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Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire Ministre de lEnseignement Suprieur et de la Recherche Scientifique

Universit Constantine 1

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie Dpartement de Biochimie et Biologie Cellulaire et Molculaire

Mmoire pour lobtention du diplme de

Master en Biochimie

Option : Biochimie Molculaire et Sant

Thme

Soutenu le 22 juin 2014

Ralis par :

MelleMEGUENANI Karima

Melle ZEBILA ASMA

Devant le jury:

Prsident : BENSEGUENI A. Professeur Universit Constantine 1.

Rapporteur : CHIKHI A. Professeur Universit Constantine 1.

Examinateur : MOKRANI E .H. Matr assistant B lUniversit Constantine 1.

- Session Juin 2014 -

Inhibition in silico de la Shikimate 5-Dshydrognase (aroE) de

Helicobacter pylori pour combattre lulcre.

Remerciements

Au premier lieu, nous remercions Dieu le tout puissant pour son

aide, de nous avoir donn volont, courage et patience.

Nos remerciements les plus chaleureux et les plus vifs sadressent

dabord notre promoteur, Monsieur CHIKHI A. Professeur

Universit Constantine 1 a davoir accept de nous encadrer

ainsi que pour son entire disponibilit ainsi que ses grandes

aides, orientations et conseils et que sans lui, le prsent travail ne

serait jamais abouti.

Nous tenons remercier aussi Monsieur BENSEGUENI.A.

Professeur Universit Constantine 1 de nous avoir consacrer

de son temps et nous faisons lhonneur de prsider les jury.

Mes remerciements vont aussi Monsieur MOKRANI E .H.

Matre assistant lUniversit Constantine 1. Pour avoir

accept de juger ce travail.

Nous remercions galement, trs sincrement :

Nos enseignants pour leur soutient et leur dvouement durant

toutes nos annes dtudes.

Sans oublier de remercier nos trs chers parents.

Nous tmoignons notre reconnaissance toute personne ayant contribu de prs ou de loin la ralisation de notre mmoire.

Ddicaces

A ma trs chre maman, pour m'avoir toujours coute, pour son

soutien moral et ces prcieux conseils ;

A mes surs : Hala, Faten ;

A Mon adorable frre : Abderrahmane ;

A mon cher ami Oussama qui ma encourag, qui ma donn la force et

la volont de surmonter tous les obstacles et les difficults ;

A mon amie et ma binme : Karima et toute sa famille ;

A mes Cousins et mes Cousines ; Lilia ; Mina ; Radia ; Sara ;

Sofiane ;

A mes amis les plus fidles ; Khaoula 1 ; Khaoula2 ; Rima ;

A tous mes amis de la promotion de master en biochimie ;

A la mmoire de mon regrett pre ;

Et pour finir, je prsente davance mes excuses ceux dont jaurais

oubli de citer le nom : ma mmoire peut me jouer de tours, mais ceci

ne change rien la considration que jai

Et que jaurais toujours pour chacun de vous.

Asma

Ddicaces

Cest avec une grande joie que je ddie ce modeste travail, fruit de mes tudes

en exprimant ma profonde gratitude tous mes proches particulirement :

A ma mre : Fella , la tendresse, la sympathie et le sacrifice, qui ma toujours orient pour le meilleur ;

Amon pre : Mahmoud qui ma inculqu le courage, lespoir et ma permis

datteindre mes objectifs, il a t dun grand secours par son soutien et sa

prsence pendant les moments difficiles ;

A mes chres surs : Oumeima et Abir ;

A mon chre frre: Mohamed Seif Elddinne ;

Mon affection pour vous est sans limite, votre soutien a sans doute t important

pour le bon droulement de mes tudes ;

A tout ma famille grand et petit chacun avec son nom ;

A tout mes amies surtout : Hadjer, Rokia, Meriem et Amira......

A mon binme Asma qui a partag avec moi les moments difficiles de ce travail

et sa famille ;

A toutes les personnes ayant particip ce travail, se serait-ce que par un petit mot dencouragement ou mme un petit sourire.

Karima

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION .....1

CHAPITRE 1 : Revue bibliographique

I. LULCERE GASTREQUE PAR HELICOBACTER PYLORI. 3 1.LULCERE ........................................................................................................................... 3

1.1.Gnralits .................................................................................................................... 3

1.2.Dfinition ....................................................................................................................... 3

1.3. Epidmiologie .............................................................................................................. 4

1.4. Facteurs aggravant lulcre gastrique .......................................................................... 5

1.5. Causes de lulcre gastrique ........................................................................................ 5

2. HELICOBACTER PYLORI ................................................................................................. 6

2.1. Gnralits .................................................................................................................... 6

2.2. Dfinition de H.pylori................................................................................................... 6

2.3. Taxonomie d H.pylori .................................................................................................. 8

2.4. Facteurs majeurs de virulence ...................................................................................... 8

2.5. Adaptation d H.pylori au milieu ................................................................................. 8

2.6. Le cycle de vie (pathognie) de l H.pylori ................................................................... 8

2.7. Transmission d H.pylori ............................................................................................... 9

2.7.1. Transmission oro-orale ............................................................................................ 9

2.7.2. Transmission fco-orale .......................................................................................... 9

2.7.3. Transmission par le matriel d'endoscopie ............................................................. 10

2.8. Maladies provoques par H.pylori .............................................................................. 10

2.9. Traitements de H.pylori ............................................................................................... 10

II. LA SHIKIMATE 5-DEHYDROGENASE ......................................................................... 11

1. GENERALITES ............................................................................................................... 11

2. DEFINITION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE ......................................... 11

3. FONCTION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE ........................................... 12

4. LA REACTION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE ..................................... 12

5. LA MODE DACTION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE .......................... 13

5.1. Le domaine N terminal ................................................................................................. 13

5.2. Le domaine C terminal ................................................................................................. 13

file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151947file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151948file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151949file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151950file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151951file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151952file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151953file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151954file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151955file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151956file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151957file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151958file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151959file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151960file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151961file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151962file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151963file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151964file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151965file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151966file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151967file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151968file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151969file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151970file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151971file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151972file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151973file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151974

6. LES INHIBITEURS DE SHIKIMATE DEHYDROGENASE ...................................... 14

CHAPITRE 2:LE DOCKING MOLECULAIRE

1. INTRODUCTION ............................................................................................................. 16

2. DIFINITION DE DOCKING MOLECULAIRE .............................................................. 16

3. PRINCIPE DE DOKING .................................................................................................. 16

4. PRINCIPE THEORIQUE................................................................................................. 17

5. LES INTERACTIONS PROTEINE-LIGAND ................................................................ 17

6. LES PROGRAMMES DE DOCKING MOLECULAIRE ............................................... 19

7. EVALUATION DES PROGRAMMES DE DOKING ................................................... 21

CHAPITRE 3 : MATERIEL ET METHODES

1.MATERIEL ........................................................................................................................ 22

2.METHODES ...................................................................................................................... 22

2.1. Banque de donnes protiques Protein Data Bank ................................................ 22

2.2. Le protocole dutilisation des logiciels ...................................................................... 22

2.2.1. ArgusLab ............................................................................................................... 22

2.2.2. Surflex ...........23

2.3. Le test de fiabilit des logiciels ......25

2.3.1. RMSD (root mean square deviation) .................................................................... 25

2.3.2. Coefficient de corrlation ...................................................................................... 25

3. INHIBITION DE LENZYME DU COMPLEXE 3PHH ............................................... 26

3.1. Choix du complexe 3PHH ......................................................................................... 26

3.2. Calcul des interactions enzyme- composs substitus ......................................... 27

3.2.1. Les mono-substitutions ......................................................................................... 28

3.2.2. Les bi-substitutions ..........29

CHAPITRE 4 : RESULTAT ET DISCUSSION

1.TESTS DE FIABILITE DES PROGRAMMES DE DOCKING ...................................... 31

1.1. Le test RMSD .............................................................................................................. 31

1.2. Lanalyse visuelle ....................................................................................................... 33

1.3. Le coefficient de corrlation (r) ................................................................................ 35

file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358151975file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152002file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152003file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152004file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152005file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152006file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152007file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152008file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152095file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152096file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152097file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152099file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152100file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152101file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152095file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152096file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152097file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152099file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152100file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152095file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152096file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152097file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152099

2.INHIBITION DE LENZYME DU COMPLEXE 3PHH .................................................. 36

2.1. Mono-substitution...........38

2.2. Bi-substitution.........40

3. EDUDE DES INTERACTIONS ENTRE LE CURCUMIN ET SHIKIMATE

DEHYDROGENASE ............................................................................................................. 40

4. ETUDE DES INTERACTIONS DES COMPLEXES SDH-DERIVES SUBSTITUES .. 42

CONCLUSION ....47

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXES

RESUMES

file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152100file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152101file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152101file:///C:/Users/Oumeima/Downloads/admine/mona/sommairesM&O.docx%23_Toc358152095

LISTE DES TABLEAUX

Tableau01 : Les principeaux programmes de docking molculaire.. .................................................... 20

Tableau02 : Les mono-substitutions du curcumin ................................................................................ 28

Tableau 03: Les bi-substitutions du curcumin ...................................................................................... 29

Tableau04 : Rsultats de lanalyse par rgression linaire. ................................................................... 35

Tableau 05 : Les proprits pharmaceutiques de curcumin. ................................................................. 37

Tableau 06 : Les affinits des meilleurs composs substitus ,le curcmin et le substrat . .................... 38

Tableau 07 :Table dapplication de la rgle de Lipinski sur les 4 composs. ...................................... 46

LISTE DES FIGURES

Figure 01 : Reprsentation dulcre gastrique. ........................................................................................ 3

Figure 02 : Reprsentation chmatique des pertes de substencesgastrique non tumorales. .................... 4

Figure 03: hlicobacter pylori. ................................................................................................................ 6

Figure04 : photo dune H.pylori en microscopie lctronique ................................................................ 7

Figure 05 :H.pylori au niveau des cellules hpithliales gastrique ......................................................... 7

Figure 06 :Raction de la chikimate dehydrognase ............................................................................. 13

Figure 07 :Le domaine C de chikimate dehydrognase ........................................................................ 14

Figure 08 :Les inhibiteurs de shikimate dehydrognase ....................................................................... 14

Figure 9: Les forces de Van Der Vaals. ................................................................................................ 18

Figure 10:La liaison hydrogne. ............................................................................................................ 19

Figure 11:Les diffrentes liaisons hydrognes ...................................................................................... 19

Figure 12: Structure du curcumin. ......................................................................................................... 27

Figure 13: Superposition de linhibiteur et final-0 calcul par Surflex du complexe 3ITI.. ................. 34

Figure 14: Superposition de linhibiteur et final-0 calcul par Surflex du complexe 4BUL................. 34

Figure 15: Corrlation entre lactivit biologique (PIC50) des diffrents complexes et leurs Affinits donnes par Surflex. ............................................................................................................................. 36

Figure 16: Les positions cibles lors de la Substitution. ....................................................................... 38

Figure 17: Le meilleur mono substitu (compose37).. .......................................................................... 39

Figure 18: Affinit de compos 37 par le Surflex.......39

Figure 19: Les meilleurs drivs bi-substitus (compos 44, compos101, compos103).. ................ 40

Figure 20: Illustration du positionnement de l'inhibiteur curcumin dans le site actif de shikimate dshydrognase ..................................................................................................................................... 41

Figure 21: Le curcumin dans la shikimate dshydrognase.......41

Figure 22: Reprsentation des liaisons hydrogne formes par la SDH et le compose 37................... 42

Figure 23: Reprsentation des liaisons hydrogne formes par la SDH et le compose 44................... 43

Figure 24: Reprsentation des liaisons hydrogne formes par la SDH et le compos 101.................. 44

Figure 25: Reprsentation des liaisons hydrogne formes par la SDH et le compos 103.................. 45

LISTE DES GRAPHES

Graphe 01 : Rsultats en % obtenus par ArgusLab deux intervalles de RMSD (). ........................ 32

Graphe 02 : Rsultats en % obtenus par Surflex deux intervalles de RMSD ().. ........................... 32

Graphe 03: Comparaison des deux programmes.. ................................................................................. 33

LISTE DES ABREVIATIONS

3D: Trois dimensions. : Angstrm. ADME/Tox : Absorption, Distribution, Mtabolisme, Excrtion et de Toxicit. AINS : Anti-inflammatoires Non Strodiens. CMI : concentration minimale inhibitrice. H .PYLORI: Helicobacter pylori. IC50: Inhibitory Concentration 50.

IPP : Inhibiteur de la Pompe Proton. logP : Le coefficient de partition Eau/Octanol.

NCBI: National Center for Biotechnology Information.

PDB: Protein Data Bank.

PH : potentiel hydrogne. r : Coefficient de corrlation linaire. RMN : Rsonance Magntique Nuclaire.

RMSD: Root Mean Square Deviation.

SDH : Shikimate dshydrognase.

INTRODUCTION

Inhibition in silico de la Shikimate 5-Dshydrognase (aroE) de Helicobacter pylori pour combattre lulcre 1

Les interactions protine-ligand jouent un rle important dans les systmes vivants o elles participent la rgulation de certains mcanismes biologiques [1, 2], la transmission des signaux [3] ou la catalyse de diffrentes ractions biochimiques [4, 5, 6]. La conception de nouveaux composs chimiques ayant des proprits bioactives require des tudes exprimentales quantitatives de leur efficacit. Llaboration d'un protocole reproductible pour estimer cette efficacit in vitro et in vivo est parfois trs difficile raliser sur le plan biologique. A titre dexemple, la mise sur le march dun mdicament ncessite

entre 12 et 15 ans de travail et cote prs dun milliard de dollars [7, 8]. Tenter les exprimentations au laboratoire demanderait trop dinvestissements au niveau conomique,

temps et travail. La simulation in silico (docking molculaire) entre lenzyme et le ligand, de part son cot peu onreux et sa rapidit se mettre en uvre, reste une bonne alternative qui permet la recherche dans le domaine du mdicament davancer plus vite.

Le docking molculaire vise prdire la formation du complexe le plus stable rsultant de la protine et du ligand pris sparment. Lavantage essentiel de cette approche est de mettre en vidence les proprits lectroniques, structurales et nergtiques de larchitecture

molculaire ainsi constitue.

Il a longtemps t considr que le stress tait la cause principale de lulcre. Les gurisons taient donc rares et la maladie le plus souvent chronique, touchant environ 10% de la population. Mais cette situation a t radicalement modifie au dbut des annes 1980 par Barry J. Marshall et J. Robin Warren, deux chercheurs Australiens. En effet, leurs travaux ont dmontr que la majorit des ulcres gastroduodnaux sont dus la prsence d'une bactrie qu'ils ont dcouverte et isole : Helicobacter pylori. Cette ide a fini par s'imposer, non sans rsistance, et les traitements proposs de nos jours sont bass sur une antibiothrapie. En soignant la cause, ils permettent non seulement de diminuer les symptmes mais surtout d'obtenir frquemment une gurison.

La prise en charge de linfection par Helicobacter pylori a volu ces dernires annes. Les indications de la recherche et du traitement de linfection ont t prcises. La place des

diffrentes mthodes directes ou indirectes de la recherche de linfection par H. pylori est maintenant bien dfinie [9,10]. Lenzyme, la shikimate dshydrognase est utilise comme une cible intressante pour dvelopper de nouveaux antibiotiques car elle est essentielle la survie de la bactrie Helicobacter pylori. Lobjectif du prsent travail est, dans un premier temps, de tester la fiabilit du programme Surflex utilis dans cette tude : le premier test consiste calculer la dviation en angstrms ou RMSD entre la gomtrie du ligand conue par le logiciel et celle dtermine

INTRODUCTION

Inhibition in silico de la Shikimate 5-Dshydrognase (aroE) de Helicobacter pylori pour combattre lulcre 2

exprimentalement, le deuxime test consiste calculer le coefficient de corrlation entre laffinit des interactions obtenues par docking des molcules retenues dans cette tude et les

valeurs exprimentales de leurs IC50. Dans la deuxime partie, nous tudierons linhibition de le shikimate dshydrognase par les mthodes de docking molculaire. Nous nous intresserons dterminer le mode dinteraction, lors de la fixation de certains drivs substitus lenzyme durant la formation

du complexe shikimate dshydrognase-inhibiteur, avec une meilleure complmentarit par le calcul de laffinit du complexe form. Enfin dans un troisime temps nous tenterons de proposer, la lumire des rsultats prcdents, des structures nouvelles avec une meilleure affinit vis--vis de la shikimate dshydrognase en vue de dcouvrir de nouveaux antibiotiques. Ces rsultats aideront, probablement, au dveloppement dun outil thrapeutique efficace dans la lutte contre lulcre gastrique.

CHAPITRE 1: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

Inhibition in silico de la Shikimate 5-Deshydrognase (aroE) de Helicobacter pylori pour combattre lulcre 3

I. LULCERE GASTREQUE PAR HELICOBACTER PYLORI 1. LULCERE

1.1. Gnralits

Lulcre peptique dsigne un ensemble daffections ulcreuses de la partie suprieure du tube digestif touchant essentiellement lestomac et la partie initiale de duodnum (bulbe), et dans lequel la participation de lacide et de la pepsine dans leur pathognie est fondamentale [11]. La muqueuse gastroduodnale saine est capable de rsister des agressions tant endognes quexognes. Cette tolrance est le fait de protections naturelles par dfenses de barrire

muqueuse, la barrire muqueuse est constitue de lassociation du film de mucus et de la

scrtion de bicarbonates [12]. Un ulcre survient lorsque cette couche protectrice est endommage. En gnral les maladies de l'estomac sont soit des maladies de la paroi de l'estomac: inflammation, ulcre, tumeur; soit des problmes lis au contenu de l'estomac [13].

1.2. Dfinition

L'ulcre gastroduodnal est une maladie chronique rcidivante. C'est en fait un cadre nosologique dans lequel on intgre des affections se traduisant par une perte de substance d'un revtement pithlial cutan ou muqueux sans tendance la cicatrisation spontane et entamant la paroi gastrique ou duodnale. En ralit, l'ulcre duodnal ou gastrique rsulte d'un dsquilibre entre des facteurs d'agression (scrtion acide et peptique) et des facteurs de dfense (mucus, pithlium de surface...) [14].

Figure01 : Reprsentation dulcre gastrique.



Lulcre de lestomac, aussi appel ulcre gastrique, et lulcre duodnal, qui se forme dans le duodnum (premire partie de lintestin grle), sont des plaies ouvertes dans la

muqueuse, superficielle ou profonde. Ils saccompagnent de douleurs labdomen dues au contact entre lacide de lestomac et les plaies[14].

Figure 02 : Reprsentation schmatique des pertes de substances gastrique non tumorales.

Les ulcres dbutent lorsque les sucs digestifs acides altrent le mucus protecteur qui tapisse la muqueuse exposant ainsi le tissu sous-jacent une bactrie appele Hlicobacter pylori (H.pylori) qui possde la capacit exceptionnelle de survivre dans lenvironnement acide de lestomac. La prsence de cette bactrie et son rle ont t identifis pour la premire fois en 1982. Un second type dulcre peut survenir chez les patients recevant des anti-inflammatoires non strodiens (AINS). Malheureusement, ces mdicaments diminuent la synthse du mucus qui, normalement, protge la paroi interne de lestomac et du duodnum. Linfection H. pylori serait la cause de 95% des ulcres duodnaux et de 80% des ulcres gastriques; les AINS sont responsables de la plupart des autres cas [15]. 1.3. Epidmiologie La maladie ulcreuse gastroduodnale touche presque 10 % de la population, avec une incidence globale de 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants. Lulcre du bulbe est plus

frquent chez lhomme (sex ratio 3/1), la parit est respecte pour lulcre gastrique. En dtail, la maladie ulcreuse duodnale a une incidence annuelle de 60 80 000 nouveaux cas par an.



H.pylori est alors retrouv dans la muqueuse gastrique 9 fois sur 10. Lincidence annuelle de la maladie ulcreuse gastrique est quatre fois plus rare (jusqu 20 000 cas par an), une infection H.pylori est retrouve 7 fois sur dix. La prise danti- inflammatoires non strodiens augmente de 3 5 fois le risque dulcre gastro-duodnal, lincidence annuelle est de 1 cas pour 100 patients traits par an. La survenue de lsions gastriques ou duodnales sous AINS est de 5% cours terme et de 30% en cas de traitement prolong. Les traitements par inhibiteurs spcifiques de la COX 2 rduisent le risque dulcre symptomatique, ce bnfice est annul en cas de prise concomitante daspirine faible dose [16].

1.4. Facteurs aggravant lulcre gastrique

Le tabagisme. La consommation excessive d'alcool. Le stress. Chez certaines personnes, lalimentation aggrave les symptmes d'ulcre, on peut

citer : Boissons : le caf (mme dcafin), le th, le lait, les boissons a base de

cola. Aliments : les aliments gras, dont le chocolat et les concentrs de viande. Epices : le poivre noir, les graines de moutarde et la muscade.

1.5. Causes de lulcre gastrique

La cause la plus frquente d'un ulcre gastrique ou d'un ulcre gastro-duodnal est une infection de la paroi de l'estomac par la bactrie H.pylori (entre 75% et 80%). Des causes plus rares incluent la consommation de certains mdicaments antalgiques et anti-inflammatoires. Le stress physique et d'autres troubles peuvent galement tre l'origine des ulcres gastriques et gastro-duodnaux.

L'identification de la bactrie H.pylori comme cause du dveloppement de l'ulcre gastrique et de l'ulcre duodnal a t une dcouverte importante de ces dernires annes. Des donnes officielles montrent que 35% environ de la population d'Europe occidentale est touche par l' H.pylori, mais seulement 10% des cas d'infections dveloppent une gastrite, des ulcres gastriques ou gastro-duodnaux.

Les causes externes qui contribuent l'atteinte de la paroi de l'estomac mais dont le rapport direct avec le dveloppement d'un ulcre gastrique n'a pas encore t prouv sont la nicotine, l'alcool, les mdicaments et le stress d aux nuisances sonores ou la profession exerce [1].



2. HELICOBACTER PYLORI

2.1. Gnralits

L'intrieur de l'estomac baigne dans environ un demi-gallon de jus gastrique chaque jour. Le jus gastrique est compos d'enzymes digestives et d'acide hydrochlorique concentr, qui peut aisment dchirer l'alimentation la plus dure ou le microorganisme. Les bactries, des virus et le dner de bifteck d'hier sont tous consomms dans ce bain mortel de produits chimiques. On a dj pens que l'estomac ne contenait aucune bactrie et tait en ralit strile, mais la bactrie H.pylori a chang cela. Normalement la haute concentration acide dans l'tendue digestive empche des bactries de survivre dans cet environnement.

Avant 1982 o on n'avait pas encore dcouvert la bactrie, les ulcres taient gnralement associs au stress, l'acide, l'alimentation pice et un style de vie malsain. Les ulcres ont t traits en prescrivant des mdications long terme qui traiteraient et diminueraient les symptmes et guriront peut-tre l'ulcre, mais ne guriraient pas l'infection. Quand les mdicaments ne sont plus pris, les ulcres reviennent. Une fois que l'on l'a dcouvert que la majorit d'ulcres a t lie avec une infection bactrienne, on pourrait recommander les mdicaments appropris afin d'liminer l'infection avec une petite chance du retour d'ulcres [17].

2.2. Dfinition de H.pylori

H. pylori est un pathogne qui colonise slectivement lpithlium gastrique humain. Cest un bacille Gram-ngatif spirale mesurant 2 4 m de long et 0,5 1 m de large et qui peut galement exister sous une autre forme ronde dite coccoide viable mais non cultivable [18].

H. pylori est une bactrie micro arophile, urase, catalase et oxydase positives. Elle possde 3 a 5 flagelles polaires et en gaines confrant une motilit et permettant un mouvement rapide dans la muqueuse gastrique visqueuse lui assurant ainsi une meilleure colonisation [19] .

Figure03 : Hlicobacter pylori.



H. pylori rsiste lacidit gastrique en hydrolysant lure en ammoniac, grce son urase. Elle est galement capable de rsister au stress oxydatif gnr par la rponse immunitaire grce la catalase ainsi que dautres lments de dfense tels que la superoxide dismutase et lalkylhydroperoxide rductase [20].

Figure04 : Photo d'une H. pylori en microscopie lectronique.

Figure05 : H.pylori au niveau des cellules pithliales gastriques.

H. Pylori ont t classifi comme la Classe I cancrigne par l'Organisation Mondiale de la sant et malgr la prsence rpandue des maladies attribuables aux organismes, on en connat peu de leur mode de transmission et de l'cologie microbienne [21].



2.3. Taxonomie d H.pylori H. pylori est une bactrie de forme hlicodale dcouverte dans une zone de lestomac proche du pylore, do son nom. Elle est classe dans le rgne des Bacteria, la division

Proteobacteria, la classe Epsilonproteobacteria, l'ordre des Campylobacterales, la famille Helicobacteraceae, le genre Helicobacter et l'espce H.pylori [22]. 2.4. Facteurs majeurs de virulence

H. pylori possde une multitude de facteurs de virulence cods par des gnes dont le polymorphisme est la base dun dterminisme pathologique plus ou moins svre. Ces facteurs de pathognicit peuvent dclencher et moduler la nature de la rponse inflammatoire et altrer lintgrit de la muqueuse gastrique confrant cette bactrie un caractre carcinogne et pro-inflammatoire. H. pylori colonise trs efficacement la muqueuse grce sa motilit, son chimiotactisme, sa rsistance lacidit gastrique et sa capacit dadhsion aux cellules pithliales. La persistance de linfection par H. pylori est rendue possible par des stratgies dchappement aux dfenses immunitaires incluant des mcanismes enzymatiques, des capacits faire varier les motifs antigniques prsents sa surface et le relargage dantignes immun-dominants servant de leurres aux anticorps [23].

2.5. Adaptation d H.pylori au milieu La grande mobilit et la morphologie spirale de H. pylori lui permettent de traverser le mucus beaucoup mieux que les autres germes. H. pylori est aussi sensible que les autres bactries l'acidit gastrique, cependant, on a montr qu'en prsence d'ure, il restait viable 2 heures dans un milieu PH 2. Cette rsistance est due sa puissante urase qui, en hydrolysant l'ure normalement prsente dans l'estomac, libre de l'ammoniac qui tamponne l'acidit du milieu suffisamment longtemps pour permettre la bactrie de gagner, travers le mucus, les cellules muqueuses gastriques, l o le PH est voisin de la neutralit [18]. La raction d'hydrolyse d'ure est importante pour le diagnostic de H. pylori par test respiratoire. 2.6. Le cycle de vie (pathognie) de l H.pylori H.pylori est capable de survivre dans lacide de lestomac car il produit des enzymes qui neutralisent lacide. Ce mcanisme permet aux bactries de se loger dans le mur protecteur muqueux de lestomac. Quand la bactrie est dans le mur muqueux, les dfenses naturelles du corps ne peuvent latteindre. Le systme se dfendra contre linfection, mais il ne sera pas capable de

tuer les bactries puisquelles sont dans le mur muqueux de lestomac. Le systme

immunitaire continuera se battre en envoyant des substances nutritives aux combattants de



lestomac, mais H. pylori se nourrira de ses substances nutritives lui permettant ainsi de survivre dans lestomac. Les bactries affaiblissent le mur muqueux de lestomac. Lacide et les bactries irritent lestomac entrainant ainsi la gastrite (inflammation de lestomac) et peut aussi causer des

ulcres quelques jours aprs linfection initiale. Ironiquement ce ne sont pas les bactries H. pylori qui causent les ulcres mais bien les bactries de linflammation [24].

2.7. Transmission d H.pylori

Le rservoir exclusif de H. pylori est l'estomac de l'homme. Plusieurs animaux qui avaient t considrs comme des rservoirs potentiels (porc, chat, mouton, singe) sont maintenant disculps. Les mouches et les cafards pourraient tre impliqus si la bactrie tait limine en quantit importante et sous forme viable dans les selles.

Les sources de contamination potentielles sont les vomissures, la salive et les selles. Chez les sujets infects, H. pylori est toujours prsent au niveau des vomissures et va survivre quelques heures dans l'environnement. La salive est parfois positive, du fait de rgurgitations, mais les selles ne renferment des formes viables qu'en cas de transit acclr et de manire inconstante. La transmission survient essentiellement dans l'enfance et est le plus souvent intrafamiliale. Cependant, il a pu tre dmontr, que la bactrie peut survivre pendant 30 heures chez des mouches domestiques. De ce fait, on pense qu'il est possible qu'il y ait des rservoirs dans l'environnement et que des mouches ou d'autres insectes puissent transmettre le germe de faon indirecte par l'intermdiaire d'aliments ou d'eau potable. De plus H. pylori a pu tre mis en vidence dans l'estomac de chats et d'autres animaux domestiques, alors que leur rle dans la transmission de la bactrie n'est pas prcis et est probablement d'importance mineure [25]. 2.7.1. Transmission oro-orale Cest le mode prdominant de transmission des Helicobacter chez l'animal; chez l'homme, le visage de l'enfant en contact troit avec celui des adultes qui l'entourent, est hautement expos leurs projections salivaires. 2.7.2. Transmission fco-orale L'hypothse de la contamination partir des selles a t longtemps carte, du fait que l'excrtion fcale de la bactrie est difficile mettre en vidence, en raison des concentrations bactriennes infrieures celles desmicro-organismes pathognes, habituellement rencontrs. En fait, contrairement ces derniers, H. pylori n'est pas dgrad dans l'estomac mais il y est mtaboliquement stimul par activation de son urase. Il est donc possible, que des doses faibles soient infectantes.



2.7.3. Transmission par le matriel d'endoscopie On peut certainement contaminer un sujet au cours d'une endoscopie digestive haute, ce risque de transmission de H. pylori est un des motifs de dsinfection du matriel endoscopique entre deux examens [26]. 2.8. Maladies provoques par H.pylori

L H.pylori a t associ beaucoup de maladies comme des ulcres duodnaux, ulcres gastriques, cancer de lestomac et la dyspepsie (indigestion). Cette infection a t aussi lie

aux gastrites (inflammation de lestomac) chez les adultes et les enfants. Les personnes infectes ont plus de risques davoir le cancer de lestomac et avoir des lymphomes (tumeurs

malignes dans les tissus lymphatiques). Si lulcre cause vraiment un saignement, le saignement prolong peut provoquer lanmie menant des faiblesses et de la fatigue. Si les saignements sont importants (vomissement de sang ou excrments contenant du sang), il peut y avoir dimportants problmes [27].

2.9. Traitements de H.pylori

Puisque nous savons maintenant que la plupart des ulcres sont causs par H. pylori, des rgimes antibiotiques appropris peuvent supprimer l'infection avec succs chez la plupart des patients, avec la rsolution complte d'inflammation muqueuse et une chance minimale pour la rptition d'ulcres. La thrapie pour l'infection H. pylori dure de 10 jours 2 semaines d'un ou deux antibiotiques efficaces, comme l'amoxicilline, tetracycline ( ne peut pas tre utilis pour des enfants < 12 ans.), metronidazole, ou clarithromycin, plus citrate de bismuth ranitidine, bismuth subsalicylate, ou un inhibiteur de pompe de proton. La suppression acide par le H2 blocker ou l'inhibiteur de pompe de proton en accord avec les aides d'antibiotiques soulage des symptmes concernant l'ulcre (c'est--dire, la douleur abdominale, la nause), les aides gurissent l'inflammation muqueuse gastrique et peuvent augmenter l'efficacit des antibiotiques contre H. pylori la surface muqueuse gastrique. La rsistance antibiotique et le refus d'obissance des patients sont les deux raisons majeures de l'chec de traitement. En gnral des rgimes de thrapie triples ont montr des meilleurs taux d'extermination que la thrapie duelle. La dure plus longue de traitement (14 jours contre 10 jours) aboutit aux meilleurs taux d'extermination.

Un traitement aux antibiotiques entranera, dans 9 cas sur 10, la disparition de la bactrie de votre estomac: vous serez alors jamais guri de la maladie ulcreuse qui vous assaillait depuis de nombreuses annes. Les combinaisons d'antibiotiques pour traiter les ulcres sont varies. On les accompagne galement de mdication antiacide. Le but du traitement est de dtruire la bactrie et de redonner votre estomac des conditions optimales de gurison [28].

http://www.servicevie.com/fievre-et-maladies-infectieuses/prescrit-on-trop-d-antibiotiques/a/695



Les personnes infectes par le H. pylori reoivent habituellement une trithrapie qui dure en tout de 7 14 jours.

La trithrapie comprend un inhibiteur de la pompe protons (IPP) et deux antibiotiques :

Le mdicament appel IPP rduit la production dacide dans lestomac, ce qui permet aux tissus endommags par linfection de gurir.

Les antibiotiques aident sassurer que le traitement soit efficace.

Linfection H. pylori ragit habituellement au traitement. Le traitement gurit linfection H. pylori chez 80 90 % des gens.

Pour certains spcialistes les trithrapies probabilistes ne sont plus suffisamment efficaces et adaptes pour rester recommandes (rsistance aux antibiotiques) et un traitement squentiel associant trois antibiotiques est ncessaire.

IPP double dose en 2 prises pendant 10 jours. Amoxicilline 1g matin et soir pendant les 5 premiers jours. Puis Clarithromycine500mg matin et soir + Trinidazole500mg matin et

soir les 5 jours suivants [29].

II.LA SHIKIMATE 5-DEHYDROGENASE

1. GENERALITES

La voie du shikimate est prsente uniquement chez les bactries, les champignons et les plantes. Les animaux ne possdent pas cette voie mtabolique, ceci ayant pour consquence Que les acides amins aromatiques doivent faire partie intgrante de leur alimentation. La spcificit de ce mtabolisme aux microorganismes et aux plantes suprieures a conduit la recherche et lobtention de nouveaux antibiotiques et herbicides ayant pour cibles molculaires des enzymes intervenant dans cette voie [30].

2. DEFINITION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE

Shikimque 5-dshydrognase (SDH) est la quatrime enzyme dans la voie shikimique et a t tudi abondamment servir de biocatalyseur possible et en tant que cibler pour herbicide inhibition [31 ; 32]. Elle catalyse la rduction rversible de 3 dhydroshikimate shikimate avec NAD (P) H comme donneur d'lectrons.

3. FONCTION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE

La shikimate dshydrognase est une enzyme qui catalyse une tape de la voie du shikimate. Cette voie est trouve dans des bactries, des plantes, des champignons, des algues, et des parasites et est responsable de la biosynthse des acides amins aromatiques



(phnylalanine, tyrosine, tryptophane) et du mtabolisme des glucides. En revanche, les animaux et les humains n'ont pas cette voie o les produits de cette voie de biosynthse des acides amins sont essentiels qui doivent tre obtenus par le biais du rgime alimentaire d'un animal.

Il existe sept enzymes qui jouent un rle dans cette voie. Shikimate dshydrognase (galement connu sous le nom dshydrognase 3-dhydroshikimate) est la quatrime tape du processus en sept tapes. Cette tape convertit 3 dhydroshikimate shikimate ainsi que de rduire le NADP + en NADPH.

4. LA REACTION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE

Shikimate dshydrognase catalyse la raction rversible NADPH-dpendante de la 3-dhydroshikimate shikimate. Lenzyme rduit la liaison carbone-oxygne double liaison d'un groupe fonctionnel carbonyle en un groupe hydroxyle (OH), la production de l'anion shikimique. La raction est dpendante de NADPH est oxyd en NADP + NADPH. [33]

Shikimat

e

+

NADP(+)

=

3-dehydroshikimat

e

+

NADPH



Figure06 : Raction de la shikimate dshydrognase.

5. LE MODE DACTION DE LA SHIKIMATE DESHYDROGENASE

5.1. Le domaine N terminal

Le domaine de liaison de substrat shikimate dshydrognase trouv l'extrmit N-terminale se lie au substrat, la 3-dhydroshikimate. Il est considr comme tant le domaine catalytique. Il a une structure de six brins bta formant un feuillet bta torsade avec quatre hlices alpha.

5.2. Le domaine C terminal Le domaine C -terminal se lie NADPH. Il a une structure spciale qui compose deux domaines le premier domaine de fixation de NADPH, le second domaine catalytique.



Figure07 : Le domaine C de shikimate dshydrognase.

6. LES INHIBITEURS DE SHIKIMATE DEHYDROGENASE

Aroe a t dtermine comme une cible prometteuse pour la dcouverte de nouveaux agents antimicrobiens.

Figure08 : Les inhibiteurs de shikimate dehydrognase.

Compte tenu de la diversit des SDH, la mesure exacte dans laquelle d'autres SDH peuvent compenser la perte de la fonction Aroe doit tre clarifie.

La capacit potentielle de SDH supplmentaires dans le gnome d'un agent pathogne donn pour complter la perte de la fonction Aroe peut rendre une approche chimio thrapeutique qui cible cette enzyme largement inefficace et peu pratique. Ainsi l'ensemble des SDH prsents dans un pathogne donn ainsi que leur caractristique enzymatique par



rapport au substrat spcificits et affinits doivent tre tablies en premier afin de permettre une dclaration concluante si une telle approche est prometteuse Pour autant que nous savons qu'il ya un seul rapport sur les inhibiteurs SDH, o le gne aroE SDH cod de H. pylori a t utilis dans un criblage haut dbit. Cette approche a conduit l'identification de cinq inhibiteurs de HpSDH nouveaux: le curcumin (1), la 3 - (2-naphtyloxy)-4-oxo-2-(trifluoromthyl)-4H-chromne-7-yle 3-chlorobenzoate (2), de butyle 2 - {[3 - (2-naphtyloxy)-4-oxo-2-(trifluoromthyl)-4H-chromne-7-yl] oxy} propanoate de mthyle (3), le 2 - ({2 - [(2 - {[2 - (2,3-dimthylanilino)-2-oxo-thyl] sulfanyl} -1,3-benzothiazol-6-yl) amino] -2 oxothyl} sulfanyl)-N-(2-naphtyl) actamide (4), et le diactate de maesaquinone (5) prsentant des valeurs de IC50 sur la HpSDH de 15,4, 3,9, 13,4 et 3,5 uM, respectivement . Pour la structure chimique des composs consulter la Figure 8 [34].

Les composs 1 et 4 sont des inhibiteurs comptitifs du shikimate et les composs 2 et 3 des inhibiteurs comptitifs par rapport NADP. Le compos 5 n'a pas montr une inhibition comptitive avec shikimique ou NADP, ce qui suggre qu'il nest pas un inhibiteur comptitif de l'enzyme. Parmi les cinq composs uniquement des substances 2 et 5 avaient un effet modr de H. pylori avec la croissance des valeurs de CMI de 16 et 32 ug / mL, respectivement, tandis que les composs 3 et 4 n'ont montr aucune inhibition significative. Le curcumin est considr comme l'lment le plus actif de la plante vivace herbace longa Curcuma, qui est une pice courante dans les currys de la cuisine du Sud-est asiatique et du Moyen.Dans une deuxime tude, son effet sur 65 cliniques de H. pylori isole de Kolkata a t tudie rsultant des variations de CMI variant de 5 50 pg / ml. En outre, son efficacit dans la rduction des lsions gastriques a t tudie histologiquement dans un systme de souris [35].

CHAPITRE 2: LE DOCKING MOLECULAIRE


1. INTRODUCTION

Connaitre la structure en trois dimensions des macromolcules et comprendre leurs mcanismes de complication est fondamental pour la comprhension des systmes biologiques, et donc essentiel dans de nombreux domaines. Dans ce but, la chimie apporte sa collaboration la biologie structurale qui sintresse quant elle au rapport qui existe entre la structure des molcules et leur fonction biologique cette union dbouche sur des avances couvrant diffrentes applications, telles que :

La recherche pharmacologique (conception de mdicaments en trouvant un ligand, cest--dire une molcule mdicamenteuse complmentaire, assembler avec un rcepteur membranaire connu).

La biologie cellulaire (interaction entre macromolcules, protines ou acides nucliques, intervenant dans les cycles cellulaires).

La recherche mdicale (laboration de nouveaux traitements visant les cellules une une ...).

Le plus souvent, le rcepteur est une protine qui possde un ou plusieurs sites actifs spcifiques, plus ou moins accessibles selon les cas. Le ligand est gnralement une molcule flexible trangre de petite taille. La liaison entre le ligand et le rcepteur introduit un signal biologique qui peut avoir diverses formes [36].

2. DEFINITION DE DOCKING MOLECULAIRE

Le Docking molculaire vise prdire la structure dun complexe form par deux molcules, la formation de ces complexes est fonde sur la reconnaissance de la structure tridimensionnelle dun ligand par site rcepteur et contrle de lactivit de nombreuses

molcules [37]. Le processus de docking consiste faire interagir une petite molcule organique avec le rcepteur, gnralement de nature protique. Des tudes ont montr que certains algorithmes de docking sont plus fiables que dautres pour reproduire le mode de fixation exprimentale

de ligands [38 ,39 ,40].

3. PRINCIPE DE DOCKING Le docking molculaire se droule en deux tapes principales [41] :

La premire consiste rechercher et gnrer toutes les conformations possibles et donc gnrant les modes dinteraction possibles entre la protine et le ligand. Cette

tape doit parcourir au mieux lespace conformation elle pour trouver lnergie

minimale globale.



La deuxime est une donne numrique dite fonction de score capable de dterminer la conformation qui reprsentera le mode dinteraction le plus juste pour chaque ligand

par rapport son rcepteur. En calculant rapidement lnergie libre totale du complexe protine-ligand form : cest ltape de marquage de score [42].

4. PRINCIPE THEORIQUE Docking (ancrage ou amarrage en franais) est le nom donn aux simulations molculaires dans les quelles diffrentes approches sont combines pour tudier les modes dinteractions entre deux molcules. Dans la plupart des cas, il sagit dun rcepteur macromolculaire (cible

de docking) dont la structure tridimensionnelle est connue et dune petite molcule (ligand).

Le rcepteur macromolculaire tant le plus souvent une protine [43] .Une simulation de docking comprend essentiellement deux tapes : le docking proprement dit et le scoring.

La premire (le docking) est ltape de slection, consistant placer le ligand dans le site actif de la protine et chantillonner les conformations, positions et orientations poses) possibles, en ne retenant que celle qui reprsentent les modes dinteractions les

plus favorables. La deuxime (le scoring) est ltape de classement, qui consiste valuer laffinit

entre le ligand et la protine et de donner un score aux poses obtenues lors de la phase de docking. Ce score permettra de retenir la meilleure pose parmi toutes celles proposes [43,44].

5. LES INTERACTIONS PROTEINE-LIGAND

Pour attacher un ligand une protine (docking) le problme est de prdire la conformation et lorientation du ligand relative au site actif de la protine cible. Le docking

est la base de la reconnaissance molculaire et du type de linteraction [45]. Les interactions entre une protine et un ligand sont en gnral de nature non covalente. L'nergie libre de Gibbs se calcule selon lquation 1 [46] :

G = -RT ln Ki = H TS

quation 1. Energie libre de Gibbs R: constante des gaz (8,314 J. K-1 mol-1) T: Temprature (K) Ki: constante dinhibition



Les interactions intermolculaires

Les interactions intermolculaires, plus faibles par leur nature que des liaisons covalentes ou intramolculaires permettant ainsi de distinguer molcules et assemblages de molcules sont adresses souvent sous le nom interactions non covalentes, interactions faibles ou

interactions van der Waals(VDW). Les interactions intermolculaires ont un rle important dans des domaines aussi varies que la physique, la chimie et la biologie. Le Docking molculaire est ltude des interactions non-liantes intervenant lors de la formation de complexes molculaires telle que :

Les interactions VDW. Les interactions lectrostatiques. Les interactions Hydrognes.

Le but du Docking molculaire est de dterminer le mode dinteraction dun complexe forme de deux ou de plusieurs molcules, en cherchant des orientations dans lespace et des

conformations favorables pour la fixation dun ligand un rcepteur [47]. Types Van Der Waals lorsquelles se rapportent aux nuages lectroniques de deux atomes adjacents conduisant la prsence dune force attractive pour des distances de 3-4 A (ces forces comprennent une composante attractive longue porte [force de dispersion de London] et une composante rpulsive trs courte porte). De par leur grand nombre, ces interactions jouent un rle important dans la stabilisation des complexes et favorisent leur compacit.

Figure09 : Les forces de Van Der Vaals.



Types hydrognes lorsquelles se forment de manire lectrostatique entre un atome dhydrogne(H), li lui-mme par covalence un atome lectrongatif (O, N, S) (donneur) et un atome lectrongatif possdant une paire dlectrons non partage (accepteur). Les liaisons hydrognes sont plus fortes que les liaisons de Van der Waals ; leurs nergies sont estimes entre 3 et 9 kcal/mol. Les acides amins polaires peuvent ainsi former des liaisons hydrogne entre eux ou avec des molcules deaux trs courte distance (0.8 2.8 A). Les liaisons

hydrognes sont peu nombreuses et sadaptent la flexibilit (langle peut varie de 120

180).

Figure 10 : La liaison Hydrogne.

Les liaisons hydrognes habituelles sont :

Figure11 : Les diffrentes liaisons hydrognes

De types hydrophobes et de solvatations lorsque les molcules non polaires tendent se rapprocher les unes des autres afin de limiter les contacts avec leau, et crer entre elles des liaisons dites interactions non covalentes.

6. LES PROGRAMMES DE DOCKING MOLECULAIRE

Le docking est une mthode qui prdit lorientation dune molcule dans le site actif du rcepteur pour former le complexe le plus stable. Il est bas sur deux approches : la complmentarit des surfaces et le calcul dnergie du complexe [48]. De nombreux

programmes de docking sont disponibles [49] (voir le tableau 1) tels que SURFLEX et GOLD sont devenus des outils utiliss rgulirement par les modlisateurs molculaires.



Nom Editeur Site Internet Auto Dock Scripps http://www.scripps.edu/mb/olson/doc/autodock/

Dock UCSF http://dock.compbio.ucsf.edu/ Flex X BioSolvelT http://www.biosolveit.de/flexX/ Fred Open Eyes http://www.eyesopen.com/products/applications/fred.html Glide Schrdinger http://www.schrodinger.com/Products/glide.html Gold CCDC http://www.ccdc.cam.ac.uk/products/life_sciences/gold/ ICM Molsoft http://www.molsoft.com/products.html

Ligand Fit Accelrys http://www.accelrys.com/cerius2/c2ligandfit.html Surflex Biopharmics http://www.biopharmics.com/products.html

Tableau 01 : Les principaux programmes de docking molculaire.

La plupart des programmes existants essayent de dterminer la gomtrie du complexe macromolcule-ligand. L'algorithme de base tient essentiellement en trois points :

Dfinir une gomtrie du complexe. valuer la qualit de cette gomtrie. Recommencer en classant les gomtries.

Une simulation de Docking comprend essentiellement deux tapes le searching et le scoring.

La premire sert trouver et slectionner des gomtries possibles pour le complexe en plaant le ligand dans le site actif de la protine. Elle est utile pour chantillonner les conformations, positions et orientations (poses) ventuelles, en ne retenant que celles qui reprsentent les modes dinteractions les plus favorables. Cette tape est le plus souvent excuter de manire automatise laide dalgorithme de Docking, ce qui amliore la vitesse et prcision des simulations. La seconde consiste valuer laffinit entre le ligand et la protine dans chacun des complexes slectionne lors de ltape prcdente. Cette tche est

accomplie par des outils informatiques nomms fonctions de score. Celles-ci valuent dabord les diffrentes contributions nergtiques pour la stabilisation des complexes protine-ligand, et les ordonnent ensuite, pour permettre lidentification des modes dinteractions les plus

probables [50,51]. Pour faciliter les calculs, la majorit des logiciels de docking ne prennent en compte que la flexibilit du ligand, la protine est considre entit rigide.

Searching

Il existe plusieurs mthodes de recherche de lespace conformationnel, celles bases sur la



complmentarit gomtrique dune part et celles fondes sur la complmentarit atomique

dautre part. Elles utilisent diffrents algorithmes (Mont Carlo, recherche stochastique, exhaustive, construction incrmentale.etc.) afin de trouver le meilleur positionnement du ligand au sein de la cavit enzymatique [52].

Scoring

Les rsultats du docking consistent le plus souvent en diffrentes poses du ligand dans le site dinteraction, correspondant plusieurs conformations favorables que le ligand peut adopter. Les mthodes de scoring permettent dvaluer lnergie de liaison du complexe

form et de donner un score aux poses obtenues lors de la phase de docking. Ce score permettra dune part de retenir la meilleure pose parmi toutes celles proposes, mais galement de classer la meilleure pose de diffrents ligands pour identifier les meilleurs dentre eux. Le score est une donne numrique utile pour quantifier le degr avec lequel un ligand se complexe un rcepteur. Cest globalement une approximation de lnergie libre rsultant du

passage de la forme libre de la protine et du ligand lassociation sous forme de complexe [53].

7. EVALUATION DES PROGRAMMES DE DOCKING Les performances dun programme de docking sont values en termes de capacit reproduire le mieux possible des complexes exprimentaux. Le mieux possible signifie que la valeur du RMSD (Root Mean Square Deviation) entre la pose du ligand calcule par le logiciel et la conformation dans le complexe exprimental est la plus petite possible. Le positionnement, cest--dire lidentification correcte du site de liaison sur la protine, lorientation et la conformation du ligand influent sur la valeur du RMSD [54].



1. MATERIEL

Dans notre tude nous avons utilis :

Deux micro-ordinateurs prsentant les performances suivantes : Un PC Packard bell avec 2GO de RAM, 320 GB HDD et une vitesse de 2;20 GHz. Un PC HP avec 4GO de RAM, 320 GB HDD et une vitesse de 2,53 GHz.

Le rseau internet comme outil principal pour le tlchargement des programmes, des complexes et des ligands dont on a besoin.

Surflex v 1.3, 2005 [55]: logiciel de docking. ArgusLab v 4.0.1 2003 [56]: logiciel de docking et de construction molculaire. MSViewer v 4.2 : programme de visualisation des molcules. Une banque de donnes appele la PDB (Protein Data Bank) [57]: cest la principale

source de donnes de biologie structurale, elle permet en particulier daccder des structures 3D de protines dintrt pharmaceutique. Ces structures sont essentiellement dtermines par cristallographie aux rayons X ou par spectroscopie RMN.

2. METHODES

Pour raliser le docking il faut avoir les structures dont on a besoin et pour cela il faut consulter la PDB.

2.1. Banque de donnes protiques Protein Data Bank

La banque de donnes protiques contient 30 structures cristallographiques de la shikimate dshydrognase de H.pylori dont la majorit est sous forme de complexes avec le shikimate.

Les principales diffrences entre ces complexes sont :

Le microorganisme : Helicobacter pylori , Salmonella enterica. Oligo-lments : Ca, K... Divers ligands.

2.2. Le protocole dutilisation des logiciels

2.2.1. ArgusLab

Les tapes de la ralisation du docking molculaire sont les suivantes :

1. Aprs dmarrage du programme ouvrir le fichier de la molcule en cliquant sur le signe +, une liste va apparaitre.

2. Cliquer sur le miscellanous (misc) une liste de ligand va apparaitre. 3. Choisir le ligand et cliquer dessus pour le slectionner en rouge.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Biologie_structuralehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Structure_des_prot%C3%A9ineshttp://fr.wikipedia.org/wiki/Cristallographiehttp://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9sonance_magn%C3%A9tique_nucl%C3%A9airehttp://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9sonance_magn%C3%A9tique_nucl%C3%A9airehttp://www.rcsb.org/pdb/search/smart.do?smartSearchSubtype_0=TreeQueryExpression_1&t_0=1&n_0=%2B11320&smartComparator=and&refine=true&tabtoshow=Current&qrid=1217A622http://www.rcsb.org/pdb/search/smart.do?smartSearchSubtype_0=TreeQueryExpression_1&t_0=1&n_0=%2B99287&smartComparator=and&refine=true&tabtoshow=Current&qrid=1217A622



4. Cliquer sur le menu Edit/Hide unselected ou appuyer sur les touches Ctrl+U pour cacher le reste du complexe et obtenir le ligand seul.

5. Ajouter les hydrognes en cliquant sur la lettre H. 6. Slectionner le ligand, cliquer sur le bouton droit de la souris et choisir loption

Make a ligand group from this residu nous obtiendrons le ligand dans le groupe. 7. Slectionner la molcule dans le miscellanous (misc) et appuyer sur les touches Ctrl+C

puis Ctrl+V, nous obtiendrons la copie du ligand. 8. Slectionner la copie puis cliquer sur le bouton droit de la souris choisir loption

Make a ligand group from this residu pour obtenir la copie dans le groupe. 9. Ouvrir le dossier groupe en cliquant sur le signe + les molcules que nous avons cres

apparaissent lintrieur du dossier. 10. Cliquer sur le premier ligand qui est le ligand de rfrence et le renommer en cliquant

sur le bouton droit de la souris et choisir loption Modify group et en le renommant X-ray.

11. Changer la couleur des deux ligands pour bien les diffrencier en cliquant sur le bouton droit de la souris et choisir loption set color.

12. Slectionner le ligand de rfrence pour dterminer les acides amins du site actif en cliquant sur le bouton droit de la souris et choisir loption Make a binding site group for this group.

13. Faire le docking en cliquant sur calculation qui se trouve en haut et choisir loption dock ligand dans le menu en haut ou bien appuyer sur le raccourci Alt+D. Aprs quelques temps et selon la taille du ligand nous observons ce dernier qui prend place lintrieur du site dinteraction de la protine, ainsi lnergie dinteraction et le temps

de calcul entre le ligand et la protine safficheront sur lcran. 14. Calculer RMSD en slectionnant les deux ligands et en appuyant sur la touche shift,

puis cliquer par le bouton et avec le bouton droit de la souris choisir loption calcul

RMSD, une boite de dialogue apparaitra.

La construction des molcules

ArgusLab permet de construire de nouvelles molcules et de modifier celles existant dj

dans la littrature, pour mieux comprendre comment construire une molcule on peut

consulter tutorials en cliquant sur help/tutorials and FAQs, un sommaire contenant les

principaux titres apparaitra, ensuite cliquer sur molecule builder.

2.2.2. Surflex

Pour raliser larrimage il faut passer par : - La sparation de la protine et du ligand : pour cela il y a deux mthodes, lune consiste utiliser le fichier wordpad c'est--dire que les constituants des molcules apparaissent sous



format texte, et lautre cest la technique que nous avons choisie et qui est plus rapide, elle consiste en lutilisation du logiciel MSViewer :

1. Cliquer sur le menu File/Open. 2. Choisir le complexe. 3. Cliquer sur Window /New Hierachy Window ou bien le raccourci Ctrl+ H. 4. Cliquer sur le signe + pour obtenir le contenu du complexe (les chaines de la

protine, les ligands et les molcules deau). 5. Pour obtenir la protine seule il faut garder lune des chaines et supprimer le reste. 6. Pour obtenir le ligand seul il faut garder lun des ligands de la mme chaine et

supprimer le reste. 7. Enregistrer les modifications sous format pdb et les renommer en ajoutant la lettre P

pour la protine et L pour les ligands.

- Ralisation du docking en utilisant linvite de commandes MS Dos :

1. Cration du site dinteraction (Protomol) en lanant la commande suivante : Surflex-dock proto ligand.pdb proteine.pdb pl

2. Le docking :

Surflex-dock dock ligand.pdb pl-protomol.mol2 proteine.pdb 3. Le calcul de RMS :

Surflex-dock rms final-0.mol2 ligand.pdb 4. En cas de lobtention dun rms suprieur 2 et inferieur ou gal 3, on peut lancer la

commande suivante pour optimiser le rsultat. Surflex-dock optrms final-0.mol2 ligand.pdb

-La visualisation :

Apres larrimage vient ltape de la visualisation par le biais de MSViewer :

1. Cliquer sur file/open dans la barre des menus pour ouvrir les diffrents fichiers :

La protine. Le ligand de rfrence. Le final-0. Loptrms dans certains cas.

2. Changer la couleur du ligand de rfrence (vert), le final-0 (violet), optrms (bleu)

3. Cacher les hydrognes de la protine en cliquant sur tools /hydrogens /hide dans la barre des menus.

4. Mettre les fentres verticalement en cliquant sur window/tile vertical dans la barre des menus pour visualiser le tout.



5. Copier et coller au niveau de la protine le ligand de rfrence, final-0 et loptrms(en cas dune optimisation du RMSD) pour comparer leur superposition au niveau du site dinteraction.

6. Enregistrer les rsultats des modifications effectues et les renommer.

Pour raliser linhibition de la shikimate dshydrognase il est indispensable de tester la

fiabilit des deux logiciels utiliss ArgusLab, Surflex

2.3. Le test de fiabilit des logiciels

Deux programmes de docking ArgusLab (v 4.0.1 2003), Surflex (v1.3, 2005) ont t tests sur 160 complexes protines-ligands tirs de la PDB.

Les performances dun programme de docking peuvent tre juges au moyen de deux critres : dtermination du RMSD suivi dune visualisation et du coefficient de corrlation.

2.3.1. RMSD (root mean square deviation)

Correspond la moyenne de la dviation de chacun des atomes du ligand (ligand de calcul) par rapport ceux de la molcule dorigine (le ligand de rfrence).

Les performances dun programme de docking sont values en termes de capacit reproduire le mieux possible des complexes exprimentaux. Le mieux possible signifie que la valeur du RMSD (Root Mean Square Deviation) entre la pose du ligand calcule par le logiciel et la conformation dans le complexe exprimental est la plus petite possible. Le positionnement, cest--dire lidentification correcte du site de liaison sur la protine, lorientation et la conformation du ligand influent sur la valeur du RMSD.

2.3.2. Coefficient de corrlation

En probabilits et en statistiques, tudier la corrlation entre deux ou plusieurs variables alatoires ou statistiques numriques, cest tudier lintensit de la liaison qui peut exister entre ces variables. La liaison recherche est une relation affine. Dans le cas de deux variables numriques, il s'agit de la rgression linaire.

Une mesure de cette corrlation est obtenue par le calcul du coefficient de corrlation linaire. Ce coefficient est gal au rapport de leur covariance et du produit non nul de leurs carts types. Le coefficient de corrlation est compris entre -1 et 1.

Ce test consiste valuer le degr de corrlation qui existe entre laffinit des inhibiteurs simuls par docking molculaire laide du programme Surflex et les valeurs de leurs IC50

(la concentration anti bactrienne inhibant 50 % de la multiplication bactrienne) dtermines exprimentalement par des essais in vitro et obtenues partir de la littrature [58]. La liste des complexes protines-ligands tests sera retrouve dans lAnnexe-1.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Probabilit%C3%A9http://fr.wikipedia.org/wiki/Statistiquehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Variable_al%C3%A9atoire_r%C3%A9ellehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Variable_al%C3%A9atoire_r%C3%A9ellehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Fonction_affinehttp://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9gression_lin%C3%A9airehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Covariancehttp://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89cart_type



3. INHIBITION DE LENZYME DU COMPLEXE 3PHH

3.1. Choix du complexe 3PHH

Parmi les 30 complexes de la shikimate dshydrognase (SDH) de H. pylori trouvs dans la PDB, nous avons choisi le complexe 3phh en raison de sa bonne rsolution (1.45), son bon rmsd (1.42) et sa bonne affinit (5.05M-1) par rapport aux autres complexes tests, son ligand est le shikimate. Linhibiteur considr dans cette tude est le curcumin, inhibiteur naturel de la SDH de H. pylori selon la littrature.

Pour quun mdicament soit biodisponible oralement, il doit rpondre certains critres dfinis par la rgle de Christopher A. Lipinski [59]: Outre une affinit qui lui confre une activit biologique, une molcule tte de srie doit pouvoir survivre dans lorganisme humain suffisamment longtemps pour pouvoir exercer

cette activit biologique. Les proprits dADME-T de ces molcules se vrifient lors de la premire phase clinique, cest--dire chez le sujet sain. Lipinski dfini un ensemble de rgles permettant destimer la biodisponibilit dun compos par voie orale partir de sa structure

bidimensionnelle (2D). Ces rgles concernant les proprits physico-chimiques ont t dfinies aprs lanalyse de 2245 mdicaments commercialiss ou en phase finales de

dveloppement :

le poids molculaire du compos ne doit pas tre suprieur 500 daltons (Da). le logarithme dcimal du coefficient de partage eau / 1-octanol, not LogP, doit tre

infrieur 5. le nombre de donneurs de liaisons hydrogne doit tre infrieur 5. le nombre daccepteurs de liaisons hydrogne doit tre infrieur 10. le nombre de liaisons rotables doit tre infrieur 15.

Dfinition du LogP

On considre le partage dun solut entre leau et un solvant non miscible

(Hexane, ther, chloroforme, octanol...).

Le coefficient de partage P est gal au rapport des concentrations du solut dans les deux phases :



C : solvant (satur deau).

C : eau (satur de solvant).

P = C/C.

C > C P > 1 log P > 0 : le solut est dit lipophile (hydrophobe).

C < C P < 1 log P < 0 : le solut est dit hydrophile.

Les composs dont les proprits physico-chimiques ne satisfont pas au moins 2 des rgles sont fortement susceptibles de prsenter des problmes dabsorption ou de permabilit. En

effet, moins de 10 % des molcules en phase clinique prsentent plus de deux critres en dehors de la gamme prconise par Lipinski.

3.2. Calcul des interactions enzyme- composs substitus

Dans le but de dvelopper de nouveaux inhibiteurs plus efficaces shikimate dehydrogenase, nous avons utilis comme structure de dpart, le meilleur inhibiteur tudier le curcumin . Afin d'amliorer l'affinit de le curcumin, plusieurs groupements fonctionnels prsentant la capacit d'engager des liaisons hydrogne avec le site actif de l'enzyme ont t introduits sur diffrentes positions de la molcule. Il s'agit des fonctions : acide (-COOH) ; amine (-NH2) ; amide (CONH2), hydroxyle(OH). (Voir Figure 12).



Figure 12 : Structure du curcumin.

3.2.1. Les mono-substitutions

Mono substitution

compos C2 C3 C4 C5 C6 a b c d e f g 1 NH2

2 NH2

3 NH2

4 NH2

5 NH2

6 NH2

7 NH2

8 COOH

9 COOH

10 COOH

11 COOH

12 COOH

13 COOH

14 COOH

15 COOH

16 OH

17 OH

18 OH

19 OH

20 OH

21 OH

22 OH

23 CONH2

24 CONH2

25 CONH2

26 CONH2

27 CONH2

28 CONH2

29 CONHH2

30 CONH2

31 CONH2

32 COOH

33 NH2

34 NH2

35 CONH2

36 CONH2



37 OH

Tableau02 : Les mono-substitutions du curcumin .

3.2.2. Les bi-substitutions

BI SUBSTUTITION

Compos C2 C3 C4 C5 C6 a b c d e f G 38 OH NH2

39 OH OH

40 NH2 COOH

41 COOH NH2

42 COOH OH

43 OH COOH

44 OH CONH2

45 COOH COOH

46 OH COOH

47 COOH OH

48 OH OH

49 OH COOH

50 COOH OH

51 COOH OH

52 OH COOH

53 COOH NH2

54 OH COOH

55 COOH COOH

56 OH COOH

57 OH COOH

58 COOH NH2

59 OH NH2

60 OH COOH

61 NH2 OH

62 NH2 COOH

63 NH2 COOHH

64 OH OH

65 OH NH2

66 COOH 0H

67 COOH COOH

68 OH COOH

69 OH OH

70 OH COOH

71 OH COOH

72 OH NH2

73 NH2 NH2

74 OH OH

75 COOH COOH

76 COOH COOH

77 COOH COOH

78 OH OH

79 OH OH

80 NH2 CONH2

81 NH2 CONH2

82 NH2 NH2

83 CONH2 CONH2

84 CONH2 CONH2

85 CONH2 CONH2

86 CONH2 CONH2

87 CONH2 CONH2



88 NH2 NH2

89 NH2 NH2

90 NH2 NH2

91 NH2 OH

92 NH2 COOH

93 COOH NH2

94 COOH NH2

95 OH COOH

96 COOH CONH2

97 NH2 COOH

98 OH OH

99 COOH COOH

100 CONH2 COOH

101 CONH2 COOH

102 OH NH2

103 OH CONH2

104 COOH NH2

105 CONH2 CONH2

106 OH COOH

107 OH OH

Tableau03 : Les bi-substitutions du curcumin.

La visualisation des liaisons hydrognes tablies entre le ligand et les acides

amins du site actif :

Ouvrir le fichier de la protine du final-0, ou de loptrms via MSViewer.

Slectionner le ligand, puis le copier et le coller au niveau du site dinteraction

de la protine en cliquant sur Edit/Copy puis Paste dans la barre des menu, ou

bien appuyer sur le raccourcis Ctrl+ C puis Ctrl+V.

Slectionner le ligand une fois coll dans le site actif, puis cliquer sur

tools/Monitor/Hbonds pour visualiser les liaisons hydrognes tablies entre le

ligand et les acides amins du site dinteraction.

Cliquer sur chacun des atomes relis avec le ligand par un trait discontinu en

vert, puis marquer cet acide amin en cliquant par le bouton droit de la souris

et choisir loption Label : changer la couleur et sassurer des options suivante

rsidu, Name ensuite cliquer sur les boutons Apply/Ok.

Lacide amin slectionn apparait en bas de lcran.

Ensuite faire la mme chose avec le final-0 du similaire (meilleure affinit)

choisi pour comparer les deux rsultats.

CHAPITRE 4: RESULTAT ET DISCUSSION


1. TESTS DE FIABILITE DES PROGRAMMES DE DOCKING

Avant daborder ltude de linhibition de SDH par diverses molcules, savoir le curcumin et ses drivs mono et bi-substitus, nous avons jug utile dvaluer tout dabord la performanc

thème - apache2 debian default page: it...

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