techniques de séchage des starters lactiques et mécanismes

BASE Biotechnol. Agron. Soc. Environ.201115(2),287-299 Le Point sur :

TechniquesdeséchagedesstarterslactiquesetmécanismesaffectantlaviabilitécellulairesuiteàlalyophilisationIbourahemaCoulibaly(1),RobinDubois-Dauphin(1),SabineDanthine(3),LamiaMajad(1),ThamiMejoub(2),JacquelineDestain(1),FrançoisBéra(3),Jean-PaulWathelet(4),PhilippeThonart(1,2)(1)Univ.Liège-GemblouxAgro-BioTech.CentreWallondeBiologieIndustrielle.UnitédeBio-industrie.PassagedesDéportés,2.B-5030Gembloux(Belgique).E-mail:[email protected](2)Univ.Liège.CentreWallondeBiologieIndustrielle.UnitédeTechnologiemicrobienne.Sart-Tilman.B40.B-4000Liège(Belgique).(3)Univ.Liège-GemblouxAgro-BioTech.UnitédeTechnologieagro-alimentaire.PassagesdesDéportés,2.B-5030Gembloux(Belgique).(4)Univ.Liège-GemblouxAgro-BioTech.UnitédeChimieorganique.PassagesdesDéportés,2.B-5030Gembloux(Belgique).

Reçule5novembre2009,acceptéle24aout2010.

Laplupartdesstarterslactiquesontd’importantsbesoinsnutritionnelsetpossèdentpeuderésistancevis-à-visdesconditionsenvironnementalesentourantleurproduction(séchage,stockage,etc.)etleurutilisationin vivo(propriétésphysico-chimiquesdutractusdigestif).Cettesituationamènerégulièrementlesindustrielsàdévelopper,aveclesmicrobiologistes,desprojetsderecherchedenouvellesbactérieslactiquescapablesdesupporterl’ensembledesprocédésdeproduction,destockageetdeformulationsansperdreleurspropriétésfonctionnelles.Parmilesdifférentesméthodesdeséchage(atomisation,fluidisationetlyophilisation),lalyophilisationpermetd’obtenirunedéshydratationpousséecompatibleavecdesduréesdeconservationtrèslongues.Cetteméthodeimpliquedeschangementsdelatempératureduproduitassezagressifspourlesmicro-organismescarellenécessiteunecongélation,cequin’estpassansconséquencepourlescellules.Danscertainscas,elleoccasionnedesaltérationscellulaires(peroxydationdesacidesgras)etgénétiques(modificationdesprotéines).L’utilisationdecryoprotecteursaucoursdelalyophilisationetd’antioxydantspendantlestockageaugmentesensiblementletauxdeviabilitédecescellules.Mots-clés.Probiotiques,lyophilisation,radicauxlibres,acidesgrascellulaires,hydroperoxydes,peroxydation,cryoprotecteurs.

Preservation of industrial’s lactic acid bacteria (probiotics) by freeze-drying.Majorityofthelacticacidbacteriahaveimportant nutritional needs anddonot have resistance against the environmental conditions surrounding their production(drying,storage,etc.)andtheirusein vivo(physico-chemicalpropertiesofthedigestivetract).Inthiscondition,industrialistsandmicrobiologists develop regularly researchprojects of new lacticbacteria able to support thewholeof theprocessesof production, storage and formulationwithout losing their functional properties.Among the variousmethods of drying(atomization,fluidizationandfreeze-drying),freeze-dryingmakesitpossibletoobtainathoroughdehydrationcompatiblewithverylongstoragetimes.Thismethodinvolveschangesinproducttemperatureandisenoughaggressiveformicroorganismsbecauseitrequiresfreezingthatisnotwithoutconsequencesforcells.Inothercases,itcausescellular(peroxydationofthefatty-acids) and genetic (modification of proteins) deteriorations.The use of cryoprotecteurs during freeze-drying and ofantioxidantsduringstorageappreciablyincreasestherateofviabilityofthesecells.Keywords.Probiotics,freeze-drying,freeradicals,cellularfattyacid,hydroperoxides,peroxydation,cryoprotectants.

288 Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 201115(2),287-299 CoulibalyI.,Dubois-DauphinR.,DanthineS.etal.

1. Généralités sur le séchaGe des Micro-orGanisMes

1.1. introduction

Lacommercialisationdesouchesmicrobiennes,qu’ils’agisse de bactéries, de levures ou de moisissures,nécessitede lesconditionnersousune formedurablestable(Leslieetal.,1995).Eneffet,enraisondeleurphysiologie,lescellulesmicrobiennesneseconserventpas à l’état natif dans leur milieu de culture. Leurdéveloppementestsouventassuréenfermenteurdansun substrat liquide.Conservées dans cemilieu aprèsleurcroissance,lescellulesyconsommentlesderniersnutriments disponibles et expriment, pour la plupart,un métabolisme fermentaire qui nuit à la qualité duproduit (modification du pH, émanation d’odeurs,etc.). De plus, les cellules, après avoir brûlé leursréserves,meurentengrandnombre(Zhaoetal.,2005).Il est donc indispensable de stabiliser la populationmicrobienne. Le séchage des cellules apparait alorscomme une solution pratique. En éliminant l’eau, lemétabolisme cellulaire est bloqué, les cellules sontfigées dans un état physiologique déterminé. Outrela conservation des micro-organismes, le séchagefacilite la manipulation et le stockage et en réduitles couts. Les méthodes de séchage seront passéesen revue, surtout lesméthodesappliquéesà l’échelleindustrielle, à savoir l’atomisation, la fluidisation etlalyophilisation.Ellessontassezagressivesvis-à-visdes micro-organismes car elles impliquent de fortesvariations de la température du produit (Mille et al.,2005).L’utilisationdecryoprotecteursaucoursde lalyophilisation et d’antioxydants pendant le stockageaugmente significativement le taux de viabilité descellules.

1.2. types de séchage dans les industries agro-alimentaires

Concentration, dessiccation, séchage, déshydratation,autant de termes que l’on regroupera sous le termegénéral d’élimination d’eau. Toutes ces opérationsobéissent en effet, fondamentalement, aux mêmeslois et leurs objectifs sont les mêmes.Alors que laconcentrationtraiteunproduitliquidepouraboutiràunliquide,leséchagepartd’unproduitliquideousolide,pouraboutiràunsolide.Leséchageestunprocédédeconservationextrêmementancienqui,privantl’alimentd’eau libre, interdit toute activité microbienne ouenzymatique.Laconcentrationnedonnelieuqu’àuneéliminationd’eaupartielle,maisellepermetd’obtenirun produit dont la pression osmotique est parfoissuffisantepourentravertoutdéveloppementmicrobien(Thonart, 2004). C’est ainsi que l’élimination d’eaupermet de tamponner les caractères saisonniers de

certainesactivitésagricoles(fenaison)ouindustrielles(concentrés de jus de pommes en cidrerie). Desproduitssecs,telsquelelaitenpoudre,seconserventpendantdesannées.Leséchageconsisteàéliminerunsolvantemprisonnédansunsolideenl’évaporantdanslaphasegazeusequilebaigne(Aller,1998).Pourcela,il fautapporterdel’énergiepourcompenserà lafoisl’énergiedeliaisonsolide-liquide(dueàdesforcesdeVanDerWaals) et la chaleur latente de vaporisationdusolvant(Bayrocketal.,1997).Cetapportpeutêtrefaitparlaphasegazeuse(onparlealorsdeséchageparconvection)ouparunesourceexterne(chauffagepareffetJoule,parradiationinfrarougeouparcourantsdehaute fréquence). Il faut aussi éviter la saturation ensolvantde laphasegazeuse,cequiestassuréparunbalayage de l’atmosphère, qui maintient la pressionpartielleensolvantauvoisinagedusolide,inférieureàlapressiondevapeursaturante.

atomisation. En agro-alimentaire, l’atomisationest uneméthodededéshydratationd’un liquide (jus,lait, etc.). Lors de la déshydratation par atomisation,les aliments liquides sontprojetésdansune chambrechauffante sous forme de fines gouttelettes, ce quipermetdefaireévaporerl’eauetderecueillirl’alimentdéshydraté en poudre à la base de l’appareil. Cetteméthodeestutiliséenotammentpourladéshydratationdu lait. Elle se déroule en quatre grandes étapes: lanébulisationouladispersionenunsprayhomogèneduliquide,lecontactdusprayavecl’airchaud(150°C),l’évaporationdel’eaudesgouttelettesetlaséparationdu produit déshydraté (50-60°C) et de l’air. Elle al’inconvénientdefaireperdreauxalimentsleursarômesqui sont entrainés avec la vapeur d’eau et aussi, parsuiteduchauffage,dedénaturer certains composantscar lorsque les cellules sont séchées avecune teneurfaible en eau, un certain nombre des composantscellulaires,commel’ADNoul’ARN,etdesprotéinessontaffligées(Santivarangknaetal.,2008).

Fluidisation.Cettetechniques’appliqueauxproduitssolidessousformedeparticulesoususceptiblesdesedésagréger par frottement. La fluidisation consiste àfaire passer une phasefluide (très souvent un gaz) àtraversun litdeparticules, supportéesparunegrille,pour lesmettre en suspension. Le terme fluidisationvientdufaitquelasuspensiongaz/solideestamenéedansunétatsemblableàceluidesfluides.Latechniqueduséchagepar litfluidiséest laconjonctiondedeuxidées: le séchage et la fluidisation. Si le courant estenvoyé à une vitesse suffisante, elle provoque unedésagrégation du solide; par contre, si cette vitessen’estpastropforte,lesgrains,aulieud’êtreentrainés,ontuneagitationdésordonnéecomparableàl’agitationmoléculaire(Rasuletal.,2000).C’estcequ’onappelleunlitfluidisé.Lebutdelafluidisationestnotamment

Incidencesdelalyophilisation 289

d’augmenter la surface de contact gaz-solide pourfaciliter le séchage. Il existe trois grands types delit fluidisé: lit fluidisé simple, l’air assure à la foisla fluidisation, l’apport de chaleur et l’évacuationdesvapeursdésorbées; litfluidisévibré, l’apportdechaleurestencoreassuréparl’air,maislafluidisationsefaitcettefoisparunprocédémécanique;litfluidiséàéchangeurinterne,l’airn’assurequelafluidisationet l’évacuation des vapeurs, l’apport de chaleur esteffectuéparunéchangeurexterne,placéàl’intérieurdulit.

lyophilisation. La technique consiste à ôter l’eaud’un produit liquide, pâteux ou solide, à l’aide del’action combinée du froid et du vide. Le principedebaseestque lorsqu’on réchauffede l’eauà l’étatsolide à très basse pression, l’eau se sublime, c’est-à-dire qu’elle passe directement de l’état solide àl’étatgazeux(DeBeeretal.,2006).Lavapeurd’eau(ou de tout autre solvant) quitte le produit et on lacapture par congélation à l’aide d’un condensateurou piège. Cette technique permet de conserver à lafoislevolumeetl’aspectduproduittraité.Ellepeutavoir lieu naturellement (séchage enmontagne), ou,plusrapidement,dansunlyophilisateur(Chouvencetal., 2004). La lyophilisation comporte généralementtrois étapes: la congélation, la sublimation et ladessiccationsecondaire.

2. lyoPhilisation des bacteries lactiques

Lalyophilisations’estdéveloppéependantlasecondeguerremondialepourlestockageduplasmasanguin(Pegg,2002).Ainsi,pourdesvaccins,commepourungrandnombredemédicamentsetdemicro-organismes,lalyophilisationestlaseuletechniquepermettantuneconservationàlongtermedesprincipesactifsàl’étatsec(Tangetal.,2004).Dansledomainedesindustriesalimentaires, les ferments lactiques (probiotiques etstarters) sont de plus en plus utilisés sous la formelyophilisée.

2.1. description et principes de la lyophilisation

Lapremièrephasedel’opérationconsisteàcongelerle produit, c’est-à-dire à amener l’eauqu’il contientà l’état solide; ceci implique de lui soustraire del’énergie. La seconde phase consiste à extrairel’eau du produit par volatilisation en lui fournissantde l’énergie thermique (Shalev et al., 2002). Cetteseconde opération se déroule dans une enceinteoù règne une pression très largement inférieure àla pression atmosphérique (de l’ordre de 0,1 à 1mBar).

congélation.Aucoursdelacongélation,lasolutionliquidededépartestsupposéehomogène,unepartiede l’eau se sépare des substances dissoutes pourcristalliser à l’état pur.Le reste de l’eau se solidifieensuite peu à peu enmélange avec les solutés pourformerunematièreinterstitielle(entrelescristauxdeglace)quiadopteunestructureamorphe(noncristallineou vitreuse). En général, à partir d’une solutioncomplexe, les substances dissoutes ne cristallisentpas (Shuck et al., 2004). Un paramètre important àprendreencomptepourl’étapedelacongélationestlavitessedecongélationquiconditionneladimensiondes cristaux de glace. En effet, plus les cristaux deglaceforméssontgrands,pluslediamètredesporesest important et par conséquent, plus la vitesse dedessiccationestélevée.Ilestdoncimportant,dupointde vue technologique, de produire de petits cristauxde glace par une congélation rapide conduisant àl’obtention de petits cristaux intracellulaires nondommageables pour les cellules (DeAngelis et al.,2004).

dessiccation. Ellesedérouleendeuxtemps:d’abordlasublimationdel’eaucristallisée(séchageprimaire,l’eaupassedirectementdel’étatsolideàl’étatgazeux),puislaphasededésorptionetd’évaporationdel’eauliéequiaadopté,lorsdelacongélation,uneformenoncristalline ou vitreuse (séchage secondaire).Celle-cirésulte de la solidification sans réarrangement desmoléculesenraisondelatrèsgrandeaugmentationdelaviscosité(Cailletetal.,2007).Cesétats(cristallinet vitreux) peuvent coexister dans des proportionsvariables pour un même échantillon, la proportiond’eauà l’étatvitreuxétantd’autantplusgrandequelavitessedecongélationet laviscositésontgrandes(Hausman et al., 2005). Les cavités laissées par lescristaux après la sublimation de l’eau confèrent laporosité nécessaire à l’évaporation de l’eau situéedansl’espaceinterstitiel(Fonsecaetal.,2001).

L’eau présente dans la masse vitreuse doitd’abord subir une diffusion moléculaire au sein delamatièreavantd’atteindre lescavitéset lescanauxqui la mèneront vers l’extérieur. On comprend dèslorsque lamanière selon laquelle lacongélationestmenéeconditionnelaqualitéduséchage.Descristauxde grande taille et jointifs donnent lieu à un réseaude cavités qui communiquent entre elles et quiconduisent bien l’eau vers l’extérieur. De plus, laréhydratationestaussifacilitéeavecmoinsderisqued’obtenirdes«flotteurs»,c’est-à-diredesmatièresdechargesensuspension.Undegrédecristallisationélevé(c’est-à-dire qu’une forte proportion de l’eau totaleestsousformecristalline)favorisel’établissementdejonctions entre les cristaux et réduit l’épaisseur descloisonsdematièrevitreusequiséparentlescristaux,commel’indiquelafigure 1.


affaissement/collapse. De manière schématique, lastructure congelée peut être considérée comme unesubstanceporeuse initialement rempliedeglace.Lesparois de ce pore sont constituées de la phase cryo-concentrée(solutéeteau«liée»).Lorsquelaglaceestéliminée par sublimation, les parois du pore ne sontplussoutenuesparlaglace.Silatempératureduproduitest suffisamment faible, la phase cryo-concentrée estmaintenuedansunétatsolideamorpheetonobserveune rétention de structure (les parois ne subissentpas d’écoulement visqueux et se maintiennent dansleur forme initiale). Au contraire, si la températureremonte,lematériauconstituantlesparoisduporepeutsubirunetransitionvitreuseetl’écoulementvisqueuxqui en résulte entraine l’affaissement de la structure.SelonShahetal.(1995),l’affaissementduproduitestobservablequandl’écoulementvisqueuxestinduitparlesforcesdetensiondesurfacequitendentàminimiserlasurfacespécifiqueduproduit.

affaissement/température de transition vitreuse.Selon Matthieu (2002), la température de transitionvitreuse, définie comme la température où a lieu latransition entre deux formes de l’état amorphe, lesformes « vitreuse rigide » et « caoutchouteuse »(Figure 2), est un paramètre important pour lacaractérisation d’un produit. En effet, les matériauxamorphes,commelesproduitsalimentaires,sontplusstablesdans leur état vitreux largement au-dessusdela température de transition vitreuse (Tg). Cela estdû à la viscosité élevée et à lamobilitémoléculairebeaucoup plus réduite dans l’état vitreux que dansl’état caoutchouteux (Fonseca et al., 2001). Parconvention, la température de transition vitreuse(Tg) est le lieu où la valeur de la viscosité atteint1012 Pa.s-1 (Matthieu, 2002). La viabilité et l’activité

des bactéries diminuent généralement pendant lesdifférentes étapes de la fabrication et le stockage.Composéesprincipalementd’hydratesdecarbonesetdeprotéines,lesbactériescongeléessontsusceptiblesde subir les phénomènes de transition vitreuse et decollapse. La mobilité moléculaire et les propriétésphysico-chimiques desmatériaux biologiques conge-lés sont fortement liées à l’activité d’eau et à latempérature. La technique d’analyse thermique[analysecalorimétriquedifférentielle(ACD)]consisteà maintenir une différence de température nulleentre la substance étudiée et une substance inerte deréférence,lorsquelesdeuxéchantillonssontsoumisàlamêmevariationlinéairedetempératureetaumêmeenvironnement, et à mesurer l’énergie nécessairefournie soit à l’échantillon étudié, soit à la référence(généralement par effet Joule).Ces diagrammes sonthabituellementétablisavecdesmesureseffectuéesparanalysecalorimétriquedifférentielle(ACD).Associésauxisothermesdesorptiond’eaudesproduitssecs,ilssontsouventemployéspourexpliquerlastabilitédecesproduitspendant le stockage (Hausmanetal.,2005).En revanche, lephénomèned’affaissement intervientdanslacouchesèche,encoursdedessiccation.L’étudedes propriétés physiques susmentionnées réaliséesur lesbactéries lactiques est susceptibled’expliquercertains changements qui se produisent pendant leurtraitementetleurstockage.

2.2. Facteurs agissants sur la conservation des cellules séchées

La maitrise des procédés de congélation ou delyophilisationnedoitpassebornerauxconditionsde

Figure 1.Représentationschématiqued’unproduitencoursde lyophilisation — Diagrammatic representation of a product in the course of freeze-drying (Simatosetal.,1994).

E:zoneexterneporeuse—porous external zone ;S:interfacedesublimation—interface of sublimation;I:zoneinternecongélée—frozen internal zone.

Figure 2.évolutiondufluxdechaleur(dQ/dt)enfonctionde la température (T),mesuréepar analyse calorimétriquedifférentielle—Evolution of the heat flow (dQ/dt) according to the temperature (T) measured by differential calorimetric analysis. Latempératuredetransitionvitreuse(Tg)correspondaupointd’inflexiondelacourbe—The temperature of vitreous transition (Tg) corresponds to the point of inflection of the curve.

Température (°C)

Flux

dQ

/d

Tg

Tg,midpoint

Tg,endset

Tg,onset

Réseauinterstitiel

Glace

E

S

I


changementsdel’étatdel’eau;lesuccèsestintimementliéàl’étatdanslequelsetrouveleproduitbiologiqueaumomentdutraitement.Lesnombreuxfacteursquiinfluencent directement la survie des souches sontreprésentés sur la figure 3 : facteurs physiques derefroidissement, de congélation et de décongélationou de dessiccation, mais aussi facteurs biologiquesd’adaptabilité du micro-organisme au traitement(Roméoetal.,2001).Lenombreetladiversitédecesfacteursexpliquentladifficultéd’obtenirdesrésultatsreproductibles de la survie d’un micro-organisme,d’autantplusqu’ilestmalaisédelesétudierisolément.D’autresfacteurscommelerayonnementU.V.ousolaireetl’oxygènefavorisentlesréactionsd’oxydation.Pourune conservation optimale, un conditionnement sousvideou sousatmosphère inerte (azotepur) enflaconscellé ou bouché hermétiquement est recommandé(Kinget al., 1998).Lapertedeviabilitédes cellulessèches est une conséquence des dommages causés

aux cellules au niveau de différentes cibles, à savoirla paroi cellulaire, la membrane cellulaire et l’ADN(Teixeira et al., 1995). Le séchage est responsablede différentes formes de dommages cellulaires,principalementenraisondeschangementsdansl’étatphysiquedeslipidesmembranairesetdanslastructuredesprotéines sensiblesqui conduisent souvent àuneperte sévèrede la viabilité bactérienne (Leslie et al.,1995). La dessiccation impose un stress sévère auxmicro-organismespar l’éliminationde l’eauet induitdeschangementsdeconformationdesprotéinesetdelamembranecellulaire(Strasseretal.,2009).

Pour préserver le produit lyophilisé et lui assurerunelongueconservation,ilestparfoissouhaitablederétablirlapressionatmosphériquedanslachambredestockageà l’aided’ungaz inerteet sec (N2,Ar).Parailleurs, plus la température de stockage est basse,meilleure est la conservation, comme l’ont démontréGardineretal.(2000)auniveaudesstarterslactiques.

Figure 3. Facteurs influençant la survie des bactéries lactiques lors de la lyophilisation. [Encadrés] :Depuis leur culturejusqu’àleurdécongélationouréhydratation—Factors influencing the survival of the freeze-drying bacteria. [Framed]: from culture to defrosting or rehydration(Bessonetal.,1987).


Les produits lyophilisés sont caractérisés par lespropriétés importantes pour leur conservation, leurmanipulationouleurusage:humiditérésiduelle,massespécifique,couleurouluminance(l’intensitélumineuseémise/réfléchiedansunedirectiondonnéeparunitédesurface), leur friabilité et leur réhydratabilité (AbdelGawadetal.,1989).

3. utilisation des cryoProtecteurs

3.1. cryoprotection des bactéries lactiques

Il existe des substances protectrices qui permettentaux cellules de mieux supporter une congélation ouunedécongélationlentesetunstockageàtempératuresupérieureà-50°Cappeléescryoprotecteurs(Fonsecaetal.,2001).Lescryoprotecteurssontgroupésendeuxclassesquinesontpasforcémentexclusives(tableau 1).Ondistingueainsilessubstancesquipénètrentdanslescellules(cryoprotecteursintracellulaires,CPI)etcellesquidemeurentàl’extérieurdescellules(cryoprotecteursextracellulaires, CPE). Les bactéries contiennentnaturellementdescryoprotecteurs:lessucres(sucroseet tréhalose), chez les bactéries gram+ (Bert et al.,1998); les polyols (glycérol, sorbitol et mannitol),que l’on retrouve chez les algues, les champignons,les levures, les plantes et certaines bactéries (Ketset al., 1996), les acides aminés et dérivés (bétaïneet carnitine), chez plusieurs groupes de bactéries(Csonka, 1989) et l’acide tetrahydroxypyrimidinecarboxylique (hydroxyectoïne) chez les bactérieshalophiles (DelMoral et al., 1994), le glutamate, laglutamine, la proline et l’alanine chez Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Pseudomonasetd’autresmicro-organismes et les acides aminés bêta chez lesbactériesméthanogènes.

3.2. Mécanismes d’action des cryoprotecteurs

Lesmécanismes de la cryoprotection sont l’objet denombreusesétudesdenosjours.Lesmodesd’actionlesplusprobablessont:unaccroissementduvolumedela

phaseliquideinterstitielle,àunetempératuredonnée,pardépressiondupointdecongélationcommençanteetdoncréductiondeseffets liésàunrefroidissementlent;unediminutiondelatailledescristauxdeglacepar abaissement de la température de nucléation,une réduction de leur vitesse de croissance et unestabilisation de la configuration native des protéines(Leslieetal.,1995).Lorsquelespremierscristauxdeglaceapparaissent,lesCPEseconcentrentuniquementà l’extérieur des cellules, contrairement aux autressolutésquiseconcentrentàl’intérieuretàl’extérieurdescellules.Laperted’eaudescellulesconduitdoncàuneconcentrationensolutés.Celle-ciestplusfaibleenl’absencedeCPE,cequiminimiseainsileseffetsdel’accroissementdeconcentrationenliquideinterstitiel(Fonseca et al., 2001). Au niveau des membranescellulaires séchées, des sucres comme le tréhaloseet le saccharose peuvent remplacer les moléculesd’eaudans leur liaisonavec lesgroupespolairesdesphospholipides,empêchantainsilesdommagesdurantla réhydratation (Leslie et al., 1995).Le tréhalose etle saccharose stabilisent la structure des protéinesintracellulaires par ce phénomène de remplacementde l’eau(Carpenteretal.,1993).D’autresétudesontmontréquelescryoprotecteursétaient indispensableslorsde lacongélation,quellesquesoient lescourbesde refroidissement. Tous les cryoprotecteurs nepénètrentpasdanslescellules(Peggetal.,1988).Lescryoprotecteurs diffusants vont se substituer à unepartie de l’eau intracellulaire et permettre ainsi unedéshydratationpartielledescellules,enplusdelimiterla formation de cristaux de glace intracellulaire. Ilsréduisent également la vitesse de croissance de cescristaux,abaissent la températuredesolidificationdel’eau intracellulaire, telun«antigel»etmodifient laforme des cristaux de glace (O’Byrne et al., 2002).Quantauxcryoprotecteurspénétrants(nondiffusants),ilsprotègentaussiaucoursdelacongélationetdeladécongélation en réduisant la taille des cristaux deglace et en induisant des formes de cristaux moinstraumatisantes. Ils permettent, via l’augmentationdelaviscositédumilieu,ladiminutiondelarapiditédes mouvements de l’eau et de chocs osmotiques

tableau 1. Quelquescaractéristiquesetsubstancesutiliséescommecryoprotecteursintracellulaires(CPI)etextracellulaires(CPE) (d’après Anchordoguy et al., 1987) — Some characteristics and substances used as intracellular (CPI) and extracellular cryoprotectants (CPE) (according to Anchordoguy et al., 1987).caractéristiques intracellulaires (cPi) extracellulaires (cPe)Poidsmoléculaires(g.mol-1) <400 >10000Activitéàuneconcentrationdel’ordrede lamole(M) lamillimode(mM)Exemplesdemoléculesutilisées glycérol,dyméthylsulfoxyde,méthanoléthanol, polyvinylpyrolidone,

polyéthylèneoxyde,(PEO-400),diméthyl, amidonhydroxyéthyle,acétamide1-2propanediol dextran


importants.Deplus,ilspermettent,vial’augmentationde la pressionosmotique, la réductionde la quantitédecryoprotecteurspénétrantsnécessairesàunebonneconservation(Milleetal.,2005).

4. acides Gras et oxydation cellulaire

4.1. rôles des acides gras au niveau des bactéries et mécanismes d’oxydation des lipides

Les lipides membranaires sont l’objet d’intensesmodificationsenvuedemaintenirunefluiditéetainsiassurerlaperméabilitédesmembranescellulaires.Cetteactivitéestindispensablepourlebonfonctionnementdescellulesencasdestress.L’élévationdelatempératured’incubation chez L. plantarum (tableau 2) a unimpact sur l’augmentation de la synthèse des acidesgras insaturés (C18:1 principalement) d’une part etd’autre part, sur l’augmentation de la synthèse desC16:0,afinde réguler lafluiditémembranaire (Russellet al., 1995). Dans les mêmes conditions, pourL. monocytogenes,onnoteunebaissede la synthèsedesC15:0etuneaugmentationdelasynthèsedesC17:0ainsiquedesC18:1(Russelletal.,1995).Aucoursdustockage, les phénomènes d’oxydation des lipidesmembranaires sont responsables des dégradationsdescellulesissuesdelalyophilisationetdelabaissede viabilité. Ayant pour substrats les acides grasinsaturés, le degré d’oxydation et la vitesse serontfonction des insaturations (Rousch et al., 2003). Ladifférence fondamentale entre les acides gras saturéset les acides gras polyinsaturés existe au niveau dela température, tandis que les acides gras saturéss’oxydent à une température supérieure à 60 °C, lesacides gras polyinsaturés s’oxydent même lors del’entreposagedesalimentsàl’étatcongelé(Nikietal.,2005). Plusieurs mécanismes naturels de contrôlede l’oxydation sedéroulent auniveaudes cellules et

ontpourbutdeprévenir ladestructionoxydativedeslipides membranaires, des protéines et des acidesnucléiques (Pereira et al., 2003).Lesmécanismesderégulationdessystèmespro-oxydantsetantioxydantssontmisenplacepourmaintenir l’équilibreentrelesfacteursimpliquésdanslesréactionsd’oxydation.Maiscette régulation des facteurs pro- et antioxydants estperturbéedurantlesprocessusdetransformationetdestockagedesproduits,cequifavoriseledéveloppementdes réactions d’oxydation (Niki et al., 2000). Selonles travaux effectués par Steinberg et al. (1989), lesfacteursquiinfluencentouquiinitientl’oxydationdeslipidessontdedeuxtypes:– des facteurs intrinsèques tels que la composition en acides gras des lipides (nombre et positiondes insaturations), la présence de pro-oxydants (ions métalliques, enzymes, etc.) ou d’antioxydants naturels(tocophérols,caroténoïdes,etc.)– des facteurs externes tels que la température, la lumière,lapressionpartielleenoxygène,l’activité de l’eau, les conditions de stockage et de transformation(Steinbergetal.,1989).

La classification de l’oxydation est fonctiondes agents initiateurs, ainsi on distingue trois typesd’oxydationdeslipides:– l’auto-oxydation catalysée par la température, les ionsmétalliquesetlesradicauxlibres,– laphoto-oxydation,initiéeparlalumièreenprésence dephotosensibilisateurs,– l’oxydationenzymatiqueinitiéeparlaprésencedes enzymesd’oxydation.

4.2. auto-oxydation

Dans la nature, il existe un certain nombre d’auto-oxydations, dont celle du dioxygène (O2) qui donnenaissance à l’ozone (O3). Dans l’organisme, l’auto-oxydation, ou oxydation spontanée de certainscomposants, forme essentiellement des peroxydes,

tableau 2.Effetdelatempératuredeculturesurlacompositionenacidesgras(%)chezLactobacillus plantarum—Effect of the temperature of culture on Lactobacillusplantarum fatty acids composition (%) (Russelletal.,1989).acides gras nom commun nom scientifique composition en acides gras

10°c 30°c 40°cC16:1 Acidepalmitoléique acide9-hexadécénoïque 11 18 2C16:0 Acidepalmitique acidehexadécanoïque 15 30 56C17:0cyc Acidemargarique acideheptadécanoïque <1 trace traceC18:1 Acideoléique acide9-octadécénoïque 56 34 11C18:0 Acidestéarique acideoctadécanoïque 10 4 13C19:0cyc Acidenonadécyclique acidenonadécanoïque 6 8 16cyc:acidegrasdeformecyclopropane—cyclopropane fatty acid.


dégradés ensuite par des enzymes spécifiques: lesperoxydases. Pour ce qui est des lipides, l’oxydationest une réaction auto-catalytique. Il s’agit d’unenchainementderéactionsradicalairessedéroulantentroisétapes.Unepremière réactionproduitun radicallibre par élimination d’un hydrogène de l’acide gras(Phased’initiation).Laréactions’auto-entretient,puislesréactionss’enchainentpourproduireplusieursradicauxlibres (Phase de propagation), les lipides insaturésdisparaissent progressivement et la concentration enhydroperoxydes croît pour atteindre son maximumaumilieu de la phase de propagation (Pereira et al.,2003). Les réactions d’auto-oxydations conduisent àlaformationderadicauxlibrespuisd’hydroperoxydes,composésintermédiaires,quiàleurtoursedécomposentendonnantnaissanceàdescomposésvolatils,composésfuraniquesetsurtoutaldéhydessaturésetinsaturés.Leshydroperoxydes, les premiers produits de l’oxydationdeslipides,sontinstables(Noguchietal.,2002).Cetteinstabilité engendre une série de réactions complexesquiaboutissentàunemyriadedecomposésayantdespoidsmoléculairesvariables.

4.3. Photo-oxydation

Comme évoqué pour l’auto-oxydation, la photo-oxydationquiestuneoxydationinduiteengrandepartieparlaprésencedelalumièreetdephotosensibilisateurstels que les hémoprotéines, la chlorophylle ou lariboflavine,estaussiunevoieimportantedeproductiond’hydroperoxydes en présence d’oxygène. Pour cequiestdumécanisme,lesphotosensibilisateurs(Sens)absorberaient l’énergie lumineuse afin d’atteindre unétatdetripletexcité(Sens3).Cesphotosensibilisateursinterviennent dans l’oxydation des lipides selondeuxtypesdemécanismes(Noguchietal.,2002).

Le premier type demécanisme est induit par desphotosensibilisateurs (typeI), tels que la riboflavine,quiagissentcommedesradicauxlibresinitiateurs.Dansleurétat triplet,ellesarrachentunatomed’hydrogèneouunélectronauxmoléculeslipidiquespourformerunradicalcapablederéagiravecl’oxygène:

Sens3+RH—›SensH+R° (1)

Selon le second mécanisme, les moléculesphotosensiblesdetypeII,tellesquelachlorophylleetl’érythrosine, réagissent dans leur état excité (Sens3)avec l’oxygène triplet auquel elles transfèrent leurénergiepourdonnerdel’oxygènesingulet(1O2):

Sens3+3O2—›1O2+Sens (2)

L’oxygènesinguletainsiforméesttrèsélectrophileet peut réagir directement sur un acide gras insaturé(RH)formantainsiunhydroperoxyde(ROOH):

1O2+RH—›ROOH (3)

Les réactions radicalaires interviennent en chaineparlasuitedecetteauto-oxydation.SelonlestravauxeffectuésparLaineetal. (2006), leshydroperoxydesainsiforméssontdifférentsdeceuxformésparauto-oxydation.

4.4. oxydation enzymatique

Après l’auto-oxydation et la photo-oxydation, untroisièmetyped’oxydationalieuauniveaudeslipidesissus généralement des plantes. Cette oxydation estinitiéepardesenzymes,d’oùlephénomèned’oxydationdes acides gras insaturés d’origine enzymatique.Lesdeux enzymes principalement impliquées sont lalipoxygénase et la cyclooxygénase. La lipoxygénasecatalyse l’insertiond’unemoléculed’oxygènesurunacidegrasinsaturéselonuneréactionstéréospécifiqueet aboutit à la formation d’hydroperoxydes (Pereiraet al., 2003). Elle agit spécifiquement sur les acidesgras non estérifiés. Son activité est donc souventcouplée avec celle des lipases et des phospholipasescomme l’indique la figure 4 (Fauconnier et al.,1997). La cyclooxygénase est une lipoxygénase quiincorpore deuxmolécules d’oxygène au niveau d’unacide gras insaturé pour former des hydroperoxydesspécifiques. L’oxydation enzymatique se produitmêmeàbassetempérature.Durantlestockage,àl’étatcongelé,l’activitéenzymatiqueestralentie.À-40°C,l’oxydationenzymatiquedeslipidesestcomplètementarrêtée. Cependant, dès la décongélation amorcée etdestempératuresde0°Cà4°Catteintes,cetteactivitéreprendets’accentue.

5. PrinciPaux Facteurs de l’oxydation des liPides et ses iMPacts sur la viabilité cellulaire

Plusieursfacteurssontimpliquésdansl’oxydationdeslipidesaucoursdesprocédésdetransformationetdeconservation des aliments. Parmi celles-ci, citons latempérature,lepH,l’activitédel’eau(aw)etlapressionpartielle en oxygène (PO2) (Chatterjee et al., 2000).Uneélévationde la température favorise l’oxydationdes lipides. Cette oxydation est d’autant plus rapidequelatempératureestimportante.Ainsi,lesopérationsdecuisson,parexemple,sontbienconnuespouravoirun effet pro-oxydant marqué (Howlett et al., 1997).Quant à la congélation, par contre, elle se révèlecomme un bon moyen pour augmenter la durée deconservationdes aliments, car la vitessed’oxydationdeslipidesestnotablementréduiteàfaibletempérature.L’influencedupHdansledéroulementdel’oxydationse manifeste par le biais de plusieurs mécanismes.


Premièrement, pour les réactions d’oxydo-réductionfaisant intervenirdesprotons(H+), lepotentiel redoxdécroîtlinéairementaveclepH.UnpHacidefavorisedonclaréactiond’oxydation,enparticulierquandlesespècespro-oxydantes(ionsdesmétauxdetransition)ou antioxydantes (acide ascorbique, BHT et BHA)solublesenphaseaqueusesontprésentes.L’activitédel’eaud’unsystèmeinfluencelesréactionsd’oxydationdeslipides.Eneffet,l’eaupermetlamobilisationdessubstances pro-oxydantes ou antioxydantes (Chen etal.,2006).Engénéral,uneactivitéd’eau(aw)compriseentre 0,2 et 0,3 correspond aux vitesses d’oxydationles plus faibles. Ces valeurs correspondent à laformation d’une couche monomoléculaire d’eauautour des constituants. Par contre, une aw compriseentre 0,6 et 0,8 correspond aux vitesses d’oxydationles plus grandes. L’oxydation des lipides genère deshydroperoxydes.

LesdommagescausésauxLABpendantlestockagesont également attribués aux modifications dans leprofil des acides gras (taux d’acides gras saturés etd’acidesgrasinsaturés)delamembrane,pourlaquellel’oxydation des lipides est une cause importante(Castroetal.,1995;Castroetal.,1996;Teixeiraetal.,1996;Andersenetal.,1999).L’oxydationdeslipidespeut donner lieu à des changements physiques danslesfonctionsetlesstructuremembranaires(In‘tVeldetal.,1992;Borstetal.,2000).Laperterapidedelaviabilitétendàseproduireaudébutdelapériodedeconservation(Korobkinaetal.,1982;Brennanetal.,1983;Kingetal.,1993),tandisqueleschangementsdanslacompositionlipidiquedelamembranecellulaire

augmententaucoursdustockage(Teixeira et al., 1996). En outre,il est établi aujourd’hui que laconséquence des nombreusesoxydations biologiques est laformation de radicaux libres,qui sont l’une des principalescauses de la mort cellulaire(Van de Guchte et al., 2002).L’attaque des acides gras parles radicaux libres diminuel’hydrophobicité en raisonde l’introduction de groupeshydrophiles et affaiblit, parconséquent, l’interactionhydrophobe des protéinesmembranaires (Santivarangknaet al., 2008). Par exemple, unediminution de l’activité del’ATPase membranaire a étésuggéréecommeconséquenceduchangement de cette interaction(Castro et al., 1996). Leschangementsaffectentaussi,dans

lamembrane,certainsmécanismesdecontrôleliésàlarégulationetàlaréplicationdel’ADN,carl’initiationde la synthèse d’ADN et son maintien requièrentl’attachement du complexe d’ADN à la membranecytoplasmique (Israeli et al., 1975). En outre, lesradicaux libres peuvent aussi bien directementprovoquer des dommages de l’ADN (Inouye, 1984;Akasaka,1986;Hruszkewycz,1988).Bienqu’ilsoitplausible d’ajouter un antioxydant pour diminuerl’oxydation des lipides, l’addition doit être exercéeavecsoin.Cesméthodesetcomposésservirontdanslasuiteàdéfinirlesdifférentesapprochesafind’inhiberl’oxydationcellulaire.

6. diFFérentes aPProches Pour inhiber l’oxydation des starters lactiques lyoPhilisés au cours du stocKaGe

Lecontrôleoul’inhibitiondel’oxydationdeslipidesestbaséesurlamaitrisedesparamètres:température,pH, aw et concentration en oxygène (Coulibaly etal., 2009). Selon Buettner (1999), les antioxydantssusceptibles de protéger les lipides de l’oxydationpeuventêtrerépartisendeuxtypes: lesantioxydantspréventifs qui empêchent la formation d’espècesréactives de l’oxygène ou interceptent les espècesresponsables de l’initiation de la lipoperoxydation etles antioxydants «chain breaking » qui interceptentlesradicauxpropagateursdelaperoxydationlipidiqueetretardentlaperoxydation(périoded’induction).

Figure 4. Les principales voies de la lipoxygénase — The main lipoxygenase pathways(Fauconnieretal.,1997).

Acides gras

Acyle hydrolase

Lypoxygénase

Cétols et acidejasmonique lyase

9- et 13- hydroxyperoxydes

Hydroxyperoxydelyase

Allène oxy

de

synthase

Div

inyl

e ét

her

synt

hase

Divinyle éther d’acides gras Aldéhydes, alcanes oualcools et oxo-acide

Acide linoléiqueAcide linolénique


6.1. Mécanismes d’action des antioxydants préventifs

les chélateurs des métaux de transition. Lecycle redox de certains métaux, responsable dans laproduction des radicaux libres, est bloqué par deschélateursdemétaux.Cesontdesprotéinestellesquelatransferrine,laferritine,lalactalbuminequiséquestrentlefer, lacéruloplasmineetl’albuminequisequestrentle cuivre (Muggli, 1993). Notons au passage quelesflavonoïdes sontdebonschélateursdu fer, cequiest un des mécanismes de leur activité antioxydante(VanAckeretal.,1998;Moreletal.,1993).

les désactivateurs (quencher) de l’oxygène singulet.Selon Buettner, ils peuvent agir par désactivationchimique en se fixant sur une molécule telle qu’unacide gras pour donner un hydroperoxyde: 1O2 +LOH→LOOH,ouencorepardésactivationphysiqueéliminant l’énergie d’excitation sans changementchimique: 1O2 + β-carotène → O2 + β-carotène.Les caroténoïdes sont particulièrement efficaces. Lelycopèneestleplusréactif.

élimination des hydroperoxydes. Les hydro-peroxydes sont générateurs de radicaux libres, leurélimination prévient l’oxydation des biomolécules.Les hydroperoxydes (LOOH) peuvent être réduitspar des enzymes. La glutathion peroxydase (GPx)élimineleshydroperoxydesorganiquesetleperoxyded’hydrogène(H2O2).

les piégeurs d’oxygène.Cesontdesmoléculestellesquelessulfitesoul’acideascorbique.

6.2. Mécanismes d’action des antioxydants de type « chaine rompue » (« chain breaking »)

Cette catégorie d’antioxydants va réagir le plussouvent avec les radicaux peroxyles (LOO°) oualcoxyles (LO°) interrompant ainsi la réaction depropagation de la peroxydation. Cette catégoried’antioxydants va réagir le plus souvent avec lesradicaux peroxyles ou alcoxyles, interrompant ainsila réactiondepropagationde laperoxydation. Il està noter que ces antioxydants n’inhiberont pas parconséquent l’autoxydation des lipides par l’oxygènesingulet. Ces antioxydants peuvent agir selon deuxmécanismes.

les donneurs d’hydrogène. Ces antioxydants sontprincipalementdes composésphénoliquesmono-oupolyhydroxylés (tocophérols, tocotriènols, BHT,BHA, flavonoïdes, etc.). Ils sont susceptibles decéderunhydrogèneauradicalalcoxyleetauradicalperoxyle.Aprèslaréactiond’oxydation,l’antioxydant

esttransforméenunradicalquidoitêtresuffisammentstablepourinhiberlaformationd’unautreradicaletarrêterainsilapropagationdelachaineradicalaire.Ildoitensuiteévoluerversunproduitd’oxydationstable,ce qui conduit à la consommation de l’antioxydant.Le tocophérol donnera un radical tocophéroxyle quiévolueraversuncomposéd’oxydationnonradicalairetel que la tocophérylquinone ou un composé dedimérisationoudepolymérisationsupérieure.

les antioxydants « sacrifiés ». Le qualificatif de«chain breaking antioxidant sacrificial » employépar Buettner concerne des molécules, elles-mêmesradicalaires,quiréagissentaveclesradicauxperoxylesoualcoxylespourdonnerdesproduitsnonradicalaires,interrompantainsilapropagationdelaperoxydation.Deux radicaux sont connus pour se combiner aveclesradicauxperoxyles,lemonoxyded’azote(NO)etl’anionsuperoxyde(O2-):

LOO+NO→LOONOetLO+NO→LONO

Mécanismes d’action mixtes des antioxydants.Certainsantioxydantsontdesmodesd’actionmixtes.Deux exemples peuvent illustrer ces mécanismesmultiples.L’exempledel’acideascorbique,quiestundésactivateurdel’oxygènesingulet,éliminel’oxygènemoléculaire;ilestaussiundonneurd’hydrogèneauxradicaux lipidiques et aux radicaux tocophéroxylespour régénérer le tocophérol.Quant auxflavonoïdestelsquelesanthocyanines,lescatéchines,lesflavones,lesflavonols,lesisoflavonesetlesproanthocyanidines,ce sont des chélateurs demétaux, piégeurs d’anionssuperoxydeetdonneursd’hydrogène.L’utilisationdesantioxydants (tocophérols, polyphénols, flavonoïdes,vitamineE,vitamineC,etc.)est souvent laméthodela plus courante en industrie agro-alimentaire pourinhiber l’oxydation des lipides. Les antioxydantsutiliséssontsoitdesagentsdepréventionquibloquentlaphased’initiationenréagissantaveclesinitiateursde la réaction (O2, lumière, métaux, etc.), soit desagentsdeterminaisonquibloquentlapoursuitedelaphasedepropagationenréagissantaveclesradicauxlibresetenlestransformantencomposésstables(Nikietal.,2000).

7. conclusion

Il est donc possible de conserver par lyophilisationun grand nombre de bactéries lactiques, à l’échelledulaboratoire,maisaussiindustrielle.Lesconditionsopératoires qui permettent d’obtenir une bonneconservation de l’activité métabolique des bactériessont relativement bien connues, à l’inverse desmécanismes de leur altération. La résolution des


difficultés, telles que la mauvaise conservation decertaines souches à l’état lyophilisé et la reprised’activitésouventtroplentedesfermentsdestinésauxensemencementsdirects,passecertainementparunemeilleure compréhension de ces mécanismes. Pouroptimiser la conservation, plusieurs techniques etvoiesde recherchesdoivent êtremenéesde concert.Parmilesplusprometteuses,onpeutciterl’étudedesmodificationssubiesparlesstructuresmembranairesaucoursdestraitementsdeconservation,larecherchede formulation incorporant des cryoprotecteurs plusefficaces, l’induction des mécanismes de résistanceà ces traitements (par adaptation des bactéries, parleur culture, dans des conditions appropriées ouéventuellement par utilisation d’antioxydant afin debloquerlephénomènedeperoxydation).

remerciements

Nous remercions très sincèrement le personnel du CWBI(CentreWallondeBiologieIndustrielle)poursonassistanceet son dévouement ainsi que Maryse Hardenne, VincentHotte et Dany Trisman de l’Unité de Chimie organiquede Gembloux Agro-Bio Tech. Je remercie également laRépubliquedeCôted’Ivoirepoursonsoutienfinancier.

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techniques de séchage des starters lactiques et mécanismes

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