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UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Biologique

Mémoire

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Science de la Nature et de la Vie

Filière : Biologie

Spécialité : Biotechnologie végétale

Présente par : BOUTALBI SAFA

Thème

Soutenu publiquement

Le : 08/06/2014

Devant le jury :

Présidente Mme. BAYOUCEFZ. M.A.A U.K.M. Ouargla

Promotrice Mme. OULD ELHADJ-KHELIL A. Pr U.K.M. Ouargla

CO-Promoteur Mr. SEGGAI A. M.A. A U.KI.M Ouargla

Examinatrice Mme. ANNOU G. M.A.A U.K.M Ouargla

Examinatrice Mlle. SALHI N M.C.A U.K.M Ouargla

Année universitaire : 2013/2014

Criblage chimique et l'activité biologique de spiruline (Arthrospira platensis).

Avant propos

Avant tout, je remercie ALLAH, sans Lui ce manuscrit n'aurait pu exister.

Je tiens particulièrement à remercier mon encadreur Mme OULD EL HADJ

KHELIL AMINTA Professeur de l'université d'Ouargla, pour ses conseils, ses commentaires

et sa bienveillance. Qu’elle soit assurée de ma profonde gratitude pour m’avoir guidée et

aidée tout au long de la réalisation de ce mémoire.

Je remercié les plus vifs vont également à ma Co-promoteur Mr SEGGAI.ALI

M.A.A à l'Université de Ouargla pour leur aide et orientation les conseils qu’elle m’a

prodigués, sa grande expérience en production de spiruline

J’exprime ma gratitude particulièrement Mr BELGUIDOUM Mahdi, Doctorant en

chimie appliquée spécialité phytochimie pour leur disponibilité durant la réalisation de ce

travail. Je vous remercie pour vos discussions scientifiques et techniques enrichissantes que

vous m’avez apporté au jour le jour, qui ont fortement contribué au bon déroulement de ce

mémoire et m’ont permis d’acquérir des nouvelles connaissances à l’échelle du laboratoire

J’exprime mes vifs remerciements à Mme BAYOUCEF ZAHIA Maitre conférence

A, de l'université de Ouargla d’avoir de m’avoir fait l’honneur de présider ce jury.

Je remercie vivement Melle SALHI NESRIN Maitre de conférence A à l’université

de Ouargla qui m’a fait l’honneur qui m’a fait le plaisir d’examiner ce modeste travail.

Je remercie sincèrement Mme ANNOU GHANIA Maitre assistante classe A à

l’université de Ouargla qui m’a fait l’honneur qui m’a fait le plaisir d’examiner ce modeste

travail.

Merci également à Mr HIRI fournisseur de la souche de Spiruline « Arthrospira

platensis » à Tamanrasset J’adresse également mes profonds remerciements à Mme ALOUI

Nabiha, Technicienne de laboratoire VPRS (valorisation et promotions et ressources

sahariennes) de la faculté de mathématique et science de la matière qui m'a permis d'effectuer

ce travail dans de bonnes conditions.

Je tiens à remercier Mr HADJADJ Professeur de l’université d'Ouargla Pour

m’avoir accueilli au sein de son laboratoire (VPRS).

A ceux qui mon donné la vie

" Papa et Mama "

Et à mon frère et mes sœurs

Ceux qui la rendent plus intéressante...

A toute ma famille et mes ami(e)s

Mon petit univers

Safa

SOMMAIRE

Remerciement

Liste des figures

Liste des tableaux

Liste des photos

Liste des abréviations

Introduction

Chapitre I : Généralité sur l'arthrospira platensis

I.1 Description de spiruline 3

I.2 Biologie et écologie

3I.2.1 Caractère morphologique 3

I.2.2 Taxonomie et systématique 3

I.2.3 Habitat et répartition géographique 4

I.3 Composition chimique de la spiruline 4

I.3.1 Protéines 4

I.3.2 Vitamines 5

I.3.3 Acides nucléiques 5

I.3.4 Lipides 5

I.3.5 Glucides 6

I.3.6 Composition en sels minéraux et oligo-éléments 6

I.3.7 Phycocyanine 6

I.4 Intérêt de la spiruline dans différents domaines 7

I.4.1 Santé 7

I.4.2 Cosmétique 7

I.4.3 Agroalimentaire 7

Chapitre II: les métabolites sécondaires

II.1 Métabolites secondaires 8

II .1.1 Composés phénoliques 8

II.1 .2 Principales classes des composés phénoliques 8

II.1.2.1 Flavonoïdes 9

II.1.2.2tanins 10

II.1.3 Composés terpéniques 10

II.1.4 Alcaloïdes 10

Chapitre III: les activités biologiques

III. 1 antioxydant

III.1. 2 Les antioxydants endogènes

III.1. 3 Les antioxydants exogènes

III.2 Agents antimicrobienne

III.2.1 Bactéries

III.2.2 Infections bactériennes

III.3 Généralités sur les champignons

11

11

11

12

13

13

13

Chapitre IV : Matériels et méthodes

IV.1 Matériel biologique 13

IV.2 méthodes d’extraction pour Screening chimique 13

IV.2.1.1 Détection des poly phénols 15

IV.3 Méthode d'extraction pour les activités biologiques 16

IV.4 Analyse quantitative des composés phénoliques 19

IV.4.1 Dosage des phénols totaux 19

IV.4.1.1 Courbe d’étalonnage 19

IV.4.2 Dosage de flavonoïdes 20

IV.4.2.1 Courbe d’étalonnage 21

IV.4.3 Dosage des tannins condensés 21

IV.5 Evaluation du pouvoir antioxydant 22

IV.5.1 Le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay) 22

IV.5.1.1 Courbe d'étalonnage 23

IV.5.2 Piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil) 23

IV.6 Analyses chromatographiques 24

IV.6.1 Analyse par chromatographie sur couche mince 24

IV.6.1.1 chromatographie sur couche mince de L’extrait aqueux brute et MeOH brut 25

IV.6.1.2 chromatographie sur couche mince CCM L'extrait chloroformique 25

IV.6. 2 Analyse par chromatographie sur papier CP monodimensionnelle 25

IV.6.2.1 CP monodimensionnelle 26

IV.6.2.2C.P bidimensionnelle 27

IV.7Activité antimicrobienne 28

IV.7.1Souches testées 28

IV.7.2Ensemencement 29

IV.8Activité antifongique 31

IV.8.1 Préparation des différentes concentrations 31

IV.8.2 Essai d’activité antifongique 32

Chapitre V: Résultats et discussion

V.1 Résultats 34

V.1.1 criblage chimique 34

V.1.2 Teneur des extraits en polyphénols 35

V.1.3 Teneur en flavonoïdes 36

V.1.4 Teneur en tanins 38

V.1.5 Activité antioxydant 39

V.1.5.1 Piégeage du radical libre DPPH (2.2-diphényl-1-picrylhydrazyl) 39

V.1.5.2 Méthode de la réduction de fer (FRAP) 43

V.1.6 Analyse chromatographique 46

V.1.6.1 Analyse par chromatographie sur couche mince CCM 46

V.1.6.2 Analyse par chromatographie sur papier CP monodimensionnelle 48.

V.1.6.3 chromatographie sur papier C.P bidimensionnelle 51

V.1.7 Activité antimicrobienne 52

V.1.8 Activité antifongique 54

V.2 Dissucusion 56

Conclusion 58

Liste des figures

Figure Page

Figure 01: Extraction méthanolique à partir de poudre de spiruline 14

Figure 02: Extraction aqueuse à partir de poudre de spiruline 14

Figure 03 : Protocole d'extraction des différentes phases 19

Figure 04 : structure de l'acide gallique 20

Figure 05 : structure de quercétine 20

Figure 06 : Réaction d’un antioxydant avec le radical DPPH 25

Figure 07: Illustration de prise de dépôt sur C.P de la monodimensionnelle 27

Figure08:Illustration de prise de dépôt sur C.P de la bidimensionnelle 28

Figure 09: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antibactérienne des extraits de

spiruline

30

Figure 10: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antifongique des extraits de

Spiruline

32

Figure 11:courbe d'étalonnage des polyphénols. 34

Figure 12: teneur en polyphénols totaux (mg/g de poids sec de la spiruline) 35

Figure 13: courbe d'étalonnage de Quercétine 36

Figure 14: teneur en flavonoïde des extraits de spiruline 36

Figure 15: courbe d'étalonnage de vanilline 36

Figure 16: teneur en tanins des extraits de spiruline 37

Figure 17: Comparaison des teneurs en polyphénols et flavonoïdes et tanins 38

Figure 18 : Pourcentage d’inhibition en fonction des différentes concentrations de

L’acide ascorbique

39

Figure 19 : Pourcentage d'inhibition de BHA 39

Figure 20 : Pourcentage d'inhibition de BHT 39

Figure 21: Pourcentage d’inhibition de radical libre DPPH en fonction des

concentrations des extraits BuOH, brut MeOH, AcET, brut Aqx. .

40

Figure 22 : IC50 de l'acide ascorbique, , les extraits de spiruline 41

Figure 23 : courbes représentants le pouvoir réductrice des extraits de spiruline 42

Figure 24: pouvoir réductrice de l'acide ascorbique 43

Figure 25 : Moyennes des diamètres des zones d'inhibition des extraits de spiruline

relatives aux différentes souches bactériennes

52

Figure 26 : Effet d'inhibition de la croissance mycélienne (mm) de Fusaruim

oxysporum par les extraits de spiruline

53

Liste des tableaux

Tableau01 classification des composés phénoliques 09

Tbaleau02 Liste des principaux radicaux libres. 10

Tableau 03 les souches bactériennes 30

Tableau 04 les résultats des screening chimique de spiruline. 34

Tableau 05 Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés. 44

Tableau 06 fluorescence et Rf des taches sur CCM des extraits. 47

Tableau 07 Les résultats du CP monodimensionnelle. 50

Tableau 08 résultats de CP 2D de l'extrait butanolique et acétate. 52

Liste des abréviations

AcOEt acétate d'éthyle.

AEAC Ascorbique acide équivalent antioxydant capacité.

BHA Butyl hydroxyanizole.

BHT Butylhydroxytoluène.

BuOH butanol.

C concentration

CCM chromatographie sur couche mince

CHCl3 chloroforme.

CuSo4 sulfate de cuivre.

CP chromatographie sur papier WATHMANE

D nombre de dilution

DPPH 1 ,1-diphényle-2-picrylhydrazyl.

EQ Quercétine équivalent

EV Vanilline équivalent

FeCl3 Chlorure de fer.

FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power.

g/l gramme par litre.

g gramme

GAE acide gallique équivalent

GN gélose nutritive

H2O2 Le peroxyde d’hydrogène

H2SO4 Acide sulferique

H3PMo12O40 Acide phosphomolybdique

H3PW12O40 Acide phosphotungstique

HCL Acide Chlorhydrique.

I% pourcentage d’inhibition.

IC50 concentration inhibitrice IC50.

K3Fe(CN) 6 Ferricyanure de potassium.

l litre

m Masse

M Molaire

mg/g milligramme par gramme.

mg/ml milligramme par millilitre.

Mg2+

Magnésium.

min Minute

ml millilitre.

NaOH hydroxyde de sodium.

NH4OH hydroxyde d'ammonium.

nm nanomètre.

O2 Oxygène moléculaire

O2·- Le radical superoxyde

OH Le radical Hydroxyle

PDA gélose dextrosée à la pomme de terre

R rendement.

ROO• Le radical Peroxyle

ROOH Hydroperoxydes organiques

TCA Acide trichlorure acétique.

UV Ultra-violet.

VC vitamine C ou acide ascorbique

λ longueur d’onde.

μl microlitre.

φ phase.

% pourcentage 0C Dégrée

Introduction

INTRODUCTION

1

INTRODUCTION

Le groupe des cyanobactéries, anciennement appelées algues bleues, compte parmi

l'unedes plus anciennes formes de vie sur Terre et constitue l'essentiel des bactéries

photosynthétique avec production d'oxygène. Parmi elle existe le genre Spirulina ou

Arthrospira,des cyanobactéries filamenteuses dont fait partie une bactérie particulièrement

intéressantedénommée Spirulina platensis (ou Arthrospira platensis) plus connue sous le nom

de algueSpiruline. Cettecyanobactérie semble actuellement l'une des meilleurs solutions pour

la production simple d'uncomplément alimentaire de haute qualité [15].

Elle consommée depuis des siècles par certains peuples primitifs d'Afrique et

d'Amérique,et connue par les scientifiques depuis plusieurs décennies pour sa richesse

nutritionnelle, elle faitl'objet d'une redécouverte depuis quelques années[1].Outre des

propriétés nutritionnelles avérées, la spiruline connait aujourd'hui un regaind'intérêt de la part

de la communauté scientifique internationale du fait de sa possible utilisationcomme source

de produits à vertus thérapeutiques.[12].

En effet, le potentiel de cette micro-alguesemble être important et ceci principalement

grâce a son principal pigment, la phycocyanine,donnant a cet organisme sa couleur bleu-vert

caractéristique. Certaines études ont en autres misen évidence des activités sur le système

immunitaire, le cancer, le SIDA mais aussi des effets dansla lutte contre le vieillissement

cellulaire, des propriétés hepatoprotectrices, et anti-inflammatoires.[14].

De multiples études, certes dispersées, portent sur la recherche de

nouveauxconstituants naturels tels que les composés phénoliques, les huiles essentielles qui

ont desintérêts multiples mis en faveur de l’industrie agroalimentaire (additifs, colorants,

arômes,agents de conservation) et pharmaceutique, malheureusement l’exploitation et la

valorisationde ces ressources naturelles reste très limitée et très artisanale [20].

Toutefois, l’évaluation des propriétés thérapeutiques antioxydantes etantimicrobiennes

demeure une tâche très intéressante et utile en particulier,pour cela notre travail s’intéresse de

l'étude de chimique et l'activité biologique d'une cyanobactérie possède des caractéristiques

communes entre le monde végétal

Notre travail sera donc réparti en cinq chapitres, initié par une recherche

bibliographique où nousapportons dans le premier chapitre l'espèce sélectionnée: Arthrospira

INTRODUCTION

2

platensis. Dans leDeuxième chapitre nous avons développé un abrégé sur les substances

actives: composés phénoliques et terpènes et les alcaloïdes. Le troisième chapitre a pour objet

de définir les divers qctivit2s biologiques.

La partie pratique est subdivisée en deux chapitresprésente lesméthodes et les

techniques utilisées pour la réalisation de ce travail. Enfin le cinquième chapitre discute les

résultats obtenus dans cette étude.

Chapitre I

Généralité sur l’Arthrospira platensis

Chapitre I Généralités sur les l’Arthrospira platensis

3

Chapitre I : Généralité sur l'Arthrospira platensis

I.1 Description de spiruline

Arthrospira platensis, appelée communément spiruline est une cyanobactérie qui est

exploitée, aussi bien en lacs naturel qu'en bassins industriels, dans divers régions du monde

[1]. Elle est consommée depuis les temps reculés par diverses populations du monde (Tchad,

Mexique, Inde) [2]. La spiruline se présente sous formes de filaments constitués des

cellules juxtaposées. La reproduction de la spiruline, asexuées, se fait par division des

filaments [3]. Elle est considérée comme une source alimentaire de haute qualité nutritive [4].

I.2 Biologie et écologie

I.2.1 Caractère morphologique

La spiruline a une longueur moyenne de 250µm quand elle possède 7 spires .Elle est

composée de filaments mobiles (de 10 à 12 µm de diamètre) non ramifiés et enroulés en

spirales [2].La spiruline donc dotée du pouvoir photosynthétique, c'est-à-dire qu'elle produit

de la matière organique à partir du gaz carbonique et de l'énergie solaire qu'elle convertit en

énergie chimique utilisée pour réaliser la synthèse d'un grand nombre des métabolites [5].

C'est une procaryote vrai Elle est de type GRAM négative. Malgré son système

énergétique photosynthétique [2].

I.2.2 Taxonomie et systématique

La classification de la spiruline et la suivant [5] :

Règne: Monéra

Classe: Cyanophyceae

Ordre: Nostocales

Famille: Oscillatoriceae

Genre: Arthrospira

Espèce: Arthrospira platensis.


4

Photo 01: aspect microscopique de l'Arthrospira platensis [2].

I.2.3 Habitat et répartition géographique

La spiruline se développe préférentiellement dans des eaux chaudes, alcalines et riches en

nutriments azotés et phosphorés. Plus communément, elle s’observe dans les eaux saumâtres,

ainsi que dans les lacs salins des régions tropicales et semi-tropicales [6].

Le caractère thermophile et les besoins importants en lumière limitent l'aire de répartition

de cette micro algue une bande intertropicale située environ entre 35° de latitude Nord et 35°

de latitude Sud [7]. Sa forte plasticité écologique permet de la retrouver à l’état naturel à la

fois dans les lacs alcalins en Afrique (Tchad, Ethiopie, Tunisie), en Amérique latine

(Mexique, Pérou), et en Asie du Sud (Inde, Sri Lanka, Thaïlande) [8].

I.3 Composition chimique de la spiruline platensis

La spiruline est utilisée, en alimentation humaine, compte tenu de ses teneurs en

protéines, vitamines, minéraux et acides gras non saturés. C'est l'ensemble de tous ses

nombreux facteurs nutritifs qui en fait un aliment si précieux. La composition chimique des

spirulines est variable selon les conditions de culture. Les caractéristiques les plus

intéressantes restent toujours présentes [9].

I.3.1 Protéines

Selon les souches et les conditions de culture, la quantité en protéines d'Arthrospira

platensis varie de 55 à 70 % du poids sec. La spiruline contient la plupart des acides amines et

notamment tous les acides aminés essentiels constituant prés de 60% du poids total des

protéines [3]. La spiruline est caractérisée par un très fort taux de protéines pouvant atteindre

jusqu’à 70 % du poids sec de l’algue.


5

C’est l’aliment le plus riche en protéines connu à ce jour puisqu’elle en contient deux

fois plus que le soja et trois plus que la viande ou le poisson [9].

I.3.2 Vitamines

La spiruline est très riche en vitamines du groupe B, notamment en vitamine B12

puisqu’elle en contient 4 fois plus que le foie de veau. D’autre part, elle se distingue par sa

richesse en β-carotène (jusqu’à 80 % des caroténoïdes totaux). La vitamine E est retrouvée à

des taux comparables aux germes de blé [10].

Il existe treize vitamines, 4 liposolubles (A, D, E, K) et 9 hydrosolubles (B1, B2, B5, B6,

B12, C, PP). La spiruline contient de nombreuses d'entres elles et spécialement des vitamines

B dans des proportions optimales [11]. Les vitamines constituent le principal facteur implique

dans les propriétés biologiques des spirulines. Les vitamines identifiées en majorité chez

Spirulina platensis sont (pour 100g de biomasse) : la vitamine C (42,0-195,3 mg), la vitamine

B3 (0,6-5,3 mg), la vitamine B1 (0,8-15,4 mg), la vitamine B2 (0,2-0,9 mg), la vitamine B6

(0,3-4,0 mg), la vitamine B9 (0,2-0,6 mg) et la vitamine B12 (0,3-0,8 mg) [12]. Les trois

vitamines liposolubles trouvées chez la spiruline sont le β-carotène, précurseur de la vitamine

A, la vitamine E et la vitamine [7].

I.3.3 Acides nucléiques

Les acides nucléiques totaux représentent 4,2 à 6 % du poids sec de l’algue, et ce

faible taux exclut tout risque d’excès d’acide urique chez les consommateurs réguliers de

spiruline à la dose journalière recommandée à titre de complément alimentaire [13].

I.3.4 Lipides

En règle générale, après hydrolyse, la spiruline renferme principalement des acides gras

poly insaturés essentiels à 18 atomes de carbones, notamment de la série oméga-6 (ω6). C’est

en effet une des meilleures sources d’acide gamma-linolénique (18:3ω6) après le lait humain

et certaines huiles végétales onéreuses [2]. D’autres acides gras essentiels comme l’acide

linoléique (18:2ω6) sont retrouvés dans la spiruline ainsi qu’un fort pourcentage d’acide

palmitique (acide gras saturé) permettant de préférer certaines souches à d’autres [11].


6

Cette richesse lui donne un intérêt biologique particulier puisque que cet acide gras est un

précurseur des prostaglandines, molécules ayant une activité anti-inflammatoire et

immunostimulante au sein de l’organisme [6].

I.3.5 Glucides

Les glucides représentent 15 à 25 % du poids sec de l’algue. Les sucres simples et les

polyols ne sont présents qu’en très faible quantité. Les glucides assimilables sont représentés

par du rhamnosanne et du glucosanne aminés, respectivement environ 2 % et 10 %. On note

aussi la présence de glycogène (0,5 %) [4].

I.3.6 Composition en sels minéraux et oligo-éléments

La richesse de la spiruline en fer, dont la biodisponibilité est deux à trois fois supérieure à

celle de la viande, se révèle très intéressante pour améliorer les anémies ferriprives liées aux

malnutritions protéino-énergétiques [5].Calcium et phosphore sont présents à des taux

comparables à ceux retrouvés dans le lait et dans des proportions qui excluent tout risque de

décalcification par apport excessif de phosphore. La spiruline est aussi une bonne source de

magnésium biodisponibles chez l’Homme [3].Le potassium est richement représenté dans la

spiruline, atout intéressant dans les pays industrialisés où le rapport sodium/potassium est

souvent trop élevé [10].

I.3.7 Phycocyanine

Les cyanobactéries possèdent une large variété de composants colores incluant les

Caroténoïdes, les chlorophylles et les phycobiliprotéines.ces derniers, dont fait partie la

phycocyanine, sont des chromoprotéines constitues d'une partie protéique et d'un pigment.

Leur agrégation en complexe macromoléculaire forme le phycobilisome. Les phycobilisomes

sont attachés en matrices régulières à la surface externe de la membrane du thylacoide, siège

de la photosynthèse [14].

I.4 Intérêt de la spiruline dans différents domaines

I.4.1 Santé

Dans les pays développés, et depuis peu dans quelques régions d’Afrique, la Spiruline

est consommée comme complément alimentaire « bénéfique à la santé ». Longtemps

recommandée comme complément en cas de carences en acides gras essentiels, elle répond

actuellement en Europe à la législation sur les compléments alimentaires et sa


7

commercialisation pour la santé est indépendante de l’obtention de preuves d’efficacité, non

réclamées pour les compléments alimentaires [15].

I.4.2 Cosmétique

Elle est utilisée dans les masques cryogéniques et crèmes anti-âge, par son action sur

le renouvellement cellulaire et la tonicité des tissus. Elle est aussi utilisée en synergie avec

d’autres algues, comme agent cicatrisant et antiseptique [13].

I.4.3 Agroalimentaire

En alimentation humaine elle est utilisée comme colorant naturel dans les chewing

gums, produits laitiers, boissons non alcoolisées comme la menthe. La phycocyanine est un

des rares pigments naturels de couleur bleue. Elle apparaît également dans une gamme de

produits algaux mélangée à du sel, des tagliatelles. En Suisse et au Japon, il existe depuis

longtemps du pain à la spiruline [15].

Chapitre II

Les métabolites sécondaires

Chapitre II Les métabolites secondaires

8

Chapitre II: les métabolites sécondaires

II.1 Métabolites sécondaires

Les métabolites secondaires sont des produits à structure chimique souvent complexe,

on recense plusieurs milliers de métabolites (au moins 30000 structures caractérisées) et sont

classées selon leur appartenance chimique [16].

Parmi ces substances on trouve les composés phénoliques, les flavonoïdes, les tanins,

les saponosides, les huiles essentielles et les alcaloïdes qui ont des intérêts multiples mis à

profit dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique [17].

Les cyanobactéries produisent une grande variété de métabolites qui peuvent être des

peptides de faibles poids moléculaires, des alcaloïdes, des terpénoides, des polysaccharides et

des lipopolysaccharides.La, des polyphénols. La plupart de ces métabolites sont accumulés

dans la biomasse cyanobactérienne [1].

II .1.1 Composés phénoliques

Ce sont des dérivés non azotés dont le ou les cycles aromatiques sont issus de deux

grandes voies métaboliques : la voie du shikimates et celle de l’acétate [18]. Les composants

phénoliques sont des molécules biologiquement actives, ils sont largement utilisés en vertus

thérapeutique comme vasoconstricteurs, anti-inflammatoires, inhibiteurs enzymatiques,

antioxydants et anti radicalaires, antimicrobiens [17].

II.1 .2 Principales classes des composés phénoliques

Les composés phénoliques sont classés selon le nombre d’atome de carbone dans le

squelette de base, ces structures peuvent être sous forme libres ou liées à l’ester ou hétérosides

Ils existent également sous forme de polymères naturels (tanins) [18]. Les différentes classes

de ces composés phénoliques sont classées dans le tableau 01


9

Tableau 01: classification des composés phénoliques [19]

Nombre de

carbones

Squelette Classification Structure de base

7 C6-C1 Acides phénols

8 C6-C2 acétophénones

8 C6-C2 Acide phénylacétique

9 C6-C3 Acides hydroxycinamiques

9 C6-C3 Coumarines

10 C6-C4 Naphthoquinones

13 C6-C1-C6 Xanthones

14

C6-C2-C6

Stilbènes

15 C6-C3-C6 Flavonoïdes

II.1. 2.1 Flavonoïdes

Les flavonoïdes possèdent un squelette de base à 15 atomes de carbone constitués de

deux cycles phényles, les cycles A et B, reliés par une chaine à trois carbones (structure en

C6-C3-C6). La chaine en C3 entre les cycles A et B est communément cyclisé pour former le

cycle C [20]. Les flavonoïdes sont capables d'exercer en plus des propriétés antioxydantes,

des propriétés anti-inflammatoires, antiallergiques et antiulcérogènes. Certains flavonoïdes

ont également démontré un potentiel d'agent vasodilatateur .Ils ont été surnommés les «

modificateurs naturels des réponses biologiques» [17].

II.1.2.2 Tanins

Les tanins sont une famille complexe de principes actifs. Ils ont la capacité de former

des complexes avec des macromolécules (les protéines, glucide …) et des liaisons entre les

fibres de collagènes, d'où leur viennent la plupart de leurs propriétés. Leur structure chimique

est particulièrement variable, mais comporte toujours une partie polyphénolique ; il existe


10

deux catégories de tanins, d'origine biosynthétiques différente les tanins hydrolysables et les

tanins condensés [21].

Les tanins ont un très grand pouvoir antibactérien, antiviral, anti-inflammatoire et une

activité antimutagène. Les tanins sont utilisées dans les cas de rhume, de maux de gorge, les

problèmes de sécrétions trop importantes, les infections internes ou externes, blessures,

coupures et brûlures [17].

II.1.3 Composés terpéniques

Les terpènes et les stéroïdes ont un point commun essentiel, peuvent être considérés

comme formes semblables d’un nombre entier d’unités penta carbonées ramifiées dérivées de

2-méthylbutadiene.Selon le nombre d’unités isopréniques qui les constituent, on distingue :

les terpènes proprement dit mono terpènes en C10, les sesquiterpènes en C15, les di terpènes

en C20, les tritepènes (C30) (exemple : les stéroïdes), les tétra terpènes (C40) (exemple : les

caroténoïdes) et les poly terpènes (~4 000) [16].

II.1.4 Alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des molécules d'origine naturelle. On les trouve principalement

chez les végétaux, mais aussi chez les animaux et chez certains micro-organismes. Leur

structure chimique de base est un hétérocycle azoté sauf pour quelques substances dans

lesquelles l'azote est extra cyclique [17].

Les alcaloïdes forment un groupe hétérogène du point de vue de leur structure, de

leurs propriétés et de leurs effets biologiques. Ils agissent directement sur le système nerveux

avec des effets sur la conscience et la motricité. L’action sur le système nerveux peut aller

jusqu’à une action antispasmodique, et mydriatique, anesthésique locale ou analgésique et

narcotique [18].

Chapitre III

Les activités biologiques

Chapitre III Les activités biologiques

11

Chapitre III: les activités biologiques

III. 1 antioxydant

Les antioxydants apparaissent aujourd’hui comme les clés de la longévité et nos alliés

pour lutter contre les maladies modernes. Ce sont des éléments protecteurs qui agissent

comme capteurs de radicaux libres (tableau 02).

Ces derniers sont produit quotidiennement par l’organisme ; ce sont des composés très

réactifs comportant un électron célibataire et nécessaire à des mécanismes vitaux [22] ils

deviennent cependant nocifs quand ils sont en excès et induisent certains dommages au

niveau de la structure des protéines, des lipides [23], des acides nucléiques en entrainant un

stress oxydant qui contribue aux processus de vieillissement cellulaire accéléré et au

développement de pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers,

l’artériosclérose[22].

Des systèmes de défense permettent de prévenir la formation radicalaire ou de limiter

les lésions d'oxydation résultantes. Ces systèmes peuvent être endogènes ou exogènes,

d'origine nutritionnelle [24].

Tableau 02: Liste des principaux radicaux libres.

Radical Formule

Anion superoxyde ●-O2

Peroxyde d’hydrogène H2O2

Hydroxyle OH

Peroxyle ROO●

Hydroperoxydes ROOH

Alcoxyles RO●

Oxygène singulet 1/2O2

Oxyde nitrique NO●

III.1. 2 Les antioxydants endogènes

Ce sont des enzymes ou protéines antioxydantes (Superoxyde dismutase, Catalase et

Glutathion peroxydase) élaborés par notre organisme avec l’aide de certains minéraux. Elles

sont présentes en permanence dans l’organisme mais leur quantité diminue avec l’âge [25].


12

III.1. 3 Les antioxydants exogènes

Les antioxydants exogènes sont présents dans l’alimentation tels que les vitamines A, C, E

et les polyphénols en particulier les flavonoïdes, ainsi que les cofacteurs des enzymes

impliquées dans les systèmes anti-oxydants endogènes comme le sélénium, le zinc et le

manganèse. De nombreuses molécules issues de notre alimentation : vitamines, nutriments,

composés naturels,…etc. sont considérés comme des antioxydants [20].Notons à titre

d’exemples, les plus:

La vitamine E : Le principal anti-oxydant nutritionnel est la vitamine E

(essentiellement l’ K-tocophérol), liposoluble, puissant anti-oxydant mais qui peut

avoir des effets délétères à très forte dose [26]

L’ascorbate ou vitamine C : est l’antioxydant hydrosoluble majeur, réagit

rapidement avec l’anion superoxyde et l’oxygène singulet, ou encore avec le peroxyde

d’hydrogène. Elle est indispensable par sa capacité à réduire d’autres antioxydants

oxydés comme la vitamine E ou les caroténoïdes [23].

Les caroténoïdes : sont des pigments végétaux lipophiles formant une famille de plus

de 600 molécules notamment le lycopène et le 2-carotène, précurseurs de la vitamine

A. Ils sont présents dans les carottes, les fruits rouge et jaunes, les légumes verts et les

tomates [24].

Les flavonoïdes: Ce sont des substances naturelles présentes dans tout le règne

végétal. Les flavonoïdes peuvent agir de différentes façons dans les processus de

régulation du stress oxydant : par capture directe des espèces réactives de l’oxygène,

par chélation de métaux de transition comme le fer le cuivre ou par inhibition de

l’activité de certaines enzymes responsables de la production des espèces réactives de

l’oxygène comme la xanthine oxydase [17].

Les tanins: Les tanins sont des donneurs de protons aux radicaux libres lipidiques

produits au cours de la peroxydation. Des radicaux tanniques plus stables sont alors

formés, ce qui a pour conséquence de stopper la réaction en chaîne de l’auto oxydation

des lipides [21].

Les coumarines: Ils sont capables de piéger les radicaux hydroxyles, superoxydes et

peroxyles, importants dans la prévention de la peroxydation des lipides membranaires

et ils ont une activité antiperoxydante [17].


13

Le sélénium: IL neutralise les métaux toxiques en particulier le plomb et le mercure.

IL aurait aussi une action préventive sur certains cancers [24].

III.2 Agents antimicrobienne

L’action antibactérienne ou antifongique va dépendre du microorganisme lui-même,

de l’agent antimicrobien et de l’environnement où se situe l’action. On parle d’un effet

bactériostatique lorsque la substance antibactérienne empêche la multiplication des bactéries

et d’un effet bactéricide lorsqu’elle détruit totalement la bactérie [25].

Les antibiotiques sont des substances d’origines naturelles, hémi-synthétiques ou

synthétiques capables d’inhiber la croissance ou d’entraîner la mort des bactéries. Ils ont une

activité sélective et spécifique liée à un mécanisme d’action précis. Ce sont les principales

armes médicamenteuses les plus efficaces utilisées contre les infections bactériennes.

Cependant, la prescription à grande échelle et parfois inappropriée de ces agents a entraîné la

création des souches multi-résistantes [26].

III.2.1 Bactéries

Une bactérie, ou bacteria, est un organisme vivant caractérisé par une absence de

noyau et d'organite. Les bactéries les plus grosses mesurent plus de 2 μm et les plus petites

mesurent 0,2 μm. Les bactéries présentent de nombreuses formes : sphériques (coques),

allongées ou en bâtonnets (bacilles), des formes plus ou moins spiralées. Les bactéries sont

ubiquitaires et sont présentes dans tous les types de biotopes rencontrés sur terre. Les

bactéries représentent une grande partie de la biomasse du monde [27].

III.2.2 Infections bactériennes

Une infection bactérienne désigne la pénétration et/ou la multiplication d’un agent

pathogène (bactérie) dans un organisme hôte. Elle entraîne une diminution des défenses du

sujet et un accroissement de la virulence des germes [28].

III.3 Généralités sur les champignons

Les champignons, ou mycètes, sont des végétaux eucaryotes dits thallophytes. Les

cellules sont groupées en un ensemble plus ou moins structuré appelé thalle porteur d’organes

reproducteurs qui permettent de distinguer les champignons filamenteux des levures. Ils sont

non chlorophylliens et peuvent se multiplier par reproduction sexuée ou asexuée. On peut les

cultiver à l’abri de la lumière mais il faudra leur fournir une source de carbone [29].

Chapitre IV

Matériel et méthodes

Chapitre IV Matériels et méthodes

14

Chapitre IV : Matériels et méthodes

IV.1 Matériel biologique

Le matériel biologique utilisé dans ce travail est l'algue bleu-vert : Arthrospira

platensis, la Spiruline fournie par les bassins de culture de Mr HIRI producteur de la spiruline

au Tamanrasset. La spiruline a été cultivée dans un milieu de culture enrichi par les éléments

minéraux nécessaire à la croissance, elle est récoltée, triée et séchée à l’air libre, à l’ombre et

à température ambiante en 1 Mai 2014.

IV.2 méthode d’extraction pour Screening chimique

La phytochimie qualitative basé sur des réactions colorées ou de précipitation par des

réactifs chimiques spécifiques réalisées sur les extraits reconstitués à partir de la poudre

lyophilisée de chaque échantillon pour une première estimation des données préliminaires sur

les constituants des extraits. Les groupes phytochimiques sont nombreux, mais on peut citer

les principaux : les alcaloïdes, les polyphénols (flavonoïdes, anthocyanes, tanins), les

saponosides, les stéroïdes, les coumarines, les terpènes [20].

La méthodologie adoptée pour l'extraction des principaux métabolites de la spiruline

est représentée dans la figure 01 et 02


15

Figure 01: Extraction méthanolique à partir de poudre de spiruline.

Figure 02: Extraction aqueuse à partir de poudre de spiruline.

Macération pendant 24 h

Poudre de spiruline

Filtration

Extraction avec MeOH/eau

(9 :1 )

Filtrat

Extrait brut

méthanoïques

Résidu de la

spiruline

Poudre de spiruline

Macération pendant 24 h

Filtration

Extrait brut

aqueux Résidu de la

spiruline

1g de poudre avec 20

ml de l'eau distillée


16

IV.2.1.1 Détection des polyphénols

a.1Test des tanins

Les tanins sont mis en évidence à partir de 1 ml de l'extrait placé dans un tube en

présence de quelques gouttes de FeCl3.

Après agitation de l'extrait, la couleur vire au bleu noir en présence de tanins galliques et

au brun verdâtre en présence de tanins catéchiques [30].

a.2 Test des coumarines

Les coumarines sont révélées à partir de 2 ml d'extrait placé dans un tube est ajouté à 3

ml de NaOH (10%), après agitation de l'extrait, la formation d'une couleur jaune indique la

présence de coumarines [31].

a.3 Test des anthocyanes

Les anthocyanes sont détectés en plaçant 5m d'extrait dans un tube auquel en ajoute 15

ml d'H2HSO4 à (10%) (Milieu acide), après agitation, le mélange est ajouté à 5ml NH4OH à

(10%) (Milieu basique). La présence d'anthocyanes est affirmée par une coloration bleu-

violacée en milieu basique [32].

a.4 Test des flavonoïdes

Un mélange de quelques gouttes de mg2+

et de gouttes d'HCL concentré, placé dans un

tube, est ajouté à 2ml d'extrait .l'apparition de la coloration rose, orange ou rouge indique la

présence des flavonoïdes [30].

a.4.1 Test de H2SO4: 1ml de l'extrait est ajouté quelque gouttes de H2SO4 concentré

.l'apparition de la coloration orange indique la présence [31].

a.5 Test des anthraquinones

Pour la détection des anthraquinones, 10ml d'extrait sont ajoutés à 5ml de NH4OH à

(10%). Après agitation quelque minute, l'apparition d'un anneau rouge indique la présence

d'anthraquinones [33].


17

a.6 Test des saponosides

Pour la détection des saponosides ,10ml d'extrait placé dans un tube à essais sont

agités pendant 15 secondes puis déposées durant 15 min. Une hauteur de mousse

persistante, supérieure à 1 cm indique la présence de saponosides [34].

b. Tests des terpènes

b.1Test des stérols et tri terpènes

Les stéroïdes sont relevés après addition de 5ml d'anhydride acétique à 5ml d'extrait à

chaud. Le mélange est ajouté à 0.5 ml d'acide sulfurique concentré .Après l'agitation

l'apparition, à l'interphase, d'un anneau pourpre ou violet, virant au bleu puis vert, indique une

réaction positive [34].

c. Test des alcaloïdes

Les alcaloïdes ont été caractérisés à partir des réactifs de Mayer ou Wagner .10ml

d'extrait sont évaporés jusqu'à l'obtention d'un volume de 0.2ml, sur lequel 1.5ml de HCL à

(2%) sont ajoutés .Après agitation de la solution acide ,1 a 2 gouttes de réactifs Mayer ou

Wagner sont ajouté .L'apparition d'un précipité blanc jaunâtre ou brun indique la présence

d'alcaloïdes [31].

IV.2.1.2 Métabolites primaires

d. Test de protéine

2 ml de l'extrait aqueux est ajouté 5 a 6 gouttes NaOH a 5%, après agitation on ajouté 5 a 7

gouttes de CuSo4.l'apparition de couleur violet indique la présence de protéine [33].

E. Test de sucre réducteur

2 ml de l'extrait aqueux ,2ml de solution Fehling (A+B) placé dans un tube porté à

ébullition .l'apparition de précipité rouge indique la présence [34].

IV.2.3 Méthode d'extraction pour les activités biologiques

Après séchage dans un endroit sec et aéré, à l’abri de la lumière du soleil, l’algue est

broyée entièrement. On a effectué 3 macérations :


18

Première macération : 10 g de la matière végétale est macérée dans l’eau, cette

opération est répétée trois fois avec renouvellement du l’eau chaque 24 heure. Deuxième

macération : 10 g de la matière végétale est macérée dans un mélange hydro alcoolique

(Méthanol / eau ; 70/ 30 ; V / V), cette opération est répétée trois fois avec renouvellement du

l’eau chaque 24 heure.Troisième macération : 30g de la matière végétale obtenue est mise à

macération dans un mélange hydro alcoolique (Méthanol / eau ; 70/ 30 ; V / V). Cette

macération est répétée 3 fois avec renouvellement du solvant chaque 24 heure. Après

filtration et concentration sous vide, l’extrait méthanolique (sec)est dilué (récupéré) avec de

l’eau distillée à raison de 50 ml pour 30g de matière sèche, on laisse la solution en repos une

nuit puis on filtre. Après filtration, la solution a subi des extractions successives de type

liquide-liquide en utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le

chloroforme puis l’acétate d’éthyle et enfin avec le n-butanol.Chaque extraction est répétée

trois fois sauf avec l’acétate d’éthyle.

Les trois phases organiques ainsi obtenues (faiblement polaire : chloroforme,

moyennement polaire : acétate d’éthyle et polaire : n-butanol) sont concentrées à sec sous

pression réduite, pesées, puis les extraits acétate d’éthyle et n-butanol sont repris avec du

méthanol par contre l’extrait chloroformique est repris avec du chloroforme enfin tous sont

laissés à l’air libre pour évaporation [35].


19

Figure 03:Protocole d'extraction des différentes phases.

Matière végétale

M= 30 g

Extrait

hydroalcoolique

Phase aqueuse

Phase aqueuse Phase organique

Phase aqueuse

Extrait

chloroformique

Extraitacétate

d'éthyle

Phase organique

Phase aqueuse

Phase organique

Extrait butanolique

Macération dans un mélange

MeOH/H2O (7 :3), Répétée 3× 24h.

-Concentration à sec

-Dilution avec 50 ml d’eau distillée,

repos une nuit

-Extraction par le chloroforme 3×

- Décantation

-Concentration de l'extrait de

chloroforme

-Extraction par acétate d’éthyle x1

-Décantation

Concentration-

-Extraction Par le n-butanol(x3)

-Décantation

-Concentration


20

IV.4 Analyse quantitative des composés phénoliques

L'analyse quantitative des composés phénoliques permet d’avoir une estimation sur la

teneur en phénols totaux de l’échantillon .Le dosage des phénols totaux a été effectué par une

méthode adaptée de Singleton et Rossi en utilisant le réactif de Folin-Siocalteu[36], tandis que

les flavonoïdes ont été quantifiés par le dosage direct par le trichlorure d’aluminium d’après

une méthode adaptée de Lamaiosn et Carnat, ainsi que les tannins ont été estimés par une

méthode colorimétrique en utilisent le vanilline[37].

IV.4.1 Dosage des phénols totaux

Le dosage des polyphénols totaux en utilisant le réactif de Folin. Le réactif est formé

d’acide phosphomolybdique H3PMo12O4 et d’acide phosphotungstique H3PW12O40qui est

réduits par l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène W8O23 et de molybdène

Mo8O3.Les phénols sont estimés par une spectroscopie UV dont l’acide gallique est utilisé

comme un standard à une longueur d’onde λ =760 nm [20].

Figure 04 : structure de l'acide gallique

IV.4.1.1 Courbe d’étalonnage

Un standard de calibration a été préparé en utilisant des solutions d’acide gallique des

différentes concentrations de 0.03 jusqu'à 0.3 g/l'on prend 100μl de la solution diluée, elle est

ensuite oxydée par le réactif de Folin-Ciocalteu (dilué 10 fois) laissé 5 minutes et puis

neutralisée avec 2 ml de carbonate de sodium 20%puis les solutions ont été secouées

immédiatement et sont maintenues dans l’obscurité pendant 30 minutes à température


21

ambiante [38]. L’absorbance de chaque solution a été déterminée à 760 nm. L’analyse

quantitative des phénols totaux des extraits phénoliques a été réalisée par la même procédure.

Les concentrations des polyphénols a été déterminé par la formule suivante :

C : concentration de polyphénols en mg/g.

A : l’absorbance à λ = 760 nm.

K : tangente de l’acide gallique. (nm*ml/mg)

D : nombre de dilution.

V : volume de récupération de l’extrait. (ml).

P : le poids initial de la plante.

IV.4.2 Dosage de flavonoïdes

Le chlorure d’aluminium (AlCl3) forme un complexe très stable avec les groupements

Hydroxydes OH des phénols. Ce complexe jaune absorbe la lumière visible à une longueur

d’onde 415 nm. Les phénols sont estimés par une spectroscopie UV, dont la Quercétine est

utilisé comme un standard à une longueur d’onde λ =415 nm [39].

Figure 05 : structure de quercétine

𝑪 =𝑨 × 𝑫 × 𝑽

𝑲 × 𝑷


22

IV.4.2.1 Courbe d’étalonnage

Un standard de calibration a été préparé en utilisant des solutions de Quercétine de

différentes concentrations de 0.03 jusqu'à 0.3 g/l.1ml de la solution diluée est mis à réagir

avec1 ml de chlorure d'aluminium 10%, puis laissé 10 minutes dans l’obscurité .L’absorbance

de chaque solution a été déterminée à 415 nm. En utilisant les valeurs des absorbances

obtenues pour les différentes solutions de Quercétine [35].

L’analyse quantitative des flavonoïdes totaux des extraits a été réalisée en adaptant la

même procédure utilisée pour l’établissement de la courbe d’étalonnage, en remplaçant

l’acide gallique par des délutions des extraits jusqu'à une appropriée concentration. La teneur

en flavonoïdes totaux de chaque extrait a été calculée et exprimé en équivalent Quercétine en

milligramme par 1g de la matière végétale (mg/g) [36]. Par la formule suivante :

𝑪 =𝑨 × 𝑫 × 𝑽

𝑲 × 𝑷

C : concentration de flavonoïdes en mg/g d’ES


K : tangente de Quercétine. (nm*ml/mg).


V : volume de récupération de l’extrait. (ml)

P : le poids initial de la plante.

IV.4.3 Dosage des tannins condensés

Les quantités des tannins condensés sont estimées en utilisant la méthode à vanilline

en milieu acide (Julkunen-Titto, 1985). Un volume de 400μl de l’extrait brut est ajouté à 3

ml de la solution vanilline/éthanol (4 %, m/v) puis mélangé à l’aide d’un vortex. Ensuite, 1.5

ml de l’acide chlorhydrique concentré (HCl) est additionné et laissé réagir à la température

ambiante pendant 15 min. L'absorbance à 500 nm est mesurée contre un blanc. La

concentration des tannins est estimée en milligramme (mg) équivalents de vanilline par

gramme (g) du poids de l’extrait sec (EV)/g) à partir de la courbe d’étalonnage [37].


23

La teneur en tanins totaux de chaque extrait a été calculée et exprimé en équivalent

vanilline en milligramme par 1g de la matière biologique (mg/g). Par la formule suivante:

C : concentration de tanins en mg/g d’ES .


K : tangente de Quercitine. (nm*ml/mg).


V : volume de récupération de l’extrait. (ml)

P : le poids d’initial de la plante.

IV.5Evaluation du pouvoir antioxydant

Des nombreuses méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l'activité antioxydant des

composés phénoliques des extraits. La plupart de ces méthodes sont basées sur la coloration

ou la décoloration d’un réactif dans le milieu réactionnel. Dans notre étude nous avons utilisé

deux tests chimiques à savoir : le test ferric Reducing / Antioxydant Power Assay qui mesure

le pouvoir de réduction des ions de fer et le test du DPPH qui mesure le pouvoir d’inhibition

des radicaux libres [35].

IV.5.1 Le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay)

Ce test est considéré comme un test direct et rapide dont est utilisé pour mesurer le

pouvoir des antioxydants non enzymatiques, et utilisée pour déterminer l’activité

antioxydante des extraits étudiés dans un milieu neutre. Il est basé sur la réduction des ions

[Fe (CN) 6]3-

à des ions de [Fe (CN) 6]4-

qui donnent dans la présence des ions Fe3+ une

coloration bleu clair, dont l'absorbance à une longueur d’onde λ= 700 nm. L’activité

antioxydante est mesuré avec un nouveau terme appelé AEAC : qui présente l’activité

antioxydante en équivalant de l’acide ascorbique des extraits étudiés (Ascorbic Acid

Equivalent Antioxydant Capacity).L’évolution de l’activité antioxydante de nos extraits est

comparée par rapport à l’acide ascorbique (vitamine C) et cela en traçant une courbe

d’étalonnage de ce dernier [38].

𝑪 =𝑨 × 𝑫 × 𝑽

𝑲 × 𝑷


24

IV.5.1.1 Courbe d'étalonnage

Les solutions d’acide ascorbique (vitamine C) sont préparé de concentration allant de

0.01 jusqu'à 0.1 g/l. 1 ml de chaque solution introduite dans des tubes à essai, puis on l’ajoute

2.5 ml d’une solution K3Fe(CN) 6 (1%), 2.5 ml de solution tampon phosphaté. Les solutions

ont secouées immédiatement, puis ils sont maintenus dans un bain marie pendant 30 minutes

à une température de 50 °C. Ensuite, en suite on a ajoute 2.5 ml de l’acide trichloracétique

(TCA 10%). On prend de chaque tube 2.5 ml et on introduit dans un autre tube à essai et on

ajoute 2.5 ml de l’eau distillé, 0.5 ml de solution deFeCl3 (0.1 %).L’absorbance de chaque

solution a été déterminée à 700 nm contre un blanc. Les lectures de la densité optique à700

nm, des solutions ainsi préparées ont permis de tracer la courbe d'étalonnage de l’acide

ascorbique (Vitamine C) [39].

IV.5.2 Piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil)

Le DPPH c'est une méthode est basée sur la mesure de la capacité des antioxydants à

piéger le radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH). Ce dernier est réduit à la forme

d’hydrazine (non radical) en acceptant un atome d’hydrogène. L’effet de chaque extrait sur le

DPPH est mesuré par la procédure décrite par Sanchez-Moreno et al (1998).Un volume de 1

ml de différentes concentrations de chaque extrait exprimées en g/l est ajouté à 1 ml de la

solution méthanolique du DPPH (0.025 mg/ml) fraîchement préparée. L’absorbance à 517 nm

est mesurée [40].

Figure 06: Réaction d’un antioxydant avec le radical DPPH [41].


25

Calcule des pourcentages d’inhibitions

Nous calculons ainsi les pourcentages d’inhibition par la formule suivante :

I (%) : pouvoir d’inhibition en %.

A0: absorbance de la solution de DPPH en absence de l’extrait

A1: absorbance de la solution de DPPH en présence de l’extrait.

Calcule des IC50

IC50 est la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50 % de radical

DPPH, Les IC50 sont calculées graphiquement par les régressions linéaires des graphes tracés

; pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des fractions testées et

les standards [20].

IV.6Analyses chromatographiques

IV.6.1Analyse par chromatographie sur couche mince

L’étude préliminaire de ces extraits est, classiquement, dominée par une analyse en

CCM et la chromatographie sur papier. L’étude des chromatogrammes peut se faire : soit

Directement: chalcones et aurones sont habituellement directement visibles sur les

chromatogrammes. En présence de vapeurs d’ammoniac les taches passent à l’orange et au

rouge .Soit Par un examen en lumière ultraviolette avant et après pulvérisation de trichlorures

d’aluminium, avant et après exposition aux vapeurs d’ammoniac: la nature et les changements

des fluorescences observées donnent des renseignements utiles sur le type de flavonoïde

présent [35].

IV.6.1.1 Chromatographie sur couche mince de L’extrait aqueux brute et MeOH brute

Pour obtenir un meilleur système chromatographique des deux extraits, on a choisi

comme phase stationnaire le gel de silice. Pour la phase mobile on a effectué plusieurs tests

pour choisir le meilleur éluant :

𝑰 % = 𝟏 −𝑨𝟏

𝑨𝟎 × 𝟏𝟎𝟎


26

Chloroforme / méthanol/acide acétique (1:2:1), (1 :1:1 ).

Méthanol / chloroforme / acétate d’éthyle (0.5:1:1.5)

Chloroforme / acetone/methanol (1:1.5:0.5), (4:1).

Chloroforme / methanol (1:2)

IV.6.1.2 chromatographie sur couche mince (CCM) de l'extrait chloroformique

Pour obtenir un meilleur système chromatographique puisque l’extrait est apolaire, la

phase stationnaire donc ne sera que le gel de silice .Pour la phase mobile, on a testé beaucoup

de systèmes pour choisir le meilleur éluant :

Chloroforme /MeOH (10:1) (20:1).

Dichlorométhane/MeOH (10:1).

Chloroforme/MeOH (5:1) (30:1).

Chloroforme /acétone (10:1).

Chloroforme/acide acétique (20:1).

IV.6. 2 Analyse par chromatographie sur papier (CP) monodimensionnelle

La technique de chromatographie sur papier occupe jusqu'à maintenant une position

dominante dans le domaine de l’analyse et la séparation des flavonoïdes. La CP est

convenable pour la séparation des mélanges complexes de tous les types flavonoïdes. Elle est

aussi utilisée pour isoler les petites ainsi que les grandes quantités de flavonoïdes et nécessite

des équipements et des matériels de faible coût.

Une partie de chaque extrait doit être déposée sur un morceau de papier

chromatographique Whatman et séparée mono ou bi dimensionnellement avec du B.A.W et

de l’acide acétique. Cette procédure est inestimable en tant que moyen de déterminer la

complicité du mélange glycoside. Plus tard, pour être séparer a une large échelle sur un épais

papier chromatographique Whatman N° 3 une dimension. Chromatographie de partage sur un

épais papier filtre (Whatman N° 3) est l’un des moyens convenables de séparer et isoler les

flavonoïdes glycosides [42].

IV.6.2.1 CP monodimensionnelle

On a travaillé sur chromatographie papier (C.P) descendante avec le papier WHATMAN


27

N° 3 monodimensionnelle avec les solvants :

Phase organique : B.A.W : n-Butanol / acide acétique /water, phase supérieur (4:1:5)

Phase aqueuse : Acide acétique 20%.

La Préparation du papier sur les dimensions du papier Whatman sont 18×21 cm, mesure 1

cm et on plie le papier dans le haut de papier en dans la bas on met les quatre dépôts : extrait

acétate d’éthyle, extraits n-butanol ; extrait aqueux, extrait MeOH l’aide d’une pipette

capillaire [43].comme les représente la figure:

1.5 cm

Figure 07:Illustration de prise de dépôt sur C.P de la monodimensionnelle

IV.6.2.2C.P bidimensionnelle

Pour avoir une idée plus claire on est passé à l’analyse chromatographique

bidimensionnelle toujours avec le système CP D1 :B.A.W, D2 : acide acétique 15%.

Les flavonoïdes glycosides sont aisément distingués dans le chromatogramme 2D des

autres phénols par leurs couleurs de réaction : généralement marron sombre dans la lumière

Les extraits de spiruline


28

UV, il se change au jaune brillant avec les vapeurs d’ammoniaque, et par leurs positions

respectives.

On a travaillé sur du papier Whatman N°3 de dimension 18×21 cm. Le dépôt de

l'échantillon se fait comme pour la mono dimension mais on laisse 7 cm à partir du bord de la

deuxième dimension [35].comme le montre la figure

Figure: Illustration de prise de dépôt sur CP de la bidimensionnelle

Figure 08 : Illustration de prise de dépôt sur C.P de la bidimensionnelle.

IV.7Activité antimicrobienne

IV.7.1Souches testées

Les souches utilisées dans les tests font parties de microorganismes, qui sont des

pathogènes et des contaminants. Les microorganismes.

D1 : B

AW

D2: acide acétique 15%


29

Tableau 03 : Les souches bactériennes .

Etat frais Souche Gram

Bacille

Bâtonnet

Escherichia coli ATCC 25922

Négatif

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Klebsilla pneumonieATTCC700603

Cocci Enterococcus faecalis ATCC 29212

Positif

IV.7.2Ensemencement

15 ml de la gélose nutritive est coulé dans des boîtes de Pétri. Après le

refroidissement et solidification du milieu de culture sur la paillasse, 300μl de suspension

bactérienne à tester sont étalés en surface de gélose pour chaque boîte puis on laisse sur la

paillasse pendant 30 minute .Dans des conditions aseptiques et à l’aide d’une pince stérile, les

disques imbibés par les extrait de la spiruline , extrait butanolique; extrait acétate d'éthyle,

extrait aqueux , extrait MeOH brut. Sont déposés sur le gélose (4disques/boite) et pour le

témoin on a mite des disque imbibés par l'eau distillé (1disques/boite). Les boîtes sont ensuite

fermées et incubée à température de 37°C pendant 24 heures [44].


30

milieu GN stéril

E.coli P.aeruginosa Entr.feacalis KL.pneumonie

Après 24 heures d'incubation

10 ml d'eau physiologique dans chaque tube

+colonies de +colonies de +colonies de

15 ml de GN +300μl15 ml de GN +300μl 15 ml de GN +300μl 15 ml de GN +300μl

Sup.E.coli sup P.aerugénosa sup

sup

Préparation de pré cultures

Préparation des suspensions bactériennes

Etalement

Dépôt des disques imbibés par

les extraits de la spiruline

Incubation à 37°C pendant 24

heures

+colonies de


31

Figure 09: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antibactérienne des extraits de

spiruline.

IV.8Activité antifongique

Pour la réalisation de l’activité antifongique on a adopté la méthode de contact direct.

IV.8.1 Préparation des différentes concentrations

Pour préparer les différentes concentrations on prélave 5mlde chaque des extrait de la

spiruline et ajuster a 50 ml par PDA puis on agite pendant 5 minute pour homogènes le

milieu de PDA avec les extraites [45].

IV.8.2 Essai d’activité antifongique

15 ml de mélange (PDA +les extraits de la spiruline) a été coulé dans des boites de

Pétri, Après le refroidissement et la solidification de cette mélange sur la paillasse des disques

mycélien de diamètre de 5mm de diamètre issue de la marge d’une culture âgée de Fusarium

sporotrichioides ont été prélevée avec un emporte-pièce et inoculé au centre de chaque boite

(1disque/boite). Chaque concentration est répéter trois fois. Les boites sont incubées dans

d’obscurité à température de 20 ± 2oC ; Le témoin est réalisé dans les mêmes conditions sans

extraites des plantes et les mesures sont prélavées après 72 h d’incubation [45].


32

ⱷ BuOH ⱷ AcOH ⱷ MeOH ⱷ Aqx sans extrait

ⱷ BuOH ⱷ AcOH ⱷ MeOH ⱷ Aqx Témoin

ⱷ BuOH ⱷ AcOH ⱷ MeOH ⱷ Aqx

Figure 10: Protocole expérimentale de l’essai d’activité antifongique des extraits de spiruline.

PDA

Agitation et la mise dans des boites pétris

Dépôt des disques mycéliens de Fusarium

sporotrichioides

Incubation a 20°C (72heure)

Témoin

Chapitre V

Résultat et dissucusion

Chapitre V Résultats et discussion

33

Chapitre V: Résultats et discussion

V.1 Résultats

V.1.1 criblage chimique

Une investigation phytochimiques préliminaire a été entreprise et a permis de mettre

en évidence divers métabolites secondaires. Le tableau 04 regroupe les résultats des tests

chimiques réalisés sur la spiruline.

Tableau 04: les résultats des screening chimique de spiruline.

Extraits

Métabolites secondaires Extrait aqueux Extrait méthanolique

++ ++ Tanins hydrolysable

Polyphénols

- - Anthraquinones

+ ++ Flavonoïdes

- - Anthocyanes

- - Coumarines

+++ +++ Saponosides

++ +++ Stéroïdes Terpènes

+++ +++ Alcaloïdes

Les métabolites primaires

- - Sucre réducteur

- +++ Protéines

- - Amidon

-

++

Les composes volatiles

- : Test négatif ++: Test positif

+: Test faiblement positif +++: Test fortement positif


34

Les résultats de criblage chimique sont obtenus à partir de poudre épuisés par l’eau, et

le méthanol. La recherche, des anthraquinones, des composés réducteurs, des amidons, des

anthocyanosides, des anthracenosides sont montrée négative mais celle de flavonoïdes, des

tanins et des huiles volatiles et des alcaloïdes a été positive.

Il est à signaler que les saponosides, les stérols et stéroïdes et protéines sont présents

en forte quantité dans la spiruline. D’autre part, les coumarines sont des classes de familles

chimiques totalement absentes dans la spiruline.

La présence des principaux métabolites secondaires chez la spiruline suggère d'une

activité photosynthétique et énergétique, comparable à celle des plantes.

Le criblage réalisée a permis de constater la présence des cinq grands groupes

chimiques, les tanins, les flavonoïdes, les stérols et stéroïdes, les huiles volatiles et les

saponosides, alcaloïdes alors que les coumarines ne semblent présentes. Cependant

V.Anbarasan et al. 2011ont rapporté la présence des mêmes classes de familles chimiques

retrouvées au niveau la spiruline.

V.1.2 Teneur des extraits en polyphénols

Les quantités des polyphénols correspondantes ont été rapportées en mg équivalent

acide gallique par g du poids sec, sont déterminées par une équation de type : y = a x.

Figure 11: courbe d'étalonnage d'acide gallique .

Suivant la (figure 16) ci-dessus donne la teneur en polyphénols de chaque extrait de

spiruline. L'extrait méthanolique représente la teneur la plus élevée en polyphénols suivi

R² = 0.995

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,1 0,2 0,3 0,4

concentartion de l'acide gallique g/l

abso

rban

ce à

ג =7

60

nm


35

l'extrait aqueux et butanolique et en faible teneur en polyphénols l'extrait chloroformique et

l'extrait acétate d'éthyle.

Figure 12: teneur en polyphénols totaux (mg/g de poids sec de la spiruline) des extraits de

spiruline.

Pour les cinq extraits de la spiruline nous avons remarqué une variabilité en polyphénols

totaux (figue 16).la teneur le plus élevée est constaté dans l'extrait brute méthanolique (1.25

mg EAG/g ES) par rapport de l'extrait brute aqueux (0.79mg EAG/g ES), une faible teneur de

polyphénols est constaté dans l'extrait acétate d'éthyle et l’extrait chloroformique .

V.1.3 Teneur en flavonoïdes

Des dosages spectrophotométriques ont été effectués à partir des extraits de la

spiruline afin de déterminer la teneur totale des flavonoïdes. Une courbe d'étalonnage a été

réalisée avec Quercétine à une longueur d'onde 420 nm.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

CHCl3 AcOET BuOH Aqx MeOH

con

cen

trat

ion

mg

GA

E/g


36

Figure 13: courbe d'étalonnage de Quercétine.

D'après l'histogramme illustré par la figure 18, on a enregistré la teneur la plus élevée

en flavonoïdes dans l'extrait BuOH (1.72 mg EQ/g) et l'extrait MeOH (1.33mg EQ/g) et en

teneur plus moins0.79mg EQ/g enregistre dans l'extrait aqueux en faible teneur en flavonoïdes

enregistré chez l'extrait CHCl3 (0.03mg EQ/g).

Figure 14 : teneur en flavonoïde (mg/g de poids sec de la spiruline) des extraits de spiruline.

R² = 0.998

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01

Concentration du quercitine g/l

ab

sorb

an

ceàג

=415

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

CHCl3 AcOET Aqx MeOH BuOH

CHCl3

AcOET

Aqx

MeOH

BuOHcon

cen

trat

ion

mg

EQ/g


37

V.1.4 Teneur en tanins

Une courbe d’étalonnage est réalisée en utilisant de la Vanilline comme contrôle

positif. Les résultats sont exprimés en milligramme (mg) équivalent de la vanilline par

gramme de la matière sèche (mg EV/g).

Figure15 : courbe d'étalonnage de vanilline.

Figure 16: teneur en tanins (mg/g de poids sec de la spiruline) des extraits de spiruline.

Comme le montre l’histogramme dans la figure 22 les concentrations des tanins sont

classées comme suit : extrait BuOH qui sont de l’ordre de (0.07 mg EV/g) et extrait MeOH

(0.03mgEV/g) dont nous avons remarqué que la teneur enregistrée dans l'extrait BuOH est la

plus importante.et absente total dans les autres extraits.

R² = 0.997

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,05 0,1 0,15

concentartion du Vaniline g/l

ab

sorb

an

ceàג

=500n

m

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

Teneur en tanins Extrait BuOH

Teneur en tanins Extrait MeOH

con

cen

tart

ion

en m

gE V

/g


38

V.1.5 Activité antioxydant

V.1.5.1 Piégeage du radical libre DPPH (2.2-diphényl-1-picrylhydrazyl)

Dans notre travail nous avons étudié l’activité antioxydante des différents extraits de

la spiruline étudiée afin de préjuger et localiser la fraction la plus active. Les valeurs obtenues

ont permis de tracer des courbes ayant une allure exponentielle avec présence d’une phase

stationnaire qui signifie la réduction presque totale du DPPH· en sa forme non radicalaire. A

partir de ces courbes nous pouvons déterminer les pourcentages d’inhibition obtenus en

fonction des concentrations utilisées ainsi la valeur d’IC50 de chaque extrait.

Figure 18: Pourcentage d’inhibition en fonction des différentes concentrations de L’acide

ascorbique.

R² = 0.996

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0,01 0,02 0,03pou

rcen

tage

d'i

nh

ibit

ion

%

concentration M

R² = 0.99

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0,05 0,1

concentration mg/ml

po

urc

enta

ge

d'i

nh

ibit

ion

%

R² = 0.990

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,02 0,04

concentration mg/ml

po

urc

enta

ge

d'i

nh

ibit

ion

%

Figure 20: Pourcentage d'inhibition de BHT Figure19: Pourcentage d'inhibition de BHA


39

Figure21: Pourcentage d’inhibition de radical libre DPPH en fonction des concentrations des

extraits BuOH, brut MeOH, AcOET, brut Aqx.

La phase butanolique de spiruline a montré une activité très élevée de piégeage du

radical DPPH● par rapport à les autres extraits. Elle est même supérieure à celui de BHT.

A une concentration de 0.035 mg/ml le pourcentage d’inhibition de la fraction

butanolique est de 60% La réduction du DPPH● est dépassé l'IC50à partir de cette

concentration. En comparant avec l'extrait aqueux, le pourcentage d’inhibition est de 30% à

une concentration de 0.035 mg/ml. Concernant la fraction méthanolique et acétate d'éthyle le

pourcentage d’inhibition est de l’ordre de 40 %et de 35 % respectivement à une concentration

de 0.035 mg/ml. Ces deux fractions on a donné des activités plus faibles à celle de l’acide

ascorbique.

R² = 0.993

0102030405060708090

0 0,05 0,1

concentration de l'extrait brut Aqx de spirulinemg/ml

po

urc

enta

ge

d'i

nh

ibit

ion

%

R² = 0.991

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

concentration de l'extrait AcOET despiruline mg/ml

pou

rcen

tage

d'i

nh

ibit

ion

%

R² = 0.989

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 0,02 0,04 0,06

concentration de l'extraitbrut MeOH de spiruline mg/ml

pou

rcen

tage

d'i

nh

ibit

ion

%

R² = 0.992

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

concentartion de l'extrait BuOH despiruline mg/ml

po

urc

enta

ge

d'i

nh

ibit

ion

%


40

Les valeurs des IC50 trouvées pour tous les extraits testés sont représentées dans le

tableau et dans la figure sous forme d’histogramme.

Figure 22: IC50 de l'acide ascorbique, les extraits de spiruline

Le figure 22 rapporte les résultats du pouvoir antioxydant des extraits de spiruline par

la méthode de piégeage du radical libre DPPH.D’une manière générale, tous les extraits testés

méthanolique, aqueux, acétatique et butanolique ont provoqué une diminution plus ou moins

importante de l’absorbance à 517nm selon leurs concentrations. L’extrait butanolique

présente un pourcentage d’inhibition comparable à celui de l’extrait aqueux, et les deux

extraits sont supérieurs que le BHT, et nettement inferieure à celle acide ascorbique et le

BHA. La fraction méthanolique c'est la plus faible pouvoir anti radicalaire comparable à

l'autre extrait. Ces résultats montrent que nos extraits possèdent une puissante activité à céder

le proton pour neutraliser le radical DPPH.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Extrait

BuOH

Extrait

AcOH

Extrait

Aqx

Extrait

MeOH

Acide

ascorbique

IC5

0m

g/m

l


41

V.1.5.2 Méthode de la réduction de fer (FRAP)

Les différents extraits sont traités de la même façon que ceux des solutions standards de

l’acide ascorbique (V.C). Nous avons tracé les courbes représentants la variation du pouvoir

réducteur exprimée en absorbance en fonction de l’inverse du nombre dilution

Figure 23: courbes représentants le pouvoir réductrice des extraits de spiruline.

R² = 0.996

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,2 0,4 0,6

abso

rban

ce à

ג =

70

0 n

m

1/dilution

extrait AcOETR² = 0.93

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0 0,5 1

abso

rban

ce à

ג =

70

0 n

m

1/dilution

extraitCHcl3

R² = 0.991

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,05 0,1 0,15

abso

rban

ce à

ג =

70

0 n

m

1/dilution

extraitAqx

R² = 0.979

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,05 0,1 0,15

abso

rban

ce à

ג =

70

0 n

m

1/dilution

extrait BuOH

R² = 0.997

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,02 0,04 0,06abso

rban

ce à

ג =

700

nm

extrait MeOH

1/ dilution


42

Figure 25: la pouvoir réductrice de BHA

Figure 26: pouvoir réductrice de l'acide ascorbique.

Tableau 05: Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés.

extrait BuOH MeOH Aqx AcOET CHcl3 BHA BHT

AEAC 2.94 8.76 1.07 1.07 0.07 0.56 0.75

R² = 0.991

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,5 1 1,5

abso

rban

ce à

ג =

70

0 n

m

1/ dillution

R² = 0.987

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5

abso

rban

ce à

ג =

70

0 n

m

1/ dillution

R² = 0.997

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,2 0,4 0,6

abso

rban

ce à

=7

00

nm

1/ dilution

Figure 24 : pouvoir réductrice de BHT


43

Les résultats obtenus dans les figures 23, 24, 25,26 montrent que la capacité à réduire

le fer pour l’extrait méthanolique brut elle est plus élevée par rapport les autres extraits. On

observées de densités optique qui dépasse 0.5 à une concentration 0.05 mg/ml, elle supérieur,

mais elle est nettement inférieur de l'acide ascorbique.

L'extrait chloroformique présenté une très faible activité avec des valeurs observées

de densités optiques (DO) qui ne dépassent pas le 0.1 à une concentration de 0.9 mg/ml, mais

elle est nettement inférieure à celle de l’acide ascorbique qui présente une DO de 0.1mg/ml à

la concentration 0.5 mg/ml seulement et le BHA qui présente une DO de 0.1 mg/ml à la

concentration 0.1 mg/ml.

La fraction butanolique représente moyennement élevé pour réduire le fer pour la

fraction méthanolique densité optique maximale de 0.49 à la concentration 0.13 mg/ml mais

cette capacité est nettement supérieure à celle de BHT et nettement inférieur que l'acide

ascorbique et BHA.

Selon le tableau 05 tous les extraits de spiruline possèdent un pouvoir réducteur

important, on remarque que l'extrait méthanolique brut possède la plus forte activité de

réduction de fer suivie par l'extrait butanolique puis l'acétate et l'extrait aqueux brut.

L'extrait méthanolique montre un meilleur pouvoir réducteur que le BHA et le BHT

de fois 15 et 6 respectivement.

Pour l'extrait butanolique les résultats effectués une bonne activité réducteur 5 fois

plus que le BHA et 3 fois par rapport le BHT par contre l'extrait aqueux montre une pouvoir

plus au moins que l'extrait méthanolique brute et extrait butanolique mais une fois plus que le

BHA et BHT.

La capacité à réduire le fer pour L'extrait chloroformique enregistre plus faible

pouvoir par rapport les autre extraits mais importante le BHA et BHT.

La méthode FRAP a révélé que l’extrait MeOH possède un pouvoir réducteur plus fort

que celui du les autres solvants. Classes de polyphénols contenues dans l'extrait.

D'après synthèse bibliographique et les résultats obtenus, on peut dire que les

flavonoïdes de classe : mon-glycosides et di-o-glycosides sont les plus concentré dans l'extrait

MeOH, et ils sont très efficaces en tant qu'antioxydant [33].


44

V.1.6Analyse chromatographique

V.1.6.1 Analyse par chromatographie sur couche mince CCM

Nous avons soumis nos extraits méthanolique et aqueux et chloroformique à une

analyse sur chromatographique sur couche mince, dans 7 systèmes a donné une bonne

séparation des molécules dans le système S7 pour l'extrait méthanolique et aqueux (Méthanol/

chloroforme / acétate d’éthyle 0.5:1:1.5). Pour l'extrait chloroformique le S1 a donné une

bonne séparation (Chloroforme /MeOH 10:1).

Photo 02 : Plaque CCM de l'extrait chloroformique sous UV.

Photo 03: Plaque CCM de l'extrait MeOH brut et Aqx brut sous UV à 356 =ג nm.

MeOH

Aqueuse


45

Dans notre étude, nous avons réalisé une chromatographie sur couche mince pour les

fractions aqueuse et méthanolique et chloroformique sur une plaque de gel de silice en

utilisant différents systèmes. Pour l'extrait CHCL3 le système (CHCL3/MeOH) ;(10:1)

(donne une bonne séparation, et pour l'extrait MeOH et Aqx le système

CHCL3/MeOH/AcOH) (1:0.5:2.5).

Par le biais de ces systèmes, nous avons pu mettre en évidence : trois composés pour

l'extrait chloroformique, trois composés pour aqueux et neuf composé pour l'extrait

méthanolique brute. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 06:

Tableau 06: fluorescence et Rf des taches sur CCM des extraits.

Extrait Nombre de

taches

Valeurs de RF Couleur des

taches

CHCl3 03

0.95

0.71

0.32

Rouge

Violet

Rouge

MeOH

Brut

09 0.88

0.8

0.7

0.64

0.55

0.47

0.43

0.3

Rouge

Marron

Rose

Rouge

Violet

Bleu

Jaune

Vert

Aqx 02 0.76

0.43

Bleu

Violet

V.1.6.2 Analyse par chromatographie sur papier CP monodimensionnelle

La phase organique B.A.W a pris 10 heures pour atteindre le front de solvant par

contre l’acide acétique 20% a pris 5 heures, les chromatogrammes.


46

Photo 04: CP ascendante monodimensionnelle, solvant acide acétique20% sous UV.

Photo 05: CP ascendante monodimensionnelle, solvant acide acétique20% après UV.

Figure 07: Chromatogramme CP ascendante monodimensionnelle, solvant BAW sous UV.


47

Photo 07: Chromatogramme CP ascendante monodimensionnelle, solvant BAW après UV.

D’après les chromatogrammes C.P 1D, il est montre une variabilité des taches et des

couleurs pour les extraits selon les deux systèmes BAW et acide acétique à 20% les résultats

obtenues montre qui il y des différences entre les extraits. Les résultats de CP à 1D ont été

démontrés dans le tableau 07 ci-dessous:

Tableau 07: Les résultats du CP monodimensionnelle.

Extrait Système de

solvant

Nombre de

tache

Valeurs de

Rf

Couleurs de taches

BuOH BAW

3 0.82

0.75

0.62

Bleu

Vert

Jaune

Acide

acétique

5 0.72

0.56

0.48

0.36

0.25

3 Bleu

Jaune

vert

AcOEt BAW

3 0.84

0.76

0.64

Bleu

Vert

Jaune

Acide

acétique

3 0.73

0.50

0.36

2 Bleu

Jaune


48

MeOH

Brut

BAW

3 0.77

0.61

0.46

Bleu

Jaune

Vert

Acide

acétique

4 0.70

0.46

0.32

0.21

3 bleu

Jaune

Aqx

Brut

BAW

Acide

acétique

1

0.82

Bleu

2 0.53

0.31

Vert

Jaune

Par le biais de ce système, nous avons pu mettre en évidence : cinq taches dans le

système d'acide acétique, et 3 taches dans le system BAW pour la fraction butanolique, et on a

constaté trois taches pour la fraction d'acétate d'éthyle dans les deux systèmes, et un tache

pour l'extrait aqueux dans le système BAW et deux taches dans le système acide acétique.

. Dans la phase méthanolique on a constaté trois taches dans le système BAW et

quatre taches dans l'autre système phase acétate d'éthyle. Les couleurs des taches pour tous les

extraits et variable entre le bleu et le jaune, et le vert avec une différence de valeur RF

(tableau 06). D'après ces résultats on observées quel le système d'acide acétique le meilleurs

que le système BAW pour la séparation. Les différences des valeurs de Rf sont dues à la

polarité des composés vis-à-vis du système d solvants d’élution et la phase stationnaire.

V.1.6.3 chromatographie sur papier C.P bidimensionnelle

Les conditions opératoires sont :

Pour la première dimension : BAW.

Pour la deuxième dimension: AcOEt 20 %.

Révélateur: UV 254/365 nm.


49

Photo 08: CP bidimensionnelle Extrait BuOH solvant acide acétique /BAW.

Photo 09 : CP bidimensionnelle Extrait AcOEt solvant acide acétique /BAW.

Les papiers obtenus présentent une bonne migration ; par conséquent une bonne

séparation qui permet l’analyse qualitative des composés flavoniques. Les taches sont bien

distinctes et montrent une richesse considérable de l’extrait analysé en substances

flavoniques. Les échantillons sont riches en flavones en premier lieu qui correspondent aux

tâches violettes, jaunes et bleues. Les résultats sont présentés dans le tableau12 ci –dessous :


50

Tableau08 : résultats de CP 2D de l'extrait butanolique et acétate.

Selon le tableau 08Par le biais de ce système, nous avons pu mettre en évidence : cinq taches

pour la fraction butanolique, et aussi pour la fraction acétate d'éthyle avec des couleurs

variée entre le bleu, jaune, vert, violet.

Les différences de longueur des taches sont dues à la polarité des composés. Ont démontré

que les deux extrait riche en composés flavoniques, particulièrement le flavone qui présenté

par couleur bleu.

V.1.7 Activité antimicrobienne

Les résultats de l'évaluation antimicrobienne des extraits sont repris ci-dessous figure

sont inclus les valeurs en (mm) zones ou diamètres d'inhibitions, représentant la grandeur du

halo formé par les microorganismes inhibés par l'activité antimicrobienne.

Extrait Couleur de taches Nombre de taches Suggestion des classes de

flavonoïdes Markham;1982

BuOH 2 Bleu

Vert

Jaune

Violet

5 Flavone

chalcone

Flavonol

Flavone

AcOEt Violet

Vert

Bleu

Bleu foncé

Jaune

5 Flavone

chalcone

Flavone

Flavone

Flavonol


51

Figure 25: Moyennes des diamètres des zones d'inhibition des extraits de spiruline relatives

aux différentes souches bactériennes.

La figure montre que l'extrait butanolique a manifesté une activité modérée contre les

bactéries. En revanche l'extrait aqueux a présenté une bonne activité vis-à-vis pseudomonas

aeuroginosa et E.coli, nous remarquons les autres extraits aucune une zone d'inhibition

contres ses souches. Notre résultat montre que l'extrait aqueux possède une activité plus

élevée que les autres.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

ATCC2592 ATCC ATCC29212 ATCC700603

Extrait BuOH

Extrait Aqx

Extrait AcOH

Extrait MeOH

Photo 10 : Effet des extraits de spiruline

sur Pseudomonas aeruginosa.

Photo11: Effet des extraits de spiruline sur

Enterococcus faecalis.


52

Photo12:Effet des extraits de spiruline sur

Escherichia coli.

Photo13: Effet des extraits de spiruline sur

Klebsilla pneumonie.

V.1.8 Activité antifongique

Les résultats de l'activité antifongique de nos extraits exploités dans l à figure26 :

Figure 26: Effet des extraits de spiruline sur le Fusarium oxysporum

Le plus grand diamètre de croissance mycélienne a été enregistré en absence des

extraits aqueux des plantes étudie (témoin) avec un diamètre de croissance de 80 mm. Le

diamètre de croissance mycélienne est inversement proportionnel aux extraits de spiruline

dans le milieu de culture.la plus grande zone a été montre dans l'extrait brute méthanolique

témoin positif

extrait MeOH

extrait Aqx extrait BuOH

extrait AcET

80

24,720

16

0

tau

x d

'inh

ibit

ion

en m

m


53

(27.7 mm), et on a enregistrée (0 mm) chez l'extrait acétate d'éthyle la plus efficace. On

constate que la spiruline possède une bonne activité antifongique.

Photo 14: Effet de l'extrait AcOEt sur le

Fusarium oxysporum

Photo 15: Effet de l'extrait MeOH brut sur le

Fusarium oxysporum.

Photo16: Effet de l'extrait Aqx sur le Fusarium

oxysporum.

Photo 17: Effet de l'extrait BuOH sur le

Fusarium oxysporum.


54

V.2 Dissucusion

Le Criblage chimique des extraits de spiruline est une étape préliminaire et d’une

grande importance, puisqu’elle révèle la présence des constituants connus par leur activités

physiologiques et possédant des vertus médicinales. [38]. Les recherches effectuées sur les

différents extraits révèlent la présence d’importants métabolites secondaires comme les

flavonoïdes, les stéroïde et les tannins, les composés volatils, ainsi les alcaloïdes ont

caractérisés les deux extraits de l'Arthrospira platensis. De point de vue biologique, selon

L.trabelsi et al., 2010, cette micro algue referme de principes potentiellement actifs

rencontrés comparable à celle des plantes. Ce sont des précurseurs de drogues très utiles en

thérapie clinique.

L'analyse quantitative a révélé des taux notables et variables en polyphénols et

flavonoïdes et tanins. Dans l'extrait méthanolique brut, qui montré taux les plus élevés de

polyphénols (1.25mgGAE/g). Les flavonoïdes se concentrent principalement dans l'extrait

butanolique (1.72 mg EQ/g). Par contre on a enregistrée une faible teneur en tanins dans les

différents extraits. Selon Mohamdi, 2013 L’Acétate d’éthyle, butanol et le méthanol, et

chloroforme sont utilisés pour le fractionnement de la charge en métabolites secondaires,

principalement celle de nature phénolique. Les résultats du dosage prouvent que l’essentiel de

ces métabolites se sont retrouvés dans les fractions organiques avec des proportions

différentes d’un échantillon à un autre. Cette distribution dépend de la nature des substances

phénoliques contenues dans chaque extrait, de leur solubilité et de la polarité de chaque

solvant.

La variabilité des teneurs en polyphénols, tanins, flavonoïdes chez ces espèces

végétales est les microorganismes photosynthétique est du probablement à la composition

phénoliques des extraits [46], aux facteurs génotypiques [47], les conditions biotiques

(espèce, organe et l’étape physiologique) et abiotiques (facteurs édaphiques) [48], la

composition du milieu de culture [3].

Diverses études ont déterminé expérimentalement les capacités des extraits naturelles

à piéger les radicaux libres [39]. Jusqu’à présent, il n’y a pas une méthode simple et

universelle par laquelle l’activité antioxydante est évaluée qualitativement et quantitativement

[3].Pour cette raison, nous avons combiné deux techniques complémentaires. Ce pendant, la

présence de ces substances indique que nos extraits et fractions sont dotés d’une activité


55

antioxydante. Les meilleurs antioxydants naturels sont les fractions butanolique les piégeurs

les plus efficaces du radical libre DPPH notre étude possédant les valeurs IC50 les plus basses:

la fraction butanolique 0.031mg/ml et fraction aqueuse 0.042mg/ml ont montré un bon

pouvoir de neutralisation du radical DPPH. Dans la méthode de FRAP les valeurs d’AEAC

obtenus dans ce test montrent que les extraits méthanolique butanolique de l'Arthrospira

possèdent de très fortes capacités réductrices (8.72 mg/ml) bien quelles sont supérieur à celle

du BHT.

Les résultats de l’analyse chromatographique ont permis de mettre en évidence la

présence de flavonoïdes dans les extraits des composés mais en différents par la

concentration en flavonoïdes (Intensité des taches).selon Montoro et al;, l’essai

d’identification des composés flavoniques par la chromatographie sur couche mince et sur

papier nous permis de conclure que les composés phénoliques identifiés dans les différents

extraits sont responsable de l’activité antioxydante et renforcent la capacité de ces extraits à

céder un proton pour réduire le DPPH et de libérer un électron pour réduire le fer .

L’activité antibactérienne des métabolites extracellulaires a été identifiée chez d’autres

cyanobactéries (Nostoc commune). Ce travail montre que cette activité est également présente

chez Arthrospira platensis. Elle serait cependant modérée en comparaison aux antibiotiques

usuels, tels que la kanamycine. Toutefois, il faut rappeler que ces métabolites sont efficaces

dans des traitements locaux d’infections épidermiques (oedème et eczéma), dans les

utilisations traditionnelles par les peuplades du Ghanem au lac Tchad [49].

Selon L.trabelsi et al. 2010 Il est important de constater, à ce niveau, l’action

sélective de ces métabolites en fonction de la nature membranaire de la bactérie cible. En

effet, sur les six souches étudiées l’activité antibactérienne n’est observée que sur les bactéries

Gram positives alors qu’elle est totalement absente chez les bactéries Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli et qui sont Gram négatives.

Les résultats obtenus dans notre le présent travail montrent que les souches qu'on

étudiées sont sensibles aux l'extrait aqueux par une zone de diamètre maximal 21 mm et la

zone minimal 15 mm des la spiruline, et aussi par une zone d'inhibition modère dans l'extrait

butanolique, la plus faible activité antibactérien enregistré dans l'extrait méthanolique et

l'acétate d'éthyle par une zone d'inhibition maximal 5 mm et 9 mm respectivement.


56

Cette différence serait due au fait que la sensibilité d'un microorganisme à une extrait

dépend non seulement de l'extrait, mais aussi du microorganisme lui-même et de

l'environnement ou se situe l'action [25].

D'après les résultats Mala et al.; 2009 Sur l'activité antibactérienne des différents

extraits de spiruline , l'extrait aqueux de spiruline montre a maximum de zone de diamètre 18

mm vis-à-vis Klebsiella pneumoniae, et la zone la plus minimal 10 mm vis-à-vis Proteus

vulgaris.tous les microorganismes a été testé sont résistée dans l'extrait méthanolique.

Les effets antifongiques des extraits spiruline peuvent être attribués aux différentes

substances phytochimiques on constate une bonne activité antifongiques chez tous les extraits

de spiruline particulièrement l'extrait acétate d'éthyle qui montre aucune zone de croissance

considère, c'est l'extrait la plus efficace, une croissance mycélien faible dans l'extrait

butanolique 16 mm , 24.7 dans l'extrait méthanolique, et 20 mm dans l'extrait aqueux

indiquent que notre micro algue elle possède une activité antifongique important.

Les composants des extraits tels que les terpènes affectent non seulement la

perméabilité mais aussi d'autres fonctions dans les membranes cellulaires. Ces composés

peuvent traverser les membranes cellulaires, pénètrent ainsi à l'intérieur de la cellule et

interagissent avec des sites critiques intracellulaires tels que les enzymes et les protéines, ce

qui conduit à la mort cellulaire [51].

Les flavonoïdes sont également responsables de l’inhibition des microbes résistants

aux antibiotiques. Ils sont responsables des processus de balayage ou chélateurs et peuvent

également perturber les membranes microbiennes. Par ailleurs, les alcaloïdes renferment un

effet détoxifiant et possèdent une très bonne activité antifongique [52].

Conclusion

Conclusion

57

Conclusion

La présente étude a porté sur le criblage chimique et l'activité biologique de

l'Arthrospira platensis. Elle a permis de mettre en évidence à travers un screening chimique la

présence des tanins, des flavonoïdes, des stérols et tri terpènes, des huiles volatiles, des

saponines et des alcaloïdes.

La première étape était la préparation de différents extraits de spiruline, notons les

deux extraits bruts aqueux et méthanolique aussi que trois extraits résultants de l’extraction

liquide-liquide avec différents solvants de polarités croissantes (chloroforme, acétate d’éthyle

et n-butanol).

Les extractions des différents métabolites sécondaires les plus abondant dans notre

cyanobactérie nous a permis de calculer le rendement de chaque extrait notamment l'extrait

aqueux brut, dont le rendement le plus remarquable est celui des les autres extraits (24,4 %).

Les résultats des dosages des phénols totaux, tanins, flavonoïdes des différents

extraits de spiruline : méthanolique brut, et aqueux brut, butanol et l'extrait d'acétate d'éthyle,

et extrait chloroformique a révélé des teneurs considérable en polyphénols pour l'extrait

méthanolique brut (1.25 EAG/mg de MS), ce extrait présent de teneur en tanins (0.03 EV/mg

de MS ),et en flavonoïdes(1.33 EQ/mg de MS), l'extrait butanolique présente de teneur en

polyphénols assez faible (0.18 EAG/mg de MS) par contre une teneur la plus élevée marqué

en flavonoïdes (1.72EQ/mg de MS) .

l'extrait aqueux brut présente une teneur en polyphénols et flavonoïde appréciable (

0.79 EAG/MG mg) de MS et( 0.5 EQ/mg) de MS respectivement.les plus faible teneur de

flavonoïde , tanins ,polyphénols représente dans les deux extraits chloroformique et acétate

d'éthyle avec des teneurs ne dépassent 0.01 mg de MS .

Nous avons constaté pour l’activité antioxydante par la méthode FRAP, que tous les

extraits de spiruline étudiée ont la capacité de réduire le fer qui augmente en fonction de la

concentration. Comme nous avons remarqué que l’extrait méthanolique brut présente une

capacité intéressante pour réduire le fer par rapport aux autres extraits, mais cette capacité est

à celle de l’acide ascorbique et BHA mais plus élevée para rapport BHT.

Conclusion

58

Cependant, pour le piégeage du radical libre DPPH● et en comparant les IC50 des

différents extraits par rapport à celle de l’acide ascorbique, BHT et BHA nous avons

remarqué une activité antioxydante très importante de la fraction butanolique (IC50 = 0,03

mg/ml) qui est supérieur à la capacité du piégeage du radical DPPH● de BHT (IC50 = 0,06

mg/ml).

Le pouvoir antibactérien, par le diamètre des zones d'inhibition obtenues au contact

les extraits, a manifesté une activité modérée contre ces bactéries. En revanche l'extrait

aqueux a présenté une bonne activité vis-à-vis les quatre bactéries étudiées.

Le pouvoir antifongiques vis-à-vis Fusarium oxysporum les extraits manifeste une

bonne activité contre ce champignon, nous remarquons que l'extrait acétate d'éthyle montre

une l'activité la plus élevée que les autres extraits.

En outre, l’analyse qualitative des flavonoïdes des deux fractions acétates d’éthyle et

1-butanol des trois parties de la plante par chromatographie sur papier grâce au système

d’élution choisi a révélé la présence des différents composés flavoniques.

En utilisant les méthodes chromatographiques : CCM gel de silice on a pu séparer les

constituants de chaque extrait en comparant le nombre, la couleur et le Rf des spots grâce au

système d’élution choisi.

Selon les résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons déduire que l'Arthrospira

platensis et riche en Phénols Totaux et en Flavonoïdes. Les extraits donnent une bonne

activité antioxydante, anti radicalaire, antibactérienne et antifongique.

Notre perspective d’avenir est d’étudier chaque extrait séparément puis isoler, purifier

et identifier les différents composés qui existent et tester leurs activités antioxydantes et

biologiques.

Référence bibliographique

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Criblage chimique et l’activité biologique de spiruline (Arthrospira platensis )

Résumé L'étude présente travail porté sur un screening chimique de spiruline visant à identifier les différentes familles des composés chimiques contenus.

Cinq extraits ont été préparés à partir de la biomasse de cette micro algue, méthanolique, chloroformique, butanolique, acétate d'éthyle, et aqueux. Les resultats

de l’étude quantitative de spiruline par dosage de polyphénols, flavonoïdes, tanins ;montrent que l'extrait chloroformique et acétate d'éthyle sont les plus pauvres

en polyphénols et en flavonoïdes que les autres extraits.

L'évaluation de L'activité antioxydante des extraits par la méthode (FRAP) et celle du DPPH a montré que l'extrait butanolique manifeste un pouvoir

antioxydant plus grand que les autres extraits, et l'extrait méthanolique brute a montré un pouvoir réducteurleplus important. L'analyse par chromatographie

CCM, et CP pour les différents extraits de spiruline, a montré une bonne séparation des différents composes phénoliques

Les tests des activités antimicrobiennes sur quatre souches bactériennes (Klebsilla pneumonie, Escherichia coli, pseudo Klebsilla pneumonie,

Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus faecalis ), et une souche fongique (Fusarium oxysporum). Montrent que l'extrait aqueux possède une

fort e activité antibactérienne avec des diamètres d’inhibition varient entre 15 a 20 mm en comparaison avec les autres extraits. L’activité antifongique del'extrait

acétate d'éthyleest plus forte que l'extrait butanolique, méthanolique, et aqueux.

Mots clés : Spiruline, screening chimique, pouvoir antioxydant, pouvoir antimicrobienne, pouvoir antifongique, CCM, CP.

Chemical screening and biological activiy of spirulina ( Arthrospira platensis)

Abstract:

The present study focused on spirulina chemical screening to identify different families of chemical compounds. Five extracts were prepared from the

biomass of this micro algae, methanol, chloroform, butanol, ethyl acetate, and aqueous. The quantitative study of spirulina per dosage of polyphenols, flavonoids,

tannins. The results show that the chloroform extract and the ethyl acetate are poorer in polyphenols and flavonoids other extracts.

Evaluation of the antioxidant activity of the extracts by the method (FRAP) and the DPPH showed that the butanol extract shows an antioxidant activity

larger than the other extracts. And crude methanol extract showed the largest reducing powerr. Analysis by TLC chromatography, and CP for the various extracts

of Spirulina showed good separation of various phenolic compounds.

The antimicrobial activity tests on four strains of bacteria (Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa , Entercoccus faecalis),

and a fungal strain (Fusariumoxysporum). Show that the aqueous extract has a strong antibacterial activity with inhibition diameters ranging from 15 to 20 mm in

comparison with the other extracts. The antifungal activity of the ethyl acetate extract is stronger than the butanol extract, methanol, and aqueous.

Keywords: Spirulina, chemical screening, antioxidant, antimicrobial power, antifungal potency, CCM, CP

(Arthrospira platensis )سبيرولينا الفحص الكيميائي و النشاط البيولوجي ل

:ملخص

حى إعذاد خست يسخخهصاث ي انكخهت انحت يسخخهص انثال، . ركزث ذ انذراست عه انفحص ي انكائ نسبزنا نخحذذ عائالث يخخهفت ي انزكباث انكائت

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أظزث انخائح أ انسخخهص اظز انبخان اظز قة )(DPPH) كذا حفخخ اندذر انر(FRAP)ا حقذز انشاط انضاد نألكسذة نهسخخهصاث بطزقخ إرخاع انحذذ

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Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus faecalis ,. نهفطزاثدانشاط انضا كذ (fusaruim oxysporum ) بج أ انسخخهص انائ نذ شاط يضاد نهبكخزا قت يع

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CCM, CP ,يضاد انشاط انفطز,يضاد انشاط انبكخز ,يضاد نالكسذة , انفحص انكائ , سبيرولينا:الكلمات المفتاحية

thème · chapitre iv : matériels et méthodes ... v.1.5.2 méthode de la réduction de fer (frap)...

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