these de doctorat - univ-oran1.dzque psychologique. je remercie tous les autres membres de cette...

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

THESE DE DOCTORAT

Spécialité : Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire

Présentée par

Mr KAMEL-EDDINE EL MECHERFI

Évaluation de l’immunoréactivité et de l’allergénicité des lactoprotéines

bovines après hydrolyse enzymatique combinée à un traitement micro-ondes.

Intérêt des biopuces à allergènes dans la multi-détection des réponses IgE

spécifiques chez des enfants poly sensibilisés aux protéines du lait de vache.

Devant le jury :

Mr. Omar KHEROUA, Professeur, Université d’Oran ....................................................... Président

Mr. Thomas HAERTLE, Professeur, INRA, Nantes ........................................................... Examinateur

Mr. Mohammed BENALI, Professeur, Université Djilali Liabes Sidi-Bel Abbes ............ Examinateur

Mme. Ghazalia BOUDRAA, Professeur, Clinique A. Cabral, CHU d’Oran ....................... Examinateur

Mr. Ali RIAZI, Professeur, Université de Mostaganem ..................................................... Examinateur

Mr. Djamel SAIDI, Professeur, Université d’Oran .................................................... Directeur de thèse

Ce travail a été réalisé

Au laboratoire de Physiologie de La Nutrition et de SécuritéAlimentaire, Université d’Oran

Sous la direction du Professeur Djamel SAIDI

Et dans l’unité

Biopolymères, Interactions et Assemblages de l’INRA de Nantes

Sous la codirection du Professeur Thomas Haertle.

Ce travail a bénéficié de l’appui

D’un projet scientifique du MESRS (CNEPRU),Et d’un projet de coopération Algéro-Français PHC-TASSILI.

Je dédie ce travail à la mémoire de mon défunt père qui s’est tant sacrifié pour nousA ma mère, pour sa patience et son soutien sans failleA mes frères, ma sœur de l’autre bout du mondeA toute ma famille sans exceptionA mes beaux- parents pour leurs soutiens et encouragements

REMERCIEMENTS

A Monsieur le Professeur Omar KHEROUA,

Mes premiers remerciements vont au Professeur Omar KHEROUA, Directeur dulaboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire, pour son accueil au seinde son laboratoire, mais aussi pour l’intérêt qu’il a porté à mes travaux et les remarquesconstructives qu’il a pu me faire. Je vous prie de croire en mon éternel respect et ma sincèregratitude.

A Monsieur le Professeur Djamel SAIDI,

Je voudrais vous remercier très chaleureusement pour m’avoir si bien encadré, votreaide dans mon apprentissage de toutes ces techniques, votre intérêt pour mes travaux, lacorrection de ce manuscrit et de mes différentes publications, votre disponibilité,gentillesse, votre patience, … En bref, un grand, un énorme, un immense merci !!!

A Monsieur le Professeur Thomas HAERTLE,

Je tiens à vous adresser mes plus vifs remerciements et ma profonde reconnaissance.Vous m’avez donnée la chance de travailler au sein de votre laboratoire en m’accordant desmoments précieux pour l’enrichir de vos compétences scientifiques tout au long de lapréparation de cette thèse. Que ce travail soit le témoignage de ma sincère gratitude et demon estime pour la confiance et la disponibilité que vous m’avez accordées.

A Madame le Professeur Ghazalia BOUDRAA,

Vous me faites le grand plaisir et je suis très honorer que vous soyez examinateur dece travail pour qu’il soit confronté à votre expertise de pédiatre. Je vous en remercie trèschaleureusement.

A Monsieur le Professeur Mohammed BENALI,

Vos compétences scientifiques dans le domaine de l’immunologie seront une valeurinestimable pour enrichir ce travail. Je suis très honoré que vous ayez accepté d’en êtrel’examinateur et je vous en remercie très chaleureusement.

A Monsieur le Professeur Ali RIAZI,

Je suis très sensible à l’honneur que vous me faite et d’avoir bien voulu juger cetravail, veuillez trouver ici mes sincères remerciements et l’expression de toute mareconnaissance.

A Monsieur le Professeur Mahmoud TOUHAMI,

Je tiens à vous remercier particulièrement pour votre accueil chaleureux au sein de votreétablissement et d’avoir initié cette précieuse collaboration franco-algérienne qui m’apermis de constituer la sérothèque et de réaliser une partie décisive de ce travail. Veuilleztrouver ici l’expression de toute ma reconnaissance.

Durant ces années de thèse, le soutien et la patience sans borne de mon épouseYasmine et son rôle pour me motiver dans les moments difficiles a contribué à me faireavancer. La naissance de notre fils Yanis, le plus beau cadeau et la plus belle preuve d’amourque je n’ai jamais reçu, a embelli ma vie et m’a donné chaque jour de nouvelles ressources.

Je remercie également tous les acteurs du programme de coopération franco-algérien PHC-TASSILI, cliniciens et scientifiques, en particulier, Mlle HACHELAF Wahiba, PrBOUZIANE-Nedjadi de la Clinique de pédiatrie « C » Amilcar Cabral pour leur engagementdans l’évolution de ce travail.

Mes remerciements s’adressent également à toute l’équipe fonctions et interactionsdes protéines du laboratoire Biopolymères, Interactions et Assemblages de l’INRA deNantes, tout particulièrement au Professeur Jean-Marc CHOBERT pour son accueil au sein deson équipe, pour l’intérêt qu’il a porté à ce travail, pour ses remarques et sesencouragements. Mes vifs remerciements vont aussi à Yvan CHOISET, Hanitra Rabesona,Isabelle SERVENTON, l’ex FIP Michèle DALGALARRONDO, pour toutes les discussionsscientifiques, leur aide, leur amitié qui a facilité la réalisation de ce travail.

Je tiens à remercier les autres membres du laboratoire de physiologie de la nutritionet de sécurité alimentaire, et en premier lieu Hanane Belarbi, merci pour ta patience, pourm’avoir lancée sur le chemin de la chambre de Ussing, pour tous les coups de mains (ycompris de dernière minute). J’ai apprécié nos discussions scientifiques et celles un peumoins scientifiques qui m’ont permis de mener à bien cette thèse tant au niveau pratiqueque psychologique. Je remercie tous les autres membres de cette équipe : Melle KADDOURIHanane pour ces coups de main efficaces et ses discussions scientifiques interminables, Mme

MEHEDI Nabila, Mr CHEKROUN Abdellah, MEZMAZE Fatseh, A Notre nouveau collaborateurMr HAMMOU Habib ; merci pour la science évidemment, mais aussi pour l’ambiancechaleureuse qui règne dans cette équipe.

RésuméLes allergies représentent un véritable problème de santé publique, aussi bien pour les gênes, perturbations

et risques de pathologies graves qu’elles entraînent dans la vie des patients, que par les coûts de santé qu’ellesengendrent. Le traitement de cette affection repose sur un régime d’éviction des protéines du lait de vache etl’administration de préparations adaptées et représentées par des hydrolysats de protéines lactées ou autres(riz, collagène). Cependant, aucun de ces hydrolysats n’évite la présence de protéines intactes et une activitérésiduelle persiste toujours. À l’aide de sérums de nourrissons ayant une APLV, il est possible de détecter laprésence résiduelle de -lactoglobuline dans les différents laits hypoallergéniques et extensivementhydrolysés. D’une part, la démarche diagnostique de l’allergie aux protéines du lait de vache chez le nourrissonest assurée souvent par la disparition des signes sous éviction du lait et sa substitution ; le test de provocationpar voie orale reste l’étalon d’or pour suivre une procédure logique afin de ne pas laisser inutilement un enfantsous un régime sans lait. D’autre part, Le diagnostic est en pleine évolution, non seulement au niveautechnique, avec l’intégration de technologies innovantes issues de la génomique et de la protéomique et ladécouverte de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques de maladies, mais aussi au niveau économique,avec le développement du diagnostic préventif.

Le but de ce travail est d’évaluer l’impact d’un traitement technologique par les micro-ondes combiné à unehydrolyse enzymatique, des deux protéines majeures du lactosérum bovin, sur leur allergénicité chez la souriscomme modèle animal d’allergie et par l’exploration de leur immunoréactivité contre les IgE humainesd’enfants allergiques aux PLV. L’autre objectif de ce travail est de mettre au point un outil diagnostiqueminiaturisé les « biopuces à allergènes » pour aider le diagnostic de l’APLV et son suivi.

La première partie de ce travail expose les différents effets des micro-ondes sur l’hydrolyse enzymatiquetrypsique et chymotrypsique des deux allergènes majeurs du lait à savoir la BLG et l’ALA , leurimmunoréactivité contre les IgG anti BLG et anti ALA, ainsi que l’existence d’une éventuelle anaphylaxie localeaprès stimulation des fragments intestinaux de la souris BALB/c montés en chambre de Ussing avec lesdifférents hydrolysats produits sous micro ondes. Il a été constaté que les micro-ondes peuvent accélérer lesréactions enzymatiques des deux protéines de lactosérum bovin en obtenant des taux d’hydrolyse desprotéines plus élevés rapport à ceux obtenus sous chauffage conventionnel. La BLG généralement résistante àl’hydrolyse pepsique a été hydrolysé au bout de 3 minutes à 200W avec 42% de BLG hydrolysée, alors qu’ellereste très résistante à cette même hydrolyse dans les conditions conventionnelles. Les mêmes résultats ont étéobtenus lorsque les protéines pures étaient présentes dans le lactosérum bovin. Les résultats del’immunoréactivité des hydrolysats évaluée par ELISA compétitif ont montrés que les hydrolysats obtenus sousmicro-ondes présentaient une très faible reconnaissance par les IgG comparés à ceux de l’hydrolyseconventionnelle. En chambre de Ussing, la stimulation avec les hydrolysats de BLG ne produisait pasd’augmentation du courant de court circuit (Isc) comparée à aux hydrolysats obtenus dans les conditionsconventionnelles. Par contre, les hydrolysats d’ALA obtenus sous micro-ondes ou dans les conditionsconventionnelles stimulaient significativement l’Isc qui traduit une présence d’anaphylaxie locale.

L’étude de l’immunoréactivité des hydrolysats du lactosérum contre les IgE humaines a montré que leshydrolysats pepsiques ne sont pas reconnus par les IgE anti BLG et anti ALA et le taux d’inhibition etcomparable à celui de l’hydrolysat commercial Peptijunior®. Cette étude de l’immunoréactivité a été menéesuite à la caractérisation des sérums de nouveaux nés allergiques par la technique des biopuces à allergènes,les résultats obtenus sont comparables à ceux obtenus par test ELISA fluorimétrique classique avec plusd’informations sur le profil de sensibilisation.

Les observations et les résultats obtenus sur l’hydrolyse enzymatiques menée sous micro-ondes semblenttrès encourageants et intéressantes rendant compte sur la possibilité des micro-ondes comme traitementphysique à déstabiliser les protéines les plus résistantes à la digestion enzymatique et sa capacité à facilitél’accès des enzymes aux régions les plus enfouis des protéines globulaires. D’autre part, la mise au point de latechnique des biopuces apparaît être un outil pertinent pour l’étude de la fonctionnalité biologique del’interaction allergène-IgE, permettant une meilleure compréhension de la relation entre la structure d’uneprotéine alimentaire et son allergénicité, voire une évaluation du risque allergique des aliments ne nécessitantpas d’essais cliniques systématiques.

Mots clés : Allergie, Micro-ondes, hydrolyse enzymatique, épitope, biopuces à allergènes, chambre de Ussing, lactoglobuline, -lactalbumine, IgE.

SUMMARY

Allergies are a real public health problem for genes, disruption and risk of serious diseases they causein the lives of patients by health care costs they generate. The treatment of this condition is based on anelimination diet of cow's milk protein and administration of appropriate preparations and represented by milkprotein hydrolysates or not (rice, collagen). However, none of these hydrolysates avoids the presence of intactproteins and residual activity persists. Using sera from infants with CMPA, it is possible to detect the residual -lactoglobulin in the various milks and extensivelypresence of hydrolyzed hypoallergenic. In addition, thediagnostic approach of allergy to cow's milk proteins in infants is often provided by the disappearance of signsin eviction of milk and its replacement, the oral challenge remains the gold standard for follow a logical ordernot to unnecessarily give a child a diet without milk. On the other hand, the diagnosis is changing, not only atthe technical level, with the integration of innovative technologies of genomics and proteomics and thediscovery of diagnostic and prognostic biomarkers of disease but also economically, with the development ofpreventive diagnosis.

The purpose of this study was to evaluate the impact of a treatment technology for micro-wavecombined with enzymatic hydrolysis of the two major proteins of bovine whey, their allergenicity in mice as ananimal model of allergy and the exploration of their immunoreactivity against human IgE from allergic childrenPLV. The other objective of this work is also to develop a miniaturized diagnostic tool the "allergen biochips" toassist the diagnosis of CMPA and followed.

The first part of this work describes the different effects of microwaves on the tryptic andchymotryptic enzymatic hydrolysis of the two major milk allergen BLG and ALA on their immunoreactivityagainst IgG anti-BLG and anti-ALA, and the existence of a possible local intestinal anaphylaxis after stimulationof intestinal fragments of BALB / c mice mounted in Ussing chamber with different hydrolysis products in undermicrowaves. It was found that the microwaves accelerate enzymatic reactions of the two bovine whey proteinsby obtaining protein hydrolysis rates higher than those obtained under conventional heating. The BLG generallyresistant to pepsin hydrolysis was hydrolyzed after 3 minutes at 200W with 42%, while it is still very resistant tohydrolysis in the same conventional conditions. The same results were obtained when the pure proteins werepresent in bovine whey. The results of the immunoreactivity hydrolyzates evaluated by competitive ELISAshowed that the hydrolysates obtained under microwaves showed a very low recognition by IgG comparedwith those of conventional hydrolysis. Stimulation with hydrolyzates produced under microwaves doesn’tincrease the short circuit current (Isc) measured in Ussing chamber, compared to the hydrolysates obtained inthe conventional conditions. On the other hand ALA hydrolyzates obtained under the microwaves or inconventional heating, significantly stimulated the Isc indicating a presence of local intestinal anaphylaxis.

The study of the immunoreactivity of whey hydrolysates against the human IgE showed that peptichydrolyzates are not recognized by the anti BLG-IgE and anti-ALA and the inhibition rate is comparable to thatof the commercial hydrolyzate Peptijunior ®. This study of the immunoreactivity was carried out following thecharacterization of sera from allergic newborns by the technique of allergen microarrays, the results arecomparable to those obtained by conventional fluorescence ELISA with more information on the profile ofsensitization.

The observations and results of enzymatic hydrolysis carried out under microwaves seems veryencouraging and interesting reporting on the possibility of microwaves as physical treatment to destabilize theprotein which is more resistant to enzymatic digestion and ability to easily access enzymes to the most hiddenlinear epitope in globular proteins. On the other hand, the development of microarray technology appears tobe a useful tool for studying the biological functionality of the allergen-IgE interaction, allowing a betterunderstanding of the relationship between the structure of a food protein and allergenicity, if a risk assessmentof food allergy does not require systematic clinical trials.

Mots clés: Allergy, microwaves, enzymatic hydrolysis, epitope, microarray chips, Ussing chamber, lactoglobulin, -lactalbumie, IgE.

LISTE DES FIGURES

1. Influence des facteurs environnementaux sur la communication du tractus gastro-intestinal.......................................................................................................................................7

2. La barrière intestinale .............................................................................................................. 7

3. La perméabilité intestinale dépend de deux voies principales, la voie paracellulaire entreles cellules épithéliales et la voie transcellulaire ......................................................................... 9

4. Les exosomes sont des vésicules présentatrices d’antigènes portant à leur surface descomplexes majeurs d’incompatibilité II/peptides ....................................................................... 11

5. Système immunitaire associé au tube digestif (MALT)............................................................ 11

6. Les immunoglobulines de type IgE, IgG et surtout IgA sont présentes dans la lumièreintestinale.....................................................................................................................................13

7. Rôle des mastocytes dans la réaction allergique inflammatoire ............................................. 15

8. Structure moléculaire d’un monomère de β-lactoglobuline. .................................................. 20

9a. Localisation des séquences allergéniques sur la structure primaire du variant B de la β-lactoglobuline bovine. ..................................................................................................................22

9b. Localisation de deux épitopes monovalents dans le dimère de BLG .................................... 22

10. Position des peptides les plus fréquemment reconnues par les IgE humaines .................... 25

11. Effets des traitements thermiques sur l’allergénicité des PLV .............................................. 27

13. Evolution des publications scientifiques sur l’utilisation des micro-ondes associée auxréactions organiques....................................................................................................................35

14. Méthodes d’analyse à haut débit dans la génomique, post génomique (transcriptôme) etprotéomique et applications potentielles.................................................................................... 47

15. Technologie des puces à antigènes et à anticorps................................................................. 48

16. Dispositif expérimental des micro-ondes avec source monochromatique ........................... 52

17. Protocole d’immunisation des lapins..................................................................................... 57

18. Schéma d’une lame de nitrocellulose à 16 Pad. .................................................................... 72

19. Principe de fonctionnement d’un robot de dépôt piézoélectrique....................................... 72

20. Schéma de print des différentes protéines natives du lait .................................................... 73

21. Gradients de températures mesurés pendant les traitements micro-ondes à l’aide desfibres optiques Néottie. ..............................................................................................................7922. SDS-PAGE (12%) des hydrolysats de BLG bovine obtenus après 5 minutes d’hydrolysesous traitement micro ondes à 50 WATTS et dans sous chauffage conventionnel..................... 8123. % d'hydrolyse de la BLG sous micro-ondes (50 Watts) et durant le traitement thermiqueconventionnel...............................................................................................................................8224. Chromatographie en phase inverse (RP-HPLC) des hydrolysats de BLG obtenus sous

micro- onde à 50 Watts après 5 minutes d’hydrolyse ................................................................. 8325. SDS-PAGE (12%) des hydrolysats de BLG bovine obtenus après 3 minutes d’hydrolysesous traitement micro ondes à 100 Watts et sous chauffage conventionnel ............................ 84

26. % d'hydrolyse de la BLG sous micro-ondes (100 Watts) et durant le traitement thermiqueconventionnel...............................................................................................................................8427. Chromatographie en phase inverse (RP-HPLC) des hydrolysats de BLG obtenus sousmicro- onde à 100 Watts après 3 minutes d’hydrolyse. .............................................................. 8528. SDS-PAGE (12%) des hydrolysats de BLG bovine obtenus après 3 minutes d’hydrolysesous traitement micro-ondes à 200 Watts et sous chauffage conventionnel............................. 8629. % d'hydrolyse de la BLG sous micro-ondes (200 Watts) et durant le traitement thermiqueconventionnel...............................................................................................................................8730. RP-HPLC des hydrolysats de BLG obtenus sous micro-ondes après 3 minutes d’hydrolyseà 200 Watts. ................................................................................................................................. 8831. SDS-PAGE (12%) des hydrolysats d’ALA bovine obtenus après 5 minutes d’hydrolyse soustraitement micro-ondes à 50W et dans sous chauffage conventionnel...................................... 8932. RP-HPLC des hydrolysats d’ALA obtenus sous micro-ondes à 50 Watts après 5 minutesd’hydrolyse. ..................................................................................................................................9033. SDS-PAGE (12%) des hydrolysats d’ALA bovine obtenus après 3 minutes d’hydrolyse soustraitement micro-ondes à 100 Watts et dans sous chauffage conventionnel ............................ 9134. RP-HPLC des hydrolysats d’ALA obtenus sous micro-ondes à 100 Watts après 3 minutesd’hydrolyse. ..................................................................................................................................9135. SDS-PAGE (12%) des hydrolysats d’ALA bovine obtenus après 3 minutes d’hydrolyse soustraitement micro-ondes à 200 Watts et dans sous chauffage conventionnel ............................ 9236. RP-HPLC des hydrolysats d’ALA obtenus sous micro-ondes à 200 Watts après 3 minutesd’hydrolyse. ..................................................................................................................................9337. SDS-PAGE 12% des hydrolysats de lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes à 50Watts après 5 min d’hydrolyse et au chauffage classique........................................................... 9438. RP-HPLC des hydrolysats du lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes après 5minutes d’hydrolyse à 50 Watts. ................................................................................................. 95

39. SDS-PAGE 12% des hydrolysats de lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro ondes à100 Watts après 3 min d’hydrolyse et au chauffage classique.................................................... 9640. RP-HPLC des hydrolysats du lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes après 3minutes d’hydrolyse à 100 Watts. ............................................................................................... 97

41. SDS-PAGE 12% des hydrolysats de lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro ondes à200 Watts après 3 min d’hydrolyse et au chauffage classique.................................................... 98

42. RP-HPLC des hydrolysats du lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes après 3minutes d’hydrolyse à 200 Watts. ............................................................................................... 99

46. SDS-PAGE 12% des hydrolysats pepsique de BLG obtenus sous micro onde après 5minutes d’hydrolyse à 50 Watts, et 3 minutes d’hydrolyse à 100 et 200 Watts......................... 10047. RP-HPLC des hydrolysats pepsique de la BLG obtenus sous micro-ondes à 50 Watts (5mind’hydrolyse) 100 et 200 Watts (3min d’hydrolyse)..................................................................... 10148. % de BLG résiduelle et hydrolysée après une hydrolyse pepsique combinée à untraitement thermique par les micro-ondes à 50 Watts pendant 5 minutes, 100 et 200 Wattsdurant 3 minutes. .........................................................................................................................10249. SDS-PAGE 12% des hydrolysats pepsiques de l’ALA bovine sous micro onde après 5

minutes d’hydrolyse à 50 Watts, et pendant 3 minutes d’hydrolyse à 100 et 200 Watts. ......... 103

50. RP-HPLC des hydrolysats pepsiques de l’ALA bovine obtenus sous micro-ondes à 50Watts (5 min d’hydrolyse) et à 100 et 200 Watts (3min d’hydrolyse)......................................... 10351. SDS-PAGE 12% des hydrolysats pepsiques de lactosérum bovin obtenus sous micro-ondes à 50 Watts, 100 et 200 Watts........................................................................................... 10452. % de BLG résiduelle et hydrolysée après hydrolyse pepsique combinée à un traitementthermique par les micro-ondes à 50 Watts pendant 5 minutes, 100 et 200 Watts durant 3minutes.........................................................................................................................................10553. RP-HPLC des hydrolysats pepsique du lactosérum bovin obtenus sous micro-ondes à 50Watts (5min d’hydrolyse) 100 et 200 Watts (3min d’hydrolyse)................................................. 10554. Titres en IgG polyclonaux anti-BLG et anti-ALA obtenus chez le lapin néozélandais ........... 10755. Inhibition de la liaison IgG-BLG native par les hydrolysats de lactosérum obtenus parhydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 50 WATTS après 5 minutes detraitement. ..................................................................................................................................10856. Inhibition de la liaison IgG-BLG native par les hydrolysats de lactosérum obtenus parhydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 100 Watts après 3 minutes detraitement. ...................................................................................................................................10957. Inhibition de la liaison IgG-BLG native par les hydrolysats de lactosérum obtenus parhydrolyse peptique sous micro-ondes à 200 Watts après 3 minutes de traitement. ................. 11058. Inhibition de la liaison IgG-ALA native par les hydrolysats de lactosérum obtenus parhydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 50 Watts après 5 minutes detraitement. ...................................................................................................................................11159. Inhibition de la liaison IgG-ALA native par les hydrolysats de lactosérum obtenus parhydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 100 Watts après 3 minutes detraitement. ...................................................................................................................................11260. Inhibition de la liaison IgG-ALA native par les hydrolysats de lactosérum obtenus parhydrolyse peptique sous micro-ondes à 200 Watts après 3 minutes de traitement. ................. 11361. Titres en IgG sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA ......................... 11462. Titres en IgE sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA ......................... 11563. Titres en IgG1 sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA ........................ 11664. Titres en IgG 2a sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA ..................... 11765. Effet de la BLG et l’ALA sur le courant de court circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing 11966. Effet de la BLG et l’ALA sur la différence de potentiel (DDP) mesurée en chambre deUssing ........................................................................................................................................... 12067. Effet de la BLG et l’ALA sur la conductance (G) mesurée en chambre de Ussing sur desfragments jéjunaux de souris sensibilisées à la BLG ou l’ALA...................................................... 12168. Effet de la BLG et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro-ondes et durant un chauffage conventionnel sur lecourant de court circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing ...................................................... 12369. Effet de la BLG et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro-ondes et durant un chauffage conventionnel sur ladifférence de potentiel (DDP) mesurée en chambre de Ussing .................................................. 12570. Effet de la BLG et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et peptique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur laconductance du tissu (G) mesurée en chambre de Ussing.......................................................... 12771. Effet de l’ALA et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur lecourant de court circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing ...................................................... 130

72. Effet de l’ALA et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur ladifférence de potentiel (DDP) mesurée en chambre de Ussing ................................................. 13173. Effet de l’ALA et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur laconductance tissulaire (G) mesurée en chambre de Ussing........................................................ 13374. Courbe obtenue après correction de la gamme étalon des IgE standards (OMS, 1973). ..... 135

75. Classes cliniques observées dans le groupe de nouveau-nés étudié, selon Furlong et al.(2001). ..........................................................................................................................................136

76. Dosage des IgE spécifiques anti protéines du lait chez les nouveaux nés allergiques partest ELISA indirect Fluorimétrique. ............................................................................................. 137

77. Concentrations en IgE spécifiques anti protéines du lait selon les classes cliniques. ........... 138

78. Biopuces après lecture au scanner. Schéma des prints réalisés avec le spotteur. ................ 14179. Biopuces après lecture au scanner. Schéma des prints réalisés avec le spotteur. ................ 14280. Biopuces après lecture au scanner. Schéma des prints réalisés avec le spotteur. ................ 14381. Biopuces après lecture au scanner. Schéma des prints réalisés avec le spotteur. ................ 14482. Comparaison entre les résultats obtenus en ELISA-Fluorimétrique et par biopuces àallergènes du lait. .........................................................................................................................14683. Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsique deBLG purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 50 Wattsdurant 5 min mesurée par test ELISA compétitif. ....................................................................... 14684. Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsique deBLG purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 100 Wattsdurant 3 min mesurée par test ELISA compétitif. ....................................................................... 14785. Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats peptiques de BLG purifiée etde lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 200 Watts durant 3 minmesurée par test ELISA compétitif............................................................................................... 14986. Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsiqued’ALA purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 50 Wattsdurant 5 min mesurée par test ELISA compétitif ......................................................................... 15187. Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsiqued’ALA purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 100Watts durant 3 min mesurée par test ELISA compétitif .............................................................. 15288. Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats peptiques d’ALA purifiée et delactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 200 Watts durant 3 minmesurée par test ELISA compétitif............................................................................................... 15489. Spectres de l’UV-proche obtenus par dichroïsme circulaire de la BLG traitée à pH 2 sousmicro-ondes à 50, 100 et 200 Watts (A) et au chauffage conventionnel (B). .................................15790. Spectres de l’UV- lointain obtenus par dichroïsme circulaire de la BLGtraitée à pH 2 sousmicro-ondes à 50, 100 et 200 Watts (A) et au chauffage conventionnel (B).. ............................ 157

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Principales caractéristiques des protéines du lait de vache ............................15

Tableau 2 : Laits hypoallergéniques et hydrolysats de protéines ......................................36

Tableau 3 : Composition des gels d’électrophorèse...........................................................54

Tableau 4 Adjuvants et mécanismes d’action ...................................................................56

Tableau 5 : Description clinique des 64 sérums de nouveau nés allergiques au lait utilisés lorsdes différents tests immunochimiques...............................................................................66

Tableau 6: % d’hydrolyse des protéines du lactosérum (BLG et ALA) obtenus sous micro-ondes à 50 Watts et par chauffage conventionnel mesurés par densitométrie. ...............93

Tableau 7 : % d’hydrolyse des protéines du lactosérum (BLG et ALA) d’hydrolysats obtenussous micro-ondes à 100 Watts et par chauffage conventionnel .......................................96

Tableau 8: % d’hydrolyse des protéines du lactosérum (BLG et ALA) d’hydrolysats obtenussous micro-ondes à 200 Watts et par chauffage conventionnel ........................................98

LISTE DES ABREVIATIONS

ALA Alpha-LactalbumineBLG bêta-LactoglobulineCAS CaséineLf LactoferrineSAB Serum Albumine BovineIgE ImmunoGlobuline EEDTA Acide Ethylène Diamine TétraacétiqueFDA Food Drug AdministrationCMH Complexe Majeur d’HistocompatibilitéCD23 Cluster de Determination 23TH2 Cellules T helperACs AnticorpskDa Kilo DaltonPM Poids MoléculaireAra ArachidepH Potentiel d’HydrogèneE/S Enzyme/SubstratPhe Phenyl alanineTyr TyrosineTrp TryptophanePLV Protéines du Lait de VachePEF Pulsed Electromagnetic FieldMPa MegaPascalMhz MegaHertzPVDF Polyfluorure de vinylidèneHA HypoAllergéniqueAPLV Allergie aux protéines du Lait de vacheSPT Skin Prick TestRAST Radio Allergo Sorbent TestEAST Enzyme Allergo Sorbent TestkUA Kilo unite AbsorbanceWPI Whey Protein IsolateTPCK L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketoneTLCK N-p-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketoneM MolaireSDS Sodium Dodécyl sulfatemM Milli molaireh HeureAPS Persulfate d’ammoniumTemed TetraMethylEthyleneDiamineTFA acide trifuloro acétiqueTri Fluoro AcidACF Adjuvant Complet de FreundAIF Adujvant Incomplet de FreundELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

DDP Différence De PotentielIsc Intensiy of short circuitG ConductanceDC Dichroïsme circulaireUV Ultra VioletCMHII Complexe majeur d’histocompatibilité II

SOMMAIRE

PAGES

INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................ 1

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1. HISTORIQUE DE L’ALLERGIE ALIMENTAIRE ......................................................................... 4

2. ALLERGIE AUX PROTÉINES AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE ..................................... 5

2.1. GENERALITES ........................................................................................................................... 5

2.2. MÉCANISME PHYSIOPATHOLOGIQUE DE L’ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE . 6

2.2.1. Barrière intestinale........................................................................................................... 6

2.2.2. Les différentes voies impliquées dans la perméabilité intestinale ................................... 6

2.2.3. Le rôle des exosomes épithéliaux dans l’information du système immunitaire

Intestinal..................................................................................................................................... 9

2.2.4. Transport intestinal d’allergènes via les IgE dans l’allergie alimentaire.......................... 13

3. ALLERGÈNES MAJEURS DU LAIT & ÉPITOPES ...................................................................... 17

3.1. DÉFINITION D’UN ALLERGÈNE ALIMENTAIRE ......................................................................... 17

3.2. LES ALLERGÈNES DU LAIT BOVIN ............................................................................................ 19

3.2.1. La-lactoglobuline ..................................................................................................... 20

3.2.2. L’a-lactalbumine ......................................................................................................... 22

3.2.3. La Lactoferrine (Lf) ...................................................................................................... 24

4. TRAITEMENTS TECHNOLOGIQUES POUR RÉDUIRE L’ALLERGÉNICITÉ DES PROTÉINES DULAIT. ................................................................................................................................................ 25

4.1. EFFETS DES TRAITEMENTS THERMIQUES ............................................................................... 27

4.2. DIGESTION ENZYMATIQUE DES ALLERGÈNES......................................................................... 30

4.2.1. Les enzymes d’origine animale ........................................................................................ 30

4.2.2. Les enzymes d’origine végétale........................................................................................ 31

4.3. FERMENTATION BACTÉRIENNE ............................................................................................... 32

5. NOUVEAUX PROCÉDÉS INDUSTRIELS APPLIQUÉS AUX ALIMENTS ET IMPACT SURL’ALLERGÉNICITÉ .......................................................................................................................... 33

5.1. TRAITEMENTS PAR HAUTES PRESSIONS................................................................................. 33

5.2. TRAITEMENT PAR MICRO ONDES ........................................................................................... 34

5.3. IRRADIATION PAR RAYONS GAMMA ()................................................................................. 37

6. LES STRATÉGIES DE TRAITEMENT ET DE PRÉVENTION DE L’APLV

6.1. LE TRAITEMENT DE L’ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE ................................... 37

Formules intensivement hydrolysées ................................................................................. 37

6.2. LA PRÉVENTION DE L’ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE.................................... 39

Laits hypoallergéniques ........................................................................................................... 40

6.3. LES RISQUES ALLERGIQUES DES HYDROLYSATS PARTIELS ET EXTENSIFS .............................. 41

7. TESTS BIOLOGIQUES DANS LES MALADIES ALLERGIQUES................................................ 42

7.1. TESTS in vivo ............................................................................................................................ 42

7.1.1. Tests cutanés.................................................................................................................... 42

7.1.2. Tests de provocation labiale et orale ............................................................................... 43

7.2. TESTS in vitro ........................................................................................................................... 43

7.2.1. Dosage des IgE spécifiques ......................................................................................... 44

7.2.2. Biopuces à allergènes.................................................................................................. 45

MATERIELS ET METHODES

1. PRODUCTION D’HYDROLYSATS POUSSÉS ............................................................................ 51

1.1. LES SUBSTRATS ........................................................................................................................ 51

1.1.1. BLG & ALA ................................................................................................................... 51

1.1.2. Lactosérum bovin ........................................................................................................ 51

1.2. LES HYDROLYSES ENZYMATIQUES .......................................................................................... 51

1.2.1 Hydrolyse trypsique et chymotrypsique de la BLG, de l’ALA et du lactosérum bovin à 1%

............................................................................................................................................... 51

1.2.2. Hydrolyse pepsique de la BLG, de l’ALA et du lactosérum à 1% ................................. 51

1.3. TRAITEMENTS MICRO-ONDES................................................................................................. 52

1.4. TRAITEMENT AU CHAUFFAGE THERMIQUE CONVENTIONNEL .............................................. 54

2. CARACTÉRISATION DES HYDROLYSATS PRODUITS SOUS MICRO-ONDES ET ENCONDITIONS DE CHAUFFAGE CONVENTIONNEL .................................................................... 54

2.1. ELECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLY-ACRYLAMIDE EN PRÉSENCE DE SODIUM DODÉCYLESULFATE (SDS-PAGE)....................................................................................................................... 54

2.2. ÉTUDE PAR RP- HPLC ............................................................................................................... 55

2.3. ESTIMATION DE L’HYDROLYSE DES PROTÉINES PAR DENSITOMÉTRIE ................................. 55

3. IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS CONTRE DES IgG POLYCLONAUX ................ 56

3.1. PRODUCTION D’IGG ANTI-BLG ET ANTI-ALA CHEZ LE LAPIN.................................................. 56

3.1.1. Procédure d’Immunisation ......................................................................................... 56

3.1.2. Protocole d’immunisation ........................................................................................... 57

3.1.3. Prélèvements sanguins ............................................................................................... 57

3.2. DOSAGE DES IgGs ANTI-BLG ET ANTI-ALA PAR ELISA INDIRECT COLORIMÉTRIQUE ............. 58

3.2.1. Principe du test ELISA indirect colorimétrique ........................................................... 58

3.2.2. Mode opératoire. ........................................................................................................ 59

3.3. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS PAR ELISA COMPÉTITIF COLORIMÉTRIQUE......................................................................................................................................................... 60

4. ÉTUDE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS EN CHAMBRE DE USSING .................. 61

4.1. ANIMAUX. ................................................................................................................................ 61

4.2. ALLERGÈNES ............................................................................................................................. 61

4.3. ADJUVANTS.............................................................................................................................. 61

4.4. PRODUITS UTILISES.................................................................................................................. 61

4.5. IMMUNISATION DU MODÈLE ANIMAL D’ALLERGIE : LA SOURIS BALB/c .............................. 62

4.5.1. Répartition des animaux ............................................................................................. 62

4.5.2. Protocoles d’immunisation ......................................................................................... 62

4.5.3. Prélèvements sanguins ............................................................................................... 62

4.6. DOSAGE DES ANTICORPS RÉAGINIQUES................................................................................. 62

4.6.1. Mode opératoire ......................................................................................................... 63

5. MESURE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS OBTENUS SOUS MICRO ONDES ETDANS LES CONDITIONS CONVENTIONNELLES......................................................................... 64

5.1. TEST ex vivo EN CHAMBRE DE USSING ................................................................................... 64

5.1.1. Principe de la chambre de Ussing ............................................................................... 64

5.1.2. Montage des fragments de tissus intestinaux des souris ........................................... 66

6. SERUMS HUMAIN .................................................................................................................... 67

6.1. CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE DE LA SÉROTHÈQUE................................................. 69

6.1.1. Dosage des IgE spécifiques humaines par ELISA fluorimétrique................................. 69

6.1.2. Principe et mode opératoire ....................................................................................... 71

6.1.3. Exploitation des résultats............................................................................................ 71

6.2. CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE DES SÉRUMS DE PATIENTS PAR LA TECHNIQUE DUMICROARRAY (BIOPUCES À ALLERGÈNES)..................................................................................... 73

6.3. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS PRODUITS SOUS MICRO-ONDES ET DANSLES CONDITIONS CONVENTIONNELLES PAR ELISA COMPÉTITIF CONTRE LES SÉRUMS DE PATIENTSALLERGIQUES .................................................................................................................................. 76

6.3.1. Principe du test ........................................................................................................... 76

6.3.2. Mode opératoire ......................................................................................................... 77

7. ÉTUDE STRUCTURALE DE LA BLG PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE (DC)........................... 77

7.1. PRINCIPE .................................................................................................................................. 78

7.2. CONDITIONS ET PROTOCOLE................................................................................................... 78

8. ÉTUDE STATISTIQUE ................................................................................................................ 78

RESULTATS

1. TRAITEMENT MICRO ONDES ET TEMPÉRATURES OBTENUES.......................................... 80

2. EFFETS DES MICRO ONDES SUR L’HYDROLYSE ENZYMATIQUE ....................................... 75

2.1 HYDROLYSE TRYPSIQUE ET CHYMOTRYPSIQUE DE LA BLG SOUS MICRO-ONDES À 50WATTS ................................................................................................................................. 80

2.2. HYDROLYSE ENZYMATIQUE TRYPSIQUE ET CHYMOTRYPSIQUE DE LA BLG SOUSMICRO-ONDES À 100 WATTS .................................................................................................... 83

2.3. HYDROLYSE ENZYMATIQUE TRYPSIQUE ET CHYMOTRYPSIQUE DE LA BLG SOUSMICRO-ONDES À 200 WATTS .................................................................................................... 86

2.4. HYDROLYSE TRYPSIQUE/CHYMOTRYPSIQUE DE L’ALA BOVINE SOUS MICRO-ONDES À50 WATTS ...................................................................................................................................... 89

2.5. HYDROLYSE TRYPSIQUE/CHYMOTRYPSIQUE DE L’ALA BOVINE SOUS MICRO-ONDES À100 WATTS .................................................................................................................................... 90

2.6. HYDROLYSE TRYPSIQUE/CHYMOTRYPSIQUE DE L’ALA BOVINE SOUS MICRO-ONDES À100 WATTS .................................................................................................................................... 92

2.7. HYDROLYSE TRYPSIQUE/CHYMOTRYPSIQUE SOUS MICRO-ONDES À 50 WATTS DULACTOSÉRUM BOVIN À 1% EN PROTÉINES.............................................................................. 93

2.8. HYDROLYSE TRYPSIQUE/CHYMOTRYPSIQUE DU LACTOSÉRUM BOVIN À 1% ENPROTÉINES SOUS MICRO-ONDES À 100 WATTS..................................................................... 96

2.9. HYDROLYSE TRYPSIQUE/CHYMOTRYPSIQUE SOUS MICRO-ONDES À 200 WATTS DULACTOSÉRUM BOVIN À 1% EN PROTÉINES.............................................................................. 98

2.10. HYDROLYSATS PEPTIQUES DE LA BLG OBTENUS SOUS MICRO-ONDES À 50, 100 ET 200WATTS ............................................................................................................................................ 100

2.11. CARACTÉRISATION DES HYDROLYSATS PEPTIQUES DE L’ALA OBTENUS SOUS MICROONDES À 50, 100 ET 200 WATTS................................................................................................ 102

2.12. CARACTÉRISATION DES HYDROLYSATS PEPTIQUES DU LACTOSÉRUM BOVIN 1% SOUSMICRO-ONDES À 50, 100 ET 200 WATTS. ................................................................................ 104

3. IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS INTENSIFS CONTRE LES IGG POLYCLONAUX

OBTENUS CHEZ LE LAPIN NÉOZÉLANDAIS ............................................................................... 107

3.1. TITRES EN IgG ANTI-BLG ET ANTI-ALA BOVINES CHEZ LE LAPIN NÉO-ZÉLANDAIS ................ 106

3.2. IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS OBTENUS SOUS MICRO-ONDES CONTRE LES IgG ANTI-

BLG .......................................................................................................................................108

3.3. IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS DE LACTOSÉRUMS OBTENUS SOUS MICRO-ONDES

CONTRE LES IGG ANTI-ALA

4. ÉTUDE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS OBTENUS SOUS MICRO-ONDES ET EN

CONDITIONS DE CHAUFFAGE CONVENTIONNEL ...............................................................114

4.1. TITRES SÉRIQUES EN IMMUNOGLOBULINES (IgG ET IgE) ANTI-BLG ET ANTI-ALA DES SOURIS

BALB/C .................................................................................................................................

114

4.1.1. Titres sériques en IgG ................................................................................................. 114

4.1.2 Titres sériques en IgE.................................................................................................... 115

4.1.3. Titre sérique en IgG1 ................................................................................................... 116

4.1.4. Titres sériques en IgG2a .............................................................................................. 117

4.2. ÉVALUATION DU RAPPORT IgG1/IgG2a ................................................................................. 118

4.3. TEST DE PROVOCATION in vitro EN CHAMBRE DE USSING ................................................... 118

4.3.1 Effet de la BLG et de l’ALA sur le courant de court-circuit tissulaire l’Isc ..................118

4.3.2. Effet de la BLG et de l’ALA sur la différence de potentiel du tissu (DDP) ................... 120

4.3.3. Effet de la BLG et de l’ALA sur la conductance (G)..................................................... 121

5. ÉVALUATION DE L’ALLERGÉNICITÉ DES DIFFÉRENTS HYDROLYSATS ENZYMATIQUES SOUS

MICRO-ONDES ET AU COURS DU CHAUFFAGE CONVENTIONNEL....................................... 122

5.1. ÉTUDE DU POTENTIEL ALLERGÉNIQUE DES TROIS HYDROLYSATS DE LACTOSÉRUM

SÉLECTIONNÉS, PAR « CHALLENGE » INTESTINAL EN CHAMBRE DE USSING CHEZ LES SOURIS

SENSIBILISÉES CONTRE LA BLG : TEST DE PROVOCATION EN CHAMBRE DE USSING................... 122

5.1.1. Hydrolysats trypsique/chymotrypsique du lactosérum traités à 50 watts et par chauffage

conventionnel À 43,2°C ......................................................................................................... 122

5.1.2. Effet sur la différence de potentiel (DDP).............................................................. 124

5.1.3. Effet sur la conductance (G) .................................................................................... 126

5.2. ÉTUDE DU POTENTIEL ALLERGÉNIQUE DES TROIS HYDROLYSATS DE LACTOSÉRUM

SÉLECTIONNÉS PAR « CHALLENGE » INTESTINAL EN CHAMBRE DE USSING CHEZ LES

SOURIS SENSIBILISÉES CONTRE L’ALA ...................................................................................... 128

5.2.1 Effet sur l’Isc ................................................................................................................ 128

5.2.2 Effet sur la différence de potentiel (DDP)..........................................................................129

5.2.3. Effets sur sur la conductance ...........................................................................................132

6. PROFIL DES RÉPONSES IGE SPÉCIFIQUE AUX ALLERGÈNES PAR TEST ELISAFLUORIMÉTRIQUE CHEZ LES NOUVEAU-NÉS ALLERGIQUES AU LAIT DE VACHE. .............134

6.1. PROFIL DE SENSIBILISATION DES NOUVEAU-NÉS ÉTABLI PAR DOSAGE DES IGE SPÉCIFIQUES

.................................................................................................................................................... 137

6.2. ÉTUDE DES PROFILS DE SENSIBILISATION DES NOUVEAUX NÉS ALLERGIQUES PAR BIOPUCES À

ALLERGÈNES .................................................................................................................................... 139

7. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS INTENSIFS DE LACTOSÉRUMS

BOVINS SOUS MICRO-ONDES CONTRE LES IGE HUMAINES ANTI-BLG ET-ANTI ALA........ 145

7.1. IMMUNORÉACTIVITÉ CONTRE LES IGE ANTI BLG ................................................................... 145

7.2. IMMUNORÉACTIVITÉ CONTRE LES IGE ANTI ALA .................................................................. 150

8. ÉTUDE STRUCTURALE DE LA DÉNATURATION DE LA BLG PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE

DISCUSSION ............................................................................................................................... 159

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .....................................................................................186

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................................................190

INTRODUCTION

INTRODUCTION GENERALE

INTRODUCTION

1

INTRODUCTION GÉNÉRALE

L’allergie alimentaire affecte environ 4% à 6 % des enfants en bas âge, avec une

prédominance de l’allergie à l’œuf, au lait et à l’arachide. L’incidence de ce type d’allergie est

en nette augmentation ces dernières années dans le monde occidental (Sicherer et al. 2010).

Les allergies représentent un véritable problème de santé publique, aussi bien pour

les perturbations et les risques de pathologies graves qu’elles peuvent engendrer dans la vie

des patients, que pour les coûts de leur prise en charge. Pour les allergies au lait et à l’œuf,

la tolérance est acquise dans la plupart des cas après l’âge de 2 ans, alors qu’elle persiste

avec l’allergie à l’arachide (Sampson et al., 2004 ; Al Agmy et al., 2007).

En Algérie, une étude a été réalisée dans la région du constantinois sur 822

nourrissons et fait apparaître une prévalence de l’allergie aux protéines du lait de vache

(APLV) de 4,9%, avec apparition à un âge précoce entre 0 et 3 mois (Boughellout, 2010).

Le traitement de cette affection constitue une préoccupation importante pour les

scientifiques. Actuellement, ce traitement repose principalement sur un régime d’éviction

des protéines du lait de vache et sur l’administration de préparations adaptées sous forme

d’hydrolysats de protéines lactées ou autres protéines (riz, collagène, etc.) (Fiocchi et al.

2010).

Cependant, les traitements technologiques appliqués pour l’obtention de ces

hydrolysats semblent insuffisants, puisque dans ces produits il y a toujours une persistance

de résidus de protéines intactes allergisantes. En particulier, il a été montré qu’à l’aide de

sérums de nourrissons APLV, il est possible de détecter la présence résiduelle de -

lactoglobuline, un allergène majeur du lait de vache, dans les différents laits

hypoallergéniques et intensivement hydrolysés (Jakobsson et al., 1985; Mäkinen-Kiljunen et

al., 1993; Oldaeus et al., 1997).

La démarche diagnostique de l’APLV chez les enfants sous régime d’éviction au lait

est basée souvent sur la disparition des signes cliniques. Le test de provocation orale reste

l’étalon d’or pour suivre une procédure logique afin de ne pas laisser inutilement un enfant

sous un régime sans lait (Bicudo Mendonça et al., 2012). D’autres examens complémentaires

peuvent être utiles pour le diagnostic de l’APLV et dépendent des mécanismes

immunologiques mis en cause, IgE ou non IgE dépendants (De Boissieu et al., 2006).

INTRODUCTION

2

De même, les tests cutanés, prick tests et/ou patch-tests ainsi que le dosage des IgE

spécifiques au lait dans les formes IgE-médiées sont une aide au diagnostic (Niggemann et

al., 2001).

De manière générale, le diagnostic est en pleine évolution, non seulement au niveau

technique, avec l’intégration de technologies innovantes issues de la génomique, de la

protéomique et de la découverte de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques de

maladies, mais aussi au niveau économique, avec le développement du diagnostic préventif.

Dans ce contexte, l’évolution des tests biologiques, en particulier des IgE spécifiques,

se fait vers l’automatisation (tests dits de 3eme génération) et la miniaturisation (sang

capillaire déposé sur des chips). De nouvelles techniques telles que le microarray et l’épitope

mapping permettront peut être aussi de mieux préciser la réponse immuno-allergique sur le

plan moléculaire et sa relevance clinique et de mieux appréhender les mécanismes non IgE

dépendants (Pillette et al., 2005).

Dans ce travail, nous avons porté notre attention sur les deux principales protéines

du lactosérum bovin impliquées dans l’APLV, la lactoglobuline (BLG) et l’ lactalbumine

(ALA) avec pour objectif principal la réduction de leur potentiel allergisant par l’utilisation de

traitements enzymatiques associés à l’action du rayonnement micro-ondes.

L’évaluation de la diminution de l’antigénicité/allergénicité de ces deux

lactoprotéines est mesurée par différentes techniques immuno-enzymatique à l’aide

d’immuns sérums obtenus chez le lapin et par des tests de provocation ex-vivo en chambre

de Ussing, à partir d’un modèle animal d’allergie aux PLV, la souris Balb/c. De plus,

l’immunoréactivité des hydrolysats a été évaluée contre les IgE humaines provenant de

nourrissons allergiques aux PLV.

Enfin, la mise au point d’un outil diagnostique miniaturisé, les « biopuces à allergènes » pour

aider le diagnostic de l’APLV et son suivi ont été réalisé.


4

1. HISTORIQUE DE L’ALLERGIE ALIMENTAIRE

Aux États Unis, les allergies alimentaires touchent environ 6% des enfants et 3,7%

d’adultes (Sampson, 2004). En France, l’allergie alimentaire affecte environ 3,5% de la

population générale et 7 à 8% de la population pédiatrique. L’allergie au lait touche surtout

de jeunes enfants qui, pour la plupart, en guérissent spontanément vers l’âge de 3 ans

(Kanny et al., 2001). Une étude menée en Grande Bretagne (UK) révèle que la prévalence

des allergies alimentaires était de 1,8% (Young & Stoneham, 1994). En Algérie, la prévalence

de l’allergie alimentaire reste toujours mal décrite en raison du manque d’études

épidémiologiques. Récemment, Boughellout (2010), suite à une étude faite dans le

constantinois, a montré que la prévalence de l’allergie aux protéines du lait de vache était de

4,9% chez la population pédiatrique.

L’allergie alimentaire se définit comme une réponse immunitaire pathologique à un

aliment ou plus précisément à un composant (protéine/allergène) de l’aliment par un

individu génétiquement prédisposé (atopique). Cette prédisposition conduit les personnes

atopiques notamment à développer une réponse immunitaire dérégulée avec

hyperproduction d’anticorps particuliers de type IgE.

Chez ces personnes, et chez ces personnes seulement, une réaction allergique peut

se manifester. Elle se déroule en deux phases distinctes, séparées dans le temps: lors d’un

premier contact avec l’allergène a lieu la phase de sensibilisation marquée par la production

d’IgE spécifiques. Ces IgE circulent dans le sang et vont se fixer sur des cellules effectrices de

l’allergie que sont les basophiles sanguins et les mastocytes tissulaires, cellules contenant

des granules riches en différents médiateurs biologiquement actifs. Cette phase est

silencieuse, sans symptômes. Plus tard, lors d’une exposition ultérieure survient le

déclenchement de la réaction allergique: l’allergène en se liant aux IgE spécifiques

préalablement fixées sur les basophiles/mastocytes va les activer et provoquer leur

dégranulation avec libération des médiateurs responsables des manifestations cliniques

(Wal, 2011).

Selon l’US Food and Drug Administration (FDA), le lait, l’œuf, les céréales et le soja

sont responsables de plus de 90% des réactions d’allergies alimentaires. Chez les enfants et

les nourrissons, le lait est le premier aliment responsable des allergies suivi de l’œuf, des

céréales et du soja (Wood, 2004).

5


2. ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE

2.1. GENERALITES

L’allergie au lait de vache ou à celui de différents mammifères telle la chèvre ou la

brebis est principalement le résultat d’une réaction d’hypersensibilité immédiate médiée par

les IgE mais elle peut également faire intervenir d’autres classes d’anticorps et/ou des

mécanismes cellulaires responsables de manifestations retardées, voire chroniques. Les

composés responsables sont les protéines du lait. Les mécanismes mis en jeu de même que

les manifestations cliniques distinguent clairement l’allergie aux protéines du lait de

l’intolérance au lactose causée par des déficits enzymatiques pouvant toucher de larges

segments de la population, généralement adulte (Bahna, 2002; Fiocchi et al., 2003). La

plupart des allergies au lait apparaissent chez le jeune enfant, dans les 6 premiers mois et en

général disparaissent spontanément entre 2 et 5 ans. La majorité tolère le lait à l’âge de 3

ans (Sicherer et Sampson, 1999; Host, 2002). Les symptômes associés sont variés et peuvent

recouvrir des manifestations légères, modérées ou sévères qui affectent la peau, l’appareil

respiratoire, le système digestif ou même des réactions généralisées qui peuvent être fatales

(choc anaphylactique).

La majorité des nourrissons allergiques acquièrent leur tolérance aux protéines du

lait vers l’âge de deux ans et ce processus peut aller jusqu’à 6 ans (Strobel, 1998). L’une des

raisons de ce délai dans l’acquisition de la tolérance s’explique par la maturation du tractus

gastro-intestinal. Ce dernier s’adapte d’une part, à la diminution du pH stomacal permettant

de constituer un milieu optimal pour l’activité peptique et d’autre part, à une diminution de

la perméabilité intestinale qui limiterait l’absorption de certains allergènes alimentaire sous

leur forme intacte (Yamada et al., 2000; Wood, 2003).

6


2.2. MÉCANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES DE L’ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE

VACHE

2.2.1. La barrière intestinale

L’épithélium intestinal recouvrant la muqueuse digestive est une interface importante entre

la lumière intestinale et le système immunitaire muqueux et constitue un lieu où les

interactions les plus complexes entre gènes et le système immunitaire se produisent,

constituant ainsi l'organe le plus important pour la communication avec l'environnement

(figure 1). En outre, il permet l’absorption des nutriments tout en constituant une barrière

efficace évitant l’entrée massive d’antigènes alimentaires incomplètement hydrolysés par les

enzymes digestives et de micro-organismes commensaux. La barrière intestinale consiste

essentiellement en une monocouche épithéliale comprenant des entérocytes absorptifs, des

cellules à mucus, des cellules endocrines, des cellules de Paneth et des cellules M localisées

au-dessus des plaques de Peyer et des follicules lymphoïdes isolés, spécialisés dans la

transmission contrôlée de micro-organismes vers les cellules immunitaires du chorion (figure

2).

Les protéines alimentaires sont presque totalement dégradées dans la lumière

intestinale par les enzymes pancréatiques; cependant, certaines présentent une résistance

particulière (-lactoglobuline du lait de vache, gliadines et gluténines du gluten) leur

permettant d’atteindre l’intestin grêle sous forme intacte. Ces protéines peuvent donc avoir

un pouvoir allergisant (allergie aux protéines du lait de vache) ou une activité immunogène

toxique (gliadines dans la maladie cœliaque ou intolérance au gluten) (Ménard, 2010).

2.2.2. Les différentes voies impliquées dans la perméabilité intestinale

Le facteur limitant la diffusion de molécules antigéniques ou toxiques de la lumière

intestinale vers le chorion sous-jacent est la monocouche de cellules épithéliales. Deux voies

d’absorption peuvent intervenir dans leur transfert intestinal: la voie paracellulaire et la voie

transcellulaire (figure 3).

La diffusion paracellulaire (entre les cellules) ne concerne en condition physiologique

que les petites molécules de masse moléculaire inférieure à 600 daltons (marqueurs de

perméabilité inertes tels que le lactulose, le mannitol in vivo ou le 51Cr-EDTA in vitro). En

effet, les jonctions serrées intercellulaires constituent la structure majeure limitant la

perméabilité paracellulaire (Powell, 1981; Adson, 1994).

7


Il existe une augmentation des capacités d’absorption par la voie paracellulaire dans

un environnement inflammatoire. Cela implique une régulation complexe liée à des

modifications de la structure des jonctions serrées (remodelage par phosphorylation des

Figure 1: Influence des facteurs environnementaux sur la communication du tractus gatsrointestinal. L’intestin représente une interface entre le milieu extérieur et l’organisme(Brandtzaeg, 2011)

8


Figure 2 : La barrière intestinale d’après Mayer, 2004

9


protéines constituantes, occludine, claudines, JAM-A, ZO1, 2, 3) observée en conditions

inflammatoires. Les mouvements ioniques sont généralement responsables des

mouvements d’eau et de molécules solubles et du phénomène de solvent drag. Il existe par

ailleurs une voie de transport transcellulaire des antigènes luminaux, impliquant un

mécanisme actif de transcytose (internalisation de la membrane apicale et du contenu

luminal, formation d’endosomes, migration des endosomes et exocytose des produits de

dégradation à la membrane basale) (Ménard, 2010).

Cependant, la quantité d’antigènes franchissant la barrière épithéliale est très faible

(2 µg/h/cm2 de muqueuse) et ne représente que 1/1000 de la concentration luminale (si la

concentration luminale d’un antigène est de 1 mg/ml, une concentration de 1 µg/ml sera

observée au niveau du chorion). Ce phénomène de transcytose de protéines alimentaires n’a

donc pas d’intérêt nutritionnel mais il est nécessaire à l’information du système immunitaire

muqueux. Les protéines et peptides atteignant la lamina propria intestinale peuvent être

capturés par les cellules présentatrices d’antigènes locales, comme le montre l’étude de

Chirdo et al. (2005) indiquant qu’après gavage de souris à l’ovalbumine, cet antigène est

rapidement associé aux cellules dendritiques intestinales (Ménard, 2010).

2.2.3. Le rôle des exosomes épithéliaux dans l’information du système immunitaire

Intestinal

Les antigènes comme les protéines alimentaires et les micro-organismes présents

dans l'alimentation maternelle peuvent être reconnus par le système lymphocytaire du

système digestif. Plus précisément, les lymphocytes naïfs sont regroupés dans des structures

particulières libres appelées plaques de Peyer. A ce niveau, la barrière entre le contenu

digestif et ces lymphocytes est en partie constituée de cellules M qui ont à la fois une

fonction d'endocytose et une absence d'activité protéolytique car elles sont quasiment

dépourvues de système lysosomal. Les lymphocytes sont donc directement stimulés par les

antigènes luminaux. Il en résulte une multiplication clonale et une migration vers les

différentes structures muqueuses des organismes dont les glandes mammaires de la femme

qui allaite.


1010

Figure 3: La perméabilité intestinale dépend de deux voies principales, la voie paracellulaireentre les cellules épithéliales et la voie transcellulaire. Adapté de Ménard (2010).


1111

Puisqu’une fraction notable d’antigènes alimentaires est transmise à travers la

barrière intestinale sous forme de peptides immunogènes, cela suggère une dégradation

incomplète et une «protection» des peptides au cours du transport transépithélial. La notion

selon laquelle les cellules dendritiques présentatrices d’antigènes peuvent apprêter les

protéines en peptides et libérer des vésicules (exosomes) portant à leur surface ces peptides

associés aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II, a

conduit à examiner la possibilité d’une production d’exosomes par les cellules épithéliales

intestinales.

Cette hypothèse a été confortée par la démonstration d’une sécrétion de structures

vésiculaires (80 nm de diamètre) par des lignées épithéliales intestinales (figure. 4) dont la

structure et la composition moléculaires sont proches de celles des cellules présentatrices

d’antigènes (Raposo, 1996).

Les exosomes sont formés par internalisation de la membrane externe de ce compartiment,

cela expliquant la présence des complexes CMHII/peptides à leur surface.

Les compartiments CMHII peuvent soit fusionner avec le système lysosomal, soit

fusionner avec la membrane plasmique et libérer leur contenu d’exosomes dans le milieu

extracellulaire. Ce phénomène a été démontré au niveau des cellules épithéliales

intestinales (Van Niegel, 2001) et il pourrait être important pour le transfert d’antigènes

luminaux sous forme très immunogène (Heyman, 2010).

En effet, in vitro, les peptides provenant d’un apprêtage d’antigène par la cellule épithéliale

et libérés sous forme d’exosomes peuvent interagir très efficacement avec des cellules

dendritiques en culture et stimuler des clones T spécifiques à des concentrations 100 fois

inférieures à celles nécessaires à une activation par les peptides libres (Mallegol, 2007).

La transcytose des antigènes alimentaires s’effectue essentiellement par endocytose non

spécifique «en phase fluide». Cependant, en certaines circonstances, des antigènes luminaux

peuvent accéder à la muqueuse intestinale (Heyman, 2010). Sous la forme d’immun-

complexes (figure 5), grâce à l’expression des récepteurs aux immunoglobulines (Ig)

exprimés en condition normale ou pathologique sur la surface apicale des entérocytes. Il

peut s’agir d’immun-complexes IgE dans le cas d’allergies alimentaires ou de complexes

IgA/gliadine comme récemment décrit dans la maladie cœliaque.


1212

Figure 4 Les exosomes sont des vésicules présentatrices d’antigènes portant à leur surfacedes complexes majeurs d’incompatibilité II/peptides (Ménard, 2010).

Figure 5. Système immunitaire associé au tube digestif (MALT). D’après Brandtzaeg, 2011.


1313

2.2.4. Transport intestinal d’allergènes via les IgE dans l’allergie alimentaire

Le récepteur de faible affinité pour les IgE (Fc_RII, CD23) est capable de transporter

des immun-complexes IgE à travers l’entérocyte dans l’allergie intestinale (figure 6). Le CD23

est un récepteur essentiellement exprimé sur les cellules hématopoïétiques mais son

expression a aussi été observée sur les faces apicales et basales des entérocytes des patients

atteints de maladies intestinales, qu’elles soient IgE-dépendantes ou non (allergie aux

protéines du lait de vache, entéropathie auto-immune, maladie de Crohn, rectocolite

hémorragique) (Kaiserlian, 1993; Lachaux, 1996).

Des niveaux d’expression élevés d’IL-4, une cytokine Th2impliquée dans les maladies

allergiques, sont responsables de la surexpression de CD23. Bien que les IgE ne soient pas

considérées comme des immunoglobulines sécrétées dans la lumière intestinale, elles sont

retrouvées dans les lavages intestinaux au cours d’infection parasitaire (Negrao-Correa,

1996) ou dans l’allergie alimentaire (Belut, 1980).

Le rôle du CD23 épithélial et des immuncomplexes IgE dans l’entrée d’allergènes

alimentaires dans la muqueuse intestinale a été démontré dans des modèles murins

d’allergie. La sensibilisation de rats vis-à-vis d’une protéine test, la peroxydase de raifort

(HRP) a conduit à une absorption de cette protéine dans les entérocytes et à un transport

plus rapide que celui observé chez les animaux témoins (Yang, 2000; Tu, 2006).

Ce transfert rapide implique le récepteur CD23 et la présence d’immun-complexes

IgE (Berin, 1997). Ainsi, la sensibilisation allergique en augmentant l’expression du récepteur

CD23 permet à un allergène complexé aux IgE de franchir la barrière épithéliale sous forme

intacte en évitant la dégradation lysosomale. Ce mécanisme permet aux immun-complexes

IgE-allergènes délivrés dans le chorion d’induire rapidement une dégranulation des

mastocytes conduisant à une réponse allergique inflammatoire.


1414

Figure 6 : Les immunoglobulines de type IgE, IgG et surtout IgA sont présentes dans lalumière intestinale (Heyman, 2010).


1515

Les sujets atopiques, et après des expositions répétées à des allergènes alimentaires,

développent une puissante réponse TH2 et produisent des immunoglobulines de type (E). Les

IgE se fixent par la suite sur les mastocytes et les basophiles par le biais de leur récepteurs

les FceRI (Galli, 2000; Kawakami, 2002; Galli, 2005). Une réexposition aux mêmes antigènes

produit l’activation et la dégranulation des mastocytes et des basophiles et la sécretion,

après un pontage de l’allergène avec les IgE de surface, des médiateurs d’inflammation: des

cytokines et chemokines qui résultent en une réponse inflammatoire d’hypersensibilité

immédiate de type I (figure 7) (Cole, 2001; Wood, 2003; Bischoff, 2005). Les IgE sont les

seuls anticorps qui régulent l’expression du récepteur FceRI sur les mastocytes et basophiles

ce qui conduit à l’amplification de la réaction allergique immédiate de type I (Lantz, 1997;

Yamaguchi, 1997).


1616

Figure 7 : Rôle des mastocytes dans la réaction allergique inflammatoire (Maurer et al.,2003)


1717

3. ALLERGÈNES MAJEURS DU LAIT & EPITOPES

3.1. DÉFINITION D’UN ALLERGÈNE ALIMENTAIRE

Un allergène est un antigène susceptible d’induire une réaction allergique. Un

consensus s’est établi au sein de l’European Academy of Allergy and Clinical Immunology

(EAACI) pour définir l’allergie comme une réaction d’hypersensibilité initiée par un

mécanisme immunologique spécifique médiée par la production d’anticorps (Acs) de type

IgE, IgG, voire IgM et IgA, ou une réaction cellulaire (Johansson, 2001).

Les allergènes alimentaires sont, bien évidemment, le plus souvent des

glycoprotéines de PM compris entre 10 et 70 kDa (Taylor, 1992; Mastuda, 1993; Lehrer,

1996; Jankiewicz, 1997). Le lait, l’œuf, l’arachide, le soja et la farine de blé représentent 90%

des allergènes alimentaires chez l’enfant, tandis que l’arachide et les autres fruits à coque, le

poisson et les fruits de mer représentent 85% des allergènes alimentaires impliqués chez les

adolescents et adultes selon Sampson (Sampson, 1992 ; Madsen, 1997; Schäfer, 2001;

Taylor, 2001; Zuberbier, 2004).

Les allergènes les plus connus sont représentés par les protéines du lait: -

lactalbumine, -lactoglobuline et caséines (Fedorov, 1997; Thorn, 1997). La composition en

protéines du lait (Wal, 1998, 2002; Farrell, 2004; Restani, 2009 ; Wal, 2011) et leur

dénomination selon la nomenclature officielle internationale des allergènes sont

représentés dans le tableau 1. La principale observation est la multiplicité et la diversité des

protéines impliquées dans l’allergie au lait de vache. Des sensibilisations à plusieurs

protéines (polysensibilisations) sont courantes et toutes les protéines du lait apparaissent

comme des allergènes potentiels. Le lait de vache a un taux protéique de 30 à 35 g/L et

contient plus de 25 protéines différentes. Ces protéines sont classées en deux groupes

suivant qu’elles précipitent ou non à pH 4,6 ou sous l’action de la présure: le lait coagulé (ou

lait caillé) qui représente 80% des protéines totales et le lactosérum (ou petit lait), fraction

soluble représentant les 20% restants. La fraction caséine est constituée des caséines

suivantes : Caséine αs1-, αs2-, β etκ, et les caséines γ qui dérivent de l’hydrolyse de la β-

caséine : γ1, γ2 et γ3 qui représentent respectivement les séquences suivantes de la -

caséine : 29–209, 106–209 and 108–209 (Somma, 2008).


1818

Tableau 1 : Principales caractéristiques des protéines du lait de vache. Modifié, selon Wal,2002 et Somma, 2008.

Fraction Protéine Allergène g/L%

Protéinestotales

MM(kDa)

Nombred’acidesaminés

pHi

Caséines 30 80Caséine-Alpha s1

Caséine-Alpha s2 Bos d 8

12-15 29 23,6 199 4,9-53-4 8 25,2 207 5,2-5,4

beta-caséine 9-11 27 24 209 5,1-5,4kappa-caséine 3-4 10 19 169 5,4-5,6

Lactosérum 5 20Alpha lactalbumine Bos d 4 1-1,5 5 14,2 123 4,8Beta-lactoglobuline Bos d 5 3-4 10 18,3 162 5,3Immunoglobulines Bos d 7 0,6-1 3Sérum AlbumineBovine

Bos d 6 0,1-0,4 1 67 583 4,9-5,1

Lactoferrine 0,09 Traces 800 703 8,7Protéines

totales 36 100


1919

Les études réalisées sur des cohortes importantes de sujets allergiques au lait ont

montré que la plupart des patients sont sensibilisés à plusieurs protéines et principalement à

: la bêta-lactoglobuline « BLG » (Bos d 5), les caséines « CAS » (Bos d 8), l’alpha-lactalbumine

« ALA » (Bos d 4), SAB (Bos d 6), la lactoférrine LF, et les immunoglobulines « Ig » (Bos d 7)

(Goldman et al., 1963 a&b ; Gjesing et al., 1986 ; Kaiser et al., 1990; Host et al., 1992; Stoger

et Wüthrich, 1993 ; Wal et al., 1995 a&b ; Docena et al., 1996). Mais une grande variabilité

est observée dans la fréquence et l’intensité de la réponse. Toutefois des protéines

présentes en petite quantité comme la SAB, les Ig et surtout la lactoferrine apparaissent être

des allergènes importants puisque 35 à 50 % des patients sont sensibilisés à ces protéines et

parfois même à ces protéines seulement (Wal et al., 1995a; Gaudin et al., 2008).

3.2. LES ALLERGÈNES DU LAIT BOVIN

Vu leur structure tridimensionnelle, les protéines sont en effet sensibles à la

dénaturation qui est un processus entraînant la perte de cette structure, sous l’influence de

la chaleur, par exemple.

L’importance de ces changements structuraux s’observe lorsque l’on étudie

brièvement les interactions qui se produisent entre un allergène et les immunoglobulines IgE

spécifiques d’un patient allergique. La réaction allergique en elle-même se produit en effet

suite à la liaison d’une protéine contenant un allergène avec 2 molécules IgE. Cette liaison se

produit en des points très spécifiques de la protéine allergène, nommés épitopes.

Il est important de distinguer deux types d’épitopes, à savoir les épitopes linéaires et

les épitopes conformationnels. Les premiers, aussi appelés épitopes continus, se composent

d’une courte série de chaînes d’acides aminés ou peptides. Les épitopes conformationnels

ou discontinus dépendent de la structure tridimensionnelle des protéines. Il est clair que les

épitopes conformationnels sont nettement moins stables et peuvent donc disparaître par

dénaturation thermique, comme cela se porduit dans le cas de la BLG bovine. La structure

des épitopes linéaires, comme ceux présents dans l’allergène majeur des arachides Ara h 1,

n’est pas détruite par la dénaturation de la protéine. Ils gardent donc leur caractère

allergène (Eiwegger, 2006; De Meulenaer, 2006).


2020

3.2.1. La β-lactoglobuline (BLG)

C’est la principale protéine du lactosérum bovin (figure 8). Elle est la seule protéine

du lait de vache à n’avoir pas d’équivalent dans le lait humain (Kontopidis, 2004 ; Sawyer,

2003). Elle est naturellement présente sous forme d’un dimère de 36 kDa. Chaque sous-

unité correspond à une chaine peptidique de 162 résidus d’acides aminés. La molécule

possède 2 ponts disulfure et un résidu de cystéine libre. Cette structure est responsable des

principales propriétés physico chimiques de la BLG ainsi que des interactions qu’elle établit

avec la caséine durant, par exemple, les traitements thermiques. Sa relative résistance à

l’hydrolyse acide ainsi qu’à la dégradation par les enzymes digestives (pepsine) permet

qu’une petite fraction de la protéine soit absorbée intacte par la muqueuse intestinale.

Les lipocalines ont un fort pouvoir allergénique et de nombreux allergènes d’origine

animale font partie de cette famille. Ils ont en commun une séquence homologue bien

conservée dans la première moitié N-terminale de la molécule, avec un résidu de

tryptophane toujours présent en position 19 (Wal, 2011).

La BLG est stable à des pH acides et aux enzymes protéolytiques, laissant sa structure

inchangée pendant la digestion et, éventuellement sonpermet le passage intacte à travers la

barrière intestinale (Heyman, 2010). Dans ce sens, il semble que la majeure partie des

épitopes liant les IgE humaines, sur la structure tri-dimensionelle de la BLG, est située à la

surface de la molécule, suggérant que les importants sites de liaisons des IgE sur la de BLG

sont principalement conformationnels (Wal, 1998).

De nombreuses études ont été menées pour déterminer les épitopes allergéniques

sur la molécule de la BLG. La principale approche utilisée consiste à hydrolyser la BLG, puis à

mesurer la capacité de chaque peptide à se lier à des IgE issues de sérums de patients

allergiques au lait (Selo et al., 1998; Wal, 2002). Ainsi, Selo et al. (1999) ont identifié cinq

peptides allergéniques dans un hydrolysat trypsique de la BLG. Ces peptides sont le fragment

1-8, 25-40, 41-60, 102-124 et 149-162, reconnus par 58, 72, 92, 97 et 89% des sérums testés.


2121

Figure 8 : Structure moléculaire d’un monomère de β-lactoglobuline. D’après Brownlow etal. (1997).


2222

Les séquences 21-40, 41-60, 107-117 et 148-162 ont aussi été identifiées comme les

plus allergéniques chez le rat (Davies, 1996 ; Miller et al., 1999). Une autre approche, basée

sur l’utilisation de peptides synthétiques, a permis de valider la présence de séquences

linéaires allergéniques sur la BLG. Un peptide allergénique majoritaire (séquence 95-113) et

deux minoritaires (séquences 12-27 et 124-135) ont été déterminés par Heinzmann et al.

(1999). La séquence 97-108 a aussi été rapportée comme très allergénique par Ball et al.

(1994). Järvinen et al. (2001) ont rapporté sept séquences allergéniques, dont quatre sont en

accord avec celles déterminées par Selo et al. (1998) (Fig. 9a & b). Dans la structure

tridimensionnelle de la BLG, trois épitopes majoritaires décrits par Selo et al. (1999) sont

disposés à la surface de la molécule, ce qui explique qu’à l’état natif, la BLG soit très

allergénique.

Les épitopes allergéniques sont responsables de l’apparition des symptômes

d’allergies. La modification et/ou la destruction de ces épitopes font partie des stratégies

intéressantes pour prévenir les allergies.

3.2.2. L’-lactalbumine (ALA)

L’α-lactalbumine (ALA) est une protéine globulaire monomérique de 14,4 kDa

comportant 123 résidus d’acides aminés et 4 ponts disulfure intra moléculaires (figure. 10).

C’est un composé qui intervient dans la régulation de la synthèse enzymatique du lactose

par la galactosyl transférase (Wal, 2011). L’ALA possède un site de liaison de forte affinité

pour le calcium et cette liaison stabilise sa structure secondaire. La séquence enacides

aminés de l’ALA montre une importante homologie avec celle du lysozyme de blanc d’œuf

mais aussi avec l’ALA humaine (Browne et al., 1969; Brew et al., 1970; Findlay et Brew,

1972 ; Nitta et Sugai, 1989).

Pour l’-lactalbumine, la réponse IgE est très hétérogène et la prévalence rapportée

dans la littérature est très variable allant de 6% à 100% (Baldo, 1984; Host, 1992; Wal,

1995b; Docena, 1996). Plusieurs études ont exploré la présence d’épitopes majeurs

reconnus par les IgE humaines de patients allergiques. Les études menées par Jarvinen et al

(2001) et Hochwallner et al. (2010) ont pu démontrer la présence de quatres épitopes

majeurs de l’-lactalbumine liant les IgE : Glu1-Cys16, Lys13-Trp26, Ser47-Lys58 et Lys93-

Asp102.


2323

Figure 9a : Localisation des séquences allergéniques sur la structure primaire du variant B dela β-lactoglobuline bovine. Séquences allergéniques déterminées par Selo et al. (1999) (engris), Heinzmann et al. (1999) (trait plein), et Järvinen et al. (2001) (trait pointillé).

Figure 9b : (A) Localisation de deux épitopes monovalents dans le dimère de BLG. (B) Lessites de liaison des épitopes de BLG aux IgE. Les résidus entrant en contact sont représentésen rouge, et ceux masqués lors de la liaison de la BLG avec les IgE sont représentés enorange. Les segments sont énumérés de 1 à 6. D’après Merja (2007).


2424

L'étude de Maynard et al. (1997) a montré que la séquence Gly17-Lys58 et les

peptides issus de la digestion tryptique ont été le plus fortement et fréquemment reconnu

par les IgE. Adams et al. (1991) ont montré que le peptide synthétique Lys5-18Ala18 contient

un épitope se liant aux IgE. En plus des peptides IgE-réactives, qui forment un grand cluster

d’IgE-réactives, il a été montré que les patients ont présenté une réactivité des IgE à Asn45-

Asp64, Lac5 trp60-Lys79, et Lac7 Met90-Ala109. La maîtrise des épitopes reconnus par les

IgE de patients allergiques pourrait être d’une grande pertinence pour l’élaboration et la

mise en place de vaccins peptidiques antiallergiques (Valenta, 2002; Focke, 2004; Edlmayr,

2009)

3.2.3. Lactoferrine (Lf)

La lactoferrine (Lf) est une glycoprotéine de 689 acides aminés dont la teneur dans le

lactosérum bovin est de 0,10 g/L, soit environ 1% des protéines totales du lactosérum

(Zimecki & Kruzel, 2007). Elle possède une grande affinité pour le fer, fixant 2 atomes de fer

par molécule, et se retrouve sous forme saturée en fer (20-25%) dans des conditions

physiologiques normales (Chan & Li-Chan, 2007).

Cette aptitude à fixer le fer lui confère des propriétés bactériostatiques importantes,

car elle limite la disponibilité de cet ion essentiel au développement de nombreuses

bactéries (Lônnerdal, 2004). La lactoferrine existe sous forme endogène, en constituant par

exemple une des composantes majeures des granules secondaires des neutrophiles (Paul-

Eugène et al., 1993), mais aussi sous forme exogène de par sa présence dans certaines

sécrétions telles que le lait, les larmes, le mucus et la salive (Masson et al., 1966). Les

principales propriétés biologiques de la Lf ont été revues par Zimecki & Kruzel (2007):

propriétés antibactériennes, antifongiques, antiparasitaires, anti-cancérigènes,

immunorégulatrices et anti-inflammatoires. Cette protéine possède également des

propriétés anti-virales et permet d'améliorer l'absorption des nutriments dans l'intestin du

jeune enfant (Lônnerdal, 2004). Certaines propriétés biologiques sont exercées par la

lactoferricine (Lfc), un peptide libéré lors de l'hydrolyse de la lactoferrine par la pepsine et

dans des conditions acides (Gifford et al., 2005). Ce peptide est donc produit de façon

naturelle lors de la digestion gastrique de la lactoferrine. Les propriétés de la Lfc ont été

revues par Gifford et al. (2005): propriétés antibactériennes, antifongiques, antiparasitaires,

antivirales, anti-cancérigènes et immunomodulantes.


2525

4. TRAITEMENTS TECHNOLOGIQUES POUR RÉDUIRE L’ALLERGÉNICITÉ DES

PROTÉINES DU LAIT

Les allergènes alimentaires et leurs épitopes peuvent être assez résistants aux effets

de la transformation industrielle des aliments et de la digestion (Taylor, 1987; 2001).

Il a été suggéré cependant, que cette résistance aux procédés industriels, culinaires

puis à la digestion gastro-intestinale est une caractéristique commune des allergènes

alimentaires. L’idée sous-jacente est que les allergènes alimentaires doivent atteindre le

système immunitaire intacts, ou du moins sous une forme capable d’y induire une réponse

immunitaire spécifique (Astwood, 1996; Sampson, 2004).

Par ailleurs l’un des objectifs des traitements technologiques industriels est

l’élimination de l’allergénicité des protéines alimentaires afin qu’elles ne soient plus

reconnues par les IgE. Cependant, étudier les effets des différents traitements que subissent

les aliments sur leur allergénicité permet également de mieux comprendre la relation entre

la structure d’une protéine et son allergénicité.


2626

Figure 10 : Position des peptides les plus fréquemment reconnus par les IgE humaines, LAC1(rouge), LAC2 (bleu) et LAC8 (vert), dans la structure en ruban : présentation (Fig. 10 A & C)et dans la présentation moléculaire (Fig. 10, B & D). D’après Hochwallner et al., (2010).

LAC1: 1-20LAC2: 15-34LAC8: 105-123


2727

4.1. EFFETS DES TRAITEMENTS THERMIQUES

De manière générale, la caséine bovine est globalement thermostable alors que la

BLG est thermolabile mais elle peut être protégée du fait des interactions avec les caséines.

En conséquence les protéines et leur allergénicité sont affectées considérablement par les

facteurs suivants: les caractéristiques intrinsèques des protéines, la température et la durée

des traitements thermiques, et les conditions physico-chimiques de l'environnement

prenant en considération l’interaction au sein de la matrice alimentaire dans laquelle les PLV

sont intégrées (Wal, 2003; Poms & Anklam, 2004; Wal, 2011).

Cependant différentes études ont montré que la capacité de la BLG à se lier aux IgE

de patients allergiques (qui reflète en partie son allergénicité) n’est jamais abolie par les

traitements thermiques (Taheri-Kafrani, 2009).

De ce fait, elle peut être diminuée (de 50 à 75%) par un chauffage à 74 ou à 90°C soit

de la protéine isolée et mise en solution dans de l’eau soit du lait lui-même (Paajanen et al.,

2003). Les expérimentations menées lors du Programme Européen Allergest ont montré qu’il

en était de même pour un traitement à ébullition pendant 5 minutes (figure 11). Par ailleurs

Sélo et al. (1999) avaient montré qu’une dénaturation complète de la BLG par réduction

chimique n’altérait pas sa capacité de liaison aux IgE et pouvait même l’augmenter. Ces

observations confirment la présence sur la BLG d’épitopes linéaires, qui sont thermostables

voire démasqués lors du chauffage.

Wal et al. (2003) ont démontré que les étapes progressives de la dénaturation des

protéines (figure 12) au cours du processus de chauffage est la suivante: perte de la

structure tertiaire, dénaturation réversible, perte des structures secondaires (55-70°C),

clivage de ponts disulfure (70-80°C), formation de nouvelles interactions intra-

/intermoléculaires nouvelles, réarrangements des ponts disulfure (80-90°C), puis formation

d'agrégats à partir de 90-100°C. Cependant, ces étapes ne s'appliquent pas à toutes les

protéines qui sont résistantes au traitement thermique (Davis et al., 2001; Sathe & Sharma,

2009).


2828

Figure 11 : Effets des traitements thermiques sur l’allergénicité des PLV d’après Mondoulet

et al., (2005) (résultats non publiés). Projet « Allergest ». A : ß lactoglobuline ; B : Caséine.

Courbe bleue : lait écrémé cru. Courbe rouge : lait écrémé bouilli. L’allergénicité de la

protéine est exprimée par sa capacité de liaison aux IgE de patients allergiques mesurée par

un test ELISA d’inhibition.

Des quantités croissantes d’inhibiteur, c'est-à-dire de BLG ou de CAS provenant soit de lait

cru (courbes bleues) soit de lait bouilli (courbes rouges) sont alors ajoutées et entrent en

compétition pour cette liaison aux IgE avec la protéine native qu’elles déplacent

progressivement. La quantité d’inhibiteur nécessaire pour déplacer 50% de la liaison

(indiquée par des flèches) est d’autant plus élevée que l’allergénicité de l’inhibiteur est

faible. On voit donc l’impact (limité) du chauffage à ébullition du lait qui diminue

partiellement l’allergénicité de la BLG alors que ce traitement n’affecte pas l’allergénicité de

la caséine.


2929

Figure 12 : Représentation schématique de l’effet thermique sur la β-Lg à pH > 6.8 et unetempérature comprise entre 20 et 150 °C (De Wit, 2009).


3030

4.2. DIGESTION ENZYMATIQUE DES ALLERGÈNES

L’hydrolyse enzymatique est une méthode appropriée pour la préparation de

peptides à façon, non seulement à cause de la disponibilité d’enzymes à grande échelle et à

des coûts de plus en plus modérés, mais aussi grâce à la grande qualité de ces produits. Un

avantage très important est la possibilité de pouvoir diriger l’hydrolyse vers des peptides

particuliers souhaités en utilisant des enzymes avec des spécificités déterminées. L’hydrolyse

enzymatique est aussi sous l’influence d’autres paramètres de contrôle tels que la

température, le pH, le rapport enzyme/substrat (E/S) et le temps d’hydrolyse (Liaset et al.,

2000).

Lors de l’hydrolyse enzymatique, les liaisons peptidiques des protéines sont clivées

en milieu aqueux, la réaction étant catalysée par des protéases. Un équivalent d’un

groupeme -carboxyl ainsi qu’un groupe -aminé est formé par le clivage d’un équivalent

d’une liaison peptidique. A noter que les peptides nouvellement formés peuvent être de

nouveaux substrats pour l’enzyme (Adler-Nissen, 1982).

Les enzymes utilisées pour l’hydrolyse des protéines sont classées en tant que

protéases et se voient attribuer les nombres E.C 3.4. dans la classification internationale «

Enzyme Commission». Dans l’hydrolyse enzymatique, le taux de clivage des liaisons

peptidiques dépend principalement de deux facteurs: la spécificité de l’enzyme et

l’accessibilité aux liaisons peptidiques (Adler-Nissen, 1986). Parmi les enzymes

protéolytiques nommées protéinases, protéases, ou peptidases, on retrouve deux groupes:

les endopeptidases et les exopeptidases.

4.2.1. Les enzymes d’origine animale

Les enzymes d’origine animale (porcine et bovine) sont principalement la trypsine, la

chymotrypsine, issues du pancréas et la pepsine, issue de la muqueuse gastrique. Ces trois

enzymes sont des endoprotéases présentant des spécificités différentes. La trypsine a une

affinité pour la lysine et l’arginine, la chymotrypsine pour les acides aminés aromatiques

(Phe, Tyr, Trp) et la pepsine principalement pour les acides aminés hydrophobes (Alder-

Nissen, 1982). La pepsine est l’enzyme d’origine animale la plus largement utilisée. Son

utilisation à pH acide présente l’avantage de limiter la contamination microbienne mais

l’étape de neutralisation entraîne de hautes teneurs en cendres préjudiciables pour

déboucher sur la production de peptones (Dufosse et al., 1997).

3131


4.2.2. Les protéases d’origine végétale

Les plus connues sont la papaïne, la bromélaïne, et la ficine. Ces protéases

permettent d’obtenir des hydrolysats de bonne qualité mais leur production dépend de

nombreux facteurs externes tels que les conditions de culture, le cycle de croissance, les

recommandations climatiques, ce qui peut susciter des problèmes de coût et

d’approvisionnement. Ces enzymes ne sont pas spécifiques. La ficine s’avère peu stable dans

le temps. La papaïne, plutôt adaptée à des protéines prédigérées, peut conduire au stade

acide aminé libre et poser des problèmes d’amertume (Durand, 1982).

L'efficacité de la réaction d'hydrolyse et les propriétés finales de l'hydrolysat

protéique reposent sur de nombreux facteurs, dont la nature du substrat protéique, la

spécificité de l'enzyme utilisée, les conditions du milieu réactionnel (pH, température, force

ionique, rapport enzyme/substrat) et la durée de la réaction. De ce fait, les conditions du

milieu réactionnel sont généralement ajustées en fonction du substrat et de l'enzyme

sélectionnés. En fait, la spécificité de l'enzyme est le critère principalement utilisé pour

exercer un certain contrôle sur le profil des peptides libérés. Les endoprotéases de sources

animales (ex: pancréatine, trypsine, chymotrypsine), végétales (ex: papaine, bromeline) et

bactériennes (ex: alcalase, neutrase) sont les enzymes les plus utilisées pour la fabrication

des hydrolysats protéiques à l'échelle industrielle, bien que certaines préparations

enzymatiques contiennent également des exoprotéases (ex: flavourzyme, debiterase)

destinées à réduire l'amertume des hydrolysats protéiques (Mercier, 2004).

Les procédés par hydrolyse enzymatique des matrices alimentaires complexes

comme le lait, peuvent également aider à éliminer l’allergénicité des protéines. Les

conditions préalables sont un contact assez suffisant entre l’enzyme et l’allergène ou

l’épitope (durée d’hydrolyse).

Des hydrolysats de protéines de lait de vache « PLV » préparés par hydrolyse

enzymatique contrôlée à l’aide de protéases comme la trypsine sont également utilisés dans

des formules dites hypoallergéniques. Il est en effet généralement reconnu qu’une hydrolyse

intensifs des PLV réduit considérablement leur allergénicité.

Cependant il a été constaté que les produits de la digestion des protéines du

lactosérum (BLG ou ALA) comme de la fraction caséine conservaient tout ou une partie de


3232

leur allergénicité et que certains fragments peuvent même être mieux reconnus par les IgE

que la protéine intacte (Haddad et al., 1979; Spuergin et al., 1996; Maynard et al., 1997; Selo

et al., 1998 & 1999). Les résultats obtenus avec les formules hydrolysées dépendent en fait

des enzymes utilisées pour leur préparation et surtout du degré d’hydrolyse appliqué. La

fréquence des réactions indésirables observées chez des bébés allergiques nourris avec des

formules à base de PLV (protéines du lactosérum ou caséines) soit partiellement soit

complètement hydrolysées est de l’ordre de 45 à 65% et 15% respectivement (Oldaeus et al.,

1991; Ragno et al.,1993; De Boissieu et al., 1997).

Lorsqu’il s’agit d’hydrolysats partiels on peut penser que la réactivité est due à la

présence de résidus de protéine intacte non dégradée ou de fragments de masse importante

qui en sont dérivés. Dans le cas d’hydrolyse intense, ces formules ne contiennent plus de

trace de la protéine native ni de gros fragments polypeptidiques, la réaction allergique peut

dès lors avoir été provoquée par un ou des petits peptides formés lors de la protéolyse

comprenant encore un épitope liant les IgE.

4.3. FERMENTATION BACTÉRIENNE

La fermentation par des lactobacilles peut affecter l'allergénicité des protéines dans

deux aspects: le clivage de la protéine par des protéases et la modification de la structure

des protéines en diminuant le pH de la solution par la production de l’acide lactique.

L'allergénicité de la β-lactoglobuline dans le yaourt a été sensiblement réduite par rapport à

celle du lait fermenté (Ehn et al., 2004, Chekroun et al., 2011). Dans une autre étude,

l'allergénicité du lactosérum doux et du lait écrémé a été réduite de plus de 70% et 90%,

respectivement (Kleber et al., 2006). Ce phénomène résulte de la combinaison d'un faible pH

et de l'activité protéolytique des lactobacilles. Le système protéolytique des bactéries

lactiques est essentiel afin d’assurer leur croissance dans le lait. Les enzymes de lactobacilles

peuvent inclure les protéases (endopeptidases, dipeptidases, tripeptidases et

aminopeptidases). Ainsi, des tri-et dipeptides sont générés par la fermentation des protéines

du lait par des lactobacilles, certains épitopes linéaires dans les allergènes du lait peuventt

éventuellement être détruits par ce système protéolytique (Law & Haandrikman, 1997;

Pescuma, 2011 El-Ghaish et al., 2011). Dans certains cas, le traitement protéolytique reste

insuffisant pour réduire l'allergénicité des protéines alimentaires comme cela a été décrit

dans la littérature pour l'arachide et pour les protéines du lait. Le contact insuffisant des

3333


protéases spécifiques avec leur substrat (épitope) peut expliquer en partie le manque

d’efficacité de ces procédés biochimiques (Brenna, 2000; Maleki, 2000).

5. NOUVEAUX PROCÉDÉS INDUSTRIELS APPLIQUÉS AUX ALIMENTS ET

IMPACT SUR L’ALLERGÉNICITÉ

Depuis une dizaine d'années, pour répondre aux préoccupations croissantes des

consommateurs, les grands groupes agroalimentaires ne cessent de développer sur le plan

technologique des méthodes de conservation d’aliments afin d’améliorer la qualité

sensorielle de ces derniers. Les technologies les plus récentes sont le traitement haute

pression (HPP), le traitement sous champ électromagnétique pulsé (PEF) et les micro ondes

(MO).

5.1. TRAITEMENT PAR LES HAUTES PRESSIONS

Ces nouveaux procédés peuvent influencer l'allergénicité des aliments,

principalement en modifiant la conformation et la stabilité des protéines. Parmi ces

traitements, il y a la haute pression.

Ce traitement non thermique peut entrer en compétition avec le traitement

thermique conventionnel, pour la réduction de la population microbienne en maintenant les

qualités organoleptiques (Préstamo et al., 2007) et en préservant les nutriments

thermolabiles tels que les vitamines (Kimura et al., 1994).

Les hautes pressions peuvent affecter la conformation des protéines et peuvent

conduire à une dénaturation des protéines, l'agrégation ou la gélification, selon la protéine,

la pression appliquée, la température et la durée de traitement sous pression. En général, les

effets réversibles sont observés en dessous de 200 MPa (par exemple, la dissociation des

structures polymériques en sous-unités) tandis qu'au-dessus 200 MPa, des effets

irréversibles peuvent conduire à l'inactivation complète d'enzymes et à la dénaturation des

protéines (Balny, 1993; Messens, 1997).

3434


5.2. TRAITEMENT PAR MICRO-ONDES

Les micro-ondes se situent entre le rayonnement infrarouge et les ondes radio dans

les régions du spectre électromagnétique. Se sont des ondes d’énergie

électromagnétiqueregroupant les longueurs d’ondes comprises entre 0,001 et 1,0m, ce qui

correspond à des fréquences qui varient entre 30 et 300MHz (Zlotorzynski, 1995; Meredith,

1998; Amiot et al., 2002).

Le principe d’un traitement micro-ondes repose sur l’émission d’ondes

électromagnétiques dont l’énergie est absorbée par les molécules d’eau bipolaires et les ions

(Ohlsson et Bengtsson, 2001). L’élévation de température constatée est la conséquence de

l’augmentation de l’agitation moléculaire des dipôles et des ions qui s’orientent ou se

déplacent alternativement à la fréquence imposée par le champ électromagnétique

(Margolis et al., 1991).

La combinaison de l’effet thermique et d’une augmentation des forces rotationnelles

produites par les micro-ondes sur les liens peptidiques peut catalyser efficacement

l’hydrolyse de ces derniers tout en préservant l’intégrité et la stabilité des acides aminés

(Margolis et al., 1991). La même constatation a été faite par Karmee (2006) qui a suggéré

que la stabilité de l’enzyme est meilleure sous micro-ondes que lors d’un chauffage

conventionnel.

Ces dernières années, le nombre de procédés industriels qui combine et l'utilisation

des micro-ondes et des réactions organiques, pour plus d’avantages par rapport aux autres

méthodes conventionnelles, a énormément augmenté. Ainsi, comme l’indique la figure 13,

le nombre de publications scientifiques relatives à ces sujets a été très faible jusqu'à la fin

des années 1990, mais l'intérêt a augmenté de façon importante au cours de la dernière

décennie, et plus particulièrement dans les cinq dernières années.

Il faut noter que les traitements micro-ondes ont été appliqués dans divers

protocoles en rapport avec les sciences biologiques : coloration et décoloration de gels et

membranes PVDF (Nestavy et al., 2002), immunohistochimie et fixation de tissus (Patterson

et Bulard, 1980; Login et dvorak, 1994; Hafajee et Leong, 2004; Emerson et al., 2006; Temel

et al., 2006), caractérisation des lipases (Roy et Gupta, 2003).

3535


Ces rayonnements ont également été utilisés dans la conservation des aliments en

supprimant les organismes parasites comme les charançons dans les farines ou encore les

œufs d’insectes dans les dattes (Reynes et Tabuna, 1996).

Dans le domaine de la décontamination bactérienne, des études ont montré que les

micro-ondes, appliquées dans les mêmes conditions de température qu’un chauffage

traditionnel, ont un effet bactéricide plus important que ce dernier (Atmaca et al., 1996 ;

Salvatorelli et al., 1996). Certains auteurs (Dreyfuss et Chipley, 1980; Khalil et Villota, 1988;

Kozempel et coll., 1998; Tajchakavit et al., 1998) pensent qu’il existe un effet bactéricide non

thermique des micro-ondes.

Récemment, en dehors de leurs utilisations dans les réactions biologiques, les

rayonnements micro-ondes sont utilisés pour assister les réactions organiques (Langa, 2000;

Lidström, 2000) et d’hydrolyse utilisant des enzymes telles que les lipases ou protéases

(Carillo-Munoz et al., 1996; Nini et al., 2001).

Différentes études de l’effet des micro-ondes dans la réduction de l’immunoreactivité

des protéines du lait de vache ont été entreprises. Kaddouri et al., (2006) ont démontré une

diminution de la réactivité vis-à-vis des IgG anti BLG et des IgG anti ALA du lactosérum issu

3636


Figure 13 : Evolution des publications scientifiques sur l’utilisation des micro-ondes associéeaux réactions organiques (Source: Scopus®), (Menéndez, 2010).

3737


d’un lait traité par les micro-ondes à différentes puissances, et ont relié cela à une

dénaturation et une perte de la solubilité des protéines du lactosérum.

Bien que les mécanismes réels des micro-ondes impliqués dans la catalyse des

réactions enzymatiques ou organiques demeurent mal connus, l’utilisation des micro-ondes

en protéomique deviendra une technique de routine, et présentera un certain avantage

quant à son utilisation à l’échelle industrielle grâce au gain de temps et d’énergie (Saxena et

al., 2005; Lill et al., 2007).

5.3. IRRADIATION PAR RAYON GAMMA ()

L'irradiation a été utilisée dans l'industrie alimentaire pour inactiver les microbes et

les enzymes pour une meilleure conservation des aliments (Poms & Anklam, 2004). Bien que

les épitopes conformationnels des protéines peuvent être détruits, les épitopes linéaires

arrivent encore à maintenir leur intégrité, même si la dose d'irradiation est très élevée

(Kume & Matsuda, 1995). Certains épitopes linéaires enfouis dans les protéines peuvent être

davantage exposés au cours du traitement par irradiation, ce qui peut augmenter

l'allergénicité des protéines (Lee et al., 2002; Kaddouri et al., 2008). Après avoir été exposées

à une irradiation, les protéines peuvent former un agrégat et leur solubilité diminue (Poms &

Anklam, 2004; Kaddouri, 2008). Le précipité formé de protéines conserve toute son

allergénicité et des épitopes linéaires peuvent être libérés après digestion dans le tractus

gastro intestinal.

6. LES STRATÉGIES DE TRAITEMENT ET DE PRÉVENTION DE L’APLV

6.1. LE TRAITEMENT DE L’ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE

Pour le traitement de l’allergie aux protéines du lait de vache, il est nécessaire

d’éviter totalement les protéines allergisantes sous toutes leurs formes, en particulier sous

forme d’ingrédients d’aliments comme les margarines. Des régimes très précis ont été

publiés (Moneret-Vautrin, 1999) (Tableau 2). Il a été recommandé de n’utiliser que les

produits ayant fait la preuve de leur tolérance chez au moins 90 % des enfants allergiques au

lait, avec un intervalle de confiance de 95 %. Seuls les hydrolysats intensifs de caséine

satisfaisaient jusqu’à récemment à cette exigence (Kleinman, 1991; Martin-Estéban, 1998).

De tels hydrolysats ne devraient pas contenir de lactose, pouvant être contaminé par des

3838


protéines (Berthold et al., 2005 ; Guarino et al., 2008), le rôle de ces contaminants

protéiques dans l’entretien d’une APLV étant certain (Frémont, 1996).

Les Formules intensivement hydrolysées (FIH)

Ce sont des préparations dont les protéines ont subi une hydrolyse intensive et dont le

sucrage est à base de dextrine-maltose et d’amidon sans gluten, sans lactose. La plupart

comportent des triglycérides à chaîne moyenne (Chouraqui, 2005, 2007). Ces formules sont

utilisées exclusivement chez des enfants ayant une allergie avérée aux protéines du lait de

vache. Ces hydrolysats sont donc utilisés dans des buts curatifs alors que les laits

hypoallergéniques sont utilisés dans la prévention (Host et al., 1999).

Leurs indications sont très précises : réalimentation de diarrhée aiguë chez le

nourrisson de moins de 3 mois, diarrhées graves prolongées, diarrhées rebelles, syndrome

de malabsorption globale et/ou lipidique, syndrome du grêle court, mucoviscidose,

cholestases chroniques, allergie aux protéines du lait de vache (Chouraqui, 2005).

L’utilisation des hydrolysats intensifs de protéines du lait de vache dans la prévention

de l’allergie se fonde sur leur qualité nutritionnelle, combinée à une réactivité

immunologique indiquant des taux de BLG équivalents à ceux retrouvés dans le lait de

femme (Host et al., 1990).

Les études randomisées et contrôlées évaluant l’efficacité de formules intensivement

ou partiellement hydrolysées dans la prévention allergique primaire ont toujours inclus des

enfants à haut risque d’allergie et ont évalué ces hydrolysats soit comme seule intervention,

en normalisant les autres recommandations hypoallergéniques (Vandenplas et al., 1992;

Oldaeus et al., 1997; Halken et al., 2000), soit comme partie d’un régime d’intervention

combiné (Hide et al., 1996).

3939


Tableau 2 : Laits hypoallergéniques et hydrolysats de protéines d’après Moneret- Vautrin etal. (2008)


4040

6.2. LA PRÉVENTION DE L’ALLERGIE AUX PROTÉINES DU LAIT DE VACHE

La prévention de l’allergie aux protéines du lait de vache pourrait être envisagée avant la

naissance puisque la sensibilisation in utero est possible. La prévention de l’APLV doit

envisager les mérites comparés de l’allaitement au sein lorsqu’il existe des antécédents

familiaux. Le nouveau-né peut être alimenté avec des laits hypoallergéniques à condition

d’en poursuivre l’utilisation sans interruption et exclusivement jusqu’à l’âge de 6 mois,

tandis que la diversification alimentaire est reculée après 6 mois (Baumagartner et al., 1998;

Von Berg et al., 2003; Osborn et Sinn, 2004; Von Berg et al., 2007).

L’allaitement au sein réduit le risque sans l’annuler (Host, 1994; Saarinen et al.,

1999). Il existe un consensus pour le recommander comme le meilleur moyen de prévention

dans la population générale et chez les enfants à risque d’APLV. Un hydrolysat partiel en

complément ou en remplacement de l’allaitement au sein assure un effet préventif

équivalent (Ragno et al., 1993; Vandenplas et al., 1995). Le choix d’un lait doit alors

s’appuyer pour chaque enfant sur des critères de composition, d’avantages scientifiquement

établis et de tolérance de l’enfant, en évitant les changements intempestifs aussi inutiles

que délétères (Chouraqui, 2002, 2005).

Laits hypoallergéniques (HA)

Les laits hypoallergéniques ou laits HA sont caractérisés par une hydrolyse partielle des

protéines qui ne laisse subsister que des protéines de poids moléculaire inférieur à 5000-

10000 daltons. Un traitement thermique peut être associé pour diminuer encore

l’allergénicité de certains peptides (Dutau et al., 1999).

Sur le plan nutritionnel, un lait HA est proche d’un lait premier âge: la croissance

staturo-pondérale est identique. Le but théorique de ces laits HA est de réduire le risque

d’allergie aux protéines du lait de vache (Von Berg et al., 2007). À 6 mois et 1 an le risque de

manifestations atopiques est réduit au ¼ sous lait hypoallergénique par rapport à une

formule standard et à 60 mois cette réduction est de 65 %. En revanche, l’utilisation

prolongée (minimum 3 mois, de préférence 6 mois) de lait HA chez des enfants à risque

atopique réduit significativement l’incidence de l’allergie pendant l’enfance, de l’eczéma, de


4141

l’allergie aux protéines du lait de vache et de l’asthme. Les laits hypoallergéniques peuvent

également être proposés en complément transitoire lors de l’initiation d’un allaitement

maternel (Chouraqui, 2005).

6.3. LES RISQUES ALLERGIQUES DES HYDROLYSATS PARTIELS ET INTENSIFS

Les allergies aux hydrolysats sont connues depuis plus de dix ans. Les manifestations

cliniques sont identiques à celles de l’APLV : choc anaphylactique, urticaire, wheezing,

entérocolite hémorragique (De Boissieu, 1997; Sotto, 1999; De Boissieu, 2000). Deux cas

mortels ont été décrits (Tarim, 1994; Bruel, 1998). Les formes digestives sont fréquentes : 83

% des enfants présentent des vomissements ou de la diarrhée, et un tiers accuse un retard

staturo-pondéral (Tarim, 1994; Vanderhoof, 1997; Sotto, 1999).

On observe également des accès postprandiaux de pâleur et d’hypotonie. Une

hyperperméabilité intestinale est notée dans 80 % des cas (Barau, 1994; Ammar, 1999). La

dermatite atopique pourrait représenter une forme d’allergie aux hydrolysats en progression

de fréquence (Hill, 1995). L’âge de survenue est le même que celui de l’APLV : de deux jours

à quatre mois. L’allergie survient aussi bien chez des enfants n’ayant pas reçu

antérieurement de lait adapté, que chez des nourrissons ayant déjà une APLV (De Boissieu,

2000). Le fait que 73 % des enfants allergiques aux hydrolysats aient simultanément d’autres

allergies alimentaires peut faire évoquer un terrain atopique particulièrement accentué. La

moitié des enfants a des tests cutanés positifs, et 43 % ont des réactions immédiates lors du

test de provocation (De Boissieu, 2000).

Des cas d’allergie ont été décrits avec un hydrolysat d’alpha-lactalbumine (Heyman,

1990), et avec des hydrolysats de PLS tels que Alfarét (Businco, 1989; Elis, 1991; Schwartz,

1991 ; Businco, 1994), Peptijunior et Prégominet (Barau, 1994; Ammar, 1999). Dans tous ces

cas, les prick-tests sont clairement positifs. Ils ont parfois été complétés par des techniques

in vitro : des IgE spécifiques ont été mises en évidence pour différents hydrolysats (Schwartz,

1980).


4242

7. TESTS BIOLOGIQUES DANS LES MALADIES ALLERGIQUES

Les maladies allergiques représentent un spectre d’affections auxquelles le médecin

praticien, généraliste ou spécialiste, est souvent confronté. Ces affections qui ont un impact

sur la qualité de vie de nombreux patients se caractérisent par une grande variété de

présentations cliniques (symptômes respiratoires, digestifs, cutanés, et/ou généraux), de

mécanismes étio-pathogéniques (dégranulation mastocytaire, réactions cytotoxiques et/ou

à complexes immuns, hypersensibilité retardée etc..) et de gravité (dermatite de contact,

rhinite, choc anaphylactique).

L’étape clinique comprend tout d’abord un interrogatoire et un examen clinique. Les

manifestations, et notamment une anaphylaxie aigüe, consécutives à l’ingestion isolée d’un

aliment sont particulièrement évocatrices. Toutefois, dans la majorité des cas, les

incertitudes liées aux manifestations et à la rencontre avec l’aliment rendent nécessaires

l’utilisation de tests complémentaires aux premières investigations. Il s’agit de l’étape

biologique (Rancé, 2009).

7.1. TESTS in vivo

7.1.1. Tests cutanés

Les tests cutanés d’allergie consistent à mettre en contact les mastocytes dermiques

avec les allergènes à tester. Si les mastocytes sont porteurs des IgE spécifiques

correspondantes, une dégranulation spécifique est induite provoquant la libération des

différents médiateurs chimiques contenus dans les granules. Ce phénomène est responsable

de modifications cutanées liées à l’inflammation, notamment l’apparition d’un œdème dont

on mesure la papule en millimètres. L’induction de la réaction allergique est locale. Elle

écarte tout risque de réactions systémiques sévères, et permet d’envisager le test simultané

de différents aliments/protéines, éventuellement avant/après modifications.

Parmi les tests cutanés, les méthodes les plus fréquemment utilisées sont le «skin-prick test

» (SPT) : un extrait protéique en solution issu de l’aliment suspecté est déposé sur l’avant

bras ou sur le dos du patient. Une petite effraction de l’épiderme est réalisée à l’aide d’une

petite pointe cylindrique calibrée d’un millimètre de diamètre, permettant de mettre en

contact l’allergène avec les mastocytes cutanés (Osterballe, 1979). Des témoins négatifs

(diluant) et positifs (histamine, 1 mg/mL) servent d’éléments de comparaison pour apprécier


4343

la significativité et l’amplitude de la réaction allergique. Les résultats finaux sont relevés par

rapport à ces témoins au bout de 15 minutes (Dreborg, 2001). La réaction est considérée

comme positive si le diamètre de l’induration est supérieur d’au moins 3 mm à celui du

témoin négatif (Dreborg, 2001). Le SPT est sensible, mais s’avère peu spécifique. Jusqu’à

35% des patients dont le SPT est positif n’ont pas d’allergie confirmée par test de

provocation orale en double aveugle, et les résultats sont fortement dépendants de

l’allergène et de la qualité de l’extrait allergénique utilisé (Norgaard, 1992; Kim, 2002;

Ballmer, 2003).

7.1.2. Test de provocation orale et labiale

Le test de provocation apparaît dès lors comme la méthode de référence («gold

standard») pour confirmer le diagnostic des allergies alimentaires. Il permet d’authentifier

l’allergie alimentaire en reproduisant les symptômes cliniques et en précisant la dose

réactogène.

Le test de provocation labiale utilise les caractéristiques anatomiques des lèvres :

importante vascularisation, richesse en mastocytes et faible kératinisation du versant

externe (Rancé et Dutau, 1997). Il s’agit d’un test de contact de l’aliment avec la muqueuse

labiale dont le but est de produire des réactions locales, reflet de l’expression de la réponse

IgE à l’allergène. Le test de provocation labiale est intéressant chez l’enfant pour sa

simplicité de réalisation et sa rapidité d’exécution et de ce fait, pour son faible coût.

Le test consiste donc à appliquer pendant une durée de dix secondes à deux minutes,

selon le risque encouru, l’extrait alimentaire sur la commissure externe de la lèvre

inférieure. La bouche doit rester entrouverte, à l’aide d’un morceau de coton interposé

entre la gencive et la lèvre inférieure. Le patient ne doit pas parler durant l’application de

l’aliment. Il peut utiliser l’extrait commercial ou l’aliment frais. Les stades de positivité sont

au nombre de cinq (Rancéet Dutau, 1997) :

• Stade 1 : déplissement de la lèvre inférieure

• Stade 2 : plaque d’érythème sur la lèvre

• Stade 3 : urticaire de la joue et du menton

• Stade 4 : œdème gagnant la joue, rhinite, larmoiement

• Stade 5 : réaction systémique, prurit sur la zone d’eczéma, toux, asthme.

4444

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES7.2. TESTS in vitro

7.2.1. Dosage des IgE

Le dosage des IgE spécifiques dans le sérum du patient est réalisé par des techniques

traditionnellement dénommées « RAST » (Radio Allergo-Sorbent Test) en référence à la

première technique développée (Wide, 1967). L’allergène, fixé à un support solide (plaques

96 puits, puces, …), est incubé avec le sérum à tester et les IgE spécifiques liées à cet

allergène sont révélées par un anticorps anti-IgE marqué. Le marqueur radio-isotopique,

initialement utilisé, est désormais remplacé par des marqueurs fluorescents ou

enzymatiques (Enzyme Allergo-Sorbent Test (EAST). Les taux d’IgE mesurés sont exprimés en

kU.ml-1 ou UI.ml-1 selon le produit commercial utilisé. La technique de dosage des IgE

sériques spécifiques, reconnue comme la référence, est celle du Cap System® de Pharmacia.

Les résultats sont exprimés en kUA.ml-1 : le seuil de détection est fixé à 0,35 kUA.ml-1.

La technique de dosage des IgE sériques spécifiques, reconnue comme la référence,

est celle du Cap System® de Pharmacia dont le seuil de détection est 0,35 kU/L. En 1997,

Sampson et al. ont établi des valeurs seuils d’IgE spécifiques dirigées contre des aliments

usuels, au-dessus desquelles les tests de provocation orale ont 95% de chance d’être

positifs.

Ces valeurs prédictives ont été calculées pour l’œuf (6 kU/L), le lait de vache (32

kU/L), l’arachide (15 kU/L) et le poisson (20 kU/L). Pour certains aliments comme le soja et le

blé, ces valeurs prédictives ne peuvent pas être calculées (Sampson, 1997). D’autres études

reposant sur des populations et des techniques différentes rapportent des valeurs

prédictives légèrement différentes (Garcia-Ara, 2001; Bernard, 2003; Osterballe, 2003; Bilgili,

2005).

4545

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES7.2.2. Biopuces à allergènes

Les puces à protéines permettent de détecter des interactions avec différents types

de molécules et s’avèrent être un outil puissant pour la compréhension des pathologies

humaines, l’évaluation de la réponse immunitaire aux antigènes viraux et bactériens, le

développement des méthodes diagnostiques et l’élaboration de candidats aux vaccins. Cette

technologie, qui est en pleine émergence, possède l’avantage de pouvoir comparer et

caractériser simultanément un grand nombre de cibles protéiques tout en remplaçant de

nombreux tests individuels par un seul et évaluer plusieurs paramètres en parallèle dans des

solutions biologiques complexes (Sakanyan, 2004).

L’avènement des microarrays permet aujourd’hui d’envisager une utilisation de la

technologie des biopuces dans l’étude du transcriptôme pour mettre en place une méthode

d’analyse à grande échelle, comparative et quantitative de l’expression des protéines entre

deux conditions expérimentales différentes (Mortuaire, 2004). Ces techniques de biopuces à

protéines, ou protein array par analogie aux microarrays, ne sont pas encore des outils

d’utilisation courante et par conséquent de nombreux investissements sont actuellement

consentis afin de les développer (Lal, 2002). Les avantages d’une telle méthode par rapport

aux méthodes classiques sont de pouvoir étudier rapidement et en parallèle plusieurs

protéines préalablement choisies pour leur implication dans certaines voies de signalisation,

sans avoir recours à une phase fastidieuse d’identification bioinformatique par banques de

données (figure 14).

Les biopuces sont des capteurs multiplexes dédiés à l’analyse biologique, et

répondant à des enjeux d’automatisation, de haut débit et de sensibilité de la biologie

actuelle. C’est la miniaturisation des tests mis en œuvre qui permet une montée en débit et

une augmentation de la sensibilité de ces systèmes de détection. La miniaturisation est

rendue possible par la convergence de méthodologies issues de la physique, de la chimie et

de la biologie : les nanobiotechnologies.

Les méthodes moléculaires appliquées au diagnostic des maladies infectieuses

présentent non seulement une sensibilité de détection élevée, mais permettent également

d’identifier rapidement les agents pathogènes incriminés ainsi que les micro-organismes

échappant aux méthodes conventionnelles.

4646


La technologie des puces à biomolécules a pris naissance à la suite des travaux

d’Ekins (1990, 1998) décrivant les avantages potentiels d’un système miniaturisé, les micro-

spots, par rapport à d’autres systèmes d’étude des interactions moléculaires. Une puce à

protéines (protein array ou protein chips) correspond à l’arrangement ordonné d’un grand

nombre d’échantillons sur un support miniaturisé, pouvant contenir sous toutes ses formes

des protéines actives ou des membres d’une famille de protéines voire même l’ensemble

des protéines d’un organisme (protéome). La technologie comprend trois étapes principales:

le dépôt des protéines-cibles sur le support, les interactions cibles-sondes et la détection des

signaux (figure 15).

La distinction arbitraire entre une macro et une micropuce repose principalement sur

le nombre de spots protéiques déposés par cm2, la première regroupant une vingtaine de

spots, tandis que la deuxième peut en atteindre plus de 1000.

Du fait que les puces à protéines soient des systèmes miniaturisés, permettant

d’effectuer simultanément et en parallèle plusieurs analyses avec une très haute sensibilité,

elles offrent à cette technologie de nombreux avantages liés à ses applications médicales et,

en particulier, au développement de nouvelles méthodes moléculaires plus performantes et

destinées au diagnostic des maladies infectieuses.

Principe de la technologie

On distingue deux types de puces à protéines à finalité biomédicale, les puces à

antigènes et les puces à anticorps. Les puces à antigènes, constituées de protéines et de

peptides, peuvent être utilisées pour détecter la présence des anticorps spécifiques dans le

sérum et quantifier les immunoglobulines correspondantes chez les sujets atteints de la

maladie suspectée.

En général, la détection est réalisée par un anticorps secondaire dirigé contre

l’immunoglobuline de reconnaissance. Les puces à anticorps peuvent servir pour détecter,

dans divers échantillons cliniques (cellules, sérum, biopsies, etc.) des marqueurs ou cibles

protéiques. La technique sandwich, couramment utilisée pour ces puces, nécessite un couple

d’anticorps dirigés contre deux épitopes différents de la même protéine.

Plusieurs facteurs jouent un rôle important dans la performance des puces à antigènes et à

anticorps. Le développement des supports pour immobiliser les protéines sur la surface

d’une lame de verre a été l’objet de nombreuses investigations (Angenendt, 2003).

4747


Selon la nature de l’immobilisation des protéines, les supports proposés sont regroupés

pour:

Un accrochage covalent, qui est assuré par la fonctionnalisation d’un radical de la

protéine ou de la surface recouverte de la lame.

Un accrochage non-covalent, qui est assuré par l’environnement d’un hydrogel ou

par la structure poreuse de la membrane de nitrocellulose.

4848


Figure 14 : Méthodes d’analyse à haut débit dans la génomique, post génomique(transcriptôme) et protéomique et applications potentielles (Sakanyan, 2007).

4949


Figure 15. Technologie des puces à antigènes et à anticorps. Sur les puces à antigènes, la

détection des immunoglobulines réagissant avec les molécules spottées est réalisée par des

anticorps anti-IgG, anti-IgM ou anti-IgE marquées (en rouge). Sur les puces à anticorps, la

détection des protéines-cibles, captées par des anticorps primaires, est réalisée par des

anticorps secondaires marqués (en vert). La détection peut être aussi réalisée par d’autres

molécules capables de reconnaître des anticorps avec un tag (par exemple, l’interaction de

l’avidine avec l’immunoglobuline biotinylée) (Sakanyan, 2007).

MATERIELS & METHODES


5151

1. PRODUCTION DES HYDROLYSATS INTENSIFS

1.1. LES SUBSTRATS

1.1.1.BLG et ALA

Les deux protéines majeures du lactosérum ont été obtenues par purification au

laboratoire des fonctions et interactions des protéines laitières (INRA-Nantes) selon la

méthode préconisée par Maillart et Ribadeau Dumas (1988).

1.1.2.Le lactosérum bovin

L’isolat de protéines sériques (WPI) utilisé est le Prolacta 90, fourni sous forme de

poudre par la société Lactalis (Laval, France). Sa composition est la suivante: matière sèche :

97,8% de protéines (70% de BLG, 20% d’ALA, 6% de BSA et d’immunoglobulines, 4%

d’agrégats formés lors du processus d’atomisation chez le fabriquant), 2,2% de cendres. La

poudre contient également 4,3% d’eau.

1.2. LES HYDROLYSES ENZYMATIQUES

1.2.1.Hydrolyse trypsique et chymotrypsique de la BLG, de l’ALA et du lactosérum

bovin à 1%

La BLG (2,5mg/ml), l’ALA (1,5 mg/ml) et le lactosérum bovin à 1% (p/v) sont préparés

dans du tampon phosphate à 50 mM pH 8. La trypsine traitée TPCK (EC 3.4.21.4) (L-1-

tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone) extraite du pancréas bovin lyophilisée

(10000U/mg protéine, Sigma-Aldrich), et l’-chymotrypsine traitée TLCK (EC 3.4.4.5) (N-p-

tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone) du pancréas bovin traitée lyophilisée type VII

(40U/mg protéine, Sigma-Aldrich) préalablement diluées dans du HCl 10-2N (1 mg/ml) sont

ajoutées aux solutions protéiques avec un rapport enzyme/substrat (E/S) de 1% (p/p).

1.2.2.Hydrolyse pepsique de la BLG, de l’ALA et du lactosérum à 1%

La pepsine extraite de la muqueuse gastrique du porc (EC 3.4.23.1) (4770 U/mg

protéine ; Sigma Aldrich) préalablement diluée dans de l’eau distillée (1 mg/ml) a été ajoutée

aux solutions protéiques avec un rapport enzyme/substrat (E/S) de 2% (p/p).


5252

1.3. TRAITEMENTS AUX MICRO-ONDES

Les différentes hydrolyses enzymatiques suscitées ont été réalisées sous micro-ondes

à différentes puissances et durées de traitements en utilisant un système générant des

micro-ondes (SAIREM GMP 03 K/SM, Miribel, France), selon le schéma expérimental

représenté dans la figure 16. Ce système produit une onde monochromatique dans le mode

fondamental, notée TE10, fonctionnant à une fréquence de 2,45 GHz. L'énergie des micro-

ondes a été transmise dans la direction z d'un guide d'onde rectangulaire (86 mm x 43 mm).

L'échantillon a été mis dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et positionné sur une

plaque de polystyrène. Le tube reçoit l’énergie électromagnétique a travers sa partie

supérieure. Afin de s'assurer que seule une quantité minimale d'énergie micro-ondes soit

réfléchie vers l'échantillon, on place un compartiment d'eau à la fin du guide.

L’enregistrement des montées en température a été effectué en utilisant des fibres optiques

(Luxtron Fluroptic thermomètre, modèle 790, précision à ± 0,5 °C). Les puissances utilisées

dans les expérimentations (50, 100 et 200 Watts) concernent la puissance incidente de

l'onde électromagnétique.

Les hydrolyses trypsique, chymotrypsique, mélange trypsine/chymotrypsine et

pepsique ont été réalisées sous rayonnement micro-ondes à une puissance de 50, 100 et 200

Watts. 1 ml de chaque mélange substrat (protéines)/enzyme a été placé dans l’enceinte de

traitement micro-ondes. Les durées de traitements étaient de 5 minutes pour les

traitements à 50 Watts et 3 minutes pour les traitements à 100 et 200 Watts.

A la fin de chaque hydrolyse trypsique et/ou chymotrypsique le pH des milieux

réactionnels est abaissé à une valeur de 2 à l’aide d’une solution d’HCl 2M ou augmenté à pH

7 par du NaOH 2M pour l’hydrolyse pepsique. Les différents hydrolysats obtenus ont été

conservés à –20°C.


5353

Figure 16: Dispositif expérimental des micro-ondes avec source monochromatique d’aprèsCuret et al., 2008.


5454

1.4. TRAITEMENT AU CHAUFFAGE THERMIQUE CONVENTIONNEL

Les courbes de montée en température obtenues sous micro-ondes à l’aide des fibres

optiques nous ont permis de reproduire ces gradients de température à l’aide d’un appareil

PCR. Les différentes hydrolyses enzymatiques ont été réalisées dans les mêmes conditions

de températures (43,2°C, 51,7°C et 63,5°C) obtenues respectivement aux puissances micro-

ondes appliquées : 50, 100 et 200 Watts.

2. CARACTÉRISATION DES HYDROLYSATS PRODUITS SOUS MICRO-ONDES ET EN

CONDITIONS DE CHAUFFAGE CONVENTIONNEL

2.1. ELECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLY-ACRYLAMIDE EN PRÉSENCE DE SODIUM

DODÉCYLE SULFATE (SDS-PAGE)

L’électrophorèse nous permet d’évaluer la disparition des bandes correspondant aux

protéines natives suite aux différentes hydrolyses. L’électrophorèse a été réalisée avec un

appareil Mini Protean II Gel Electrophoresis (Bio-Rad, Hercules, CA) selon la méthode de

Schagger et Von Jagow (1988).

La composition des gels est présentée dans le tableau 3. Un standard composé de

protéines de masses moléculaires comprises entre 14,4 et 97,4 kDa (Sigma) a été utilisé. Les

échantillons de lactosérum chauffé étaient dilués (v/v) dans un tampon de solubilisation ou

d’échantillon (Tris HCl 50 mM pH 6,8, SDS 4%,-mercaptoéthanol 3%, glycérol 10% et traces

de bleu de bromophénol) à une concentration de 1 mg/ml et chauffés à 100°C pendant 3

minutes.

10 µl de chaque échantillon ont été déposés sur le gel puis la séparation était

effectuée sous une intensité constante de 10 mA dans le gel de concentration et 20 mA

dans le gel de séparation.

Le tampon de migration utilisé est le : Tris 50 mM, Glycine 0,384 M, SDS 0,1%. Après

migration, les gels sont colorés avec un mélange éthanol 30%, acide acétique 5%, bleu de

Coomassie R250 0,2% et H2O 65% pendant 1 h puis décolorés (éthanol 30%, acide acétique

5%, H2O qsp 100%) pendant 1 h. Les gels ont été scannés avec un appareil « Image scanner

III» (GE Healthcare, USA).


5555

Tableau 3 : Composition des gels d’électrophorèse (SDS-PAGE à 12%)

Solution Gel de concentration (Stacking) Gel de séparation (Principal)

Acrylamide 40% 0,2 ml 1,8 mlTris 2M pH 8,8 1,00 mlTris 0,5M pH 6,8 0,3 mlEau 2 ml 3,2 mlSDS 10% 25 µl 60 µlAPS 10% 20 µl 60 µlTemed 4 µl 12 µl

2.2. ÉTUDE PAR RP- HPLC

L’HPLC permet une séparation hautement résolutive de composés chimiques ou

biologiques grâce à une pression élevée (plusieurs dizaines de bars) qui élimine les effets de

diffusion observés dans des conditions atmosphériques.

L‘analyse en chromatographie en phase inversée a été réalisée avec un appareil

HPLC (Waters 2695, Alliance) sur colonne WATERS Symmetry 300 C18, 3,9 x 150mm.

La colonne était équilibrée par un éluant A (0,09% TFA dans H2O). L’élution était

réalisée à température ambiante par un gradient linéaire de 0 à 70% d’éluant B (80% CH3CN,

0,01% de TFA dans H2O). 20 µl d’échantillon (1 mg/ml) étaient injectés. La densité optique

était enregistrée à 220 nm et 280 nm.

2.3. ESTIMATION DE L’HYDROLYSE DES PROTÉINES PAR DENSITOMÉTRIE

Afin d’estimer la quantité de protéines hydrolysée, les électrophoregrammes obtenus

par SDS-PAGE ont été scannés à l’aide du système Image Scanner III (GE Healthcare, USA).

Les images digitales obtenues ont été analysées en utilisant le logiciel Fuji Film gauge V3.0

(Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan). Les intensités des bandes ont été enregistrées et exprimées

en pics. Après correction, les données ont été calculées et exprimées en % d’hydrolyse par

rapport à l’intensité de la protéine témoin à partir du rapport de la surface et l’intensité des

pics obtenus selon la méthode de Ong et al (2006).


5656

3. IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS CONTRE DES IgG POLYCLONAUX

3.1. PRODUCTION D’IGG ANTI-BLG ET ANTI-ALA CHEZ LE LAPIN

3.1.1.Procédure d’Immunisation

Animaux

Les animaux utilisés lors de notre expérimentation sont des lapins de race Néo-

Zélandaise provenant de l’Institut d’élevage de Lemtar situé dans la région de Sidi Bel Abbes.

Il s’agit de jeunes lapins des deux sexes, logés dans des cages spécialement conçues pour ce

type d’animal, nourris avec des granulés (STCO) et abreuvés ad libitum.

Nous avons choisi le lapin car cette espèce produit des volumes importants d’antisérum et

est idéale pour la production d’anticorps polyclonaux à forte affinité (Stills, 1994).

Antigènes

Pour l’obtention d’anticorps anti-BLG et anti-ALA, nous avons utilisé la fraction B de

la BLG et de l’ALA bovine (Type Ι), toutes deux à l’état pur et provenant de chez SIGMA

(USA).

Adjuvants

La réponse antigénique est améliorée par l'utilisation d'adjuvants. Dans notre

protocole nous avons utilisé l'adjuvant complet de Freund (ACF) pour la primo injection et de

l’adjuvant incomplet de Freund (AIF) pour les rappels (SIGMA USA).

Ceux-ci forment, au site de l'injection, un dépôt d'immunogène qui est libéré lentement sur

un certain laps de temps, ce qui a pour effet d'entretenir la stimulation du système

immunitaire (Tableau 4).

Tableau 4 Adjuvants et mécanismes d’action d'après Janeway and Travers (1999).

Nom de l'adjuvant Composition Mécanisme d'action

Adjuvant complet deFreund

Huile en émulsiondans l'eau avec des

Libération retardée de l'antigène ; capturefacilitée par les macrophages ; induction

mycobactéries tuées de la co-stimulation.Adjuvant incomplet

de FreundHuile en émulsion

dans l'eauLibération retardée de l'antigène ; capture

facilitée par les macrophages


5757

3.1.2.Protocole d’immunisation

Les lapins sont répartis en 3 groupes de six (n =6). Le 1er et le 2e groupe sont

immunisés respectivement à la BLG et à l’ALA, principales protéines du lactosérum.

Le 3e groupe constitue le groupe témoin et par conséquent ne reçoit aucune immunisation.

Les solutions immunogènes sont constituées de 2 mg de protéines pures dissoutes dans 0,5

ml de sérum physiologique (NaCl 9‰) émulsionné à 0,5 ml d’Adjuvant Complet de Freund

(ACF).

Suivant la technique utilisée par Walker et al. (1973), l’antigène est injecté en sous-

cutané en dix points le long de la colonne vertébrale à la dose de 1 ml par lapin, soit 100 μl

par site d’injection. Des rappels sont réalisés le 7e, 20e et 30e jour du protocole selon la

même procédure mais avec une solution antigénique contenant l’Adjuvant Incomplet de

Freund (AIF) (figure 17).

3.1.3.Prélèvements sanguins

Avant toute immunisation, des prélèvements sanguins de 2 ml sont effectués à partir

de la veine marginale de l’oreille de chaque lapin (sérum non immun).

Le 40e jour qui suit la primo injection, les lapins sont sacrifiés après que le sang ait été

récolté à partir de l’artère carotide par cathétérisme.

Après coagulation (prélèvement laissé à 37°C pendant ½ heure) le sang est centrifugé

à 3500 Trs/min pendant 15 minutes à +4°C, le sérum est ensuite délicatement prélevé puis

congelé dans des aliquotes à – 20°C.

Dans notre étude, nous avons utilisé différentes techniques immunologiques pour

apprécier d’une part le degré d’immunisation des lapins vis à vis de la BLG et de l’ALA et

d’autre part, pour évaluer l’efficacité des traitements protéolytiques sous micro-ondes qui

ont été appliqués au lactosérum bovin.


5858

J0 : 100µl d’antigène +ACF en sous-cutané

J7, 20 et 30 : (Rappel) 100µl d’antigène + AIF en sous-cutané

Figure 17: Protocole d’immunisation des lapins. Les lapins reçoivent une primo injection

d’antigène (BLG/ALA mélangé à un adjuvant (adjuvant complet de Freund). Des rappels sont

effectués pour booster la réponse antigénique par injection sous-cutanée d’antigène

mélangé à un adjuvant incomplet de Freund.

3.2. DOSAGE DES ANTICORPS IGGS ANTI-BLG ET ANTI-ALA SÉRIQUES PAR TEST ELISA

INDIRECT COLORIMÉTRIQUE

Pour évaluer le degré d’immunisation des lapins contre les antigènes du lait, nous

dosons les anticorps sériques IgG anti BLG et anti ALA selon un procédé non compétitif par la

technique immuno-enzymatique ELISA (Adel-Patient et al, 2000).

3.2.1. Principe d’ELISA indirecte colorimétrique

Le principe de cette technique est basé sur un procédé dans lequel les anticorps à

doser réagissent dans un premier temps avec l’antigène immobilisé par adsorption sur une

phase solide. Dans un deuxième temps, la quantité d’anticorps fixés par l’antigène est

mesurée à l’aide d’un deuxième anticorps (anti-immunoglobuline).

Dans notre travail, nous utilisons des plaques de microtitration en polystyrène (NUNC

MaxiSorp, puits à fond plat), qui permettent d’adsorber la plupart des antigènes. Après

dépôt de l’immunsérum contenant les anticorps spécifiques, la phase solide est lavée et on

révèle la présence de ces anticorps par l’addition d’un conjugué qui correspond à des anti-

anticorps couplés ou non à une enzyme (peroxydase). La dernière étape correspond au


5959

dosage de l’enzyme marqueur. Cette phase est essentielle, car du plus petit nombre de

molécules d’enzymes que l’on pourra détecter, dépendra le seuil de sensibilité.

Le substrat de la peroxydase que nous utilisons est le peroxyde d’hydrogène (H2O2).

Au cours de la réaction enzymatique, un radical O se forme. Pour le détecter, on ajoute à la

solution un chromogène, l’orthophènylène diamine (OPD).

3.2.2.Mode opératoire

Le dosage ELISA des IgG spécifiques anti-BLG et anti ALA est réalisé par la technique ELISA à

l’aide de plaques de 96 puits à fond plat (NUNC MaxiSorp), selon les étapes suivantes :

Tous les puits de la microplaque reçoivent 100 μl d’antigène à la concentration de 10

μg/ml de BLG ou d’ALA, dilué dans du tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4. Les

plaques sont alors incubées pendant au moins une nuit à 4°C.

L’excès d’antigène non fixé est éliminé par 3 lavages successifs de la plaque avec du

PBS-Tween 20 0,05% à l’aide d’un laveur automatique (Elx50).

Les sites spécifiques sont saturés par le dépôt dans tous les puits de 200 μl de SAB à

3% dans du PBS pH 7,4 lorsque l’antigène sensibilisant est la BLG ou l’ALA. La SAB est

remplacée par de la gélatine de poisson à 2% dans du PBS pH 7,4 lorsque l’antigène

sensibilisant est le lactosérum ou la sérum albumine bovine.

La plaque est ensuite incubée pendant 1 h à 37°C puis rincée 3 fois de suite sous

agitation par le tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%.

L’opération suivante consiste à diluer les échantillons de sérum à tester au 1/10ème

dans un tampon de dilution (PBS 0,01M/ SAB1% Tween 20 0,1% pH 7). Pour cela,

une série de dilution est alors effectuée allant de 10-1 à 10-7, puis, un volume de 100

μl est déposé dans des puits appropriés.

La plaque est alors incubée à 37°C pendant 2 heures, puis lavée 3 fois de suite sous

agitation, au tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%.

Ensuite chaque puits de la plaque reçoit 100 µl d’anti IgG de lapin couplé à la

peroxydase (Sigma), dilué au 1/3000ème dans du tampon de dilution.


6060

La plaque est ensuite incubée pendant 1 h 30 minutes à 37 °C, suivie d’un lavage 3

fois de suite au tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%

200 μl d'une solution contenant un chromogène l’orthophénylène diamine (OPD) : (6

mg dilués dans 20 ml de tampon citrate de sodium 0,05 M à pH 5,1 ainsi que 10 μl de

H2O2) sont déposés dans chaque puits de la plaque. Une réaction colorée se

développe en 20 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. L'ajout de

H2SO4 2 M permet de stopper la réaction.

L'intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492 nm à l'aide d'un lecteur

(ELx 800).

Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans chaque plaque à fin de contrôler

la spécificité et la sensibilité de chaque mesure.

3.3. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES DIFFÉRENTS HYDROLYSATS PAR ELISA

COMPÉTITIF

Principe du test

Les puits de la plaque (Nunc, MaxiSorp) ont été recouverts pendant 3 h à

température ambiante avec 100 µl de protéines (BLG ou, ALA) diluée à 5 µg/ml dans du PBS.

Le test se déroule comme décrit précédemment, à la différence que les sérums de lapins

anti-BLG et anti-ALA ont été préincubés 1 h à 37°C en présence de concentrations

croissantes connues en compétiteurs (les différents hydrolysats de lactosérum et leurs

contrôles). 70 µl de compétiteur sont préincubés à 70 µl de sérum de lapins immunisés. La

dilution finale des sérums était de 1.10-4 pour les sérums anti-BLG et de 1.10-2 pour les

sérums anti-ALA. Après cette étape d’incubation, 100 µl de ce mélange (compétiteurs +

sérum) sont mis en contact des protéines immobilisées (BLG et ALA), suivie de l’étape de

révélation. Les expériences ont été répétées trois fois.


6161

4. ÉTUDE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS EN CHAMBRE DE USSING

4.1. ANIMAUX

Les animaux utilisés dans nos protocoles sont des souris de souche Balb/c obtenues

auprès de l’Institut Pasteur d’Alger. Ce sont des souris femelles congéniques, élevées et

acclimatées avant toute manipulation dans l’animalerie du Laboratoire de Physiologie de la

Nutrition et de Sécurité Alimentaire dans des conditions d’hébergement conformes à la

réglementation. Les expériences sont effectuées en respectant le bien-être de l’animal, en

évitant le stress et l’agitation susceptibles d’interférer avec les résultats. Les animaux vivent

dans des cages munies de biberons et d’une mangeoire et sont abreuvés à l’eau du robinet

et nourris ad libitum à l’aide d’un aliment pour rongeurs obtenu auprès de la SARL La

Production Locale Bouzareah (Alger).

4.2. ALLERGÈNES

Les fractions pures de la BLG et d’ALA bovines proviennent de chez Sigma (France).

4.3. ADJUVANT

Nous avons utilisé de l’hydroxyde d’aluminium Al(OH3) ou alun comme adjuvant pour

sa contribution à la stimulation de la réponse Th2 (Petrovsky et Aguilar, 2004).

4.4. PRODUITS UTILISÉS

Les sels de base pour les tampons sont des produits Sigma et Merck (France). Les

différents produits utilisés pour les dosages immunoenzymatiques proviennent de chez

Pharmingen et Sigma (France).


6262

4.5. IMMUNISATION DU MODELE ANIMAL D’ALLERGIE SOURIS BALB/C

4.5.1.Répartition des animaux

46 femelles Balb/c sont utilisées pour les besoins du protocole d’immunisation. Les

souris sont âgées de 5 à 8 semaines et pèsent entre 15 et 20 g (18,03 ± 0,45). Pour les

besoins de chaque expérience, les animaux ont été répartis en 3 lots :

Le premier lot comprend 20 souris femelles Balb/c immunisées contre la BLG native;

Le deuxième lot est composé de 20 souris femelles Balb/c immunisées contre l’ALA

native;

Le troisième lot est constitué 6 souris femelles Balb/c ne recevant aucun traitement.

Ce lot constitue le groupe témoin.

4.5.2.Protocole d’immunisation

Pour chaque antigène utilisé, les souris des lots 1 et 2 sont immunisées par voie intra

péritonéale. Chaque souris reçoit une dose de 100 μl d’une solution de PBS pH 7,4 contenant

10 μg de BLG ou 10 μg l’ALA mélangés à 2 mg d’Al(OH) 3. Les injections intra péritonéales ont

lieu à J0 puis, sous forme de rappels et dans les mêmes conditions, au 14ème, 21ème et 28ème

jour du protocole.

4.5.3.Prélèvements sanguins

A J0 et avant toute manipulation de l’animal, un premier prélèvement sanguin retro

orbitaire est effectué à l’aide d’une pipette Pasteur. Le deuxième prélèvement s’effectue à

J35, c'est-à-dire une semaine après le dernier rappel d’immunisation et juste avant le sacrifice

des animaux. Un volume de 400 μl en moyenne de sang par souris est collecté puis

centrifugé à 3500 tr/min pendant 15 minutes à + 4°C. Le sérum est récupéré, aliquoté dans

des microtubes Eppendorf et conservé à - 20°C.

4.6. DOSAGE DES ANTICORPS SÉRIQUES

Afin d’évaluer le degré de sensibilisation des souris contre la BLG et contre l’ALA, les

anticorps sériques de différents isotypes d'immunoglobulines: IgG, IgG1, IgG2a et IgE totales

ont été mesurés. La méthode utilisée est un procédé non compétitif par la technique ELISA

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), dont le principe est décrit ci-dessous.


6363


Le dosage ELISA des IgG, IgG1, IgG2a et IgE spécifiques anti-BLG et anti-ALA est réalisé

par la technique ELISA indirecte à l’aide de plaques de 96 puits à fond plat (NUNC MaxiSorp),

selon les étapes suivantes :

Tous les puits de la microplaque reçoivent 100 μl d’antigène à la concentration de 10

μg/ml de BLG ou de 10 μg/ml d’ALA, dilués dans du PBS pH 7,4. Les plaques sont alors

incubées pendant au moins une nuit à + 4°C.

L’excès d’antigène non fixé est éliminé par 3 lavages successifs de la plaque avec du

PBS-Tween 20 0,05% à l’aide d’un laveur automatique (Elx50).

Les sites non spécifiques sont saturés par le dépôt, dans tous les puits, de 200 μl de

SAB à 3% dans du PBS pH 7,4.

La plaque est ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C puis rincée 3 fois de suite sous

agitation par le tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%.

L’opération suivante consiste à diluer les échantillons de sérum à tester au 1/10ème

dans un tampon de dilution (PBS 0,01M/ SAB 1% Tween 20 0,1% pH 7). Pour cela, une série

de dilutions allant de 10-1 à 10-7est alors effectuée. Puis, un volume de 100 μl est déposé

dans des puits appropriés.

La plaque est alors incubée à 37°C pendant 2 heures, puis lavée 3 fois de suite sous

agitation, au tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%.

Ensuite, chaque puits de la plaque reçoit, selon les anticorps recherchés, 100 μl

d’anti-anticorps de souris dilué au 1/20000ème dans du tampon de dilution. L’anti-anticorps

déposé est soit un anti-IgG (Sigma) soit un anti-IgE ou des anti-IgG1 ou anti-IgG2a biotinylés

(Pharmingen).

La plaque est alors incubée pendant 1 heure 30 mn à 37°C, suivie d’un lavage 3 fois

de suite au tampon de lavage PBS/ Tween 20 0,05%.

Ensuite 100 μl d’extravidine peroxydase (Sigma) diluée à 1/5000ème dans le tampon

de dilution pH 7 sont déposés dans tous les puits. La plaque est ensuite incubée pendant 30

min à 37°C.

Après lavage avec le PBS/Tween 20 0,05 %, 200 μl d'une solution contenant un

chromogène (l’orthophènylène diamine (OPD) : 6 mg dilués dans 20 ml de tampon citrate de

sodium 0,05M à pH 5,1 ainsi que 30 μl de H2O2) sont déposés dans chaque puits de la


6464

plaque. Une réaction colorée se développe en 30 minutes à température ambiante et à l'abri

de la lumière. L'ajout de H2SO4 2 N permet de stopper la réaction.

L'intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492 nm à l'aide d'un lecteur

(ELx800).

Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans chaque plaque à fin de contrôler

la spécificité et la sensibilité de chaque mesure.

5. MESURE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS OBTENUS SOUS MICRO-ONDES ET

DANS LES CONDITIONS CONVENTIONNELLES

Dans cette partie du travail, nous mesurons l’allergénicité résiduelle des différents

hydrolysats de lactosérum bovin obtenus sous micro-ondes et avec un traitement thermique

conventionnel. Cette étude est menée grâce au dispositif original de la chambre deUssing.

Ce dispositif permet de réaliser un test de provocation par mise en contact des épithéliums

intestinaux de souris sensibilisées à la BLG ou à l’ALA avec les différents hydrolysats obtenus.

5.1. TEST DE PROVOCATION ex vivo EN CHAMBRE DE USSING

5.1.1. Principe de la chambre de Ussing

La chambre deUssing (Schwan, 1968 ; Li, 2004) permet de mesurer des paramètres

électriques épithéliaux tels que le courant de court circuit (Isc), la différence de potentiel

transépithéliale DDP au repos, ou encore la conductance membranaire (G). La chambre

deUssing emprunte son nom de son créateur H.H. Ussing qui, en 1951, publia une méthode

pour étudier le flux d’ions Na+ à travers une peau de grenouille et a ainsi pu déterminer la

part d’implication de cet ion dans le potentiel membranaire. Sa méthode d’investigation

consiste à annuler la différence de potentiel de part et d’autre de la membrane, de manière

à supprimer le transport passif des ions pour observer uniquement le flux net actif, image du

courant résultant dans les conditions de court-circuit. Cette technique a été adaptée à

l’intestin par Stanley et Zalusky (1964). Depuis, cette méthode a été appliquée à de

nombreux modèles animaux de laboratoire et est utilisée pour des fragments d’intestin

humain prélevés au cours d’interventions chirurgicales ou lors de biopsies intestinales (Saidi

et al., 1995). Le fragment de muqueuse intestinale peut être monté à plat entre deux demi


6565

chambres de lucite dont l’ouverture, déterminant la surface exposée, est adaptée à la taille

du fragment à étudier (0,1 à 0,2 cm²).

La chambre de Ussing est composée à la base de deux compartiments séparés par le

tissu à étudier. Les deux compartiments contenant une solution physiologique (Ringer)

servent à isoler les côtés lumineux et séreux du tissu intestinal en vue de reproduire au

mieux le principe de la barrière sélective. Ils sont habituellement usinés dans du plexiglas

(polyméthacrylate de méthyle) apprécié pour sa transparence et son comportement vis à vis

des tissus biologiques. La solution physiologique est maintenue à une température

constante de 37°C et est continuellement oxygénée par un bullage de carbogène (95% d’O2

et 5% de CO2). L’autre effet recherché par le bullage est le brassage continu du liquide de

survie. Dans ces conditions environnementales, la plupart des tissus gardent une viabilité

fonctionnelle supérieure à 2 heures ce qui permet d’étudier aisément les transports actifs et

passifs à travers le tissu.

Le principe même de la chambre de Ussing, est qu’il ne doit exister aucun gradient

électrochimique permettant à une solution donnée, de traverser le tissu. Cette condition est

remplie lorsque les deux faces du tissu sont baignées par des solutions ayant la même

composition chimique, la même température, le même pH et la même osmolarité.

En complément des mesures classiques de perméabilité, la chambre de Ussing

couplée à des clamps permet de vérifier l’état de la membrane par la mesure des

paramètres électriques Isc, Vm et G (conductance). Pour ces mesures, la chambre de Ussing

se comporte comme une cellule électrochimique avec ses électrodes de stimulation et ses

électrodes de mesure. Les électrodes de stimulation servent à imposer le courant dans la

chambre qui annule Vm, elle même mesurée par les électrodes de référence.


6666

5.1.2. Montage de fragments de jéjunum de souris en chambre de Ussing

Préparation de l’animal

Les souris sont maintenues à jeûn depuis la veille au soir. Elles sont anesthésiées à

l’aide d’un coton imbibé d’éther, puis l’abdomen est ouvert et le segment jéjunal entier est

prélevé délicatement de la cavité abdominale, vidé de son contenu par deux ou trois

rinçages au Ringer froid. Le segment jéjunal est ensuite incisé le long du bord mésentérique.

Il est ensuite découpé en fragments qui sont maintenus dans du Ringer froid et oxygénés par

un courant de carbogène (CO2 : 5%, O2 : 95%).

Le volume de Ringer déposé dans chaqu’un des deux compartiments de la chambre est

de 2 ml, le système est maintenu à 37°C et oxygéné par un courant continu de carbogène.

Après montage du tissu, environ 30 minutes sont nécessaires pour stabiliser les

paramètres électrophysiologiques de base. Au terme de cette période, on dépose dans le

compartiment séreux 20 μg/ml d’antigène que l’on veut tester (BLG, ALA ou hydrolysats

trypsiques et chymotrypsiques obtenus sous micro-ondes et par traitement thermique

conventionnel).

Les différents paramètres électrophysiologiques sont alors mesurés dans un premier

temps toutes les minutes durant les 5 premières minutes, puis 1 fois toutes les 5 min, durant

15 min d’expérience. Les compartiments muqueux et séreux sont reliés à une paire

d’électrodes au calomel, via des ponts d’agar (4 g/100 ml de KCl 3M) aux deux faces du tissu

et permettent de mesurer la différence de potentiel (DP) spontanée du tissu (séreuse

positive). Il est possible de supprimer cette DP et de l’amener a 0 mV, grâce à un système

d’électrodes Ag/AgCl reliées à une source de courant permettant de passer un courant de

faible intensité (10 μA) à travers le tissu. Ce courant est appelé courant de court -circuit (Isc):

il représente la somme des flux ioniques nets, principalement de Na+ et de Cl- et un flux

résiduel d’ions HCO-3.

Isc = JNa+net + JCl-

net + Jr

L’application de loi d’Ohm (U=RI) permet de déterminer la résistance du fluide (Rf) en

absence du tissu ainsi que la résistance du tissu (Rt) une fois celui-ci monté dans la chambre,

ou son inverse : la conductance G (G=1/R=1/U).


6767

6. SÉRUMS HUMAINS

L’ensemble de travaux décrits dans ce chapitre repose sur une sérothèque constituée

dans le cadre d’une collaboration avec le Service de Pédiatrie de la Clinique Amilcar Cabral,

du CHU d’Oran (Pr. Mahmoud TOUHAMI).

L’étude de l’effet des procédés d’hydrolyses combinées aux rayonnements micro-ondes

des lactoprotéines sériques sur leur immunoréactivité a été réalisée sur des sérums de

nouveau-nés allergiques. 67 sérums de patients suivis à la clinique Amilcar Cabral (CHU

d’ORAN) ont ainsi pu être étudiés.

Ces patients sont des nourrissons composés de 42 garçons et de 25 filles, âgés de 1 à 54

mois (valeur de la médiane 10 mois). Dans tous les cas, l’allergie aux protéines du lait de

vache est confirmée par des tests cliniques, (tests de provocation orale). Les manifestations

cliniques présentées sont variées : elles sont de légères à sévères, avec des symptômes

cutanés, gastro-intestinaux, respiratoires, voire généralisés (tableau 5). Pour l’étude de

l’immunoréactivité septs sérum présentant des taux élevés en IgE anti-BLG et anti-ALA ont

été sélectionnés. Ces sérums proviennent d’enfants présentant des signes cliniques modérés

et sévères.


6868

Tableau 5 : Description clinique des 64 sérums de nouveau-nés allergiques au lait utilisés lors desdifférents tests immunochimiques (TD: troubles digestifs; D: Diarrhée ; VOM: Vomissements ; URT:urticaire ; SR: syndrome respiratoire ; DA: douleurs abdominales ; OV : œdème du visage ; ECZ :Eczéma).CODE SER AGE (mois) Clinique CODE SER AGE (mois) Clinique

8 1 TD+D+VOM+URT 49 5 URT2 2 TD+VOM+URT 53 0,8 ECZ9 21 TD+D 54 1,5 TD+D+VOM7 16 TD+D 44 11 TD+D+VOM3 22 TD+VOM+URT 45 12 URT+OV

12 15 TD+VOM+URT 51 18 TD+D+VOM4 10 TD+D 48 3 TD

14 7 URT 50 16 URT6 29 TD+VOM+SR 46 14 TD+VOM+RGO

10 7 TD+VOM 52 13 URT+ECZ+SR5 6 TD+D 42 22 TD+D+VOM1 6 R+URT 58 15 TD+D

16 24 TD+D 64 2 TD+D+ECZ17 1 TD+D+VOM 61 13 ECZ+URT18 4,5 TD+VOM 69 11 TD+D+R19 2 TD+D 71 1 TD+D+VOM+DA21 1 TD+D+VOM 65 3 TD+D+VOM+DA+SR22 18 TD+D+VOM+DA 75 5 TD+VOM+OV24 9 TD+D+VOM 66 4 TD+D+URT25 4 TD+D+VOM 79 17 TD+VOM+RGO26 18 TD+D+VOM 73 15 TD+D+DA27 54 VOM+OV 74 5 TD+D29 18 TD+D+VOM+R+URT 68 10 TD+D+DA+ECZ30 5 TD+D+VOM+URT 84 4 ECZ31 4 TD+CONST 82 13 TD+D+VOM33 12 D+VOM+ECZ 76 2 TD+D+VOM+DA34 2 R+OV 87 17 TD+D+VOM36 14 TD+D+VOM 89 3 TD+D37 8 TD+D 77 1 TD+D+VOM38 15 VOM+R+ECZ+RGO 90 2 TD+D+ECZ41 14 TD+D 91 TD+D+VOM59 4 TD+D 92 3 TD+D+DA+ECZ

Les sérums colorés en surbrillance ont été sélectionnés pour constituer le pool de sérum utilisé dans les tests

d’inhibition contre les hydrolysats de lactosérum produits dans ce travail.


6969

6.1. CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE DE LA SÉROTHÈQUE

6.1.1.Dosage des IgE spécifiques par test ELISA à fluorescence.

Principe du test

Le test ELISA pour les IgEs humaines utilisé comporte deux parties :

Un dosage ELISA sandwich pour la gamme étalon et le dosage des IgE totales. Un

anticorps primaire anti-IgE humaine est adsorbé sur les plaques de microtitration

puis incubé avec des concentrations connues en IgE standards humaines (gamme

étalon) et avec les sérums des patients à tester pour les IgE totales.

Un dosage ELISA indirect pour les IgE spécifiques où l’antigène est adsorbé sur les

plaques de microtitration puis incubé avec les sérums à tester.

Matériels et tampons utilisés

Les plaques de microtitration (96 puits) utilisées pour les dosages immuno-

enzymatiques sont des plaques de microtitration blanches opaques Nunc MaxiSorp (VWR,

735-0002) permettant une adsorption optimale des protéines (anticorps ou antigènes). Les

mesures de l’absorbance sont réalisées grâce à un lecteur de fluorescence pour

microplaques FLx800, BIO-TEK Instruments.

Le lavage des plaques se fait par un laveur de microplaques, réf 1197, Dynex Technologies,

Thermolab systems.

Anticorps primaire: Monoclonal anti-Human IgE clone M604199 produit chez la

souris (IgG2a) (Fitzgerald- # 10-110).

IgE standard 75/502: Human Serum Immunoglobulin E (IgE) selon la 2ème

Référence de préparation internationale de l’OMS, établie en 1981. NIBSC Code No: 75/502.

[IgE] = 10 kU IgE/ml = 24 µg IgE/ml (1 U IgE = 2,4 ng IgE).

Anticorps secondaire: Anti-Human IgE (Epsilon-chain specific) conjugué à la

Phosphatase-Alkalin developpé chez la chèvre (A-3525, Sigma).

Substrat fluorescent: 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP) (M-3168, Sigma).


7070

Les tampons utilisés lors du test ELISA-fluorimétrique sont :

Le tampon de dilution : tampon phosphate (PBS) 50 mM pH 7,4 : 0,136 M NaCl –

2,68 mM KCl – 1,46 mM KH2PO4 – 8,1 mM Na2HPO4

Le tampon de lavage : PBS + Tween 20 0,1% (v/v) (PBS/T)

Le tampon de saturation : PBS/T + polyvinyl alcohol 1% (PVA, Sigma) (PBS/T/PVA).

Le tampon de révélation : 1 M Tris/HCl pH 9,8


Étalons et témoins utilisés

Un blanc de fluorescence est mesuré sur le substrat déposé dans des puits après

saturation.

ELISA sandwich :

par:

Le Contrôle de la spécificité de la fixation IgE standard/anticorps primaire s’effectue

L’utilisation de l’anticorps secondaire seul contre l’anticorps primaire.

L’utilisation de l’anticorps secondaire seul contre les IgE standards

(concentration la plus élevée)

ELISA indirect :

Pour l’ELISA indirect, le contrôle de la spécificité de la fixation IgE de

patient/allergène se fait par:

L’utilisation de l’anticorps seul contre les antigènes testés

L’utilisation de l’anticorps seul contre les IgE des sérums de patients

L’utilisation de l’anticorps secondaire seul.

Les solutions mères de protéines sont préparées à 1 mg/ml dans du PBS, pH 7,4 (NaCl

0,136 M, KCl 2,68 mM, KH2PO4 1,46 mM, Na2HPO4 8,1 mM).

Les protéines sont diluées à la concentration de 5 µg/ml dans du PBS et déposées

dans les puits de la plaque (Nunc, Maxisorp) pendant 3h à 37°C. Entre chaque étape les


7171

puits ont été lavés avec du PBS/T 0,1%. Ils ont été ensuite saturés par 250 µl de PBS/T/PVA

1%, contenant 1 % (w/v) d’alcool de polyvinyle (Sigma). Les micro plaques ont été incubées

pendant 2 h à 37°C. Les sérums des patients et les sérums contrôles ont ensuite été dilués

au 1/20ème dans du PBS/T/PVA puis déposés dans la plaque et incubés toute la nuit.

L’anticorps secondaire (Anti-humain IgE Phosphatase alcaline conjugate developped in goat

A 3525, Sigma) dilué au 1/1000ème dans du PBS/T/PVA (100µl par puits) est ensuite ajouté.

L’activité de la phosphatase alcaline est détectée par ajout d’un substrat fluorescent (4-

méthyl umbelliferyl phosphate (4-MUP) M 3168 Sigma) dilué au 1/5 dans un tampon Tris-HCl

1 M, pH 9,8 pendant 90 minutes à température ambiante et à l’obscurité. La fluorescence

est mesurée par un lecteur de microplaque FLx800, avec un filtre d’excitation à 360 nm et un

filtre d’émission à 440nm.

6.1.3.Exploitation des résultats

Les résultats sont exploités plaque par plaque.

6.1.4.Correction des données

Toutes les valeurs de fluorescence sont corrigées par soustraction du blanc de fluorescence

(puits saturés avec le substrat de fluorescence) et moyennées.

Les valeurs de fluorescence obtenues en ELISA indirect sont corrigées du bruit de fond

mesuré sur les puits avec sérum sans antigène (contrôle sérum).

Les valeurs de fluorescence obtenues en ELISA sandwich sont corrigées du bruit de fond

mesuré sur les huit puits sans IgE.

6.1.5.Dosage des IgE spécifiques

Limites de détection et de quantification

L’écart-type (E) des valeurs de fluorescence obtenues pour les huit puits sans IgE de l’ELISA

sandwich est calculé et il permet d’estimer :

La limite de détection LD = X tel que Y = 3 ET

La limite de quantification LQ = X tel que Y = 10 ET


7272

Calcul des concentrations en IgE

Il se fait soit à partir de la courbe étalon Y = f (X), soit à l’aide d’une régression logarithmique

qui est effectuée sur la zone linéaire de la gamme (~ de 1 ng/ml à 40 ng/ml) avec EXCEL® qui

donne une équation de régression de la forme:

Y = a ln(X) + b

Y: Intensité de fluorescence; X: concentration en IgE en ng/ml;

a: pente de la droite et b: ordonnée à l'origine

(1)En transformant l'équation en: X = exp ((Y-b)/a), il est possible de calculer la concentration

en IgE totales et spécifiques des sérums de patients dans la dilution(1) puis dans la solution

initiale.

(2) Pour être valide, la valeur estimée doit être comprise entre les bornes ayant servi à

calculer la régression. En-deçà de la borne inférieure, la valeur est surestimée, au-delà de la

borne supérieure, la valeur est sous-estimée.

Soit l’ajustement d’un modèle sigmoïde est effectué sur la totalité de la gamme étalon avec

la macro complémentaire Solver d’EXCEL® qui calcule par la méthode des moindres carrés

une équation de la forme:

Y = d + (a-d)/[1 + (X/c)b]

Avec: Y: Intensité de fluorescence; X: concentration en IgE en ng/ml;

a: limX0 Y : valeur du bruit de fond de l’ELISA sandwich

d : limX Y : valeur du plateau de saturation

c: abscisse du point d’inflexion (ng/ml)

b : pente de la courbe

En transformant l'équation en: X = c[(a-d)/(Y-d) – 1]1/b, il est possible de calculer la

concentration en IgE totales et spécifiques des sérums de patients dans la dilution puis dans

la solution initiale.


7373

6.2. CARACTÉRISATION IMMUNOLOGIQUE DES SÉRUMS DE PATIENTS PAR LA

TECHNIQUE DU MICROARRAY (BIOPUCES À ALLERGÈNES).

La caractérisation du profil de sensibilisation des patients allergiques a été réalisée

par la technique des biopuces. Ces lames comprennent 16 Pad de nitrocellulose (FAST® slides

16 Pad Format-Nitrocellulose coated slides whatman) permettant ainsi de tester 16 sérums

sur une seule lame (figure 18).

La préparation des biopuces consiste à déposer et à immobiliser les différentes

protéines à la surface d’un substrat. Ici, ce sont les protéines natives du lait ainsi que les

hydrolysats trypsiques de la BLG et de ses trois épitopes majeurs correspondants aux

séquences suivantes : (149-162/102-124/41-60) qui sont déposés sur de la nitrocellulose à

l’aide d’un robot de dépôt « Sci Flex ArrayerS3 » de l’Université de Nantes, utilisant la

technologie de non contact piézoélectrique. Ce système de dépôt est basé sur la contraction

d’une céramique piézoélectrique qui entoure le capillaire contenant la solution à déposer

(figure 19).

En jouant sur l’amplitude et la durée de la tension appliquée, il est possible de

contrôler le volume de la goutte éjectée. Dans notre protocole le volume déposé est égal à 6

gouttes à environ 300 pl. Des spots en IgE standards humains à différentes dilutions ont été

prévus aussi (figure 20).

Les épitopes utilisés ont été amicalement fournis par Micaela Pescuma de l’Université

Cerela-Conicet Tucuman, Argentine.


7474

Figure 18 : Schéma d’une lame de nitrocellulose à 16 Pad.

Figure 19: Principe de fonctionnement d’un robot de dépôt piezoélectrique (Souplet, 2007).

Comme première étape, toutes les protéines ont été préparées à une concentration de 1

mg/ml dans du PBS. Ensuite, selon le schéma de spotting figure 3, les différentes dilutions

d’IgE standards humaines, les protéines ainsi que les hydrolysats ont été déposés dans une

plaque d’immunoanalyse à 96 puits NUNC. Le dépôt est réalisé en double.


7575

(IgE) 1/10 (IgE) 1/10 As2r As2r BLGr BLGr (IgE) 1/10 (IgE) 1/10

1/20 1/20 As2 As2 BLG BLG E149-162 E149-162

1/40 1/40 As1r As1r ALA ALA E102-124 E102-124

1/80 1/80 As1 As1 Lf Lf E41-60 E41-60

1/160 1/160 Bcasr Bcasr BSA BSA Y_T Y_T

1/320 1/320 Bcas Bcas IgG IgG Y-BLG-Td Y-BLG-Td

1/640 1/640 PBS PBS Kcasr Kcasr Y-BLG-T Y-BLG-T

1/1280 1/1280 HSA HSA Kcas Kcas Y1_BLG Y1_BLG

Figure 20: Schéma de la déposition des différentes protéines natives du lait, des hydrolysatstrypsiques de BLG (Y-BLG-T, Y-BLG-T) des épitopes majeurs de la BLG (E149-162/E102-124/E41-60) et des dilutions d’IgE standards humaines (les colonnes en gris représentent lesdilutions des IgE standards humaines).

BLG : -lactoglobuline, BLGr : -lactoglobuline recombinante, ALA : -lactalbumine, As1, s1caséines, As1r : s1 caséine recombinante, As2, s2 caséines, As2r : s2 caséine recombinante, Bcas,beta caséines, Bcasr : beta caséine recombinante, Kcas : Kappa caséine, Kcasr : Kappa caséinerecombinante, BSA : Bovine sérum albumine, HSA : Human Serum Albumin, IgG : Immunoglobuline G,Lf : lactoferrine bovine


7676

Les lames de nitrocellulose avec les protéines immobilisées ont été incubées dans

une solution de saturation PBS contenant 0,1% Tween-20 et 1% poly vinyl alcool (v/v),

Sigma) pendant 1 heure à 4°C. Après 3 cycles de lavages (10 min) des biopuces avec du PBS-

Tween 0,1%, des sérums de patients allergiques et contrôle ont été ajoutés à chaque pad et

incubés pendant une nuit à 4°C.

L’excès de sérum non fixé est éliminé par 3 cycles de lavage (10 min) avec du PBS

Tween 20 0,1%. L’étape suivante consiste à incuber les lames avec un anti IgE humaine

monoclonal développé chez la souris (IgG2a) (Fitzgerald, Concord, MA, USA) dilué au

1:1000ème pendant 1 heure. Après trois autres cycles de lavages de 5 minutes dans du

PBS/0,1%Tween-20 lames sont incubées avec un anti IgG de souris développé chez la chèvre

l’Alexa Fluor 680s dilué au 1 :10000ème (Invitrogen, Breda, the Netherlands).

Après trois cycles de lavage de 5 minutes dans du PBS 0,1%Tween-20, les lames sont

séchées et scannées en infrarouge à 700 nm avec un scanneur Odyssey infrared imaging

system (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).

6.3. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS PRODUITS SOUS MICRO-

ONDES ET DANS LES CONDITIONS CONVENTIONNELLES PAR ELISA COMPÉTITIF CONTRE LES

SÉRUMS DE PATIENTS ALLERGIQUES

6.3.1.Principe du test

Les études par compétition reprennent les conditions du test indirect, décrit

précédemment pour la détermination des IgE spécifiques. Ce test réside dans la capacité

d’antigènes en solution à inhiber la liaison d’anticorps spécifiques à un antigène immobilisé

sur une phase solide (la BLG et l’ALA dans notre étude). Les anticorps spécifiques (sérum

humain dilué) sont utilisés à une concentration prédéterminée et constante.

La présence d’anticorps qui se sont fixés sur la phase solide en dépit de l’incubation

avec un compétiteur en solution (dans notre cas, différents hydrolysats de lactosérum), est

révélée de la même façon que pour l’ELISA indirect. Dans ce type de dosage, le signal mesuré

est inversement proportionnel à la concentration de compétiteur introduite dans le

mélange.


7777

Les résultats sont exprimés en termes de % de liaison : B/B0 où B0 et B représentent

respectivement les IgE spécifiques liées sur la phase solide en absence ou en présence d’une

concentration donnée de compétiteur.


Les puits de la plaque (Nunc, Maxisorp) ont été recouverts pendant 3 h à 30°C avec

100 µl de protéines (BLG ou ALA) diluée à 5 µg/ml dans du PBS. 70 µl de sérums avec un titre

élevé en IgE anti- BLG ou anti-ALAont été préincubés avec 70 μl de compétiteur (différents

hydrolysats de BLG, ALA, lactosérum et leurs contrôles) à une concentration finale de 200

µg/ml pendant 3h à température ambiante. La dilution finale des sérums était de 1.10-4

pour les sérums anti BLG et 1.10-2. Après incubation et trois lavages successifs avec du PBS

Tween 20 à 0,01%, 100 µl de ce mélange sont mis en contact avec les protéines immobilisées

(BLG ou ALA) pendant 15 h à +4°C. Les expériences ont été réalisées deux fois.

7. ÉTUDE STRUCTURALE DE LA BLG PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE (DC)

7.1. PRINCIPE

Le DC est une méthode d’analyse spectrophotométrique combinant le phénomène

de polarimétrie et celui de l’absorption de la lumière par la matière. Le DC représente la

différence d’absorption des composantes droite et gauche d’une lumière polarisée par une

molécule ayant des propriétés chirales ou se trouvant dans un environnement asymétrique.

Dans le cas des protéines, deux types de structures chimiques ont un pouvoir dichroïque

lorsqu’elles sont placées dans un environnement asymétrique :

les liaisons peptidiques, qui absorbent dans l’UV lointain entre 180 et 250 nm ;

les chaînes latérales des acides aminés aromatiques et les liaisons disulfure,

absorbant dans l’UV proche entre 250 et 320 nm.

Le DC est utilisé pour les études structurales de protéines solubles : analyse de

structures secondaires (UV lointain) et tertiaires (UV proche), contrôle du repliement, étude

de la perte de structure liée à la dénaturation (Fasman, 1996). Cette approche ne permet

cependant que l’étude partielle de la structure des protéines (étude uniquement des

structures chimiques possédant une activité optique) et ne permet pas une analyse à

l’échelle atomique.


7878

7.2. CONDITIONS ET PROTOCOLE

Les spectres de DC ont été acquis avec un Spectropolarimètre 810 (Jasco) équipé d’une

cellule thermostatée et enregistrés par le logiciel CDmax (Jobin Yvon, Longjumeau, France).

Les protéines ont été préparées à une concentration de 1 mg/ml dans un tampon

phosphate de sodium 50 mM pH 7,4 ou Citrate- 50 mM pH 2. Les spectres en UV lointain et

en UV proche ont été respectivement enregistrés entre 185 et 260 nm et entre 250 et 320

nm par incréments de 1 nm et à une vitesse de 1 nm/sec. Les échantillons ont été placés

dans des cellules en quartz de trajet optique 1 mm (UV proche) et 0,1 mm (UV Lointain). 3

spectres ont été moyennés pour chaque échantillon. Les lignes de base ont été corrigées par

soustraction des spectres enregistrés avec le tampon seul.

L’analyse des spectres de DC a été réalisée après soustraction du spectre du tampon.

Les résultats obtenus sont exprimés en DA : différence d’absorption des composantes

gauche et droite de la lumière polarisée. Ces valeurs ont été normalisées par la quantité de

liaisons peptidiques, permettant l’expression des résultats en ellipticité molaire par résidu

(ΦMRW), (Kelly & Price, 2000) :

[Φ]MRW = (33 × ∆A × MM × 100) / (C × L × N AA) exprimé en deg/cm2/dmol, avec :

MM : masse moléculaire de la protéine, en g/mol.

C : concentration de la protéine, en g/L.

L : longueur du chemin optique, en cm.

NAA : nombre d’acides aminés.

8. ÉTUDE STATISTIQUE

Les résultats sont présentés sous la forme de la moyenne ± erreur standard (Χ ± ES).

Les moyennes sont comparées à l’aide d’un test t de Student pour les données appariées et

non. Le seuil de signification retenu est celui qui est habituellement considéré, soit 5%.

L’analyse statistique est mesurée à l’aide du logiciel STATISTICA (5.1.2006).

RESULTATS

RESULTATS

1. TRAITEMENTS MICRO-ONDES ET TEMPÉRATURES OBTENUES

Au cours des traitements des échantillons aux micro-ondes, la température atteinte à

chaque niveau de puissance utilisée a été mesurée et enregistrée à l’aide de fibres optiques

afin de pouvoir reproduire ces mêmes températures lors du traitement thermique

conventionnel. La reproduction des montées de températures élimine tout effet lié à cette

dernière sur les processus d’hydrolyse.

La figure 21 indique que l’évolution de ces températures en fonction du temps est

linéaire. Les valeurs finales obtenues sont proportionnelles aux puissances appliquées. Elles

résultent d’une importante friction moléculaire, conséquence elle même d’un transfert

rapide de l’énergie électromagnétique (Thostenson, 1999). Les températures finales

obtenues sont 43,2°C, 51,7°C et 63,5°C. Elles correspondent respectivement aux puissances

appliquées : 50, 100 et 200 Watts.

Figure 21: Gradients de températures mesurés pendant les traitements micro-ondes à l’aide

des fibres optiques Néoptix.

8080

2. EFFETS DES MICRO-ONDES SUR LES HYDROLYSES ENZYMATIQUES

L’utilisation des traitements thermiques conventionnels suivis d’hydrolyses

enzymatiques constitue une méthode de référence dans la production d’hydrolysats lactés à

des fins thérapeutiques et médicales. Néanmoins, l’apparition de cas d’allergie aux

hydrolysats de protéines du lait indique que ces traitements, pourtant brevetés (0322 589

B1), restent insuffisants à atteindre la totalité des épitopes séquentiels qui semblent

résistants.

Dans notre travail, l’objectif de cette première partie est d’étudier et de caractériser

les produits issus de l’action thermique des micro-ondes combinée à une hydrolyse

enzymatique sur le lactosérum bovin.

2.1. Hydrolyse trypsique et chymotrypsique de la BLG sous micro-ondes à 50 Watts

La BLG variant B purifiée a été hydrolysée par de la trypsine, la chymotrypsine et le

mélange des deux enzymes avec un rapport de 1 : 1 sous micro-ondes à 50, 100 et 200 Watts

pendant 5 et 3 minutes. Le rapport enzyme/substrat (E/S) utilisé est de 1%.

L’électrophorégramme dans la figure 22 indique clairement la disparition totale des

bandes correspondant à la BLG traitée à 50 Watts, et ce quel que soit le type d’hydrolyse qui

lui est combiné: trypsique, chymotrypsique ou mélange trypsine/chymotrypsine, comparé

au contrôle non traité dans le puits 1 (p<0,001).

8181

MMWW ((kkDDaa))

11666,2

4535

25

18,414,4

1 2 3 4 5 6 7

Figure 22: SDS-PAGE (12%) des hydrolysats de BLG bovine obtenus après 5 minutes d’hydrolyse sous

traitement micro ondes à 50 WATTS et sous chauffage conventionnel dans les mêmes conditions de

gradient de températures obtenues sous micro-ondes . 1: BLG contrôle sans traitement, 2: trypsine +

micro-ondes, 3: trypsine + chauffage conventionnel, 4: chymotrypsine + micro-ondes , 5:

chymotrypsine + chauffage conventionnel , 6: mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7:

mixture trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

Le taux de BLG hydrolysée a été évalué par densitométrie à partir des intensités des

bandes de la protéine (BLG) sur les gels d’électrophorèse à l'aide du logiciel Fuji Film Gauge

V3.0 (Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan) (figure 23). Les résultats obtenus indiquent des taux

d’hydrolyse de la BLG de 100, 95 et 100% respectivement après hydrolyse trypsique,

chymotrypsique et mélange trypsine/chymotrypsine. En revanche, les taux d’hydrolyse de la

BLG ne sont que de 55, 62 et 69% respectivement après traitement thermique

conventionnel aux mêmes températures obtenues sous micro-ondes, (p<0,001) avec une

persistance des bandes de la protéine pour les trois types d’hydrolyse.

8282

Figure 23: % d'hydrolyse de la BLG sous micro-ondes (50 Watts) et durant le traitementthermique conventionnel en appliquant le gradient de température obtenu sous micro-ondes.

La figure 24 indique les profils chromatographiques mesurés par RP-HPLC des

différents hydrolysats de BLG issus de l’action des micro-ondes à 50 Watts. Les peptides

obtenus ont un temps de rétention (Tr) compris entre 17 et 30 min. Les chromatogrammes

confirment le bon déroulement des hydrolyses avec une disparition totale de la protéine

intacte (BLG contrôle) retenue à Tr = 31 min.

Le massif peptidique des trois types d’hydrolysats se concentre entre Tr = 17 et 26

min, c’est-à-dire juste au milieu du gradient appliqué suggérant qu’il s’agit de peptides de

taille moyenne, plus au mois hydrophobes car ne s’éloignant pas trop de la BLG contrôle,

considérée elle comme étant très hydrophobe.

8383

Figure 24: Chromatographie en phase inversée (RP-HPLC) des hydrolysats de BLG obtenus

sous micro- ondes à 50 Watts après 5 minutes d’hydrolyse.

2.2. Hydrolyse enzymatique trypsique et chymotrypsique de la BLG sous micro-ondes à

100 Watts

A la puissance de 100 Watts, la température finale atteinte est de 51,7°C. A ce

niveau de traitement, on observe une persistance des bandes correspondant à la BLG

traduisant une diminution des taux d’hydrolyse de la BLG, comparativement à ceux obtenus

après traitement à 50 Watts et ceci, quelque soit le type d’enzyme. Cette diminution est

confirmée par l’analyse densitométrique de la BLG hydrolysée (figure 26). A 100 Watts, le

taux le plus élevé d’hydrolyse de la BLG est obtenu avec le mélange trypsine/chymotrypsine.

Il est de 96% contre 70% d’hydrolyse obtenue par traitement thermique conventionnel

(p<0,001). Le taux de la BLG hydrolysée par la trypsine atteint quant à lui 75% sous micro-

ondes alors qu’il n’est que de 10% après hydrolyse à la même température sous chauffage

conventionnel (p<0,001).

8484

MMWW ((kkDDaa)) 1 2 3 4 5 6 7

11666,2

4535

2518,414,4

Figure 25: SDS-PAGE (12%) des hydrolysats de BLG bovine obtenus après 3 minutes d’hydrolyse soustraitement micro ondes à 100 Watts et sous chauffage conventionnel dans les mêmes conditions degradient de températures obtenus sous micro-ondes. 1: BLG contrôle sans traitement, 2: trypsine +micro-ondes, 3: trypsine + chauffage conventionnel, 4: chymotrypsine + micro-ondes , 5:chymotrypsine + chauffage conventionnel , 6: mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7:mélange trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

Figure 26: % d'hydrolyse de la BLG sous micro-ondes (100 Watts) et durant le traitementthermique conventionnel en appliquant le gradient de température obtenu sous micro-ondes

8585

Les profils chromatographiques par RP-HPLC des différents hydrolysats de la BLG

obtenus durant un traitement micro-ondes à 100 Watts sont représentés dans la figure 27.

Contrairement aux hydrolyses à 50 Watts, les profils peptidiques obtenus sous micro-ondes

à 100 Watts ont un temps de rétention compris entre 20 et 31 min, ceci indique que

l’hydrolyse est moins importante dans ces conditions. Le massif peptidique obtenu est moins

décalé par rapport aux hydrolysats obtenus sous micro-ondes à 50 Watts. Les peptides issus

de l’hydrolyse par le mélange trypsique/chymotrypsique sont assez proches du temps de

rétention de la BLG native, suggérant des polypeptides de grande taille moins hydrolysés

que le produit final obtenu sous micro-ondes à 50 Watts.

Figure 27: Chromatographie en phase inverse (RP-HPLC) des hydrolysats de BLG obtenussous micro- ondes à 100 Watts après 3 minutes d’hydrolyse.

8686

2.3. Hydrolyse enzymatique trypsique et chymotrypsique de la BLG sous micro-ondes à

200 Watts

La figure 28 représente l’électrophorégramme des différents hydrolysats

enzymatiques trypsique et chymotrypsique de la BLG obtenus sous micro-ondes à 200

Watts et dans les conditions de chauffage conventionnel. La température finale obtenue est

de 63,5°C. Nos résultats indiquent que l’hydrolyse est assez importante sous micro-ondes

comparée au chauffage conventionnel et ceci quelle quesoit la combinaison enzymatique. Le

taux d’hydrolyse maximal est atteint avec l’hydrolyse trypsique/chymotrypsique (94% de

BLG hydrolysée) par rapport à l’hydrolyse réalisée avec le chauffage conventionnel où 58%

seulement de la protéine est hydrolysée (p>0,001) (figure 29).

MMWW ((kkDDaa))

11666,2

45352518,414,4

1 2 3 4 5 6

Figure 28: SDS-PAGE (12%) des hydrolysats de BLG bovine obtenus après 3 minutes d’hydrolyse sous

traitement micro-ondes à 200 Watts et sous chauffage conventionnel dans les mêmes conditions de

gradient de températures obtenus sous micro-ondes. 1: trypsine + micro-ondes, 2: trypsine +

chauffage conventionnel, 3: chymotrypsine + micro-ondes, 4: chymotrypsine + chauffage

conventionnel, 5: mixture trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 6: mélange

trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

8787

Figure 29: % d'hydrolyse de la BLG sous micro-ondes (200 Watts) et durant le traitementthermique conventionnel en appliquant le gradient de température obtenu sous micro-ondes.

L’analyse des hydrolysats de BLG par RP-HPLC (figure 30), montre que l’hydrolyse

reste incomplète pour les trois opérations. On observe des pics qui persistent à un Tr = 31

min et qui correspondent à la BLG résiduelle dans le produit final. Les peptides obtenus sont

assez hydrophobes, compte tenu que leur temps de rétention est assez proche de celui de la

BLG native.

8888

Figure 30: RP-HPLC des hydrolysats de BLG obtenus sous micro-ondes après 3 minutes d’hydrolyse à200 Watts.

8989

2.4. Hydrolyse trypsique/chymotrypsique de l’ALA bovine sous micro-ondes à 50 Watts

Les résultats de l’hydrolyse de l’ALA bovine sous micro-ondes à 50 Watts et durant le

chauffage conventionnel après 5 minutes de protéolyse sont représentés dans la figure 31.

L’hydrolyse de l’ALA est totale quelque soit le type d’hydrolyse. En revanche, le temps

d’hydrolyse de l’ALA durant le chauffage conventionnel semble être insuffisant pour une

hydrolyse complète.

L’analyse des résultats de chromatographie après les trois types d’hydrolyses de l’ALA

confirme l’hydrolyse complète de la protéine sous micro-ondes à 50 Watts avec un temps de

rétention des peptides se situant entre 10 et 25 minutes (figure 32).

MMWW ((kkDDaa)) 1 2 3 4 5 6 7

11666,235452518,4

14,4

Figure 31: SDS-PAGE (12%) des hydrolysats d’ALA bovine obtenus après 5 minutes d’hydrolyse sous

traitement micro ondes à 50W et dans sous chauffage conventionnel dans les mêmes conditions de

gradient de températures obtenus sous micro-ondes . 1: ALA contrôle sans traitement, 2: trypsine +


chymotrypsine + chauffage conventionnel , 6: Mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7:

Mélange trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

9090

Figure 32: RP-HPLC des hydrolysats d’ALA obtenus sous micro-ondes à 50 Watts après 5 minutesd’hydrolyse.


De manière générale, à 100 Watts et après 3 minutes, les hydrolyses sous micro-

ondes de l’ALA sont plus marquées que les hydrolyses réalisées sous chauffage

conventionnel. Pour l’hydrolyse trypsique sous micro-ondes on observe une persistance

d’une petite quantité d’ALA. Pour les hydrolyses chymotrypsique et avec le mélange de deux

enzymes au cours du traitement thermique conventionnel, les hydrolyses semblent être plus

efficaces que lors des mêmes traitements conventionnels à 50 Watts. Ces hydrolyses

accélérées de l’ALA par les micro-ondes sont vérifiées par chromatographie en phase

inversée qui indique une dégradation totale de l’ALA après hydrolyse chymotrypsique et par

le mélange trypsine/chymotrypsine réalisées sous micro-ondes (figure 34). Pour la

trypsinolyse de l’ALA, comme dans le profil életrophorétique, on remarque l’élution du pic

correspondant à l’ALA native ce qui confirme une hydrolyse incomplète dans ces conditions

de traitement micro-ondes. Les peptides obtenus sont élués entre 15 et 28 minutes.

9191

MMWW ((kkDDaa))

11666,245352518,4

14,4

1 2 3 4 5 6 7





chymotrypsine + chauffage conventionnel , 6: mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7:

mélange trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.


9292


Pour l’hydrolyse trypsique/chymotrypsique de l’ALA sous micro-ondes à 200 W, on

observe que la trypsinolyse est toujours incomplète sous micro-ondes par rapport à

l’hydrolyse réalisée durant le chauffage conventionnel (figure 35). En revanche avec la

chymotrypsine et le mélange des deux enzymes, on obtient une dégradation complète de

l’ALA comparée à la même protéolyse durant le chauffage conventionnel. Les

chromatogrammes enregistrés des hydrolysats d’ALA obtenus sous micro-ondes montrent

que l’hydrolyse ne génère que des polypeptides fortement hydrophobes avec un temps de

rétention (Tr) proche de celui de l’ALA native = 29 minutes (figure 36).

Ces résultats nous confirment, comme avec la BLG, que les micro-ondes accélèrent

les réactions d’hydrolyses enzymatiques par rapport au chauffage conventionnel. Le taux

d’hydrolyse est tout de même influencé par la température finale obtenue à 200 Watts qui

ralentirait l’action des enzymes par leur désactivation.

MMWW ((kkDDaa))116

66,245352518,414,4





chymotrypsine + chauffage conventionnel , 6: Mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7:

Mélange trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

9393


2.7. Hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 50 Watts du lactosérum

bovin à 1% en protéines

L’objectif de cette deuxième partie est de comparer le taux d’hydrolyse par les micro-

ondes de la BLG et de l’ALA lorsque celles-ci sont sous forme purifiée et lorsqu’elles sont

présentes dans un mélange complexe comme le lactosérum bovin.

La figure 37 représente l’électrophorégramme des différents hydrolysats de

lactosérum bovin obtenus sous micro-ondes à 50 Watts et au cours du chauffage

conventionnel. On observe très bien que l’hydrolyse par la trypsine est très faible pour les

deux protéines (BLG et ALA) par rapport à leur hydrolyse dans les formes purifiées. On note

tout de même que l’hydrolyse de la BLG reste plus prononcée par rapport à celle réalisée

avec un chauffage conventionnel avec 43% de BLG hydrolysée contre 28% respectivement

(p<0,001) (tableau 6). L’hydrolyse par la chymotrypsine et par le mélange des deux enzymes

semble être très efficace pour la BLG sous micro-ondes (76 et 96% respectivement) par

rapport au traitement thermique conventionnel (52 et 40% respectivement) (p<0,001). Pour

l’ALA, sous micro-ondes, on observe une résistance aux différentes hydrolyses trypsiques,

chymotrypsiques et au mélange des deux enzymes: 20, 9 et 14% respectivement, alors que

cette protéine est totalement hydrolysée au cours du chauffage conventionnel (100% d’ALA

hydrolysée).

9494

1 2 3 4 5 6 7

Figure 37: SDS-PAGE 12% des hydrolysats de lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes à 50 Watts après 5 min d’hydrolyse et avec un chauffage classique dans les mêmesconditions de gradient de température obtenus sous micro-ondes. 1 : LS contrôle, 2 :trypsine + micro-ondes, 3 : trypsine + chauffage conventionnel, 4 : chymotrypsine + microondes 5 : chymotrypsine + chauffage conventionnel, 6 : mélange trypsine/chymotrypsine +micro-ondes, 7 : mélange trypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

Tableau 6: % d’hydrolyse des protéines du lactosérum (BLG et ALA) obtenus sous micro-ondes à 50 Watts et par chauffage conventionnel mesurés par densitométrie.

% protéines (BLG/ALA) hydrolyséeTraitement

50 Watts50 CC

Trypsine Chymotrypsine (trypsine/chymotrypsine)BLG ALA BLG ALA BLG ALA43±1 20±1 76±3 9±1 96±2 14±128±3 46±2 52±2 100 40±1 100

9595

Figure 38: RP-HPLC des différents hydrolysats du lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondesaprès 5 minutes d’hydrolyse à 50 Watts.

9696

2.8. Hydrolyse trypsique/chymotrypsique du lactosérum bovin à 1% en protéines sous

micro-ondes à 100 Watts.

Les hydrolysats obtenus par hydrolyse trypsique, chymotrypsique et par le mélange

des deux enzymes sous micro-ondes à 100 Watts et durant le chauffage conventionnel ont

étaient caractérisés par SDS-PAGE 12%. Le taux des protéines (BLG et ALA) hydrolysées a été

évalué par densitométrie.

La figure 39 indique clairement que le traitement micro-ondes à 100 Watts à la

température finale de 51,7°C a accéléré les hydrolyses enzymatiques par rapport aux

hydrolyses réalisées sous traitement thermique conventionnel à la même température. Le

taux de protéine hydrolysée est significativement plus important et il est obtenu avec le

mélange trypsique/chymotrypsique : 83% de BLG hydrolysée contre 64% pour le traitement

conventionnel (p<0,01) (tableau 7). En revanche, les taux de BLG hydrolysée restent

inférieurs à ceux obtenus lorsque la BLG est hydrolysée dans sa forme purifiée avec 96 et

70% respectivement. Pour l’ALA, l’hydrolyse est totale pour les hydrolyses chymotrypsique

et le mélange des deux enzymes, alors que pour l’hydrolyse trypsique, le taux d’hydrolyse de

l’ALA sous micro-ondes a atteint 75% contre 8% seulement dans le traitement conventionnel

(p<0,001).

MMWW ((kkDDaa))1 2 3 4 5 6 7

11666,245352518,4

14,4

Figure 39: SDS-PAGE 12% des hydrolysats de lactosérum bovin à 1% obtenus sous microondes à 100 Watts après 3 min d’hydrolyse et avec un chauffage classique dans les mêmesconditions de gradients de température. 1 : LS Contrôle, 2 : trypsine + micro-ondes, 3 :trypsine + chauffage conventionnel, 4 : chymotrypsine + micro-ondes 5 : Chymotrypsine +chauffage conventionnel, 6 : Mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7 : Mélangetrypsine/chymotrypsine + chauffage conventionnel.

9797

Tableau 7 : % d’hydrolyse des protéines du lactosérum (BLG et ALA) d’hydrolysats obtenussous micro-ondes à 100 Watts et par chauffage conventionnel mesurés par densitométrie


100 Watts100CC

Trypsine Chymotrypsine (trypsine/chymotrypsine)BLG ALA BLG ALA BLG ALA75±2 75±1 76±2 100 83±1 1002±0.5 8±3 63±5 97±1 64±2 100

Figure 40: RP-HPLC des hydrolysats du lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes après 3minutes d’hydrolyse à 100 Watts.

9898

2.9. Hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 200 Watts du lactosérum

bovin à 1% en protéines

La figure 41 représente les profils d’électrophorèse en présence de SDS des

hydrolysats trypsique, chymotrypsique et du mélange des deux enzymes

(trypsine/chymotrypsine) de lactosérum bovin, obtenus sous micro-ondes à 200 Watts

(température finale de 63°C), et durant un chauffage thermique à la même température.

Sous micro-ondes à 200 Watts, le taux de BLG hydrolysée atteint 52% alors qu’il n’est que de

8% au cours du traitement thermique conventionnel (p<0,001) (tableau 8).

En revanche, les hydrolyses chymotrypsiques et les hydrolyses par le mélange

trypsine/chymotrypsine ne semblent pas être affectées par les rayonnements micro-ondes.

Le taux de BLG hydrolysée reste comparable dans les deux types de traitements: micro-

ondes et traitement thermique conventionnel.

Pour l’ALA, on remarque une légère résistance à l’hydrolyse trypsique et

chymotrypsique sous micro-ondes alors qu’elle est totalement dégradée dans les conditions

de traitement thermique conventionnel (chymotrypsique et le mélange des deux enzymes).

On obtient 84% d’hydrolyse d’ALA contre 100% respectivement lors des hydrolyses

chymotrypsique sous micro-ondes et le chauffage conventionnel. De même, 85%

d’hydrolyse d’ALA est obtenue par le mélange (trypsine/chymotrypsine) sous micro-ondes

contre 100% avec le traitement thermique conventionnel.

MMWW ((kkDDaa)) 1 2 3 4 5 6 7

11666,245352518,4

14,4

Figure 41: SDS-PAGE 12% des hydrolysats de lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro ondes à 200Watts après 3 min d’hydrolyse et avec un chauffage classique dans les mêmes conditions degradients de température. 1 : LS contrôle, 2 : trypsine + micro-ondes, 3 : trypsine + chauffageconventionnel, 4 : chymotrypsine + micro-ondes 5 : Chymotrypsine + chauffage conventionnel, 6 :Mélange trypsine/chymotrypsine + micro-ondes, 7 : Mélange trypsine/chymotrypsine + chauffageconventionnel.

9999

Tableau 8: % d’hydrolyse des protéines du lactosérum (BLG et ALA) d’hydrolysats obtenussous micro-ondes à 200 Watts et par chauffage conventionnel mesurés par densitométrie


200 Watts200CC

Trypsine Chymotrypsine (trypsine/chymotrypsine)BLG ALA BLG ALA BLG ALA52±3 30±2 62±2 84±2 71±1 85±28±4 2±0.3 68±2 100 70±3 100

Figure 42: RP-HPLC des hydrolysats du lactosérum bovin à 1% obtenus sous micro-ondes après 3minutes d’hydrolyse à 200 Watts.

100100100

2.10. Hydrolysats peptiques de la BLG obtenus sous micro-ondes à 50, 100 et 200 Watts.

L’association d’un traitement thermique par micro-ondes ou par chauffage

conventionnel avec une hydrolyse pepsique a été réalisée. Le but étant d’étudier l’impact

d’un tel traitement, considéré comme subdénaturant, sur la susceptibilité des protéines du

lactosérum bovin, en particulier la BLG, qui est naturellement résistante à la pepsine. L’étude

a concerné les protéines du lactosérum bovin sous leur forme purifiée ou dans le

lactosérum.

La figure 46 représente le profil életrophorétique de la BLG après hydrolyse pepsique

combinée à un traitement par les micro-ondes à 50 Watts durant 5 minutes, et à 100 et 200

Watts pendant 3 minutes.

A 50 et 100 Watts, on observe respectivement, de manière très nette, la persistance des

bandes de BLG dans les puits 1 et 2 (figure 46-A), ce résultat est vérifié par chromatographie

en phase inversée ou on remarque l’élution d’un pic correspondant à la BLG native. (Figure

47-B). En revanche, à 200 Watts, il y a une importante atténuation de la bande de la BLG

(figure 46-A) dont le taux de dégradation est estimé par densitométrie à 52% (figure 48).

Dans les conditions de traitement thermique conventionnel, la BLG reste résistante à

l’hydrolyse pepsique (figure 46-B).

C 1 2 3

A

C 4 5 6B

Figure 46: SDS-PAGE 12% des hydrolysats pepsique de BLG obtenus sous micro-ondes (A) et avecun chauffage conventionnel (B) après 5 minutes d’hydrolyse à 50 Watts, et 3 minutes d’hydrolyse à100 et 200 WattsBLG+ ALA contrôle (C), BLG pepsique 50 Watts (1), BLG100 Watts (2), BLG200 Watts (3).BLG chauffage conventionnel 50 Watts (4), BLG chauffage conventionnel 100 Watts (5), BLGchauffage conventionnel 200 Watts (6)

101101101

L’analyse par RP-HPLC des hydrolysats pepsiques de BLG (figure 47-B) indique

effectivement une hydrolyse partielle de la protéine à 200 Watts, alors qu’à 50 et 100 Watts

aucune protéolyse n’est observée. Les peptides obtenus ont un temps de rétention (T r) qui

se situe entre 7 et 23 minutes. Ces peptides sont moins hydrophobes que ceux obtenus avec

les hydrolyses trypsique et chymotrypsique de la BLG, car le massif peptidique est plus

décalé par rapport à la BLG native (Tr = 33 min).

A

B

Figure 47: RP-HPLC des hydrolysats pepsiques de la BLG obtenus sous micro-ondes à 50 Watts (5 mind’hydrolyse) 100 et 200 Watts (3 min d’hydrolyse).

102102102

Figure 48: % de BLG résiduelle et hydrolysée après une hydrolyse pepsique combinée à untraitement thermique par les micro-ondes à 50 Watts pendant 5 minutes, 100 et 200 Wattsdurant 3 minutes.

2.11. Caractérisation des hydrolysats peptiques de l’ALA obtenus sous micro-ondes à 50,

100 et 200 Watts

L’hydrolyse pepsique de l’ALA bovine a été réalisée sous micro-ondes dans les mêmes

conditions que celles de la BLG: à 50 Watts pendant 5 minutes et à 100 Watts et 200 Watts

pendant 3 minutes. La figure 49 montre le profil SDS-PAGE des hydrolysats d’ALA obtenus.

On observe une dégradation complète de l’ALA à 200 Watts. Ces résultats sont confirmés

par la chromatographie en phase inversée (figure 50), qui indique une disparition du pic élué

à Tr 31,8 minutes correspondant à l’ALA avec un massif peptidique assez hydrophobe élué

entre 20 et 30,9 minutes.

A 50 et 100 Watts, correspondant aux puits 1 et 2 du profil électrophorétique, on

observe une trainée dans l’hydrolyse de la protéine. En revanche, en chromatographie, les

pics d’ALA restent intacts et sont élués à Tr 31,9 minutes (figure 50).

103103103

C 1 2 3

Figure 49: SDS-PAGE 12% des hydrolysats pepsiques de l’ALA bovine sous micro onde après 5minutes d’hydrolyse à 50 Watts, et pendant 3 minutes d’hydrolyse à 100 et 200 Watts.BLG + ALA contrôle (C), ALA 50 Watts (1), ALA 100 Watts (2), ALA 200 Watts (3).

Figure 50: RP-HPLC des hydrolysats pepsiques de l’ALA bovine obtenus sous micro-ondes à 50 Watts(5 min d’hydrolyse) et à 100 et 200 Watts (3min d’hydrolyse).

104104104

2.12. Caractérisation des hydrolysats peptiques du lactosérum bovin 1% sous micro-

ondes à 50, 100 et 200 Watts.

Comme pour les hydrolyses trypsiques et chymotrypsiques, nous avons comparé

l’hydrolyse pepsique des deux protéines (BLG/ALA) entre leur formes purifiées et quand elles

sont présentes dans le milieu complexe du lactosérum bovin.

La figure 51 représente les hydrolysats de lactosérum bovin après pepsinolyse sous

micro-ondes à 50 Watts pendant 5 minutes, et à 100 et 200 Watts durant 3 minutes.

A 200 Watts, la BLG est hydrolysée à 44%, quelle que soit sa forme, purifiée ou présente

dans le lactosérum, (figure 52). Ces résultats sont confirmés par chromatographie en phase

inversée (figure 53), qui montre l’apparition des peptides issus de la dégradation de la BLG

élués entre Tr 16 et 29 minutes. En revanche, aucune forme d’hydrolyse de la protéine n’est

observée à 50 et à 100 Watts (0% de protéine hydrolysée).

Ces résultats montrent donc que les deux protéines (ALA et BLG) restent intactes durant

l’hydrolyse sous micro-ondes à 50 et 100 Watts.

BLGALA

C 1 2 3

Figure 51: SDS-PAGE 12% des hydrolysats pepsiques de lactosérum bovin obtenus sousmicro-ondes après 5 minutes d’hydrolyse à 50 Watts, et après 3 minutes d’hydrolyse à 100et 200 Watts.Lactosérum 1% contrôle (C), Lactosérum 1% à 50 Watts (1), Lactosérum 1% à 100 Watts (2),Lactosérum 1% à 200 Watts (3).

105105105

Figure 52: % de BLG résiduelle et hydrolysée après hydrolyse pepsique combinée à untraitement thermique par les micro-ondes à 50 Watts pendant 5 minutes, 100 et 200 Wattsdurant 3 minutes.

Figure 53: RP-HPLC des hydrolysats pepsiques du lactosérum bovin obtenus sous micro-ondes à 50 Watts (5min d’hydrolyse) 100 et 200 Watts (3min d’hydrolyse).

106106106

3. IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS INTENSIFS CONTRE LES IgGPOLYCLONAUX OBTENUS CHEZ LE LAPIN NÉOZÉLANDAIS

Dans cette partie de travail, l’objectif principal est d’évaluer l’impact des micro-ondes

et du chauffage conventionnel sur la capacité de liaison et de l’immunoréactivité des

différents hydrolysats de la BLG et de l’ALA.

L’approche se fera par l’étude :

De l’immunoréactivité des hydrolysats avec des anticorps de type IgG polyclonaux

produits chez le lapin néozélandais et contre des IgE humaines.

Des tests de provocation d’anaphylaxie en chambre de Ussing sur l’intestin de souris Balb/C

utilisé comme modèle d’allergie aux PLV.

3.1. Titres en IgGs anti-BLG et anti-ALA bovines chez le lapin néo-zélandais

Le degré de sensibilisation des animaux à la BLG et à l’ALA a été mesuré par dosage

immuno-enzymatique indirect (ELISA-indirect). Le niveau de production d’IgG spécifiques

anti BLG et anti ALA est indétectable à J0. Après 40 jours d’immunisation, les lapins

développent des taux très élevés d’IgG spécifiques et atteignent des titres sériques de

(1/250 000ème) (p< 0,001) pour les IgG anti BLG et de 1/5 500000ème pour les IgG anti ALA

(p<0,001) (figure 54).

107107107

Figure 54: Titres en IgG polyclonaux anti-BLG et anti-ALA obtenus chez le lapin néozélandais

108108108

%lia

ison

sIgG

-BLG

3.2. Immunoréactivité des hydrolysats obtenus sous micro-ondes contre les IgG anti-

BLG

La figure 55 représente les courbes d’inhibition obtenues par le test ELISA indirect

par compétition. Ces courbes traduisent la capacité des hydrolysats à inhiber la liaison des

IgG anti-BLG avec la BLG native adsorbée sur le support des plaques. Cette capacité

d’inhibition est calculée à partir de la concentration en hydrolysats nécessaires pour inhiber

50% des IgG anti-BLG (IC50). Nos résultats montrent que le lactosérum témoin présente une

IC50 = 3,36 µg/ml, les hydrolysats trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes et durant le

chauffage conventionnel ont des IC50 de 2,11 et 5,43 µg/ml respectivement. Ces IC50 sont

significativement différentes de celles du lactosérum contrôle (p<0,01). Ces résultats

préliminaires montrent que l’hydrolyse trypsique/chymotrypsique du lactosérum sous

micro-ondes à 50 Watts a augmenté son immunoréactivité par rapport aux hydrolysats

obtenus durant le chauffage conventionnel.

Figure 55: Inhibition de la liaison IgG-BLG native par les hydrolysats de lactosérum obtenuspar hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 50 Watts après 5 minutes detraitement.La concentration des compétiteurs est exprimée en µg/ml et l’inhibition en pourcentage.

109109109

%lia

ison

sIgG

-BLG

Pour les hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques sous micro-ondes à 100 Watts et

dans les mêmes conditions de température durant le chauffage conventionnel, l’IC50 est

significativement différente de celle du lactosérum contrôle (p<0,001) (figure 56), alors

qu’aucune différence significative n’est observée entre l’immunoréactivité des deux

hydrolysats dont les valeurs de l’IC50 sont de 5,01 et de 4,096 µg/ml respectivement.

Figure 56: Inhibition de la liaison IgG-BLG native par les hydrolysats de lactosérum obtenuspar hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 100 Watts après 3 minutes detraitement.

La concentration des compétiteurs est exprimée en µg/ml et l’inhibition en pourcentage.

110110110

%lia

ison

sIgG

-BLG

Dans l’hydrolyse peptique sous micro-ondes à 200 Watts, l’IC50 est très

significativement différente de celle du lactosérum contrôle, avec une valeur de 28,8 µg/ml

(p<0,001) (figure 57). L’IC50 de l’hydrolysat peptique obtenu durant le chauffage

conventionnel est de 2,41 µg/ml, témoignant d’une augmentation de son immunoréactivité

par rapport au lactosérum contrôle (IC50 = 3,36 µg/ml). Ces résultats montrent que

l’hydrolysat de BLG obtenu sous micro-ondes à 200 Watts a une immunoréactivité 10 fois

inférieure au lactosérum contrôle et à celui hydrolysé durant le chauffage conventionnel.

Figure 57: Inhibition de la liaison IgG-BLG native par les hydrolysats de lactosérum obtenuspar hydrolyse peptique sous micro-ondes à 200 Watts après 3 minutes de traitement.


111111111

%lia

ison

sIgG

-ALA

3.3. Immunoréactivité des hydrolysats de lactosérums obtenus sous micro-ondes contre

les IgG anti-ALA

La figure 58 représente les résultats d’inhibition des IgG-ALA bovine par les

hydrolysats de lactosérum obtenus par le mélange trypsine/chymotrypsine à 50 Watts

pendant 5 minutes. Nos résultats montrent que les hydrolyses par la trypsine et la

chymotrypsine réduisent significativement l’immunoréactivité des hydrolysats du

lactosérum sous chauffage conventionnel et sous micro-ondes avec respectivement une IC50

> 500 µg/ml et 50 µg/ml contre un IC50 de 3,36 µg/ml pour le lactosérum témoin (p<0,001).

L’IC50 des hydrolysats de lactosérum obtenus sous chauffage conventionnel est cent fois

supérieur à celle des hydrolysats obtenus sous micro-ondes (IC50 >500 µg contre 50 µg/ml

pour l’hydrolysat obtenu sous micro-ondes).

Figure 58: Inhibition de la liaison IgG-ALA native par les hydrolysats de lactosérum obtenuspar hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 50 Watts après 5 minutes detraitement.


112112112

%lia

ison

sIgG

-ALA

Les profils d’inhibition des hydrolysats de lactosérum obtenus sous traitement micro-

ondes à 100 Watts et durant le chauffage conventionnel sont représentés dans la figure 59.

On observe une importante diminution des immunoréactivités d’hydrolysats obtenus sous

micro-ondes et durant le chauffage conventionnel par rapport au lactosérum contrôle. Les

IC50 calculées sont 200 fois supérieures à celle du lactosérum contrôle (IC50=3,36 µg/ml).

Log [Hydrolysats] µg/ml

Figure 59: Inhibition de la liaison IgG-ALA native par les hydrolysats de lactosérum obtenuspar hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 100 Watts après 3 minutes detraitement.


113113113

%lia

ison

sIgG

-ALA

A 200 Watts et durant un chauffage conventionnel à la même température, (figure

60) nos résultats montrent encore une fois l’efficacité de l’hydrolyse enzymatique à réduire

significativement l’immunoréactivité du lactosérum dans les deux types de traitements

thermiques (micro-ondes ou chauffage conventionnel) (p<0,0001). Les IC50 des deux

hydrolysats sont supérieures à 500 µg/ml.

En conclusion, ces résultats préliminaires sur l’étude de l’immunoréactivité des

différents hydrolysats indiquent l’efficacité des hydrolyses enzymatiques sous micro-ondes

ou au cours d’un chauffage conventionnel à réduire significativement l’immunoréactivité du

lactosérum par la destruction des épitopes antigéniques de la BLG et de l’ALA bovine.

Log [Hydrolysats] µg/ml

Figure 60: Inhibition de la liaison IgG-ALA native par les hydrolysats de lactosérum obtenuspar hydrolyse peptique sous micro-ondes à 200 Watts après 3 minutes de traitement.


114114114

4. ÉTUDE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES HYDROLYSATS OBTENUS SOUS MICRO-ONDES ET EN CONDITIONS DE CHAUFFAGE CONVENTIONNEL

4.1. Titres sériques en immunoglobulines (IgG et IgE) anti-BLG et anti-ALA des souris

Balb/c

Après immunisation des souris Balb/c à la BLG et à l’ALA, le titrage des anticorps sériques

IgG, IgG1, IgG2a et IgE anti-BLG et anti-ALA a été réalisé par test immuno-enzymatique ELISA-

indirect.

4.1.1. Titres sériques en IgG :

A J0, c'est-à-dire avant toute immunisation, les taux sont indétectables. Après 35 jours

d’immunisation (J35), les anticorps sériques IgG anti-BLG et anti-ALA sont produits de façon

hautement significative (p<0,001). Ces titres sériques atteignent 1/270.000ème et 1/ 500ème

pour les IgG anti-BLG et anti-ALA respectivement (figure 61).

IgG (Log 1 /titre)

IgG anti-BLG IgG anti-ALAFigure 61: Titres en IgG sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA à J0 et

J35 chez des souris Balb/c immunisées à la BLG (n=6) et à l’ALA (n=6).

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.J0 : Titre avant toute immunisation.J35 : Titre après 35 jours d’immunisation.*** p<0,001

115115115

4.1.2. Titres sériques en IgE

A J35 les titres sériques en IgE anti-BLG augmentent de façon hautement significative

(p<0,001) et représentent 1/14ème. Les IgE anti-ALA sont également très significativement

élevées (p<0,01) avec un titre de 1/12ème. La présence des IgE dans le sérum des souris

traduit une réponse immunitaire IgE dépendante (Figure 62).

IgE (Log 1 /titre)

IgE anti-BLG IgE anti-ALA

Figure 62: Titres en IgE sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA à J0 et J35

chez des souris Balb/c immunisées à la BLG (n=6) et à l’ALA (n=6)

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.J0 : Titre avant toute immunisation.J35 : Titre après 35 jours d’immunisation.** p<0,01*** p<0,001

116116116

4.1.3. Titre sérique en IgG1

Les taux des titres sériques en IgG1 anti-BLG et anti-ALA représentent respectivement

des taux significativement élevés 1/45500ème (p<0,001) et 1/ 52ème (p<0,01) au 35ème jour

d’immunisation comparés aux témoins (Figure 63).

IgG1 (Log 1 /titre)

anti-BLG anti-ALA

Figure 63: Titres en IgG1 sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA à J0 et

J35 chez des souris Balb/c immunisées à la BLG (n=6) et à l’ALA (n=6).

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.J0 : Titre avant toute immunisation.J 35 : Titre après 35 jours d’immunisation.** p<0,01*** p<0,001

117117117

4.1.4. Titres sériques en IgG2a

La réponse en anticorps IgG2a anti-BLG et IgG2a anti-ALA à J35 est significativement élevée.

Les valeurs obtenues sont de 1/260ème (p<0,001) et 1/ 28ème (p<0,01) respectivement.

IgG2a (Log 1 /titre)

anti- BLG anti-ALA

Figure 64: Titres en IgG 2a sériques anti-BLG et anti-ALA mesurés par la méthode ELISA à J0 et

J35 chez des souris Balb/c immunisées à la BLG (n=6) et à l’ALA (n=6)

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.J0 : Titre avant toute immunisation.J35 : Titre après 35 jours d’immunisation.** p<0,01*** p<0,001

118118118

4.2. Évaluation du rapport IgG1/IgG2a

Il est admis que le rapport IgG1/IgG2a renseigne sur le type de réponse immune

développée chez les souris au cours de l’immunisation. Dans notre travail, ce rapport est

nettement supérieur à 1 : 3,88 et 1,12 respectivement pour les souris immunisées à la BLG et

à l’ALA). On peut donc conclure que les souris Balb/c ont développé une réponse

immunitaire à prédominance Th2.

4.3. Test de provocation in vitro en chambre de Ussing

L’objectif de cette partie de travail est de vérifier l’existence d’une réponse

anaphylactique locale chez les souris Balb/c immunisées aux protéines lactosériques BLG et

ALA et de mesurer son amplitude. La mise en contact directe de ces deux protéines et des

hydrolysats de lactosérum avec l’épithélium jéjunal nous a permis d’évaluer leur effets sur

les paramètres électro-physiologiques du tissu. Pour rappel, le dispositif de la chambre de

Ussing permet de mesurer le courant de court-circuit (Isc, µA/cm2) qui est un index de la

sécrétion électrogénique de Cl-, la différence de potentiel (DDP, mV) entre les deux faces du

tissu et la conductance (G, mmho/cm2) qui exprime un index de l’intégrité épithéliale, en

particulier au niveau des jonctions cellulaires. Dans toutes nos expériences, chaque tissu est

son propre témoin. Pour chaque paramètre lors du test de provocation, les valeurs sont

recueillies à l’état basal, c'est-à-dire avant toute stimulation, puis après le test de

provocation, c'est-à-dire au moment du dépôt de la protéine ou de l’hydrolysat dans le

compartiment séreux pendant au moins 20 minutes.

4.3.1. Effet de la BLG et de l’ALA sur le courant de court-circuit tissulaire l’Isc

Après montage en chambre de Ussing d’un fragment jéjunal d’intestin de souris

immunisées à la BLG et stimulé par cet allergène à une concentration de 10 µg/ml, on note

une augmentation significative de l’Isc qui passe des valeurs de base de 47,6 ± 6,79 µA/cm2

à 65,26 ± 7,40 µA/cm2 (ΔIsc = 17,66 ± 6,5 µA/cm2) (p<0,001). Pour les souris immunisées à

l’ALA et stimulées par l’ALA, les valeurs de bases de l’Isc passent de 39,93 ± 4,56 µA/cm2 à

56,08 ± 4,80 µA/cm2 (ΔIsc = 16,15± 5 µA/cm2 ; p<0,001).

En comparaison, la stimulation des intestins de souris naïves (non immunisées) par la

BLG ou l’ALA n’entraine aucune variation significative de l’Isc (Figure 65).

119119119

Ces résultats suggèrent donc l’existence d’une réaction anaphylactique locale produite

par l’interaction directe des antigènes sensibilisants avec les cellules immunocompétentes

de la muqueuse intestinale des animaux sensibilisés à la BLG ou à l’ALA.

Isc (µA/cm2)

-20

Figure 65: Effet de la BLG et l’ALA sur le courant de court-circuit (Isc) mesuré en chambre deUssing sur des fragments jéjunaux de souris sensibilisées par voie intrapéritonéale à la BLGet l’ALA.

Avant stimulation, les valeurs de base de l’Isc sont recueillies pendant 20 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (BLG ou l’ALA) est déposé dans le versant séreux à uneconcentration de 10 µg/ml.

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.BLG (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à la BLG native.ALA (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à l’ALA native.Témoins (n=6) : Tissus d’animaux témoins non sensibilisés.*p<0,05**p<0,01***p<0,001

120120120

4.3.2. Effet de la BLG et de l’ALA sur la différence de potentiel du tissu (DDP)

Les variations de la différence de potentiel (DDP) des tissus d’animaux sensibilisés ou

non, sont représentées dans la figure 66. On ne note aucune modification significative de la

DDP après stimulation des fragments d’intestins de souris immunisées à la BLG ou à l’ALA

Figure 66: Effet de la BLG et l’ALA sur la différence de potentiel (DDP) mesurée en chambre

de Ussing sur des fragments jéjunaux de souris sensibilisées à la BLG ou l’ALA.

Avant stimulation, les valeurs de base de la DDP sont recueillies pendant 20 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (BLG ou l’ALA) est déposé dans le versant séreux à uneconcentration de 10µg/ml.Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.BLG (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à la BLG native.ALA (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à l’ALA native.Témoins (n=6) : Tissus d’animaux témoins non sensibilisés.*p<0,05**p<0,01***p<0,001

121121121

4.3.3. Effet de la BLG et de l’ALA sur la conductance (G)

La figure 67 représente les variations de la conductance des tissus d’animaux mis en

contact avec les allergènes (BLG et ALA). Les valeurs de G augmentent de 23,43 ± 2,86

mmho/cm2 à 28,90 ± 3,05mmho/cm2 (p<0,001) chez des souris immunisées et stimulées à la

BLG et de 21,29 ± 2,56 mmho/cm2 à 26,06 ± 3,06 mmho/cm2 (p<0,001) chez des souris

immunisées et stimulées à l’ALA. Cette augmentation de la conductance est synonyme d’une

diminution de la résistance, par un relâchement de la muqueuse. Ce relâchement peut être

expliqué physiologiquement par une augmentation de la perméabilité intestinale dans

l’allergie aux protéines alimentaire.

Figure 67: Effet de la BLG et l’ALA sur la conductance (G) mesurée en chambre de Ussing surdes fragments jéjunaux de souris sensibilisées à la BLG ou l’ALA.

Avant stimulation, les valeurs de base de la G sont recueillies pendant 20 minutes.

A t=0 l’antigène sensibilisant (BLG ou ALA) est déposé dans le versant séreux à uneconcentration de 10 µg/ml.

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.BLG (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à la BLG native.ALA (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à l’ALA native.Témoins (n=6) : Tissus d’animaux témoins non sensibilisés.*p<0,05**p<0,01***p<0,001

122122122

5. ÉVALUATION DE L’ALLERGÉNICITÉ DES DIFFÉRENTS HYDROLYSATSENZYMATIQUES OBTENUS SOUS MICRO-ONDES ET AU COURS DUCHAUFFAGE CONVENTIONNEL

5.1. Étude du potentiel allergénique des trois hydrolysats de lactosérum sélectionnés,

par « challenge » intestinal en chambre de Ussing chez les souris sensibilisées contre la

BLG : test de provocation en chambre de Ussing

5.1.1. Hydrolysats trypsique/chymotrypsique du lactosérum traité à 50 Watts et

par chauffage conventionnel à 43,2°C

Le dépôt de la BLG native dans le compartiment séreux entraine une augmentation

très significative de l’Isc, qui passe de 47,60 ± 6,79 à 65,26 ± 7,4 µA/cm2, traduisant une

réaction anaphylactique brutale du tissu stimulé par l’antigène sensibilisant. La même

réponse est obtenue lorsque les fragments jéjunaux sont stimulés dans les mêmes

conditions, mais cette fois ci avec les hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques obtenus sous

micro-ondes à 50 watts ou après chauffage conventionnel à 43,2°C (Fig 68-A, 68-D).

En revanche, les valeurs de l’Isc restent inchangées après le dépôt de l’hydrolysat

trypsique/chymotrypsique obtenus sous micro-ondes à 100 watts, alors que les valeurs de

d’Isc augmentent très significativement (p<0,001) (figures 68-B, 68-E) après stimulation avec

l’hydrolysat du lactosérum trypsique/chymotrypsique obtenu avec un chauffage

conventionnel à 51,7°C.

Les mêmes effets sont observés après stimulation des fragments d’intestins de souris

sensibilisées contre la BLG avec les hydrolysats peptiques de lactosérum obtenus sous micro-

ondes à 200 watts et durant le traitement thermique conventionnel à 63,5° C. Nos résultats

indiquent une augmentation très significative de l’Isc après stimulation du tissu par

l’hydrolysat de lactosérum traité au chauffage conventionnel (p<0,001). Sous micro-ondes à

200 watts, les valeurs de l’Isc restent inchangées traduisant l’absence de toute réaction

anaphylactique locale. (Figures 68-C et 68-F).

123123123

A D

Dépôt d’antigènes

***

Dépôt d’antigènes B E

***

***

***

C FDépôt d’antigènes

***

***

Figure 68: Effet de la BLG et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro-ondes et durant un chauffage conventionnel sur le courant decourt circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux de souris sensibilisées àla BLG. (A) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 50 Watts et durant lechauffage conventionnel. (B) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro-ondes à 100Watts et durant le chauffage conventionnel. (C) hydrolyse peptique réalisée sous micro-ondes à 200Watts et durant le chauffage conventionnel. Les valeurs des ΔIsc (µA/cm²) de chaque traitement sontreprésentées dans les figures D, E et F pour les hydrolysats obtenus à 50 Watts, 100 Watts et 200Watts.Avant stimulation, les valeurs de base de l’Isc sont recueillies pendant 15 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (BLG) ou les différents hydrolysats testés sont déposés dans le versantséreux à une concentration de 10 µg/ml et de 20 µg/ml respectivement.

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.BLG, LS50 Watts, LS100 Watts, LS200 Watts (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à la BLG native.

124124124

5.1.2. Effet sur la différence de potentiel (DDP)

Les figures 69-A, 69-B et 69-C représentent les variations de la DDP des tissus jéjunaux

de souris immunisées à la BLG. L’introduction ou la stimulation des fragments jéjunaux de

souris immunisées contre la BLG par les hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques et

peptiques de lactosérum ne produit aucune modification des valeurs de base de la DDP qui

restent stables durant toute l’étude.

125125125

A

Dépôt d’antigène

BDépôt d’antigène

C

Figure 69: Effet de la BLG et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro-ondes et durant un chauffage conventionnel sur la différencede potentiel (DDP) mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux de souris sensibiliséesà la BLG. (A) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 50 Watts et durant lechauffage conventionnel. (B) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 100Watts et durant le chauffage conventionnel. (C) hydrolyse pepsique réalisée sous micro ondes à 200Watts et durant le chauffage conventionnel.Avant stimulation, les valeurs de base de la DDP sont recueillies pendant 15 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (BLG) ou les différents hydrolysats testés sont déposés dans le versantséreux à une concentration de 10 µg/ml et de 20 µg/ml respectivement.Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.

126126126

5.1.3. Effet sur la conductance (G)

Une augmentation très significative de la conductance est observée après stimulation

des fragments jéjunaux des souris immunisées à la BLG par les d’hydrolysats

trypsique/chymotrypsique obtenus sous micro-ondes à 50 WATTS et par leurs équivalents

obtenus durant le chauffage conventionnel à 43,2°C. Les valeurs passent respectivement

de 25,56 ± 2,37 mmho/cm2 à 33,22 ± 2,11 mmho/cm2 et de 21,32 ± 5,09 mmho/cm2 à 28,25

± 6,04 mmho/cm2 (p<0,0001) (figure 70-A).

En revanche, sous micro-ondes à 100 Watts et à 200 Watts, les valeurs de la

conductance restent stables alors qu’elles passent de 18,12 ± 1,91 à 26,72 ± 3,23 et de

29,26 ± 3,31 à 42,57 ± 4,87 mmho/cm² au cours du chauffage conventionnel à 51,7°C et

63,5°C respectivement (p<0,001) (figures 70-B et 70-C).

127127127

ADépôt d’antigène

***

BDépôt d’antigène

***

Dépôt d’antigèneC

***

***

Figure 70: Effet de la BLG et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et peptique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur laconductance du tissu (G) mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux de sourissensibilisées à la BLG. (A) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 50 Wattset durant le chauffage conventionnel. (B) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous microondes à 100 Watts et durant chauffage conventionnel. (C) hydrolyse pepsique réalisée sous microondes à 200 Watts et durant le chauffage conventionnel.A t0 l’antigène sensibilisant (BLG) et les différents hydrolysats sont déposés dans le versant séreux àune concentration de 10µg/ml et de 20µg/ml respectivement.Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.BLG, LS50 Watts, LS100 Watts, LS200 Watts (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à BLG native.***p<0,001

128128128

5.2. Étude du potentiel allergénique des trois hydrolysats de lactosérum sélectionnés

par « challenge » intestinal en chambre de Ussing chez les souris sensibilisées

contre l’ALA

5.2.1. Effet sur l’Isc

L’Isc augmente très significativement après stimulation des tissus par l’ALA native et

par l’hydrolysat trypsique/chymotrypsique de lactosérum obtenu sous micro-ondes à 50

Watts. Les valeurs passent de 39,93 ± 4,56 à 56,08 ± 4,80 (ΔIsc = 16,15 ± 5,43 µA/cm²) et de

71,86 ± 8,42 à 93,92 ± 7,22 (ΔIsc = 22,06 ± 8,51 µA/cm²) respectivement (p<0,001) (Figure

71-A). Le challenge avec l’hydrolysat de lactosérum obtenu par chauffage conventionnel à

43,2°C reste en revanche sans effet significatif sur les valeurs d’Isc (ΔIsc = 6,85 ± 2,08

µA/cm²), figure 71-D.

Les mêmes observations sont enregistrées après la stimulation des tissus avec les

hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques de lactosérum obtenus sous micro-ondes à 100 et à

200 Watts et avec ceux obtenus au cours des chauffages conventionnels correspondant à ces

niveaux de puissances (51,7°C et 63,5°C respectivement) (figures 71-B, 71-C).

Nos résultats montrent qu’après stimulation par les deux hydrolysats

trypsiques/chymotrypsiques, l’amplitude des augmentations des valeurs d’Isc est différente.

L’augmentation des valeurs du ΔIsc est moins importante après challenge avec l’hydrolysat

de lactosérum au cours du chauffage conventionnel (ΔIsc = 14,65 ± 4,89) comparé à celui

produit sous micro-ondes à 100 Watts (ΔIsc = 22,15 ± 7,17, p< 0,001) (figures 71-E). Ce ΔIsc

est même supérieur à celui enregistré avec l’ALA native (16,15 ± 5,43, p<0,001). Ceci peut

être lié aux produits de dégradation de l’ALA obtenus lors de l’hydrolyse qui conservent

toujours une charge épitopiques allergénique. En effet, nos résultats ont montré que

l’hydrolyse de l’ALA restait incomplète sous micro-ondes avec production de peptides

intermédiaires de haut poids moléculaire et la persistance d’ALA résiduelle intacte. Ceci

pourrait être à l’origine d’un démasquage de certains épitope enfouis au cœur de l’ALA.

129129129

5.2.2. Effet sur la différence de potentiel (DDP)

Les figures 72-A-B-C représentent les variations de la DDP des tissus jéjunaux de souris

immunisées à l’ALA après challenge avec les hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques et

peptiques obtenus sous micro-ondes à 50, 100 et 200 Watts respectivement ou durant le

chauffage conventionnel. L’introduction ou la stimulation des fragments jéjunaux de souris

immunisées contre l’ALA par les différents hydrolysats de lactosérum ne produit aucune

modification des valeurs de base de la DDP qui restent stables durant toute l’étude.

130130130

Dépôt d’antigèneA

***

***

D

BDépôt d’antigène ***

***

E

CDépôt d’antigène ***

***

F

Figure 71: Effet de l’ALA et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur le courant decourt circuit (Isc) mesuré en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux de souris sensibilisées àl’ALA. (A) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 50 Watts et durant lechauffage conventionnel. (B) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 100Watts et durant le chauffage conventionnel. (C) hydrolyse pepsique réalisée sous micro ondes à 200Watts et durant le chauffage conventionnel.

Avant stimulation, les valeurs de base de l’Isc sont recueillies pendant 15 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (ALA) ou les différents hydrolysats testés sont déposés dans le versantséreux à une concentration de 10µg/ml et de 20µg/ml respectivement.Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.ALA, LS50 Watts, LS100 Watts, LS200 Watts (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à ALA native.

131131131

ADépôt de l’antigène

BDépôt de l’antigène

CDépôt de l’antigène

Figure 72: Effet de l’ALA et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique delactosérum bovin obtenus sous micro ondes et durant un chauffage conventionnel sur la différencede potentiel (DDP) mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux de souris sensibiliséesà l’ALA. (A) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 50 Watts et durant lechauffage conventionnel. (B) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 100Watts et durant le chauffage conventionnel. (C) hydrolyse pepsique réalisée sous micro ondes à 200Watts et durant le chauffage conventionnel

Avant stimulation, les valeurs de base de la DDP sont recueillies pendant 15 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (ALA) ou les différents hydrolysats testés sont déposés dans le versantséreux à une concentration de 10 µg/ml et de 20 µg/ml respectivement.

Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.ALA, LS50 Watts, LS100 Watts, LS200 Watts (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à l’ALA native.

132132132

5.2.3. Effet sur la conductance (G)

Les effets observés des hydrolysats trypsique/chymotrypsique et peptiques obtenus

sous micro-ondes et durant un chauffage thermique conventionnel sur la conductance des

jéjunums de souris immunisées à l’ALA sont représentés par la figure 73-A, 73-B et 73-C.

Nos résultats indiquent une augmentation très significative de la conductance après

stimulation des tissus de souris immunisées à l’ALA par les d’hydrolysats

trypsique/chymotrypsique obtenus à 50 Watts, 100 watts et 200 watts avec des valeurs qui

passent de 43,92 ± 8,97 mmho/cm2 à 55,20 ± 8,04 mmho/cm2 , de 36,02 ± 6,85 à 51,1 ±

7,76 et de 38,15 ± 2,56 à 45,24 ± 3,15 mmho/cm² respectivement (p<0,01). Le même effet

est observé avec les hydrolysats obtenusau cours du chauffage conventionnel à 63,5°C, alors

que la conductance reste stable au cours du chauffage conventionnel à 43,2°C et à 51,7°C.

133133133

RESULTATS

ADépôt de l’antigène

B

Dépôt de l’antigène

CDépôt de l’antigène

Figure 73: Effet de l’ALA et des hydrolysats du mélange trypsique/chymotrypsique et pepsique de lactosérumbovin obtenus sous micro-ondes et durant un chauffage conventionnel sur la conductance tissulaire (G)mesurée en chambre de Ussing sur des fragments jéjunaux de souris sensibilisées à l’ALA. (A) hydrolysetrypsique/chymotrypsique réalisée sous micro ondes à 50 Watts et durant le chauffage conventionnel après 5minutes d’hydrolyse. (B) hydrolyse trypsique/chymotrypsique réalisée sous micro-ondes à 100 Watts et durantle chauffage conventionnel après 3 minutes. (C) hydrolyse pepsique réalisée sous micro-ondes à 200 Watts etdurant le chauffage conventionnel après 3 minutes d’hydrolyse.Avant stimulation, les valeurs de base de la conductance sont recueillies pendant 15 minutes.A t0 l’antigène sensibilisant (ALA) ou les différents hydrolysats testés sont déposés dans le versant séreux à uneconcentration de 10 µg/ml et de 20 µg/ml respectivement.Les valeurs exprimées sont des moyennes et leurs erreurs standards.ALA, LS50 Watts, LS100 Watts S, LS200Watts (n=6) : Tissus d’animaux sensibilisés à l’ALA native.

134134134

RESULTATS

6. PROFIL DES RÉPONSES IgE SPÉCIFIQUES AUX ALLERGÈNES PAR TEST ELISAFLUORIMÉTRIQUE CHEZ LES NOUVEAU-NÉS ALLERGIQUES AU LAIT DEVACHE.

Après avoir évalué l’immunoréactivité et le potentiel allergénique des hydrolysats

intensifs de protéines du lactosérum à partir du modèle animal d’allergie aux protéines du

lait de vache, l’objectif de cette partie du travail porte sur l’étude de l’interaction de ces

hydrolysats de lactosérum contre les IgE humaines.

Ces IgE proviennent de sérums de jeunes nouveau-nés recrutés auprès du service de

pédiatrie «C» A. Cabral dans le cadre d’une collaboration avec le Pr M. TOUHAMI et le Pr G.

BOUDRAA. L’allergie aux protéines de lait de vache a été confirmée après un diagnostic

clinique positif. Le dosage des IgE spécifiques anti protéines du lait (BLG, ALA, Caséine-s1,

Caséines-s2et Caséine-) a été réalisé par un test ELISA-fluorimétrique.

La gamme étalon d’IgE spécifiques a été réalisée à partir d’une courbe obtenue avec

une série de dilutions d'un sérum de référence selon les recommandations de la 2ème

Préparation Internationale de Référence (IRP) 75/502 d’Immunoglobulines E sériques de

l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) (OMS CENB 1973; B WHO 1973). En conséquence,

les résultats d’IgE obtenus avec le test sont indirectement liés à l’IRP 75/502 IgE de l’OMS

(figure 74).

135135135

RESULTATS

Figure 74: Courbe obtenue après correction de la gamme étalon des IgE standards (OMS,1973).

136136136

RESULTATS

Les patients sont répartis en fonction de leur symptomatologie selon la classification de

Furlong et al. (2001). Les manifestations cliniques sont majoritairement gastro-intestinales

(formes digestives), survenant après l’ingestion des protéines du lait ou de dérivés. Elles

peuvent être de types légères (58 sérums), modérées (7 sérums), ou sévères (2 sérums)

(figure 75).

Figure 75: Classes cliniques observées dans le groupe de nouveau-nés étudié, selon Furlonget al. (2001).

137137137

RESULTATS

6.1. Profil de sensibilisation des nouveau-nés établi par dosage des IgE spécifiques

La figure 76 représente les résultats du dosage des IgE spécifiques anti protéines du

lait chez les enfants allergiques. On remarque que plus de 70% des enfants présentent une

polysensibilisation contre toutes les protéines du lait ou au moins à deux allergènes. La

sensibilisation est prédominante aux deux protéines du lactosérum bovin la BLG et l’ALA

dans plus de 70% des cas et est associée (BLG et ALA) dans 90% des cas des sensibilisations à

ces deux protéines. Ces résultats préliminaires permettent de conclure que la sensibilisation

à la BLG ou à l’ALA est peu isolée et qu’elle pourrait être à l’origine de certaines réactions

croisées entre des séquences homologues à ces deux protéines.

A B

C D

Figure 76: Dosage des IgE spécifiques anti protéines du lait chez les nouveaux nés allergiquespar test ELISA indirect Fluorimétrique. BLG : -lactoglobuline ; ALA : -lactalbumine ; -CAS :caséine-bêta ; s1 : caséine -alpha S1 ; s2 : caséine-alpha S2.

138138138

RESULTATS

Les résultats du dosage des IgE spécifiques selon la classe clinique sont indiqués dans

la figure 77. On remarque que les nouveau-nés sont des sujets poly-sensibilisés contre les

lactoprotéines. Pour toutes les classes cliniques de lapopulation algérienne étudiée, on

remarque une prédominance des sensibilisations à la BLG et à l’ALA contre les fractions de

caséines. Chez les sujets ayant une clinique sévère, les concentrations en IgE anti-ALA sont

plus élevées (316 KUA/L) que celles des IgE anti-BLG. En revanche, l’inverse est observé chez

les nourrissons à symptomatologie légère et modérée. Cependant, pour pouvoir établir une

corrélation clinico-biologique, des études plus approfondies doivent être effectuées au

niveau moléculaire (épitopes) et on doit disposer d’une sérothèque plus importante.

Figure 77: Concentrations en IgE spécifiques anti protéines du lait selon les classes cliniques.

139139139

RESULTATS

6.2. Étude des profils de sensibilisation des nourrissons allergiques par biopuces à

allergènes

L’objectif de cette partie du travail est de mettre au point un outil de diagnostic et

d’exploration à haut débit par les biopuces. Les résultats obtenus par test ELISA-indirect

fluorimétrique nous ont permis de confirmer ou d’infirmer le diagnostic clinique de l’allergie

aux protéines du lait de vache. Cependant, la quantité d’allergènes qui peut être testée par

le test ELISA-indirect est limitée à 5 allergènes. Par la mise au point de cette biopuce à

allergènes, il est possible de tester plus de 30 allergènes natifs et recombinants. Cette

analyse pourrait fournir plus d’informations sur les profils de sensibilisation avec une plus

grande sensibilité.

Les résultats obtenus à l’aide des biopuces à allergènes sont représentés dans les

figures 78, 79, 80 et 81. Dans chaque figure est présenté le schéma de prints de protéines,

les fluorescences des spots sur les lames obtenus après scan des biopuces ainsi que les

conversions des intensités de fluorescences (A, B et C respectivement). La première

remarque est la réussite des prints comme l’indique clairement les lames scannées.

On observe l’apparition de spots très réguliers et homogènes avec un faible bruit de

fond ce qui témoigne du bon déroulement de toutes les étapes de préparation de la biopuce

sans contamination. Les intensités de fluorescence des spots sont proportionnelles aux

différentes réactivités des allergènes selon les différents sérums testés (IgE spécifiques).

Par ailleurs, la sensibilité des immunoréactivités des allergènes par rapport aux IgE

est améliorée, dans la figure 79-C les sérums 22, 23, 24,25 et 26 ont des immunoréactivités

positives contre les fractions de caséines (s2, s1 et ), alors qu’elles sont négatives dans le

test conventionnel en ELISA-fluorimétrique.

Les résultats présentés dans les tableaux de la figure 82, montrent que l’exploration

de certains sérums par biopuces s’est révélée très sensible par rapport au test ELISA-

Fluorimétrique. On observe de manière très nette, qu’une série très large de la sérothèque a

été considérée négative par rapport aux deux allergènes puissants du lait bovin (BLG, et

l’ALA) par le test ELISA-F, alors qu’elle présente une immunoréactivité élevée contre ces

deux allergènes lorsque les sérums sont explorés par biopuces à allergènes : sérums 2, 10,

RESULTATS

140140140

12, 14, 24,32, 34, 48, 51 et 53 (figure 82). En revanche, certains sérums sont négatifs aux

allergènes par biopuces alors qu’ils sont positifs par test ELISA-F.

Ces différences peuvent être dues probablement à un mauvais print des protéines

qui pourrait changer leur configuration dans la matrice de nitrocellulose et par conséquent

leur présentation optimale aux IgE.

RESULTATS

141141141

PBS 8 A

PBS 7

17 6

16 5

14 4

12 3

10 2

9 1

B (IgE)1/10

(IgE)1/10 As2r As2r Blgr Blgr (IgE)

1/10(IgE)1/10

1/20 1/20 As2 As2 Blg Blg E149-162E149-1621/40 1/40 As1r As1r Lb Lb E102-124E102-1241/80 1/80 As1 As1 Lf Lf E41-60 E41-60

1/160 1/160 BcasrBcasr BSA BSA Y_T Y_T1/320 1/320 Bcas Bcas IgG IgG Y-Blg-Td Y-Blg-Td1/640 1/640 PBS PBS KcasrKcasr Y-Blg-T Y-Blg-T

1/12801/1280 HSA HSA Kcas Kcas Y1_Blg Y1_Blg

Sérums testés

Plan des Prints sur les biopuces

C

Figure 78 (A) : Biopuces après lecture au scanner (B) : Schéma de dépositions réalisées avec lespotteur. (C) : résultats après conversion des intensités de fluorescence par le logiciel GenePix Pro V4.0.

RESULTATS

142142142

B (IgE)1/10


1/10(IgE)1/10

1/20 1/20 As2 As2 Blg Blg E149-162E149-1621/40 1/40 As1r As1r Lb Lb E102-124E102-1241/80 1/80 As1 As1 Lf Lf E41-60 E41-601/160 1/160 BcasrBcasr BSA BSA Y_T Y_T1/320 1/320 Bcas Bcas IgG IgG Y-Blg-Td Y-Blg-Td1/640 1/640 PBS PBS KcasrKcasr Y-Blg-T Y-Blg-T


PBS 26

PBS 25

PBS 24

31 23

30 22

29 21

28 19

27 18

A

Sérums testés

C

Figure 79 (A) : Biopuces après lecture au scanner (B) : Schéma des dépositionsréalisées avecle spotteur. (C) : résultats après conversion des intensités de fluorescence par le logicielGenePix Pro V 4.0.

RESULTATS

143143143

PBS 39

PBS 38

PBS 37

45 36

44 35

43 34

42 33

41 32

B(IgE)1/10


1/10(IgE)

1/20 1/20 As2 As2 Blg Blg E149-162E149-162

1/40 1/40 As1r As1r Lb Lb E102-124E102-124

1/80 1/80 As1 As1 Lf Lf E41-60 E41-60

1/160 1/160 BcasrBcasr BSA BSA Y_T Y_T

1/320 1/320 Bcas Bcas IgG IgG Y-Blg-Td Y-Blg-Td

1/640 1/640 PBS PBS KcasrKcasr Y-Blg-T Y-Blg-T


A1/10

C

Figure 80 (A) : Biopuces après lecture au scanner (B) : Schéma des dépositions réalisées avecle spotteur. (C) : résultats après conversion des intensités de fluorescence par le logicielGenePix Pro V 4.0.

RESULTATS

144144144

PBS 53

PBS 52

59 51

58 50

57 49

56 48

55 47

54 46

B (IgE)1/10


1/10(IgE)1/10

1/20 1/20 As2 As2 Blg Blg E149-162E149-162

1/40 1/40 As1r As1r Lb Lb E102-124E102-124

1/80 1/80 As1 As1 Lf Lf E41-60 E41-60

1/160 1/160 BcasrBcasr BSA BSA Y_T Y_T

1/320 1/320 Bcas Bcas IgG IgG Y-Blg-Td Y-Blg-Td

1/640 1/640 PBS PBS KcasrKcasr Y-Blg-T Y-Blg-T


A

C

Figure 81: (A) Biopuces après lecture au scanner (B) : Schéma des dépositions réalisées avec lespotteur. (C) : Résultats après conversion des intensités de fluorescence par le logiciel GenePix Pro V4.0

RESULTATS

147147147

7. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS INTENSIFS DELACTOSÉRUMS BOVINS SOUS MICRO-ONDES CONTRE LES IgE HUMAINESANTI-BLG ET-ANTI ALA

7.1. Immunoréactivité contre les IgE anti BLG mesurée par ELISA fluorimétrique compétitif

Dans cette partie du travail, nous avons voulu étudier l’immunoréactivité des

hydrolysats de lactosérums, testés jusqu’à maintenant sur le modèle animal d’antigénicité et

d’allergénicité. Après avoir caractérisé les sérums de nouveau-nés allergiques, sept sérums

présentant une concentration élevée en IgE anti-BLG et anti-ALA ont été sectionnés pour

cette étude. Les sérums sélectionnés proviennent des nouveau nés allergiques des 3 classes

cliniques définies (légère, modérée et sévère). Ce travail permet de comparer les résultats

obtenus avec les résultats de l’étude de l’antigénicité et de l’allergénicité à l’aide du modèle

animal. Les hydrolysats sont testés par test ELISA-fluorimétrique compétitif. Contrairement

aux protocoles réalisés avec les IgG produits chez le lapin, le test a été réalisé avec une seule

concentration d’inhibition (250 µg/ml de compétiteur) faute de quantités suffisantes des

sérums disponibles.

La figure 83 indique les résultats d’inhibition de la liaison des IgE avec la BLG

mobilisée sur les plaques de micro titration par les hydrolysats de BLG et du lactosérum

bovin obtenus à 50 Watts par le mélange trypsine/chymotrypsine. Nos résultats indiquent

clairement une très faible immunoréactivité en comparaison avec la formule lactée

commerciale d’hydrolysat intensif (Peptijunior). Cette immunoréactivité est comparable à

celle obtenue avec le PBS (résultats non représenté).

En revanche les hydrolysats de BLG et de lactosérum obtenus sous micro-ondes et

dans les conditions de chauffage conventionnel ont une immunoréactivité élevée contre les

IgE humaines anti-BLG comparable à celle obtenue avec la BLG native. Cependant, une

diminution significative (p<0,01) de l’immunoréactivité de la BLG est observée lorsqu’elle est

hydrolysée dans sa forme purifiée sous micro-ondes par rapport au chauffage

conventionnel. Cette différence n’est pas observée quand la BLG est présente dans le

mélange du lactosérum. Ces résultats concordent avec ceux obtenus dans l’étude de

l’immunoréactivité de ces hydrolysats par les IgG anti-BLG obtenues chez le lapin.

RESULTATS

148148148

***

***

Figure 83: Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats

trypsique/chymotrypsique de BLG purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous

traitement micro-ondes à 50 Watts durant 5 min mesurée par test ELISA compétitif.

BLG : -lactoglobuline.

Peptijunior® : formule commerciale d’hydrolysats intensifs de lactosérum pour enfants

allergiques.

MO : traitement sous micro-ondes.

CC : chauffage conventionnel.

*** : p<0,001.

RESULTATS

149149149

A 100 Watts et au cours du chauffage conventionnel à la température

correspondante, on observe également une forte inhibition de la liaison des IgE à la BLG

immobilisée. Les deux traitements d’hydrolyse sous micro-ondes et par le chauffage

conventionnel n’influent pas significativement l’immunoréactivité des lactosérums. Là aussi,

nos résultats concordent avec ceux obtenus précédemment à l’aide des sérums de lapins

immunisés, mais diffèrent des résultats obtenus en chambre de Ussing (figure 84).

******

Figure 84: Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsique de

BLG purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 100 Watts durant

3 min mesurée par test ELISA compétitif.


Peptijunior® : formule commerciale d’hydrolysats intensifs de lactosérum pour enfants allergiques.



*** : p<0,001.

RESULTATS

150150150

La figure 85 indique les résultats de l’immunoréactivité des hydrolysats peptiques de

BLG et de lactosérum obtenus sous micro-ondes à 200 Watts et au cours du chauffage

conventionnel. Les résultats sont exprimés en pourcentage (%) d’inhibition des liaisons IgE

humaines anti-BLG à la BLG immobilisée. Les hydrolysats peptiques de BLG purifiée ou du

lactosérum traité à 200 Watts ont une immunoréactivité très significativement diminuée

comparée à celles obtenues au cours du chauffage conventionnel (p<0,001). Cette

immunoréactivité est comparable à celle de la formule lactée commerciale intensivement

hydrolysée « Peptijunior ». Ce résultat coïncide parfaitement avec celui obtenu avec les IgG

polyclonaux anti-BLG du lapin et avec l’étude en chambre de Ussing.

En conclusion, l’hydrolyse peptique de la BLG sous micro-ondes à 200 Watts semble

être efficace pour réduire l’immunoréactivité. Il semble que ce procédé permet d’atteindre

le maximum d’épitopes séquentiels enfouis de la protéine. Il faut cependant noter que cette

hydrolyse peptique n’est pas complète (48% de BLG hydrolysée), suggérant que le

traitement micro-ondes à 200 Watts pourrait dénaturer et détruire les épitopes

conformationnels.

RESULTATS

151151151

******

Figure 85: Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats peptiques de BLG purifiée et de

lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 200 Watts durant 3 min mesurée par

test ELISA compétitif.





*** : p<0,001

RESULTATS

152152152

7.2. Immunoréactivité contre les IgE anti ALA mesurée par ELISA fluorimétrique

compétitive

La figure 86 montre les résultats d’inhibition de la liaison des IgE humaines anti-ALA

avec l’ALA immobilisée sur les plaques de micro titration par les hydrolysats obtenus après 5

minutes d’hydrolyse trypsique/chymotrypsique de l’ALA et du lactosérum bovin. A 50 Watts,

nos résultats montrent très clairement que l’immunoréactivité des hydrolysats de l’ALA reste

toujours élevée et est comparable à celle de l’ALA native. Ceci pourrait s’expliquer par le fait

que malgré une hydrolyse complète de l’ALA par la trypsine et la chymotrypsine, les sites

d’attaque des enzymes ne coïncideraient pas avec les séquences enfermant les épitopes

séquentiels.

Ces résultats ne concordent pas avec ceux obtenus dans l’étude de

l’immunoréactivité de ces hydrolysats par les IgG anti-ALA obtenues chez le lapin où

l’immunoréactivité de ces hydrolysats est diminuée significativement par rapport à celle du

lactosérum contrôle. En revanche, l’étude de l’allergénicité de cet hydrolysat

trypsique/chymotrypsique de lactosérum obtenu sous micro-ondes semble conserver une

activité allergénique qui se traduit par une stimulation du courant de l’Isc lors de sa mise en

contact avec la muqueuse intestinale de souris sensibilisées contre l’ALA. L’hydrolysat

trypsique/chymotrypsique de lactosérum produit durant le chauffage conventionnel quant à

lui ne produit pas de stimulation de l’Isc en chambre de Ussing. Ces observations

démontrent une contradiction en termes d’allergénicité telle qu’elle est étudiée chez le

modèle animal et lors de l’étude contre les IgE humaines. La persistance de leur

immunoréactivité contre les IgE humaines anti-ALA confirme en partie que les épitopes

reconnus chez le modèle animal sont différents de ceux reconnus chez l’humain.

RESULTATS

153153153

Figure 86: Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsique

d’ALA purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 50 Watts durant

5 min mesurée par test ELISA compétitif.

ALA : -lactalbumine.




RESULTATS

154154154

La figure 87 représente les résultats de l’immunoréactivité des hydrolysats

trypsiques/chymotrypsiques de lactosérums obtenus sous micro-ondes à 100 Watts et

durant le chauffage conventionnel contre les IgE humaines. Les mêmes observations sont

constatées, à savoir une forte inhibition de la liaison des IgE à l’ALA immobilisée avec ces

hydrolysats d’ALA et de lactosérum. L’impact des traitements thermiques par micro-ondes et

durant le chauffage conventionnel est non significatif sur la réduction de l’immunoréactivité.

De la même manière, ces résultats vont dans le sens de ceux obtenus dans l’étude de

l’antigénicité contre les IgG anti-ALA obtenus chez le lapin ; et les résultats d’allergénicité

obtenus par l’immunoréactivité (IgE humaines et IgG de lapin) où on observe une

stimulation nette de l’Isc en chambre de Ussing après challenge avec l’hydrolysat de

lactosérums obtenus sous micro-ondes à 100 Watts.

Figure 87: Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats trypsique/chymotrypsique

d’ALA purifiée et de lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 100 Watts

durant 3 min mesurée par test ELISA compétitif.



MO : traitement sous micro-ondes, CC : chauffage conventionnel.

RESULTATS

155155155

Les résultats de l’immunoréactivité des hydrolysats peptiques d’ALA et de lactosérum

obtenus sous micro-ondes à 200 Watts et au cours du chauffage conventionnel, exprimés

par le pourcentage (%) d’inhibition des liaisons IgE humaines anti-ALA à l’ALA immobilisée

sont indiqués dans lafigure 88.

A 200 Watts, les hydrolysats peptiques d’ALA purifiée ou du lactosérum présentent

une diminution très significative de leur immunoréactivité comparée à celles des hydrolysats

obtenus au cours du chauffage conventionnel (p<0,001).

Cette immunoréactivité est comparable à celle de la formule lactée commerciale

intensivement hydrolysée « Peptijunior ». Les résultats de l’allergénicité obtenus en

chambre de Ussing montrent l’effet contraire.

Ces résultats préliminaires nous autorisent à conclure que dans nos conditions

expérimentales l’hydrolyse trypsique/chymotrypsique reste inefficace contre les épitopes

séquentiels de la BLG et de l’ALA et par conséquent sur la réduction de l’immunoréactivité

vis-à-vis des IgE d’enfants allergiques. Ceci montre également que les micro-ondes utilisées

comme traitement thermique par frictions ne changent ni la spécificité de l’action des

enzymes ni leurs sites d’attaque. Jusqu’à 200 Watts, cette puissance parait suffisante pour

déstabiliser la BLG et la rendre plus susceptible à l’action de la pepsine suivie d’un large

accès de cette enzyme au cœur de la protéine. Ceci est démontré par l’étude de son

immunoréactivité ou une importante diminution de la reconnaissance par les IgE anti-BLG

est obtenue. L’autre point important est celui de l’étude des immunoréactivités chez le

modèle animal où il faudrait être prudent dans les conclusions par rapport aux réductions

d’antigénicité d’allergénicité des hydrolysats, ceci nécessite de vérifier l’activité allergénique

résiduelle par des explorations de dégranulation des mastocytes de rats humanisés.

RESULTATS

156156156

******

Figure 88: Inhibition des IgE humaines spécifiques par les hydrolysats peptiques d’ALA purifiée et de

lactosérum bovin à 1% obtenus sous traitement micro-ondes à 200 Watts durant 3 min mesurée par

test ELISA compétitif.





*** : p<0,001.

RESULTATS

157157157

8. ÉTUDE STRUCTURALE DE LA DÉNATURATION DE LA BLG PAR DICHROÏSMECIRCULAIRE (DC)

A B

Figure 89: Spectres obtenus dans l’UV proche par dichroïsme circulaire de la BLG traitée à pH 2 sousmicro-ondes à 50, 100 et 200 Watts (A) et pendant un chauffage conventionnel (B).

A B

Figure 90: Spectres obtenus dans l’UV lointain par dichroïsme circulaire de la BLGtraitée à pH 2 sousmicro-ondes à 50, 100 et 200 Watts (A) et pendant un chauffage conventionnel (B).

RESULTATS

158158158

Afin d’expliquer et d’étudier l’origine de la susceptibilité de la BLG à l’hydrolyse

peptique sous micro-ondes à 200 Watts, nous avons étudié la conséquence de sa

dénaturation thermique par dichroïsme circulaire. Par cette méthode un changement dans

la conformation secondaire peut être détecté par le balayage dans l’UV lointain et proche

des protéines traitées sans hydrolyse enzymatique.

La BLG présente un spectre de DC caractéristique dans ces deux zones :

UV lointain : dichroïsme positif maximal à 190 nm et dichroïsme négatif maximal à

215 nm ; ce spectre est caractéristique d’une protéine contenant une proportion

importante de feuillets ß (Fasman, 1996).

UV proche : dichroïsme négatif présentant des minima vers 260 nm (signal des ponts

disulfure), 280 nm (signal des acides aminés aromatiques) et surtout 293 nm ; ce

dernier correspond à l’absorption des deux résidus tryptophanyl en positions 19 et

61 (Manderson et al., 1999).

Les spectres de l’UV proche par dichroïsme circulaire de la BLG traitée sous micro-

ondes et sous chauffage conventionnel à pH 2 sont représentés dans la figure 89 A-B. Ces

résultats montrent qu’il n’y a pas d’impact significatif du chauffage conventionnel sur

l’intensité des spectres enregistrés (figure 89-B). Par contre, lors du traitement sous micro-

ondes à pH 2 une faible intensité des spectres est obtenue entre 260 et 290 nm pour la BLG

traitée à 200 Watts (figure 89-A). Ces résultats suggérent la perte de la structure compacte

de la BLG et des ponts disulfure. En revanche, aucune modification n’est observée à 50 et

100 Watts où les spectres restent inchangés par rapport au contrôle (BLG non traitée) ; les

valeurs d’ellipticité de la BLG traitée sous 200 Watts sont à leur minimum entre 270-293 nm.

Les spectres obtenus en UV-lointain sont représentés dans la figure 91 A-B

respectivement pour les traitements sous micro-ondes et par chauffage conventionnel à pH

2. Les spectres enregistrés pour le traitement micro-ondes à 50 et 100 Watts sont

comparables à ceux obtenus pour la BLG contrôle, de même que pour la BLG chauffée dans

les conditions conventionnelles ou aucun changement d’intensité n’est observé. Une faible

intensité des spectres est enregistrée entre 200 et 240 nm pour la BLG chauffée sous micro-

ondes à 200 Watts.

RESULTATS

159

Ces résultats démontrent qu’en présence de rayonnement micro-ondes, la BLG qui

est naturellement résistante et stable aux pH inférieurs à 3 devient sensible, ceci peut être

du aux importantes frictions moléculaires suite à l’abondance des protons H+ à ces pH.

Cette dénaturation observée dans ces conditions pourrait expliquer aussi les

précédents résultats obtenus avec l’hydrolyse peptique de la BLG sous micro-ondes à

hauteur de 52% en seulement 3 minutes. La dénaturation partielle de la BLG dans ces

conditions pourrait démasquer les sites d’attaque de la pepsine et permettrait la destruction

probable des épitopes enfouis dans cette région hydrophobe de la protéine.

DISCUSSION

DISCUSSION

DISCUSSION

DISCUSSION

L'incidence de l'allergie alimentaire a sensiblement augmenté au cours des ces

dernières années (Zuberbier et al., 2004; Sampson et al., 2010). Ceci a conduit à la mise en

place de méthodes visant à réduire les allergènes dans les produits alimentaires. L'étude de

l’impact de la transformation des aliments sur la réactivité aux allergènes a surtout porté sur

les traitements thermiques. Cependant, le traitement technologique des aliments nouveaux

ainsi qu’une variété de nouvelles méthodes thermiques et non thermiques, sont également

à explorer pour créer éventuellement des produits hypoallergéniques.

Les personnes sujettes aux allergies alimentaires sont généralement amenées à

éliminer complètement de leur diète les aliments en cause. La mise en place de traitement

potentiel et de nouvelles méthodes industrielles permettrait alors la consommation des

aliments mis en cause avec un potentiel allergénique réduit.

L'allergie la plus fréquente chez les enfants de moins de 2 ans dans le monde

occidental et actuellement dans les pays émergeants est l'allergie au lait de vache. Elle

affecte 1,6 à 2% de cette population (Poms, 2004). Cependant, après l'âge de trois ans, 85%

des enfants ont tendance à guérir (Vila, 2001). Ainsi, les produits lactés hypoallergéniques

sont des produits de substitution dotés d’un faible pouvoir allergénique pour la sécurité des

enfants.

Différents procédés technologiques, y compris le traitement thermique, ont été

réalisés pour réduire l'allergénicité des protéines du lait. Il a été montré que chaque fraction

d’allergène protéique présentait une résistance différente aux traitements thermiques. Par

exemple pour les protéines du lait, il a été montré que les caséines sont les plus

thermostables. Elles sont suivies de la -lactoglobuline, alors que la sérum-albumine bovine

est la plus thermolabile (Al-Agmy, 2007).

L’un des objectifs principaux de ce travail était de mettre au point un procédé

d’hydrolyse enzymatique associé à un traitement thermique par les micro-ondes afin de

digérer et d’accélérer l’hydrolyse enzymatique des protéines du lactosérum bovin les plus

résistantes (BLG et ALA). L’objectif recherché étant de réduire au maximum

l’immunoréactivité et l’allergénicité des produits par la protéolyse sous micro-ondes.

DISCUSSION

160

1. TEMPERATURES ENREGISTREES

Lors des traitements par micro-ondes l’une de nos préoccupations était la maîtrise de

la montée de température pour ne pas influencer significativement l’activité enzymatique.

Les températures finales obtenues sous micro-ondes sont 43,2°C, 51,7°C et 63,5°C pour les

traitements à 50, 100 et 200 Watts respectivement.

Les études combinant traitement thermique et activité enzymatique sont très peu

nombreuses. Iametti et al. (2002) ont mesuré l’activité résiduelle de la trypsine et de la

chymotrypsine après 5 minutes de chauffage à des températures fixes de 55, 60 et 65°C en

utilisant des substrats synthétiques pour les deux enzymes utilisées. Ils ont obtenu

respectivement 43, 17 et 6,6% d’activité résiduelle pour la chymotrypsine et 78,2, 35 et 0,4%

d’activité pour la trypsine.

La BLG et l’ALA ont été hydrolysées par des enzymes digestives (trypsine,

chymotrypsine et pepsine). Dans tous les cas d’hydrolyse, nous avons observé une

accélération des réactions d’hydrolyse de la BLG quelle soit sous forme purifiée ou

lorsqu’elle est présente dans le lactosérum. Cette hydrolyse sous micro-ondes est

significativement plus importante que lorsqu’elle est menée durant le chauffage

conventionnel. A 50 Watts, le taux de protéines dégradées est déjà significatif et le fait

d’augmenter la puissance accélère dâvantage la protéolyse. Cependant l’augmentation

concomitante de la température affecte la cinétique enzymatique.

Pour l’ALA, elle est plus facilement hydrolysée sous sa forme purifiée sous micro-

ondes qu’avec un traitement thermique conventionnel. A l’inverse, lorsqu’elle est dans le

lactosérum, son hydrolyse est plus efficace avec le chauffage conventionnel que sous les

micro-ondes, conditions dans lesquelles elle montre une certaine résistance.

Les résultats obtenus dans cette première partie de travail vont parfaitement dans le

sens des études de l’impact des micro-ondes sur les réactions enzymatiques. L’hydrolyse

enzymatique associée aux micro-ondes a fait l’objet de plusieurs études mais pour des

objectifs différents.

Les premières études ont exploré la mise en place d’hydrolyse enzymatique couplée

aux traitements micro-ondes pour la préparation d’échantillons en protéomique. Ainsi

Pramanik et al. (2002) ont réussi à produire des peptides de petites tailles pour leur analyse

DISCUSSION

161161161

par spectroscopie de masse afin d’établir une cartographie peptidique. L’hydrolyse par la

trypsine de protéines globulaires comme la myoglobine ou l’interféron 2b a été réussie

en quelques minutes contrairement aux heures requises avec les traitements

conventionnels.

Dans le contexte alimentaire, l’équipe d’Izquierdo (2005, 2007 et 2008) a réussi une

hydrolyse contrôlée de la -lactoglobuline bovine (BLG) par la pronase et la pepsine. Dans un

premier temps, ils ont évalué la cinétique d’hydrolyse en mesurant les constantes

catalytiques d’hydrolyses (Kcat.Km-1) par la chymotrypsine et par la pronase obtenues par les

micro-ondes à 30 Watts (40°C) et durant un chauffage conventionnel. Les résultats ont

montré que les hydrolyses sous micro-ondes avaient des constantes catalytiques plus

élevées que celles observées durant le chauffage conventionnel. Ceci démontre que les

hydrolyses enzymatiques réalisées sous micro-ondes sont accélérées, et cette accélération

est renforcée par l’augmentation de la vitesse de dénaturation sous micro-ondes de la BLG

(Bohr & Bohr 2000, a et b) et de la sérum albumine bovine (SAB) (De Pomerai et al., 2003).

Par ailleurs, les études menées par Porcelli et al. (1997) ont démontré que le traitement des

protéines à une fréquence de 10,4 Ghz induit des changements conformationnels au niveau

des enzymes (S-adenosyl-homocysteine et la 5’-methylthioadenosine phosphorylase) et de

leurs substrats. Les études par spectroscopie en fluorescence et par dichroïsme circulaire ont

permis d’émettre l’hypothèse selon laquelle les rayons micro-ondes provoqueraient des

réarrangements structuraux au niveau des enzymes et de leurs substrats indépendamment

de la température.

La résistance des protéines alimentaires à la digestion pepsique a été considérée

longtemps comme élément prédictif de l’allergénicité des protéines.

Une hydrolyse pepsique de certaines protéines alimentaires par la pepsine générerait

des peptides de faibles poids moléculaires qui peuvent être facilement digérés par les

enzymes pancréatiques (trypsine et chymotrypsine) empêchant ainsi l’absorption sous

forme intacte de certaines protéines comme la BLG bovine et par conséquent augmenterait

la probabilité d’éliminer les épitopes séquentiels.

Dans ce sens, nous avons réalisé dans notre travail une hydrolyse pepsique sous

micro-ondes à 50, 100 et 200 Watts et durant le chauffage conventionnel. Nous avons

observé une résistance de la BLG à la pepsinolyse dans les conditions de chauffage

DISCUSSION

162162162

conventionnel. Le même résultat a été observé avec les traitements sous micro-ondes à 50

et 100 Watts, alors qu’une hydrolyse de la BLG s’est produite à 200 Watts. Ces résultats

confirment en partie les travaux d’Izquierdo et al. (2008) qui ont observé une résistance de

la BLG à la pepsinolyse sous micro-ondes à 30 Watts et à pH 4. Cette résistance de la BLG à la

pepsinolyse est bien connue dans les conditions de traitements technologiques. Selon

Dufour et al., (1995) et Stapelfeldt et al., (1996), une large résistance à la pepsinolyse de la

BLG lors d’hydrolyse sous hautes pressions à 300 MPa est observée. Cette résistance de la

BLG peut être expliquée par la stabilité de sa structure tertiaire à pH 4 résultant du maintien

solide des ponts disulfures (Papiz et al., 1986; Kella & Kinsella, 1988; Lametti et al., 1995).

La susceptibilité de la BLG à l’hydrolyse pepsique n’a été observée jusqu’à maintenant que

suite à des traitements de substitution par mutation (Jayat et al. 2004). Ces auteurs ont

montré qu’une substitution de la cystéine libre de la BLG par une sérine déstabilisait la BLG,

ce qui la rendait par conséquent plus sensible à la pepsinolyse.

Alors que beaucoup d’études ont été consacrées à la BLG bovine en raison de son

statut d’allergène principal du lait, peu d’études l’ont été sur l’hydrolyse de l’ALA bovine

pour évaluer son degré d’allergénicité dans les produits lactés.

Dans le cas des nouveaux procédés technologiques, il est intéressant de démontrer

la susceptibilité de cette protéine aux différentes hydrolyses enzymatiques. Dans notre

étude, nous avons pu conclure que l’ALA bovine était facilement hydrolysée dans les

conditions de traitements aux micro-ondes alors qu’elle était résistante dans les mêmes

conditions au chauffage conventionnel. Ce résultat va dans le sens de l’étude de Dubois-

Delval (2006) qui a montré que l’hydrolyse de l’ALA bovine ne peut se déclencher qu’après

10 minutes d’hydrolyse à 37°C. Contrairement à cela, lorsque l’ALA bovine est présente dans

le lactosérum, sa susceptibilité à l’hydrolyse enzymatique est inversée. On observe

cependant, une meilleure hydrolyse durant le chauffage conventionnel que sous micro-

ondes. Ceci peut être le résultat d’agrégations produites par l’élévation assez rapide de la

température lors du traitement micro-ondes. L’étude menée par Chaplin & Lyster, (1986) a

montré que le chauffage brusque de l’ALA bovine en absence de calcium augmente la

formation des dimères et trimères d’ALA bovine, alors que cette polymérisation disparait à

des températures supérieures à 70°C (Dalgleish et al., 1997; Gezimati et al., 1997; Schokker,

2000). Par ailleurs, lors du chauffage et en présence de BLG, des homopolymères de chaque

DISCUSSION

163163163

protéine se forment en même temps que des hétéropolymères (Havea et al., 2001; Hong &

Creamer, 2002).

2. ANTIGENICITE DES HYDROLYSATS DE LACTOSERUM

Les hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques présentent une stabilité de leur

immunoréactivité vis à vis des IgG anti-BLG sériques du lapin. Plusieurs auteurs estiment que

la persistance de cette immunoréactivité pourrait être due aux sites d’attaque enzymatique

qui restent insuffisants pour détruire les épitopes séquentiels de la BLG.

Dans ce sens, l’équipe de Jarvinen et al., (2001) a établi des séquences d’épitopes

linéaires de la BLG et de l’ALA bovines reconnues par les IgG humaines en utilisant des

peptides synthétiques couvrant toute la séquence des deux protéines étudiées. Les résultats

obtenus de ce screening montrent l’existence de 6 épitopes dans la séquence de la BLG

reconnus par les IgG humaines (1-6 ; 51-64 ; 67-88 ; 85-96 ; 129-144 ; 139-156) et 3 épitopes

linéaires d’ALA (7-18 ; 51-61 ;89-108).

De plus ces auteurs ont démontré que les sites antigéniques identifiés au niveau de la BLG

sont co-localisés avec le épitopes reconnus par les IgE humaines, à l’exception de trois

régions pour l’ALA (1-6 ; 19-26 et 47-52) et d’une région pour la BLG (31-50).

Mais en se référant à la caractérisation de ces épitopes séquentiels, reconnus par les

IgG humaines, on remarque que les sites d’attaque enzymatique trypsique et

chymotrypsiques ne correspondent pas à ces sites antigénique de la séquence protéique.

Ceci laisse supposer que ces épitopes restent intacts et immunoréactifs. En revanche, une

nette diminution, très significative de l’immunoréactivité est observée avec les hydrolysats

peptiques de la BLG obtenus à 200 Watts après 3 minutes d’hydrolyse.

Ces résultats pourraient s’expliquer par le fait que les hydrolyses peptiques sont réalisées à

pH 2. L’action de la pepsine, lorsque le pH est inférieur ou égal à 2, touche 47 sites

d’attaque, préférentiellement au niveau des positions P1 et P1’ des résidus de Phenyle-

alanine, tyrosine, tryptophane et de la leucine. Cette spécificité de la pepsine se perd lorsque

le pH devient supérieur à 2 (Keil, 1992).

En revanche, les différents hydrolysats d’ALA bovine présentent une diminution significative

de leur immunoréactivité quelque soit le type de traitement qui leur est appliqué (micro-

ondes ou chauffage conventionnel).

DISCUSSION

164164164

La production des IgG polyclonaux anti-BLG et anti-ALA après immunisation des

animaux avec de la BLG et de l’ALA natives laisse supposer que les épitopes seraient

préférentiellement conformationnels. Ceci ne concorde pas avec nos résultats. En effet, les

IgG anti-BLG et anti-ALA reconnaissent aussi bien les différents hydrolysats produits que les

protéines natives (BLG et ALA).

Les études de Iametti et al. (2002) ont montré qu’une hydrolyse de la BLG par de la

trypsine et la chymotrypsine après 20 minutes de traitement combiné (chauffage +

protéolyse) réduisait significativement l’immunoréactivité des hydrolysats de la BLG contre

les IgG polyclonaux. L’étude a porté sur les produits d’hydrolyse mais à l’aide du test ELISA

direct.

L’utilisation de ce test pourrait être à l’origine des résultats négatifs de reconnaissance, car

l’adsorption des peptides sur les puits des microplaques est faible et un test par inhibition

est nécessaire. Dans une autre étude (Kim, 2007), l’immunoréactivité des hydrolysats

peptiques de lactosérum bovin contre les IgG polyclonaux a été évaluée par test ELISA

compétitif. L’antigénicité des produits obtenus a été complètement éliminée après

hydrolyse pepsique/trypsique pendant 120 minutes. Aussi, cette diminution est atteinte

avec un rapport enzyme/substrat égal à 1%. Ceci concorde avec nos résultats sauf que dans

notre cas, nous avons réussi à éliminer toute immunoréactivité au bout de trois minutes

avec une hydrolyse peptique.

Les résultats obtenus dans cette partie ne concordent pas avec ceux d’Ena et al.

(1995). Ces auteurs ont montré qu’une hydrolyse avec la pepsine suivie d’une hydrolyse avec

la corolase réduisait partiellement l’antigénicité et qu’il fallait une étape supplémentaire,

celle de l’ultrafiltration, pour éliminer les gros peptides immunoréactifs.

En résumé nous avons constaté que la liaison des IgG à l’ALA est facilement altérée

par les traitements combinés (thermique/protéolyse) suggérant que les épitopes mis en jeu

sont dâvantage conformationnels contrairement à ceux reconnus par la BLG qui sont

majoritairement linéaires.

3. ÉTUDE DE L’ALLERGENICITE DES HYDROLYSATS A L’AIDE DU MODELEANIMAL

L'émergence de l’industrie agro-alimentaire et des produits dérivés de la

biotechnologie, ainsi que leur potentiel à sensibiliser les populations génétiquement

DISCUSSION

165165165

prédisposées à développer des allergies alimentaires a incité les agences de réglementation

à travers le monde à chercher des approches et des méthodologies pour l’étude du potentiel

allergénique des nouveaux aliments.

Une telle approche a été proposée initialement par l'International Life Science Institute (ILSI)

en collaboration avec l'International Food Biotechnology Council (CISFC) (Metcalfe et

al.1996). Elle a ensuite été modifiée par l’Organisation de l'Alimentation et de l'Agriculture

(FAO) et l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) (FAO/OMS 2001).

Une des recommandations de ces institutions est que les modèles animaux, lorsqu'ils sont

suffisamment développés et validés, pourraient contribuer à fournir des informations

précieuses afin d’identifier le potentiel sensibilisant et allergisant de certaines protéines

alimentaires.

Les modèles animaux actuellement en cours de développement sont le rat Brown

Norway (BN), la souris BALB /c, et une souris transgénique de souche génétiquement

manipulée pour produire les molécules HLA de classe II. L’intérêt de sensibiliser les souris

BALB/c par injection intrapéritonéale des protéines a été exploré dans une série

d’expériences détaillées par Kimber et al. (2003). Cette approche favorise l'initiation de

réponses immunitaires humorales vigoureuses des immunoglobulines IgG et IgE et pourrait

constituer un modèle utile pour dépister de nouvelles protéines potentiellement

allergéniques.

Dans notre travail, nous avons utilisé la souris BALB/c pour évaluer l’allergénicité de nos

hydrolysats ex-vivo par un test original en chambre de Ussing. L’immunisation des souris par

la BLG et l’ALA purifiées a produit des quantités suffisantes d’IgE, d’IgG1 etd’IgG2a traduisant

une bonne sensibilisation des animaux avec une réponse de type Th2 comparable à celle des

patients allergiques.

Les résultats obtenus dans notre travail sont en accord avecd’autres auteurs. L’équipe de

Patient et al. (2005) a montré l’efficacité de ce modèle animal. La sensibilisation

intrapéritonéale et par voie orale des souris Balb/c a induit l’activation de la voie Th2 en

produisant des quantités d’IgE et des IgG2a spécifiques ainsi que la production

d’interleukines (IL-4 et IL-5) spécifiques à ce type de réponse immune (Th2). De leur côté

Fritsché et al. (2002) ont montré que les souris Balb/c avaient une capacité à reproduire les

DISCUSSION

166166166

mêmes mécanismes physiopathologiques de l’allergie que chez l’homme avec une

production d’IgE spécifiques d’une réponse Th2.

Dans un autre contexte, Lifrani et al. (2005) ont étudié l’effet de la sensibilisation par

l’arachide sur quatre souches de souris (C3H, BALB/c, CBA et SJL). L’évaluation du pouvoir

sensibilisant de l’arachide et la présence d’une hypersensibilité immédiate de type I a été

réalisée par le dosage des anticorps IgE et IgG1. Parmi les quatres souches de souris

étudiées, la souris BALB/c présentait un tableau d’une hypersensibilité immédiate très

caractéristique avec des taux élevés d’IgE et d’IgG1 et une apparition de symptôme

anaphylactique après challenge avec l’arachide brut. Ceci montre bien que la souris BALB/c

constitue un excellent modèle d’allergie alimentaire.

Afin d’évaluer l’allergénicité du lactosérum après traitement thermique aux micro-ondes,

une étude réalisée en chambre de Ussing par Negaoui et al. (2008) a montré que la mise en

contact de lactosérum natif avec la muqueuse de souris sensibilisées à la BLG stimulait le

courant de court-circuit (Isc) au niveau de l’intestin . L’Isc est un indicateur de la sécrétion de

chlorure (Cl-) qui constitue la base physiopathologique de l’un des signes cliniques (diarrhée)

dans l’allergie aux protéines du lait de vache. Ces résultats confirment encore une fois la

grande qualité de la souris Balb/c comme modèle animal d’allergie et d’anaphylaxie

intestinale locale.

4. ÉTUDE DE L’ALLERGÉNICITÉ DES DIFFÉRENTS HYDROLYSATS DELACTOSÉRUM

Dans cette partie du travail, nous avons évalué le pouvoir allergisant des différents

hydrolysats en chambre de Ussing. Ces hydrolysats ont étaient mis en contact avec des

muqueuses de souris sensibilisées contre la BLG et l’ALA.

Il a été montré précédemment que l'activation des mastocytes au niveau des

muqueuses, induite par l'antigène sensibilisant, est à la base de la sécrétion de chlorure par

l’intestin de souris via l’action de l'histamine, de la sérotonine et des prostaglandines

(Crowe, 1990 ; Perdue, 1991). Cette sécrétion de chlorure suite à la stimulation antigénique

est associée également à une importante modification des mécanismes de l'absorption

glucose-dépendante et une augmentation transitoire de la conductance épithéliale. in vivo,

chacun de ces facteurs peuvt contribuer au transport net des fluides au niveau de la lumière

intestinale. Combinés aux effets connus de l’activation des mastocytes sur la motilité

DISCUSSION

167167167

intestinale, ces changements de sécrétion hydro-chlorhydriques seraient à l’origine des

diarrhées dans l’allergie alimentaire (Kheroua, 1987 ; Scott, 1988 ; Saidi, 1995).

Ces données fondamentales de la physiopathologie de l’allergie au lait confirment

nos résultats obtenus en chambre de Ussing. En effet, après stimulation des muqueuses

intestinales de souris sensibilisées avec les protéines natives (BLG et ALA) une augmentation

très significative des valeurs de l’Isc est enregistrée.

Ces résultats valident la souris BALB/c comme un bon modèle d’anaphylaxie

intestinale. La conductance des tissus étudiés après stimulation par les antigènes

sensibilisants augmente de manière significative. Cette augmentation est le résultat d’un

relâchement des tissus sensibilisés, interprétée physiologiquement comme étant une

augmentation de la perméabilité intestinale.

On a longtemps pensé qu’un défaut primitif de la barrière intestinale pourrait initier

des maladies digestives (maladie inflammatoires chroniques de l’intestin [MICI], allergies,

maladie cœliaque) et promouvoir le développement d’une sensibilisation plutôt que d’une

tolérance du fait d’une absorption excessive d’antigènes luminaux.

Dans l’allergie alimentaire cependant, il n’est pas observé de défaut constitutif de la

perméabilité intestinale. En effet, après régime d’exclusion, les valeurs de la perméabilité,

qui sont augmentées en phase active de la maladie, retournent à la normale après régime

d’exclusion (Heyman, 1988, Saidi et al., 1995).

Il est cependant établi que les facteurs environnementaux qui ont un impact sur la

perméabilité (infection, stress) ont des conséquences sur le développement des maladies

allergiques (Heyman, 2005, 2010).

L’allergénicité des hydrolysats de lactosérums issus de l’hydrolyse trypsique et

chymotrypsique à 50 Watts et ceux obtenus durant le chauffage conventionnels a été

étudiée. Après stimulation avec les hydrolysats des tissus sensibilisés contre la BLG, on

obtient une augmentation significative de l’Isc. Cette augmentation est observée à la suite

de la stimulation par les hydrolysats issus des deux types de traitements (micro-ondes et

chauffage conventionnel). Ces résultats rendent compte du pouvoir allergisant résiduel de la

BLG conservé dans ces hydrolysats et confirment en partie les résultats de

l’immunoréactivité obtenus contre les IgG anti-BLG. Les épitopes semblent toujours être

DISCUSSION

168168168

conservés et résistants à cette hydrolyse quelque soit le traitement. Les produits issus de

l’hydrolyse trypsique/chymotrypsique sous micro-ondes à 100 Watts et par la pepsine à

200W présentent une activité allergénique très faible reflétée par la stabilité du courant de

court circuit après mise en contact de ces hydrolysats avec les muqueuses intestinales de

souris immunisées contre la BLG.

Les études sur l’allergénicité des hydrolysats in vivo sont peu nombreuses, les

traitements thermiques par micro-ondes combinés aux hydrolyses enzymatiques pourraient

être à l’origine de la disparition des épitopes conformationnels et séquentiels produits chez

la souris et par conséquent de la diminution de l’allergénicité du lactosérum. En d’autres

termes, l’hydrolyse complétée par le traitement thermique dénature les protéines en

entraînant la perte de leur structure tertiaire. Ceci fait disparaître les épitopes

conformationnels et diminue le nombre des épitopes séquentiels.

Pour l’allergénicité de l’ALA, les hydrolysats de lactosérum obtenus sous micro-ondes

et pendant le chauffage conventionnel on été testés chez des souris sensibilisées contre

l’ALA en chambre de Ussing. Contrairement aux résultats obtenus chez les animaux

sensibilisés contre la BLG, l’allergénicité de l’ALA a été entièrement conservée pour tous les

hydrolysats de lactosérum produits quel que soit le traitement thermique appliqué (sous

micro-ondes ou chauffage conventionnel). Ceci est démontré par l’augmentation des valeurs

de l’Isc après chaque stimulation en chambre de Ussing.

La possibilité pour les hydrolysats de provoquer l’activation des cellules effectrices

(mastocytes des muqueuses) par pontage d’IgE spécifiques membranaires est étudiée par le

test d’histamino-libération leucocytaire (Wahn, 1992 ; Dean, 1993).

Les méthodes immunologiques in vitro utilisent des sérums animaux ou humains

pour caractériser la présence d’épitopes réactifs, aptes à se lier aux anticorps. Les modèles

expérimentaux, fondés sur l’immunisation d’animaux, peuvent fournir des informations sur

la persistance ou l’absence des épitopes reconnus par les IgE humaines. Cependant, les

hydrolysats qui ne se lient pas aux anticorps (IgG) ou ne déclenchent pas de réactions

d’anaphylaxie in vivo chez des animaux sensibilisés ne permettent pas de préjuger de leur

absence d’allergénicité (Plebani, 1997).

DISCUSSION

169169169

La persistance de l’allergénicité de certains hydrolysats testés dans notre étude chez

le modèle animal d’allergie va dans le sens de certaines études menées dans ce sens. Une

allergénicité résiduelle des hydrolysats partiels a été constatée, par l’étude de la réponse

proliférative de clones lymphocytaires T spécifiques de la caséine, chez des sujets allergiques

à la caséine. Il a été observé en particulier une forte synthèse de l’IL4, traduisant une

réponse de type Th2 (Szepfalusi, 1998).

Par ailleurs, les hydrolysats partiels des protéines du lactosérum (PLS) renferment des

peptides résiduels de 6000 Da et plus (Assadullahi ,1992 ; Tounian, 1997). Nidal HA

contiendrait 30 % de peptides de poids moléculaire supérieur à 5 000 Da (Mäkinen-Kiljunen,

1993 ; Ragno, 1993). L’hydrolysat intensif de PLS Alfarét contient encore 22 % de peptides de

1 400 à 2 600 Da, 28 % de peptides de 2 600 Da à 15 000 Da, 0,4 % de peptides supérieurs à

15 000 Da (Van Hoeyveld, 1998). Ces données d’analyses biochimiques renforcent

l’hypothèse selon laquelle une bonne partie des épitopes séquentiels est toujours résistante

aux traitements appliqués au lactosérum bovin pour la production de ces formules lactées

infantiles.

La persistance de l’immunoréactivité de l’ALA et de son allergénicité en chambre de

Ussing est liée à sa résistance aux hydrolyses sous micro-ondes et à son hydrolyse partielle

durant le chauffage conventionnel. La résistance à la digestion trypsique a été montrée par

l’équipe de Bertrand-Harb et al. (2002). Ces auteurs ont montré que la forme holo-ALA qui

fixe une molécule de Ca++ serait plus résistante à l’hydrolyse grâce à la stabilité de la

structure tertiaire conférée par le Ca++ par rapport à la forme apo-ALA.

5. PROFIL DE RÉPONSE IgE SPÉCIFIQUE CHEZ LES NOUVEAU-NÉSALLERGIQUES

Après l’étude de l’allergénicité des hydrolysats à partir du modèle animal d’allergie

représenté par la souris Balb/c, nous avons évalué l’immunoréactivité des hydrolysats

obtenus sous micro-ondes et durant le chauffage conventionnel contre les IgE humaines.

Cette étude a été réalisée sur un groupe de nouveau-nés allergiques recrutés au niveau du

service de pédiatrie Amilcar Cabral du CHU d’Oran.

Le but recherché était de caractériser les sérums de ces nouveau-nés allergiques et d’établir

leur profil de sensibilisation pour savoir si un lien existe entre la sensibilisation et la

DISCUSSION

170170170

symptomatologie clinique. La caractérisation de ces sérums a été réalisée par test ELISA-

fluorimétrique et par biopuces à allergènes.

Les données cliniques des patients ont permis d’établir des classes cliniques déclinées

comme suit : signes cliniques légers, signes cliniques modérés et signes cliniques sévères.

Dans notre groupe, 58 sujets présentaient une clinique légère, 7 sujets une clinique modérée

et 2 sujets une clinique sévère (Furlong et al. 2001). La symptomatologie clinique principale

observée était à 80% représentée par des signes digestifs (diarrhée, vomissement) suivi des

signes cutanés (dermatite atopique, eczéma). Ces observations sont en accord avec l’étude

de Rancé (2004, 2009) qui a rapporté que les signes cliniques sont variés : digestifs (50 à 60

% des cas), cutanés (10 à 39 % des cas) ou respiratoires (20 à 30 % des cas). Le choc

anaphylactique (9 % des allergies aux protéines du lait de vache) peut inaugurer l’affection

ou, plus fréquemment, survenir au moment de réintroductions effectuées dans un but

diagnostique. La sévérité initiale de la réaction allergique ne préjuge pas d’une évolution

clinique péjorative.

Pour les formes sévères, les signes digestifs se traduisent par des nausées, des

douleurs abdominales, des vomissements, une diarrhée, la présence de sang dans les selles.

Ces signes sont souvent associés à une irritabilité, à des troubles du sommeil et à une

mauvaise croissance staturo-pondérale (Furlong, 2001 ; Vandenplas, 2007).

La recherche d’IgE spécifiques a été effectuée chez 67 enfants diagnostiqués par

examen clinique comme étant allergiques avérés. La première observation constatée est

l’existence d’une polysensibilisation aux protéines du lait, par au moins deux allergènes qui

sont impliqués. La prédominance des IgE est plutôt obtenue avec les deux allergènes du

lactosérum (BLG et ALA) avec une sensibilisation dans 80% des cas et dans plus de 70% des

cas, la sensibilisation est associée aux IgE anti-BLG et aux IgE anti-ALA. La sensibilisation par

les fractions de caséines est de faible amplitude et est très hétérogène. A la suite d’une

analyse entre les profils de sensibilisation et la symptomatologie clinique, les corrélations ne

tiennent pas pour les formes cliniques légères et modérées avec des IgE spécifiques faibles

en concentrations pour ces dernières. Pour les formes sévères, nous avons observé que le

taux des IgE spécifiques des deux allergènes anti-BLG et anti-ALA très élevés dépassent les

100 KUA/l. Ceci nous permet d’établir une hypothèse de corrélation entre les formes

cliniques sévères et les concentrations en IgE spécifiques.

DISCUSSION

171171171

Les résultats obtenus dans notre travail ont montré clairement que les nouveau-nés

allergiques sont des patients qui ont développé une allergie immédiate médiée par les IgE à

la suite d’une polysensibilisation. Le développement d’une allergie alimentaire nécessite une

étape préalable de sensibilisation à un allergène donné. Cette étape indispensable conduit à

la mise en place des effecteurs humoraux (IgE spécifiques) et cellulaires (lymphocytes T

mémoires) participant à la réaction immuno-allergique. On distingue classiquement au sein

d’un aliment les allergènes dits « majeurs » qui sont définis comme la fraction protéique de

l’allergène contre laquelle au moins 50 % des malades sensibilisés à l’aliment ont des

anticorps sériques de type IgE détectables. Classiquement, plus un aliment possède

d’antigènes majeurs, plus il est sensibilisant (Kay, 2001).

Schématiquement, les antigènes alimentaires ingérés qui passent la barrière

intestinale sont pris en charge puis présentés par les cellules dendritiques aux lymphocytes

T. Ainsi les facteurs qui augmentent la perméabilité intestinale favorisent le développement

de sensibilisations aux allergènes contenus dans la lumière intestinale. Les IgE spécifiques de

l’allergène auquel le sujet est sensibilisé se fixent à la surface des polynucléaires basophiles

circulant et des mastocytes sur leur récepteur à haute affinité, le FcRI (Kay, 2001). Les

mastocytes se distribuent dans la peau et les muqueuses (principalement du tube digestif,

des bronches et des voies aériennes supérieures) expliquant l’expression clinique variable de

l’allergie en fonction de la distribution prédominante de ces cellules. Cette phase de

sensibilisation nécessite 10 à 15 jours chez l’homme.

Par ailleurs, les médiateurs de l’anaphylaxie qui modifient la perméabilité intestinale

résultent en un passage accru de macromolécules normalement exclues du milieu intérieur,

qui entrent à leur tour en contact avec les cellules de l’immunité, expliquant en partie une

polysensibilisation alimentaire fréquente chez ces malades. Ces médiateurs augmentent la

perméabilité vasculaire à l’origine d’une extravasation de liquides dans le milieu interstitiel

responsable d’œdèmes. Ils favorisent aussi la contraction du muscle lisse aboutissant à une

broncho constriction et à une accélération du transit intestinal (Kobayashi, 2000 ; Gurish,

2001 ; Mayer, 2003). D’autres cellules comme les basophiles, les macrophages, les cellules

dendritiques, les polynucléaires éosinophiles et les plaquettes présentent également des

récepteurs aux IgE et participent à la réaction allergique.

DISCUSSION

172172172

La prédominance des manifestations cliniques sous formes digestives (diarrhée,

vomissement et douleurs abdominales) est en partie en contradiction avec les données

épidémiologiques européennes ou une prédominance des manifestations cutanées est

constatée.

Ainsi et d’après une mise au point de Nancey (2005) l’allergie aux protéines du lait de vache,

aliment essentiel du nourrisson, se manifeste principalement par des manifestations

dermatologiques (urticaire aiguë, dermatite atopique) ou digestives (coliques du nourrisson).

Elle disparaît dans plus de 80 % des cas à l’âge de 18 mois, expliquant ainsi qu’il

s’agisse d’un phénomène rare chez l’adulte. À l’inverse, l’allergie à l’arachide ou aux noix

d’arbre a tendance à persister toute la vie (Moneret-Vautrin, 1996). Les manifestations

systémiques sous forme de réactions anaphylactiques sont l’expression clinique la plus grave

de l’allergie alimentaire. Elles engagent le pronostic vital et sont parfois mortelles (Yocum,

1998).

Par contre, l’étude récente menée par Fiocchi (2010) dans le cadre de la mission de

l’organisation mondiale des allergies (WAO) pour le diagnostic et la prise en charge de

l’allergie aux protéines du lait de vache, a montré que les manifestations cliniques

prédominantes au cours de l’allergie aux protéines du lait étaient principalement des

réactions gastro-intestinales suivie de réactions respiratoires et cutanées IgE dépendantes.

L’étude des corrélations entre IgE spécifiques et symptômes cliniques a été envisagée

dans cette partie du travail. Nous avons été confrontés au nombre restreint des patients

ayant une clinique sévère contre ceux ayant une clinique légère ou modérée. Un taux élevé

entre IgE anti-BLG et anti-ALA a été observé en relation avec les manifestations sévères

observées (choc anaphylactique avec implication d’autre manifestations respiratoires et

cutanées). Les études menées pour établir un lien entre allergènes et signes cliniques sont

très peu nombreuses.

L’étude menée par Niggermann et al. (2004) a montré que parmi 62 enfants

présentant une allergie alimentaire transitoire avec dermatite atopique, 37 enfants (avec un

test de provocation orale positif et négatif respectivement avant et après le régime de

restriction) avaient des taux élevés en IgE spécifiques au deuxième test de provocation. Ceci

DISCUSSION

173173173

démontre que durant le régime d’exclusion, les IgE spécifiques n'ont pas diminué de façon

significative et ne concordent pas avec la guérison clinique.

Par ailleurs, l’étude de García-Ara (2001) a montré que le dosage des IgE spécifiques

aux protéines du lait pourrait être un bon marqueur biologique pour discriminer les enfants

allergiques des enfants tolérants. Selon leur étude, la prévalence de l'hypersensibilité

immédiate symptomatique aux protéines du lait de vache était de 44% lorsque le lait entier

et ses principales protéines ont été utilisés dans le prick test. Les valeurs négatives

prédictives sont très élevées, et une valeur négative excluait l'allergie dans 97% des patients.

Les différents seuils de positivité des IgE spécifiques pour le lait ont été analysés : 2,5 KUA / l

avait une valeur prédictive positive de 90% et 5 KUA / l avait une valeur prédictive positive de

95%.

Le dosage des IgE peut être utile dans le suivi de l’installation de la tolérance dans les

cas des allergies aux protéines du lait persistantes. C’est ce qui a été démontré par l’étude

de Saarinen et al. (2005), qui ont indiqué que le groupe constitué d’enfants avec une allergie

aux protéines du lait persistante avaient des IgE spécifiques positives et que ces IgE

disparaissaient après l’âge de 5 ans, c'est-à-dire après l’acquisition de la tolérance.

6. ÉTUDE PAR LES BIOPUCES DU PROFIL DE SENSIBILISATION DES PATIENTSALLERGIQUES

Les observations que nous avons pu mettre en évidence dans la première partie de

ce travail sur le profil de sensibilisation des enfants allergiques par test ELISA fluorimétrique

peuvent rendre compte de l’utilité de ce type d’explorations pour aider au diagnostic des

allergies aux protéines du lait de vache et des allergies alimentaires en général. Cependant,

les corrélations entre données biologiques et cliniques restent controversées et la recherche

fondamentale en matière d’étude des interactions allergène-anticorps ne cesse d’évoluer.

Cette évolution est avantageuse non seulement au niveau technique, avec l’intégration

progressive de technologies innovantes issues de la génomique et de la protéomique, et la

découverte de biomarqueurs biologiques de diagnostic, mais aussi au niveau économique

avec le développement du diagnostic préventif.

Ces procédés faiblement consommateurs en sérum permettent une évaluation

concomitante de la réactivité aux IgE des patients vis-à-vis de plusieurs dizaines de

DISCUSSION

174174174

protéines recombinantes (PR) et/ou naturelles purifiées, (Alcocer, 2004 ; Shreffler, 2005). À

terme, ces procédés guideront des immunothérapies avec un mélange de protéines non

redondantes, éventuellement modifiées, adapté au profil individuel de sensibilisation IgE et

lymphocyte T dépendante.

Les résultats obtenus dans notre travail sur l’utilisation des biopuces à allergènes,

montrent que ce test est très avantageux et économique. L’un des premiers constats est

que les profils de sensibilisation obtenus en test ELISA conventionnel sont identiques et

concordent avec ceux observés à l’aide de biopuces. L’utilisation de telles explorations chez

les nouveau-nés offrirait beaucoup plus d’économie sur le volume de sérum prélevé tout en

ayant une information la plus exhaustive en matière de profil de sensibilisation.

Nous avons observé dans notre étude que les nouveau-nés allergiques étaient

souvent sensibilisés contre la lactoferrine sous forme isolée ou associée à la sensibilisation

contre la BLG et l’ALA. La lactoferrine, une protéine présente sous forme de traces dans le

lait, est difficilement purifiable et les quantités obtenues sont insuffisantes pour une

exploration avec un test ELISA conventionnel. L’autre avantage, est la reconnaissance

simultanée par les IgE spécifiques aussi bien des caséines recombinantes que natives. Les

protéines globulaires comme la BLG et l’ALA recombinantes sont mal reconnues par les IgE

spécifiques positives avec ces mêmes protéines natives. Ceci pourrait être dû à des

modifications post-traductionnelles lors de la synthèse de peptides, comme une absence de

glycosylation ou de phosphorylation des protéines qui changerait leur comportement vis-à-

vis des IgE et même lors de l’interaction avec le support en nitrocellulose.

Plusieurs études prouvent qu’il existe une bonne concordance entre les résultats

obtenus par des puces à protéines et ceux obtenus par d’autres méthodes (Wiese, 2001 ;

Ghochikyan, 2002 ; Arnaud, 2004).

Cependant, eu égard à leur performance expérimentale, l’analyse d’interactions

moléculaires et le criblage à haut débit, rapide et en parallèle, traduit les avantages de la

technologie des micropuces par rapport aux méthodes conventionnelles. De plus, la quantité

de protéines immobilisées sur nitrocellulose ou gélose est mieux contrôlée que celle des

protéines adsorbées sur une microplaque dont la variabilité peut augmenter le taux

d’erreurs des mesures des interactions moléculaires par ELISA. Par ailleurs, la quantité de

protéines-cibles à immobiliser et les volumes d’analyses pour les essais sont respectivement

DISCUSSION

175175175

d’environ 1000 fois et 100 fois plus faibles, tout en permettant une sensibilité de détection

de 2 à 8 fois plus élevée que celle de l’ELISA. Enfin, la diminution de la consommation des

réactifs et l’augmentation du nombre d’analyses exécutées dans le même temps et en

parallèle, réduisent considérablement le coût des essais par les puces (Sakanyan, 2007).

Un des intérêts des protéines recombinantes par rapport aux protéines naturelles

purifiées, repose sur le fait que la synthèse de protéines par des bactéries transfectés (E.

coli) permet d’obtenir des protéines recombinantes non glycosylées et de s’affranchir de

réactivités croisées in vitro, non cliniquement « pertinentes », liées aux IgE anti-CDD

(Malandain, 2005).

Cependant, dans certains cas, l’absence de glycosylation des protéines

recombinantes pourrait réduire leur immunoréactivité et la sensibilité du test par rapport

aux extraits naturels. Ainsi, la production sur levures (Pichia Pastoris..) ou par le système

baculovirus/ cellules d’insectes pourrait être plus performante, pour certains allergènes

alimentaires (Morisset, 2008).

Dans notre étude, pour tous les sérums testés, le premier résultat frappant est la

forte réactivité des sérums testés contre la lactoferrine bovine. Pour rappel, cette protéine

présente dans le lait sous forme de traces n’a pas été testée par le test conventionnel (ELISA-

fluorimétrique) en raison des faibles quantités de protéines disponibles. L’utilisation des

biopuces ne requiert qu’une faible quantité de protéines. Dans notre travail, la quantité de

lactoferrine utilisée pour tous les sérums testée est de 150 µl à partir d’une solution à 1

mg/ml. Ceci montre l’efficacité de ce test en termes d’un balayage plus exhaustif dans

l’étude des allergènes et d’économie en termes d’allergènes précieux. Ceci est valable aussi

pour les protéines recombinantes testées. L’utilisation de ces protéines dans nos tests avait

comme objectif d’évaluer l’information apportée par ces protéines comme protéines plus

stables sur le plan structural et facilement standardisées pour les tests d’étude de

l’interaction allergène-anticorps. Ceci dit, la maîtrise des conditions de synthèse des

protéines recombinantes conduit à la perte de certaines fonctionnalités de ces protéines

comme c’est le cas avec la BLG recombinante qui présente une très faible réactivité en

biopuces par rapport à la BLG native qui présente une forte réactivité contre les sérums

Nos résultats vont dans le sens de certains objectifs d’études réalisées sur les biopuces.

Mêmes si les objectifs sont différents de ceux fixés dans notre travail, la réussite technique

DISCUSSION

176176176

dans l’utilisation de ces biopuces a été démontrée par plusieurs travaux. Ainsi, Lebrun et al.

(2005) ont pu mettre en place un test de microarray colorimétrique pour la détection des

IgE spécifiques anti pneumallergènes. L’utilisation des extraits d’allergènes natifs et semi

purifiés a donné des résultats concordant avec ceux obtenus en ELISA fluorimétrique. Les

résultats obtenus étaient encourageants et l’une des perspectives était de mener une étude

avec des allergènes recombinants pour pouvoir valider le test.

Dans ce contexte, Gaudin et al. (2008) ont pu mettre en place une biopuce à

allergènes du lait contenant des protéines du lait purifiées et recombinantes. L’exploitation

de la biopuce s’est faite dans le domaine de l’infra-rouge pour augmenter la sensibilité de

lecture et de détection. Les résultats obtenus sont similaires à ceux observées dans notre

étude, à savoir une excellente reconnaissance des caséines natives et recombinantes. Le

problème de reconnaissance avec la BLG recombinante a été rapporté. Les auteurs ont

suggéré que sa mauvaise reconnaissance contre les IgE, pourrait être due à sa mauvaise

configuration et exposition spatiale dans le substrat de fixation utilisé (Nitrocellulose).

Sur un autre plan les dernières études concernant l’exploration à haut débit des

peptides du lait ont réussi à mettre en place des biopuces à peptides. Cette approche

faciliterait une meilleure compréhension des interactions IgE-épitopes et leurs relations avec

les manifestations cliniques. Ainsi, Matsumoto, (2009) à criblé à l’aide de biopuces à

peptides une trentaine de peptides synthétiques recouvrant toutes les séquences des

fractions de caséines, de la bêta-lactoglobuline et de l’alpha-lactalbumine. Les résultats

obtenus ont montré l’existence d’une interaction spécifique entre les peptides représentant

les épitopes majeurs des caséines et les IgE. Cette liaison est stable et reproductible.

L’équipe de Vieira et al. (2001) a montré que le suivi de quatres cas cliniques

d’allergie aux pneumallergènes avec suspicion d’allergie alimentaire complexe pouvait

détecter l’allergène responsable par test de biopuces (Phadia-ISAC) en une seule étape

d’exploration.

Les équipes d’Inmaculada et al. (2008) et de Wang et al. (2010) ont étudié la

caractérisation des épitopes par l’utilisation d’une puce à peptides. Là aussi, cette équipe à

pu caractériser plus de dix nouveaux épitopes sur les séquences linéaires des caséines et de

la beta-lactoglobuline en utilisant des sérums d’enfants allergiques. L’épitope découvert sur

DISCUSSION

177177177

la BLG est situé entre les acides aminés 55 et 77, cette séquence avait une réactivité positive

en peptide microarray égale à 77,81%.

En conclusion les progrès dans ces directions seront essentiels pour l’introduction,

dans la pratique médicale, des biopuces multiplexes pour le diagnostic précoce et le

monitoring multiparamétrique des maladies humaines.

7. ÉTUDE DE L’IMMUNORÉACTIVITÉ DES HYDROLYSATS DE LACTOSÉRUMCONTRE LES IgE HUMAINES

Dans la première partie de notre travail, nous avons produit des hydrolysats sous

micro-ondes et durant le chauffage conventionnel. Nous avons mesuré par la suite

l’immunoréactivité de ces hydrolysats contre les IgG polyclonaux anti-BLG et anti-ALA. Les

résultats obtenus ont montré une diminution de l’immunoréactivité des hydrolysats

trypsiques et chymotrypsiques sous micro-ondes à 100 Watts et par hydrolyse pepsique sous

micro-ondes à 200 Watts. La deuxième partie de ce travail consistait à évaluer l’allergénicité

de ces hydrolysats en chambre de Ussing. Là aussi, nous avons constaté une diminution de

l’allergénicité de certains hydrolysats de lactosérum trypsique/chymotrypsique sous micro-

ondes à 100W Watts et 200 Watts. En revanche, les hydrolysats conservaient toujours leur

allergénicité par vis à vis de l’ALA.

Dans cette dernière partie de notre travail, nous avons évalué l’immunoréactivité des

hydrolysats produits contre les IgE humaines anti-BLG et anti-ALA.

Les résultats obtenus montrent que l’immunoréactivité des hydrolysats

trypsiques/chymotrypsiques sous micro-ondes et au cours du chauffage conventionnel

restait comparable à celle des protéines natives étudiées dans les mêmes conditions. En

revanche, lorsque le lactosérum est hydrolysé par la pepsine à 200 Watts pendant 3

minutes, son immunoréactivité avec les IgE anti-BLG et les IgE anti-ALA est totalement

supprimée.

La conservation de l’immunoréactivité des hydrolysats trypsique/chymotrypsique

pourrait être due aux actions des enzymes utilisées qui ne coïncide forcément pas avec les

sites épitopiques. Ceci traduit donc une résistance des épitopes linéaires de l’ALA et de la

BLG. Par contre la baisse de l’immunoréactivité des hydrolysats pepsiques sous micro-ondes

DISCUSSION

178178178

à 200 Watts pourrait être expliquée par l’action efficace de la pepsine atteignant ainsi les

principaux épitopes majeurs de l’ALA et de la BLG. Par ailleurs, les micro-ondes pourraient

avoir un impact sur la structure tertiaire des protéines, en particulier la BLG connue pour sa

résistance à la pepsinolyse. Cet impact se traduirait sous micro-ondes par un comportement

d’hydrolyse différent de celui observé durant le chauffage conventionnel. Cette étape sub-

dénaturante de la BLG se traduit par un démasquage des sites compacts les plus profonds

des régions hydrophobes des protéines et permet ainsi aux enzymes d’attaquer

simultanément les épitopes séquentiels.

L’hydrolyse pepsique de la BLG n’est observée que dans le cas du traitement sous

micro-ondes à 200 Watts. La BLG a été hydrolysée soit sous sa forme purifiée ou présente

dans le mélange du lactosérum. Cette hydrolyse partielle de la BLG est associée à une forte

réduction de son immnuoréactivité contre le sérum des enfants allergiques.

Généralement, la BLG et l’ALA sont les principaux allergènes du lait responsables de

plus de 80% de sensibilisation chez une population pédiatrique. La réduction de

l’immunoréactivité de ces protéines par la pepsine pourrait être due à la spécificité de

l’action de cette enzyme facilitée par les traitements sous micro-ondes. La spécificité de la

pepsine coïnciderait avec les régions recouvrant les épitopes séquentiels habituellement

résistants aux hydrolyses enzymatiques (trypsine/chymotrypsine).

Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus avec Izquierdo et al. (2008) où

l’hydrolyse de la BLG par la pronase et la papaïne diminuait significativement leur

immunoréactivité lorsque l’hydrolyse est combinée au traitement par les micro-ondes. Alors

que l’hydrolyse menée par la chymotrypsine n’affecte pas trop son immunoréactivité, une

autre étude menée par Kim et al. (2007) a montré que l’hydrolyse des protéines du

lactosérum (BLG et ALA) par la pepsine suivie d’une trypsinolyse pendant 120 minutes

diminuait significativement l’immunoréactivité des hydrolysats contre la BLG.

Les études reprenant la réduction de l’immunoréactivité des protéines laitières à la

suite des traitements physiques combinés aux hydrolyses enzymatiques par chauffage sont

nombreuses comme le démontrent les travaux de Bonomi et al. (2003) sur la réduction de

l’immunoréactivité de la BLG. Plusieurs travaux ont montré une réduction de

l’immunoréactivité du lactosérum bovin (Penas, Préstamo et al., 2006; Penas et al. 2006b ;

DISCUSSION

179179179

Penas, Snel et al., 2006) et de l’arachide (Penas et al., 2004, 2006a, Penas, Préstamo et al.,

2006) après des protéolyses couplées aux traitements par hautes pressions.

Alors que la BLG est le plus souvent résistante à la pepsinolyse dans les conditions de

traitements conventionnels, Penas et al. (2006) et Chicon et al (2008) ont démontré que

l’hydrolyse par la pepsine de la BLG sous hautes pressions était effectuée avec succès et ceci

avec une importante diminution de l’immunoréactivité de son hydrolysat pepsique contre le

sérum d’enfants allergiques aux protéines du lait. Ceci concorde parfaitement avec nos

observations, confirmant ainsi l’effet des traitements physiques exerçant une pression sur la

structure compacte de la BLG qui passe à un état de Molten Globule facilitant ainsi l’accès

des enzymes au cœur de la protéine.

L’objectif principal de traitements associés aux protéolyses est d’atteindre au

maximum les épitopes impliqués dans les immunoréactivités contre les IgE de patients

allergiques qui sont le plus souvent linéaires et résistants aux hydrolyses enzymatiques.

Plusieurs auteurs ont étudié la caractérisation des épitopes linéaires reconnus par la plupart

des IgE de patients allergiques dénommés épitopes majeurs.

Jarvinen et al., (2001) ont étudié les épitopes de liaison aux IgE et aux IgG de l’ALA et

de la BLG bovine chez des patients allergiques aux protéines du lait. Ces auteurs ont mis en

évidence quatre épitopes d’ALA liant les IgE et six épitopes de liaisons aux IgE détectés dans

la BLG. Ces épitopes ont été découverts chez des patients avec une allergie persistante au

lait. Par contre les enfants ayant acquis la tolérance ne reconnaissent que trois épitopes

parmi six pour la BLG et aucun épitope n’est retrouvé pour l’ALA. D’après ces auteurs le site

antigénique majeur de l’ALA correspond à la séquence d’acides aminés 5-18) qui concorde

parfaitement avec une homologie de séquence 124-134 de la BLG. Ces résultats avaient été

présentés auparavant par Wal et al.,(1998). Ceci pourrait expliquer aussi la réactivité

associée entre la BLG et l’ALA retrouvée dans notre travail (70% des cas) dans les profils de

sensibilisation des nouveau-nés explorés.

DISCUSSION

180180180

8. EPITOPES LINÉAIRES DE LA BLG RECONNUS PAR LES IgELes épitopes séquentiels liant les IgE ont été étudiés chez des sujets présentant une

allergie aux protéines du lait persistante (Jarvinen, 2001, 2002). Sept épitopes ont été

caractérisés et les séquences d’acides aminés correspondantes sont les suivantes: 1-16 ; 31-

48 ; 47-60 ; 67-78 ; 75-86 ; 127-144 et le 141-152. Chez les jeunes sujets allergiques (âge < 3

ans) seulement trois de ces épitopes sont fortement immunoréactifs.

Contrairement à nos résultats, les études menées par Sélo et al. (1998, 1999) ont

montré que les hydrolyses tryptiques de la BLG bovine réduisaient à 50% son

immunoréactivité contre les IgE de patients allergiques. Les fragments tryptiques suivants :

1-8 ; 25-40 ; 41-60 ; 102-124 et le 149-162 générés de l’hydrolyse de la BLG ont été

considérés comme épitopes majeurs de liaison aux IgE.

Par ailleurs, dans une autre étude et dans le but d’identifier les épitopes séquentiels

liant les IgE humaines, l’équipe de William et al. en 1999 a généré des IgE chez le rat Brown

Norway comme modèle d’étude des épitopes allergéniques. Les résultats indiquaient que les

fragments tryptiques de la BLG utilisés pour l’immunisation de l’animal produisaient des IgE

qui liaient les même épitopes majeurs produits chez l’homme et identifiés par Selo et al.

(1998). Ces résultats peuvent confirmer l’utilité des modèles animaux pour l’étude de

l’allergénicité des protéines alimentaires et leur possible extrapolation chez l’humain.

Les différentes études menées sur les épitopes séquentiels de la BLG indiquent que

leur destruction dépend des enzymes utilisées et de leur spécificité. La trypsine et la

chymotrypsine restent sans effet sur les épitopes de la BLG et de l’ALA , car leurs sites

d’attaque ne coïncident pas avec les épitopes majeurs, (ExPAsy PeptidCutter®,

http://web.expasy.org/peptide_cutter/). Ceci est à l’origine de la conservation de

l’immunoréactivité des hydrolysats trypsiques/chymotrypsiques contre les IgE humaines

observée.

Par contre, et dans nos conditions expérimentales, les sites d’attaque théorique de la

pepsine (47 sites), élimineraient la majorité des épitopes linéaires de la BLG et de l’ALA. Ceci

pourrait expliquer l’importante diminution de l’immunoréactivité des hydrolysats peptiques

de la BLG et de l’ALA.

La diminution de reconnaissance des IgE par les hydrolysats ne signifie pas forcément

une diminution de leur allergénicité. En effet, une allergie ne s’exprime cliniquement chez un

DISCUSSION

181181181

sujet sensibilisé qu’après contact pour la seconde fois avec l’allergène. Dans ce cas,

l’interaction de cet allergène avec deux IgE spécifiques pontées à la surface des mastocytes

aboutit à leur activation et à la libération rapide et massive par exocytose de nombreux

médiateurs solubles (Nancey, 2005).

En 2005, Fritsché et al. ont montré que les épitopes majeurs découverts au niveau de

la BLG n’étaient pas tous fonctionnels. L’étude menée sur des mastocytes de rat humanisés

a montré que ces cellules ne dégranulaient pas en présence de tous les peptides

représentant les épitopes linéaires de la BLG. Ainsi la séquence linéaire de la BLG 149-162

était la seule à pouvoir dégranuler les mastocytes in vitro. Ce dernier épitope a été considéré

comme épitope bivalent de la BLG. En analysant les sites d’attaques de la pepsine sur la

séquence linéaire de la BLG on remarque que cet épitope bivalent (149-162) est dégradé par

la pepsine dans les conditions de traitements physiques par hautes pressions combinés à la

pepsinolyse. Ceci pourrait expliquer en partie la diminution de l’immunoréactivité de nos

lactosérums bovins obtenus sous micro-ondes à 200 Watts.

9. EPITOPES LINÉAIRES DE L’ALA RECONNUS PAR LES IGE

Les études de caractérisation des épitopes de l’ALA sont peu nombreuses. Une

récente étude de Hochwallner et al. (2010) par biopuces avec une ALA recombinante et

native a montré que les séquences suivantes de l’ALA ont fortement liées les IgE : 1-19 ; 15-

34 et la séquence 105-123. L’étude de dégranulation des mastocytes humanisés (RBL) a

montré que la séquence 15-34 était la plus impliquée dans la dégranulation des mastocytes

sensibilisés avec les IgE de patients humains. Dans une étude plus ancienne, Jarvinen et al.

(2001) ont pu caractériser quatre épitopes linéaires de l’ALA à savoir : 1-16 ; 13-26 ; 47-58 et

93-102 ces quatres épitopes se rapprochent de ceux trouvés dans l’étude d’Hochwallner

(2010).

Dans notre travail, l’étude de l’immunoréactivité des hydrolysats contre les IgE anti-

ALA, a montré une conservation de cette immunoréactivité après hydrolyse

trypsique/chymotrypsique, ce qui laisserait penser à un degré d’hydrolyse insuffisant de

l’ALA, car en reprenant la séquence de l’ALA avec les sites d’attaques des enzymes, nous

avons remarqué que les enzymes pourraient détruire les quelques épitopes séquentiels cités

DISCUSSION

182182182

dans la littérature. Ceci pourrait aussi être expliqué par l’existence probable d’autres

épitopes bivalents non identifiés jusqu’à maintenant.

Une autre étude d’Adams et al. en 1991, a pu aussi caractériser une séquence représentant

un épitope séquentiel de l’ALA : 5-18 et prouver par un test ELISA compétitif l’existence

d’une réaction croisée entre la BLG et ceux de l’ALA.

10. ÉTUDE PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE (DC)

Dans les précédentes parties de ce travail, nous avons pu démontrer que les micro-

ondes accélèrent les réactions enzymatiques des protéines du lactosérum bovin comparées

à celles obtenues durant le chauffage conventionnel. Cependant, cette action privilégiée des

micro-ondes n’avait pas d’effet sur la spécificité des enzymes à partir du moment ou les

immunoréactivités des différents hydrolysats de lactosérum observées avec les deux types

de traitements (micro-ondes et chauffage conventionnel) n’étaient pas significativement

différentes. Le résultat le plus significatif et le plus intéressant était la susceptibilité de la BLG

à la pepsinolyse sous micro-ondes à 200 Watts. L’hydrolysat de lactosérum issu de cette

hydrolyse à été le moins immunoréactif contre les IgE humaines.

L’hypothèse qui découle de ce travail est que la dénaturation de la BLG sous micro-

ondes se faisait de manière différente que lors du chauffage conventionnel ce qui exposerait

d’avantage les sites d’attaque de la pepsine et l’atteinte des épitopes linéaires enfouis dans

le cœur hydrophobe de la BLG. Pour vérifier cela, une étude par dichroïsme circulaire (DC) a

été réalisée pour évaluer l’impact de ce traitement sur les structures tertiaire et secondaire

de la BLG.

Les résultats obtenus ont révélée des changements des spectres enregistrés et qui

correspondent aux feuillets détectés dans l’UV lointain et des changements de la structure

tertiaire observés à la suitede l’analyse dans l’UV proche. Ceci pourrait nous mener à

conclure en partie qu’une dénaturation est observée.

Ces observations peuvent être soutenues par les études menées sur la pepsinolyse

de la BLG sous haute pression. Ainsi Belloque et al. en 2007, ont pu montrer que la

pepsinolyse de la BLG est réalisée sous hautes pressions (> 300 MPa, pH 2). Ces conditions

extrêmes de traitement physique appliqué à la BLG auraient des effets sur le changement de

DISCUSSION

183183183

sa structure compacte permettant une meilleure exposition des sites d’attaque de la

pepsine.

Chicon et al. (2008) ont démontré aussi que la pepsinolyse de la BLG combinée à des hautes

pressions (400 MPa) a diminué son immunoréactivité contre les IgE humaines.

Une autre étude très récente et intéressante de Ahmed et Luciano, en 2009 vient aussi

renforcer l’idée de la dénaturation de la BLG sous micro-ondes. Ces auteurs ont étudié les

propriétés diélectriques de la BLG à différents pH de traitements sous micro-ondes.

Pour rappel, les propriétés électriques d’une molécule alimentaire (protéines dans

notre cas) dans le contexte des micro-ondes et des champs électromagnétiques sont

connues sous le terme de propriétés diélectriques. Ces propriétés sont des constantes

permettant de comprendre l’interaction entre micro-ondes et molécules alimentaires, à

savoir la quantité d’énergie absorbée, transmise ou réfléchieau cours de cette interaction.

Plusieurs facteurs influencent ces propriétés diélectriques des protéines, la teneur en sel, les

ondes électromagnétiques et leurs fréquences, la température et l’état physique de

l’aliment (Galéma, 1997).

Ces auteurs (Ahmed et al., 2009) ont démontré que les propriétés diélectriques de la

BLG mesurés lors de son chauffage par les micro-ondes sont élevées et atteignent leur

valeurs maximales à des pH bas (<4). L’augmentation de ces constantes est fortement liée à

la dénaturation de la BLG dans ces conditions de traitement sous micro-ondes.

En conclusion, les micro-ondes jouent un rôle important dans le processus de la

dénaturation des protéines les plus compactes comme la BLG. Cette dénaturation peut être

à l’origine de sa susceptibilité à la pepsinolyse et de la destruction des épitopes linéaires

liants les IgE.

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CONCLUSIONS & PERSPECTIVES

CONCLUSION & PERSPECTIVES

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CONCLUSION

Dans ce travail, nous avons abordé deux points clés dans la prise en charge de

l’allergie aux protéines du lait de vache : l’évolution de l’immunoréactivité des protéines du

lait à la suite d’un traitement thermique par micro-ondes couplé à une hydrolyse

enzymatique, chez le modèle animal et contre les IgE humaines de patients allergiques.

L’élaboration d’un test miniaturisé pour l’étude et l’exploration à haut débit du profil de

sensibilisation de patients allergiques aux protéines du lait a été élaboré.

La protéolyse des protéines du lactosérum bovin sous micro-ondes a permis une

dégradation plus accélérée des protéines comparée au chauffage conventionnel. L’effet de

la digestion sur les allergènes alimentaires sous leurs formes purifiées peut être différent de

celui de ces mêmes allergènes au sein de la matrice alimentaire. Il est donc important de

considérer l’allergène isolé mais également dans l’aliment entier où les interactions avec

d’autres protéines ou d’autres composés peuvent avoir lieu et interférer sur la digestion

enzymatique.

Dans notre travail, la forme purifiée de l’allergène (BLG ou ALA ou lorsqu’elles sont

présentes dans le mélange du lactosérum) n’affecte pas les produits d’hydrolyse obtenues.

D’après nos résultats, la BLG naturellement résistante à la pepsinolyse devient sensible à

cette digestion dans les conditions de traitements sous micro-ondes à 200 Watts. Cette

susceptibilité peut être le résultat des effets des micro-ondes sur la structure tertiaire de la

BLG. Dans ce sens, l’analyse par dichroïsme circulaire a montré une dénaturation de la BLG

dans les conditions de traitements micro-ondes à 200 Watts.

L’étude de l’immunoréactivité des hydrolysats de lactosérum obtenus contre les IgG

polyclonaux a montré que les épitopes antigéniques de ces allergènes semblent affectés par

ces hydrolyses enzymatiques couplées aux micro-ondes.

Le deuxième aspect étudié dans ce travail, est l’évaluation du potentiel allergénique

des hydrolysats produits. Pour cela nous avons bénéficié d’un modèle animal d’allergie mis

en place dans notre laboratoire. Nous avons observé que les hydrolysats peptiques obtenus

sous micro-ondes à 200 Watts présentaient un faible potentiel allergénique comme la

montré l’étude d’anaphylaxie intestinale en chambre de Ussing. L’autre point important,

était de comparer entre les profils d’immunoréactivité d’hydrolysats obtenus contre les IgG

polyclonaux avec leur potentiel allergénique mesuré en chambre de Ussing. Les données

186186186


obtenues entre les deux explorations ont montré que les hydrolysats de lactosérum qui

présentaient une faible immunoréactivité antigénique avaient un faible potentiel

allergénique chez le modèle animal d’allergie.

Les résultats obtenus de l’étude de l’allergénicité en chambre de Ussing des différents

hydrolysats sont confrontés par l’étude de leur immunoréactivité contre les IgE humaines

anti-BLG et anti-ALA. Les résultats obtenus dans cette partie du travail a démontré que la

perte du potentiel allergénique des hydrolysats de lactosérum observé en chambre de

Ussing est associée à une diminution de reconnaissance de ces hydrolysats par les IgE

humaines.

Le troisième point étudié dans ce travail est l’analyse de la spécificité de la réponse

IgE nous a conduit à développer un outil original. Ce nouvel outil de caractérisation de la

réponse IgE, à la fois plus sensible et plus spécifique, pourrait contribuer à l’amélioration du

diagnostic de l’allergie au lait. Son utilisation pourrait être généralisée à d’autres allergies,

alimentaires ou polliniques. Les IgE humaines étudiées proviennent de sérums d’enfants

allergiques avec des manifestations cliniques légères, modérées et sévères.

L’étude du profil de sensibilisation de ces nouveau-nés allergiques a été réalisés par

un test conventionnel l’ELISA-fluorimétrique et un test miniaturisé des biopuces à

allergènes. Les résultats obtenus ont montré que les IgE anti-BLG et anti-ALA sont

prédominantes dans la population allergique étudiée. L’analyse par les biopuces à allergènes

a pu démontrer son efficacité en incorporant une quantité variée et diversifiée d’allergènes

laitiers. Les résultats de cette exploration confirment la polysensibilisation de l’allergie chez

ces enfants et la prédominance non seulement de la sensibilisation à la BLG et à l’ALA mais

aussi contre un autre allergène peu étudié, la lactoferrine. Cette protéine qui existe sous

forme de traces dans le lait rend difficile son exploration dans les tests conventionnels ou

même par des tests cutanés.

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Comme perspectives la production des hydrolysats de lactosérum à grande échelle

industrielle est l’un de nos objectifs futurs. L’hydrolyse enzymatique couplée aux micro-

ondes sur du lait entier avec contrôle de la température de traitement est envisagée.

Les micro-ondes semblent être un traitement subdénaturant intéressant qui pourrait

faciliter l’accès des enzymes à leurs sites d’attaques.

L’un de nos objectifs c’est de produire des hydrolysats lactés avec un degré d’hydrolyse

optimal en appliquant ce traitement et de cibler les épitopes linéaires résistants aux

traitements classiques.

L’application du test miniaturisé des biopuces à l’analyse de la réponse IgG spécifique

permettrait d’attribuer aux sous-classes, notamment IgG1 et IgG4, un rôle dans l’évolution

de l’allergie, rôle qui n’a pas pu être défini avec nos techniques classiques.

Dans ce cadre, nous pourrions envisager d’établir un lien entre l’évolution clinique de

l’allergie du patient et le profil de réponse IgE et IgG. Cette spécificité nécessiterait une

étude approfondie avec un suivi longitudinal des patients : âge de la première

sensibilisation, évolution de la symptomatologie, acquisition ou non d’une tolérance. Il serait

intéressant d’établir une corrélation de l’évolution de la maladie au cours de la vie du

patient avec tous les allergènes sélectionnés et également avec les épitopes de ces mêmes

allergènes. Cette évocation d’épitopes permet également de suggérer de nouvelles

recherches.

En termes de prévention primaire de l’allergie aux protéines du lait de vache, l’étude

périnatale chez des mères atopiques et témoins pourrait fournir des informations sur les

biomarqueurs sériques de sensibilisation chez la mère ou le nouveau-né. Ceci faciliterais la

détection et la prise en charge précoce de cette affection et éviter les réactions adverses

d’allergies durant les premiers mois de la vie.

Nous sommes conscients que l’ensemble des projets décrits dans ces perspectives

représente une somme de travail considérable. Il nous appartiendra de choisir parmi les

différents sujets les approches à privilégier. Cependant, il nous paraissait intéressant

d’exposer l’ensemble de ces perspectives pour montrer les différents aspects lié à la

problématique de la prise en charge et de l’étude de l’allergie aux protéines du lait.

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES


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1. Adams S.L., Barnett D., Walsh B.J., Pearce R.J., Hill D.J., Howden M.E. Human IgEbinding synthetic peptides of bovine beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin. Invitro cross-reactivity of the allergens. Immunology Cell Biology, 1991; 69:191-7.

2. Adel-Patient K., Nahori M.A., Proust B., Lapa E., Silva J.R., Creminon C., Wal J.M.,Vargaftig B.B.. Peanut- and cow’s milk-specific IgE, Th2 cells and local anaphylacticreaction are induced in Balb/c mice orally sensitized with cholera toxin. Allergy,2005; 33: 376-385.

3. Adel-Patient K., Creminon C., Bernard H., Clement G., Negroni L., Frobert Y., GrassiJ., Wal J.M., Chatel J.M. Evaluation of a high IgE-responder mouse model of allergyto bovine beta-lactoglobulin (BLG): development of sandwich immunoassays fortotal and allergen-specific IgE, IgG1 and IgG2a in BLG-sensitized mice. Journal ofImmunology Methods, 2000; 235:21–32.

4. Adler-Nissen J. Limited enzymatic degradation of proteins: a new approach in theindustrial application of hydrolases. J. Chem. Tech. Biotechnology., 1982; 32: 138-156.

5. Adler-Nissen J. Enzymic hydrolysis of food proteins. New York : Elsevier AppliedScience Publishers. 1986: 110-169

6. Adson A., Raub T.J., Burton P.S., Barsuhn C.L., Hilgers A.R., Audus K.L., Ho N.F.Quantitative approaches to delineate paracellular diffusion in cultured epithelial cellmonolayers. Journal of Pharm Science, 1994; 83:1529—36.

7. Ahmed J., Luciano G. Dielectric properties of -lactoglobulin as influenced by pH,concentration and temperature. Journal of Food Engineering, 2009; 95: 30–35.

8. Alcocer M.J., Murtagh G.J., Wilson P.B., Progias P., Lin J,Archer D.B. Themajorhuman structural IgE epitope of the Brazil nut allergen Ber e 1: a chimaeric andprotein microarray approach. Journal of Molecular Biology, 2004; 343(3):759–69.

9. Amiot J., Fournier S., Lebeuf Y., Paquin P., Simpson R. Composition, propriétésphysico-chimiques, valeur nutritive, qualité technologique et techniques d’analysedu lait. In : Vignola CL. Sciences et technologie du lait : transformation du lait. Ecolepolytechnique édition, Montréal, 2002; pp 5-17.

10. Ammar F., De Boissieu D., Dupont C. Allergie aux hydrolysats de protéines. Àpropos de 30 cas. Archive of Pédiatrics, 1999 ; 6 : 837-43.

11. Andre F., Pene J., Andre C. Interleukin-4 and interferon-gamma production byperipheral blood mononuclear cells from food allergic patients. Allergy, 1996;51:350–5.

12. Angenendt P., Glokler J., Sobek J., Lehrach H., Cahill D.J. Next generation of proteinmicroarray support materials: evaluation for protein and antibody microarrayapplications. Journal of Chromatography A, 2003; 1009:97–104.


190190190

13. Arnaud M.C., Gazarian T., Palacios Rodriguez Y., Gazarian K., Sakanyan V. Arrayassessement of phage displayed peptide mimics of Human Immunodeficiency Virustype 1 gp41 immunodominant epitope: binding to antibodies of infectedindividuals. Proteomics. 2004; 4 (7): 1959-64.

14. Assadullahi T.P., Adler B.R.O., Warner J. Presence of high molecular weightpeptides in protein hydrolysate formulae. Journal of Allergy Clinical andImmunology, 1992; 228 (Suppl).

15. Astwood J.D., Leach J.N., Fuchs R.L. Stability of food allergens to digestion in vitro.Nature Biotechnology, 1996; 14:1269-1273.

16. Atmaca S., Akdag Z., Dasdag S. et Celik S. Effect of microwaves on survival of somebacterial strains. Acta Microbiology Immunology Hung, 1996; 43 (4) : 371-378.

17. Bahna S.L. Cow’s milk allergy vs cow’s milk intolerance. Annals of Allergy Asthmaand Immunology, 2002; 89 (Suppl), 56-60.

18. Baldo B.A. Milk allergies. Ausralian Journal of Dairy Technologies, 1984; 39:120-8.

19. Ball G., Shelton M.J., Walsh B.J., Hill D.J., Hosking C.S., M. Howden E.H. A majorcontinuous allergenic epitope of bovine β-lactoglobulin recognized by human IgEbinding. Clinical & Experimental Allergy, August 1994 ; 24 (8) : 758–764,

20. Ballmer-Weber B.K., Vieths S., Bucher C., Luttkopf D., Wuthrich B. Hazelnut allergy.Validation of diagnostic procedures on the basis of double-blind placebo controlledfood challenges. Allergologie, 2000; 23:285-291.

21. Balny, C. & Masson, P. Effects of high pressure on proteins. Food ReviewInternational, 1993; 9, 611–628.

22. Barau E., Dupont C. Allergy to cow’s milk proteins in mother’s milk or in hydrolyzedcow’s milk infant formulas as assessed by intestinal permeability measurements.Allergy, 1994; 49: 295-8.

23. Baumgartner M., Brown C.A., Exl B.M. ,Secretin M.C., Van’Hof M., Haschke F.Controlled trials investigating the use of one partially hydrolyzed whey formula fordietary prevention of atopic manifestations until 60 months of age: an overviewusing meta-analyical techniques. Nutrition. Research, 1998; 18: 1425-42.

24. Belloque J., Chicon R., and Lopez-Fandino R. Unfolding and refolding of -Lactoglobulin Subjected to High Hydrostatic Pressure at Different pH Values andTemperatures and Its Influence on Proteolysis. Journal of Agricultural Food andChemistry, 2007; 55: 5282-5288.

25. Belut D., Moneret-Vautrin D.A., Nicolas J.P., Grilliat J.P. IgE levels in intestinal juice.Dig Dis Sci, 1980; 25:323-32.


191191191

26. Berin M.C., Kiliaan A.J., Yang P.C., Groot J.A., Taminiau J.A., Perdue M.H. Rapidtransepithelial antigen transport in rat jejunum: impact of sensitization and thehypersensitivity reaction. Gastroenterology, 1997; 113: 856-64.

27. Bernard H., Paty E., Mondoulet L., Burks A.W., Bannon G.A., Wal J.M.,Scheinmann P. Serological characteristics of peanut allergy in children. Allergy,2003; 58:1285-1292.

28. Berthold K., Olivier G., Joanne H., Kathrin K., Raanan S. Guidelines on PaediatricParenteral Nutrition of the European Society of Paediatric Gastroenterology,Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) and the European Society for Clinical Nutritionand Metabolism (ESPEN), Supported by the European Society of Paediatric Research(ESPR). Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, November 2005; 41: 1-4

29. Bertrand-Harb C., Baday A., Dalgalarrondo M., Chobert J.-M and Haertle T.Thermal modifications of structure and co-denaturation of -lactalbumin and -lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases.Nahrung/Food, 2002; 46 No. 4 : 283– 289.

30. Bicudo Mendonça R., Motta Franco J., Rodrigues Cocco R., Suano de Souza F.I.,Lopes de Oliveira L.C., Saccardo Sarni R.O., Solé D. Open oral food challenge in theconfirmation of cow’s milk allergy mediated by immunoglobulin E. Allergologia etImmunopathologia, January–February 2012; Vol 40, Issue 1 : 25–30.

31. Bilgili S., Mehl A., Verstege A., Staden U., Nocon M., Beyer K., Niggemann B.. Thepredictive value of specific immunoglobulin E levels in serum for the outcome oforal food challenges. Clinical and Experimental Allergy, 2005; 35:268-73.

32. Bischoff S.C. & Crowe S.E. Gastrointestinal food allergy: new insights intopathophysiology and clinical perspectives. Gastroenterology, 2005; 128, 1089–1113.

33. Bohr H., & Bohr J. Microwave enhanced kinetics observed in ORD studies of aprotein. Bioelectromagnetics, 2000a; 21: 68–72.

34. Bohr H., & Bohr J. Microwave-enhanced folding and denaturation of globularproteins. Physical Review. Statistical Physics, Plasmas, Fluids, and RelatedInterdisciplinary Topics, 2000b; 61: 4310–4314.

35. Bonomi F., Fiocchi A., Frokiaer H., Gaiaschi A., Iametti S., Poiesi C., Rasmussen P. ,Restani P. and Rovere P. Reduction of immunoreactivity of bovine b-lactoglobulinupon combined physical and proteolytic treatment. Journal of Dairy Research, 2003;70: 51–59.

36. Boughellout H., Zidoune M.N. Prévalence de l’allergie aux protéines au lait devache dans la région d’Annaba. Archives de Pédiatrie, June 2010 ; 17 (6) : 86–87.

37. Boyano Martinez T., Garcia-Ara C., Diaz-Pena J.M., Munoz F.M., Garcia Sanchez G.,Esteban M.M. Validity of specific IgE antibodies in children with egg allergy. Clinicaland Experimental Allergy, 2001; 31:1464-9.


192192192

38. Brandtzaeg P. The gut as communicator between environment and host:Immunological consequences. European Journal of Pharmacology, 2011; Volume668, Supplement 1, September: S16-S32.

39. Brenna, O., Pompei, C., Ortolani, C., Pravettoni, V., Farioli, L. & Pastorello, E.A.Technological processes to decrease the allergenicity of peach juice and nectar.Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2000; 48, 493–497.

40. Brew K., Castellino F.J., Vanaman T.C., Hill R. The complete amino acid sequence ofbovine alpha-lactalbumin. Journal of Biology Chemistry, 1970; 245, 4570-4582.

41. Browne W.J., North A.C.T., Phillips D.C., Brew K., Vanaman T.C., Hill R.L. A possiblethreedimensional structure of bovine α-lactalbumin based on that of hen’s egg-white lysozyme. Journal of Molecular Biology, 1969; 42: 65-86.

42. Brownlow S. Morais Cabral J.H., Cooper R., Flower D.R., Yewdall S.J., PolikarpovI., North AC., Sawyer L. Bovine B lactoglobuline at 1,8 A resolution, still anenigmatic lipocalin. Structure, April 1997; Vol 5, Issue 4 : 481–495.

43. Bruel H., Le Luyer B., Chabrolle J.P., Le Roux P., Bouleau-Debordes O., Poinsot J.Allergie à un hydrolysat de protéines du lait de vache chez des jumeaux prématurés.Archives de Pédiatrie, 1998; 5 : 461-2.

44. Businco L., Cantani A., Longhi M.A., Giampetro G.R. Anaphylactic reactions tocow’s milk whey protein hydrolysate (Alfaré Nestlé) in infants with cow’s milkallergy. Annals of Allergy, 1989; 62: 333-5.

45. Businco L., Lucenti P., Arcese G., Ziruolo G., Cantani A. Immunogenicity of a so-called hypoallergenic formula in at-risk babies: two case reports. Clinical andExperimental Allergy, 1994; 24: 42-5.

46. Carrillo-Munoz J.R., Bouvet D., Guibé-Jampel E., Loupy A., Petit A. Journal ofOrganic Chemistry, 1996 ; 61 :7746.

47. Cerecedo I., Zamora J., Shreffler W.G., Lin L., Bardina L., Dieguez M.C., Wang J.,Muriel A., Del Hoz B., and Sampson H.A. Mapping of the IgE and IgG4 sequentialepitopes of milk allergens with a peptide microarray–based immunoassay. Journalof Allergy and Clinical Immunology, 2008; 122:589-94.

48. Chan J.C.K. & Li-Chan E.C.Y. Production of lactoferricin and other cationic peptidesfrom food grade bovine lactoferrin with various iron saturation levels. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 2007; 55: 493-501.

49. Chaplin L. C., & Lyster R. L. J. Irreversible heat denaturation of bovine α-lactalbumin. Journal of Dairy Research, 1986; 53: 249−258.

50. Chekroun A., Bensoltane A., Saidi D., Kheroua O. Dietetic valorization of cow’s milkproteins fermented at 45°C by Lactobacillus acidophilus Associated withBifidobacteria. Journal of agricultural science and technology, 2011; 5: 283-289.


193193193

51. Chicon R., Lopez-Fandino R., Alonso E., and Belloque J. Proteolytic Pattern,Antigenicity, and Serum Immunoglobulin E Binding of β-Lactoglobulin HydrolysatesObtained by Pepsin and High-Pressure Treatments. Journal of Dairy Science. 2008;91: 928–938.

52. Chirdo F.G., Millington O.R., Beacock-Sharp H., Mowat A.M. Immunomodulatorydendritic cells in intestinal lamina propria. European Journal of Immunology, 2005;35: 1831-40.

53. Chouraqui J.P. Les grands principes de la nutrition entre 1 et 3 ans. Revue Pratique,2004 ; 54 : 2005-12.

54. Chouraqui J.P. Place des laits infantiles dans l’alimentation du nourrisson et del’enfant, in Goulet O., Vidailhet M. et coll. Alimentation de l’enfant en situationnormale et pathologique. Progrès en Pédiatrie, Doin ed, 2002 ; 13 : 83-93.

55. Chouraqui J.-P., Michard-Lenoir A.-P. Alimentation au cours des diarrhées aiguesdu nourrisson et du jeune enfant. Archives de pédiatrie, 2007 ; 14 : 176-180

56. Cole Z. A., Clough G. F. & Church M. K. Inhibition by glucocorticoids of the mastcell-dependent weal and flare response in human skin in vivo. British Joural ofPharmacology, 2001; 132: 286–292.

57. Crowe S.E., Sestini P., Perdue M.H. Allergic reactions of rat jejuna mucosa. Iontransport responses to luminal antigen and inflammatory mediators.Gastroenterology, 1990; 99: 74–82.

58. Curet S., Rouaud O., Boillereaux L. Microwave tempering and heating in a single-mode cavity: Numerical and experimental investigations. Chemical Engineering andProcessing, 2008; 47: 1656–1665.

59. Dalgleish D. G., Senaratne V., & Francois S. Interactions between α- lactalbuminand β-lactoglobulin in the early stages of heat denaturation. Journal of Agriculturaland Food Chemistry, 1997; 45: 3459−3464.

60. Davies D.R., and Cohen, G.H. Interactions of protein antigens with antibodies. Proc.Natl. Acad. Sci., 1996; USA 93: 7–12.

61. Davis P. J., Smales C. M., & James D. C. How can thermal processing modify theantigenicity of proteins? Allergy, 2001; 56: 56-60.

62. De Boissieu D. , Dupont C. Sublingual immunotherapy for cow's milk protein allergy:a preliminary report. Allergy, October 2006; 61 (10): 1238–1239.

63. De Boissieu D., Ammar F., Dupont C. L’allergie aux hydrolysats de protéines. RevueFrançaise d’Allergologie, 2000 ; 40 : 98-104.

64. De Boissieu D., Matarazzo P., Dupont C. Allergy to extensively hydrolyzed cow’smilk proteins in infants: identification and treatment with an amino acid-basedformula. Journal of Pediatrics, 1997; 131, 744-747.


194194194

65. De Meulenaer B. Les allergènes alimentaires: “to be or not to be” - aspectstechnologiques lies aux propriétés allergéniques et à la détection. Symposium “Lesallergies – maladies du future?” Institut Danone, 2006.

66. De Pomerai D. I., Smith B., Dawe A., North K., Smith T., Archer D. B., Duce I. R.,Jones D., & Candido E. P. Microwave radiation can alter protein conformationwithout bulk heating. FEBS Letters, 2003; 543: 93–97.

67. De Wit J.N., Thermal behaviour of bovine -lactoglobulin at temperatures up to 150°C. A review. Trends in Food Science & Technology, 2009; 20: 27-34.

68. Dean T.P., Adler B.R., Ruge F., Warner J.O. In vitro allergenicity of cow’s milksubstitutes. Clinical Experimnetal Allergy, 1993; 23: 205-10.

69. Di Prisco M.C., Hagel I., Lynch N.R., Jimenez J.C., Rojas R., Gil M., et al. Associationbetween giardiasis and allergy. Annals Allergy Asthma Immunology, 1998; 81:261-5.

70. Docena G.H., Fernandez R., Chirdo F.G., Fossati C.A. Identification of casein as themajor allergenic and antigenic protein of cow’s milk. Allergy, 1996; 51:412-6.

71. Dreborg S. Diagnosis of food allergy: tests in vivo and in vitro. Pediatric Allergy andImmunology, 2001; 12:24-30.

72. Dreyfuss M.S., Chipley, J.R. Comparison of effects of sublethal microwave radiationand conventional heating on the metabolic activity of Staphylococcus aureus.Applied Environnement Microbiology, 1980; 39: 13.

73. Dubois-Delval V. Préparation de peptides antimicrobiens à partie de l’hydrolyse dedeux protéines : l’alpha lactalbumine et l’hémoglobine bovine. Biochimie. Universitédes Sciences et technologies de Lille, 2006, 242.

74. Dufosse L., De La Broise D., Guerard F. Fish protein hydrolysates as nitrogensources for microbial growth and metabolite production. Recent ResearchDevelopments in Microbiology, 1997; 1: 365-381.

75. Dufour E., Hervé G., & Haertle T. Hydrolysis of -lactoglobulin by thermolysin andtrypsin under high hydrostatic pressure. Biopolymers, 1995; 35: 475–483.

76. Durand P. Étude de la fraction azotée soluble de l'anchois salé au cours de lamaturation. Revue des Travaux de l'Institut des Pêches Maritimes, 1982 ; 45 (4):271-281.

77. Duteau G., Rancé F., Micheau P., Juchet A., Rittié J.L., Brémont F. Prévention del’allergie : Manipulations diététiques pendant la grossesse et la première année devie Revue Française d’Allergologie, 1999 ; 39 : 4.

78. Edlmayr J., Niespodziana K., Linhart B., Focke-Tejkl M., Westritschnig K.,Scheiblhofer S., Stoecklinger A., Kneidinger M., Valent P., Campana R., ThalhamerJ., Popow-Kraupp T., Valenta R. A combination vaccine for allergy and rhinovirusinfections based on rhinovirus-derived surface protein VP1 and a non allergenic


195195195

peptide of the major timothy grass pollen allergen Phl p 1. Journal of Immunology,2009; 182:6298-306.

79. Ehn B.-M., Ekstrand B., Bengtsson U., and Ahlstedt S. Modification of IgE Bindingduring Heat Processing of the Cow's Milk Allergen β-Lactoglobulin. Journal ofAgricultural Food and Chemistry, 2004; 52 (5): 1398–1403.

80. Eiwegger T., Rigby N., Mondoulet L., Bernard H., Krauth M-T., Boehm A., DehlinkE., Valent P., Wal J.M., Mills E.N., Szépfalusi Z. Gastro-duodenal digestion productsof the major allergen Ara h1 retain an allergenic potential. Clinical and ExperimentalAllergy, 2006; 36:1281–8.

81. Ekins R., Chu F., Biggart E. Multispot, multianalyte, immunoassay. Annals BiologieClinique (Paris), 1990; 48:655–66.

82. Ekins R.P. Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays. ClinicalChemestry, 1998; 44:2015–30.

83. El-Agamy E. The challenge of cow milk protein allergy. Small Ruminants Research,2007; 68(1–2):64–72.

84. El-Ghaish S., Rabesona H., Choiset Y., Sitohy M., Haertlé T. and Chobert J-M.Proteolysis by Lactobacillus fermentum IFO3956 isolated from Egyptian milkproducts decreases immuno-reactivity of αS1-casein. Journal of Dairy Research,2011; 78: 203-21.

85. Ellis M.H., Short J.A., Heiner D.C. Anaphylaxis after ingestion of a recentlyintroduced hydrolyzed whey protein formula. Journal of Pediatrics, 1991; 118: 74-7.

86. Emerson L.L., Tripp S.R., Baird B.C., Layfield L.J., Rohr L.R. A comparison ofimmunohistochemical stain quality in conventional and rapid microwave processedtissues. American Journal of Clinical Pathology, 2006; 125:176–183.

87. Ena J. M., Van Beresteijn E. C. H., Robben P. M. and Schmidt D. G. Whey proteinantigenicity reduction by fungal proteinases and a pepsin/pancreatic combination.Journal of Food Science, 1995; 60:104–116.

88. Farrell Jr. H.M., Jimenez-Flores R., Bleck G. T., Brown E. M., Butler J. E., Creamer L.K., Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., and Swaisgood H. E. Nomenclatureof the Proteins of Cows’ Milk—Sixth Revision. Journal of Dairy Science., 2004;87:1641–1674.

89. Fasman, G.D. Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules,Plenum Press, (Ed., 1996). New-York, U.S.A.: 738.

90. Fedorov A.A., Ball T., Mohoney N.M., Valenta R., Almo S.C. Structure, 5 ,1997; 33.

91. Findlay J.B.C., Brew K. The complete amino-acid sequence of human α-lactalbumin.European Journal of Biochemistry, 1972; 27: 65-86.


196196196

92. Fiocchi A., Brozek, J., Schünemann H., Bahna L., Von Berg A., Beyer, K., Bozzola M.,Bradshe J., Compalati E., Ebisawa M., Guzman M.A., Li, H., Heine R.G., Keith P.,Lack G., Landi M., Martelli A., Rancé F., Sampson H., Stein A., Terracciano L.,Vieths S. World Allergy Organization (WAO) Diagnosis and Rationale for Actionagainst Cow's Milk Allergy (DRACMA) Guidelines. World Allergy OrganizationJournal: April 2010, 3 (4): 57-161.

93. Fiocchi A., Restani P., Leo G., Martelli A., Bouygue G.R., Terraciano L., Ballabio C.,Valsasina R. Clinical tolerance to lactose in children with cow’s milk allergy.Pediatrics, 2003; 112: 359-362.

94. Fiocchi A., Schunemann H., Brozek J., Restani P., Beyer K., Troncone R., Martelli A.,Terracciano L., Bahna S.L., Rancé F., Ebisawa M., Heine R.G., Assa'ad A., SampsonH., Verduci E., Bouygue G.R., Baena-Cagnani C., Canonica W., Lockey R.F. Diagnosisand rationale for action against cow’s milk allergy (DRACMA): a summary report. JAllergy and Clinical Immunology, 2010; 126:1119–28.

95. Focke M., Linhart B., Hartl A., Wiedermann U., Sperr W.R., Valent P., Thalhamer J.,Kraft D., Valenta R. Nonanaphylactic surface-exposed peptides of the major birchpollen allergen, Bet v 1, for preventive vaccination. Clinical and ExperimentalAllergy, 2004; 34:1525-33.

96. Fred D. Finkelman J., Boyce A., Finkelman F., William T. Vercelli S., and D.Anaphylaxis: Lessons from mouse models. Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2007; 120:506-15.

97. Frémont S., Kanny G., Biéber S., Nicolas J.P., Moneret-Vautrin D.A. Identificationd’un allergène masqué, l’alpha-lactalbumine, dans une farine de céréales infantilegarantie sans protéines de lait. Annales de Médecine-Nancy, 1996 ; 35 : 177-80.

98. Fritsché R. Animal models in food allergy: assessment of allergenicity andpreventive activity of infant formulas. Toxicology Letters, 2003; 140: 303-309.

99. Furlong T.J., De Simone J., Sicherer S.H. Peanut and tree nut allergic reactions inrestaurants and other food establishments. Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2001; 108: 867-870.

100. Galema, S.A. Microwave chemistry. Chemical Society Review, 1997; 26: 233–238.

101. Galli S.J. Kalesnikoff J., Grimbaldeston M.A., Piliponsky A.M., Williams C.M., TsaiM. Mast cells as ‘‘tunable’’ effector and immunoregulatory cells: recent advances.Annuals Review of Immunology, 2005; 23: 749–786.

102. Galli S.J. Mast cells and basophils. Current Opinion in Hematology, 2000; 7:32–39.

103. Garcia-Ara C., Boyano-Martinez T., Az-Pena J.M., Martin-Munoz F., Reche-FrutosM., Martin-Esteban M. Specific IgE levels in the diagnosis of immediatehypersensitivity to cows' milk protein in the infant. Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2001; 107:185-190.


197197197

104. Garcia-Ara C., Boyano-Martinez T., Diaz-Pena J.M., Martin-Munoz F., Reche-FrutosM., Martin-Esteban M. Specific IgE levels in the diagnosis of immediatehypersensitivity to cows’ milk protein in the infant. Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2001; 107: 185-90.

105. Gaudin J.-C., Rabesona H., Choiset Y., Yeretssian G., Chobert J.-M., Sakanyan V.,Drouet M. and Haertlé T. Assessment of the immunoglobulin E-mediated immuneresponse to milk-specific proteins in allergic patients using microarrays. Clinical andExperimental Allergy, 2008; 38, 686–693.

106. Gezimati J., Creamer L. K., & Singh H. Heat-induced interactions and gelation ofmixtures of β-lactoglobulin and α-lactalbumin. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 1997; 45: 1130−1136.

107. Ghochikyan A., Karaivanova I., Lecocq M., et al. Arginine operator binding byheterologous and chimeric ArgR repressors from Escherichia coli and Bacillusstearothermophilus. Journal of Bacteriology, 2002; 184: 6602-6614.

108. Gifford J.L., Hunter H.N. and Vogel H.J. Lactoferricin: a lactoferrin-derived peptidewith antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties. Cellular andMolecular Life Science, 2005; 62 : 2588–2598

109. Gjesing B., Osterballe O., Schwartz B., Wahn U., Lowenstein H. Allergen- specificIgE antibodies against antigenic components in cow milk and milk substitutes.Allergy, 1986; 41: 51-56.

110. Goldman A.S., Anderson Jr D.W., Sellers W.A., Saperstein S., Kniker W.T., HalpernS.R.,. Milk allergy, Oral challenge with milk and isolated milk proteins in allergicchildren. Pediatrics, 1963a; 32: 425-443.

111. Goldman A.S., Sellars W.A., Halpern S.R., Anderson Jr D.W., Furlow T.E., JohnsonJr C.H. Milk allergy; II Skin testing of allergic and normal children with purified milkproteins. Pediatrics, 1963b; 32: 572-579.

112. Guarino A., Albano F., Ashkenazi S., Gendrel D., Hoekstra J. H., Shamir R., andSzajewska H. European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology, andNutrition/European Society for Paediatric Infectious Diseases Evidence-BasedGuidelines for the Management of Acute Gastroenteritis in Children in Europe:Executive Summary. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2008;46:619–621

113. Gurish M.F., Austen K.F. The diverse roles of mast cells. Journal of ExperimentalMedecine 2001; 194: 1-5.

114. Haddad Z.H., Kalra V., Verma S. IgE antibodies to peptic and peptic- tryptic digestsof β- lactoglobulin: significance in food hypersensitivity. Annals of Allergy, 1979; 42,368-371.


198198198

115. Hafajee Z.A., Leong A.S.Ultra-rapid microwave-stimulated tissue processing with amodified protocol incorporating microwave fixation. Pathology, 2004; 36:325–329.

116. Halken S., Hansen K.S., Jacobsen H.P. Estmann A., Faelling A.E., Hansen L.G., KierS.R., Havea, P., Singh, H., & Creamer, L. K. Characterization of heat-inducedaggregates of β-lactoglobulin, α-lactalbumin and bovine serum albumin in a wheyprotein concentrate environment. Journal of Dairy Research, 2001; 68: 483−497.

117. Heinzmann A., Blattmann S., Spuergin P., Forster J., Deichmann K.A. TheRecognition Pattern of Sequential B Cell Epitopes of Beta–Lactoglobulin Does NotVary with the Clinical Manifestations of Cow’s Milk Allergy. International Archives ofAllergy and Immunology, 1999; 120 (4): 280-286.

118. Heyman M. Antigènes alimentaires, barrière intestinale et immunité muqueuse.Cahiers de nutrition et de diététique, 2010 ; 45 : 65—71.

119. Heyman M. Gut barrier dysfunction in food allergy. European Journal ofGastroenterology and Hepatology, 2005; 17:1279—85.

120. Heyman M., Grasset E., Ducroc R., Desjeux J.F. Antigen absorption by the jejunalepithelium of children with cow’s milk allergy. Pediatrics Research, 1988; 24:197—202.

121. Heyman M., Stoker T.W., Rudolph C.D., Frick O.L. Hypersensitivity reaction in aninfant fed hydrolyzed lactalbumin contained in a semielemental formula. Journal ofPediatric and Gastroenterology Nutrition, 1990; 10: 253-6.

122. Hide D.W., Matthews S., Tariq S. Arshad S.H. Allergen avoidance in infancy andallergy at 4 years of age. Allergy, 1996; 51:89-93.

123. Hill D.J., Cameron D.J.S, Francis D.E.M, Gonzalez-Andaya A.M, Hosking C.Challenge confirmation of late-onset reactions to extensively hydrolyzed formulas ininfants with multiple food protein intolerance. Journal Allergy and CliniclaImmunology, 1995; 96: 386-94.

124. Hochwallner H., Schulmeister U., Swoboda I., Focke-Tejkl M., Civaj V., Balic N.,Nystrand M., Harlin A., Thalhamer J., Scheiblhofer S., Keller W., Pavkov T., ZafredD., Niggemann B., Quirce S., Mari A., Pauli G., Ebner C.,. Papadopoulos N.G, HerzU., van Tol E.A.F., Valenta R. and Spitzauer S. Visualization of clustered IgE epitopeson -lactalbumin. Journal Allergy and Clinical Immunology, June 2010; Vol 125,Issue 6 : 1279-1285.e9.

125. Hong Y. H., & Creamer L. K. Changed protein structures of bovine β- lactoglobulin Band α-lactalbumin as a consequence of heat treatment. International Dairy Journal,2002; 12, 345−359.

126. Höst A. Cow’s milk protein allergy and intolerance in infancy. Some clinicalepidemiological and immunological aspects. Pediatric Allergy and Immunology,1994; 5: 1-36.


199199199

127. Høst A. Frequency of cow's milk allergy in childhood. Annals of Allergy, Asthma &Immunology, December 2002; 89 (6): 33-37.

128. Höst A., Husby S., Gjesing B., Larsen I.N., Lowenstein H. Prospective estimation ofIgG, IgG subclass and IgE antibodies to dietary proteins in infants with cow milkallergy. Levels of antibodies to whole milk protein, BLG and ovalbumin in relation torepeated milk challenge and clinical course of cow milk allergy. Allergy, 1992; 47:218-229.

129. Höst A., Husby S., Hansen L.G. Osterballe O. Bovine beta-lactoglobulin in humanmilk from atopic and non-atopic mothers. Relationship to maternal intake ofhomogenized and unhomogenized milk. Clinical and Experimental Allergy, 1990;20:383-7.

130. Höst A., Koletzko B., Dreborg S., Muraro A., Wahn U., Aggett P. Bresson J.L.,Hernell O., Lafeber H., Michaelsen K.F., Micheli J.L., Rigo J., Weaver L., HeymansH., Strobel S., Vandenplas Y. Dietary products used in infants for treatment andprevention of food allergy. Joint statement of the European Society for paediatricallergoIogy and clinical immunology (ESPACI), Committee on hypoallergenicformulas and the European society for paediatric gastroenterology, hepatology andnutrition (ESPGHAN) Committee on nutrition, Archives of Diseases in Childhood 81,1999; (1) :80-84.

131. Iametti S., Rasmussen P., Frøkiær H., Ferranti P., Addeo F. and Bonomi F.Proteolysis of bovine -lactoglobulin during thermal treatment in subdenaturingconditions highlights some structural features of the temperature-modified proteinand yields fragments with low immunoreactivity. European Journal of Biochemistry,2002; 269: 1362-1372.

132. Iametti S., Cairoli S., De Gregori B., & Bonomi F. Modifications of high orderstructures upon heating of -lactoglobulin: Dependence on the proteinconcentration. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995; 43: 53–58.

133. Izquierdo F., Alli I., Yaylayan V., Gomez R. Microwave-assisted digestion of -lactoglobulin by pronase, -chymotrypsin and pepsin. International Dairy Journal,2007; 17: 465–470.

134. Izquierdo F., Alli I., Gomez R., Ramaswamy H. S., Yaylayan V. Effects of highpressure and microwave on pronase and -chymotrypsin hydrolysis of -lactoglobulin. Food Chemistry, 2005 ; 92 : 713–719.

135. Izquierdo F., Penas E., Baeza M., Gomez R. Effects of combined microwave andenzymatic treatments on the hydrolysis and immunoreactivity of dairy wheyproteins. International Dairy Journal, 2008 ; 18 : 918–922


200200200

136. Jakobsson I., Lindberg T., Benediktsson B., Hansson B.N. Dietary Bovine βlactoglobulin is transferred to Human Milk. Acta Paediatrica, May 1985; 74, (3):342–345.

137. Janeway C. A., and Travers P. Immunobiology: the immune system in health anddisease. 4th ed. Current Biology, 1999. London.

138. Jankiewicz, A., Baltes, W., Bögl, K.W., Dehne L.I, Jamin A., Hoffmann A., HausteinD., Vieths S. Influence of food processing on the immunochemical stability of celeryallergens. Journal of Science Food and Agriculture, 1997; 75: 359–370.

139. Järvinen K.-M., Beyer K., Vila L., Chatchatee P., Busse P.J., and Sampson H.A. B-cellepitopes as a screening instrument for persistent cow’s milk allergy. Journal ofAllergy and Clinical Immunology, 2002; 110:293-7.

140. Järvinen K.M., Chatchatee P., Bardina L., Beyer K., Sampson H. IgE and IgG BindingEpitopes on [alpha]-Lactalbumin and [beta]-Lactoglobulin in cow’s milk allergy.International Archives of Allergy and Immunology; Oct 2001; 126, 2; ResearchLibrary: 111.

141. Jayat D., Gaudin J.-C., Chobert J.-M., Burova T.V., Holt C., McNae L., Sawyer L., andHaertlé T. A Recombinant C121S Mutant of Bovine β-Lactoglobulin Is MoreSusceptible to Peptic Digestion and to Denaturation by Reducing Agents andHeating. Biochemistry, 2004; 43 (20): 6312–6321.

142. Jennie R. L., Elizabeth S. I., Peter S. L., Victoria P., Wendy N. Sandoval. Microwave-assisted proteomics. Mass Spectrometry Reviews, 2007; Volume 26, Issue 5: 657-671.

143. Johansson S.G.O., Hourihane J.O., Bousquet J., Bruijnzeel-Koomen C., Dreborg S.,Haahtela T., M. Kowalski M.L., Mygind N., Ring J., Van Cauwenberge P., Van Hage-Hamsten M, Wuthrich B. Position paper. A revised nomenclature for allergy. AnEAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy, 2001;56: 813-24.

144. Jung T., Lack G., Schauer U. Uberück W., Renz H., Gelfand E.W., Rieger C.H.Decreased frequency of interferon-gamma- and interleukin-2-producing cells inpatients with atopic diseases measured at the single cell level. Journal of Allergy andClinical Immunology, 1995; 96:515–27.

145. Kaddouri H., El-Mecherfi K.-E. , Kheroua O., D Saidi D. Microwave treatmentsmodify antigenicity properties of bovine milk proteins. African Journal ofBiotechnology, 2006; 5 (13): 1267-1270.

146. Kaddouri H., Mimoun S., El-Mecherfi K.E., Chekroun A., Kheroua O., Saidi D.Impact of gamma radiation on antigenic properties of cow's milk beta-lactoglobulin.Journal of Food Protection, 2008 Jun; 71(6):1270-2.


201201201

147. Kaiser C., Reibisch H., Folster-Holst R., Sick H. Cow’s milk protein allergy -results ofskin- prick test with purified milk proteins. Z Emahrungswiss, 1990; 29, 122-128.

148. Kaiserlian D., Lachaux A., Grosjean I., Graber P., Bonnefoy J.Y. Intestinal epithelialcells express the CD23/Fc epsilon RII molecule: enhanced expression inenteropathies. Immunology, 1993; 80:90-5.

149. Kanny G., Moneret-Vautrin D., Flabbee J., Beaudouin E., Morisset M., & TheveninF. Population study of food allergy in France. The Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2001; 108(1): 133-140.

150. Karmee S.K. Application of microwave Irradiation in Biocatalysis. Research Journalof Biotechnology, 2006; 1: 2p.

151. Kawakami T. & Galli S.J. Regulation of mast-cell and basophil function and survivalby IgE. Nature Review of Immunology, 2002; 2, 773–786.

152. Kay A.B. Allergy and allergic diseases. First of two parts. N Engl J Med, 2001; 344:30-7.

153. Keil B. Specificity of Proteolysis. New York, 1992; Springer-Verlag.

154. Kella N. K. D., & Kinsella J. E. Enhanced thermodynamic stability of beta-lactoglobulin at low pH— A possible mechanism. Biochemical Journal, 1988; 255:113–118.

155. Khalil H. and Villota R. Comparative study on injury and recovery ofStaphyloccoccus aureus using microwaves and conventional heating. Journal ofFood Protection, 1988; 51: 181–186.

156. Kheroua, O. Tomé, D. Marcon-Genty, D. Ben Mansour, A. Desjeux, J-F.Anticholeraic effect and intestinal transepithelial passage of native and solubleformaldehyde-modified caseins. Padiatric Research, August 1987; Vol 22 - Issue 2 - :234. European Society for Paediatric Research.

157. Kimber I., Basketter D.A., Butler M., Gamer A., Garrigue J.-L., Gerberick G.F.,Newsome C., Steiling W., Vohr H.-W. Classification of contact allergens accordingto potency: proposals. Food and Chemical Toxicology, 2003 ; 41 : 1799–1809.

158. Kim S. B., Ki K. S., Khan M. A., Lee W. S., Lee H. J., Ahn B. S., and Kim H. S.. Pepticand Tryptic Hydrolysis of Native and Heated Whey Protein to Reduce ItsAntigenicity. Journal of Dairy Science, 2007; 90:4043–4050.

159. Kim T.E., Park S.W., Noh G., Lee S. Comparison of Skin Prick Test results betweencrude allergen extracts from foods and commercial allergen extracts in atopicdermatitis by double-blind placebo-controlled food challenge for milk, egg, andsoybean. Yonsei Medical Journal, 2002; 43:613-620.


202202202

160. Kleber N., Weyrich U., Jörg H. Screening for lactic acid bacteria with potential toreduce antigenic response of β-lactoglobulin in bovine skim milk and sweet whey.Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2006; 7: 233–238

161. Kleinman R.E., Bahna S., Powell G.F., Sampson H.A. Use of infant formulas ininfants with cow milk allergy. A review and recommendations. Pediatric, Allergy andImmunology, 1991; 2: 146-55.

162. Kobayashi H., Ishizuka T., Okayama Y. Human mast cells and basophils as sourcesof cytokines. Clinical and Experimental Allergy, 2000; 30:1205-12.

163. Kontopidis G., Holt C., and Sawyer L. Invited Review: β-Lactoglobulin: BindingProperties, Structure, and Function. Journal of Dairy Science.,2004;87:785–796

164. Kozempel M.F., Annous B.A., Cook R.D., Scullen O.J. et Whiting R.C. Inactivation ofmicroorganisms with microwaves at reduced temperatures. Journal of FoodProtection, 1998; 61 (5): 582-585.

165. Kume, T., & Matsuda, T. Changes in structural and antigenic properties of proteinsby radiation. Radiation Physics and Chemistry, 1995; 46(2): 225-231.

166. Lachaux A., Grosjean I., Bonnefoy J.Y., Kaiserlian D. Soluble serum CD23 levels andCD23 molecule expression on intestinal epithelial cells in infants with reaginic andnon reaginic cow’s milk allergy. European Journal of Pediatrics, 1996; 155:918.

167. Lal S.P., Christopherson R.I., dos Remedios C.G. Antibody arrays: an embryonic butrapidly growing technology. Drug Discovery Today, 2002; 7: 143-9.

168. Langa F., De La Cruz P., Espíldora E., García J.J., Pérez M.C., De La Hoz A. Chemistryunder microwave irradiation. Carbon, 2000; 38: 1641–1646.

169. Lantz C.S., Yamaguchi M., Oettgen H.C., Katona I.M., Miyajima I., Kinet J.P., GalliS.J. IgE regulates mouse basophil FceRI expression in vivo. Journal of Immunology1997, 158, 2517–2521.

170. Lassen K., Lintrup M., Mortensen S., Ibsen K.K., Osterballe O., Høst A. Comparisonof a partially hydrolyzed infant formula with two extensively hydrolyzed formulasfor allergy prevention: a prospective, randomized study. Pediatrics, Allergy andImmunology, 2000; 11:149-161.

171. Law, J., & Haandrikman, A. Proteolytic enzymes of lactic acid bacteria. InternationalDairy Journal, 1997; 7(1): 1-11.

172. Lee J. W., Lee K. Y., Yook H. S., Yook H. S., Lee S. Y., Kim H. Y., Jo C., & Byun M. W.Allergenicity of hen's egg ovomucoid gamma irradiated and heated under differentpH conditions. Journal of Food Protection, 2002; 65(7): 1196-1199.

173. Lehrer S.B., Horner W.E. & Rees G. Why are some proteins allergenic? Implicationsfor Biotechnology. Critical Review in Food Science and Nutrition, 1996; 36: 553–564.


203203203

174. Li H., Sheppard D.N., and Hug M.J. Transepithelial electrical measurements with theUssing chamber. Journal of Cystic Fibrosis, 2004; 3:123–126.

175. Liaset B., Lied E., Espe M. Enzymatic hydrolysis of by-products from the fish-filletingindustry; chemical characterization and nutritional evaluation. Journal of theScience of Food and Agriculture, 2000; 80: 581-589.

176. Lidström P., Tierney J., Wathey B., Westman J. Microwave assisted organicsynthesis—a review, Tetrahedron, 2001; 57: 9225–9283.

177. Lifrani A., Dubarry M., Rautureau M., Aattouri N., Boyaka P., and Tomé D. Peanut-lupine antibody cross-reactivity is not associated to cross-allergenicity in peanut-sensitized mouse strains. International Immunopharmacology, 2005 ; 5 : 1427–1435.

178. Lill J.R., Ingle E.S., Liu P.S., Pham V., Sandoval W.N. Microwave-assistedproteomics. Mass Spectrometry Reviews, September/October 2007; 26 (5): 657–671,

179. Login G., Dvorak A. Application of microwave fixation techniques in pathology toneuroscience studies: a review. Journal of Neuroscience Methods, 1994; 55: 173–182.Loupy (Ed.), Microwaves in Organic Synthesis, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-305: 14-9.

180. Lônnerdal B. Human milk proteins: key components for the biological activity ofhuman milk. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2004; 554: 11-25.

181. Lucas J.M. Microarrays: Molecular allergology and nanotechnology for personalizedmedicine. Allergollogy and Immunopathology, 2010; 38 (3) :153–161

182. Madsen C. Prevalence of food allergy / intolerance in European EnvironnementToxicology and Pharmacology, 1997; 4: 163-7.

183. Mailliart P., Ribadeau Dumas B. Preparation of b-lactoglobulin and lactoglobulin-free proteins from whey retentate by NaCl salting out at low pH. Journal of FoodScience, 1988; 53:743–752.

184. Mäkinen-Kiljunen S., Sorva R.. Bovine ß-lactoglobulin levels in hydrolyzed proteinformulas for infant feeding. Clinical and Experimental Allergy, 1993; 23: 287-91.

185. Malandain H. IgE-reactive carbohydrate epitopes–classification, cross-reactivity,and clinical impact. Allerg Immunol, 2005; 37(4):122–8.

186. Maleki S.J., Kopper R.A., Shin D.S. Park C.W., Compadre C.M., Sampson H., BurksA.W., Bannon G.A. Structure of the major peanut allergen Ara h 1 may protect IgE-binding epitopes from degradation. Journal of Immunology, 2000; 164: 5844–5849.

187. Mallegol J., Van N.G., Lebreton C., Lepelletier Y., Candalh C., Dugave C., Heath J.K.,Raposo G., Cerf-Bensussan N., Heyman M. T84-intestinal epithelial exosomes bear


204204204

MHC class II/peptide complexes potentiating antigen presentation by dendritic cells.Gastroenterology, 2007; 132:1866—76.

188. Manderson G.A., Hardman M.J., Creamer L.K. Effect of heat treatment on theconformation and aggregation of ß-lactogobulins A, B and C, Journal of Agriculturaland Food Chemistry, 1999; 46: 5052-5061.

189. Marcon-Genty D., Tomé D., Dumontier A.M., Kheroua O. et. Desjeux J.F.Permeability of milk protein antigens across the intestinal epithelium in vitro.Reproduction Nutrition and Developpement, 1989; 29: 717-723.

190. Margolis S.A., Jassie L., Kingston H.M. The hydrolysis of proteins by microwaveenergy. Journal of Automatic Chemistry, 1991; 13 (3) : 93-95.

191. Martin-Esteban M., Garcia-Ara M.C., Banqué-Molas M., Boyano- Martinez M.T.,Martin-Munoz F., Diaz-Pena J.M. Evaluation of an extensively hydrolyzed casein-whey protein formula in immediate cow’s milk protein hypersensitivity. J PediatrGastroenterol& Nutrition, 1998; Vol 26, 4 :398-401

192. Masson P.L., Heremans J.F. & Dive, C. An iron-binding protein common to manyexternal secretions. Clinica Chimica Acta, 1966; 14: 735-739.

193. Matsuda T. & Nakamura R. Molecular structure and immunological properties offood allergens. Trends in Food Science, 1993; Tech 4: 289–293.

194. Matsumoto N., Okochi M., Matsushima M., Ogawa A., Takase T., Yoshida Y.,Kawase M., Isobe K., Kawabe T.,and Honda H. Development of peptide arrays fordetection of IgE-binding epitopes in cow's milk allergens. Journal of Bioscience andBioengineering, 2009; 107 (3): 324-330.

195. Maurer M., Theoharides T., Granstein R.D., Bischoff S.C., Bienenstock J., Henz B.,Kovanen P., Piliponsky A.M., Kambe N., Vliagoftis H., Levi-Schaffer F., Metz M.,Miyachi Y., Befus D., Forsythe P., Kitamura Y., Galli S. What is the physiologicalfunction of mast cells? Experimental Dermatolology, 2003; 12: 886–910.

196. Mayer L. Mucosal immunity. Pediatrics, 2003; 111:1595-600.

197. Mayer L. and Shao L. Therapeutic potential of oral tolerance. Nature Reviews ofImmunology,June 2004; 4: 407-419. Doi:10.1038/nri1370

198. Maynard F., Jost R., Wal J.M. Human IgE binding capacity of tryptic peptides frombovine alpha-lactalbumin. International Archives of Allergy and Immunology, 1997;113:478-88.

199. Ménard S., Cerf-Bensussan N. and Heyman M. Multiple facets of intestinalpermeability and epithelial handling of dietary antigens. Mucosal Immunology,2010; 3, 247–259; Doi:10.1038/mi.2010.5.


205205205

200. Menéndez J.A., Arenillas A., Fidalgo B., Fernández Y., Zubizarreta L., Calvo E.G.,Bermúdez J.M. Microwave heating processes involving carbon materials. FuelProcessing Technology, 2010; 91: 1–8.

201. Mercier A., Gauthier S., Fliss I. Immunomodulating effects of whey proteins andtheir enzymatic digests. International Dairy Journal, March 2004; Volume 14 (3):175-183.

202. Meredith R. Engineers Handbook of Industrial Microwave Heating. The Institutionof Electrical Engineers, London, UK, 1998.

203. Merja N., Sirpa J., Marja-Leena L., Hans S., Soili M., Johanna M. Kallio, HakulinenN., Haahtela T., Takkinen K., and Rouvinen J. Molecular Interactions between aRecombinant IgE Antibody and the -Lactoglobulin Allergen. Structure, 2007; 15:1413–1421.

204. Messens W., Van Camp J. & Huyghebaert A. The uses of high pressure to modifythe functionality of food proteins. Trends in Food Science and Technology, 1997; 8:107–111.

205. Metcalfe D.D., Astwood J.D., Townsend R., Sampson H.A., Taylor S.L., Fuchs R.L.Assessment of the allergenic potential of foods derived from genetically engineeredcrop plants. Critical Review in Food Science and Nutrition, 1996; 36(suppl):165–186.

206. Miller K., Meredith C., Selo I., Wal J.M. Allergy to bovine β-lactoglobulin: specificityof immunoglobulin E generated in the Brown Norway rat to tryptic and syntheticpeptides. Clinical & Experimental Allergy, 1999; Vol 29, 12: 1696–1704.

207. Miller K., Meredith C., Selo J. and Wal J.-M. Allergy to bovine -lactoglobulin:specificity of immunoglobulin E generated in the Brown Norway rat to tryptic andsynthetic peptides. Clinical and Experimental Allergy, 1999; Volume 29: 1696-1704.

208. Mondoulet Lucie. Diversité de la réponse IgE dans l’allergie à l’arachide.Caractérisation des allergènes et devenir de leur potentiel allergénique lors destraitements thermiques et des processus digestifs. THESE de doctorat de l’INSA deToulouse, 2005.

209. Moneret-Vautrin D.-A. Épidémiologie de l’allergie alimentaire. Revue Françaised'Allergologie et d'Immunologie Clinique. April 2008, Vol 48, Issue 3 : 171–178.

210. Moneret-Vautrin D.A., Hatahet R., Kanny G. Hydrolysats de protéines : laitshypoallergéniques et formules extensivement hydrolysées. Bases immunoallergologiques de leur utilisation dans la prévention et le traitement de l’allergie aulait. Archives de Pédiatrie, 2001 ; 8 : 1348-57.

211. Moneret-Vautrin D.A., Kanny G. Allergies alimentaires. Revue Pratique, 1996;46:961-7.


206206206

212. Moneret-Vautrin D.A., Kanny G., Sergeant P. La diététique thérapeutique desallergies alimentaires. Revue Française d’Allergologie, 1999; 39: 325-38.

213. Morisset M., Codreanu F., Astier C., Olivie R., Jacquenet S., Bihain B., Moneret-Vautrin D.-A., Kanny G. Improvement of the diagnosis of food allergy withrecombinant allergens. Revue française d’allergologie et d’immunologie clinique,2008 ; 48 : 242–245.

214. Mortuaire G., Marchetti P., Formstecher P., Danzé P-M. Nouvelle approche globaleen protéomique : les biopuces à protéines. Techniques actuelles et applications.Annales de Biologie Clinique, 2004 ; 62 : 139-48.

215. Nakazawa M., Sugi N., Kawaguchi H., Ishii N., Nakajima H., Minami M.Predominance of type 2 cytokine-producing CD41 and CD81 cells in patients withatopic dermatitis. Journal of Allergy and Clinical Immunol, 1997; 99:673–82.

216. Nancey S., Moussata D., Roman S., Andre F., Bouvier M., Claudel S., Descos L.,Andre C., Flourie B. L’allergie alimentaire et digestive chez l’adulte : mise au point.Gastroenterologie Clinique et Biologie, 2005;29:255-265.

217. Negaoui H., Kaddouri H., Kheroua O., Saidi D. A model of intestinal anaphylaxis inwhey sensitized Balb/c mice. American Journal of Immunology, 2009; 5 (2): 56-60.

218. Negrao-Correa D., Adams L.S., Bell R.G. Intestinal transport and catabolism of IgE: amajor blood-independent pathway of IgE dissemination during a Trichinella spiralisinfection of rats. Journal of Immunology, 1996; 157: 4037-44.

219. Nestayy V.J., Dacanay A., Kelly J.F., Ross N.W. Microwave-assisted protein staining;mass spectrometry compatible methods for rapid protein visualization. RapidCommunication in Mass Spectrometry, 2002; 16: 272– 280.

220. Niggemann B., Celik-Bilgili S., Ziegert M., Reibel S., Sommerfeld C., and Wahn U.Specific IgE levels do not indicate persistence or transience of food allergy inchildren with atopic dermatitis. Journal of Investigation in Allergol and ClinicalImmunology, 2004; Vol. 14(2): 98-103.

221. Niggemann B., Binder C., Dupont C., Hadji S., Arvola T. and Isolauri E. “Prospective,controlled, multicenter study on the effect of an amino-acid-based formula ininfants with cow's milk allergy/intolerance and atopic dermatitis.” Pediatry Allergyand Immunol, 2001; 12: 78-82.

222. Niggermann B. Prevalence of adverse reactions to food in Germany- populationsstudy. Allergy, 2004; 59: 338-45.

223. Nini L. Sarda L., Comeau L.C., Boitard E., Dubès J.P., Chahinian H. Lipase-catalysedhydrolysis of short-chain substrates in solution and in emulsion: a kinetic study.Biochemistry Biophysics Acta, 2001; 1534, 34-44.


207207207

224. Nitta K., Sugai S. The evolution of lysozyme and alpha-lactalbumin. EuropeanJournal of Biochemistry, 1989; 182, 111-118.

225. Norgaard A., Skov P.S., Bindslevjensen C. Egg and Milk Allergy in Adults -Comparison between Fresh Foods and Commercial Allergen Extracts in Skin PrickTest and Histamine-Release from Basophils. Clinical and Experimental Allergy, 1992;22:940-947.

226. Ohlsson T., Bengtsson N. Microwave technology and foods. Advances in food andnutrition research, 2001; 43: 65-140.

227. Oldaeus G., Anjou K., Björkstén B., Moran J.R., Kjellman N.I. Extensively andpartially hydrolysed infant formulas for allergy prophylaxis, Archives Dis Child, 1997;77: 4-10.

228. Oldaeus G., Bjorksten B., Emarsson R., Kjellman N.I.M. Antigenicity andallergenicity of cow milk hydrolysates intended for infant feeding. Pediatrics, Allergyand Immunology, 1991; 2, 156-164.

229. Ong L., Henriksson A., Shah N.P. Development of probiotic Cheddar cheesecontaining Lactobacillus acidophilus, Lb. casei, Lb. paracasei and Bifidobacteriumspp. and the influence of these bacteria on proteolytic patterns and production oforganic acid. International Dairy Journal, 2006; 16:446–456.

230. Osborn D.A, Sinn J. Formula’s containing hydrolyzed protein for prevention ofallergy and food intolerance in infants (Cochrane Review). In: The Cochrane Library,Chichester, UK: John Wiley & Sons Ltd, 2004; 1-61.

231. Osterballe M., Bindslev-Jensen C. Threshold levels in food challenge and specific IgEin patients with egg allergy: Is there a relationship? Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2003; 112:196-201.

232. Osterballe O., Weeke B. A new lancet for skin pricks testing. Allergy, 1979; 34:209-212.

233. Paajanen L., Tuure T., Poussa T., Korpela R. No difference in symptoms duringchallenges with homogenized and unhomogenized cow's milk in subjects withsubjective hypersensitivity to homogenized milk. Journal of Dairy Res., 2003; 70:175-179.

234. Papiz M., Sawyer L., Eliopoulos E. E., North A. C. T., Findlay J. B. C., SivaprasadaraoR., Jones, T. A., Newcomer M. E., & Kraulis J. The structure of -lactoglobulin andits similarity to plasma retinol-binding protein. Nature, 1986; 324: 383–385.

235. Patterson M.K. Jr., Bulard R. Microwave fixation of cells in tissue culture. StainTechnology, 1980; 55: 71–75.


208208208

236. Paul-Eugène N., Dugas B., Kolb J.P., Damais C, Braquet P., Paubert-Braquet M. &Rialland J.P. Effets immunomodulateurs et anti-oxydants de la lactoferrine bovinechez l'homme. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, 1993 ; 316, 113-119.

237. Penas E., Prestamo G., & Gomez R. High pressure and the enzymatic hydrolysis ofsoybean whey proteins. Food Chemistry, 2004; 85: 641–648.

238. Penas E., Prestamo G., Baeza M. L., Martınez-Molero M. I., & Gomez R. Effects ofcombined high pressure and enzymatic treatments on the hydrolysis andimmunoreactivity of dairy whey proteins. International Dairy Journal, 2006; 16(8):831–839.

239. Penas E., Prestamo G., Polo F., & Gomez R. Enzymatic proteolysis under highpressure of soybean whey: analysis of peptides and the allergen Gly m1 in thehydrolysates. Food Chemistry, 2006; 99: 569–573.

240. Penas E., Restani P., Ballabio C., Prestamo G., Fiocchi, A., & Gomez, R. Evaluationof the residual antigenicity of dairy whey hydrolysates obtained by combination ofenzymatic hydrolysis and high pressure treatment. Journal of Food Protection,2006b; 69: 1707–1712.

241. Penas E., Restani P., Ballabio, C., Prestamo G., Fiocchi A., & Gomez R. Assessmentof the residual immunoreactivity of soybean whey hydrolysates obtained bycombined enzymatic proteolysis and high pressure. European Food Research andTechnology, 2006a; 222: 286–290.

242. Penas E., Snel H., Floris R., Prestamo G., & Gomez R. High pressure can reduce theantigenicity of bovine whey hydrolysates. International Dairy Journal, 2006; 16,969–975.

243. Perdue M.H., Masson S., Wershil B.K., Galli S.J. Role of mast cells in ion transportabnormalities associated with intestinal anaphylaxis. Correction of the diminishedsecretory response in genetically mast cell-deficient W/Wv mice by bone marrowtransplantation. Journal of Clinical Investigation, 1991; 87: 687–693.

244. Pescuma M., María Hébert E., Rabesona H., Drouet M., Choiset Y., Haertlé T.,Mozzi F., Font de Valdez G., Chobert J.-M. Proteolytic action of Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus CRL 656 reduces antigenic response to bovine β-lactoglobulin. Food Chemistry, July 2011; Volume 127, Issue 2, 15: 487-492.


209209209

245. Petrovsky N. and César Aguilar J. Vaccine adjuvants: Current state and futuretrends. Immunology and Cell Biology, 2004; 82: 488–496; doi:10.1111/j.08189641.2004.01272

246. Pillette C. Tests biologiques dans les maladies allergiques : Intérêts et limites.Louvain Medical, 2005; 124, 9: S245-253.

247. Plebani A., Restani P., Naselli A., Galli C., Meini A. Monoclonal and polyclonalantibodies against casein components of cow milk for evaluation of residualantigenic activity in hypoallergenic infant formulas. Clinical and ExperimentalAllergy, 1997; 27: 949-56.

248. Poms R., Klein C., Anklam E. Methods for allergen analysis in food: a review. FoodAdditives Contamination: Part A, 2004; 21:1–31.

249. Poms R. E., & Anklam, E. Effects of chemical, physical, and technological processeson the nature of food allergens. Journal of AOAC International, 2004; 87(6): 1466-1474.

250. Porcelli M., Cacciapuoti G., Fusco S., Massa R., d'Ambrosio G., Bertoldo C., De RosaM., Zappia V. Non-thermal effects of microwaves on proteins: thermophilicenzymes as model system. FEBS Letters, 1997 ; 402 : 102-106

251. Powell D.W. Barrier functions of epithelia. American Journal of Physiology, 1981;241: G275—88.

252. Pramanik N., Urooj A., Yao H., Yan-Hui L., Peter L., Bartner, Patricia C., Weber andAjay K. Bose. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by massspectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Science,2002; 11:2676 2687.

253. Préstamo G., Fontecha J. High pressure treatment on the tofu fatty acids andacylglycerols content. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2007;Volume 8, Issue 2: 188-191.

254. Préstamo G., Fontecha J. High pressure treatment on the tofu fatty acids andacylglycerols content. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2007; 8:188–191.

255. Ragno V., Giampietro P.G., Bruno G., Businco L. Allergenicity of milk proteinhydrolyzate formulae in children with cow’s milk allergy. European Journal ofPediatric, 1993; 152: 760-2.

256. Rancé F., Dutaub G. Actualités sur l’exploration et la prise en charge de l’allergieaux protéines du lait de vache (APLV). Revue française d’allergologie, 2009; 49:S28–S33.

257. Rancé F. et Dutau G. Labial food challenge in children with food allergy. Pediatric.Allergy and Immunology, 1997, 8: 41-44.


210210210

258. Raposo G., Nijman H.W., Stoorvogel W., Liejendekker R., Harding C.V., Melief C.J.,Geuze H.J. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal ofExperimental Medecine, 1996; 183:1161—72.

259. Restani P., Ballabio C., Di Lorenzo C., Tripodi S. & Fiocchi A. Molecular aspects ofmilk allergens and their role in clinical Events. Annals and Bio-annals Chemistry,2009; 395:47–56.

260. Reynes M., Tabuna H. Le palmier dattier dans l'agriculture d'oasis des paysméditerranéens. In : Ferry Michel (ed.), Greiner Didier (ed.), Bedrani S. (ed.),Tonneau Jean-Philippe (ed.), 1996 Paris : CIHEAM : 213.

261. Robinson D.S., Hamid Q., Ying S. et al. Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. National English Journal of Medicine,1992; 326:298–304.

262. Roy I., Mondal K., & Gupta M. N. Accelerating enzymatic hydrolysis of chitin bymicrowave pretreatment. Biotechnology Progress, 2003; 19: 1648–1653.

263. Saarinen K.M., Juntunen-Backman K., Järvenpää A.L., Kuitunen P., Lope L.,Renlund M., Siivola M., Savilahti E. Supplementary feeding in maternity hospitalsand the risk of cow’s milk allergy: a prospective study of 6 209 infants. Journal ofAllergy and Clinical Immunology, 1999; 104: 457-61.

264. Saarinen K.M., Pelkonen A., Ma kela M.J., and Savilahti E. Clinical course andprognosis of cow’s milk allergy are dependent on milk-specific IgE status. Journal ofAllergy and Clinical Immunology, 2005; 116:869-75.

265. Saidi D., Heyman M., Kheroua O., Boudraa G., Bylsma P., Kerroucha R., ChekrounA., Maragi J.-A., Touhami M., Desjeux J.-F. Jejunal response to β-lactoglobulin ininfants with cow's milk allergy : Réponse intestinale à la β-lactoglobuline dansl'allergie aux protéines du lait de vache chez l'enfant. Comptes rendus del'Académie des sciences. Série 3, Sciences de la vie, 1995 ; Vol 318, 6 : 683-689.

266. Sakanyan V. Puces à protéines: nouvelle approche du diagnostic des maladiesinfectieuses. Antibiotiques, 2004; 6:185–92.

267. Sakanyan V., Arnaud M.-C. Protein arrays and perspectives of medical applications.ITBM-RBM, November–December 2007; Vol 28, 5–6 : Pages 187–193.

268. Salvatorelli G., Marchetti M.G., Betti V., Rosaspina S. et Finzi G. Comparison of theeffects of microwave radiation and conventional heating on Bacillus subtilis spores.Microbios, 1996; 87: 169-174.

269. Sampson H.A. Update on food allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology,2004; 113:805-819.


211211211

270. Sampson H.A., Ho D.G. Relationship between food-specific IgE concentrations andthe risk of positive food challenges in children and adolescents. Journal of Allergyand Clinical Immunology, 1997, 100:444-451.

271. Sampson H.A., James J.M., Bernhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid-derivedinfant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics, 1992; 90(3): 463-5.

272. Sampson H. A. Update on food allergy. The Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2004; 113(5): 805-819.

273. Sathe S. K., & Sharma G. M. Effects of food processing on food allergens. MolecularNutrition & Food Research, 2009; 53(8), 970-978.

274. Sawyer, L. β-Lactoglobulin. In Advanced Dairy Chemistry, 2003; 3rd ed. P. F. Fox andP. Mc Sweeney, eds. Kluwer, Amsterdam, the Netherlands. pp 319–386

275. Saxena I., Borah Dilip C., Jadab C. Three component condensations catalyzed byiodine–alumina for the synthesis of substituted 3, 4-dihydropyrimidin-2(1H)-onesunder microwave irradiation and solvent-free conditions. Tetrahedron Letters, 2005Volume 46; Issue 7: 1159-1160.

276. Schade R.P., Van Ieperen-Van Dijk A.G., Van Reijsen F.C. et al. Differences inantigen-specific T-cell responses between infants with atopic dermatitis with andwithout cow’s milk allergy: relevance of TH2 cytokines. Journal of Allergy andClinical Immunology, 2000; 106:1155–62.

277. Schäfer T., Böhler S., Ruhdorfer S., Weigl L., Wessner D., Heinrich J., Filipiak B.,Wichmann H-E., Ring J. Epidemiology of food allergy/food intolerance in adults:associations with other manifestations of atopy. Allergy, 2001; 56: 1172-9.

278. Schagger H., Aquila H., AND Vonjagow G. Coomassie Blue-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Direct Visualization of Polypeptides duringElectrophoresis. Analytical Biochemistry, 1988; 173, 20: 1-205.

279. Schokker E. P., Singh H., & Creamer L. K. Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin A and B with α-lactalbumin. International Dairy Journal, 2000; 10:843−853.

280. Schwan H.P. Electrode polarization impedance and measurements in biologicalmaterials. Annual New York Academy of Science, 1968; 148(1):191–209.

281. Schwartz H.R., Amonette M.S. Cow milk protein hydrolyzate infant formulas notalways “hypoallergenic”. Journal of Pediatrics, 1991; 119: 839.

282. Schwartz H.R., Nerurkar L.S., Spies J.R., Scanlon R.T., Bellanti J.A. Milkhypersensitivity: Rast studies using new antigens generated by pepsin hydrolysis ofbeta-lactoglobulin. Annals of Allergy, 1980; 45: 242-5.

283. Scott R.B., Diamant S.C., Gall D.G. Motility effects of intestinal anaphylaxis in therat. American Journal of Gastro-intestin and Liver Physiology, 1988; 255: 505–511.


212212212

284. Selo I., Clement G., Bernard H., Chatel J.M., Cremion C., Peltre G., Wal J-M. Allergyto bovine β-lactoglobulin: specificity of human IgE to tryptic peptides. Clinical andExperimental Allergy, 1999; 29: 1055-1063.

285. Selo I., Negroni L., Creminon C., Yvon M., Peltre G., Wal J.M. Allergy to bovine β-lactoglobulin: specificity of human IgE using cyanogen bromide- derived peptides.International Archive of Allergy and Immunology, 1998; 117: 20-28.

286. Shreffler W.G., Lencer D.A., Bardina L., Sampson HA. IgE and IgG4 epitope mappingby microarray immunoassay reveals the diversity of immune response to the peanutallergen, Ara h 2. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2005; 116(4):893–9.

287. Sicherer S.H., and Sampson H.A. Food hypersensitivity and atopic dermatitis:Pathophysiology, epidemiology, diagnosis, and management. Journal of Allergy andClinical Immunology, April 1999; 103 (4): 559–562

288. Sicherer S.H., Sampson H.A. Food allergy. The Journal of Allergy and ClinicalImmunology, February 2010; 125 (2) : 116-125.

289. Somma A., Ferranti P., Addeo F., Mauriello R., Chianese L. Peptidomic approachbased on combined capillary isoelectric focusing and mass spectrometry for thecharacterization of the plasmin primary products from bovine and water buffalo β-casein. Journal of Chromatography A, 2008; 1192:294–300

290. Sotto D., Tounian P., Baudon J.J., Pauliat S., Challier P., Fontaine J.L., et al. Allergieaux hydrolysats de protéines de lait : à propos de huit cas. Archive of Pediatrics,1999; 12: 1279-85.

291. Souplet V., Desmet R., Melnyk O. Imaging of protein layers with an opticalmicroscope for the characterization of peptide microarrays. Journal of PeptideScience, July 2007; 13, (7): 451–457.

292. Spuergin P., Mueller H., Walter M., Schiltz E., Forster J. Allergenic epitopes ofbovine alpha Slcasein recognized by human IgE and IgG. Allergy, 1996; 51: 306-312.

293. Stanley G., Schultz and Zalusky R. Ion Transport in Isolated Rabbit Ileum. TheJournal of General Physiology, 1964; Vol. 47, 3: 567-584.

294. Stapelfeldt H., Petersen P. H., Kristiansen K. R., Qvist K. B., & Skibsted L. H. Effectof high hydrostatic pressure on the enzymatic hydrolysis of beta-lactoglobulin B bytrypsin, thermolysin and pepsin. Journal of Dairy Research, 1996; 63: 111–118.

295. Stills H.F. Jr. Polyclonal antibody production. In: Manning PJ, Ringler DH, NewcomerCE, Eds. The Biology of the Laboratory Rabbit, 1994; 2nd ed. San Diego: AcademicPress, Inc. p 435-448.

296. Stoger P., Wüthrich B. Type I allergy to cow milk proteins in adults. A retrospectivestudy of 34 adult milk-and cheese- allergic patients. International Archive in Allergyand Immunol, 1993; 102, 399-407.


213213213

297. Strobel S., Mowat A.M. Immune responses to dietary antigens: oral tolerance.Immunology Today, April 1998; (19) : 173-181.

298. Szepfalusi Z., Nentwich I., Jost E., Gertsmayr M., Ebner C., Frischer T., et al . Cordblood mononuclear cells and milk specific T cell clones are tools to evaluate theresidual immunogenicity of hydrolyzed milk formulas. Journal Allergy and ClinicalImmunology, 1998; 101: 514-20.

299. Taheri-Kafrani A., Gaudin J.-C., Rabesona H., Nioi C., Agarwal D., Drouet M.,Chobert J.-M., Bordbar A.K and HaertleT. Effects of Heating and Glycation of β-Lactoglobulin on Its Recognition by IgE of Sera from Cow Milk Allergy Patients.Journal of Agricultural Food and Chemestry, 2009, 57 (11): 4974–4982.

300. Tajchakavit S., Ramaswamy H.S. and Fustier P. Enhanced destruction of spoilagemicroorganisms in apple juice during continuous flow microwave heating. FoodResearch International, 1998; 31 (10): 713-722.

301. Tarim O., Anderson V.M., Lifschitz F. Fatal anaphylaxis in a very young infantpossibly due to a partially hydrolyzed whey formula. Archive of PediatricsAdolescents Medecine, 1994; 148: 1224-9.

302. Taylor S. Chemistry and detection of food allergens. Food Technology 1992; 46:148-52.

303. Taylor S.L., Hefle S.L. Food Allergies and Other Food Sensitivities. Food Technology,2001; 55: 68-83.

304. Taylor S.L., Lehrer S.B. Principles and characteristics of food allergens. CriticalReview in Food Science and Nutrition, 1996; 36 Suppl: S91-118.

305. Taylor S.L., Lemanski R.F., Bush R.K. & Busse W.W. Food allergens: structure andimmunologic properties. Annals of Allergy, 1987; 59, 93–99.

306. Temel S.G., Minbay F.Z., Kahveci Z., Jennes L. Microwave-assisted antigen retrievaland incubation with cox-2 antibody of archival paraffin-embedded humanoligodendroglioma and astrocytomas. J Neuroscience Methods, 2006; 16: (Epub).

307. Thorn K.S., Christensen H.E., Shigeta R., Huddler D., Shalby L., Lindberg U., ChauaN.H., Schutt C.E. Structure 5,1997; 19.

308. Thostenson E.T., Chou T.W. Microwave processing: fundamentals and applications.Composites Part A, 1999 ; 30 : 1055–1071.

309. Tounian P., Girardet J.P., Pauliat S., Fontaine J.L. Allergie aux hydrolysats deprotéines du lait de vache. Journées Parisiennes de Pédiatrie. Paris : FlammarionMédecine Sciences ; 1997 : 1-7.

310. Tu Y. and Perdue M. H. CD23-mediated transport of IgE/immune complexes acrosshuman intestinal epithelium: role of p38 MAPK. American Journal of PhysiologyGastrointestin Liver Physiology, 2006; September 1; 291 (3): 532-538.


214214214

311. Ussing Hans H., Zerahn K. Active Transport of Sodium as the Source of ElectricCurrent in the Short-circuited Isolated Frog Skin. Acta Physiologica Scandinavica.October 1951 ; 23, (2-3) : 110–127.

312. Valenta R. The future of antigen-specific immunotherapy of allergy. Nature Reviewof Immunology, 2002; 2:446-53.

313. Van Hoeyveld E.M., Escalona-Monge M., de Swert L.F.A., Stevens E.A.M. Allergenicand antigenic activity of peptide fragments in a whey hydrolyzate formula. Clinicaland Experimental Allergy, 1998; 28: 1131-7.

314. Van Niel G., Raposo G., Candalh C., et al. Intestinal epithelial cells secrete exosome-like vesicles. Gastroenterology, 2001; 121: 337—49.

315. Vandenplas Y., Hauser B., van den Borre C., Clybon W.C., Mahler T., Hachemi-Idrissi S., Deraeve L., Malfroot A., Dab I. The longterm effect of a partial wheyhydrolysate formula on the prophylaxis of atopic disease. European Journal ofPediatrics, 1995; 154: 488-94.

316. Vandenplas Y., Hauser B., Van den Borre C., Sacre L., Dab I. Effect of a wheyhydrolysate prophylaxis of atopic disease. Annals of Allergy, 1992; 68(5):419-24.

317. Vandenplas Y., Koletzko S., Isolauri E., Hill D., Orange A.P., Brueton M., Staiano A.,Dupont C. Guidelines for the diagnosis and management of cow’s milk proteinallergy in infants. Archives Dise ases of Child, 2007; 92: 902-8.

318. Vanderhoof J.A., Murray N.D., Kaufman S.S., Mack D.R., Antonson D.L., CorkingM.R., Perry D., Kruger R. Intolerance to protein hydrolyzate formulas: anunderrecognized cause of gastrointestinal symptoms in infants. Journal ofPediatrics, 1997; 131: 741-4.

319. Vieira T., Lopes C., Pereira A.M., Araújo L., Moreira A., Delgado L. Microarraybased IgE detection in poly-sensitized allergic patients with suspected food allergy— an approach in four clinical cases. Allergologia et Immunopathologia, In Press,Corrected Proof, 29 June 2011.

320. Vila L., Beyer K., Jarvinen K.M., Chatchatee P., Bardina L., Sampson H.A. Role ofconformational and linear epitopes in the achievement of tolerance in cow’s milkallergy. Clinical and Experimental Allergy, 2001; 31(10):1599–1606.

321. Von Berg A., Koletzko S., Filipiak-Pittroff B., Laubereau B., Grubl A., WichmannH.E., Bauer C.-P., Reinhardt D., Berdel D. Certain hydrolyzed formulas reduce theincidence of atopic dermatitis but not that of asthma: Three-year results of theGerman Infant Nutritional Intervention Study. Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2007; Vol 119, 3: 718-725.

322. Von Berg A., Koletzko S., Grübl A., Filipiak-Pittroff B., Wichmann H.E., Bauer C.P.,Reinhardt D., Berdel D., German Infant Nutritional Intervention Study Group. The


215215215

effect of hydrolyzed cow’s milk formula for allergy prevention in the first year oflife: the German Infant Nutritional Intervention Study, a randomized double-blindtrial. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2003; 111: 533-40.

323. Wahn U.,Wahl R., Rugo E. Comparison of the residual allergenic activity of sixdifferent hydrolyzed protein formulas. Journal of Pediatrics, 1992; 121 (Suppl): 80-4.

324. WaI J.-M. Cow’s milk allergens. Allergy, 1998; 53: 1013-1022.

325. Wal J.-M. Allergénicité des protéines laitières. Innovations agronomiques, 2011; 13:25-43.

326. Wal J.-M. Bernard H., Creminon C., Hamberger C., David B., Peltre G. Cow’s milkallergy: the the humoral immune response to eight purified allergens. Advances inExperimental Medecine Biology, 1995b; 371B: 879-881.

327. Wal J.-M. Cow’s milk proteins/Allergens. Annals of Allergy Asthma and Immunology,2002; 89 (Suppl): 3-10.

328. Wal J.-M., Bernard H., Yvon M., Peltre G., David B., Creminon C., Frobert Y., GrassiJ.. Enzyme immunoassay of specific human IgE to purified cow’s milk allergens.Food Agriculture Immunology, 1995a; 7: 175-187.

329. Walker W. A., Isselbacher K. J. and Bloch K. J. Intestinal Uptake of Macromolecules:Effect of Parenteral Immunization. Journal of Immunology, 1973; 111:221-226

330. Wang J., Lin J., Bardina L., Goldis M., Nowak-We A., Shreffler W.G., and SampsonH.A. Correlation of IgE/IgG4 milk epitopes and affinity of milk specific IgE antibodieswith different phenotypes of clinical milk allergy. Journal of Allergy and ClinicalImmunology, 2010; 125:695-702.

331. Wide L., Bennich H., Johansson S.G. Diagnosis of allergy by an in-vitro test forallergen antibodies. Lancet, 1967; 2:1105-1107.

332. Wiese R., Belosludtsev Y., Powdrill T., Thompson P., Hogan M. Simultaneous multianalyte ELISA performed on a microarray platform. Clinical Chemistry, 2001; 47:1451-1457.

333. Wood, J. D. Enteric neuro-immunophysiology and pathophysiology.Gastroenterology, 2004; 127, 635–657.

334. Wood, R. A. The natural history of food allergy. Pediatrics, 2003; 111(6): 1631.

335. Yamada, K., Urisu, A., Kakami, M., Koyama, H., Tokuda, R., Wada, E., Kondo, Y.,Ando, H., Morita, Y., & Torii, S. IgE-binding activity to enzyme-digested ovomucoiddistinguishes between patients with contact urticaria to egg with and without overtsymptoms on ingestion. Allergy, 2000; 55(6), 565-569.


216216216

336. Yamaguchi, M. et al. IgE enhances mouse mast cell FceRI expression in vitro and invivo: evidence for a novel amplification mechanism in IgE-dependent reactions.Journal of Experimental Medicine, 1997; 185: 663–672.

337. Yang P.C., Berin M.C., Yu L.C., Conrad D.H., Perdue M.H. Enhanced intestinaltransepithelial antigen transport in allergic rats is mediated by IgE and CD23(Fcepsilon RII). Journal of Clinical Investigation, 2000; 106: 879-86.

338. Yocum M.W., Khan D.A. Assessment of patients who have experienced anaphylaxis:a 3-year survey. Mayo Clinical Proc, 1998; 69:16-23.

339. Young, E., & Stoneham, M. D. A population study of food intolerance. Lancet, 1994;343(8906): 1127-1130.

340. Zimecki M. & Kruzel M.L. Milk-derived proteins and peptides of potentialtherapeutic and nutritive value. Journal of Experimental Therapeutics and Oncology,2007; 6: 89-106.

341. Zlotorzynski A. The application of microwave radiation to analytical andenvironmental chemistry, Critical Review Anal Chemistry, 1995; 25: 43–76.

342. Zuberbier T., Edenharter G., Worm M., Ehlers I., Reimann S., Hantke T., Roehr C.C.,Bergmann K.E., Niggemann B. Prevalence of adverse reactions to food in Germany -a population study. Allergy, 2004 Mar; 59(3):338-45.


217217217

Publications Internationales

1. KADDOURI Hanane, El-MECHERFI Kamel-Eddine, KHEROUA Omar, SAIDI Djamel.Microwave treatments modify antigenicity properties of bovine milk proteins. AfricanJournal of Biotechnology, July 2006; Vol. 5 (13): 1267-1270.

2. EL-MECHERFI Kamel-Eddine, BENZINEB Khaled, SAIDI Djamel, KHEROUA Omar.Supplementation of olive mill wastes in broiler chicken feeding. EL HACHEMI Ahmed,African Journal of Biotechnology, August 2007; Vol. 6 (15): 1848-1853. ISSN 1684–5315 © 2007 Academic Journals.

3. KADDOURI, H; MIMOUN, S.; El-MECHERFI, K.E.; CHEKROUN, A.; KHEROUA, O.; SAIDI,D. Impact of -Radiation on Antigenic Properties of Cow's Milk β-Lactoglobulin..Journal of Food Protection, June 2008; Volume 71, Number 6:1270-1272(3)International Association for Food Protection.

4. N. Youcef, D Saidi, F. Mezemaze, K.E. El-Mecherfi, H Kaddouri, H. Negaoui, AChekroun, O Kheroua? Cross Reacticity between Dromedary Whey Proteins and IgGanti Bovine -Lactalbumin and anti Bovine -lactoglobulin. American journal ofApplied Sciences, 2009: 6 (8): 11448-1452.

5. Shady El-Ghaish, Aynur Ahmadova, Imen Hadji-Sfaxi, Kamel Eddine El Mecherfi, IngaBazukyan, Yvan Choiset, Hanitra Rabesona, Mahmoud Sitohy, Yuri G. Popov, Akif A.Kuliev, Fernanda Mozzi, Jean-Marc Chobert and Thomas Haertlé. Potential use oflactic acid bacteria for reduction of allergenicity and for longer conservation offermented foods. Trends in Food Science & Technology, September 2011; Volume 22,Issue 9: 509–516http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224411000926.

6. Kamel Eddine El Mecherfi , Djamel Saidi , Omar Kheroua , Ghazalia Boudraa ,Mahmoud Touhami , Olivier Rouaud , Sébastien Curet , Yvan Choiset , HanitraRabesona ,Jean-Marc Chobert , Thomas Haertle. Combined microwave and enzymatictreatments for -lactoglobulin and bovine whey proteins and their effect on the IgEimmunoreactivity. European Food Research and Technology, 2011; Volume 233,Number 5, 859-867 DOI 10.1007/s00217-011-1581-y.


218218218

Communications Internationales

1. Negaoui H, Kaddouri H, El Mecherfi K.E., Youcef N, Khéroua O, Saïdi D. Lerayonnement micro-onde modifie l’antigénicité/allergénicité des protéines du lait devache. 5ème Rencontre Scientifique de l’Association Tunisienne des sciences de laNutrition, 9-10-11 Avril 2010, Nabeul, Tunisie.

2. El Mecherfi Kamel eddine. Exploration biologique de l’allergie alimentaire.Symposium de l’allergie aux protéines du lait de vache. Organisé par les laboratoiresDanone-Milupa/Clinique Amilcar cabral CHU d’Oran et le laboratoire de Physiologiede la Nutrition et de sécurité alimentaire. Oran Hôtel Eden, 27 Février 2010.

3. El Mecherfi K.E, Salah S, Kheroua O, Saidi D. Immunoréactivité de la β-Lactoglobulineaprès hydrolyse trypsique ou chymotrypsique sous influence du rayonnement desmicro-ondes. Deuxième Congrès International de Nutrition 17 et 18 octobre 2008,Tunisie.http://www.astsn.com/downloads/Livre%20du%20congr%C3%83%C2%A8s%202008.pdf

4. Kamel-Eddine EL-MECHERFI, Ghazalia BOUDRAA, Mahmoud TOUHAMI, YvanCHOISET, Hanitra RABESONA, Omar KHEROUA, Thomas HAERTLE, Djamel SAIDI.Intérêt des biopuces à allergènes DANS la détermination du profil de sensibilisationd’enfants allergiques aux protéines du lait de vache (APLV) par dosage d’IgEspecifiques. Congrès international de Nutrition, 22 et 23 mai 2011 Oran, Algérie.

5. EL Mecherfi kamel eddine, Haddi Abir, Kazi Tani Amila, Choiset Yvan, RabesonaHanitra, heartle thomas, Kheroua Omar, Saidi Djamel. effets des micro-ondescombines a l’hydrolyse pepsique de la -lactoglobuline sur son immunoreactivitecontre les IgE humaines. Congrès International de Nutrition, 22 et 23 mai 2011 Oran,Algérie.

6. Kamel Eddine El Mecherfi, Djamel Saidi, Omar Kheroua, Ghazalia Boudraa, MahmoudTouhami, Olivier Rouaud, Sébastien Curet, Yvan Choiset, Hanitra Rabesona, Jean-Marc Chobert, Thomas Haertlé. Combined microwave and enzymatic treatments ofß-lactoglobulin and bovine whey proteins and their effect on the IgEimmunoreactivity. IMPI’s 45th Annual Microwave Power Symposium (IMPI 45), June8–10, 2011 Doubletree Hotel, New Orleans New Orleans, Louisiana, USA. ISSN: 1070-0129.

7. G. BOUDRAA, KE. EL MECHERFI, M. NACEUR, W. HACHELAF, M. BESSAHRAOUI, D.SAIDI, O. KHEROUA, T. HAERTLE, M. TOUHAMI. Évolution des IgE spécifiques dansl’allergie aux protéines du lait de vache. Congrès de la société française de pédiatrie.Marseille, du 11 au 14 Mai 2011.

8. Elmecherfi Kamel Eddine. Quel intérêt clinique dans l’étude des IgE spécifiques chezdes enfants allergiques aux protéines du lait de vache. Symposium sur l’allergie auxprotéines du lait de vache. Organisé par service de pédiatrie « C », Clinique AmilcarCabral CHU d’Oran & les laboratoires DANONE. Oran Hôtel Eden. 10 Novembre2011.


219219219

9. Kamel Eddine ELMECHERFI. Participation à la SAICO : Société d’Allergologie etd’Immunologie Clinique de l’Ouest. ANGERS, 27 Mai 2010.

these de doctorat - univ-oran1.dzque psychologique. je remercie tous les autres membres de cette...

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