chaque image étant
acquise par chaque opérateur à 3 reprises dans les conditions du § 5.3.1.3 (Tableau 5.3-4);
nous avons volontairement choisi des comètes montrant des dégâts d'intensités différentes.
Tableau 5.3-4 : Paramètres principaux mesurés par le logiciel Komet sur une image acquise
lors de chaque mesure
Opérateur 1 (D.G.) Opérateur 2 (D.P.) Opérateur 3 (B.M.)
Cellule Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surfacede la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
Surface de la
comète
Tail DNA
Tail length
Olive Tail
Moment
1 3687.33 55.00 40.61 5.44 3683.94 55.79 37.06 5.36 3877.8 58.62 42.13 5.61
3512.28 55.91 3732.79 55.17 5.54 37.06 5.42 41.12 5.29 3630.64 58.23 39.09
3927.18 58.07 42.13 5.60 3813.00 58.62 58.38 37.06 5.56 3399.93 43.65 5.48
2 3667.48 56.37 44.16 7.09 2674.12 58.48 46.7 7.66 2819.39 58.43 39.59 6.78
2727.16 58.20 40.10 6.70 2631.27 55.61 37.06 6.57 2909.79 55.19 38.58 6.50
2567.78 56.35 38.07 6.56 2701.81 57.15 6.58 2963.09 6.89 39.09 58.43 39.09
3 1000.41 0.86 1698.53 0.10 3.55 0.10 0.81 5.58 1526.61 0.59 7.61 0.08
1030.20 0.12 1728.58 0.08 1.02 4.57 0.54 6.09 1606.04 0.92 6.60 0.11
926.47 0.53 3.05 0.07 1707.67 0.52 5.08 0.07 3.55 1358.35 0.37 0.05
4 1149.07 17.68 29.44 1.36 2328.19 14.78 39.09 1.58 30.46 2159.41 12.36 1.25
2454.39 13.79 38.07 1.44 2270.72 15.21 38.07 1.51 2215.85 14.92 36.55 1.45
2685.09 18.89 38.58 1.78 2445.77 17.91 43.65 1.73 1986.97 9.28 30.96 1.01
5 2151.58 2.27 31.98 2.91 0.58 2164.12 2.19 28.43 0.47 3151.99 25.89 0.75
2471.89 3.25 0.83 2.48 32.49 0.66 37.06 2270.98 2636.50 3.04 41.62 0.83
2090.44 2.12 25.89 0.49 2267.84 2.54 29.44 0.65 2637.28 2.46 36.04 0.45
6 5291.02 57.57 53.81 50.25 12.59 51.78 12.12 3420.31 60.38 3655.2 60.79 12.78
4996.3 59.14 12.74 58.21 58.88 12.89 3577.86 54.31 3430.76 58.77 49.24 12.54
3585.17 57.83 54.31 12.27 3741.94 58.99 54.82 12.99 3478.05 58.71 50.25 12.61
7 1925.05 35.89 36.04 4.87 2164.64 39.78 35.03 4.82 2306.25 39.2 28.93 4.77
1933.94 37.82 35.03 5.18 2152.62 34.32 29.44 4.58 2200.96 39.21 30.46 4.72
2036.09 41.61 36.04 5.39 2121.53 38.34 27.92 4.56 2111.34 37.91 29.95 4.42
8 1847.98 43.22 2078.94 45.89 6.49 43.65 43.15 5.78 43.15 1967.64 49.21 6.03
2024.34 48.54 44.67 6.28 2033.48 48.13 43.65 6.07 1860.78 45.80 44.67
1933.94 43.50 41.12 5.81 1917.48 50.30 42.64 6.33 1992.46 49.95 45.69 6.84
9 2432.44 53.09 47.72 10.29 2533.29 57.43 47.21 10.76 2785.42 54.54 47.72 10.74
2578.75 53.43 47.72 10.50 2634.14 57.08 46.19 10.62 2686.40 54.35 47.21 10.60
2563.08 53.54 47.21 10.56 2667.33 58.40 48.22 10.84 2967.27 55.13 46.70 11.07
10 2585.81 48.16 39.59 6.91 2720.63 49.52 7.13 39.09 2944.80 49.82 40.10 7.24
2784.90 48.54 39.59 7.10 2842.38 53.18 40.10 7.39 2789.08 53.56 39.59 7.42
2653.48 50.48 39.59 7.13 2831.93 49.36 38.58 7.11 2729.77 54.35 38.58 7.46
5.8
261
En considérant que les conditions de normalité et d'homoscédasticité sont remplies par les
distributions des mesures de chaque opérateur, une analyse ANOVA à 2 facteurs de
classification a été effectuée pour chaque paramètre, en considérant un effet aléatoire, la
comète mesurée, et un effet fixe, l'opérateur (Tableau 5.3-5).
Tableau 5.3-5 : Comparaison de 3 opérateurs analysant 10 images différentes
1 facteur aléatoire, la comète; 1 facteur fixe, l'opérateur (***, p< 0.001; **, p<0.01; *, p<0.05)
Paramètre étudié
Source de variation
Somme des carrés
ddl Carré moyen F Probabilité du F observé
Opérateur 45221.371 2 22610.686 0.30 0.7446 NS
Image 47713707.448 9 5301523.050 22.07 < 0.001 ***
Interaction O x I 4323455.649 18 240191.981 3.15 < 0.001 ***
Surface de la comète
60 Résidu 4578565.862 76309.431
CV% = 10.6 %
Opérateur 13.997 2.57 2 6.998 0.0853 NS
Image 43995.528 9 4888.392 834.39 < 0.001 ***
Interaction O x I 105.456 18 5.859 2.15 0.0143 *
Tail DNA
Résidu 163.663 60 2.728
CV% = 4.3 %
Opérateur 8.722 2 4.361 0.54 0.5857 NS
Image 13517.702 9 1501.967 109.09 < 0.001 ***
Interaction O x I 247.828 18 13.768 1.70 0.0638 NS
Tail Length
Résidu 484.757 60 8.079
CV% = 7.7 %
Opérateur 0.083 2 0.041 0.75 0.4750 NS
Image 1368.776 9 152.086 1812.19 < 0.001 ***
Interaction O x I 1.511 18 0.084 1.53 0.1128 NS
Olive Tail Moment
Résidu 3.300 60 0.055
CV% = 4.2 %
Il n'y a pas d'effet opérateur, quel que soit le paramètre mesuré. Une interaction
opérateur X échantillon se marque cependant aux niveaux de la surface de la comète et du tail
DNA, indiquant que l'opérateur peut influencer la mesure de ces paramètres pour certaines
comètes. L'examen des résultats bruts montre que cette influence est relativement faible et
peut être considérée comme négligeable.
262
5.3.1.5 Conclusions
Cette étude montre que le plus grand facteur de variabilité provient de l'étape d'acquisition
d'image, notamment pour le paramètre tail length qui influence négativement le Olive tail
moment. Lorsque l'opérateur intervient pour corriger les mesures, la reproductibilité
s'améliore sensiblement pour ces 2 paramètres.
Les coefficients de variation mesurés sur 10 cellules différentes acquises à 3 reprises par 3
opérateurs différents sont de l'ordre de 4 % pour les 2 paramètres les plus usités dans la
littérature, le tail DNA et le Olive tail moment.
Nous pouvons donc estimer que la mesure de comètes est globalement fiable et qu'il n'y a
pas, du moins dans nos mains, de différence majeure entre opérateurs.
5.3.2 Mise en évidence de quelques effets génotoxiques décrits
Quelques effets génotoxiques publiés dans la littérature ont été reproduits au Laboratoire.
Soulignons qu'une comparaison entre ces résultats et les données publiées ne peut être
qu'essentiellement qualitative car chaque auteur teste des cellules et temps de contact
différents et emploie une méthode d'évaluation du dommage qui lui est propre. Nous69 avons
expérimenté sur notre modèle P388D1 une série de génotoxiques qui présentent des
mécanismes d'action différents : (i) le sulfate de bléomycine, un anticancéreux
radiomimétique, testé à 5 concentrations, 10, 25, 50, 75 et 100 µg/ml; (ii) l'éthyl-
méthanesulfonate (EMS), un agent alkylant monofonctionnel, testé à 3 concentrations, 2, 5 et
10 mM; (iii) le cis-platine, un agent qui se comporte au niveau biologique comme un alkylant
bifonctionnel et forme de nombreuses liaisons croisées, notamment intercaténaires, dans
l'ADN; il a été testé seul, à la dose de 537 µM, et en présence de 5 mM d'EMS, aux doses de
269 et 537 µM; et (iv) la N-nitroso-N-méthyl-éthylamine, une nitrosamine qui ne devient
génotoxique qu'après activation métabolique. La photoactivation des génotoxiques suivants a
été également testée : (i) la ciprofloxacine aux concentrations de 30 et 150 µM; et (ii) le
chlorhydrate de tétracycline aux concentrations de 1 et 2 µM.
En raison du caractère non-gaussien de la plupart des distributions (cf, plus loin, § 5.4),
nous avons choisi de présenter les résultats sous forme de box plots qui permettent une
comparaison rapide et aisée de différents échantillons. Ces box plot matérialisent (i) la
médiane, par la ligne à l'intérieur de la boîte; (ii) les percentiles 25 et 75, par les extrémités
69 L'ensemble de ces mesures a été réalisé avec le concours de Mlle Marjorie Blot, de M. Gilles Dehon et de M. Laurent Boccart, dans le cadre de leurs mémoires de fin d'études. Nous les remercions de leur collaboration efficace et enthousiaste.
263
inférieure et supérieure de la boîte; (iii) les percentiles 10 et 90, par les extrémités des tiges
inférieure et supérieure; et (iv) les valeurs expérimentales extrêmes, respectivement
inférieures et supérieures aux percentiles 10 et 90.
5.3.2.1 La bléomycine
L'activité biologique de la bléomycine requiert de l'oxygène et dépendrait de la formation
de chélates avec le fer; elle attaque le squelette osidique de l'ADN avec formation de sites AP
et cassures de chaînes (Jaloszynski et al., 1997). La Figure 5.3-1 présente les résultats
obtenus.
A partir de 50 µg/ml, un effet manifeste se présente par une augmentation de la médiane
des résultats, mais surtout par une augmentation de la dispersion (inter-quartile range). Dans
la zone de concentrations investiguée, il n'y a cependant pas de relation dose-effet pour le
temps étudié. Ces résultats peuvent être rapprochés des données70 rapportées par (Anderson et
al., 1994) qui observent des dégâts extrêmement faibles à 10.3 µg/ml et des dégâts fort
appréciables à 103 µg/ml (lymphocytes humains, 30 min de contact, mesures de tail moment).
Figure 5.3-1 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose de
sulfate de bléomycine (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; 50 comètes mesurées par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
Sulfate de bléomycine(µg/ml)
0 10 25 50 75 100
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Concentration de bléomycine(µg/ml)
0 10 25 50 75 100
Oliv
e Ta
il M
omen
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40
D'autres données montrent (i) un effet équivalent à 4 fois le témoin et à 12 fois le témoin
pour des concentrations de respectivement 10 et 50 µg/ml (lymphocytes humains de patients
cancéreux, 10 min de contact, somme des scores attribués visuellement aux comètes)
(Jaloszynski et al., 1997); (ii) un effet significatif entre 1.4 et 7 µg/ml (leucémie murine
L1210, 48 h, tail length) (Kasamatsu et al., 1995); et (iii) un effet significatif pour les
70 Nous avons converti en µg/ml les doses publiées en utilisant les facteurs suivants fournis par Sigma : Mr du composé A2 majoritaire = 1416.58; l'activité moyenne du sulfate de bléomycine est de 1.45 U/mg
264
concentrations comprises entre 0.34 et 9.9 µg/ml sans relation dose-effet (cellules CHO, 1 h
de contact, tail length) (Miyamae et al., 1997a). Rappelons que la haute sensibilité du
paramètre tail length explique certainement les résultats rapportés aux doses les plus faibles.
5.3.2.2 L'éthylméthanesulfonate (EMS)
Les cassures de chaînes induites par l'EMS ont une double origine; elles proviennent à la
fois de son activité alkylante et des incisions induites par les mécanismes de réparation.
Dans nos résultats (Figure 5.3-2), les dégâts croissent avec la dose d'EMS, de manière
pratiquement proportionnelle pour 6 h d'incubation mais avec un plateau apparent pour 3 h.
Pour les doses plus faibles, les dégâts sont moindres après l'incubation la plus longue,
reflétant probablement la cinétique de réparation.
La littérature mentionne (i) de 12 à 65 % de tail DNA avec relation dose-effet pour des
concentrations comprises entre 1 et 4 mM (lignée érythroleucémique humaine K562, 2 h de
contact) (De Boek et al., 2000); (ii) de 19 à 38 % de tail moment 71 à une dose de 2 mM
(lymphocytes humains, 1 h) ; et (iii) un effet significatif pour les concentrations comprises
entre 27 et 805 µM sans relation dose-effet (cellules CHO, 1 h de contact, tail length)
(Miyamae et al., 1997a).
Figure 5.3-2 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose
d'éthylméthanesulfonate (cellules P388D1; temps de contact, 3 h et 6h; 100 comètes mesurées sur 2 lames par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
Contrôle 2 5 10 2 5 10
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
EMS (mM)3 heures
EMS (mM)6 heures
Contrôle 2 5 10 2 5 10
Oliv
e Ta
il M
omen
t
0
10
20
30
40
EMS (mM)3 heures
EMS (mM)6 heures
71 Note : la définition du tail moment de cet auteur est différente de celle appliquée dans ce travail; elle correspond au produit du tail DNA et du tail length
265
5.3.2.3 Le cis-platine
Le cis-platine forme des liens croisés entre les brins d'ADN, ce qui empêche la migration
éventuelle des brins fragmentés suite à un traitement génotoxique. Nos résultats (Figure 5.3-3)
montrent qu'effectivement la quantité d'ADN ayant migré en présence de cet agent est
inférieure à celle du contrôle; de même, le traitement concomitant des cellules avec le cis-
platine et l'EMS réduit fortement la migration d'ADN induite par ce dernier. Ces résultats sont
tout à fait en accord avec ceux publiés (Pfuhler et Wolf, 1996).
Figure 5.3-3 : Effet du cis-platine sur la migration de l'ADN de cellules contrôles et de
cellules traitées par l'éthylméthanesulfonate (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; 100 comètes mesurées sur 2 lames par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
Cont
rôle
EMS
5 m
MCi
s-Pt
269
µM
+ E
MS
5 m
MCi
s-Pt
537
µM
+ E
MS
5 m
M
Cis-
Pt 5
37 µ
M
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Cont
rôle
EMS
5 m
MCi
s-Pt
269
µM
+ E
MS
5 m
MCi
s-Pt
537
µM
+ E
MS
5 m
M
Cis-
Pt 5
37 µ
M
Oliv
e Ta
il M
omen
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5.3.2.4 La N-nitroso-N-méthyl-éthylamine
Avec ce composé, une légère augmentation du tail DNA est observée (Figure 5.3-4), mais
aucun effet en ce qui concerne le Olive tail moment; cette différence pourrait être due à un
léger effet clastogénique, correspondant à une faible migration de grosses pièces d'ADN.
Nous pouvons donc conclure que, pour le temps et les doses testés, il n'y a qu'un effet très
limité de ce composé sur notre modèle. Les données publiées montrent une activité de
l'analogue N-nitroso-N-diméthylamine sur des hépatocytes en culture (Ashby et al., 1995) et
sur des cellules de foie humain T5-2E1 et T5-1A2, qui expriment respectivement les
cytochromes CYP2E1 et CYP1A2, mais pas sur des T5-neo qui sont dépourvues d'activité
cytochrome (de 0.135 à 13.5 µM, 1 h de contact) (Barcelo et al., 1998). Une étude in vivo sur
souris a montré un effet comète de la N-nitroso-N-diéthylamine sur le foie, le rein et le
poumon, mais pas sur la rate et la moelle osseuse (Miyamae et al., 1998). Les nitrosamines,
266
qui requièrent en effet une activation métabolique pour montrer un effet carcinogène,
pourraient donc être pratiquement considérées comme un contrôle négatif pour notre modèle.
Figure 5.3-4 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose de N-
nitroso-N-méthyl-éthylamine (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; 50 comètes mesurées par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
N-nitroso-N-méthyl-éthyl-amine (µM)
0 284 568
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
N-nitroso-N-méthyl-éthyl-amine (µM)
0 284 568O
live
Tail
Mom
ent
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5.3.2.5 La ciprofloxacine et les UVA
Les antibiotiques du groupe des fluoroquinolones72 possèdent des propriétés photo-
sensibilisantes importantes; bien que la ciprofloxacine soit une des molécules les moins
phototoxiques, elle se dégrade sous irradiation lumineuse en libérant des espèces réactives de
Figure 5.3-5 : Effet de l'irradiation UVA de la ciprofloxacine sur le Tail DNA et le Olive tail
moment (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; irradiation, UVA, 4°C, 15 min soit 279 mJ/cm²; 50 comètes mesurées par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
Contrôle UVA 30 150 30 150
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Ciprofloxacine (µM)+ UVA
Ciprofloxacine (µM)
Contrôle UVA 30 150 30 150
Oliv
e Ta
il M
omen
t
0
10
20
30
40
Ciprofloxacine (µM)+ UVA
Ciprofloxacine (µM)
72 La ciprofloxacine ne possède pas de fluor en position 8; pour les molécules les plus phototoxiques de la série, les UVA induisent la perte de cet atome fluor et la formation d'un radical carbène hautement réactif
267
l'oxygène qui induisent une génotoxicité (Chetelat et al., 1996; Snyder et Cooper, 1999).
Dans nos essais comète (Figure 5.3-5), la ciprofloxacine seule montre un effet comparable
à celui des UVA. Ceci pourrait s'expliquer par un manque de sélectivité de cet antibiotique
qui peut agir non seulement sur la gyrase bactérienne mais également sur son analogue
eucaryote, la topoisomérase II (Snyder et Cooper, 1999); ce qui semble confirmé par une
légère augmentation de l'effet avec la dose. Lors de l'exposition à la ciprofloxacine et aux
UVA, une augmentation très importante des dégâts est observée; une relation dose-effet
s'observe en Olive tail moment, alors que le tail DNA sature. Ces résultats sous UV sont du
même ordre que ceux rapportés (lymphome de souris L5178Y, concentrations de 30 à 300
µM, 20 min de contact, illumination par un simulateur solaire, 500 mJ/cm², t° de la pièce)
(Chetelat et al., 1996).
5.3.2.6 La tétracycline et les UVA
La photodégradation des tétracyclines est un processus bien connu; l'irradiation par les
longueurs d'onde supérieures à 290 nm induit un processus de désamination accompagné par
la génération de radicaux carbonés et de •OH; la génération d'oxygène singulet a également
été observée (Witte et al., 1994). La Figure 5.3-6 montre que la tétracycline seule à 2 µM
induit des effets plus importants que les UVA au niveau de l'ADN. Ceci pourrait être dû à un
effet génotoxique de la tétracycline elle-même (Witte et al., 1994) ou, malgré toutes nos
précautions, à de faibles expositions à la lumière en cours de manipulation. Lors de
l'exposition aux UVA, une forte augmentation de la fragmentation est observée en présence
de tétracycline. Ces effets, à notre connaissance non encore mis en évidence par le test
comète, peuvent être comparés à ceux rapportés (Witte et al., 1994) par une méthode d'élution
alcaline73 à pH 12.1 (lignée de fibroblastes humains GM 5659, concentrations de 0.5 à
1.75 mM, illumination par une lampe visible à incandescence, 37°C, 1h). La différence entre
les doses actives, d'un facteur 250, pourrait s'expliquer par (i) une différence de sensibilité des
lignées cellulaires; (ii) une différence de rendement de l'irradiation (lampe UVA et lampe
visible); et (iii) une différence de méthodologie (essai comète pH > 13 et élution alcaline pH
12.1), l'essai comète révélant en plus les lésions alcali-labiles.
73 Qui mesure les cassures de chaînes simple-brin, cf § 5.2.2.3.4; à ce pH, les sites alcali-labiles ne sont pas mis en évidence
268
Figure 5.3-6 : Effet de l'irradiation UVA de la tétracycline sur le Tail DNA et le Olive tail moment (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; irradiation, UVA, 4°C, 15 min soit 279 mJ/cm²; 50 comètes mesurées par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
Contrôle UVA 1 µM 2 µM 1 µM 2 µM
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Tétracycline+ UVA
Tétracycline
Contrôle UVA 1 µM 2 µM 1 µM 2 µM
Oliv
e Ta
il M
omen
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tétracycline+ UVA
Tétracycline
5.3.3 Différence de sensibilité entre les mesures comète et CLHP
Nous avons réalisé des mesures comètes sur les échantillons dont les taux de 8-oxodG ont
été modulés pour la validation du dosage CLHP (§ 2.2.4.4). Les résultats présentés à la Figure
5.3-7 montrent qu'une fragmentation intense est déjà induite par le peroxyde d'hydrogène et
les UVC seuls. En tail DNA, leur effet combiné est inférieur à un effet additif et ne montre
aucune relation avec la dose d'UVC; en tail moment 74, par contre, une relation entre la
fragmentation et la dose d'UVC est observée aux doses faibles.
La comparaison de ces résultats avec les taux de 8-oxodG induits (Figure 5.3-8) tels que
mesurés par CLHP (§ 3.3.4.3.4), ne montre aucune relation, l'essai comète étant probablement
quasi saturé à la dose la plus faible d'UVC. Le traitement terriblement oxydant, appliqué
délibérément pour la validation CLHP, induit déjà une intense fragmentation de l'ADN, même
pour des niveaux de 8-oxodG relativement modestes.
Signalons que le peroxyde d'hydrogène seul n'induit pas d'augmentation significative de la
8-oxodG sur les cellules P388D1, en tous cas pour la dose fort élevée (20 mM) et le temps de
contact (15 min) étudiés; cette observation, a priori étonnante, a déjà été constatée sur un
autre modèle (kératinocytes de souris dérivés de la lignée 291.09, de 1 à 20 mM, 15 min)
(Beehler et al., 1992; Przybyszewski et al., 1998).
74 Note : ces mesures ont été réalisées avec le logiciel Komet 3.0 qui ne calculait pas le Olive Tail Moment; le Tail Moment correspond au produit du tail DNA et du tail length et est donc systématiquement plus élevé
269
Figure 5.3-7 : Effet de l'irradiation UVC du peroxyde d'hydrogène sur le Tail DNA et le Tail moment 74 (cellules P388D1; 20 mM H2O2; irradiation UVC, t° ambiante, 2 à 15 min; 100 comètes mesurées par concentration; dénaturation et électrophorèse à pH > 13; l'échantillon traité par H2O2 et non irradié est resté en contact avec le peroxyde pendant 15 min).
Temps d'irradiation UVC (min)
0 10 0 2 5 10 15
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Contrôle H2O2 20 mM
Temps d'irradiation UVC (min)
0 10 0 2 5 10 15
Tail
Mom
ent
0
40
80
120
160
Contrôle H2O2 20 mM
Figure 5.3-8 : Comparaison de la fragmentation de chaînes et des taux de 8-oxodG induits par
irradiation UVC du peroxyde d'hydrogène (cellules P388D1; 20 mM H2O2; irradiation UVC, t° ambiante, 2 à 15 min).
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0 10 20 30 40
8-oxodG par 105 dG
Tail
DN
A
500.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0 10 20 30 40
8-oxodG par 105 dG
Tail
Mom
ent
50
De gauche à droite, les points correspondent à : 20 mM H2O2 15 min; 20 mM H2O2 + UVC 2 min; 20 mM H2O2 + UVC 5 min; 20 mM H2O2 + UVC 10 min; 20 mM H2O2 + UVC 15 min. Pour la 8-oxodG, les points représentent la moyenne et les barres l'écart étalon (n = 12, sauf pour les 2 premiers points où n = 3); pour les données comètes, les points représentent la médiane et les extrémités des barres les percentiles 25 et 75 (100 comètes mesurées sur 2 lames)
5.3.4 Conclusion
Après avoir établi la fiabilité des mesures brutes, nous avons vérifié que nous pouvions
mettre en évidence le caractère génotoxique de composés décrits : (i)la bléomycine et
l'éthylméthanesulfonate, qui induisent des cassures de chaînes, donc une migration; (ii) le cis-
platine, qui induit des liens croisés, donc une absence de migration; (iii) la ciprofloxacine et la
270
tétracycline, qui induisent des cassures de chaînes principalement après photoactivation. La
N-nitroso-N-méthyl-éthylamine montre une activité très faible, ce qui indique, comme
attendu, une faible capacité métabolique de nos cellule.
Comme nous l'avons souligné, il est difficile de comparer exactement les résultats obtenus
aux données de la littérature; mais, globalement, nos données sont cohérentes avec celles
publiées et parviennent à des conclusions semblables.
La méthode développée au laboratoire offre donc des mesures fiables qui permettent de
mettre en évidence les effets génotoxiques de manière similaire à d'autres équipes, objectif
proposé, nous le rappelons, par le Comet assay working group (Tice et al., 2000).
5.4 PHOTOOXYDATION DE L'ADN PAR LES PORPHYRINES INDUITES : REPRODUCTIBILITE INTER-ELECTROPHORESES ET MISE EN EVIDENCE D'UN EFFET
Les mesures de comètes sont réalisées cellule par cellule, ce qui génère assez rapidement
de grandes quantités de données. Des approches statistiques variées sont employées dans la
littérature, mais la plupart d'entre elles apparaissent peu satisfaisantes en raison de la
distribution des données, mais aussi parce qu'elles considèrent comme unité de comparaison
la cellule (la comète) et non le traitement (Lovell et al., 1999).
Comme le montrent déjà les graphiques box-plots présentés dans la section précédente, la
distribution des mesures apparaît rarement normale (gaussienne), excluant l'emploi de
statistiques et de tests paramétriques. De plus, les formes des courbes de distribution varient
avec l'intensité du stress appliqué, un facteur compliquant la transformation des données mais
pouvant également interférer avec certains tests non-paramétriques basés sur les rangs (Zar,
1996; Conover, 1999; Statsoft, 1999).
Les possibilités de traitement des données ont donc été envisagées en testant la
reproductibilité de la méthode, chaque run d'électrophorèse reprenant la séquence complète
des opérations, de la préparation des échantillons à la mesure informatique des images
obtenues.
5.4.1 Protocoles mis en oeuvre
Afin de mettre en évidence une méthodologie permettant de démontrer statistiquement un
effet photooxydant des porphyrines endogènes, les 2 expériences suivantes ont été entreprises :
• Expérience A (étude de reproductibilité) : 9 traitements, réalisés sur des
échantillons indépendants de cellules, sont analysés au cours de 3 runs
271
d'électrophorèse, 2 lames de microscope répliquant chaque traitement au sein de
chaque électrophorèse; 50 comètes sont alors mesurées par lame, ce qui permet de
comparer les distributions, d'extraire les statistiques représentatives des
échantillons de comètes et de comparer ces échantillons en évaluant la
reproductibilité inter-électrophorèses
(donc, 9 traitements x 3 runs d'électrophorèse x 2 lames x 50 comètes)
Expérience B : une étude de la relation "dose de lumière – effet" permet une
analyse de tendance par comparaison des courbes obtenues en présence et en
absence de δ-ala.
•
5.4.2 Etude de reproductibilité
Une séquence d'opérations typique d'un test de routine a été réalisée. Les échantillons ont
été préparés le même jour (Tableau 5.4-1), immergés dans les solutions de lyse au fur et à
mesure de la journée et maintenus à 4°C. Les électrophorèses et le traitement des lames de
microscope ont été réalisés dans les 2 jours suivants, à raison d'une série par demi-journée75.
Les lames, séchées et rangées à l'abri de la poussière et de l'humidité, ont été réhydratées,
colorées et mesurées au hasard dans les 3 semaines qui ont suivi.
Tableau 5.4-1 : Traitements réalisés dans le cadre de l'étude de reproductibilité
(Cellules P388D1)
Echantillons Traitement
contrôle 1 aucun (ni δ-ala, ni irradiation )
contrôle 2 aucun (ni δ-ala, ni irradiation)
δ-ala δ-ala 300 µM 3 h + 30 min à 4°C sans irradiation
lum irradiation lumière visible, 4°C, 30 min (21.4 J/cm²)
UVA irradiation UVA, 4°C, 30 min (0.56 J/cm²)
δ-ala + lum 30 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation lumière visible, 4°C, 30 min (21.4 J/cm²)
δ-ala + lum 60 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation lumière visible, 4°C, 60 min (42.8 J/cm²)
δ-ala + UVA 30 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA, 4°C, 30 min (0.56 J/cm²)
δ-ala + UVA 60 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA, 4°C, 60 min (1.12 J/cm²)
75 Certains auteurs n'observent aucune modification jusqu'à 4 semaines de lyse à 4°C (Tice et Vazquez, 1998). Pour (De Boek et al., 2000) au contraire, une lyse prolongée (à partir de 2 semaines) induit des modifications erratiques. Mais les facteurs confondants sont tels qu'aucune conclusion probante ne peut être tirée quant à l'influence d'une lyse de quelques jours (De Boek, 2001), souvent imposée par les contraintes expérimentales.
272
5.4.2.1 Méthode d'évaluation du caractère gaussien
Les distributions de comètes ont été évaluées en couplant les 50 mesures de chaque paire
de lames duplicata (même traitement, même électrophorèse).
Chaque distribution de comètes échantillonnées a été représentée sous forme
d'histogrammes, de graphes de probabilités gaussiennes (normal probability plots) et de box
plots (Analyse-It); le caractère gaussien des distributions a été également évaluée suivant le
test de Shapiro et Wilk (Analyse-It).
5.4.2.1.1 Graphes de probabilités gaussiennes
Les observations sont rangées dans l'ordre croissant et un graphe du quantile normal en
fonction des observations est établi. La valeur du quantile normal zj pour la valeur de rang j
d'une variable avec n observations est calculée comme suit :
−
Φ= −
n5.0jz 1
j
Dans cette équation, représente la fonction de distribution cumulative normale
inverse (qui convertit la probabilité normale p en valeur normale z).
1−Φ
Ce graphe des quantiles normaux donne une droite pour une distribution gaussienne. Un
simple examen visuel permet donc d'apprécier rapidement le caractère gaussien d'une
distribution.
5.4.2.1.2 Test W de Shapiro et Wilk
Le graphe des quantiles normaux n'offre cependant qu'un avis qualitatif et non pas une
décision basée sur un test statistique. Le caractère gaussien de chacune des distributions a
donc été évalué à l'aide d'un test formel, le test W de Shapiro et Wilk (Shapiro et Wilk, 1965).
Ce test calcule une statistique W, en fait un quotient qui compare une estimation de la
variance, basée sur la pente de la régression des valeurs xi sur les rankits, à la variance
calculée de manière classique sur l'échantillon.
Après rangement des observations, la pente qui permet l'estimation de la variance est
calculée à partir d'une série de n/2 statistiques d'ordre appelées W(i / n) :
( )∑=
=n
1i
i)n/i( x.Wb
Ces W(i/n), présentés de manière analogue aux rankits, ont été à l'origine tabulés jusque n =
50 (Shapiro et Wilk, 1965); les techniques informatiques permettent à présent une
approximation jusque n = 5000 (Royston, 1992).
273
Le carré de cette pente est alors comparé à la variance observée des xi :
( )
∑
∑
∑=
=
=
−
=−
= n
1i
2i
2n
1i
i)n/i(
n
1i
2i
2
)xx(
x.W
)xx(
bW
ce qui permet de déterminer une probabilité de rejet de l'hypothèse nulle d'égalité des 2
estimations de la variance, donc l'hypothèse du caractère gaussien (Conover, 1999). Cette
statistique W peut en fait être assimilée au carré d'un coefficient de corrélation linéaire dans
une échelle gaussienne (Ryan et Joiner, 1976). Dans ce travail, la statistique et sa probabilité
ont été calculées à l'aide du logiciel (Analyse-It).
5.4.2.2 Résultats et tests du caractère gaussien des distributions
Nous n'avons pas la place de détailler tous les graphes obtenus sur les 27 échantillons (9
traitements x 3 électrophorèses. Nous avons donc choisi de présenter (i) quelques exemples
graphiques de distributions représentatives de comètes en histogrammes et en graphes de
probabilités gaussiennes; et (ii) l'ensemble des résultats sous forme d'un graphique comparatif
de box plots et d'un tableau reprenant l'évaluation statistique.
5.4.2.2.1 Quelques exemples de distribution de comètes
La Figure 5.4-1 présente les histogrammes76 et graphes de probabilités gaussiennes des
mesures réalisées sur un échantillon contrôle (Contrôle 1, électrophorèse 2) et 2 échantillons
stressés (UVA 30, électrophorèse 1; δ-ala + UVA 30, électrophorèse 3).
76 Pour l'échelle de l'axe X, le domaine des valeurs a été arbitrairement subdivisé en 10 classes égales dans lesquelles les comètes ont été réparties
274
Figure 5.4-1 : Exemples de distribution des comètes (histogrammes et graphes de probabilités gaussiennes) (Cellules P388D1)
A. Echantillon contrôle (Contrôle 1, électrophorèse 2) n = 100 comètes mesurées sur 2 lames
• Tail DNA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Fréq
uenc
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tail DNA
Qua
ntile
Nor
mal
WShapiro-Wilk = 0.3552 (p <0.0001)
non-gaussien
• Olive tail moment
0
20
40
60
80
100
120
Fréq
uenc
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25
OliveTail Moment
Qua
ntile
Nor
mal
WShapiro-Wilk = 0.2477 (p <0.0001)
non-gaussien
275
Figure 5.4-1 – Suite (1) B. Echantillon stressé (UVA 30, électrophorèse 1) n = 100 comètes mesurées sur 2 lames
• Tail DNA
0
5
10
15
20
25
30
35
Fréq
uenc
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tail DNAQ
uant
ile N
orm
al
WShapiro-Wilk = 0.8891 (p <0.0001)
non-gaussien
• Olive tail moment
0
5
10
15
20
25
30
35
Fréq
uenc
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5
Olive Tail Moment
Qua
ntile
Nor
mal
WShapiro-Wilk = 0.8272 (p <0.0001)
non-gaussien
276
Figure 5.4-1 – Suite (2) C. Echantillon stressé (δ-ala + UVA 30, électrophorèse 3) n = 100 comètes mesurées sur 2 lames
• Tail DNA
0
5
10
15
20
25
30
Fréq
uenc
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tail DNAQ
uant
ile N
orm
al
WShapiro-Wilk = 0.9854 (p = 0.3412)
gaussien
• Olive tail moment
0
5
10
15
20
25
30
Fréq
uenc
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5
Olive Tail Moment
Qua
ntile
Nor
mal
WShapiro-Wilk = 0.9553 (p = 0.0019) non-gaussien
277
5.4.2.2.2 Présentation de l'ensemble des résultats
Les graphiques présentés dans le § 5.4.2.2.1 sont typiques des données obtenues, comme
le montre une comparaison avec les Figures 5.4-2 et 5.4-3 qui présentent les box plots de
l'ensemble des expériences. En fonction de l'intensité du stress, la médiane et la dispersion des
données augmentent fortement. Bien que les distribution tendent alors vers une courbe
gaussienne, le test de Shapiro et Wilk n'est qu'exceptionnellement significatif (Tableau 5.4-2),
que ce soit en tail DNA ou en Olive tail moment. Une transformation logarithmique rend
gaussiennes à peine quelques distributions au détriment d'autres (Tableau 5.4-3). Elle ne peut
donc être appliquée à l'ensemble des échantillons.
Tableau 5.4-2 : Résultats des test de Shapiro et Wilk sur l'ensemble des données : statistique
W et sa probabilité; les échantillons pour lesquels la distribution des comètes est gaussienne sont soulignés (p > 0.05) (9 traitements; 3 électrophorèses; 100 comètes mesurées sur 2 lames) Données non transformées (Cellules P388D1)
Traitement Tail DNA
pour l'électrophorèse Olive Tail Moment
pour l'électrophorèse
1 2 3 1 2 3
contrôle 1 0.7239 p < 0.0001
0.3552 p < 0.0001
0.5967 p < 0.0001
0.5143 p < 0.0001
0.2477 p < 0.0001
0.4481 p < 0.0001
contrôle 2 0.6606 p < 0.0001
0.4436 p < 0.0001
0.6938 p < 0.0001
0.4624 p < 0.0001
0.3127 p < 0.0001
0.3791 p < 0.0001
δ-ala 0.4099 p < 0.0001
0.4025 p < 0.0001
0.3964 p < 0.0001
0.3080 p < 0.0001
0.2451 p < 0.0001
0.2688 p < 0.0001
lum 0.5992 p < 0.0001
0.4992 p < 0.0001
0.3217 p < 0.0001
0.2927 p < 0.0001
UVA 0.8891 p < 0.0001
0.9229 p < 0.0001
0.8511 p < 0.0001
0.8272 p < 0.0001
0.8667 p < 0.0001
0.7356 p < 0.0001
δ-ala + lum 30 0.8978 p < 0.0001
0.7446 p < 0.0001
0.7169 p < 0.0001
0.8418 p < 0.0001
0.6693 p < 0.0001
0.5511 p < 0.0001
δ-ala + lum 60 0.9291 p < 0.0001
0.9382 p = 0.0001
0.9589 p = 0.0033
0.8236 p < 0.0001
0.8309 p < 0.0001
0.8255 p < 0.0001
δ-ala + UVA 30 0.9598 p = 0.0039
0.9937 p = 0.9253
0.9854 p = 0.3412
0.9451 p = 0.0004
0.9806 p = 0.1487
0.9553 p = 0.0019
δ-ala + UVA 60 0.9748 p = 0.0524
0.9713 p = 0.0278
0.9495 p = 0.0008
0.9556 p = 0.0020
0.9829 p = 0.2208
0.9860 p = 0.3714
278
Figure 5.4-2
Tail DNA
0 20 40 60 80
Contrôle 1
Contrôle 2
ala
Lum30 min
UVA30 min
δ -ala + lum60 min
δ -ala + UVA60 min
δ -ala + UVA30 min
δ -ala + lum30 min
δ −
: Tail DNA : Résultats de l'ensemble des expériences (Cellules P388D1)
es
(NS)
( )
(NS)
(NS)
(NS)
(NS)
(NS)
( )
( )
100
Les résultats sont présentés traitement par traitement avec chaque fois classées de bas en haut lélectrophorèses 1, 2 et 3 (100 comètes mesurées sur 2 lames). Entre parenthèses, signification du test de Kruskal-Wallis comparant les 3 électrophorèses (***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05) (cf § 5.4.2.3); les résultats surprenants de ce test seront commentés dans le § 5.4.2.3.2 (Note : 1 échantillon perdu pour le traitement Lum 3)
279
Figure 5.4-3 : Olive tail moment : Résultats de l'ensemble des expériences (Cellules P388D1)
échantillon perdu pour le traitement Lum 3)
Les résultats sont présentés traitement par traitement avec chaque fois classées de bas en haut les électrophorèses 1, 2 et 3 (100 comètes mesurées sur 2 lames). Entre parenthèses, signification du test de Kruskal-Wallis comparant les 3 électrophorèses (***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05) (cf § 5.4.2.3); les résultats surprenants de ce test seront commentés dans le § 5.4.2.3.2 (Note : 1
Olive Tail Moment
0 10 20 30
Contrôle 1( )
Contrôle 2( )
ala(NS)
Lum30 min
( )
UVA30 min
(NS)
δ -ala + lum60 min
(NS)
δ -ala + UVA60 min
( )
δ -ala + UVA30 min( )
δ -ala + lum30 min( )
δ −
40
280
Tableau 5.4-3 : Résultats des tests de Shapiro et Wilk sur l'ensemble des données : statistique W et sa probabilité; les échantillons pour lesquels la distribution des comètes est gaussienne sont soulignés (p > 0.05) (9 traitements; 3 électrophorèses; 100 comètes mesurées sur 2 lames) Données transformées en logarithme décimal (Cellules P388D1)
Traitement Log10 Tail DNA
pour l'électrophorèse Log10 Olive Tail Moment
pour l'électrophorèse
1 2 3 1 2 3
contrôle 1 0.9801 p = 0.1357
0.9229 p < 0.0001
0.9608 p = 0.0046
0.9760 p = 0.0646
0.8916 p < 0.0001
0.9595 p = 0.0037
contrôle 2 0.9713 p = 0.0278
0.9558 p = 0.0021
0.9884 p = 0.5406
0.9712 p = 0.0271
0.8859 p < 0.0001
0.9585 p = 0.0032
δ-ala 0.9369 p = 0.0001
0.9509 p = 0.0009
0.9450 p = 0.0004
0.8781 p < 0.0001
0.9059 p < 0.0001
0.8581 p < 0.0001
lum 0.9744 p = 0.0481
0.9618 p = 0.0054
0.9691 p = 0.0188
0.9369 p = 0.0001
UVA 0.9825 p = 0.2070
0.9568 p = 0.0024
0.9721 p = 0.0321
0.9648 p = 0.0090
0.9755 p = 0.0588
0.9718 p = 0.0305
δ-ala + lum 30 0.9702 p = 0.0228
0.9640 p = 0.0079
0.9723 p = 0.0332
0.9661 p = 0.0112
0.9790 p = 0.1103
0.9723 p = 0.0331
δ-ala + lum 60 0.8942 p < 0.0001
0.8366 p < 0.0001
0.9104 p < 0.0001
0.8940 p < 0.0001
0.8743 p < 0.0001
0.9272 p < 0.0001
δ-ala + UVA 30 0.8445 p < 0.0001
0.8913 p < 0.0001
0.8896 p < 0.0001
0.8830 p < 0.0001
0.8982 p < 0.0001
0.9139 p < 0.0001
δ-ala + UVA 60 0.9010 p < 0.0001
0.8119 p < 0.0001
0.8152 p < 0.0001
0.9509 p = 0.0010
0.8713 p < 0.0001
0.8599 p < 0.0001
5.4.2.3 Comparaison inter-électrophorèse (tests non-paramétriques)
Suite aux résultats des tests du caractère gaussien, la possibilité d'employer des tests non-
paramétriques pour comparer les électrophorèses et les échantillons a été étudiée. Pour
comparer plus de 2 échantillons, nous avons utilisé le test de Kruskal-Wallis, une variante
non-paramétrique des ANOVA, basée sur la transformation en rangs (Conover, 1999). Bien
qu'il s'agisse d'une méthode "distribution-free", elle demande en théorie que les distributions à
comparer soient similaires, c'est-à-dire de mêmes dispersions et formes. Cette condition est
jugée de manière plus (Statsoft, 1999) ou moins (Zar, 1996; Conover, 1999) drastique suivant
les auteurs; il semble que le test de Kruskal-Wallis soit typiquement peu affecté si les
variances des populations sont plus ou moins hétérogènes (Zar, 1996). En cas de comparaison
1996; C
de 2 échantillons, ce test est identique au test de Mann-Whitney (ou test de Wilcoxon) (Zar,
onover, 1999).
281
Avant de comparer les traitements entre-eux et de nous poser des questions quant à
es variances admissibles, nous avons commencé par évaluer la
des électrophorèses pour les différents traitements, ces échantillons pré
fort semblables.
l'hétérogénéité d
reproductibilité sentant
des distribution
.4.2.3.1 Le test de Kruskal-Wallis (ANOVA non-paramétrique)5
it d'un test de ran somme des rangs d e des
rangs de tous les traitements. Les variables suivantes sont définies (Conover, 1999) :
oient k éc ns a s de 1 à nk,
• Soit Xi,j dénotant la jèm observation du groupe i; les k échantillons comprennent donc
les observ à
Soit N le nombre total ati
• Le rang 1 est assigné à su ainsi
de suite; R rés ng à l'obs Xi,j et Ri la somme des rangs
és au i :
1, ,….,k
Pour tester l'h nu es ons de ion pu ont
identiques" la statistique T est alors définie comme suit :
Il s'ag g comparant la 'un traitement à la somm
• S hantillo léatoiree
tailles n
ations X1,1 Xk,nk
• d'observ ons :
=N in
la plus petite des N observations, le rang 2 à la ivante et
(Xi,j) rep ente le ra attribué ervation
attribu groupe
=iR j,i )X(R où i = 2
ypothèse lle "Tout les foncti distribut des k po lations s
∑=
k
1i
∑=
in
1j
−= ∑ i
1i i 4
Nn²S
T
dans laquelle S² représente :
+
−= ∑ranks
all
22
j,i)1N(N)X(R1²S
La distribution de T étant fort complexe, l'approximation de la distribution chi-carré à
k - 1 degrés de liberté est utilisée de manière générale pour évaluer la probabilité du T observé
(Conover, 1999). L'ensemble des calculs est réalisé à l'aide du logiciel (Analyse-It).
+k 22 )1N(R1=
− 41N
282
5.4.2.3.2 Résultats
Les résultats des 9 comparaisons inter-électrophorèses sont présentés dans le
5.4-4, à la fois pour le tail DNA et le Olive tail moment; pour permettre une comparaison de la
signification du test avec la distri
Tableau
bution des différents échantillons, sa probabilité est indiquée
sur les Figures 5.4-2 et 5.4-3 présentées ci-avant (§ 5.4.2.2.2).
Tableau 5.4-4 : Résultats des test de Kruskal-Wallis comparant les 3 électrophorèses sur et sa probabilité; les traitements pour distributions est acceptée sont
s; Cellules P388D1)
Traitement Tail DNA Olive Tail Moment
l'ensemble des traitements : statistique T lesquels l'hypothèse nulle d'identité entresoulignés (p > 0.05) (9 traitements; 3 électrophorèses; 100 comètes mesurées sur 2 lame
contrôle 1 5.48 p = 0.0645
16.96 p = 0.0002
contrôle 2 20.04 P < 0.0001
49.45 p < 0.0001
δ-ala 5.09 5.18p = 0.0786
Lum (a)
V
p = 0.0751
5719.5 p = 0.0787
5901 p = 0.0277
U A 3.85 p = 0.1456
4.99 p = 0.0824
p < 0.0001 p < 0.0001δ-ala + lum 30 27.54
22.29
δ-ala + lum 60 0.71 p = 0.7005
80.61 p = 0.7368
δ-ala + UVA 30 7.22 p = 0.0270
16.11 p = 0.0003
3.17δ-ala + UVA 60 p = 0.2054
7.65 p = 0.0218
(a) Comme il n'y a que 2 valeurs pour ce traitement, la statistiqu alculée est le U de Mann-Whitney
5.4.2.3.3 Discussion
e c
a Figure
5.4-4 détaille les plot box des comètes du traitement "Contrôle 1" (Olive tail moment), pour
lequel une différence significative est démontrée, et compare les 3 électrophorèses.
La comparaison de ces résultats avec les Figures 5.4-2 et 5.4-3 montre que, lorsque les
tests mettent en évidence des différences significatives entre électrophorèses, celles-ci
apparaissent cependant négligeables par rapport aux différences entre traitements. L
283
Figure 5.4-4 : Comparaison des électrophorèses pour le traitement "Contrôle 1" (Olive tail moment) (100 comètes mesurées sur 2 lames)
re Le graphique est présenté avec en ordonnée (i) la même échelle que la Figu5.4-3 et (ii) une échelle agrandie.
40
3
Electrophorèse 1 Electrophorèse 2 Electrophorèse 3
Oliv
e Ta
t
0
10
30
Electrophorèse 1 Electrophorèse 2 Electrophorèse 3
nt
0
il M
omen
20
Oliv
e Ta
il M
ome
1
2
En agrandissant l'échelle, la différence significative entre électrophorèses (p = 0.0002)
apparaît clairement; la plupart des co l'électrophorèse 1 sont en effet supérieures à
celles des 2 autres électrophorèses, présentant donc un rang supérieur. La plus grande
dispersion de l'électrophorèse 1 et le no important de comètes (N = 300) jouent
probablement un rôle dans la signification du test.
Nos essais d'estimation de la reproductibilité intraélectrophor s de Mann-Whitney
pour chaque paire de lames duplicata) se sont heurtés au même écueil, à savoir la mise en
évidence de atistiquement significatives mais insignifiantes sur le plan
biologique.
5.4.2.3.4 Co
mètes de
mbre
èse (test
différences st
nclusions
Les conclusions suivantes peuvent être tirées :
• l'hypothèse de mêmes dispersion et distribution, bien que non rédhibitoire, pose un
problème certain pour la comparaison entre échantillons traités et contrôles;
• l
interaction; une différence statistiquement significative (ou une absence de différence)
tements étudiés, mais aussi du paramètre mesuré (tail DNA ou Olive
vement
ent inutile,
car peu susceptible d'apporter une information supplémentaire.
a comparaison des séries d'électrophorèse par le test de Kruskal-Wallis montre une
dépend des trai
tail moment);
• quand une différence inter-électrophorèses est mise en évidence, elle est objecti
négligeable par rapport à la différence entre traitements;
• si le test parvient à mettre en évidence des différences aussi négligeables, son
application dans la comparaison des différents traitements s'avère pratiquem
284
5.4.2.4 Extraction de statistiques significatives
oposé par (Lovell et al., 1999), nous avons alors considéré comme unité de
e traitement et non plus la comète,
Comme pr
comparaison l réduisant chaque série de mesures de
comètes à une statistique représentative de l'échantillon mesuré, lui-même représentatif de la
population de comètes du traitement examiné.
Un examen des résultats présentés jusqu'ici montre qu'un stress se traduit par une
augmentation de la médiane et de la dispersion des mesures; la médiane (quantile 0.5) et le
percentile 75 (p75, quantile 0.75) seront donc extraits pour représenter chaque échantillon de
comètes. Ces 2 valeurs permettent une image globale de l'échantillon car elles ne sont que peu
sensibles aux valeurs extrêmes77 (Lovell et al., 1999).
Pour cette étude de reproductibilité, chaque lame individuelle a d'abord été traitée comme
l'un ;
r
mes) qui seront traités comme des points
de
nt
50
nt donc se trouver résumées en 27 paramètres statistiques (9 traitements x 3
ont traités comme des points de mesure individuels.
5.4 es de confiance
ité élémentaire permettant d'évaluer la reproductibilité intra-électrophorèse (intra-essai)
chaque lame a en effet subi le même traitement et la même électrophorèse mais diffère de pa
sa position aléatoire dans le bac d'électrophorèse. Les 2700 comètes (9 traitements x 3
électrophorèses x 2 lames x 50 comètes) se trouvent donc résumées en 54 paramètres
statistiques (9 traitements x 3 électrophorèses x 2 la
mesure individuels.
Nous avons également vérifié si le traitement des données pouvait s'effectuer en coupla
les lames duplicata. Les 2700 comètes (9 traitements x 3 électrophorèses x 2 lames x
comètes) vo
électrophorèses) qui ser
.2.4.1 Calcul des quantiles et de leurs intervall
p*ème q re Xp
déf t
positio ème
Soit un échantillon ordonné de Xn valeurs indépendantes dont on désire déterminer le
uantile et son intervalle de confiance (0 ≤ p* ≤ 1); ce quantile p* est le nomb
ini el que la proportion p* des valeurs de l'échantillon soit inférieure ou égale à Xp. La
n P du p* quantile Xp est déterminée comme suit :
*p.)1n( +100
P =
n'est pas un nombre entier, Xp est interpolé entre les 2 vaSi P leurs dont les positions sont
imméd
iatement inférieure et supérieure à P (Aczel, 1993).
i n'est pas le cas d'autres percentiles testés, notamment le p5 et le p95; le p2577 Ce qu n'a permis de tirer aucune
conclusion et a donc été abandonné.
285
Pour n > 20, les positions de l'intervalle de confiance r* et s* sont calculées, à partir d'une
approximation basée sur le théorème central limite (Conover, 1999) :
*)p1(.*p.n.z*p.n*r )2/( −+= α
*)p1(.*p.n.z*p.n*s )2/1( −+= α−
La valeur du quantile normal z est calculée à partir de la fonction de distribution cumulative
normale inverse (qui convertit la probabilité normale p en valeur normale z) et le niveau de
confiance est 1 – α. En général, r* et s* ne sont pas des nombres entiers et sont
systématiquement arrondis aux entiers supérieurs, r et s (Conover, 1999).
5.4.2.4.2 Traitement des résultats
Intuitivement, lorsque le nombre de données est suffisamment grand, les quartiles obtenus
sur un échantillon devraient être une approximation raisonnablement correcte des quart
la population et leur distribution devrait s'approcher de la normale. Cette intuition est
d'ailleurs renforcée par la méthode appliquée au calcul de leurs intervalles de confiance,
lorsque n est supérieur à
iles de
20 (approximation basée sur le théorème central limite, § 5.4.2.4.1).
ées
d'estimer
l'incertitude associée aux différentes sources de variabilité (Lovell et al., 1999).
Après extraction des statistiques représentatives des échantillons, celles-ci ont donc été
comparées par une analyse de variance à 2 facteurs aléatoires, électrophorèse et traitement, en
considérant la lame de microscope comme unité élémentaire de répétition . Les variances ont
alors été réparties comme décrit au § 3.3.4.2.2.3 pour calculer les CV% intra-série et de
variation totale. En cas de rejet de l'hypothèse nulle d'égalité des moyennes, un test post-hoc
(tests t multiples avec correction de Bonferroni) a été réalisé pour mettre en évidence les
différences entre échantillons. Ces tests ont été réalisés à l'aide du logiciel Systat 7.1.
Cette hypothèse de normalité a par ailleurs été vérifiée sur des médianes et percentiles 75
extraits de lames réalisées et mesurées par 3 opérateurs, et ce pour des cellules non stress
(Contrôle) et stressées (UVA) (Tableau 5.4-5). Les méthodes dérivées du modèle linéaire
général, notamment l'analyse de variance, sont donc applicables permettant
78
78 Comme dit précédemment, l'échantillon LUM de la 3ème électrophorèse a été perdu; afin de rétablir la balance de l'étude, nécessaire pour réaliser une ANOVA à 2 niveaux, un échantillon LUM identique a été réalisé sur une 4ème électrophorèse et introduit dans les résultats. Cet artifice nous semble plus correct que de dériver mathématiquement une valeur, tel que préconisé par certains auteurs {(Shearer, 1973) in (Zar, 1996)}.
286
Tableau 5.4-5 : Caractère gaussien des distributions des médianes et percentiles 75 extraits d'échantillons de cellules stressées et non stressées (50résultats obtenus au cours de 5 électrophorèses par 3 o
comètes par lame; pérateurs différents;
Cellules P388D1).
Tail DNA Olive tail moment
Traitement Médiane Percentile 75 Médiane Percentile 75
Contrôle 5.575 8.535 0.645 1.105
5.620 9.868 0.63 1.385
4.375 6.363 0.515 0.685
5.415 7.440 0.515 0.7175
4.665 7.058 0.465 0.7625
4.020 6.948 0.43 0.7125
1.528 0.515 1.13
W 0.8516 0.8760 0.8692 0.8852
3.875 1
7.910 14.885 0.9 1.41
7.390 15.420 0.835 1.465
11.070 17.553 1.110 2.075
Shapiro-Wilkp = 0.0607
gaussien p = 0.1173
gaussien p = 0.0977
gaussien p = 0.1496
gaussien
Tail DNA Olive tail moment
Traitement Médiane Percentile 75 Médiane Percentile 75
UVA 25.780 43.920 3.9 9.2975
25.605 47.563 3.62 10.4375
24.175 43.563 4.13 9.02
29.100 51.878 5.29 10.92
20.140 38.625 2.585 7.0475
24.440 49.430 3.53 11.1025
18.710 23.478 2.53 3.095
20.515 27.325 2.68 3.645
WShapiro-Wilk 0.9431 p = 0.6417
gaussien
0.8888 p = 0.2283
gaussien
0.9090 p = 0.3467
gaussien
0.8506 p = 0.0966
gaussien
287
5.4.2.4.3 Résu
hantillons.
ltats : Statistiques représentatives des différents échantillons
Les Tableaux 5.4-6 et 5.4-7 présentent respectivement les médianes et les p75 des tail
DNA mesurés sur les différents éc Les Tableaux 5.4-8 et 5.4-9 présentent
spectivement les médianes et les p75 des Olive tail moment mesurés sur les différents
échantillons.
Tableau 5.4-6
re
: Médianes des distributions de comèt urs inte s de confiance à 95 % NA; 9 traitements 3 élec orèses; s; 50 comètes par lame; Cellules P388D1)
édiane d NA
es et le rvalle (tail D ; troph 2 lame
M u Tail DTraitement Lame
e Electrop Electrophorèse 3 Electrophorès 1 horèse 2
rôl 58 -
38 5.4)
62 2
rôl 37 -
3 5.97)
82(
00 7 - 7.24)
5.91 A - 4.9
.13 - (5
A .77(3 -
7.31 .28 - 9.84)
23- 7.56)
99 - 8.42)
.7 - 42.26)
B .61 18
A 23.6 -
67- 13.68)
B .12 00
- - 37.21)
B (26.18 - 14)
7.12 51 - 30.42)
cont e 1 A 5.(3.77 6.24)
4.(3.90 -
4.67 (3.63 - 5.83)
B 5. (4.35 - 7.19)
5.4(3.32 - 6.74)
4.02 (3.25 - 5.14)
cont e 2 A 7. (6.57 8.36)
5.1 (3.63 -
4.48 (3.59 - 5.54)
B 5. 5.29 - 8.05)
5.(4.4
4.11 (3.05 - 5.74)
δ-ala 5.25 (3.78 6.51) ( 7 - 8.35)
5.60 (4.14 - 6.62)
B 5 (3.99 6.75)
6.46 .37 - 8.74)
6.31 (4.88 - 7.79)
Lum 5 .70 6.79) (6
6.57 (3.50 – 8.35)
B 6. (5.06
6.(4.86
6.68 (3.73 – 12.27)
UVA A 25 8 (21.17 38.78)
29.10 (22.08 -
20.14 (14.02 - 26.7)
25 (19.60 - 35.14)
24.(21.50 - 30.26)
24.44 (19.79 - 29.08)
δ-ala + lum 30 6 (21.18 25.79)
9. (8.35
16.27 (13.16 - 19.32)
23 (18.57 - 28.52)
18.(14.07 - 24.06)
18.28 (15.79 - 20.39)
δ-ala + lum 60 A 27.40 (21.17 33.74)
33.50 (31.60
26.31 (22.22 - 32.37)
30.93 38.
2(22.
29.71 (20.73 - 41.58)
-ala + UVA 30 A 48.42 (42.63 - 53.98)
50.25 (44.17 - 55.1)
42.52 (38.42 - 46.67)
δ
B 51.23 (48.14 - 56.4)
47.30 (38.23 - 53.19)
45.90 (40.04 - 51.36)
δ-ala + UVA 60 A 60.11 (55.62 - 63.53)
64.43 (58.99 - 68.38)
60.30 (52.30 - 69.39)
B 57.63 (55.57 - 65.25)
63.31 (58.81 - 67.79)
58.81 (54.33 - 67.0)
288
Tableau 5.4-7 : Percentiles 75 des distributions de comètes et leurs intervalles de confiance à
p75 du Tail DNA
95 % (tail DNA; 9 traitements; 3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1)
Traitement Lame Electrophorèse 1 Electrophorèse 2 Electrophorèse 3
contrôle 1 A 8.54 (6.24 - 10.14)
6.36 (5.40 - 9.11)
7.06 (5.83 - 9.18)
B 9.87 (7.19 - 13.81)
7.44 (6.74 - 8.79)
6.95 (5.14 - 8.98)
contrôle 2 A 9.92 (8.36 - 11.97)
6.92 (5.54 - 8.70)
6.51 (5.97 - 12.94)
9.82 5 - 11.5
8.36
8.56 4 - 10.1
9.80
7.31 74 - 7.74
9.04 1 - 10.3 5 - 12.8 2 - 11.8
8.195 - 12.1
8.05
10.194 - 12.0
11.82
10.039 - 12.2
11.809 - 11.3 4 - 16.8 5 - 16..3
10.87 6 - 15.0
43.92
10.19 2 - 14.7
51.88
17.18
78 - 52. 26 - 66.38.63 70 - 76.
47.56 14 - 62.
30.38
43.56 26 - 55.
16.95
49.43 08 - 65.
23.46 79 - 37 68 - 24. 32 - 27.
35.695 .52 - 45.8
39.41
27.350 .06 - 35.3
42.92
25.115 .39 - 32.0
37.47 .74 - 43.1 .21 - 58.3 .37 - 49.4
43.31 .14 - 50.6
62.26
36.86 42 - 42.
63.82
46.46 .58 - 52.4
55.12 .98 - 88.9 .10 - 66.6 .67 - 62.6
60.17 6.4 - 64.6
68.38
62.08 .19 - 65.2
72.45
57.36 .36 - 65.0
83.68 .53 - 76.5 .38 - 77.8 .39 - 87.9
68.44 .25 - 71.5
72.06 .79 - 77.2
86.73 .00 - 89.1
B (8.0 3) (7.2 9) (5. )
δ-ala A (6.5 7) (8.3 0) (6.6 8)
B (6.7 7)
(8.7 6)
(7.7 9)
Lum A (6.7 5)
(9.8 7)
(8.3 0)
B (7.5 4) (8.4 2) (12.27 – 39.25)
UVA A (38. 29) (42. 49) (26. 77)
B (35. 23) (30. 56) (29. 09)
δ-ala + lum 30 A (25. .16) (13. 82) (19. 46)
B (28 3) (24 1) (20 4)
δ-ala + lum 60 A (33 4) (37 6) (32 0)
B (38 8) (30. 08) (41 2)
δ-ala + UVA 30 A (53 7) (55 6) (46 5)
B (5 ) (53 6) (51 4)
δ-ala + UVA 60 A (63 2) (68 4) (69 4)
B (65 7) (67 7) (67 2)
289
Tableau 5.4-8 : Médianes des distributions de comètes et leurs intervalles de confiance à
95 % (Olive tail moment; 9 traitements; 3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1)
Médiane du Olive tail moment Traitement Lame
Electrophorèse 1 Electrophorèse 3 Electrophorèse 2
0.65 48 - 0.8
0.52 38 - 0.5
0.47 39 - 0.6
0.630 53 - 0.8
1.12
0.515 40 - 0.5
0.56
0.430 33 - 0.5
0.49 83 - 1.3 42 - 0.6 42 - 0.5
0.84 69 - 1.1
0.57
0.56 51 - 0.7
0.67
0.48 36 - 0.5
0.68 39 - 0.6 50 - 0.7 53 - 0.8
0.58 48 - 0.7
0.59
0.69 .61 - 0.90
1.01
0.68 .50 - 0.87
0.53 40 - 0.8 .64 - 1.13 .39 - 0.61
0.62 .51 - 0.85
3.90
0.69 .49 - 0.89
5.29
0.68 .40 - 0.96
2.59 .89 - 5.80 .14 - 8.09 .78 - 3.53
3.62 .04 - 6.16
4.37
4.13 .58 - 5.71
1.50
3.53 .55 - 4.70
2.57 .76 - 4.86 .09 - 2.39 .01 - 3.58
4.49 .47 - 5.87
4.83
4.39 .95 - 5.08
6.51
2.89 2.22 - 3.51
4.42 .42 - 5.29 .00 - 7.13 .10 - 5.68
5.93 .31 - 6.63
9.70
4.17 .52 - 4.90
10.300
5.65 .25 - 7.29
7.870 56 - 11.0 99 - 11.5 .80 - 8.59
10.59 87 - 11.9
11.29
9.46 87 - 10.7
13.36
8.95 24 - 10.2
12.24 .57 -14.9 .73 -15.1
.56 -13.112.87 .70 -14.4
12.02 .73 -13.5
contrôle 1 A (0. 0) (0. 7) (0. 3)
B (0. 8) (0. 9) (0. 4)
contrôle 2 A (0. 2) (0. 5) (0. 9)
B (0. 2) (0. 1) (0. 8)
δ-ala A (0. 8) (0. 7) (0. 6)
B (0. 4) (0 ) (0 )
Lum A (0. 0) (0 ) (0 )
B (0 ) (0 ) (0 )
UVA A (2 ) (3 ) (1 )
B (3 ) (3 ) (2 )
δ-ala + lum 30 A (3 ) (1 ) (2 )
B (3 ) (2 ) ( )
δ-ala + lum 60 A (3 ) (6 ) (4 )
B (5 ) (3 ) (3 )
δ-ala + UVA 30 A (8. 4) (8. 5) (6 )
B (9. 6) (7. 3) (7. 7)
δ-ala + UVA 60 A (10.31 -12.38) (12 0) (9 5)
B 11.58 (10 9) (11 7) (10 8)
290
Tableau 5.4-9 : Percentiles 75 des distributions de comètes et leurs intervalles de confianc95 % (Olive tail moment; 9 traitements; 3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1)
e à
p75 du Olive tail moment
Electrophorèse 1 Electrophorèse 2 Electrophorèse 3
contrôle 1 (0. 5 (0.
0.76 (0.63 - 0.94)
A 1.11 80 - 1.2 )
0.69 57 - 1.04)
.88 - 1.82) .59 - 0.92) .54 - 0.93)
contrô A 1.46 32 - 1.7 )
0.72 65 - 1.17)
0.71 9 - 0.89)
12 - 1.9 ) 71 - 1.02) 8 - 0.89)
68 - 1.0 ) 77 - 1.43) 6 - 1.44)
B 0.93 74 - 1.4 )
1.06 90 - 1.49)
1.01 7 - 1.37)
80 - 1.1 ) 13 - 1.78) 1 – 10.2 )
B 1.00 85 - 1.7 )
1.22
0 - 13.12) 9 - 15.42) 3 - 17.20)
0.4386 - 14.48)
9.020 1 - 11.83)
1.103 0 - 17.23)
-ala + lum 3 A 6.830 86 - 8.0 )
2.975 39 - 4.16)
.228 8 - 4.93)
7.51 87 - 9.4 )
6.38 08 - 8.76)
4.48 1 - 6.63)
-ala + lum 6 A 6.60 29 - 7.4 )
8.28 3 -11.6 )
7.04 8 - 8.32)
B 8.09 3 -10.0 )
6.27 90 - 7.33)
8.58 9 -10.5 )
-ala + UVA 3 A 13.04 04 - 19.66)
13.02 .55 - 15.10)
10.53 59 - 12.51)
13.69 .96 - 15.32)
13.45 73 - 13.98)
1.44 7 - 14.78)
-ala + UVA 6 A 15.94 .90 -18.5 )
17.19 .15 -19.53)
B 13.72 .19 -14.3 )
15.00 .47 -16.6 )
16.07 .58 -19.2 )
Traitement Lame
B 1.39 (0
0.72 (0
0.71 (0
le 2 (1. 5 (0. (0.5
B 1.40 (1. 0
0.81 (0.
0.74 (0.5
δ-ala A 0.83 (0. 1
0.94 (0.
1.03 (0.8
(0. 1 (0. (0.8
Lum A 0.93 (0. 2
1.41 (1.
0.88 (0.6 3
(0. 7
1.07 (0.89 - 1.39) (0.96 – 6.48)
UVA A 9.30 (5.8
10.92 (8.0
7.05 (3.5
B 1 (6.1 (5.7
1(4.7
δ 0 (4. 7 (2.
4(3.5
B (5. 0 (5. (3.5
δ 0 (5. 4 (7.1 7 (5.6
(6.6 5 (4. (7.2 5
δ 0 (11. (11 (8.
B (11 (10.
1(10.2
δ 0 13.77 (12.38 -16.73) (14 5 (15
(13 9 (14 4 (13 6
291
5.4.2.4.4 Résultats : Comparaison des électrophorèses et des traitements
x 5.4-10 et 5.4-11 présentent les résultLes Tableau ats de l'analyse de variance et des tests t
ost-hoc pour, respectivement, les médianes et les p75 des tail DNA mesurés sur les différents
échantillons. Les Tableaux 5.4-12 et 5.4-13 présentent r les Olive tail
moments.
5.4.2.4.5 Conclusions
p
les mêmes résultats pou
e (tail D e tail es
mètres sta
p > 0.05). s les cas, ents
nts
ier cas pa de tail DN
oment (T .4-12). Un vergence
s dan l
nts (médi et p75, 1 tail DNA
ent X éle se. Cette i pourrait
e simplement éci des s s tail
ntale
de la queue, co omène. A c u, l'étude st
r plots (Figures 5.4-2 et 5.4-3).
Le traitement r un va
tale; il ne p
e de
qu'être de l'inform
hique des d ons. Par ex es plot boxe
Quels que soient les paramètres de comèt NA ou Oliv moment) ou l
para tistiques (médiane ou percentile 75) envisagés, l'étude ANOVA (Tableaux
5.4-10 à 5.4-13) démontre une différence statistiquement significative (***) entre traitements
et pas de différence entre électrophorèses ( Dans tou les traitem
contrôle 1, contrôle 2, δ-ala et lum 30 ne peuvent être distingués entre-eux.
Tous les autres traiteme diffèrent des contrôles et diffèrent entre eux, à l'exception des
paires de traitements (UVA et δ-ala + lum 60) et (UVA et δ-ala + lum 30) qui peuvent être
occasionnellement assimilées, dans le prem r les p75 A (Tableau 5.4-11),
dans l'autre par les médianes de Olive tail m ableau 5 e telle di
entre les paramètres ne pose pas de problème s e cas présent, ces comparaisons purement
anecdotiques ne nous intéressant pas.
Bien que la reproductibilité totale des statistiques des tail DNA (médiane et p75, 10 %,)
soit meilleure que pour les Olive tail mome ane, 18 % 5 %), les
mettent en évidence une interaction traitem ctrophorè nteraction
êtr due à la pr sion supérieure tatistiques de DNA ou indiquer que ce
paramètre dépend plus fortement de l'électrophorèse, donc des conditions expérime s. Le
Olive tail moment, le produit du tail DNA par la distance entre les centres de masses de la tête
et rrige absolument ce phén e nivea atistique permet de
confirme l'impression générale dégagée par les graphiques box
statistique envisagé, très efficace pour résume ste ensembl
données, perd cependant une bonne partie ation to eut donc
complémentaire d'une représentation grap istributi emple, l s
des distributions des données montrent que, même si la reproductibilité des médianes et p75
des tail DNA apparaît meilleure, les mesures tail DNA sont plus dispersées que les tail
moments; la correction introduite dans le Olive tail moment réduit sensiblement cette
dispersion.
292
Tableau 5.4-10 : Médianes des Tail DNA Résultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements;
Source de Somme des rrés Carré moyen F Probabilité
du F observé Signification Variance CV %
3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1) et tests post-hoc (matrice des probabilités; comparaisons par paires)
variation ddl ca
Tra 63.48 itement 8 19796.132 2474.517 254.919 < 0.001 *** 205.40
Electroph. 2 39.216 19.608 2.020 0.165 NS 1.10
T X E 16 155.313 9.707 2.341 0.025 * 1.85
Résidu 27 111.971 4.147 4.15 9.0
4.65
6.03
2
• CV % intra-série (inter-lames) = 9.0 %
• CV % total = 10.2 %
Comparaisons post-hoc : tests t, correction de Bonferroni; les différences statistiquement
Contrôle 1
Contrôle 2
UVA δ-ala δ-ala + δ-ala + δ-ala + δ-ala + Lum 30
significatives (p < 0.05) sont soulignées
lum 30 lum 60 UVA 30 UVA 60
Contrôle 1 1.000
UVA < 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala 1.000 1.000 < 0.001 1.000
δ-ala + lum 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala + lum 60
< 0.001 < 0.001 0.040 < 0.001 < 0.001 1.000
UVA 30
δ-ala + UVA 60
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
Contrôle 2 1.000 1.000
δ-ala + < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
Lum 30 1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
L'étude des médianes des distributions de tail DNA montre qu'il y a une différence significative entre traitements, pas de différence entre électrophorèses et une interaction traitement X électrophorèse significative (*). A l'inverse des traitements contrôle 1, contrôle 2, δ-ala et lum 30 qui ne peuvent être distingués, tousautres traitements diffèrent des contrôles et diffèrent entre eux.
les
293
Tableau 5.4-11 : Percentiles 75 des Tail DNRésultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements; 3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1) et tests post-hoc (matrice des probabilités; comparaisons par paires)
A
Source de ddl Somme des Carré moyen F Probabilité d Signification Variance CV %
variation carrés u F observé
< 0.001
10.732 5.366 0.157 0.856 NS -3.2 ------
T X E 16 546.775 34.173 3.411 0.002 ** 8.05 8.94
Résidu 27 270.468 10.017 10.02 9.98
Traitement 8 30312.305 3789.038 110.877 *** 312.91 55.75
Electroph. 2
• CV % intra-série (inter-lames) = 10 %
Comparaisons post-hoc
• CV % total = 10 %
: tests t, correction de Bonferroni; les différences statistiquement
Contrôle 1
Contrôle UVA δ-ala δ-ala + δ-ala + δ-ala + δ-ala + Lum 30
significatives (p < 0.05) sont soulignées
2 lum 30 lum 60 UVA 30 UVA 60
Contrôle 2 1.000 1.000
< 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala 1.000 1.000 < 0.001 1.000
δ-ala + lum 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala + lum 60
δ-ala + UVA 30
δ-ala + UVA 60
Lum 30
Contrôle 1 1.000
UVA
< 0.001 < 0.001 0.533 < 0.001 < 0.001 1.000
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
L'étude des percentiles 75 des distributions de tail DNA montre qu'il y a une différence significative entre
ntrôle 1, contrôle 2, δ-ala et lum 30 ne peuvent être distingués. Tous les autres traitements t
traitements, pas de différence entre électrophorèses et une interaction traitement X électrophorèse significative (**). Les traitements codiffèrent des contrôles et différent entre eux, à l'exception des traitements UVA et δ-ala + lum 60 qui sonidentiques.
294
Tableau 5.4-12 : Médianes des Olive tail momeRésultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements; 3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1) et tests post-hoc (matrice des probabilités; comparaisons par paires)
nts
Source de d Somme des CarrPro
duobservé
nificat Varian CV %
variation dl carrés é moyen F babilité
F Sig ion ce
Traitement 8 869.585 108.698 177.587 < 0.001 *** 9.01 73.62
Electroph. 2 3.314 1.657 2.707 0.097 NS 0.12 8.36
T X E 16 9.793 0.612 1.486 0.177 NS 0.07 6.34
Résidu 27 11.118 0.412 0.41 15.74
ter-lames) = 15.7 %
• CV % total = 17.8 %
omparaisons post-hoc
• CV % intra-série (in
C : tests t, correction de Bonferroni; les différences statistiquement significatives (p < 0.05) sont soulignées
C 1
Contrôle 2
UVA δ-ala δ-ala + lum 30
δ-ala + lum 60
δ-ala + UVA 30
δ-ala + UVA 60
Lum 30
ontrôle
δ-ala
δ-ala + lum 30
< 0.001
Contrôle 1 1.000
Contrôle 2 1.000 1.000
UVA < 0.001 < 0.001 1.000
1.000 1.000 < 0.001 1.000
< 0.001 < 0.001 1.000
< 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
δ-ala + UVA 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala + UVA 60
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
L'étude des médianes des distributions de Olive tail moment montre qu'il y a une différence significatentre traitements, pa
ive s de différence entre électrophorèses et pas d'interaction traitement X électrophorèse.
Les traitements contrôle 1, contrôle 2, δ-ala et lum 30 ne peuvent être distingués. Tous les autres traitements diffèrent des contrôles et différent entre eux, à l'exception des traitements UVA et δ-ala + lum 30 qui sont identiques.
1.000
δ-ala + lum 60
0.027
< 0.001
< 0.001
Lum 30 1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
295
Tableau 5.4-13 : Percentiles 75 des Olive tail momeRésultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements; 3 électrophorèses; 2 lames; 50 comètes par lame; Cellules P388D1) et tests post-hoc (matrice des probabilités; comparaisons par paires)
nt
n F lité obs ti ance V %
Source de variation ddl Somme des
carrés Carré moye Probabidu F ervé Significa on Vari C
16 1.62 1.9 0.0
Résidu 27 22.97 0.85
Traitement 8 1471.901 183.988 113.009 < 0.001 *** 15.20 64.69
Electroph. 2 1.456 0.728 0.447 0.647 NS -0.10 ------
T X E 26.049 8 13 66 NS 0.26 8.45
5 1 0.85 15.31
• CV % intra-série (inter-lames) = 15.3 %
• CV % total = 15.3 %
Comparaisons post-hoc : tests t, correction de Bonferroni; les différences statistiquement
Contrôle Contrôle UVA δ-ala δ-ala + δ-ala + δ-ala + δ-ala + Lum 30
significatives (p < 0.05) sont soulignées
1 2 lum 30 lum 60 UVA 30 UVA 60
Contrôle 2 1.000 1.000
UVA < 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala 1.000 1.000 < 0.001 1.000
lum 30 < 0.001
δ-ala + < 0.001lum 60
δ-ala +
Contrôle 1 1.000
δ-ala + < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
< 0.001 0.014 < 0.001 0.021 1.000
UVA 30 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
δ-ala +
< 0.001UVA 60
Lum 30
L'étude des percentiles 75 des distributions de Olive tail moment montre qu'il y a une différence significative entre traitements, pas de différence entre électrophorèses et pas d'interaction traitement X électrophorèse. A l'inverse des traitements contrôle 1, contrôle 2, δ-ala et lum 30 qui ne peuvent être distingués, tous les autres traitements diffèrent des contrôles et diffèrent entre eux.
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
296
5.4.2.5 Discussion
aramètre comète à considérer fait toujours l'objet d'un débat actif entr
éthode et aucun consensus ne semble se dégager (Tice et al., 2000).
Le choix du p e les
utilisateurs de la m Nous
vons donc étudié 2 paramètres souvent employés, le tail DNA et une expression du moment
e queue; pour ce dernier, nous avons choisi le Olive tail moment 79 qui, au contraire du tail
m sique 80, e tivem luencé par l'estimation exacte de la longueur de
queue, un paramètre très difficile à r. Une recommandation gén e cons
mesurer de 50 à 100 comètes sur 2 ou 3 lames (Lovell et al., 1999; Tice et al., 2000) ce qui
fo pide nt une somme de données considérables.
Le traitement statistique de ces données a été relativement peu étudié et nombre d'auteurs
div e ètes, certains
reco e t t ou à une analyse de variance, soit après test du caractère
gaussien des distributions (Belpaeme et al., 1998; De Boek et al., 2000), soit après
8),
it sans tenir compte du c d'autres procèdent à des
tests non-paramétriques, Mann-Whitney (Anderson et al., 1997; Lehmann et al., 1998) ou
Kolmogorov-Smirnov (Belpaeme et al., 1998; Moretti et a ) c ns, et
Wa n et al., 97; De Boek et al., 2000) pour plus de 2 échantillons. Le
test de Kolmogorov-Smirnov a également été appliqué sur les données poolées de plusieurs
échantillons qvi l., 1 don des nombres impressionnants de réplicata, ce
qui peut sér n r l e ue.
Une évaluation visuelle du % de cellules présentant une queue peut être suivie d'une
araison par un test χ² (Miyamae et al., 1997b), un test cependant très sensible à de petites
différences entre échantillons (Lovell et al., 1999).
dispe es s re p isa n icient de
ion", com le r nt end va an écart étalon
ijayalaxmi et al., 1992). Cette valeur qui caractérise la distribution est cependant très
sen
s de modélisation ont également été appliquées. Chaque échantillon de
com
donc de comparer les distances entre les 2 moyennes (Olive et Durand, 1992). La distribution
a
d
oment clas st rela ent peu inf
mesure éral iste à
urnit ra me
ur nt simplement à un tes
transformation logarithmique (Betti et al., 1994; Churg et al., 1995; Wojewodzka et al., 199
aractère non-gaussien (Holz et al., 1995so );
l., 1998 hantillo
Kruskal- llis (Anderso 19
erg nt quant à la méthode employée. Pour comparer les échantillons de com
pour 2 é
(Berg st et a 998), c sur
ieuseme e s
d re t
t fauss 'analy statistiq
comp
La rsion mesu peut ê reflétée l 'u
r l'
ar l'uti tion d "coeff
dispers défini me apport e re l'ét ue des leurs ( ge) et
(V
sible à un petit nombre de valeurs extrêmes (Lovell et al., 1999).
Des technique
ètes a pu être ajusté à une somme de 2 distributions normales, permettant d'estimer et
79 Produit du tail DNA et de la distance séparant les centres de masse de la tête et de la queue 80 Produit du tail DNA et du tail length
297
des mom ue a également pu être modélisée comme une distribution χ², une fonction
à u e
ité de
cellules présentent en effet un
pou
ents de que
n seul paramètre (n, le "nombre de degrés de liberté") qui permet donc de caractériser et d
comparer les échantillons (Bauer et al., 1998). La fonction χ² présente cependant une
singularité pour les valeurs faibles du paramètre (n < 2), empêchant de caractériser les
échantillons de cellules contrôles (Bock et al., 1998).
Parmi toutes ces méthodes et philosophies de test statistique, aucune ne fait encore l'objet
d'un consensus (Tice et al., 2000). Les discussions récentes montrent cependant que l'un
comparaison ne devrait pas être la cellule, mais le traitement (Lovell et al., 1999; Tice et al.,
2000). Les comparaisons portant sur de grands nombres de
voir discriminant élevé, mettant trop facilement en évidence un effet.
5.4.2.6 Conclusions quant au traitement statistique des données comètes
Aucune étude systématique des traitements statistiques de données comètes n'étant enc
publiée, il nous a semblé important de définir les conditions d'utilisation de cette mé
nouvellement introduite dans le laboratoire. Cette étude originale des différentes possibilités
de représentation des données et de traitement statistique nous mène aux conclusions
suivantes :
1. la représentation en box plots est un moyen efficace de comparer visuellement l
amplitudes et surtout les distributions des dégâts occasionnés, sans le biais visuel
des histogrammes tridimensionnels;
2. les distributions de comètes ne présentent pratiquement jamais un caractère
gaussien;
ore
thode
es
ique;
en évidence des différences
le;
es peut être limitée par
3. les distributions ne peuvent être normalisées par une transformation logarithm
4. la comparaison des échantillons de comètes par un test non-paramétrique
(Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney) met
objectivement peu importantes et n'apporte donc aucun renseignement uti
5. la réduction aux statistiques non-paramétriques représentatives permet une
comparaison des échantillons par analyse de variances;
6. la perte d'information81 due à cette réduction aux statistiqu
l'utilisation de 2 statistiques (médiane et percentile 75);
7. il n'y a pas de différence significative entre électrophorèses;
81 Notamment quant à la dispersion des mesures
298
8. les 2 paramètres de comètes étudiés, tail DNA et Olive tail moment, permettent
d'arriver à des conclusions similaires et il n'y a pas de différence flagrante entre
eux.
Pour la suite de ce travail qui consistera principalement en analyses de tendance, nous
avo
à
NA (% d'ADN dans
r une
e,
e la
"forme" des comètes. La mesure de ce paramètre est aussi fiable que celle du
2. uplicata afin d'en extraire les paramètres
ui, considérées individuellement, nous ont permis d'estimer la
3. rver une
5.4.2.7 Conclusions quant à l'effet photodynamique des porphyrines
ns donc décidé :
1. de ne plus considérer les 2 paramètres comètes pour chaque expérience et de
présenter les résultats :
• sous la forme de tail DNA pour les essais de détection de lésions spécifiques
l'aide d'endonucléases de réparation (Section 5.5); le tail D
la queue) nous semble en effet le paramètre naturel pour estime
augmentation de la quantité d'ADN migrant après fragmentation enzymatique;
• sous la forme de Olive tail moment pour les autres expériences; ce paramètr
qui localise d'une certaine façon le gros de l'ADN déplacé sous l'action du
champ électrique, nous semble en effet un bon moyen de tenir compte d
tail DNA (§ 5.3.1.5); elle présente l'avantage de dépendre moins des conditions
expérimentales et de présenter une dispersion plus réduite.
de coupler les lames de microscope d
statistiques représentatifs de 100 comètes et non plus de 2 x 50; ces lames
duplicata q
reproductibilité intra-électrophorèse ne sont en effet pas des échantillons
indépendants;
de considérer les 2 statistiques, médiane et percentile 75, afin de conse
idée de la dispersion des mesures.
L'analyse de variance sur les paramètres extraits des distributions de comètes démontre
que ni la lumière blanche, ni l'acide δ-aminolévulinique n'induisent des cassures de chaînes en
quantit e blanche après
induction des porphyrines exerce un effet significatif.
Les UVA induisent des cassures de chaînes et cet effet est largement potentialisé après
induction des porphyrines.
é supérieure aux contrôle. Par contre, une irradiation par la lumièr
299
5.4.3 Analyse de tendance
Les réponses au traitement photodynamique ont été mesurées en fonction de la dose de
lumière, en présence et en absence de δ-ala; les traitements réalisés sont décrits dans le
Tableau 5.4-14. Chaque traitement (100 comètes mesurées sur 2 lames) a été répliqué au
cou
4.2). Au fur et à mesure de leur préparation, les lames de microscope sont
disposées aléatoirement dans les cuves contenant la solution de lyse et maintenues à 4°C;
chaque cuve est assignée à un run d'électrophorèse exécuté endéans les 2 jours.
Tableau 5.4-14
rs d'expériences indépendantes réalisées de la même manière que pour l'étude de
reproductibilité (§ 5.
: Traitements réalisés dans le cadre de l'étude d'analyse de tendance (Cellules P388D1)
Nom donné aux échantillons
Traitement
contrôle aucun (ni δ-ala, ni irradiation )
δ-ala 300 µM 3 h + 30 min à 4°C sans irradiation
irradiation lumière visible, 4°C, 5 min (3.6 J/cm²)
irradiation lumière visible, 4°C, 15 min (10.7 J/cm²)
δ-ala
lum 5
lum 10 irradiation lumière visible, 4°C, 10 min (7.1 J/cm²)
lum 15
lum 30 irradiation lumière visible, 4°C, 30 min (21.4 J/cm²)
UVA 5 irradiation UVA, 4°C, 5 min (0.09 J/cm²)
UVA 10 irradiation UVA, 4°C, 10 min (0.19 J/cm²)
UVA 15 irradiation UVA, 4°C, 15 min (0.28 J/cm²)
UVA 30 irradiation UVA, 4°C, 30 min (0.56 J/cm²)
δ-ala + lum 5 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation lumière visible, 4°C, 5 min (3.6 J/cm²)
δ-al
δ-ala + l diation lumière visible, 4°C, 15 min (10.7 J/cm²)
δ-ala + lum 30 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation lumière visible, 4°C, 30 min (21.4 J/cm²)
/cm²)
δ-ala + UVA 10 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA, 4°C, 10 min (0.19 J/cm²)
a + lum 10 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation lumière visible, 4°C, 10 min (7.1 J/cm²)
um 15 δ-ala 300 µM 3 h + irra
δ-ala + UVA 5 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA, 4°C, 5 min (0.09 J
δ-ala + UVA 15 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA, 4°C, 15 min (0.28 J/cm²)
δ-ala + UVA 30 δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA, 4°C, 30 min (0.56 J/cm²)
300
5.4.3.1 Résultats
Les Figures 5.4-5 et 5.4-6 montrent les box plots de l'ensemble des résultats pour,
respectivement, les traitements lumière blanche et UVA. Le Tableau 5.4-15 présente les
médianes et p75 des Olive tail moments mesurés pour tous les traitements.
5.4.3.2 Courbes dose-réponse
Les courbes de tendance "dose de lumière - réponse (statistique représentative de la
distribution des Olive tail moments)", en absence et en présence de δ-ala et pour les
traitements lumière blanche et UVA, ont été établies pour les médianes (Figure 5.4-7) et les
percentiles 75 (Figure 5.4-8).
301
Figure 5.4-5 : Lumière blanche : Résultats de l'ensemble des expériences (Cellules P388D1)
Contrôle
ala
Lum 5 min
Lum 10 min
Lum 15 min
Lum 30 min
Lum 5 min
Lum 10 min
Olive Tail Moment
0 10 20 30 40
Lum 30 min
Lum 15 minδ-ala 300 µM
3 h +
Les résultats, présentés traitement par traitement en fonction de la dose de lumière, correspondent à 10 traitements (décrits au Tableau 5.4-14) réalisés en duplicata (expériences indépendantes); 100 comètes mesurées sur 2 lames.
302
Figure 5.4-6 : UVA : Résultats de l'ensemble des expériences (Cellules P388D1).
Contrôle
ala
UVA 5 min
UVA 10 min
UVA 15 min
UVA 30 min
UVA 5 min
UVA 10 min
UVA 15 min
UVA 30 min
Olive Tail Moment
0 10 20 30 40
δ-ala 300 µM
3 h +
Les résultats, présentés traitement par traitement en fonction de la dose de lumière, correspondent à 10 traitements (décrits au Tableau 5.4-14) réalisés en duplicata (expériences indépendantes); 100 comètes mesurées sur 2 lames.
303
Tableau 5.4-15 : Médianes et percentiles 75 des distributions de comètes et leurs intervalles de confiance à 95 %; Olive tail moment; 10 traitements réalisés en duplicata (expériences indépendantes); 100 comètes mesurées sur 2 lames; Cellules P388D1 (Traitements décrits dans le Tableau 5.4-14)
Médiane du Olive tail moment p75 du Olive tail moment Traitement
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2
contrôle 0.46 (0.29 - 0.61)
1.66 (1.27 – 1.96)
0.89 (0.70 – 1.20)
2.64 (2.12 – 3.58)
δ-ala 0.39 (0.23 - 0.52)
1.75 (1.33 – 2.06)
0.81 (0.61 - 0.97)
3.39 (2.49 – 3.99)
lum 5 0.55 (0.42 - 0.69)
0.48 (0.33 – 0.57)
1.10 (0.85 - 5.55)
0.76 (0.69 - 0.97)
lum 10 0.56 (0.46 - 0.64)
0.45 (0.38 - 0.57)
0.85 (0.72 – 1.00)
0.95 (0.65 – 1.27)
lum 15 0.94 (0.64 – 1.29)
0.31 (0.20 - 0.45)
1.85 (1.47 – 2.11)
0.67 (0.52 - 0.89)
lum 30 0.61 (0.53 - 0.80)
0.81 (0.65 - 0.98)
0.94 (0.86 – 1.20)
1.25 (1.06 – 1.58)
δ-ala + lum 5 1.02 (0.88 – 1.24)
0.50 (0.41 - 0.69)
1.55 (1.40 – 2.01)
1.09 (0.89 – 1.17)
δ-ala + lum 10 1.06 (0.91 – 1.38)
0.90 (0.69 – 1.23)
1.96 (1.54 – 2.23)
1.70 (1.43 – 2.20)
δ-ala + lum 15 2.82 (1.94 – 3.78)
1.62 (1.44 – 1.85)
6.85 ((5.30 – 8.55)
2.65 (2.24 – 3.20)
δ-ala + lum 30 4.39 (3.92 – 4.86)
2.43 (1.64 – 3.23)
6.85 (5.87 – 8.08)
4.83 (4.16 – 6.09)
UVA 5 0.53 (0.36 - 0.63)
0.72 (0.51 - 0.90)
0.92 (0.72 – 2.03)
1.34 (1.12 – 1.51)
UVA 10 0.99 (0.79 – 1.14)
2.38 (1.98 – 2.95)
2.10 (1.52 – 2.89)
4.24 (3.45 - 5.33)
UVA 15 1.34 (1.16 – 1.72)
3.99 (3.04 – 4.84)
2.20 (1.83 – 2.77)
6.33 (5.29 – 7.72)
UVA 30 3.71 (3.04 - 5.57)
4.22 (3.58 - 5.94)
9.89 (8.15 – 12.57)
9.70 (7.53 – 12.76)
δ-ala + UVA 5 1.76 (1.49 – 2.39)
1.02 (0.85 – 1.43)
4.12 (2.70 - 5.11)
2.01 (1.54 – 2.29)
δ-ala + UVA 10 2.69 (1.96 – 3.55)
5.22 (4.62 – 6.21)
4.87 (3.99 – 6.49)
8.26 (7.34 - 9.23)
δ-ala + UVA 15 5.08 (4.50 - 5.62)
5.56 (4.23 – 7.12)
7.23 (6.06 – 7.66)
9.04 (8.05 – 10.65)
δ-ala + UVA 30 10.53 (9.45 – 11.06)
9.78 (8.87 – 10.73)
13.38 (11.96 – 14.93)
13.43 (11.73 – 14.09)
304
Figure 5.4-7 : Médianes de la distribution des Olive tail moments en fonction de la dose de ière (Cellules P388D1)
face de chaque droite sont indiqués le coefficient de détermination et la probabilité du testr l'existence d'une pente significative. Les traitements sont
lumEn pou décrits dans le Tableau 5.4-14 (** 1; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05)
• Sans incubation a ique
*, p < 0.00
vec l'acide δ-aminolévulin
'irradia
Lumière blan
Va
Après incubation a 'acide δ-aminolévuliniq
• vec l
Oli
ail
umière b
UVa
(pas d'induction de porphyrines)
0
4
8
12
16
0 10 2
Temps d ti
Oliv
e ta
il m
omen
t
che
U
0
4
8
12
16
0 10 2
Temps d'irradiati
ve t
mom
ent
L lanche
R² = 0.665 ( )
30
ue tion d )
R² = 0.02 (NS)
0
on (min)
(induc e porphyrines
R² = 0.906 ( )
0.634
0 30
on (min)
R² = ( )
305
Figure 5.4-8 : Percentiles 75 de la distribution des Olive tail moments en fonction de la dosede lumière (Cellules P388D1En face de chaque droite sont indiqués le coefficient de détermination et la probabilité du test pour l'existence d'une pente significative. Les traitements sont décrits dans le Tableau 5.4-14 (***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05)
)
• Sans incubation avec l'acide δ-aminolévulinique (pas d'induction de porphyrines)
0
4
8
12
16
0 10 20 30
Temps d'irradiation (min)
Oliv
e ta
il m
omen
t
Lumière blanche
UVa
• Après incubation avec l'acide δ-aminolévulinique (induction de porphyrines)
0
4
8
12
16
0 10 20 30
Temps d'irradiation (min)
Oliv
e ta
il m
omen
t
Lumière blanche
UVa
R² = 0.911 ( )
R² = 0.538 ( )
R² = 0.829 ( )
= 0.041 (NS)
R²
306
Le Tableau 5.4-16 compare les pentes des droites de régression obtenues en présence et en
la (correspondant aux Figures 5.4-7 et 5.4-8 présentées ci-avant).
absence de δ-a
Tableau 5.4-16 : Comparaison des pentes des droites de régression obtenues avec et sans
(0.05; 16) Médiane Percentile 75
induction des porphyrines t = 2.112
Lumière blanche (n = 10)
Sans induction des porphyrines
Après induction des porphyrines
Sans induction des porphyrines
Après induction des porphyrines
R² 0.020 0.634 0.041 0.538
b - 0.005 0.090 - 0.011 0.153
sb 0.013 0.024 0.019 0.050
p du test pour l'existence d'une pente significative 0.659 NS 0.006 ** 0.575 NS 0.016 *
Comparaison des pentes (a) Comparaison des pentes (a)
t calculé 3.48 3.07
p 0.003 ** 0.007 **
UVA (n = 10)
Sans induction des porphyrines
Après induction des porphyrines
Sans induction des porphyrines
Après induction des porphyrines
R² 0.665 0.906 0.829 911 0.
b 0.111 0.317 0.290 0.388
sb 3
p du test pour l'existence d'une pente significative 0.004 ** < 0.001 *** < 0.001 *** < 0.001 ***
Comparaison des pentes Comparaison des pentes
0.028 0.028 0.047 0.04
t calculé 5.202 1.538
p < 0.001 *** 0.143 NS (a) Note : dans le cas présent, ce test est redondant; en effet, les sont statistiquement non différentes de 0 pour l'irradiation sans induction des porphyrines.
5.4.3.3 Discussion
pentes
La lumière blanche seule ne présente aucun effet significatif et il n'y aucune relation entre
la dose de lumière et la fragmentation de l'ADN (R² = 0.02 ou 0.041 suivant le quantile
envisagé; les tests pour l'existence d'une pente sont largement non significatifs). Après
induction des porphyrines, l'analyse de tendance démontre un effet significatif dose-
dépendant.
307
La lampe UVA induit par elle-même des cassures de chaîne de manière dose-dépendante;
après induction des porphyrines, l'étude des médianes démontre une augmentation de pente
significative, donc un effet photodynamique se traduisant par une fragmentation accrue de
istiquement significative, certainement en raison d'une
lus grande variabilité des mesures. Ce paramètre statistique est en effet plus sensible que la
édiane aux valeurs extrême
e des box p de s l'interprétation des données, car il
toute une part d'in du ucti u
graphiques (Figures 5.4-5 et 5.4-6), un certain nombre de valeurs extrêmes peuvent en effet
server, de manière appar nt erratique certains échan (notamme r des
in et UVA 5 et 10 min). D'a s notre expérience ultérieure, ces valeurs
proviennent de la manipulation; une remise en suspension trop vigoureuse des cellules avant
l'étape d'incorporation dans l'agar induit des cassures de chaînes dans l'ADN, ce qui augmente
variabilité intra-échantillon
Conclusions q an de
l'ADN. La même tendance s'observe dans l'étude des percentiles 75; mais, dans ce cas,
l'augmentation de pente n'est pas stat
p
m s.
Le graphiqu
présente
lots est une ai
formation per
précieuse dan
e lors de la réd on aux statistiq es. Sur ces
s'ob emme pour tillons nt pou
échantillons LUM 5 m prè
la .
5.4.3.4 u t à l'analyse tendance
L'analyse de tendance sur les paramètres statistiques met en évidence un effet dose-
pendant et parvient à des ré s similaires à ceux de l'étude de ductibilité
lyse ANOVA présentée c t (§ 5.4.2.4). Elle permet de distinguer une absence d'effet
blanche ffet pos δ-ala + lu nche,
UVA). So application ose cependa t le oxicité et
t pas être toujours év e pouvoir onter en dose.
4.3.5 Conclusions quant hotodynamique des porp e
dé sultat repro par
ana i-avan
génotoxique (lumière ) d'un e itif (UVA, mière bla δ-ala +
n à certaines molécules p n problème de la cytot
il ne doi ident d m
5. à l'effet p hyrin s
'une pente significative pour la lumière blanche après induction des porphyrines indique sans
ur les UVA, la pente devient plus importante après δ-ala ce qui indique
également un effet photodynamique; l'augmentation de pente, statistiquement significative
pour la médiane, est une tendance nette pour les percentiles 75.
Les coefficients de détermination sont relativement éloignés de l'unité, mais il convient de
ne pas oublier que ces régressions portent sur des quantiles qui ne sont que des reflets très
imparfaits des distributions réelles.
L'effet photodynamique est également démontré par l'analyse de tendance. L'apparition
d
conteste un effet. Po
308
5.5 PHOTOOXYDATION DE L'ADN PAR LES PORPHYRINES INDUITES : UTILISATION D'ENDONUCLEASES SPECIFIQUES.
L'utilisation d'endonucléases bactériennes spécifiques de certaines lésions devrait
permettre de déterminer si (i) l'essai comète parvient aux mêmes conclusions que les études
chromatographiques (Chapitre 4) quant à l'induction de purines oxydées par le traitement
photodynamique; et (ii) si l'effet de fragmentation observé avec la lampe UV est dû à
l'induction (donc à la réparation) de dimères par la fraction UVB présente dans le
rayonnement.
Après l'étape de lyse, les nucléoïdes sont traités in situ dans le gel d'agarose par l'enzyme
étudiée, à 37°C; les lésions spécifiques excisées se traduisent par une fragmentation
additionnelle, donc par une migration accrue de l'ADN.
5.5.1 Les endonucléases utilisées
Les 3 endonucléases bactériennes spécifiques employées au cours de ce travail
proviennent de vecteurs plasmidiques exprimés dans des souches bactériennes (Epe et Hegler,
s décrits dans le Tableau 5.5-1.
1994; Angelis et al., 1999). Elles reconnaissent les site
Tableau 5.5-1 : Endonucléases de réparation utilisées au cours de ce travail
Enzyme Spectre de reconnaissance
Bases modifiées Site abasique (site AP) dont ledésoxyribose est
non modifié oxydé en 1' oxydé en 4'
Formamidopyrimidine 8-oxodG et formamidopyrimidine glycosylase (FPG) (EC 3.2.2.23)
5-OH-cytosine, 5-OH-uracile, acide β-uréidoisobutyrique et acide α-R-OH-β-uréidoisobutyrique
(Endo III)82
OH-6-hydrothymine, 5,6-dihydrouracile, alloxane, 5-OH-6-hydrouracile, uracile glycol, 5-OH-cytosine, 5-OH-uracile, acide β-uréidoisobutyrique et acide α-R-OH-β-uréidoisobutyrique
-
T4 endonucléase V dimères de pyrimidines
+ - +
Endonucléase III thymine glycols, 5,6-dihydrothymine, 5- + +
(T4 82+ - +
)
D'après (Epe et Hegler, 1994; Laval et al., 1998)
82 Pas de numéro EC
309
La FPG est globalement spécifique des purines oxydées mais elle peut également exciser
certaines pyrimidines; l'Endo III a une spécificité large envers les pyrimidines oxydées,
excisant les pyrimidines à noyau saturé, ouvert ou fragmenté; la T4 endonucléase V reconnaît
les dommages UV-induits directs.
Ces enzymes ont en fait une activité glycosylasique et AP endonucléasique combinée;
elles éliminent la lésion et incisent le squelette ADN au site AP généré (Epe et Hegler, 1994).
Les sites AP sont donc également substrats de ces enzymes.
ole5.5.2 Protoc
t entre la source UVA et les
oute trace d'UVB (cf § 2.3.2.4.4)
Tab
Afin de pouvoir mettre en évidence une augmentation de la fraction d'ADN migrante, des
conditions qui fragmentent relativement peu l'ADN ont été étudiées (Tableau 5.5-2).
Certaines expériences ont été réalisées en interposan
échantillons un filtre qui permet éliminer t
leau 5.5-2 : Traitements réalisés dans le cadre de l'étude avec endonucléases (Cellules P388D1)
Nom donné aux Traitement
échantillons (a)
contrôle aucun (ni δ-ala, ni irradiation )
δ-ala δ-ala 300 µM 3 h + 30 min à 4°C sans irradiation
0 irradiation lumière visibl
lum 20 mière visible, 4°C, 20 min (14.2
UVA 10 irradiation UVA, 4°C, 10 min (0.19 J/cm
ya UV34, 4°C, in
umière visible, 4°C, 10 min (7.1 J/cm²)
δ-ala + lum 20 rradiation lumière visible, 4°C, 20 min (14.2 J/cm²)
, 4°C, 10 .19 J/cm
V filtré sous filtre Hoya UV34, 4°C, 11 min
lum 1 e, 4°C, 10 min (7.1 J/cm²)
irradiation lu J/cm²)
²)
UVA filtré
δ-ala + lum 10
irradiation UVA sous filtre Ho
δ-ala 300 µM 3 h + irradiation l
δ-ala 300 µM 3 h + i
11 m
δ-ala + UVA 10
δ-ala + U
δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA
δ-ala 300 µM 3 h + irradiation UVA
min (0 ²)
ux de résultats et Figures, le nom de l'enzyau nom de l'échantillon; par
des cellules δ-ala (300 µM 3 h), irrad 0.1
(a) Dans les Tablea me utilisée pour révéler un type de lésions
peut être accolé exemple : "δ-ala + UVA 10 + FPG" signifie "traitement par iation UVA (4°C, 10 min, 9 J/cm²) et révélation des lésions
par digestion des nucléoïdes par l'enzyme FPG (formamidopyrimidine glycosylase) avant électrophorèse"
310
5.5.3 ines et pyrimidines oxydé Pur es
5.5.3.1 Résultats
Les graphes box plots des Figures 5.5-1 et 5.5-2 (3 expériences indépendantes réalisées
endéans 3 mois) comparent l'augmentation de fragmentation due à l'action des endonucléases
FPG et Endo III, et ce pour différentes conditions expérimentales. Les Figures 5.5-3 et 5.5-4
résument ces données en présentant les médianes de tail DNA mesurées. Pour plus de
lisibilité, chaque figure reprend les données obtenues sans l'utilisation d'endonucléases.
compare les augmentations des médianes de tail DNA dues à l'effet
photodynamique des porphyrines; les médianes de Olive tail moment sont également
présentées.
Tab
Le Tableau 5.5-3
leau 5.5-3 : Différences de médianes entraînées par l'induction de porphyrines avirradiations lumière blanche et UVA
ant les
Les résultats correspondent à 3 expériences indépendantes réalisées sur 3 mois; 100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2).
Tail DNA VA Irradiation lumière blanche
Irradiation U
Traiendo A 10
Différence due à l'effet
photodynamique lum 20
δ-ala + lum 20
Différence due à l'effet
photodynamique
tement nucléase UV δ-ala +
UVA 10
de digestionmatique
27.7 + 13.1 4.3
34.6 + 16.8 23.2
41.5 + 23.8 12.4
28.8 + 12.6 17.7
26.5 + 13.5 7.0
e tail ent
Irradiation UVA Irradiation lumière bl
ment δ-ala + Différence due à δ-ala + Différenc
Pas enzy
17.7 19.6 14.6
30.4 37.9
+ 12.7 + 18.3
14.8 11.4
18.8 26.3 14.1
+ 4.0 + 14.9 + 9.8
Digestion FPG 17.8 36.2 17.7
56.4 + 20.2 20.8 29.1 36.0 22.1
+ 5.9 + 15.2 + 9.7
Digestion Endo III
16.2 24.9 13.0
34.0 + 9.1 17.8 24.8 21.2 14.7
+ 7.1 + 3.4 + 7.7
Olivmom
anche
Traiteendonucléase UVA 10 UVA 10 l'effet
photodynamique lum 20 lum 20
e due à l'effet
photodynamique
Pas deenzymati
digestion que
1.0 4.0 1.6
2.7 7.5 4.7
+ 1.7 + 3.5 + 3.1
1.5 1.2 0.6
3.9 4.8 2.3
+ 2.4 + 3.6 + 1.7
FPG 2.3 Digestion6.9 2.2
6.5 10.5 8.3
+ 4.2 + 3.6 + 6.1
3.1 3.6 1.5
5.3 6.9 3.8
+ 2.2 + 3.3 + 2.3
Digestion Endo III
2.1 3.6 1.3
5.6 5.9 4.2
+ 3.5 + 2.3 + 2.9
2.5 2.2 0.7
4.5 4.4 1.6
+ 2.0 + 2.2 + 0.9
311
Figure 5.5-1 : Comparaison de la fragmentation mesurée avant et après action de la FPG (excision des purines oxydées)
ésultats, présentés traitement par traitement, correspondent à 3 expériences indépendantes réalisées sur 3 mois; 100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2).
Les r
Les mesures sans l'action d'une endonucléase sont identiques à celles de la Figure 5.5-2.
A. Sans action d'une endonucléase
100Co
ne
l 1
0
+ 1
ala
+ lu
m 2
0
UV 1
0
UVA
1
Tail
D
0
2
60
NA
80
0
40
Expérie Expérience 1
nce 2 Expérience 3
trôl ala
um lum
20
lum
0
ala
A
ala
+
0
B. Aprè ion d a FP
δ −
δ −
−
s act e l G
δ −
δ
rôle ala 0
lum
2 10
ala
+ lu
m 2
0
A 10
UVA
10
Tail
DN
A
0
20
60
80
100
−
δ −
δ −
δ −
Cont lum
1
0al
a +
lum
UV
ala
+
40
δ
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3
312
Figure 5.5-2 : Comparaison de la fragmentation mesurée avant et après action de l'Endo II(excision des pyrimidines oxydéLes résultats, présentés traitement par traitement, correspondent à 3 expériences indépendantes réalisées sur 3 mois; 100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2)). Les mesures sans l'action d'une endonucléase sont identiques à celles de la Figure 5.5-1.
I es)
A. Sans action d'une endonucléase Co
ntrô
le ala
lum
10
lum
20
ala
+ lu
m 1
0al
a +
lum
20
UVA
10al
a +
UVA
10
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3
I
δ −
δ −
δ −
δ −
B. Après action de l'Endo II
Cont
rôle ala
lum
10
lum
20
ala
+ lu
m 1
0al
a +
lum
20
UVA
10al
a +
UVA
10
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
δ −
δ −
δ −
δ −
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3
313
Figure 5.5-3 : Comparaison des médianes mesurée avant et après action de la FPG (excision des purines oxydées) Les résultats correspondent à 3 expériences indépendantes réalisées sur 3 mois; 100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2). Les mesures sans l'action d'une endonucléase sont identiques à celles de la Figure 5.5-4.
A. Sans action d'une endonucléase
0
20
40
60
ala
lum20
ala +
lum 20
UVA
10
ala +
UVA
10
Tail
DN
A
Expérience 1Expérience 2Expérience 3
δ −
δ −
δ −
Cont
rôle
B. Après action de la FPG
0
20
40
60
ala
lum
20
ala
+ lu
m 2
0
UVA
10
ala
+ UV δ −
δ −
δ −
A 10
Tail
DN
A
Expérience 1Expérience 2Expérience 3
Cont
rôle
314
Figure 5.5-4 : Comparaison des médianes mesurée avant et après action de l'Endo II(excision des pyrimidines oxydéLes résultats correspondent à 3 expériences indépendantes réalisées sur 3 mois; 100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2). Les mesures sans l'action d'une endonucléase sont identiques à celles de la Figure 5.5-3.
I es)
A. Sans action d'une endonucléase
0
20
40
60
ala
lum20
ala +
lum 20
UVA
10
ala +
UVA
10
Tail
DN
A
Expérience 1Expérience 2Expérience 3
δ −
δ −
δ −
Cont
rôle
IB. Après action de l'Endo II
0
20
40
60
ala
lum
20
ala
+ lu
m 2
0
UVA
10
ala
+ UV
A 10
Tail
DN
A
Expérience 1Expérience 2Expérience 3
δ −
δ −
δ −
Cont
rôle
315
5.5.3.2 Discussion
ulations avec les endonucléases de restriction nous semblent nettement plus
'essai comète classique et apparaissent moins reproductibles. De plus, la
Les manip
délicates que l
lourdeur de manipulation et surtout les faibles quantités d'enzymes dont nous disposions ne
nous ont pas permis de répéter les essais. Remarquons que les résultats enregistrés au cours de
l'expérience 2 sont systématiquement plus élevés que dans les autres essais. Il n'y a pas
d'explication évidente à cette observation.
La dispersion des mesures, relativement importante, empêche toute comparaison
statistique, mais nous pouvons cependant tenter de retirer quelques tendances importantes de
nos essais :
• les UVA par eux-mêmes n'induiraient que peu de sites sensibles à la FPG et pas de
sites Endo III;
• le traitement photodynamique UVA ne semble pas induire de pyrimidines oxydées
(pas d'effet de l'Endo III), il y a une tendance nette à la formation de purines oxydées
(augmentation des médianes et de la dispersion des distributions par excision FPG);
cet effet se manifeste de manière moindre lorsque la fragmentation "bruit de fond" est
très importante (Expérience 2);
• le traitement photodynamique lumière visible montre une tendance moins nette que les
UVA à l'apparition de purines oxydées (augmentation de la dispersion des mesures par
ible sur la médiane).
5.5.4 Photoproduits dimères
excision FPG mais effet fa
5.5.4.1 Résultats
Les graphes box plots de la Figure 5.5-5 (2 échantillons indépendants) comparent
l'augmentation de fragmentation due à l'action de la T4 endonucléase V, et ce pour différentes
conditions expérimentales.
Une expérience a également été réalisée après filtration de la fraction UVB de la lampe
employée dans ce travail (Filtre Hoya UV-34 qui absorbe toutes les longueurs d'onde
inférieures à 320 nm, présente une transmission de 50 % à 340 nm et de 80 à 90 % au-dessus
de 360 nm; cf Figure 2.3-8); les résultats sont présentés à la Figure 5.5-6.
316
Figure 5.5-5 : Comparaison de la fragmentation mesurée avant et après action de la T4 endonucléase V (excision des dimères de pyrimidines)
ts; Les résultats, présentés traitement par traitement, correspondent à 2 échantillons indépendan100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2).
A. Sans action d'une endonucléase
80
100
t
TD
40ail
NA 60
20
Con
rôle ala
lum
20
+ lu
m 2
0
UVA
10
+ UV
A 10
0 Ech
−
Echantillon 1 antillon 2
ala
ala
δ
δ −
δ −
B. Après action de la T4 endonucléase V
100
Cont
60
80
Tail
DN
A
40
rôle ala
m 2
0
m 2
0
A 10
A 10
0
20 Ech
−
antillon 1 Echantillon 2
lu
ala
+ lu UV
ala
+ UV δ
δ −
δ −
317
Figure 5.5-6 : Effet de la filtration des UVB sur les fragmentations mesurées avec ledifférentes endonucléases 100 comètes mesurées sur 2 lames (traitements décrits au Tableau 5.5-2).
s
Cont
rôle
Cont
rôle
End
o III
Cont
rôle
FPG
UVA
Filtr
é
UVA
Filtr
é +
Endo
IIIUV
A Fi
ltré
+ FP
GUV
A Fi
ltré
+ T4
ala
+ U
VA F
iltré
ala
+ UV
A Fi
ltré
+ En
do III
ala
+ UV
A Fi
ltré
+ FP
G
ala
+ UV
A Fi
ltré
+ T4
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
5.5.4.2 Discussion
Une forte augmentation de la fragmentation par la T4 endonucléase V est observée après
irradiation UV, que ce soit avant ou après induction des porphyrines (Figure 5.5-5).
L'irradiation avec les tubes Cléo utilisés dans ce travail, typiques, rappelons-le, des salons de
bronzage, génère donc des quantités appréciables de dimères bipyrimidiques. L'expérience
avec les UVB filtrés (Figure 5.5-6) montre que la plus grande partie de ces dimères sont
formés par la fraction d'UVB contenue dans le rayonnement de la lampe (rapport UVB/UVA,
1.2 %). En effet, après filtration des UVB, l'endonucléase T4 génère sensiblement moins de
fragmentation additionnelle. Ces tracés montrent un effet net de la FPG, révélant l'induction
de purines oxydées après induction des porphyrines et UVA; l'effet de l'Endo III après ce
traitement photodynamique est beaucoup plus important que dans les autres expériences mais
il est difficile de tirer une conclusion à partir de l'ensemble des données. Rappelons que nous
n'avons pas eu l'occasion de répéter ces essais (§ 5.5.3.2).
δ −
δ − δ −
δ −
318
5.6 DISCUSSION : LA LUMIERE ET L'ESSAI COMETE
e ce travail, qui visait à mettre en évidence un effet photodynaAu cours d mique des
porphyrines endogènes ainsi qu'une méthode de traitement statistique des données obtenues
dans l'essai comète, nous avons relevé différentes observations qui méritent d'être mises en
perspective par rapport aux données publiées.
5.6.1 Formation de cassures de chaînes par une irradiation lumineuse
5.6.1.1 Energie nécessaire pour induire une lésion à l'ADN
Une irradiation laser à 308 nm a permis d'estimer que moins de 4 x 105 photons UVB par
cellule sont requis pour induire une lésion dans l'ADN détectable par essai comète83, ce qui
Figure 5.6-1 : Energie nécessaire pour induire une lésion détectable par essai comète
dans une cellule en fonction de la longueur d'onde.
(de With et Greulich, 1995)
correspondrait, compte tenu de la portion d'UVB dans la lumière solaire, à une exposition
0.5 ms au soleil (de With et al., 1994). De la même manière, les quantités d'énergie
nécessaires pour induire une lésion à l'ADN en fonction de la longueur d'onde ont été
estimées (Figure 5.6-1) (de With et Greulich, 1995). Dans le graphique obtenu, la
modification de pente observée vers 340 nm correspond à la transition entre les effets de ty
UVC (effets directs) et les effets de type UVA (effets indirects médiés par des
photosensibilisants) (de With et Greulich, 1995) (cf § 1.3.4.2.7). Les doses de lumière
de
pe
83 Cassures simple-brin et double-brin, sites alcali-labiles
319
nécessaires pour observer un effet augmentent donc considérablement avec la longueur
d'onde, de manière logiquement inverse à l'énergie du rayonnement.
5.6.1.2 Origine des cassures de chaîne induites par la lumière
Les comètes induites par les radiations ionisantes et certains génotoxiques sont une
conséquence des cassures provenant de l'attaque directe de l'ADN. Les comètes induites par
les UV (A, B et C) résulteraient par contre en grande partie des incisions transitoires
effectu
2000). E
ées par les mécanismes de réparation au niveau des photoproduits (Rünger et al.,
n effet, les quantités d'ADN migrant augmentent jusqu'à environ 2.5 h après
l'ex
,
l'utilisation d'inhibiteurs des ADN polymérases (l'aphidicoline et l'ara-C84, inhibiteurs
notamment de la polymérase α) mène à l'accumulation
position aux UV pour ensuite régresser, au fur et à mesure de l'achèvement de la
réparation, ce qui prend de 4 h à 24 h suivant les lignées cellulaires et les auteurs; d'autre part
des cassures de chaînes, la réparation
s'arrêtant à l'étape d'incision (Speit et Hartmann, 1995; Bock et al., 1998; Rünger et al., 2000).
La répartition de ces effets de fragmentation entre les différentes bandes UV est complexe
et controversée85 (Rünger et al., 2000). Les UV peuvent en effet produire un mélange de
lésions qui sont réparées par 2 voies principales87, le NER et le BER. Ces mécanismes
distincts contribuent donc aux incisions détectées dans l'essai comète, leurs parts relatives
dépendant des longueurs d'onde impliquées86.
Remarquons que l'effet d'accroissement de cassures de chaînes au cours du temps n'est pas
observé après irradiation des cellules de patients présentant un défaut génétique dans le
mécanisme de réparation NER87 (groupes de complémentation A à G de xeroderma
pigmentosum et trichothiodystrophie); cette particularité a été proposée comme moyen de
diagnostic (Green et al., 1992), notamment préna
es résultats de notre étude montrent un effet de fragmentation statistiquement significatif
; de fait,
ères,
tal (Alapetite et al., 1997).
L
de l'irradiation UV mais aucun effet pour l'irradiation lumière blanche. L'effet des UV
pourrait être dû soit aux UVA, soit à la fraction d'UVB contaminant le rayonnement
nous avons montré que la lampe utilisée induisait une proportion élevée de dégâts dim
typiques des UVB.
84 1-β-D-arabinofuranosyl cytosine 85
font qu'embrouiller la situation en employant des sources aux spectres complètement faussés (lampe "UV Certains travaux supposés éclairer la contribution respective de chaque bande UV (Lehmann et al., 1998) ne
B" émettant un spectre continu intense de 270 à 390 nm et lampe "UVA" émettant de 300 à plus de 400 nm). 86 Un spectre d'action pour les cassures simple-brins est présenté au § 5.6.2.2 qui suit 87 Malgré un certain recouvrement de fonctions, le NER (nucleotide excision repair) s'adresse particulièrement aux adduits encombrants (dimères); le BER (base excision repair) concernerait plutôt les adduits de taille faible (bases oxydées) (cf section 1.1.5)
320
Remarquons cependant que, pour les dégâts induits par les UVA, une réparation
incomplète 80 min après irradiation s'observe aussi bien à 4°C qu'à 37°C (Bock et al., 1998).
L'induc eurs du NER (aphidicoline
par
s cette
nous
incision
tion de cassures de chaînes a pu être exaltée par les inhibit
exemple), mais pas ceux du BER (méthoxyamine) ce qui indique que le premier
mécanisme pourrait jouer un rôle important dans la réparation des dégâts UVA (Bock et al.,
1998) alors que l'induction des dimères bipyrimidiques ne joue qu'un rôle mineur dan
bande de longueurs d'onde (Rünger et al., 2000).
Il apparaît donc que même des conditions de travail à basse température, telles que
les avons appliquées (< 4°C), sont susceptibles d'induire des cassures de chaînes par
enzymatique, au cours soit de l'irradiation, soit des manipulations subséquentes
(centrifugations, lavage des cellules, coulée du gel).
5.6.2 Dégâts oxydatifs, dimères de pyrimidine et irradiation lumineuse
Les essais avec les endonucléases spécifiques sont fort délicats, particulièrement au
niveau de l'étude menée. En effet, nous essayons de différencier les migrations d'ADN
correspondant à une triple fragmentation due à l'irradiation lumineuse, à l'effet
photodynamique et à l'action de l'enzyme; chacune de ces étapes étant entachée de sa propre
variabilité, la distinction non équivoque d'un effet dépend de son importance .
Grâce à ces endonucléases, nous avons cependant pu montrer que, sans induction de
porphyrines, l'irradiation par notre lampe UVA induit peu de sites sensibles à la FPG, quasi
pas de sites Endo III (Tableau 5.5-3, Figures 5.5-1 et 5.5-4), mais une quantité importante de
lésions bipyrimidiques (Figure 5.5-5). Par contre, l'irradiation en lumière visible induit des
bases oxydées (purines et
88
pyrimidines) mais pas de dimères bipyrimidiques.
Ces observations sont tout à fait cohérentes avec le spectre d'action établi par élution
alcaline (Kielbassa et al., 1997) pour l'induction de cassures de chaînes, de lésions dimères et
de purines oxydées (Figure 5.6-2). Ce spectre indique que les quantités de cassures simple-
brins, de sites FPG et de sites T4 diminuent en parallèle entre 290 et ~ 315 nm. Les sites T4
continuent à diminuer de manière exponentielle aux longueurs d'onde supérieures et restent
détectables jusqu'à environ 380 nm. Le nombre de modification sensibles à la FPG présente
un minimum vers 340 nm et monte vers un maximum entre 400 et 450 nm. Les cassures
simple-brins sont détectables à toutes les longueur d'onde et sont moins importantes que les
sites FPG dans la zone visible. 88 Par exemple, l'effet de la T4 endonucléase V est si flagrant que les sites T4 spécifiques sont détectés sans aucune ambiguïté.
321
Figure 5.6-2 : Induction de lésions à l'ADN en fonction de la longueur d'onde
Cellules d'ovaire de cobaye AS52. Données obtenues par élution alcaline avec utilisation d'un monochromateur et de filtres de bandes de longueur d'ondes
lésions reconnues par la T4 endonucléase V (dimères de pyrimidine) ○ cassures simple-brins (single-strand breaks)
● lésions reconnues par la FPG (purines oxydées)
(Kielbassa et al., 1997)
5.6.3 Essai comète et bronzage artificiel
L'essai comète couplé à la T4 endonucléase V et à l'Endo III a déjà démontré l'induction
de dégâts mutagènes par exposition à des lampes de bronzage et au soleil (fibroblastes
humains MRC-5 irradiés sur de la glace, directement dans la couche d'agarose des lames de
microscope) (Woollons et al., 1997). Une des lampes étudiées par ces auteurs est la Philips
"Cléo Performance" 1000 W-R, une des lampes les plus employées dans les salons de
bronzage . Dans ce modèle, les lésions prédominantes sont les dimères bipyrimidiques; les
cassures de chaîne et les sites Endo III représentent seulement 1.0 et 3.3 % de la
fragmentation révélée par excision des dimères.
Dans notre modèle (cellules P388D1 irradiées dans le milieu de culture), nous confirmons
la forte induction de dimères par l'irradiation avec une lampe similaire à celle employée par
Woollons et al; en effet, le spectre d'émission de notre lampe "Cléo Compact" est quasi
89
89 Un historique complet de l'évolution des techniques de bronzage artificiel est présenté par (Diffey, 1999); il y apparaît que les lampes de marque Cléo sont aujourd'hui les lampes les plus utilisées, remplaçant les lampes à très faible teneur en UVB (0.05 % UVB) introduites vers 1985 et tombées en désuétude.
322
identique à celui de la Philips "Cléo Performance", si ce n'est pour la teneur en UVB du
la "Compact") rvons une proportion plus
importante de sure
Remarquons que le soleil induit des profils de dommages comparables. Après 1 min
d'exposition (fibroblastes humains MRC-5 irradiés dans la couche d'agarose), les cassures
brutes et les pyrimidines oxydées représentent 8.5 et 2.6 % de la fragmentation due aux
dimères (Woollons et al., 1997). Sur une autre lignée (leucémie murine L1210, irradiation
dans le PBS, détection par la méthode d'élution alcaline), une exposition solaire de 4 min
induit un taux élevé de dimères ainsi que des sites sensibles à la FPG (15 % de la
fragmentation due aux dimères), mais quasi pas de sites Endo III (0.02 %) ni de cassures de
chaînes brutes (Pflaum et al., 1998).
5.6.4 Essai comète et effet photodynamique des porphyrines
rayonnement (les rapports UVB/UVA sont de 0.7 % pour la "Performance" et de 1.2 % pour
(Philips, 2000). Par rapport à cette étude, nous obse
cas s de chaînes90.
5.6.4.1 Essai comète et porphyrines exogènes
L'essai comète a déjà été employé pour estimer l'effet génotoxique de la thérapie
photodynamique à base de porphyrines exogènes (dérivé d'hématoporphyrine, HpD), et d'une
chlorine91, la meta-(tétrahydroxyphényl)-chlorine (m-TH
Un effet photodynamique intense a été observé pour le HpD immédiatement après
traitem K562), les cassures de chaînes étant
ent
un
lésion
PC).
ent (lignée de leucémie myéloïde humaine
ièrement réparées en 4 h. Sur le même modèle, aucun effet n'a pu être mis en évidence
pour la m-THPC (McNair et al., 1997). Par contre, sur des cellules de gliome murin C6,
traitement photodynamique avec la mTHPC induit une fragmentation intense de l'ADN,
réparée significativement après 4 h et complètement après 24 h (Rousset et al., 2000). Un
autre essai sur une lignée établie à partir d'un carcinome spino-cellulaire n'a mis aucune
en évidence avec la m-THPC, mais les auteurs n'ont étudié la fragmentation que 24 h après
irradiation, soit après la phase de réparation… (Yow et al., 2000).
90 L'étude avec la "Cléo Performance" (Woollons et al., 1997) minimise l'expression des incisions de réparation. L'irradiation sur les lames de microscope réduit sensiblement le temps entre les étapes d'irradiation et de lyse; la puissance des lampes employées (100 W/m²) permet également des irradiations très courtes (0.5 à 1 min). La couche d'agarose peut cependant absorber une certaine partie des rayonnements et décaler le spectre vers les longueurs d'onde supérieures (Rünger et al., 2000) 91 Les cycles chlorines sont des porphyrines portant une double-liaison saturée
323
5.6.4.2 Essai comète et porphyrines endogènes
D'autres auteurs ont également remarqué un effet de fragmentation de l'ADN après δ-ala
(i) en présence de lumière visible (lignée de leucémie murine L1210) par élution alcaline
(Pflaum et al., 1998); et (ii) tout récemment92, en présence d'UVA (lignée de lymphoblastes
humains), par essai comète en milieu faiblement alcalin (Rünger et al., 2000). Remarquons
que ce dernier auteur n'a tiré aucune conséquence de ses observations.
L'étude de Pflaum et al montre que la lumière blanche (1 à 6 J/cm²) n'exerce un effet
cytotoxique et génotoxique (induction de cassures de chaînes et de micronoyaux) qu'après
induction des porphyrines; l'effet photodynamique augmente les proportions de cassures de
chaînes brutes d'un facteur 15 et de sites sensibles à la FPG d'un facteur 4; l'induction de sites
FPG montre une courbe de saturation avec la dose de lumière. Alors que l'acide ascorbique
(piégeur de 1O2) inhibe sensiblement cet effet photodynamique, l'o-phénanthroline
(compl s) ne présentent
aucun effet quant à l'induction des cassures de chaînes et sites FPG (Pflaum et al., 1998).
L'étude de Rünger et al montre que les UVA93 (0.25 à 1 J/cm²) et non les UVB94 (3 à
10 es
ment dû à la fraction UVA-
vis us
exant du fer), l'α-tocophérol et le β-carotène (antioxydants lipidique
mJ/cm²) sont responsables des cassures de chaînes photoinduites par les porphyrin
endogènes (Rünger et al., 2000). Nos essais avec le filtre UV34 (Figure 5.5-6) démontrent que
l'effet photodynamique observé avec notre lampe est effective
ible. En dépit de la largeur des bandes de longueur d'onde utilisées par cet auteur, no
arrivons donc à des conclusions similaires.
5.7 CONCLUSIONS
5.7.1 L'essai comète
Dans leurs publications, les pionniers et les premiers utilisateurs de l'essai comète font
montre de nombreux éloges envers la méthode. Il s'agirait d'une technique sensible, fiable,
flexible, facile, exigeant peu de cellules par test, de coût peu élevé et, surtout, rapide (Tice et
al., 2000). Ces louanges ont apparemment convaincu de nombreux expérimentateurs car la
popularité de la technique ne fait que croître.
Après tous les essais décrits ci-avant, la "sensibilité" et la "fiabilité" de la méthode nous
semblent correctes. Les mesures sont reproductibles entre les électrophorèses et les
92 Note: cette publication est postérieure à notre présentation d'une partie des résultats de ce chapitre (Duez et al., 1999, 2000a) 93 320 à 440 nm avec 97% de l'énergie supérieure à 340 nm 94 275 à 365 nm, avec un maximum à 315 nm et un rapport UVB:UVA d'environ 2
324
opérateu t" et "non-effet". Il manque cependant
sin
t
test programmé, les
pos 95
probablement d'améliorer notre technique (travaux en cours).
La "rapidité" dépend de ce dont l'expérimentateur se contente. Quelques lames mesurées
visuellement ou à l'aide d'un système d'acquisition d'images et comparées par un test non-
paramétrique ne demandent effectivement pas trop de temps. Nous avons cependant montré
dans ce travail qu'une étude statistique considérant le traitement et non la comète comme unité
de base permet la mise en évidence non ambiguë d'un effet. Une telle étude exige cependant
de répéter soit une série d'essais, soit une série de doses et/ou de temps d'exposition, ce qui
allon 'expérimentation.
omète possède de nombreux atouts et son potentiel est important.
Rappelons cependant qu'il s'agit d'une technique relativement récente. L'enthousiasme des
débuts laisse à présent place à des recherches qui devront permettre (i) de déterminer la valeur
prédictive de l'essai comète pour le positionner clairement parmi les autres tests de
mutagénicité; et (ii) d'automatiser la mesure des comètes afin d'alléger la détermination
visuelle ou assistée par ordinateur, étape limitative de la méthode.
rs; il est possible de distinguer entre "effe
gulièrement de recul pour estimer le pouvoir prédictif de ce test quant à la génotoxicité.
Situation qui devrait être remédiée assez vite par l'augmentation du nombre de composés
testés et le développement de validations croisées avec d'autres tests de génotoxicité (Rojas e
al., 1999).
La "flexibilité" est un avantage certain. Cependant, en fonction du
sibilités de l'essai comète sont telles que le nombre de lames envisageables pour
circonscrire une expérience donnée peut devenir rédhibitoire…
La "facilité" est une notion relative. Il nous semble quant à nous que l'essai comète
requiert pas mal d'habileté manuelle dans un environnement fort peu éclairé… La mesure
assistée par ordinateur, seul dans l'obscurité pendant de nombreuses heures, exige doigté,
calme, patience et endurance. L'utilisation d'endonucléases de réparation apparaît
particulièrement délicate. Notre participation au projet européen ESCODD mentionné ci-
avant va nous permettre de comparer la méthode FPG avec d'autres laboratoires et
ge considérablement l
En conclusion, l'essai c
95 Les paramètres suivants peuvent notamment être envisagés : électrophorèse à 3 pH, variations sur les temps de dénaturation et d'électrophorèse, révélation par différents fluorophores, utilisation d'une série d'endonucléases pour révéler des lésions spécifiques, étude de doses de toxiques (et de lumière) avec différentes combinaisons de temps d'exposition, mesures de cinétiques de réparation, recherche d'effet cross-linker, etc…
325
5.7.2 Effet photodynamique des porphyrines endogènes
Les 2 études comètes menées dans notre travail permettent de démontrer un effet
photodynamique des porphyrines endogènes envers l'ADN, aussi bien en présence de lum
visible que d'UVA; le traitement photodynamique UVA induit également des purines
oxydées, co
ière
nfirmant l'induction de 8-oxodG mesurée par CLHP (Chapitre 4).
ponsable de l'effet bronzant
rec
x
thodes
s inconvénients non
nég
La fraction UVA-visible de la lampe que nous avons utilisée est responsable de l'effet
photodynamique observé, alors que la faible fraction UVB induit de fortes quantités de
dimères cyclobutanes; l'excision de ceux-ci est probablement res
herché avec ce type de lampes.
Les résultats de l'essai comète viennent renforcer nos conclusions précédentes quant au
conséquences possibles de cet effet photodynamique. Celles-ci sont largement discutées et
développées dans les section 4.4 et 4.5 de ce travail.
Rappelons qu'il n'y a pas à l'heure actuelle de corrélation entre les taux de 8-oxodG
mesurés par CLHP et par essai comète couplé à la FPG (Gedik et al., 1998). Les mé
sont en effet extrêmement différentes et présentent chacune de
ligeables (Tableau 5.7-1) qui rendent la comparaison difficile. La meilleure sensibilité des
méthodes LC-MS-MS et une tendance continue à réduire les oxydations artéfactuelles
devraient cependant permettre d'entrevoir une concordance entre les 2 méthodes au moins
quant à l'estimation des taux de base en 8-oxodG dans l'ADN nucléaire (ESCODD, 2001).
Tableau 5.7-1 : Problèmes associés à la détermination de la 8-oxodG par méthodes
chromatographiques et par es
sai comète
Méthodes chromatographiques (CLHP) Essai comète couplé à l'endonucléase FPG
Oxydation artéfactuelle possible en cours
digestion enzymatique Manque de sensibilité pour les taux de base
La spécificité de l'enzyme n'est pas absolue Problème de la calibration qui peut être :
• basée sur la mesure en gradient de sucrose du nombre de cassures induites par une irradiat
• basée sur la teneur en 8-oxodG déterminée par chromatographie (Pou
Problème des lésions groupées
de lyse cellulaire, d'extraction et de
ion γ (Gedik et al., 1998)
get et al., 1999) qui s'enregistrent comme
une seule cassure
326
6. Résultats et Discussion :
Essai "comète"et photoactivation des porphyrines endogènes -
Application à une lignée umainde mélanome h
327
6.1 INDUCTION DES PORPHYRINES ENDOGENES
Comme pour les cellules P388D1, les porphyrines endogènes ont été induites par
incubation des cellules de mélanome HBL avec l'acide δ-aminolévulinique; la synthèse
effective de porphyrines a été contrôlée par spectroscopie et microscopie de fluorescence.
6.1.1 Spectroscopie de fluorescence
6.1.1.1 Fluorescence intracellulaire
La présence de mélanine a empêché de relever les spectres de fluorescence sur le lysat
brut obtenu par sonication des cellules dans le PBS. Les spectres ont donc été relevés en
milieu HClO4 1 M : méthanol (1 : 1, v/v).
Le maximum d'excitation se situe à 408 nm et les maxima d'émission 604 et 664 nm
(Figure 6.1-1), ce qui est en accord avec les caractéristiques spectrales de la PPIX (Gomer et
al., 1985; Qu ous avons
également pu relever sur cellules P388D1 (§ 4.1.2).
Il y a donc bien production de PPIX, mais l luorescence induite dans les cellules de
mélan
6.1.1.2 Flu
intanilla-Vega et al., 1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997) que n
a f
ome est beaucoup plus faible que dans le cas des cellules P388D1.
orescence extracellulaire
fluorescence supérieure à celle du témoin n'a été détectée dans le milieu
it par relevé spectroscopique direct ou après extraction par le m
ol (1 : 1, v/v). Cette différence avec les observations su
une moindre production de porphyrines intracellulaires
Aucune de
culture, que ce so élange
HClO4 1 M : méthan r cellules P388D1
peut s'expliquer par mais aussi par une
densité cellulaire nettement inférieure.
328
Figure 6.1-1 : Spectroscopie de fluorescence intracellulaire (1 : 1, v/v)
650 mV; 5 nm/s
Spectres d'émission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm
Mesures dans le mélange HClO4 aqueux 1 M : méthanol
Spectre d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante émission, 4 nm
Spectres d'émission - HBLλ excitation = 406 nm
0 850
Si0.1
0.05gnal Blanc
d-ala 300 µM (3 h)Blanc
δ-ala 1 mM (3 h)
0550 600 650 700 750 80
λ (nm)
Spectres d'excitation - HBLλ émission = 604 nm
0300 350 400 450 500 550 600
λ (nm)
a
0.1
0.05
Sign
l
d-ala 300 µM (3 h)δ-ala 1 mM (3 h) BlancBlanc
329
6.1.2 Cinétique d'induction de la fluorescence intracellulaire
e de fluorescence, mesurée sur 5 heures d'incubation avec 1 mM de δ-alaLa cinétiqu ,
émontre une synthèse croissante de PPIX (Figure 6.1-2).
Figure 6.1-2
d
: HBL + δ-ala : Cinétique d'apparition de la fluorescence intracellulaire (PPIX). Mesures dans le mélange HClO aqueux 1 M : méthanol (1 : 1, v/v) 4
0
0.05
0.1
0.15
0 1 2 3 4 5
Temps d'incubation (h)
Sign
al /
mg
prot
éines
Les points représentent les résultats obtenus dans 2 expériences indépendantes; la courbe rejoint les moyennes des valeurs expérimentales. 650 mV; acquisition de 1 point/s pendant 20 s; λ excitation, 406 nm (bande passante, 4 nm); λ émission, 604 nm (bande passante, 8 nm).
6.1.3 Microscopie de fluorescence
La Figure 6.1-3 montre une image en microscopie de fluorescence de cellules HBL
incubées pendant 3 h avec 1 mM de δ-ala. La fluorescence apparaît répartie de manière
diffuse dans l'ensemble du cytosol; l'intensité faible de la fluorescence combinée à un
bleaching rapide ne permettent pas d'observation fine ni de distinguer le noyau cellulaire
comme c'était le cas pour les cellules P388D1 (cf Figure 4.1-8).
our cette lignée cellulaire, une observation microscopique n'a pas révélé de fluorescence
intense, détectable sans l'assistance d'une caméra, jusqu'à 24 h après mise en contact avec
l'acide δ-aminolévulinique.
P
330
Figure 6.1-3 : Image obtenue en microscopie de fluorescence. Cellules HBL incubées en
présence de δ-ala (1 mM, 3 h).
t, respectivement, 425 ± 20 nm, 460 nm et 590 nm (long pass); un filtre de densité neutre (Zeiss, 0.06) est
et a été combinée de manière informatique avec l'image acquise en lumière visible pour délimiter les contours
Objectif 25 X à immersion; les longueurs d'onde d'excitation, du miroir dichroïque et d'émission son
incorporé sur le trajet optique d'excitation. L'image de fluorescence a nécessité un temps de pose de 3 s
cellulaires. Les niveaux de gris proviennent de l'image visible, les niveaux de rouge de l'image de fluorescence.
331
6.1.4 Conclusion
L'incubation des cellules HBL avec l'acide δ-aminolévulinique induit l'apparition d'une
fluorescence intracellulaire croissant jusqu'au moins 5 h d'incubation; aucune excrétion d'une
espèce fluorescente n'a pu être détectée.
Les données spectrales, obtenues en milieu HClO4 : méthanol, sont en accord avec celles
publiées pour la protoporphyrine IX, suggérant que le traitement appliqué induit bien le
composé intracellulaire attendu. Les taux de ce composé apparaissent nettement inférieurs à
ceux produits par les cellules P388D1; les niveaux atteints, exprimés par mg de protéines,
sont inférieurs d'environ un facteur 10 et une incubation de durée plus longue (24 h) ne
permet pas d'atteindre des taux de porphyrines détectables visuellement.
6.2 CYTOTOXICITE DU TRAITEMENT PHOTODYNAMIQUE
Les courbes de survie ont été établies pour l'effet létal de différentes doses de δ-ala
combinées avec des rayons UVA (filtrés par le filtre Hoya UV34) et visibles, et ce dans les
conditions suivantes : 3 h de chargement en δ-ala et 30 min d'irradiation à 4°C (soit
560 mJ/cm² pour la lampe UVA et 21.4 J/cm² pour la lampe visible) (Figure 6.2-1). Compte
tenu de la dispersion expérimentale, il n'y a pas d'effet létal du traitement photodynamique
jusqu'au moins 3 mM en δ-ala, ce qui est matérialisé sur les graphiques par une droite
représentant 100 % de vie.
Pour les UVA, la répétition de cette expérience avec 1 h d'irradiation (1.12 J/cm²) a fourni
des résultats tout à fait similaires.
Nous pouvons donc conclure que la photoactivation des porphyrines endogènes, telle que
réalisée dans nos conditions expérimentales, n'est pas cytotoxique.
332
Figure 6.2-1 : Cytotoxicité de l'acide δ-aminolévulinique combiné avec des radiations UVA es
et visibl
100%
10
es
0%
50%
% c
llule
s vi
vant
e
0%
50%
10
% c
ellu
les
v
100%
ivan
tes
Cellules HBL incubéeslumière visible 30 min,(les points ● et ○ repré
Irradiation UVAIrradiation UVA (Filtre Hoya UV34)
100 1000 10000
Concentration en δ-ala (µM)
e
C
en présen soit 21.4sentent, r
Irradiation visiblIrradiation Visible
100 1000 10000
oncentration en δ-ala (µM)
ce de δ-ala (3 h) et irradiées (4°C; UVA 30 min, soit 560 mJ/cm²; J/cm²). Les points représentent 2 expériences en octoplicat espectivement, les expériences 1 et 2).
333
6.3 RESULTATS DE L'ESSAI COMETE
.3.1 Mise en évidence d'un effet génotoxique de référence6
Le procédé de décollage des cellules de mélanome des boîtes de culture a été validé et
n'induit pas de cassures de chaînes dans l'ADN (Section 2.3.6.2.2). Il a été vérifié que cette
méthode permet de mettre en évidence l'effet génotoxique bien connu de l'EMS
(éthylméthanesulfonate, cf § 5.3.2.2) (Figure 6.3-1).
Figure 6.3-1 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose
d'éthylméthanesulfonate (cellules HBL; temps de contact, 3 h; 100 comètes mesurées sur 2 lames; dénaturation et électrophorèse à pH > 13).
Contrôle EMS 2 mM (3 heures)
Tail
DN
A
0
20
40
60
80
100
Contrôle EMS 2 mM (3 heures)
Oliv
e Ta
il M
omen
t
0
5
10
15
20
6.3.2 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Analyse de tendance
En raison de la faible induction de porphyrines et de la filtration des rayonnements par la
mélanine, cette étude n'a été réalisée que pour les UVA; ceux-ci ont en effet montré sur
cellules P388D1 un effet beaucoup plus intense que la lumière visible, que ce soit en termes
de formation de 8-oxodG (Section 4) ou de fragmentation de l'ADN (Section 5). Pour essayer
d'augmenter la sensibilité de détection des cassures de chaînes induites par le traitement
photodynamique, la fraction UVB a été éliminée du rayonnement à l'aide du filtre Hoya
UV34.
Les réponses au traitement photodynamique UVA ont été mesurées en fonction de la dose
de lumière, en présence et en absence de δ-ala; les traitements réalisés sont décrits dans le
Tableau 6.3-1. Chaque traitement (100 comètes mesurées sur 2 lames) a été répliqué au cours
d'expériences indépendantes. Au fur et à mesure de leur préparation, les lames de microscope
sont dispo
chaque cu
sées aléatoirement dans les cuves contenant la solution de lyse et maintenues à 4°C;
ve est assignée à un run d'électrophorèse exécuté endéans les 2 jours.
334
Tableau 6.3-1 : Traitements réalisés dans le cadre de l'étude d'analyse de tendance (Cellules HBL)
Nom donné aux Traitement échantillons
contrôle aucun (ni δ-ala, ni irradiation )
δ-ala δ-ala 1 mM 3 h + 30 min à 4°C sans irradiation
UVA 5 irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 5 min
UVA 10 irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 10 min
UVA 30
δ-ala + UVA min
δ-ala + UVA 10 δ-ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 10 min
δ-ala + UVA 15 δ-ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 15 min
δ-ala + UVA 30 δ-ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 30 min
UVA 15 irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 15 min
irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 30 min
5 δ-ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4°C sous filtre Hoya UV34, 5
6.3.2.1 Résultats
La Figure 6.3-2 montre les box plots de l'ensemble des résultats; le Tableau 6.3-2 présente
les médianes et p75 des Olive tail moments mesurés pour tous les traitements.
6.3.2.2 Courbes dose-réponse
Les courbes de tendance "dose de lumière - réponse (statistique représentative de la
ur
les médianes et les percentiles 75 (Figure 6.3-3).
6.3
distribution des Olive tail moments)", en absence et en présence de δ-ala, ont été établies po
.2.3 Discussion
L'irradiation UVA a tendance à induire une fragmentation de l'ADN, mais il n'y a pas de
relation significative entre la dose de lumière et la migration de l'ADN. En effet, la filtration
de la fraction UVB, à la fois par la mélanine et par le filtre Hoya UV34, induit probablement
peu de dimères bipyrimidiques et donc peu d'excisions de réparation.
Après induction des porphyrines, l'irradiation UVA induit sensiblement plus de
fragmentation, ce qui se marque par l'apparition d'une relation significative (p < 0.05) entre la
dose de lumière et la médiane de l'Olive tail moment. Comme précédemment avec les cellules
P388D1 (§ 5.4.3.2), le percentile 75 marque une tendance nette à un accroissement avec la
dose de lumière mais cette tendance n'est pas significative au seuil 0.05.
335
Figure 6.3-2 : UVA filtrés (Résultats de deux expériences; Cellules HBL)
VA 10 min
UVA 15 min
min
U
UVA 30
la µM h
δ-a300
3 +
Olive tail Moment
Les résultats, présentés traitement par traitement en fonction de la dose de lumière (traitements décrits au Tableau 6.3-1), sont réalisés au cours de 2 expériences indépendantes 100 comètes mesurées sur 2 lames.
UVA 5 min
min
min
UVA 5 min
UVA 30
UVA 15
UVA 10 min
ala 1 mM
Contrôle
0 2 4 6 8 10 12 14
336
Tableau 6.3-2 : Médianes et percentiles 75 des distributions de comètes et leurs intervalles de confiance à 95 %; Olive tail moment; traitements réalisés en duplicata (expériences indépendantes); 100 comètes mesurées sur 2 lames. Cellules HBL (Traitements décrits dans le Tableau 6.3-1)
Médiane du Olive tail moment p75 du Olive tail moment Traitement
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2
contrôle 1.26 (1.13 - 1.55)
0.60 (0.46 - 0.76)
1.99 (1.71 - 2.44)
0.98 (0.85 - 1.29)
δ-ala 1.00 (0.78 - 1.17)
0.86 (0.72 - 1.03)
1.69 (1.49 - 2.34)
1.96 (1.28 - 2.32)
UVA 5 1.08 (0.78 - 1.28)
1.29 (1 - 1.66)
2.15 (1.56 - 2.61)
2.03 (1.85 - 2.83)
UVA 10 1.64 (1.27 - 1.93)
0.81 (0.53 - 1.13)
2.25 (2.09 - 2.47)
1.49 (1.27 - 1.75)
UVA 15 1.25 (1.07 - 1.56)
1.36 (1.12 - 1.73)
2.15 (1.79 - 2.39)
2.13 (1.88 - 2.39)
UVA 30 1.27 (1 - 1.54) ----
2.37 (2.06 - 2.76) ----
δ-ala + UVA 5 1.23 (0.8 - 1.57)
2.22 (1.96 - 2.52)
2.10 (1.96 - 2.46)
3.63 (2.98 - 4.07)
δ-ala + UVA 10 0.92 (0.83 - 1.24)
1.69 (1.29 - 2.01)
1.66 (1.48 - 2.24)
2.67 (2.4 - 3.16)
δ-ala + UVA 15 1.71 (1.23 - 2.09)
2.19 (1.88 - 2.48)
2.68 (2.31 - 3.03)
3.22 (2.65 - 3.49)
δ-ala + UVA 30 2.29 (1.88 - 2.53) ----
3.22 (2.64 - 3.83) ----
337
Figure 6.3-3 : Médianes et percentiles 75 de la distribution des Olive tail moments en fonction e la dose de lumière (Cellules HBL) n face de chaque droite sont indiqués le coefficient de détermination et la probaour l'existence d'une pente significative. Les traitements sont
dE bilité du test p rits dans le Tableau 6.3-1 (* > 0.05)
déc, p < 0.05; NS, p
• Médianes
0
1
2
10
Temps d'irradiat
Oliv
e ta
il m
omen
tUVAInductio phyrines + UVA
3
0
n de por
• Percentiles 75
0
1
2
3
4
0 10
Temps d'irradia
Oliv
e ta
il m
omen
t
UVAInduction de porphyrin
R² = 0.452 ( )
20
ion (min)
30
8 R² = 0.30(NS)
20
ti
es + UVA
R² = 0.285 (NS)
30
on (min)
R² = 0.391 (NS)
338
6.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS
s résultats présentés dans ce chapitre doivent être considérés comme Bien que le
préliminaires, la photoactivation de faibles quantités de porphyrines
endogènes induit bien un stress oxydatif au niveau de l'ADN. Nous avons également tenté de
mettre en évidence des lésions sensibles aux endonucléases FPG, endo III et T4; cependant,
une importante variabilité expérimentale ne nous a pas permis de conclure quant à l 'induction
de ces lésions. Cette étude mérite certainement d'être conduite plus avant (modification des
conditions d'induction des porphyrines et d'irradiation, réduction du temps entre irradiation et
lyse, modification des rapports eumélanine/phaeomélanine,…).
Quelques publications en rapport avec nos observations sont discutées dans les
paragraphes qui viennent.
6.4.1 Mélanocytes et cassures de chaînes UV-induites
nous avons montré que
Un dosage immunochimique, réalisé à l'aide d'un anticorps spécifique des lésions simple-
brin (ssb), a montré que, dans des mélanocytes humains, les UVA et les UVB96 induisent
respectivement97 0.07 et 1.9 ssb/1010 Da par kJ/m² (Wenczl et al., 1997).
En fonction du phénotype de peau, les UVA ont un effet plus ou moins important. Les
mêmes auteurs ont en effet montré que les mélanocytes provenant d'un individu de phototype
VI (peau très foncée) présentent une bien plus forte sensibilité aux UVA (1.18 ssb/1010 Da par
kJ/m²) que ceux provenant d'un individu de phototype I (0.04 ssb/1010 Da par kJ/m²) alors que
leurs teneurs en mélanine sont nettement plus élevées (10 fois plus de mélanine totale et 7 fois
plus de phaeomélanine). Les mélanocytes d'un individu de phototype I (peau très claire)98
voient leur sensibilité augmenter d'un facteur 3 après induction de la mélanine par incubation
avec de la L-tyrosine (Wenczl et al., 1998). D'après ces publications, il n'est cependant pas
clair si l'auteur a irradié des mélanines en formation (pendant l'activation de la mélanogenèse)
ou des mélanines préformées. L'effet observé pourrait donc être dû à l'irradiation
d'intermédiares indoliques et quinoniques.
96 Les débits de fluence appliqués sont 7 mW/cm² (UVA ) et 0.6 mW/cm² (UVB) 97 Le génome humain comprend ~ 3 x 109 paires de bases, ce qui correspond à ~ 1.9 x 1012 daltons (Sambrook et al., 1989) 98 Dans cette expérience, ces cellules apparaissent capables de fabriquer de l'eumélanine; il s'agirait donc plus vraisemblablement d'un individu de phototype II.
339
La sensibilité des mélanocytes humains aux UVA a été confirmée par essai comète; une
exp qui croît
hénomènes de réparation
pen n
oz et al., 1996; Wenczl et al., 1997; Wenczl et al., 1998; Marrot et
al., 1999), soit empaquetées dans de l'agarose (Marrot et al., 1999); les débits de fluence sont
souven ysiologiques"100 en des
tem
osition à une fluence de 7 J/cm² (15 min)99 induit une fragmentation appréciable
en fonction de la teneur en mélanine. Il semble que le risque de dégât à l'ADN augmente
lorsque la pigmentation commence à se développer, c'est-à-dire en début de bronzage (Marrot
et al., 1999).
L'essai comète a également été appliqué aux dommages induits par les UVB; une
irradiation de 5 à 20 mJ/cm² (débit de fluence, 0.5 mW/cm²) induit des cassures de chaînes
dose-dépendantes dans les mélanocytes (Noz et al., 1996).
Les protocoles appliqués par tous ces auteurs minimisent les p
dant et après l'exposition à la lumière. Les cellules sont irradiées sur glace, soit e
suspension dans le PBS (N
t extrêmement élevés, permettant d'administrer des doses "ph
ps très courts, par exemple 40 s pour 20 mJ/cm² d'UVB (Noz et al., 1996).
Il faut également remarquer que les phénomènes de réparation sont toujours présents,
même à basse température (Bock et al., 1998). De plus, l'extrapolation aux conditions
phy
6.4.2 Effet pro-oxydant des mélanines ?
siologiques des phénomènes observés à des débits de fluence élevés n'est pas forcément
valable, des différences majeures pouvant se marquer en fonction du débit de la dose de
lumière (Pflaum et al., 1998). Enfin, les mélanocytes en suspension sont dans des conditions
tout à fait particulières, pas vraiment représentatives de leurs conditions physiologiques.
Les mélanines, d'excellents filtres envers les longueurs d'onde solaires les plus
dangereuses, sont également des piégeurs de radicaux libres fort efficace (Rozanowska et al
1999). Il semble donc paradoxal que la présence de mélanine puisse jouer un rôle de
photosensibilisant (§ 6.4.1). Le statut redox du mélanocyte apparaît en fait fort com
pourrait en partie réguler la synthèse de mé
.,
plexe et
lanine, notamment la balance entre eu- et
phaeomélanine (del Marmol et al., 1996).
99 Pour comparaison, rappelons que la fluence appliquée dans notre étude est de 250 mJ/cm² (mesurée sur la lampe UVA non filtrée; débit de fluence total, 0.31 mW/cm² pendant 13.5 min) 100 Comparables à celles reçues lors d'une exposition solaire typique
340
L'effet photo-oxydant observé dans ces différentes études a été attribué soit aux
mélanines, soit aux intermédiaires de leur synthèse qui sont eux-mêmes de puissants pro-
oxydants :
• un stress oxydatif constitutif a pu être mis en évidence dans les mélanomes mais aussi
dans les mélanocytes de patients atteints de mélanome (Picardo et al., 1996).
t un
'eumélanine et transforme la
ôle
l'ADN (Kipp
• une étude in vitro sur liposomes a montré que les 2 types de mélanines exercen
effet antioxydant envers la peroxydation lipidique induite par les UVB et UVA;
cependant, la complexation du fer inhibe l'effet de l
phaeomélanine en un prooxydant (Krol et Liebler, 1998).
• la répartition des mélanines et de leur synthèse dans les mélanosomes joue un r
protecteur. Mais certains intermédiaires, comme par exemple l'acide 5,6-
dihydroxyindole-2-carboxylique, peuvent s'échapper de l'organelle et de la cellule; il a
notamment été démontré par essai comète que des kératinocytes irradiés en présence
de cet acide subissaient un stress photo-oxydant capable d'endommager
et Young, 1999).
6.4.3 Mélanome et porphyrines
Peu d'études ont porté sur l'induction de porphyrines et la thérapie photodynamique d
mélanomes; en effet, la mélanine, filtre de densité neutre, ne fait pas de ces tumeurs une cible
optimale de ce mode thérapeutique (Dougherty et al., 1998). Le développement de
es
photosensibilisants activables dans l'infrarouge devrait cependant lever cette limitation
ion des
tanés
eurs
rphyrines induit une inhibition de croissance
significative, mais pas de rémission complète (Abels et al., 1997).
Le contenu en porphyrines de cellules de mélanome B16, traitées in vitro par l'acide δ-
aminolévulinique en présence de diméthylsulfoxyde et d'allylisopropyl-acétamide, augmente
(Andreoni et al., 1991; Busetti et al., 1999).
Après injection intra-veineuse d'acide δ-aminolévulinique, la cinétique d'apparit
porphyrines a été déterminée chez des hamsters portant un mélanome amélanotique. Des taux
6 fois plus élevés de PPIX101 ont été mesurés dans la tumeur par rapport aux tissus cu
voisins. Cette différence s'expliquerait par une forte vascularisation de la tumeur, mais aussi
par la perméabilité de ses vaisseaux (Fritsch et al., 1997). Le phototraitement des tum
(635 nm; 100 J/cm²) après induction des po
101 La PPIX représente 83 % du total des porphyrines induites; la coproporphyrine et des porphyrines hautement carboxylées ont été également mises en évidence par CLHP.
341
d'u en l'effet
é de benzoporphyrine monoacide A, injecté en intraveineuse chez des souris
portant
rapport crose
tumora
absorp ré-
irradiat l.,
1999).
6.4.4 Conclusions
n facteur 2700. La photosensibilisation des cellules traitées est effective, résultant
létal d'une irradiation lumineuse (Schoenfeld et al., 1994).
Le dériv
un mélanome pigmenté B16, s'accumule dans la tumeur endéans les 3 h (mais avec un
tumeur/peau saine de seulement 1.6); sa photoactivation à 690 nm induit la né
le avec un délai de reprise de croissance. Cet effet important, observé malgré la forte
tion de cette bande de longueur d'ondes par la mélanine, est potentialisé par une p
ion à 1064 nm qui entraîne la destruction sélective des mélanosomes (Busetti et a
L'e
reste co
incerta
possibl de capture de radicaux libres par les polymères soient saturées.
Par contre, l'effet que nous observons avec de faibles taux de porphyrines induites et des
us une lampe de bronzage typique, à une distance et
un
4.4.2.
ouvons en effet conclure que les cellules de
mélanome, et donc probablement les mélanocytes, sont capables de synthétiser la PPIX in
vivo. Il apparaît également que la photoactivation d'un dérivé porphyrique, même par des
longueurs d'onde fortement absorbées par la mélanine, peut résulter en un effet
tait
tti et
l'induction des mélanomes.
ffet pro-oxydant éventuel des mélanines, plus particulièrement de la phaeomélanine,
ntroversé et son impact éventuel dans l'induction de mélanome est largement
in. Comme cet effet est démontré à des débits de fluence importants, il nous semble
e que les capacités
débits de fluence communs (exposition so
temps d'exposition naturels) semble plus proche des conditions physiologiques. En
fonction de la localisation intracellulaire de la PPIX, les radicaux libres induits par la lumière
qui a pu passer le filtre mélanique pourraient ne pas être piégés par la mélanine des
mélanosomes et exercer un effet génotoxique suivant un des mécanismes discutés au §
Des études présentées au § 6.4.2, nous p
photodynamique appréciable.
Si notre hypothèse basée sur la photoactivation des porphyrines endogènes (§ 4.4.3.1) é
correcte, la potentialisation de cet effet par les radiations infrarouges thermoactives (Buse
al., 1999) pourrait s'avérer fondamentale dans la problématique de
342
7. Conclusions générales
343
7.1 PROPOS DU TRAVAIL
Ce travail aborde la problématique des dommages photo-oxydatifs à l'ADN par la mesure
d'un biomarqueur sensible, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxodG), et par
l'estimation des cassures simple-brin, double-brins et sites alcali-labiles.
L'étude de la photo-oxydation de l'ADN après induction des porphyrines endogènes
permet de proposer un mécanisme possible d'initiation de la cancérogenèse par les fractions
UVA et visible de la lumière solaire.
7.2 VALIDATION DES METHODES ANALYTIQUES
7.2.1 La méthode de dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine
Les performances de la méthode chromatographique de dosage de la 8-oxodG (CLHP
avec détection ampérométrique et UV) ont été étudiées à travers une validation analytique
complète qui nous a permis de répondre à certaines questions récurrentes dans la littérature.
Il s'agit, à notre connaissance, de la première validation formelle publiée pour un
biomarqueur du stress oxydatif.
Les critères ogique ont
été validés, à sa ibilité, les
limites de détection et de quantification, la robustesse et la conservation des échantillons à
différents points de la procédure. Après une étude statistique de l'ensemble de ces critères,
nous sommes arrivé aux conclusions suivantes :
• la méthode de dosage de la 8-oxodG, bien qu'extrêmement délicate
de qualité aujourd'hui préconisés pour les dosages en milieu biol
voir la spécificité, la linéarité, l'exactitude, la répétabilité, la sens
, fournit des
données cohérentes qui permettent de détecter de manière fiable une augmentation
de ce biomarqueur dans l'ADN cellulaire;
• la digestion enzymatique de l'ADN telle qu'appliquée au cours du dosage n'est pas
entravée par les modifications induites par un stress oxydatif sévère;
• l'expression des taux de 8-oxodG relativement à la base normale, la 2'-
désoxyguanosine, influence positivement la répétabilité et la sensibilité du dosage;
• la génération artefactuelle de l'analyte en cours de manipulation peut être
contrôlée.
7.2.2 L'essai comète
Nous avons également évalué les performances de la méthode choisie pour la mesure de la
fragmentation de l'ADN, une technique de micro-électrophorèse appliquée à des cellules
344
individuelles. Les critères de qualité, adaptés à la nature semi-quantitative de l'essai comète en
rer que :
t
guère satisfaisantes, nous avons proposé et testé une
appr nent en effet rarement
compte de la distribution des données, qui n'est manifestement pas gaussienne, et considèrent
milieu alcalin, nous permettent d'assu
• les mesures sont fiables et reproductibles entre électrophorèses et opérateurs;
• la technique, telle qu'adaptée au laboratoire, nous permet bien de mettre en
évidence des effets génotoxiques connus.
Après avoir montré que les méthodes statistiques habituellement appliquées au traitemen
des données de l'essai comète ne sont
oche statistique simple et pratique. Les traitements classiques tien
le plus souvent la cellule et non le traitement comme unité de comparaison. Différentes
exp
re
7.3
ériences nous ont montré que les traitements peuvent être comparés de manière valable
via la médiane des distributions de comètes; cette statistique représentative permet de mett
en évidence un effet génotoxique, aussi bien par comparaison d'échantillons répliqués que
par une analyse de tendance.
EFFET PHOTODYNAMIQUE DES PORPHYRINES ENDOGENES
Après induction de la synthèse des porphyrines endogènes par l'acide δ-aminolévuliniqu
(δ-ala) dans 2 modèles cellulaires, la synthèse effective de protoporphyrine IX a été mise en
évidence par spectroscopie de fluorescence.
Nous avons montré pour la première fois que
e
la photo-activation par les UVA (lampe
typique de c es
δ-ala-induit
En effet ation lumineuse des porphyrines
induites gén
différents p is, à savoir la
concentratio es
porphyrines
intracellula e la
concentrati , mais de la dose de lumière.
A la fois sur les cellules P388D1 et sur des cellules de mélanome humain HBL, la photo-
induites provoque une fragmentation significative de l'ADN, reflet
des
elles employées dans les salons de bronzage) et la lumière visible des porphyrin
es présente des effets pro-oxydants au niveau de l'ADN cellulaire.
, sur une leucémie murine P388D1, l'irradi
ère une augmentation significative de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire; les
aramètres impliqués dans cet effet photodynamique ont été approfond
n et le temps de chargement en δ-ala, la dose de lumière et l'influence d
intracellulaires et excrétées dans le milieu de culture. Seules les porphyrines
ires participent à l'effet photodynamique observé; celui-ci ne dépend pas d
on en δ-ala
oxydation des porphyrines
cassures de chaînes et des sites alcali-labiles produits, soit directement, soit par les
345
mécanismes de réparation cellulaire. Une production de purines oxydées et de dimères
bipyrimidiques est également observée pour le traitement photodynamique UV au niveau des
cellules P38
utilisée.
Les hyp utées; ceux-ci pourraient être directs
(photogénération de radicaux libres à proximité de l'ADN) ou transmis au matériel génétique
par
7.4 CONCLUSIONS
8D1; les dimères sont principalement dus à la faible fraction UVB de la lampe
othèses quant aux effets observés sont disc
une réaction en chaîne de type peroxydation lipidique.
Il est aujourd'hui admis que les UVA exerceraient leur effet mutagène principalement par
l'entremise de radicaux libres, ce qui suppose la présence de photosensibilisants endogèn
qui ne sont toujours pas identifiés avec certitude.
Les résultats obtenus au cours de ce travail indiquent une implication possible des
porphyrines endogènes dans la carcinogénicité solaire, mais aussi dans des effets secondair
éventuels des applications méd
es
es
icales de thérapie et de diagnostic photodynamique.
Cet effet photo-oxydant est également mis en évidence dans des cellules de mélanome
En
bservé. La potentialisation possible de cet effet
par
humain pour de faibles taux de porphyrines induites et une lampe de bronzage typique.
fonction de la localisation intracellulaire de la PPIX, les radicaux libres induits par la
lumière qui a pu passer le filtre mélanique pourraient ne pas être piégés par la mélanine des
mélanosomes et exercer l'effet génotoxique o
les radiations infrarouges pourrait s'avérer fondamentale dans la problématique de
l'induction des mélanomes.
346
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