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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEURE ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN ES- SENIA

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Laboratoire de Biotechnologie des Rhizobiums et Amélioration des Plantes

Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magister

Spécialité : Amélioration des plantes

Option : Sélection

Intitulé ;

Présenté par : Melle Hammou Bakhta

Devant la commission du jury : Président : Pr. BEKKI .A Professeur Université d’Es-Senia Oran Rapporteur : Pr. FYAD F.Z Professeur Université d’Oran Es- Sénia Examinateur : Dr. BENBAYER .Z Docteur Université d’Oran Es- Sénia Examinateur : Pr. AOUES .A Professeur Université d’Oran Es- Sénia

RECHERCHE DE MARQUEURS GENETIQUES LIES A

LA TOLERANCE A LA SALINITE CHEZ DES ECOTYPES

D’ESPECES ANNUELLES DE MEDICAGO

Année Universitaire : 2009-2010

http://www.pdfcomplete.com/cms/hppl/tabid/108/Default.aspx?r=q8b3uige22

Sommaire

Remerciement

Dédicace

Résumer.

INTRODUCTION ................................................................................................................. 01

PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I : Présentation de la plante .................................................................................... 05

I. 1. Le genre Medicago : Taxinomie, aire de répartition et domestication: ............................... .05

I. 1. 1. Medicago truncatula .................................................................................................. .08

I. 1. 2. Medicago aculeata..................................................................................................... .08

I. 2. Medicago plante modèle pour l’étude des interactions plante- stress ................................. .10

I. 2. 1. Importance des légumineuses cultivées. ......................................................................... .10

I. 2. 2. Le genre Medicago comme modèle génétique ................................................................ .11

Chapitre II : Les stress chez les plantes ................................................................................. 15

II. 1. Qu’est qu’un stress ? ....................................................................................................... 15

II. 2. Le stress abiotique ......................................................................................................... 16

II. 3. La perception du stress et les différents types de senseurs ................................................. 16

II. 4. Transduction du signal : ................................................................................................... 18

II. 4. 1. Le calcium ................................................................................................................ 18

II. 4. 2. La voie SOS ............................................................................................................. 19

II. 4. 3. Les protéines kinases dépendantes du calcium (CDPKs) ........................................... 19

II. 4. 4. Les vois de MAPKinas ........................................................................................... 19

II. 4. 5. Les phospholipases ..................................................................................................... 20


II. 5. La salinité ........................................................................................................................ 21

II. 5. 1. Origine de la salinité ................................................................................................. .22

II. 5. 1. 1. Origine primaire ............................................................................................... .22

II. 5. 1. 2. Origine secondaire. ........................................................................................... 22

II. 5. 2. Le stress salin .......................................................................................................... 23

II. 5. 2. 1. Les réponses des plantes au stress. .................................................................. 23

II. 5. 2. 2. Tolérance au stress salin chez le « Medicago ». ................................................. 27

II. 5. 3. Les modifications métaboliques suite aux signaux du stress. .................................... 28

II. 5. 3. 1. Synthèse des protéines. ......................................................................................... 29

II. 5. 3. 2. Synthèse des enzymes. .......................................................................................... 32

Chapitre III : Les marqueurs isoenzymatiques. .................................................................... 36

III. 1. Définition d’un marqueur ............................................................................................... 36

III. 2. Les isoenzymes ............................................................................................................. 38

III. 2. 1. Les estérases. ........................................................................................................... 39

III. 2. 2. Les peroxydases .................................................................................................... 40

III. 2. 2.1 Définition ......................................................................................................... 40

III. 2. 2. 2. Historique. ......................................................................................................... 41

III. 2. 2. 3. Structure chimique ............................................................................................. 41

III. 2. 2. 3. Localisation et mobilité des peroxydases. ........................................................... 42

III. 2. 2. 5. Rôle physiologique ............................................................................................ 42

DEUXIEME PARTIE : PARTIE EXPERIMENTALE

Chapitre IV : Matériel et Méthodes. ...................................................................................... 46

IV. 1. Matériel végétal ............................................................................................................. 46

IV. 2. Protocole expérimental ................................................................................................... 47

IV. 3. Séparation des isoenzymes (estérases et peroxydases) par électrophorèses PAGE : ........ 47


IV. 3. 1. Extraction des estérases et des peroxydases. ....................................................... 48

IV.3. 2. Préparation du gel pour les estérases et les peroxydases ...................................... 48

IV. 3.3. Condition de migration des estérases et les peroxydases ...................................... 48

IV. 3.4. Révélation des estérases ....................................................................................... 49

IV. 3.5. Révélation des peroxydases .................................................................................. 49

Chapitre V : Résultats et interprétation ................................................................................ 51

V. 1. Résultats relatifs aux estérases ....................................................................................... 51

V. 2. Résultats relatifs aux Peroxydases ................................................................................... 58

V. 2. 1. Changements des profils des peroxydases chez les deux espèces Truncatula et

Aculeata.et une population sauvage (inconnue)......................................................................... 58

V. 2. 2. Changements des profils des peroxydases chez la population sauvage de Medicago. .... 62

VI. Discussion .......................................................................................................................... 65

VI. 1. Modification des estérases sous un stress salin. .............................................................. 65

VI. 1. Modification des peroxydases sous un stress salin .......................................................... .71

Conclusion et perspective ....................................................................................................... 77

- Références bibliographiques


Au nom de Dieu je dédie ce modeste travail :

La mémoire de ma mère, qui M’a appris la patience, la volonté….

Mon père pour ses prières et son sacrifice.

Mes sœurs et mes frères

AISSAM

Mes collègues et amis

Et a toutes les personnes qui portent le nom Hammou et Yagoubi


Ma profonde gratitude s’adresse en premier lieu à Dieu dont l’aide et l’assistance m’ont permis de suivre ma formation au sein de ce laboratoire afin de réaliser ce travail.

Merci au Laboratoire Génétique et amélioration des plantes en nommant sa directrice Madame Fyad-Lameche F-Z pour m’avoir accueillie pendant ces 4 années de travail. Mes remerciements s’adressent également aux différents membres du jury : Monsieur BEKKI .A professeur à l’université d’ES_SENIA d’Oran pour avoir accepter d’honorer la présidence du jury.

Madame BENBAYER .Z Docteur à l’université des Sciences d’Oran pour avoir accepter d’examiner ce travail.

Monsieur AOUES .A Professeur à l’université d’ES_SENIA d’Oran qui a bien voulue participer au jury en tant qu’examinateur.

Merci à Monsieur YAHIA.N collaborateurs au laboratoire de génétique et d’Amélioration des plantes pour m'avoir appris les techniques d’électrophorèse, pour m'avoir soutenue au cours de l'élucidation des mystères peroxydasiques et Pour son aide précieuse durant mes années de thèse.

J'adresse mes remerciements les plus chaleureux à Melle Lachheb Fayrouse pour sa première correction de thèse, pour sa gentillesse et pour son amitié, qui s’est muée en fraternité, ainsi que pour tous les moments partagés autour d’un repas de midi ou d’une tasse de thé à discuter de tout et de rien…

Je tiens à adresser ma vive reconnaissance à tous mes professeurs de collège, de CEM, de Lycée en particulier Mr Mahdi et Madame Khaldi.

Ce travail étant le fruit de nombreuses collaborations et contributions, J’exprime mes remerciements à toutes les personnes et à l'ensemble des membres du laboratoire de génétique et d’amélioration des plantes. Merci encore à ceux que je n'ai pas cité et qui ont également contribué à rendre ces quatre années distrayantes, mouvementées et particulièrement enrichissantes.

Je remercie enfin spécialement mes parents, mes sœurs et mes frères pour leur présence et leur soutien immuables dans les moments les plus durs pour tout cela, je leur Témoigne mon affection éternelle.

Résumé :

L‘Algérie représente l‘une des zones de diversité génétique les plus riches, où l‘on peut

recenser une grande variété de milieux agro-écologiques ; néanmoins la caractéristique

aléatoire des précipitations annuelles et les stress abiotiques imprévisibles et sévères viennent

souvent aggraver la situation de l‘agriculture algérienne, qui connaît un déficit fourrager

énorme, et les animaux sont souvent soumis à des périodes de disettes alimentaires fréquentes.

Cet état de fait a amené les décideurs à opter pour augmenter le nombre de forages, donc une

sollicitation plus accrue des nappes littorales.

La salinisation des sols qui recensée parmi les stress abiotiques représente un facteur limitatif

majeur de la production agricole de plusieurs pays méditerranéens, en particulier l’Algérie. Ce

qui fait l’objectif de cette étude, c’est l’identification des marqueurs isoenzymatiques en

particulier les estérases et les peroxydases liés à la tolérance au stress salin chez des espèces

annuelles de Medicago.

Les résultats de notre expérimentation montrent des profils isoenzymatiques de peroxydases

présentant par rapport aux témoins deux zones avec des variations quantitatives et

qualitatives. Le stress salin semble altérer le métabolisme normal de ces enzymes en le

retardant davantage chez les écotypes sensibles que les écotypes tolérants. De plus une

apparition de nouvelles bandes isoenzymatiques a été mentionné chez les écotypes sensibles

que chez les tolérants. De même, les profils des estérases présentant entre deux et trois zones

d’activités selon l’espèce, nous remarquons là aussi l’apparition de variations d'ordre

quantitatif et qualitatif. Outre de ces variations, une expression différentielle liée au stade de

développement de la plante au niveau du témoin est notée, alors que chez les traitées en plus

de bandes constitutives, des bandes spécifiques au stress apparaissent.

Mots Clés: Stress slain - Medicago - Estérases – Peroxydases.


Abstract:

Algeria represents one of the richest genetic diversity zones, where one can count a big

variety of agro-ecological surroundings; nevertheless the characteristic uncertain of the yearly

precipitations and the unforeseeable and abiotic stress comes to aggravate the situation of the

Algerian agriculture, that knows an enormous fodder deficit often, where the animals are

often submitted to periods of frequent food scarcities. This actual position brought the

decision-makers to opt to increase the number of forage, therefore a solicitation more

increased of the coastal tablecloths.

Salinity in sol is one of the major stress can severely limit crop production of many

Mediterranean countries, in particular Algeria.

Esterase and peroxidase isoenzymatiques pattern associated with salt tolerance in Medicago

were studied in this work. The results show two major zones of peroxidases with quantitative

and qualitative variation. We noted the presence of the novels bands exclusively in sensible

ecotypes.

Esterase activity shows 2 and 3 zone according to the species. Whereas at treated in addition

to the bands constitutive the specific bands to the stress appears to different salt

concentrations.

Key word: Salt Stress - Medicago - Estérases – Peroxydases.


ملخص

نذرتتقلبات المناخ و أنغیر . غني المناطق من حیث التنوع الوراثي النباتي أ الجزائر ھي واحدة من

.أحیانا النباتي الجزائري و بالتالي نقص العلف الحیواني اإلنتاجتعتبر عوامل قاسیة على مردود األمطار

المتوسط خصوصا األبیضالمحصول الزراعي في بلدان البحر على تؤثرالملوحة ھي احد العوامل التي

بیرو ایستراز و ( عالقة بین نوعین من االیزوانزیمات إلیجادالجزائر ، ھذا ما جعلنا نقوم بھذا البحث

.نبات البرسیم للملوحة جة تحملو بین در) زكسیدا

بین إنتاج ھذین النوعین من األنزیمات وین النتائج أظھرت أن ھناك اختالف كمي و نوعي مرتبط ب

. درجة تركیز الملوحة

.بیروكسیداز -استراز –الفصة –بالملوحة اإلجھاد: كلمات المفتاح


Introduction

1

Introduction :

L’amélioration des plantes se définit comme la recherche des meilleures voies permettant

de réaliser, à partir d’une constitution imparfaite, une structure génétique adaptée aux critères

et aux besoins des populations humaines (Demarly, 1977) cité par Baudoin (1995). Cette

amélioration des plantes pour la tolérance et/ou la résistance aux stress abiotiques, dans le but

d’augmenter, de stabiliser la productivité des plantes cultivées, et d’en élargir leur culture aux

régions marginalisées, a vu un succès indéniable à travers les techniques conventionnelles

d’amélioration. Au delà de la sélection classique, différentes techniques biotechnologiques

peuvent être utilisées pour améliorer la tolérance ou la résistance aux stress

environnementaux.

L’on sait que la faiblesse des superficies et de la production fourragère et pastorale, ainsi

que les périodes de disettes alimentaires constituent des obstacles majeurs au développement

de l’élevage des ruminants en Algérie. Citées comme solution les luzernes, de par leur facilité

d'utilisation, assurent l'amélioration de la flore et de la jachère et entrent en rotation avec les

céréales grâce à leurs graines dures (Abdelguerfi, 1987). En effet, elles permettent

l'enrichissement du sol en azote, sa protection contre l'érosion et l'amélioration de ses

propriétés physico-chimiques en rétablissant les réserves de matières organiques disparues.

Cependant, la production de semences constitue un frein à l'utilisation des luzernes annuelles

au niveau des jachères et des parcours.

L’Algérie se trouve parmi les pays qui présentent un besoin réel en fourrage. Le

remplacement de la jachère par une culture fourragère assurera sans aucun doute une

meilleure intégration de l’élevage à l’agriculture. Hormis le rôle de fixation de l’azote

atmosphérique, ces espèces possèdent un système racinaire très puissant qui permet

l’utilisation des éléments fertilisants sur une profondeur rarement atteinte par d’autres


Introduction

2

cultures. De ce fait, la luzerne est considérée comme une culture améliorante de la structure et

de la texture du sol (Amouri, 2006).

Chaque année, les surfaces perdues à cause de la salinité des sols varient autour de 20

millions d'hectare dans le monde. Ainsi, ces surfaces sont passées de 48 millions à 265

millions d'ha de terres agricoles touchées par la salinité et aujourd’hui, les surfaces agricoles

affectées dans le monde seraient de 340 millions d'ha soit 23% des terres cultivées dans le

monde (Cheverry, 1995). Selon Szabolcs (1994), un milliard d’ha est menacé dont 3,2

millions d’ha en Algérie (Belkhodja et al., 2004).

Il est avéré que la salinité constitue l’un des stress abiotiques des sols les plus répandus

au niveau de la planète limitant fortement leurs rendements (Khales et al., 2006). Par

conséquent, l’emploi de cultivars de Medicago tolérant le stress salin présente un avantage

d’autant plus viable du point de vue technico-économique.

Le genre Medicago est un genre qui renferme 34 espèces annuelles et 21 espèces

pérennes. Ces dernières présentent un intérêt agro-économique du fait de leur excellente

qualité fourragère et de l’enrichissement de la fertilité du sol qu’elles assurent (Lalaoui-Kamal

et al., 1997). C’est ainsi que dans le but de valoriser les ressources phytogénétiques en

Algérie, la connaissance des espèces à intérêt fourrager et pastoral représente une

préoccupation essentielle (Abdelguerfi et al., 1988).

Au cours de ces dernières décennies, ces propriétés ont trouvé des applications

agronomiques notamment dans la pratique des assolements légumineuses-Blés. C’est dans

une telle perspective qu’en Algérie, l’institut de développement des grandes cultures

(I.D.G.C.) s’intéresse à la recherche de cultivars adaptés à nos régions principalement semi-

arides ou les hivers sont rigoureux et où les sols sont souvent salés. C’est dans le but de

valoriser les luzernes sauvages d’Algérie que des travaux portant sur leur écologie et sur des

essais de sélection d’écotypes locaux ont été réalisés par plusieurs auteurs (INA collectif,


Introduction

3

1974; Adem, 1974; Abdelguerfi, 1976, 1978). La première évaluation génétique des

« médics » à l’échelle nationale est réalisée en utilisant les marqueurs iso-enzymatiques

comme moyen d’identification et de caractérisation génétique (El mousadik, 1991).

L’objectif de cette étude est d’identifier les marqueurs isoenzymatiques impliqués dans la

tolérance d’espèces du genre Medicago à un stress salin modéré et d’évaluer la diversité

génétique existant entre les espèces étudiées grâce à ces marqueurs. Pour cela, il a été

convenu d’opter pour l’approche d’analyse de l’expression des peroxydases ( PERs) et des

estérases ( ESTs).


Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago

5

Chapitre I : Présentation de la plante

I. 1. Le genre Medicago : Taxonomie, aires de répartition et domestication :

La plupart des espèces du genre Medicago sont connues depuis le XVIéme siècle, ainsi

dans « species plantarum » plus de 9 espèces sont décrites dont certaines avec plusieurs

variétés botaniques. Plusieurs travaux importants réalisés au cours du XIXéme siècle, mais mal

reliés entre eux, ont abouti à une description complète du genre Medicago menant à un grand

nombre de synonymes.

Un premier effort de synthèse – relativement incomplet – a été effectué par Urban

(1872). Ce n’est que vers le milieu du XXème siècle que ces espèces ont été réellement

étudiées. Aujourd’hui encore, des homonymies ou ressemblances peuvent prêter à confusion

et plusieurs limites d’espèces sont incertaines.

Le genre Medicago appartient à la famile des Fabaceae, sous famille des papilionoideae.

Il est proche des genres Melilotus et Trigonella, ainsi Medicago radiata L. est placée par

certains auteurs dans le genre Trigonella. Les caractéristiques principales du genre Medicago

L. (1754), peuvent être ainsi résumées : plantes annuelles ou pérennes, herbacées ou

arbustives, possédant une corolle papilionacée constituée d’un étendard, de pétales formant

deux ailes libres, d’une carène formée par les deux pétales inférieurs soudés ; neuf étamines

soudées forment la colonne staminale, une dixième étamine est libre. La corolle et la colonne

staminale constituent le dispositif de déclenchement de la fleur, caractéristique du genre,

retrouvé chez les espèces autogames. Le calice est formé de cinq sépales soudés. Les feuilles

sont trifoliées non terminées par une vrille. Le stipule est collé au pétiole. Les inflorescences

pédonculées portent de 20 à 30 fleurs libres. (Prosperi M, 1995). Ce genre comprend des

espèces diploïdes, tétraploïdes, exceptionnellement hexaploides (M. cancellata, M. saxatilis et

certaines populations de M. arborea). Le nombre chromosomique de base est de 7 ou 8. Les



6

ouvrages de références sont peut nombreux, on peut en citer deux : Negre (1956), Lesins et

Lesins (1979).

D’après Lesins et Lesins (1979), les formes les plus anciennes auraient été pérennes,

probablement ligneuses, préférentiellement allogames. Les formes annuelles se seraient

différenciées, il y a 6 à 7 millions d’années, au Miocène, à l’occasion des transgressions

marines du bassin méditerranéen. L’évolution du genre s’est accompagnée de modifications

morphologiques et biologiques. Les formes annuelles sont strictement autogames, très

souvent diploïdes et ont généralement des graines plus grosses (poids de 1000 graines

supérieures à 4g) que les espèces pérennes (pois de 1000 graines de 2 à 3 g) avec néanmoins

des exceptions notables.

Les aires d’origine de toutes les espèces du genre Medicago sont « le croissant fertile »,

recouvrant les pays ou régions actuelles de Turquie, Iran, Irak, sud du Caucase et le pourtour

méditerranéen. Ces espèces ont ensuite conquis l’ensemble de la zone méditerranéenne et les

steppes avoisinantes (voir Fig. 1). Au cours du XIXème siècle, elles ont ensuite envahi

d’autres parties du monde, en particulier les continents américain et australien à l’occasion

des différents courants de colonisation humaine.



7

Figure 1. Distribution du genre Medicago truncatula, Medicago littoralis et Medicago italica

par pays de provenance d’après Delalande, 2007.

M Truncatula

M Littoralis

M Italica



8

I.1.1. Medicago truncatula :

C’est une espèce de taille intermédiaire, 60 cm maximum, poilue, à port variable,

souvent prostrée, présente sur des sols lourds, marneux ou argileux. L’inflorescence porte de

1 à 5 fleurs. Les gousses sont cylindriques, en forme de tronc, glabres, très dures, à spires

jointive et serrées, aux épines recourbées, souvent perpendiculaires au plan des spires ( Fig. 4)

. Elles contiennent de 3 à 12 graines. Le poids de 1000 graines varie de 3.3 à 6 g. C’est une

espèce diploïde (2n=16).

M .truncatula est une espèce localisée principalement dans les zones méditerranéennes

chaudes et de basse altitude. On peut la classer parmi les espèces colonisatrices (Cockos et al.,

1980). Elle présente une adaptabilité et une variabilité importante vue la gamme de milieux

dans lesquels elle évolue.

Depuis quelques années, deux espèces-modèles, Medicago truncatula et Lotus japonicus

suscitent un intérêt croissant sur la scène internationale. De nombreux laboratoires, les

utilisent pour étudier divers aspects des interactions plantes-microorganismes. M. truncatula

est plus proche d'un point de vue phylogénétique de la plupart des légumineuses cultivées. En

Europe : elle fait partie du groupe des Galégoïdes qui contient les tribus des Trifoliées

(luzernes, trèfles) des Viciées (pois, féveroles, lentilles, vesces) et des Cicerées (pois

chiches)… Par ailleurs, aux USA, des institutions comme la NSF, l'USDA, et la Noble

Fondation ont opté pour M. truncatula comme modèle. C’est ce qui a axé notre choix sur M.

truncatula comme légumineuse-modèle.

I.1.2. Medicago aculeata:

Cette espèce ne diffère essentiellement des autres variétés que par les gousses, munies

sur leur suture d’aiguillions très courts, inégaux, un peu épais, sans tubercules ; elles ont

d’ailleurs la même forme, roulées cinq à six fois sur elles-mêmes, un peu comprimées à leur

deux extrémités, le poids de 1000 graines est élevé (souvent supérieur à 8 g) (Prosperi M,



9

1995), les fleurs sont aussi plus nombreuses, réunies au nombre de trois ou quatre à

l’extrémité d’un pédoncule plus long que les pétioles. Les folioles sont en ovale renversé, un

peu rhomboïdales, quelque fois plus allongées, les stipules dentées et un peu ciliées à leur

base ; les tiges très anguleuses, légèrement pubescentes et rameuses.

Figure 2. Différents modèles de la gousse du genre Medicago (Prosperi, 1995)

Figure 3. Medicago Aculeata (feuilles, gousses, fleur) (forage.okstate, 2008)

figure 4. Medicago Truncatula (feuilles, gousses, fleur) (Besancon, 2009)



10

I. 2. Medicago plante modèle pour l’étude des interactions plante-stress

environnementaux :

I. 2. 1. Importance des légumineuses cultivées

Les légumineuses (Fabaceae) sont définies par leur structure florale spécifique, la cosse

de leur fruit et surtout par l'aptitude (88% des espèces examinées) à former des symbioses

fixatrices d'azote avec les bactéries de la famille des Rhizobiaceae (de Faria et al., 1989). Ces

plantes viennent au deuxième rang après les graminées pour la satisfaction des besoins

alimentaires de l'homme (Graham et al., 2003). Les légumineuses comptent 670 à 750 genres

et 18000 à 19000 espèces différentes (Polhill et al., 1981). Elles comprennent d’importantes

espèces à graines, de pâturage et forestières.

Au niveau mondial les légumineuses à graines et de fourrage occupent près de 180

millions d’hectares représentant 12 à 15% de la surface des terres arables (F.A.O. 2007).

D’une part les légumineuses à graines couvrent 33% des besoins humains en protéines

alimentaires. Cette part est fournie, essentiellement, par les cultures du haricot, petit pois, pois

chiche et fève (Vance et al., 2000). Les graines de ces légumineuses contiennent

généralement 20 à 30% de protéines et sont particulièrement riches en Lysine (acide aminé

essentiel pour la croissance). Elles sont, de ce fait, complémentaires des profils nutritionnels

des céréales (Duranti et al., 1997), et représentent les principales sources de protéines dans les

pays en voie de développement et dans les régions subtropicales. Parmi les légumineuses, le

soja (Glycine max) et l'arachide (Arachis hypogea) fournissent plus de 35% des besoins

mondiaux en huiles végétales (F.A.O. 2007).

D’autre part, Les légumineuses fourragères, telles que la luzerne (M. sativa) et le trèfle

(Trifolium spp.) constituent une base importante de l’alimentation des productions animales

laitières et à viande en raison de leur faible coût, et de leurs qualités nutritives (richesse en



11

azote, énergie et fibre) améliorant la production de viande et de lait dans le monde (Russelle

2001), vu leurs richesses en protéines, fibres et énergie.

Enfin, les espèces ligneuses ont également montré une aptitude à séquestrer le carbone, ce qui

suggère aussi la possibilité de les utiliser pour s'opposer à l'augmentation du taux de dioxyde

de carbone dans l'atmosphère (Resh et al., 2002).

Par ailleurs, outre les bénéfices qu’elles entraînent pour l’alimentation et l’environnement, les

légumineuses peuvent être utiles dans diverses industries alimentaires (lait et dérivés, pain,

tourteau) et chimiques (plastique biodégradable, huile, bio-diésel, colorants, gomme, textile,

papier…) (Graham et al., 2003). Plusieurs légumineuses ont été utilisées dans l'industrie

pharmaceutique (Duke 1992; Kindscher 1992), en effet, les isoflavones du soja et d'autres

légumineuses ont été pressenties pour diminuer les risques de cancer et les effets du

cholestérol (Kennedy 1995; Molteni et al. 1995).

Bien qu’importantes sur les plans économique, écologique et industriel, les légumineuses

cultivées présentent des caractéristiques biologiques qui retardent leur amélioration génétique.

Elles possèdent en général un grand génome, sont souvent polyploïdes et leur transformation

par Agrobacterium est délicate voire impossible. C’est pourquoi, il a été décidé d’identifier

une espèce légumineuse modèle qui serait plus facile à manipuler et à étudier, et qui

permettrait, via sa synthénie avec les légumineuses cultivées, d’accélérer les recherches

fondamentales et l’amélioration génétique concernant les traits agronomiques d’intérêt : c’est

le genre Medicago truncatula.

I. 2. Le genre Medicago comme modèle génétique :

Les luzernes annuelles ou « médics » dont la culture a été développée par les australiens

dans le cadre du "ley farming system" (système céréale-médics), semblent constituer à cet

égard une solution intéressante (Puckridge et al., 1983). Diverses tentatives d’implantation de

ce système (Halse, 1993) ont été entreprises en Afrique du Nord (Doolette, 1980. ; Jaritz et



12

Amine, 1993 ; Maatougi, 1993). Une dizaine d’espèces parmies les 55 espèces de Medicago

recensés par Lesins & Lesins (1979) sont cultivées, la plupart sont présentes dans les

pâturages ou parcours, notamment méditerranéens.

La plus connue est sans conteste la luzerne cultivée (Medicago sativa L.). Cette espèce

constitue, avec les trèfles la principale ressource en légumineuses fourragères. Elle est

cultivée dans le monde entier : dans les années 1980 on comptait plus de 33 millions

d’hectares dont la majorité aux Etas Unis (13 millions d’hectares) et en Europe (8 millions

d’hectares) (Hanson et al, 1988). Le rôle agricole des espèces annuelles du genre Medicago a

été reconnu dès les années Trente quand Trumble et Donald (1938) ont recommandé la

culture de Medicago truncatula sur les sols calcaires de l'Australie du sud-ouest. Dans cette

région, les medics ont été utilisées en rotation avec les céréales et ont eu un grand impact sur

la production agricole (Cocks et al., 1980).

Medicago truncatula est actuellement une plante modèle pour la génétique moléculaire .

Historiquement, le choix de Medicago truncatula résulte d’un programme INRA (1985-1986)

dont l’objectif était de définir une espèce modèle à l’intérieur du genre Medicago, afin de

l’associer à Shinorhizobium melilloti, le microsymbiote bien étudié de la luzerne et constituer

ainsi un système symbiotique modèle plante-bactérie. En outre elle présente, comme

Arabidopsis une grande facilité de culture et un petit génome (Wollmen F-A 2004) d’environ

500 méga-bases/ cellule, c'est-à-dire trois à quatre fois supérieure à celle de Arabidopsis

thaliana et équivalente à celle du riz. La biodiversité de l’espèce M. truncatula est

caractérisée par une forte variabilité morphologique et génétique intra et inter populations et

par une importante homozygotie au niveau individuel.

Cette plante a été proposée comme légumineuse modèle (Barker et al., 1990; Cook

1999) en raison de ses nombreux atouts aux niveaux de la biologie, de la génétique et des

différents outils génomiques qu’elle offre (Huguet et al., 1996; Young et al. 1995). De plus,



13

Medicago truncatula présente une grande synthénie avec beaucoup de légumineuses cultivées

tels que le pois et la luzerne pérenne (Zhu et al., 2005), permettant ainsi le transfert des acquis

sur cette plante modèle vers ces légumineuses. Ces avantages sont mis à profit pour des

études de génomique fonctionnelle et structurale en vue de l’identification des gènes

agronomiques intéressants, ainsi que l’étude des interactions légumineuses-agents pathogènes

et symbiotes (Cook 1999, Cook et al., 2000).


Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes

15

Chapitre II : Le stress chez les plantes

Les plantes sont souvent confrontées à des conditions environnementales défavorables

qu’on peut dénommer ‘stress’ et qui ont pour conséquence une diminution de la croissance.

Tous les stress impliquent des réactions de signalisation capables d’aboutir à la mise en place

de défenses ou de déclencher une mort cellulaire programmée.

II.1. Qu’est qu’un stress ?

Le mot stress est apparu autour de 1940. Il s’agissait d’un mot anglais, employé en

mécanique et en physique, qui voulait dire «force, poids, tension, charge ou effort».

Le français Claude Bernard fut le premier à dégager une notion physiologique du stress

en 1868. Selon lui, les réactions déclenchées par le stress visent à maintenir l’équilibre de

notre organisme. L’ensemble de ces réactions internes a été nommé homéostasie par le

physiologiste américain C.W. Bradford (1915), à partir du grec « stasis » (état, position) et

homoios (égal, semblable à). Il y inclura en outre la notion de stress. Le lien stress-

homéostasie-adaptation va perdurer jusqu'à nos jours et les recherches menées concernant ces

processus sont à la base d’une littérature abondante. L’association de ces trois notions

constitue l’approche biologique du stress et permet notamment d’expliquer dans certaines

limites, l’adaptation à l’environnement, et donc au maintien de la vie (Roeder, 2006).

Selon Wang et al., 2001, les stress se traduisent chez les plantes par des changements

morphologiques et moléculaires qui affectent leur croissance et leur productivité.

D’une façon plus générale, on peut dire qu’au niveau cellulaire, un stress est causé par

la variation d’un paramètre environnemental qui entraine la mise en place des mécanismes de

régulation de l’homéostasie.



16

II. 2. Le Stress abiotique :

Lorsque les conditions environnementales sont susceptibles de provoquer chez une

espèce végétale une réduction de la croissance des individus ou une augmentation du taux de

mortalité de la population, ces conditions peuvent être assimilées à des conditions stressantes

(Tal, 1984).

Le stress peut être induit par une substance chimique ou une contrainte physique, de

manière réversible ou permanente, selon que les altérations provoquées dans ces conditions

disparaissent ou non, après retour à des conditions de croissance normale (Chrétien, 1992).

En effet les plantes se trouvent rarement dans des conditions environnementales optimales,

mais elles se trouvent souvent dans des conditions extrêmes de potentiel hydrique, de

température, de salinité ainsi que d’autres facteurs qui amènent les organismes à la limite de

la survie (Hopkins et al., 2003). Les stress abiotiques sont connus depuis longtemps chez les

plantes cultivées comme étant des facteurs limitant majeurs de la productivité (Boyer, 1982 ;

Balarathinasnasabathi, 2002), ils peuvent également affecter le fonctionnement de la plante en

perturbant les flux ioniques (Knight et al., 2001) ou en altérant les parois ou membranes

cellulaires (Zhu, 2001 ; Wang et al., 2003). Les organismes qui vivent dans ces habitats ou

ces facteurs prédominent, ont développé plusieurs adaptations.

II. 3. La perception du stress et les différents types de senseurs :

Les conditions du stress abiotique constituent une source de signaux complexes pour les

cellules. Un seul type de stress correspond à des variations physiques et/ou chimiques, ces

composantes représentant pour la plante des informations différentes. Les cellules végétales

ne possèdent pas un récepteur spécifique d’un stress donné, mais plutôt un ensemble de

récepteurs qui vent être sollicités par les différentes composantes du stress (Figure 5).



17

Figure 5 : Représentation générale de réponse au stress chez les plantes (D’après Wang

et al., 2003).

stress Perturbation de l’équilibre osmotique et de l’homéostasie ionique Dommages sur les protéines et les membranes

Stress secondair: Stress oxidatif

Stress osmotique

Senseur, canaux Ca2+, HK

2 nd messagers, MAPK, SOS, CDPK

Facteurs de transcription, (CBF,HSF)

Activation de

gènes

Chaperonnes

H2O et mouvement d

ions (transporteurs)

Détoxification

Osmoprotection

Résistance ou tolérance au stress

Perception du signal

Transduction du signal

Contrôle de la transcription

Mécanismes de réponse au

stress



18

Parmi les récepteurs identifiés se trouvent les canaux Ca2+. En condition de stress

thermique ou salin, il a été observé chez les plantes un influx de calcium dans le cytoplasme.

Ce calcium provient soit de l’extérieur de la cellule, soit de stocks internes (Knight et al. ;

2000). Cet influx résulterait d’une activation des canaux calciques induite par les

changements structuraux de la cellule. Cette supposition résulte des études de Pieth ( 1999)

montrant les liens entre les flux de Ca2+ et la température, considérant que la réorganisation

du cytosquelette et la fluidité de la membrane plasmique sont les premiers changements

structuraux liés au froid ( Orvar et al., 2000 ; Sangwan et al., 2001 et Wang et al., 2001) cité

par ( Roeder, 2006).

Les histidines kinases (HK) représentent un autre récepteur du stress identifié chez les

bactéries et les plantes. Ces enzymes transmettent un signal externe vers l’intérieur de la

cellule par un système de phospho-relais à 2 composants ( Urao et al., 2000). La protéine

AtHK1 est fortement suspectée d’être un capteur osmosensible chez A. thaliana ( Urao et al.,

1999)

II. 4. Transduction du signal :

Suite à la perception du stress, le signal crée par les récepteurs doit être transmis à

l’intérieur de la cellule. Cette transduction du signal est assurée par les «seconds messagers »

qui vont activer des voies enzymatiques assurant le fonctionnement de la cascade de réactions

et permettant à la cellule de répondre au stress perçu.

II.4.1. le calcium :

L’entrée de Ca2+ dans les cellules végétales a été observée en condition de stress

abiotique, mais également lors de stress hormonaux (ABA : acide abscissique), biotiques ou

lors de processus liés au développement. Cette augmentation transitoire de la concentration

interne de calcium est due soit à un influx de calcium extracellulaire soit à une libération des



19

stocks intracellulaires (Knight et al., 2000, Sanders et al., 1999). La libération interne de Ca2+

est contrôlée par des canaux dépendant de ligands. Ces ligands sont les seconds messagers

décrits chez les cellules animales ( inositol polyphosphates, ribose ADPcyclique), qui ont une

action similaire chez les plantes ( Schroeder et al., 2001).

II. 4. 2. la voie SOS :

Parmi les voies métaboliques activées par le calcium et participant à la transduction du

signal, l’une des plus étudiées à l’heure actuelle est la voie SOS (Salt Overly Sensitive).

L’analyse du mutant SOS chez A. thaliana a permis l’identification de 3 protéines (SOS1,

SOS2, SOS3), impliquées dans la réponse au stress salin ; le processus impliquant les SOS

débute après la fixation de calcium sur la protéine SOS3 qui contient 3 sites de fixation du

calcium et un site de N-myristilysation ( Ishitani et al., 2000).

II. 4. 3. les protéines kinases dépendantes du calcium ( CDPKs) :

Les CDPK (Protéines Kinases dépendantes du Calcium) interagissent directement avec

le calcium. Trente quatre gènes codants des CDRKs ont été identifiés chez A. thaliana. Les

recherches menées sur ces enzymes ont montré leur implication dans une variété de voies de

réponses à différents stress. Par exemple, la surexpression chez le riz (Oryza sativa)

d’OsCPKS7 entraîne une augmentation de la tolérance au froid, à la sécheresse et au stress

salin ( Saijo et al., 2000).

II. 4. 4. Les voies de MAPKinases :

La cascade type de la voie des MAPKinases (mitogen actived proteine kinases) est

constituée du système MAPKKK-MAPKK-MAPK. Cette cascade est activée soit par une

interaction physique directe entre le récepteur et une MAPKKK soit par la phosphorylation de

médiateurs externes ou de MAPKKKK intermédiaires, provoqué par ces mêmes récepteurs.

Les MAPKKK sont des serine / thréonines kinases qui activent les MAPKK par la

phosphorylation de 2 résidus serine / thréonine placés au sein d’un motif conservé ST-X3-5-



20

S/T. Ces MAPKK sont des kinases à spécificité double qui procèdent à) la phosphorylation

des thréonines et tyrosines des MAPK sur le motif TXY. Chez les végétaux supérieurs, les

MAPKs interviennent également dans la transduction du signal suite à un stress osmotique.

Un stress hyper-osmotique peut entraîner l’activation de kinases apparentées aux MAPKs

chez le tabac (Usami et al., 1995 ; Tena et al., 1998). Récemment, l’équipe de Munnik (1999)

a montré que, chez la luzerne, des concentrations de sels comprises entre 100 et 500 mM

entraînaient l’activation de la voie de SIMK (salt stress-induced MAPK). De manière

surprenante, des concentrations plus élevées de sels n’activaient non pas SIMK mais une

kinase de 35 kDa. Ces travaux révèlent l'existence probable de deux osmosenseurs chez la

luzerne, un pour des pressions osmotiques modérées, l’autre pour des pressions osmotiques

élevées.

En outre, il existe d’autres protéines kinases associées au cytosquelette. Suite au

séquençage complet du génome d’A. thaliana, 20 MAPK, 10 MAPKK et 60 MAPKKK ont

été identifiées. Des protéines similaires ont été aussi isolées chez d’autres végétaux

(Nakagami et al., 2005). Les MAPKKK son les premières kinases intervenant dans la cascade

de phosphorylation des MAPKK. Ainsi, il a été confirmé que les kinases de type MEKK sont

des kinases dont le rôle est identique à celui de MAPKKK, tandis que celui-ci reste à vérifier

pour les kinases de type RAF (MAPK Groupe, 2002).

II.4.5. Les phospholipases :

Une autre forme de la transduction du signal résulte de l’action des phospholipases. Les

phospholipase D (PLD) hydrolysent les phospholipides et produisent de l’acide

phosphatidique (PA), jouant ainsi un rôle important dans les mécanismes de la réponse au

stress, mais ce rôle varie d’une PLD à une autre. Par exemple, la suppression de PLDα chez

A. thaliana entraîne une baisse de la tolérance au froid tandis que sa sur-expression entraine



21

une meilleure tolérance chez ce même organisme (Li et al., 2004). Par comparaison, la

suppression de PLDα1 entraîne une meilleure résistance au froid (Weltri et al., 2002).

Un certain nombre de travaux montre que la quantité de phospholipides s’accroît

généralement dans les plantes exposées au froid. Il en est ainsi, par exemple, pour les tiges de

bouleau ou de peuplier (endurcies au froid jusqu’à résister à la température de l’azote liquide),

les céréales d’hiver, les semences de céréales ou les racines de luzerne (Willemont, 1979).

II. 5. La salinité :

Les terrains salés sont fréquents au Maghreb, aussi bien en situation littorale que

continentale, (Chotts, Sebkhas) et leur végétation est encore relativement en bon état, même

s’ils constituent des pâturages très appréciés pour les ovins et les camelins. Leurs structures

s’organisent en fonction de la teneur en sels du sol (Quzel, 2000).

La salinité peut entraîner des effets nocifs conséquents en raison de la fixation des

chlorures de sodium par les colloïdes du sol. De plus, les sels causent des changements dans

la structure du sol (sur sa perméabilité et son aération) affectant directement le développement

de la plante (Derradji et al., 2004).

Après des siècles d’irrigation et d’exploitations intensives, beaucoup de zones agricoles

importantes de notre planète ont souffert des changements de la composition chimique de

leurs sols. L’accumulation des sels est l’une de ces modifications. De plus le fort

ensoleillement et la faible pluviométrie ont obligé les agriculteurs de ces régions à irriguer en

quantité importante et, souvent, avec une eau saumâtre ( Haouala et al., 2007).

Les sols salés, fréquemment associés à la contrainte hydrique dans les zones arides et

semi-arides du Maghreb, constituent l’un des principaux problèmes pour le développement

des plantes. Ils entrainent une réduction des surfaces cultivables et, combinées à d’autre

facteurs, ils représentent une menace pour l’équilibre alimentaire de ces régions (Jean et al,

1998, Cheverry 1995). La salinité touche actuellement environ 25 % des terres irriguées et



22

concerne plus particulièrement les zones arides et semi-arides des région méditerranéennes,

ainsi que les régions tropicales. Dans ces conditions, la culture des espèces florales, connues

pour leur forte sensibilité à la salinité, peut être sérieusement compromise (Maas, 1986).

II. 5. 1. Origine de la salinité :

II. 5. 1. 1. Origine primaire :

Cette salinité provient de l’altération de la roche mère saline par les facteurs d’érosion.

La dissolution, par les eaux de ruissellements des roches sédimentaires qui sont riches en

chlorures, sulfate et carbonates contribuent ainsi à la salinisation des sols. En effet, l’altération

de la roche mère qui fournit les sels responsables de la salinisation primaire est provoquée par

l’eau de pluie souvent acide (H2CO3) mais aussi par des agents physiques. (Aubert, 1975)

II. 5. 1. 2. Origine secondaire :

Un autre processus ne faisant pas appel à la roche mère, peut avoir comme origine soit

les eaux d’irrigation qui sont chargées en sels ou une fertilisation chimique excessive

(Mouhouche et al., 1999).

Par ailleurs, dans un sol irrigué, la remontée capillaire se réalise lors des intervalles

entre les irrigations et lors d’une période jachère quand il n’y a pas un mouvement descendant

par la percolation d’eau. Selon Eilers et al., 1995, dans la zone d’alimentation qui reçoit des

précipitations, l’eau pénètre dans le sol et, si elle n’est pas absorbée par les végétaux, elle

atteint les eaux souterraines, celles-ci dissolvent les sels et les transportent dans les zones

d’émergence ou l’apport en eau souterraine fait élever la nappe phréatique jusqu'à la frange

capillaire telle une éponge, faisant ainsi remonter l’eau à la surface du sol qui s’évapore

permettant au sel s’accumuler.

II. 5. 2. Stress salin :

Le stress salin est défini comme étant le processus pédologique suivant lequel, le sol

s’enrichit anormalement en sels solubles acquérant ainsi le caractère salin. ( Eilers et



23

al.,1998). Ainsi, sont appelé sols salés ceux qui sont caractérisés par la présence d’un excès de

l’ion sodium échangeable dans le profil (Da Silva, 1982).

II. 5. 2. 1. Les réponses des plantes au stress salin :

Les plantes peuvent répondre au stress par diverses réactions. Certaines d’entre elles

peuvent subir des lésions, ce qui signifie qu’elles peuvent montrer des disfonctionnement

métaboliques, d’autre plantes comme les éphémères ne sont jamais confrontées réellement à

la sécheresse ou au froid -on dit qu’elles échappent au stress- d’autres plantes possèdent la

capacité de résister aux stress par des mécanismes d’évitement ou de tolérance. La tolérance

signifie que les conditions qui règnent dans la plante sont en équilibre avec les conditions de

l’environnement externe. (Hopkins, 2003).

Le stress salin a un accent ionique aussi bien qu'osmotique sur les plantes. Ce stress

peut être distingué à plusieurs niveaux (Tester et al., 2003). La racine et l'augmentation de la

pousse sont réduites abruptement chez les plantes sensibles au sel et cet effet ne paraît pas

dépendre de la concentration des ions dans les tissus en croissance, mais c'est plutôt une

réponse à l'osmolarité de la solution externe (Munns, 2002). Les contraintes dues à

l’accumulation spécifique de Na+ dans les tissus des feuilles se caractérisent par la nécrose

des feuilles les plus anciennes, en commençant par le bout de celles-ci et en progressant vers

les marges, puis continue vers la partie basale de la feuille. Les effets spécifiques du Na+

s’ajoutent à l’effet osmotique du NaCl (Munns 2002). Il est rapporté aussi que l’insuffisance

des éléments nutritifs dans le sol est due à la haute concentration de Na+ qui réagit

réciproquement avec les autres facteurs de l'environnement, telle la sécheresse (Silberbush et

al., 2001).

La toxicité métabolique du Na+ est en grand partie un résultat de sa capacité à

concurrencer l’ion k+, le potassium étant essentiel pour les fonctionnements cellulaires. Plus

de cinquante enzymes sont activées par l’ion K+, et le Na+ ne peut pas remplir ce rôle. Ainsi



24

des niveaux élevés de Na+, ou des rapports Na+/K+ importants peuvent perturber divers

processus enzymatiques dans le cytoplasme. D’ailleurs, la synthèse des protéines exige des

concentrations élevées de K+ , ceci étant dû à la nécessité de la présence de l’ion K+ pour

l’adhésion de l’ARNT aux ribosomes ainsi qu’à d’autres aspects du fonctionnement des

ribosomes (Blaha et al., 2000).

La tolérance des plantes au NaCl varie d’une espèce à l’autre,( jusqu'à 100 mM de NaCl

dans l’eau du sol) en effet, les rendements de l’orge, de la canne à sucre et du coton sont peu

affectés, mais le maïs, les haricots et la luzerne présentent déjà des limitations importantes

dans la production de matière sèche. Les plantes halophiles ou halophytes qui fréquentent les

sols salés ou « halomorphes », c'est-à-dire chargé de chlorure de sodium et accessoirement

d’autres sels, présentent des adaptations morphologiques «xéromorphoses» et des adaptations

physiologiques (Laval-Martin et al., 1995).

La plupart des espèces d’intérêt agronomique sont rangées dans le groupe des

glycophytes, plantes dites sensibles au sel parce que leur croissance est diminuée en présence

de sel dans le sol. Il n’ y a pas de distinction précise entre les concentrations extrêmes de sel

tolérées par les plantes de l’un ou de l’autre groupe, bien qu’une frontière arbitraire de

concentration extrême en chlorure de sodium de l’ordre de 6g/L soit souvent citée ( Flowers,

1983).

Errabii (2006) a étudié l’effet du sel à l’échelle cellulaire chez une variété de canne à

sucre. Les résultats obtenus ont montré la présence d’une similitude entre la réponse «in

vivo » et «in vitro» de variétés de canne à sucre. Il s’est avéré que le stress salin provoque des

altérations et des perturbations très importantes et très sévères chez toutes les variétés aussi

bien au stade plante qu’au stade cal. Cette réaction se traduit par une réduction de la

croissance (Yang et al 2005), de la teneur en eau ainsi que de la teneur en éléments essentiels



25

tels que le K+ et le Ca2+. En contrepartie, il a remarqué des augmentations importantes en ions

toxiques principalement Na+ et Cl- ainsi que de la teneur en proline et en sucres solubles.

Afin d’évaluer d’une manière rapide et efficace la tolérance à la salinité de la vigne, on a

analysé « in vitro » le comportement de différentes variétés autochtones et porte-greffes vis-à-

vis du stress salin. À cet égard, des micro-boutures issues de matériel végétal homogène

prélevé en plein champ ont été cultivées « in vitro » et soumises durant 45 jours à différentes

concentrations salines (0, 20, 50, 80, 100, 150 et 200 mM de NaCl). Les différents paramètres

de croissance mesurés concernent la capacité de survie, l’allongement des pousses, la

formation des bourgeons et l’aptitude à l’enracinement. Les résultats montrent que la salinité

affecte la croissance et le développement de la vigne « in vitro ». Les premiers symptômes du

stress (nécroses foliaires) sont apparus après 10 jours de traitement à 80 mM NaCl, et peuvent

atteindre un dessèchement total des vitroplants. Par ailleurs, une variabilité de la réponse a été

mise en évidence selon le génotype testé et les doses de NaCl appliquées. En effet, les variétés

Séjnène et Asli sont relativement plus tolérantes que Saouadi, Sakasly et Razegui, alors que

les porte-greffes se sont avérés les plus sensibles par rapport aux variétés testées. En fait, la

capacité d’adaptation à la salinité semble être corrélée à la vigueur du génotype. Il semblerait

ainsi que la tolérance relative de certaines variétés soit due essentiellement à une composante

génétique (Hamrouni et al., 2008).

Les travaux d’Almansouri et al., 2001, portant sur l’effet des stress osmotiques et

salins sur la germination des graines chez trois cultivars de blé dur (Triticum durum Desf.)

différents par leur résistance à la salinité et à la sécheresse, ont montré que les stress

d’intensité modérées retardent seulement la germination, tandis que les fortes concentrations

de NaCl et PEG réduisent le pourcentage final de germination, et que les effets délétères du

NaCl et du PEG sont supérieurs lorsque les stress sont appliqués sur des embryons isolés mis

à germer dans des milieux adéquats in vitro que ceux obtenus sur les graines. Ces travaux ont



26

permis de conclure que l’inhibition de la germination par les stress peut ne pas être attribuée à

une inhibition du métabolisme des réserves de la graine, et l’effet principal du PEG observé

par l’inhibition de l’absorption de l’eau, alors que l’effet nuisible du NaCl peut être lié à

l’accumulation des ions toxiques à long-terme.

Chez la pomme de terre (salanum tuberons L.) la présence de sel dans l’eau d’irrigation

provoque la réduction du diamètre des tubercules, la diminution du nombre d’yeux par

tubercule, et des fissurations de l’épiderme du tubercule (Hannachi et al., 2004).

La plante selon Polevoï (1989) cité par Laarabi (2006) réagit par :

1. Une augmentation de la perméabilité membranaire et une dépolarisation de son

potentiel électrique.

2. Un influx du Ca2+ dans le cytoplasme. Ces ions viennent de la paroi squelettique et

des compartiments internes : vacuole, mitochondries, etc.

3. Une acidification du cytoplasme.

4. Un montage de microfilaments.

5. Une accélération de l’absorption d’O2, de la consommation de l’ATP et de la

libération de radicaux libres.

6. Une augmentation des processus hydrolytiques.

7. Une activation de la synthèse des protéines du stress.

8. Une activation de la pompe à protons.

9. Une activation de la teneur en éthylène et en acide abscissique. Ces deux substances

arrêtent le métabolisme.

II. 5. 2. 2. Tolérance au stress salin chez les espèces du genre Medicago

Boughanmi et al (2008) ont étudié, chez une espèce fourragère vivace autochtone des

oasis tunisiennes (Medicago sativa cv Gabès), l’effet d’un stress salin de forte intensité (150

mM) et de longue durée (4 semaines) sur les aspects ioniques et structuraux des feuilles



27

assimilatrices. Une attention particulière a été portée au complexe phloémien des veines

mineures et de la nervure principale respectivement impliquées dans la collecte et le transport

à longue distance des assimilas/solutés. Les modifications structurales des cellules de

transfert phloémiennes et l’accumulation du Na+ dans le complexe phloémien plaide en

faveur de l’implication de telles cellules dans la tolérance à la salinité de Medicaco sativa cv

Gabès. La localisation des transporteurs de sodium au niveau de leur membrane élargie sous

l’effet du sel confirmerait leur rôle dans la recirculation du Na+.

En outre, Zhao et al., (2008) ont montrés que l’activité totale d’ascorbate peroxydase de

la peroxydase et de la catalase est généralement augmentés, sous un stress toxique du mercure

chez la Luzerne (Medicago sativa).

Aussi Rabhi et al., 2007 ont-ils étudié les effets de l'interaction salinité-déficience

ferrique sur l'acquisition du fer et l'acidification racinaire induite par le manque de fer chez

Medicago ciliaris L à partir de quatre traitements :

- C, milieu complet (MC) contenant 30 μM Fe

- S, traitement salin (MC) additionné de 75 mM NaCl

- D, milieu déficient en fer (MC), contenant 1 μM Fe seulement

- DS, traitement combiné, (MC) contenant 1 μM Fe et additionné de 75 mM NaCl.

Les résultats ont montré que la croissance et la teneur en chlorophylle des plantes sont

beaucoup plus affectées par les effets conjugués de la salinité et de la déficience en fer que par

leurs effets individuels, indiquant un effet additif des deux contraintes chez les plantes DS.

Ces résultats s’expliquent par l'accumulation du sodium dans les parties aériennes, ainsi que

par la limitation de l'acquisition d'éléments indispensables, comme Fe et K en condition de

salinité, de déficience en fer et, surtout, en conditions d'interaction de ces deux effets. L'étude

a montré également que l'acidification racinaire induite par la limitation en Fe a été fortement

réduite en présence du sel. Ce résultat, qui est concomitant avec la diminution de l'absorption



28

.du fer, suggère que l'activité de la pompe à protons racinaire peut être inhibée par le stress

salin.

Chebouti et al., 2000 avaient déjà noté que quelle que soit la phase où le stress a été

imposé, il provoque une chute de la production de gousses et de graines chez les trois espèces

de Medicago (M. aculeata, M. orbicularis, et M. truncatula.) étudiées. Mais la réduction a été

plus importante lorsque le stress est appliqué lors de la phase floraison (Abbad et al., 2004)

que lorsqu‘il est appliqué lors de la phase végétative.

II. 5. 3. les modifications métaboliques suite aux signaux du stress :

Les stress environnementaux (ou abiotiques), comme la sécheresse, la salinité et les

basses températures sont des conditions de stress qui affectent la croissance et le rendement

des plantes. Contrairement aux animaux, qui peuvent se déplacer lorsque les conditions de vie

ne leur sont plus favorables, les plantes ont développé des stratégies d’adaptation pour

répondre aux changements de leur environnement en contrôlant et en ajustant leurs systèmes

métaboliques. Ces perturbations entraînent une faible production d’énergie par la

phosphorylation et la photo transpiration, une assimilation de l’azote perturbée, et un

dérèglement de nombreuses voies métaboliques. Si la concentration en sel excède le niveau de

la tolérance de la plante, des perturbations fonctionnelles apparaissent au niveau de la

photosynthèse, par effet de sel dans le stroma des chloroplastes qui perturbent le transport des

électrons. La glycolyse et le cycle de Krebs sont aussi affectés (Calu, 2006).

Les réponses cellulaires et moléculaires des plantes aux conditions de stress ont fait

l’objet de nombreuses études. Les mécanismes par lesquels elles perçoivent les signaux

environnementaux et les transmettent à la machinerie cellulaire pour activer des mécanismes

de réponses adaptées, déterminent chaque jour leur survie. Le NaCl affecterait la croissance et

les paramètres de l'impédance par les changements négatifs dans l'activité enzymatique



29

(Roxas et al., 2000), dans la synthèse protéique (Mattioni et al., 1997; Ashraf et al., 1999;

Simon-Sarkadi et al., 2002) ou dans la perméabilité cellulaire (Tang et al., 1999).

Pour un ensemble d’espèces on constate souvent que les plantes qui peuvent tolérer les

environnements modérément salins montrent une plus grande capacité d’exclure l’ion Na+

par la partie aérienne ou au moins les limbes des feuilles elles maintiennent concurremment

des niveaux élèves de k+ (ZHU et al., 2001). La plante peut rétablir l’équilibre

homéostatique dans le nouvel environnement stressant, l’homéostasie se définit comme la

capacité d’autorégulation d’un organisme pour maintenir un état d’équilibre dynamique

constant entre les conditions extérieurs et les différentes composantes de son milieu interne,

suite à cette adaptation, la croissance peut reprendre et se trouve probablement réduite

relativement aux conditions antérieures moins stressantes (Yeo, 1983 et Zhu, 2001)

Berthomieu et al., 2003 ont montré chez Arabidopsis thaliana une troisième stratégie à

l’intermédiaire entre l’exclusion et l’inclusion : la recirculation. Le Na+ est absorbé et

parvient jusqu’aux parties aériennes mais il est aussitôt « re-pompé » et reconduit par les

vaisseaux du phloème vers les racines qui peuvent excréter les ions à l’extérieur.

II. 5. 3. 1. Synthèse des protéines :

Parmi les approches biochimiques visant à décrire, quantifier et analyser les mécanismes

de tolérance aux stress chez les plantes, les changements qualitatifs et quantitatifs des

protéines sont d’un avantage particulier pour l’amélioration des plantes, en plus de leur

utilisation comme marqueurs pour la sélection.

L’existence du NaCl dans le sol a toujours préoccupé les agro-biologistes à cause de

son action négative sur le rendement des plantes cultivées. Chez les plantes non tolérantes aux

sels, le NaCl, en particulier, facilite l’accumulation d’éléments minéraux dans la plante,

diminue la teneur en eau de celle-ci et par conséquent baisse l’hydratation des protéines,



30

augmente la viscosité et diminue l’activité enzymatique (Slayter, 1967). Selon Oknina (1953)

le NaCl provoque la destruction du contenu cellulaire.

L’une des voies protéiques par lesquelles la plante répond au stress, est la production de

protéines spécifiques, qui peuvent être impliquées dans l’esquive au stress, dans la réparation

des dommages, ou dans la protection des mécanismes cellulaires ; les protéines de cette

dernière catégorie comprennent les protéines LEA (late embryogeny abundant)qui

s’accumulent pendant la maturation des graines et dont certaines peuvent également être

induites dans les tissus végétatifs lors d’un stress hydrique. Ces protéines semblent jouer un

rôle de protection contre les stress osmotiques, et il a pu être démontré que certaines

pouvaient protéger des systèmes enzymatiques. Cependant, pour la plupart, leur mode

d’action est encore peu connu. (Virginie, 2008).

La teneur en protéines est plus prononcée chez les écotypes tolérants que chez les

écotypes sensibles des jeunes plantes de différentes espèces du genre Medicago (Yahia et al.,

2003).

Singh et al., 1985 ont étudié l’expression génique induite par le sel dans des cultures de

cellules en suspension et dans des systèmes racinaires intacts, les racines étant les premiers

organes confrontés aux augmentations de salinité. Il a été observé que des concentrations

importantes de plusieurs polypeptides s’accumulent dans des cultures de cellules de tabac

soumises à de fortes concentrations de NaCl et de polyéthylène glycol (PEG). Un polypeptide

de 26 KDa en particulier est induit à la fois par le NaCl et le PEG. Ce polypeptide a été appelé

osmotine, en raison de son apparition dans des conditions de faible potentiel hydrique, ou de

chocs osmotiques provoqués par toute une série de facteurs.

Une protéine kinase (BGH009N22) dont les homologues du riz ou du blé sont

différentiellement régulés par l'ABA (Anderberg et Walker-Simmons, 1992 ; Kobayashi, Y. et

al., 2004) cité par (Grimlet, 2004) , voit son niveau d'expression augmenter au cours de la



31

maturation de l’espèce Bergeron. Il est extrêmement surprenant, que l'expression de ce gène

soit inhibée chez Moniqui au stade mûr. Cependant, chez le riz, aucun membre de cette

famille multigénique n'est contrôlé uniquement par l'ABA. Le niveau d'expression d'un autre

isogène (PA269TC1) de cette protéine kinase déposé aussi sur les lames de microarray,

augmente jusqu'au stade mi-mûr et chute ensuite. Il est sous-exprimé chez Moniqui au stade

mi-mûr et surexprimé dans cette même variété au stade mûr par rapport à Bergeron, ce qui

pourrait signifier qu'il est probablement constitutif dans cette variété entre ces deux stades.

Les observations sur blé et riz suggèrent que l'expression de ces protéines kinases pourrait être

liée au stress hydrique (Grimlet, 2004).

Les teneurs en amidon, protéines et huile sont des critères majeurs de qualité. Une

variation forte est enregistrée sous l’effet du climat interannuel ou géographique. Par

exemple, dans les conditions chaudes et sèches de l’année 2003, François et al., 2003 ont

enregistré une teneur supérieure en protéines chez le blé et une diminution de la teneur en

huile chez le tournesol. Chez cette espèce, 41% des échantillons ont eu des teneurs en huile

qui n’ont pas satisfait la norme de commercialisation. Ces résultats sont une conséquence de

la relation négative rendement - teneur en protéines enregistrée à différents niveaux

d'investigation (Triboi et al., 2002, 2003).

Zid et al., 1991 ont conclu que Le sel induit des modifications qualitatives et

quantitatives dans la synthèse des protéines, détectables par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide. L’application de cette technique à deux variétés d’orge permet de mettre en

évidence une différence de comportement entre la variété sensible au sel (Prato) et la variété

résistante (California Mariout). Cette différence se manifeste seulement au niveau des feuilles.

Dans ces organes, le sel induit la synthèse de cinq nouvelles protéines : trois d’entre elles sont

spécifiques de la variété sensible et les deux autres communes aux deux variétés. Au niveau

des racines, six nouvelles protéines sont synthétisées par les deux variétés (Ramagopal, 1987)



32

Tableau 1. Les changements des protéines solubles vis-à-vis de la salinité chez différentes espèces.

Espèces réponses au salinité Références

Vicia faba diminue Gadallah (1999)

Amaranthus tricolor diminue Wang and Nil (2000)

Bruguiera parviflora diminue Parida et al., (2002)

Pancratium maritimum augmente à basse salinité; diminue à une forte salinité Khedr et al., (2003)

Arabidopsis thaliana augmente Quintero et al., (1996)

Fragaria × ananassa cv. Camarosa augmente El-Baz et al., (2003)

II .5.3.2. Synthèse des enzymes :

De nombreux travaux montrent que des enzymes telles que des superoxide dismutases

(SOD), des ascorbate peroxydases (APX), des catalases (CAT), des glutathion-S-transférases

(GST) et des glutathion peroxydases (GPX) s’accumulent pendant le stress hydrique. La

capacité du système antioxydant est déterminante pour maintenir l’intégrité du système

photosynthétique lors d’une contrainte hydrique (Reddy et al., 2004).

Les travaux menés par Botella et al., (1994), travaillant sur la caractérisation in situ des

transcrits de peroxydases chez la tomate en présence d’une faible concentration de Na Cl ( 50

mM), ont montré que cette dose induit l’accumulation des peroxydases.

Une étude concernant l’activité de la peroxydase dans le milieu de culture des cellules de

tomate, a montré que le milieu dans lequel les cellules sont adaptées à la croissance en

présence de 15% de NaCl présente, une activité peroxydase plus élevée que le milieu dans

lequel les cellules ne se sont pas adaptées à la croissance en présence de NaCl. Une

augmentation de la teneur en protéine a été également observée dans le milieu des cellules



33

adaptées comparé au milieu des cellules non adaptées. Apparemment, les valeurs élevées de

l’activité peroxydase dans le milieu des cellules adaptées au sel, reflètent les changements des

propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, qui à son tour peut être associée au processus

d’adaptation (Sancho et al., 1996).

Dans le but d’étudier le système de défense antioxydant, les changements induits par

le stress salin sur les enzymes antioxydantes sont examinés dans les feuilles de mûrier (Morus

sp.) chez une variété tolérante au sel, « Pei ». L’activité de l’enzyme peroxydase guaïacol-

spécifique augmente remarquablement avec l’augmentation du NaCl à 150 mM. De plus, les

activités de la superoxyde dismutase, l’ascorbate peroxydase et la glutathione réductase

augmentent légèrement à 150 mM de NaCl. Par contre, l’activité catalase n’est pas corrélée

avec le contenu du peroxyde d’hydrogène lors d’une augmentation de sel. Les résultats

suggèrent que sous des concentrations élevées de sel, l’activité peroxydase primaire,

accentuée, semble jouer un rôle actif dans le nettoyage des types d’oxygène réactif chez cette

variété (Harinasut et al., 2003).

Un autre facteur du stress, les basses températures font que certaines enzymes sont

spécifiquement inactivées par le froid. C’est le cas des enzymes multimériques, pour

lesquelles les interactions hydrophobes entre monomères sont affaiblies aux basses

températures (Mazliak, 1981).

L’effet de la température peut aussi induire des changements réversibles dans la

conformation de l’enzyme sans entraîner la dissociation de la protéine en sous unités, comme

dans le cas de la RuBP carboxylase. La stabilité de cette enzyme à basse température semble

d’ailleurs déterminée par les liaisons –S-S-. En effet, la RuBP carboxylase isolée des plantes

endurcies au froid, présente généralement une grande quantité de groupe –SH exposés à la

surface de la molécule, et ses propriétés cinétiques suggèrent une meilleure adaptation au

fonctionnement à des températures inférieures à I0°C (Challet et al., 1977).



34


Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques

36

Chapitre III : Les marqueurs isoenzymatiques

III. 1. Définition :

Le terme marqueur génétique est un synonyme de locus marqueur. Un locus marqueur

est un locus polymorphe qui renseigne :

-sur le génotype de l’individu qui le porte ; c’est à ce titre que les marqueurs sont utilisés

en génétique des populations.

-sur le génotype d’un (de) locus voisin(s) ; les applications vont ici du clonage

positionnel à la sélection assistée par des marqueurs

Les plus courants de ces marqueurs génétiques sont, selon une terminologie consacrée,

les marqueurs morphologiques, les marqueurs moléculaires (au niveau de l’ADN), et les

marqueurs biochimiques (isozyme, protéine).

Avec les marqueurs biochimiques, il est aujourd‘hui possible de cartographier

conjointement dans une même descendance de très nombreux locus, jusqu'à en «saturer» le

génome, c’est-à-dire jusqu’ à ce que tout point du génome soit génétiquement lié à au moins

un marqueur. Dans de telles cartes, il y a donc autant de groupes de liaisons que de

chromosomes.

En sélection classique, chaque lignée est examinée à travers son aspect phénotypique, soit

la résultante de l’expression de ses gènes dans un milieu donné. Ces observations se faisant

dans des conditions d’interaction entre le génotype et le milieu, il est important pour le

sélectionneur de connaître l’aspect purement génétique du caractère étudié, indépendamment

de son expression. A cet effet, de nombreux marqueurs biochimiques ou moléculaires ont été

développés pour le blé depuis une vingtaine d’années. Cependant, un saut technologique est

nécessaire pour valoriser les acquis sur les connaissances individuelles des gènes lors de leur

intégration dans les schémas de sélection (Moulai et al., 2009).



37

Pare ailleurs, la sélection assistée par marqueurs est d’une part utilisée pour repérer les

caractères ergonomiquement intéressants comme le rendement ou la résistance aux

contraintes environnementales. Actuellement, les marqueurs les plus utilises sont les

microsatellites (répétition de courtes séquences d'ADN mises en évidence par PCR).

L'utilisation des marqueurs moléculaires, aujourd'hui largement répandue, intervient dans

divers programmes axes sur l'amélioration de la résistance aux stress biotiques et abiotiques.

Et d’autre part, cette sélection correspond à toute forme possible d’utilisation des marqueurs

dans le processus d’amélioration. Les principales applications pour le sélectionneur sont :

l’identification du matériel, la gestion des ressources génétiques, la conduite des

rétrocroisements, la construction de génotypes, la prédiction de l’hétérosis, la prédiction des

valeurs génotypiques et la conduite de la sélection récurrente. L’intérêt des marqueurs pour

l’identification du matériel est évident (Galias, 1994).

L’analyse des systèmes enzymatiques par l’électrophorèse qui fournit des marqueurs iso

enzymatiques, reste toujours fiable pour la sélection. Cette méthode est une technique

permettant de mesurer la vitesse et le sens de déplacement des molécules organiques en

réponse à un champ électrique. La vitesse et la direction du déplacement des protéines sur un

gel d’amidon ou d’agar ou d’acrylamide dépendront de la charge superficielle nette de la

protéine, de sa taille et de sa forme.

L’électrophorèse est particulièrement utile pour l’étude des populations d’une même

espèce ou d’espèces étroitement apparentées, et les caractères taxonomiques qui en résultent

(répartition des bandes) sont généralement soumis à une analyse phénétique ( Grawford and

julian 1967. ; Grawford 1979 – 1983). La sélection et les programmes d’amélioration sont

basés sur la recherche des marqueurs génétiques. L’électrophorèse des isoenzymes est un outil

pour ce but. Les ressources génétiques estimées par les techniques moléculaires doivent êtres

considérées dans les stratégies de protection des plantes. (Hannachi et al., 1998).



38

III. 2. Les isoenzymes :

Dès 1950 le problème des isoenzymes a été appréhendé au cours de l’étude de la lactase

déshydrogénase partiellement purifiée révèlent la présence de 5 constituants différents

possédant cette activité enzymatique. Il s’agit de protéines très voisines par leurs propriétés et

qui ne sont séparées que grâce au pouvoir de résolution élevé des méthodes

électrophorétiques. L’explication a été fournie par un nouvel examen de ces 5 protéines à

l’état dénaturé. Par électrophorèse du mélange des 5 enzymes en présence d’urée (maintenant

avec le SDS) on ne trouve plus que 2 constituants. Les différentes isœnzymes semblent donc

différer les unes des autres par des propriétés de détail, notamment par leurs paramètres

cinétiques et leurs spécificités. La synthèse des différentes sous-unités d’un tissu à l’autre

résulte d’adaptations physiologiques. L’enzyme est apparemment optimisée dans chaque cas

pour répondre aux exigences. Les isoenzymes s’observent sous forme de bandes multiples

après une séparation qui est le plus souvent une électrophorèse. (Jean, 1993).

L’analyse par isozyme est relativement aisée, bon marché, rapide et ne nécessite pas un

équipement de laboratoire sophistiqué mais l’inconvénient majeur consiste dans le nombre

réduit de variante électrophorétiques (Oléo et al., 1993).

C’est chez le maïs (Zea mayas .L) peut être plus que chez aucune autre plante, qu’il y eut

des études sur les isoenzymes. Elles sont passées des études purement biochimiques, étude

des propriétés enzymatiques, aux études de sélection concernant le contrôle et le maintien de

la qualité durant la production de graines. De plus, la plupart des gènes de structure codant

pour les isoenzymes du maïs étudiées, ont été localisés sur des sites chromosomiques

spécifiques ( Godman et Stuber, 1983 cité par Fyad Lameche , 1999).

Les marqueurs isoenzymatiques sont largement utilisés dans la recherche biologique, ne

causent aucun changement délétère dans le phénotype par récessivité ou pléiotropie et



39

s’expriment généralement de façon codominante relativement simple en stocks de plusieurs

marqueurs (Tansley et Rick, 1980).

Puisque l'activité catalytique des enzymes peut être l’action de plusieurs protéines, le

terme "isoenzymes" a été adopté pour les distinguer par les différences dans leur activité

(Subden et al., 1987).

III.2.1 Les estérases:

Les estérases mises en évidence par cette réaction de révélation catalysent la réaction

suivante :

Aryl-acetate + H2o Aryl alcool+acetate

Les estérases cathodiques et les estérases anodiques constituent deux grands groupes. Ce

sont des enzymes très variables en fonction des espèces et des populations, et beaucoup plus

en fonction des stades de développement (FYAD-LAMECHE.F.Z., 1999).

En effet, il existe chez le Maïs des estérases que l’on trouve à tous les stades de

développement et d’autres qui sont spécifiques de certains stades de développement. Le

nombre d’allèles identifiés à chaque locus estérase varie de 2 à 9. (Godman et Stuber, 1983)

cité par (Fyad-Lameche.., 1999).

L’activité des estérases qui est liée au stade physiologique et métabolique de la cellule,

peut être affectée par les facteurs environnementaux tels que la température de culture, le

stress hydrique et les agents polluants. (Bilkova et al, 1999).

Les estérases ont été les premiers isozymes dont le déterminisme génétique a été analysé

(Desborough et Peloquin ,1967). D’autre systèmes se sont peu à peu développés aussi bien en

utilisant les gels de polyacrylamide que les gels d’amidon (Staub et Kuhns, 1979 ;

Desborough, 1983). A ce jour, environ une cinquantaine de systèmes sont connus de façon

plus ou moins précise au niveau de la technique de séparation ou de leur déterminisme

génétique.



40

L’analyse de différents profils d’estérases chez l’espèce Hydysarum coronarium

(légumineuse) permet de révéler l’existence de 13 bandes isoenzymatique (Trifi N et

al.,1989).

Reyes et al., ( 1998) avaient détecté un total de 14 bandes réparties en 5 zones d’activité

enzymatique en analysant les feuilles de 15 clones de l’écotype Musa( variété de bananier)

provenant de culture «in vitro», ce qui indiquerait que ces bandes pourraient être activées au

cours d’autres phases de développement de plante.

III.2.2. Les peroxydases :

III.2.2.1. Définition :

Les peroxydases des plantes, appelées aussi peroxydases de classe III, catalysent

l’oxydation de plusieurs substrats dont les phénols en présence du peroxyde d’hydrogène

(H2O2). (Baaziz, 2006). Elles jouent des rôles importants dans la croissance, le

développement et le système de défense des plantes contre les stress biotique et abiotique

(Gaspar et al., 1985). Elles sont codées par des familles multigéniques, regroupant par

exemple 73 gènes chez Arabidipsis thaliana ou 138 chez le riz (Oryza sativa japonica). Il a

été montré que la plupart des gênes sont exprimés chez Arabidopsis, certains

constitutivement, d’autres en réponse à divers stimuli. Bien que leur fonction soient connues

en général, il est très difficile d’assigner un rôle précis a chaque isoforme (Penel et al., 2004).

Les peroxydases sont comme la catalase des protéines héméniques à haut spin. Elles sont

particulièrement répandues chez les plantes. Il est très facile de mettre en évidence celle du

radis qui broyé dans un peu d’eau oxygénée diluée, constitue un mélange pouvant changer

rapidement la couleur des produits organiques variés par exemple la benzidine ou le gaïacol.

Les peroxydases sont en général peu spécifiques des produits oxydés, leur

fonctionnement rappelle celui de la catalase en passant par un composé I, obtenu après perte

de 2 électrons. (Jean, 1993).



41

Ces oxydoréductases très répandues chez les plantes, sont souvent utilisées comme

marqueurs de la tolérance à de nombreux stress biotiques et abiotiques. (Aouad et al., 1997).

II.2.2.2. Historique :

En 1810, Planche décrit l’apparition d’une couleur bleue, sur des morceaux de racine de

raifort incubé dans de la teinture de gaïac. En 1818, Thenard fut le premier à décrire les

propriétés d’eau oxygénée (H2O2) et Schönbein, en 1855, décrit l’oxydation de certains

composés organiques, catalysée par des extraits issus de plantes ou d’animaux, en présence de

solutions diluées de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Le nom de peroxydase fut donné en 1898

par Linossier, a un extrait de pus humain présentant une telle activité (Saunder et al., 1964).

Les fameuses peroxydases de raifort furent l’outil de base des premiers travaux

moléculaires sur les peroxydases végétales (Theorell, 1942) et c’est en 1976, grâce aux

travaux de Braithwaite, d’une part et de Welinder, d’autre part, qu’on a pu avoir une première

image cristalline d’une de ces enzymes, ainsi que la première séquence protéique. Il a fallu

attendre ensuite plus de 10 années pour voir publier la première séquences nucléotidique d’un

messager codant pour une peroxydase du tabac (Lagrimini et al., 1987). C’est principalement

sur la base de ces travaux, qu’aujourd’hui les données moléculaires concernant les

peroxydases végétales ont pu s’accumuler de manière plus que significative.

III.2.2.3. Structure chimique des peroxydases :

Les peroxydases sont des enzymes à hèmes constituant une très grande famille

multigénique, dans laquelle on distingue trois classes différentes (Passardi et al., 2005) : la

classe I strictement intracellulaire (EC 1.11.1.5.6/.11), la classe II excrétée par les

champignons (EC 1.11.1.13/.14), et la classe III constituée par les peroxydases végétales (EC

1.11.1.7).

Les peroxydases sont de petites glycoprotéines (40.000 à 50.000 daltons) combinées

avec une ferriporphyrine (figure. 5).



42

Protoporpherine Fe3+ Apoprotéine Glycosylation (RE)

Protohaematine IX Glycoprotéine

Peroxydase

Figure. 6 : Représentation schématique de la constitution des peroxydases végétales (Thierry,

2002).

III.2.2.4. Localisation et mobilité des peroxydases :

Le nombre croissant de peroxydases connues, ainsi que les investigations de plus en

plus poussées concernant leurs rôles physiologiques chez les plantes, obligent à déterminer de

manière plus précise leur localisation subcellulaire. Globalement, les peroxydases peuvent se

trouver au niveau des parois cellulaires et dans les vacuoles. Les peroxydases pariétales sont

connues pour être impliquées dans les processus de lignification (Thierry, 2002).

III.2.2.5. Rôle physiologique :

Le nombre possible de substrats pour les peroxydases est énorme, et il peut être admis

que chaque réaction peroxydasique ayant lieu joue un rôle spécifique dans le maintien ou

l’adaptation des structures et des fonctions des cellules végétales dans leur environnement.

Les interactions des peroxydases dans les processus de croissance, de différenciation et de

développement, sont plutôt limitées et concernent plusieurs opérations, à savoir la régulation

de la teneur en auxine, le contrôle possible de la dernière étape de la biosynthèse de



43

l’éthylène, la participation dans l’établissement du potentiel redox de la membrane plasmique,

la formation de la H2O2 et la construction, la rigidification et éventuellement la lignification et

la subérisation des parois cellulaires.

Ce rôle intervient à partir de la régulation du taux circulant de l’acide indole-3-acétique

(AIA) par le biais de son catabolisme oxydatif ; mais les peroxydases interviennent aussi dans

la perte de la plasticité des parois cellulaires, en formant des ponts phénoliques entre les

polymères de la paroi (Biggs, 1987). Ce dernier processus conduit à une rigidification

irréversible de la paroi qui empêche une expansion cellulaire par l’augmentation de la

pression de turgescence. Ainsi les peroxydases réguleraient le taux endogène d’un des

principaux facteurs de croissance, l’AIA, et les derniers stades de la croissance cellulaire.

Les peroxydases ont longtemps été considérées comme des enzymes impliquées dans

des réactions réduisant la croissance des cellules végétales, grâce à la destruction de l’auxine

et la formation de liaisons covalentes au sein des parois (Penel et al., 1992).

Depuis les travaux pionnier de Ven overkeek dans les années 30 sur le nanisme végétal,

un grand nombre d’études ont été réalisées dans le but de mettre en relation les travaux

endogènes de l’activité peroxydasique avec la croissance cellulaire (Gasper et al., 1982). Le

nanisme végétale, est généralement associé a une augmentation de l’activité peroxydasique

dans la fraction pariétale (Evans 1990, Jupe et Scott 1989). La croissance normale chez des

plantes naines peut être restaurée par des applications exogènes de gibbérelline : la

restauration de la croissance est concomitante avec une inhibition de la sécrétion des

peroxydases ( Fry, 1980). Des résultats similaires proviennent d’applications exogènes d’AIA

sur des tissus végétaux. Ainsi la stimulation de la croissance par l’AIA est associée sur une

courte période à une rapide diminution du niveau des peroxydases extracellulaires (Jones,

1986 Ros Barcelo et al., 1989) bien que par la suite on observe une stimulation de la sécrétion

Ca 2+ dépendante des peroxydases (Gaspar et al., 1983).



44

Pour l’instant, aucun résultat ne permet de dire clairement si les peroxydases sont à

l’origine ou la conséquence des processus biochimiques qui conduisent à l’arrêt de la

croissance. Dans le premier cas, les peroxydases auraient une influence sur le potentiel de

croissance des cellules, dans le deuxième cas, elles interviendraient dans la perte irréversible

de ce potentiel (Thierry, 2002).


Expérimentation Matériel et méthodes

46

Chapitre IV : Matériel et méthodes

IV.1. Matériel végétal :

Le choix des variétés modèles pour l’étude d’expression des PERs et ESTs a été guidé

par une caractérisation physiologique de la tolérance et la sensibilité à la salinité de quatre

écotypes de Medicago déjà réalisé en laboratoire. Le matériel végétal utilisé dans ce travail

comprend deux écotypes tolérants et deux sensibles appartenant à des espèces annuelles de

Medicago Ainsi que des medics sauvages récoltés sur le campus de l’EGMO (tableau 2).

Espèces écotypes Comportement physiologique

M.aculeata

M.truncatula

Medics

Acu 80

Acu 209

Tru 40

Tru 32

Ecotype sauvage

sensible

tolérant

sensible

tolérant

inconnu ( ?)

Tableau 2 : Les différents écotypes étudiés avec leur comportement aux stress salins (Source

ITGC., Fyad F.Z., 1999 ; Yahia N., 1998 ; Amouri A., 2005).

IV. 2. Protocole expérimental

Les essais ont été conduits en laboratoire sur une durée de 9 jours. Pour chaque écotype,

les grains ont été désinfectés pendant quelques minutes dans une solution de CaCl2

(hypochlorite de calcium) 6%, puis rincés à l’eau distillée et enfin scarifier. Durant les 6

premiers jours les grains ont été placés à raison de 30 grains dans des boites de Pétri sur du

papier filtre imbibé avec, soit de l’eau distillée (témoin T0), soit des solutions salines

contenant respectivement 86.6mMol/l (T1), 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3) de



47

chlorure de sodium ( NaCl). Dans les trois jours de germination restants, les jeunes plantules

ont été transférées dans la chambre de culture dans d’autres boites de Pétri arrosées avec une

solution nutritive Knop en plus des quatre concentrations de NaCl, sous une intensité

d’éclairage de 6762 lx et une photopériode de 8 heures.

Ces traitements peuvent être résumés comme suit :

Les Concentrations des 6 premiers jours Les Concentrations des 3 derniers jours

T0 : 100 ml eau distillée + 0g de NaCl

T1 : 100 ml eau distillée+ 86.6mMol/l de NaCl

T2 : 100 ml eau distillée+102.9mMol/l de NaCl

T3 : 100 ml eau distillée + 137.2 mMol/l de NaCl

T0 : 100 ml du Knop + 0g de NaCl

T1 : 100 ml du Knop + 86.6mMol/l de NaCl

T2 : 100 ml du Knop + 102.9mMol/l de NaCl

T3 : 100 ml du Knop + 137.2 mMol/l de NaCl

IV.3. Séparation des isoenzymes (estérases et peroxydases) par

électrophorèses de gel de polyacrylamide (PAGE) :

Pour mettre en évidence d’éventuelles modifications biochimiques induites par le stress

salin Une analyse qualitative des isoenzymes a été réalisée par PAGE.

Le principe de cette méthode d’analyse, consiste à séparer les deux isoenzymes selon leur

charges ionique et à comparer les profils électrophorétiques des individus traités par le stress

salin (T1, T2 et T3) avec les témoins (T0).

IV. 3. 1. Extraction des estérases et peroxydase :

L’extraction des ( ESTs) et ( PERs) est menée à froid dans un mortier à partir des jeunes

plantes issues de la germination pendant 09 jours pour les lots traités ( T1 , T2 , T3 ) , et le 1er

, 3eme , 5eme , 7eme , et le 9eme jour pour les lots témoins (To), afin de prélever 04 plantules (

0.20 g ) pour chaque extraction . Les jeunes plantules sont broyées dans un tampon



48

d’extraction tris –KCL 1mM (pH = 7), Puis elles sont centrifugées pendant 30 minutes à

13 000 tr/min (a+4°C) ; le surnagent est récupéré et conservé dans un cryoconservateur

contenant de l’azote liquide pour être soumis ensuite à l’électrophorèse, pour ce faire, huit

extraits sont alors déposés par plaque et la quantité d’extrait enzymatique déposée par puits de

trente microlitre ( 30 Ml).

Pour les Medics sauvages l’extraction des peroxydases se fait quotidiennement pour les

lots témoins et chaque lot traité durant neuf jours.

IV. 3. 2. Préparation du gel des estérases et peroxydases:

Pour les estérases le support électrophorétiques est constitué d’un gel discontinu (4% à

8%) de polyacrylamide et pour les peroxydases d’un gel gradient contenant (4% à 10%) de

polyacrylamide dans un tampon tris-borate EDTA à pH= 8.3 avec du NP10, du TEMED et

persulfate d’ammonium.

IV. 3. 3. Condition de migration des estérases et des peroxydases :

Le tampon cuve pour les estérases est le même que celui utilisé dans la préparation du gel

à savoir tris-Borate EDTA pH= 8.3 dilué 10 fois ; mais pour les peroxydases, le tampon cuve

est le tris-glycine 0.0685 M (ph 8.6) dilué 10 fois.

La migration se déroule à 4°C pendant 7 h sous une intensité de 25 mA la première heure et

30 mA pour le reste du temps et sous une tension permanente de 150 V.

IV. 3. 4. Révélation des estérases :

Après démoulage du gel, la révélation des activités estérases est effectuée dans un tampon

phosphate de sodium (NaH2 PO4) 0,1 M, pH = 6,2, additionné du substrat (α- Naphtylacetate)

et du révélateur (Fast Blue RR Salt). Suite à l’apparition des bandes, le gel est fixé dans une

solution d’acide acétique à 7%.

IV. 3. 5. Révélation des peroxydases :



49

La révélation des peroxydases est réalisée à l’aide d’une solution de substrat de

l’odianozidine préparée dans le tampon acétate de sodium 0.2M (pH- 4.6). Pour déclencher la

réaction 0.2 ml de H2O2 à 30% est ajoutée, dans l’obscurité et à 25°C; suite à l’apparition des

bandes, le gel est fixé dans une solution d’acide acétique à 7%.


Expérimentation résultats et interprétation

51

Chapitre V : Résultats et interprétation

Afin d’évaluer la tolérance et la sensibilité à la salinité d’une population de genre

Medicago, une analyse par électrophorèse d’isoenzymes est entreprise. Cette étude permettrait

de mettre en évidence un marqueur génétique utile dans l’évaluation des ressources

génétiques et l’amélioration des plantes vis-à-vis de stress. En effet, la réponse des plantes

aux stress environnementaux est souvent liée à des changements biochimiques. Les travaux de

Fyad Lamech et al., 2008, sur la tolérance et la sensibilité au stress salin, chez certains

écotypes de Medicago, ont montré que les écotypes Tru 32 et Acu 209 sont les plus tolérants

par contre Tru 40 et Acu 80 sont les plus sensibles. Sur cette base, ces quatre écotypes ont été

retenus pour l’analyse de deux systèmes enzymatiques dont le premier est une hydrolase

(estérase) et le deuxième une oxydoréductase (peroxydase). Les changements des systèmes

enzymatiques chez les écotypes tolérants et sensibles ont été évalués par la présence ou

l’absence de bande identifiée par leur Rf. Chaque écotype possède son propre profil et des

bandes qui lui sont spécifiques.

V.1. Résultats relatifs aux estérases

Les profils d’estérases sont suivis durant 9 jours de germination chez les quatre écotypes

traités ainsi que leurs témoins. De nombreuses bandes apparaissent avec une mobilité

différente d'un écotype à l’autre. L’analyse des différents profils, au niveau des différents

écotypes, a permis de révéler l’existence d’une variabilité isoenzymatique intrapopulation et

interpopulation.

Au niveau de l’espèce Truncatula, les résultats montrent chez l’écotype tolérant Tru 32,

11 bandes isoenzymatiques, réparties en 3 zones, une zone à migration lente (ZI), une autre à

migration rapide (ZIII), et enfin, une intermédiaire (ZII). Alors que, chez l’écotype sensible



52

Tru 40, seulement 9 bandes sont affichées, représentant chacune une estérase, réparties en

2 zones. (Figures. 6a et 6b).

Par contre au niveau de l’espèce Aculeata, les écotypes tolérants Acu 209 et Acu 80 sensible

leurs profils exhibent 5 à 6 bandes d’estérases réparties en 2 zones. (Figures 8 et 9).

D’autre part, les résultats montrent que l’expression des estérases en ce qui concerne le

témoin, est de deux types : un type constitutif qui se révèle dans tous les stades de

développement chez les individus traités ou témoins, et un type spécifique à chaque stade de

croissance. Cette expression différentielle diffère d’un écotype à un autre que ce soit chez les

écotypes tolérants ou sensibles.

Au niveau de l’écotype tolérant (Tru 32), au premier jour de croissance le profil des

estérases exhibe quatre bandes (Est-3, Est-7, Est-8 et Est-9) avec des Rf compris entre 0.34, et

0.78, alors que, pour le troisième jour de développement, nous constatons une différence dans

l’activité estérasique par rapport au premier jour. En effet, d’après la figure (6 (a) et 7 (a) ) et

leur phénotype électrophoretique du Rf, il y apparait cinq bandes Est-1, Est-2, Est-5, Est-6 et

Est-10 avec des Rf de 0.12, 0.14, 0.43, 0.50, et 0.81 avec l’absence d’Est-3 et Est-7. Au 5eme

jour, on note une diminution progressive de cette activité, de sorte que les bandes estérasiques

précédentes disparaissent (Est-8, Est-9, Est-10). Au bout du 7eme jour de croissance le profil

présente la révélation de deux nouvelles bandes moins intenses (Est-4 et Est-11) avec des Rf

de 0.37 et de 0.89 respectivement. Après neuf jours de croissance, on observe une

augmentation de l’activité esterasique avec la réapparition de certaines bandes disparues au

niveau des stades précédent (Est-3, Est-6, Est-7, Est-8, Est-9, et Est-10). Donc, il semble bien

que l’expression de certaines bandes et leurs disparition est en relation avec chaque stade de

développement de la plante, alors que d’autres s’expriment tout le temps durant toute la phase

de croissance du végétale (figure 6a).



53

Quant à l’écotype sensible Tru40, le premier jour de germination présente deux bandes

Est-7 et Est-8 avec des Rf de 0.62 et de 0.68. Cette activité augmente avec la croissance de la

plante. Dans le troisième jour, on note l’existence de six bandes Est-1, Est-4, Est-5, Est-7, Est-8

et Est-9 avec des Rf compris entre 0.15 et 0.75. Après le cinquième jour cette activité diminue

et présente quatre bandes seulement (Est-3, Est-6, Est-7 et Est-8) avec des Rf de 0.35, 0.51,

0.62 et 0.75. La situation au septième jour est identique à celle du premier jour, par contre,

au niveau du neuvième jour de croissance l’activité estérasique augmente. En plus des bandes

(constitutives) (Est-6, Est-7, Est-8), une estérase spécifique à ce stade est nouvellement

exprimées (Est-2) ( Figure 6 (b) et 7 ( b) ).

Lorsque la plante est soumise au stress, l’expression des estérases est différente d’un

traitement à un autre et d’un écotype à un autre. Pour une concentration de sel de 86.6

mMol/l (T1) le profil de l’écotype Tru32 correspond au profil du cinquième jour du témoin,

donc il s’est révélé un ralentissement de 4 jours, alors que, pour les traitements T2 et T3 les

profiles ressemblent au profil du neuvième jour (Figure 6 (a) et 7(a)) donc l’activation des

estérases ne s’est pas modifiée pour le type tolérant à ce niveau de concentration de sel.

En ce qui concerne l’écotype Tru 40, quelque soit la concentration du sel, les profils des

estérases sont identiques au profil du 1er jour de croissance du contrôle ; en conséquence il est

apparu un ralentissement de 8 jours avec la révélation de la bande Est-9 (bande révélée au

3eme jour seulement) (Figure 6 (b) et 7(b)).



54

Est-1 (0.12)

a) b)

a) b)

Est-2 (0.14)

Est-3( 0.34)

Est-4 (0.37) Est-5(0.43)

Est-6 (0.50) Est-7 (0.56)

Est-8 (0.67)

Est-9 (0.78)

Est-10(0.81)

Est-11 (0.89)

Figure 6: zymogramme et Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Tru 32 (a)

et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours,

5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités ( T1, T2, T3)

1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3

Est-1( 0.15)

Est-2 (0.31)

Est-3 (0.35) Est-4( 0.41)

Est-5 (0.48) Est-6 (0.51)

Est-7 (0.62)

Est-8 (0.68) Est-9 (0.75)

ZI

ZII

ZIII

ZI

ZII

1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3

Figure 7: phénotypes électrophoretiques du Rfs des différentes Estérases, chez

l’écotype Tru 32 et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance :

1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et le lot traité ( T1, T2, T3).

1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3

-

+



55

En ce qui concerne l’espèce Aculeata, les résultats montrent aussi une certaine

variabilité dans l’expression des estérases chez le témoin, ceci pour les différents stades de

développement de la plante, et chez les plantes traitées à différentes concentration de sel.

Cette variabilité enzymatique diffère aussi chez les deux écotypes de cette espèce.

Pour l’écotype Acu 209, cinq bandes Est-1, Est-2, Est-3, Est-4 et Est-5 avec des Rf de 0.12,

0.18, 0.25, 0.32 et de 0.50, sont observées dans la zone I (figure 8 (a) et 9 (a) ), correspondant

à une vitesse de migration lente chez la variété tolérante . Le profil du 1er jour présente trois

bandes d’activité Est-3, Est-4 et Est-5 avec des Rf de 0.25, 0.32 et de 0.50. Cette activité

augmente dans le deuxième profil qui correspond aux plantules âgées de trois jours par la

révélation d’Est-2 avec un Rf de 0.18. Le 5eme et le 9eme jour expose les mêmes bandes avec la

révélation d’une nouvelle bande nommée Est-1et la disparition d’Est-2 et Est-3, tandis que le

7eme jour de germination montre deux bandes seulement Est-4 et Est-5 qui sont révélées

régulièrement durant tous les jours de germination, avec une nette intensité (figure 8 (a) et 9

(a) ).

Sous les conditions stressées, le lot (T1) correspondant à la concentration 86.6mMol/l

présente deux zones d’activité des estérases Est-5 et Est-6 et ce lot est semblable au 7eme jour

du lot témoin, par conséquent, il est apparu un ralentissement de deux jours, par contre pour

(T2) et (T3) les lots sont identiques à ceux du 1er jour et donc le stress à provoqué un

ralentissement de 9 jours (figure 8 (a) et 9 (a) ).

Le profil des estérases chez l’écotype sensible Acu 80 présente un nombre plus élevé de

bandes que chez l’écotype tolérant Acu 209. En effet, 6 bandes estérasiques ont été révélées.

Le premier jour, ce dernier exhibe trois bandes Est-3, Est-4 et Est-6 avec des Rf 0.28, 0.34 et

0.56. Les deux bandes Est-4 et Est-6 persistent jusqu’au 5eme jour de germination, le troisième

jour est caractérisé par les deux bandes précédentes avec la révélation d’une nouvelle bande

(Est-2) de Rf 0.20. Pour le cinquième jour, on note la disparition d’Est-2 et Est-3 et la



56

révélation d’Est-1 avec un de Rf 0.15. Les lots du 7eme et du 9eme jour présentent le même

nombre de bandes Est-5 avec un Rf de 0.40 nouvellement synthétisé et Est-6.

Dans les profils des plantules traitées par T1, T2 et T3, l’intensité des bandes est très forte, le

même nombre de bandes est présent dans le profil du lot témoins âgé de 1 J de germination et

par conséquent le sel a provoqué un retard de 9 jours (figure 8 (a) et 9 (a) ).



57

a) b)

a) b)

ZI

ZII

ZI

ZII

1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3

-

+

Est-1 (0.12) Est-2 (0.18) Est-3 (0.25)

Est-4 (0.32)

Est-5 (0.50)

Est-1( 0.15) Est-2 (0.20) Est-3 (0.28) Est-4( 0.34) Est-5 (0.40)

Est-6 (0.56)

Figure 8: zymogramme et Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Acu 209

(a) et Acu 80 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour,

3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités ( T1, T2, T3).

Figure 9: phénotypes électrophoretiques du Rfs des différentes Estérases, chez

l’écotype Acu 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de

croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2,




58

V.2. Résultats relatifs aux peroxydases (PER).

V.2.1. Changements des profils des peroxydases chez les deux espèces Truncatula,

Aculeata et une population sauvage (inconnue).

Les profils des peroxydases sont aussi suivis durant 9 jours de germination chez les

quatre variétés traitées et leurs témoins par des extractions alternées. Par contre chez le Medic

sauvage des extractions journalières sont effectuées pour tous les lots T0, T1, T2, T3.

L’analyse des différents profils des peroxydases permet de révéler l’existence de 15

bandes d’activité enzymatique. En absence de stress, cette activité des peroxydases diffère

dans le temps, c’est-à-dire chaque stade de développement de la plante présente des bandes

spécifiques. Certaines bandes apparaissent pendant les premiers jours de croissance pour

disparaître les jours suivants.

Chez l’espèce Truncatula, en absence de stress, l’écotype tolérant Tru 32, montre une bande

enzymatique (PER-3 de Rf 0.20) au niveau du 1er et du 5eme jour, puis celle-ci disparait au

niveau des autres jours. En outre la PER-1 (Rf 0.08) révélée le 2eme jour persiste jusqu’au 9eme

jour de germination. Au niveau du 7eme et 9eme jour, le même nombre de bandes ont été

observées PER-1 et PER-2 avec un Rf de 0.08 et 0.10 (Figure 10 (a), 11 (a) ).

Chez l’écotype sensible Tru 40, cinq bandes peroxydasiques ont été observées. Le lot du 1er

jour de germination exhibe une seule bande PER-3 avec un Rf de 0.26. Le 3eme, le 5eme et le

7eme jour révèle une seule bande aussi PER-1 ( Rf 0.08) migrant dans la zone (I). Ont trouve

toujours une disparition des bandes et une révélation des autres. En effet le lot du 9eme jour a

exhibé une nouvelle bande PER-2 avec un Rf de 0.15 et la disparition des bandes précédentes.

En conditions de stress pour une concentration de 86.6Mm/l (T1), l’effet du sel active la

synthèse des nouvelles bandes d’intensité moyenne migrant avec un Rf de 0.32 (PER-3) chez

l’écotype tolérant Tru 32, alors que chez l’écotype sensible Tru 40 elle est de Rf de 0.39



59

(PER-5). Pour des concentrations de 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3), le sel entraîne

une inhibition de synthèse de cette bande chez l’écotype tolérant, par contre l’écotype sensible

présente toujours cette bande pour qu’elle disparaisse sous le traitement (T3) avec la

révélation ou la synthèse d’une nouvelle bande PER-3 avec un Rf de 0.19. (Figure 10 (a), 11

(a) et 10 (b), 11 (b)).



60

a) b)

a) b)

: Flèche indiquant une isoenzyme de stress (PER-4 et PER-3).

PER-1 (0.08) PER -2(0.10) PER -3 (0.22)

PER -4 (0.32)

PER -1 (0.08)

PER -2 (0.15) PER -3 (0.19) PER -4(0.26)

PER -5(0.39)


ZI ZI

ZII ZII

Figure 10: Zymogramme et Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype Tru

32 (a) et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour,

3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités (T1, T2, T3).

Figure 11: phénotypes électrophorétiques du Rfs des différentes Estérases, chez

l’écotype Tru 32 (a) et Tru 40 (b), pour le lot témoin (différents stades de

croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3).

+

-




61

Chez l’espèce Aculeata, en absence de stress, l’écotype tolérant Acu 209 montre différente

formes peroxydasiques, au niveau des plantules issues de post-germination pour les différents

jours (1er, 3eme, 5eme ,7eme et 9eme). Après une croissance de 1 jour, nous notons seulement la

présence d’une seule bande PER-3 (Rf 0.32). Après 3 jours de croissance, une bande (PER-1

avec un Rf de 0.07) est nouvellement synthétisée en plus de celle du premier jour. Le profil

reste inchangé le 5eme jour. Au bout de 7 jours de croissance, le profil révèle une bande (PER-

2 avec un Rf de 0.12 et la disparition des deux autres bandes. Enfin, après neuf jours de

croissance, une bande nouvellement synthétisée PER-4 (0.39) est révélée. En conclusion,

l’activité peroxydasique, en condition naturelle, semble évoluer quantitativement avec le stade

de croissance de la plante (figure 12 (a) et 13 (a)).

Quant à l’écotype sensible Acu 80 (figure 12 (b), 13 (b) ) il’ a révélé aussi une seule

bande de Rf 0.30 après 24heurs de germination. Au bout de 3 jours de germination, nous

constatons la synthèse de deux bandes de peroxydase PER-1 et PER-4 avec des Rf de 0.10 et

de 0.30 respectivement, le 7eme jour présente une faible activité, et enfin, les lots du 9eme et du

5eme jour ont exhibé une nouvelle bande PER-2 avec un Rf de 0.12.

La séparation èlèctrophorétique des peroxydases des jeunes plantules cultivées en

présence de NaCl (86.6mMol/l (T1), 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3)), a permis de

révéler des changements dans la synthèse des peroxydases. En effet, après 9 jours de stress

salin, le lot traité T1, révèle une seule bande (PER-3) d’activité peroxydasique chez l’écotype

tolérant Acu 209 et cinq bandes chez l’écotype sensible Acu 80 (PER-2, PER-3, PER-4, PER-5

et PER-6). Chez ce dernier, l’activité des PERs semble diminuer en fonction de la

concentration du stress. De plus, les profils sont semblables au profil du 3eme jour du témoin.

Il est probable que le stress entraine un retard d’activité de 6 jours (figure 12 (b) et 13 (b)).

Pour l’écotype Acu 209, l’intensité des deux bandes (PER-2 et PER-3) augmente avec



62

l’intensité du stress. Les profils de T2 et de T3 correspondent au 5éme jour témoin et par

conséquent nous remarquons un ralentissement de 4jours.

V.2.2. Changements des profils des peroxydases chez la population sauvage de

Medicago.

D’après la figure (14), le profil de l’activité des peroxydases montre que la distribution des

bandes de peroxydases varie en fonction de la croissance. C’est-à-dire que cette activité est

beaucoup plus importante pendant les 6eme, 7eme et 8eme jours, par la révélation de 5 bandes.

Alors que cette activité est faible durant les premiers jours de croissance ou on peut noter la

présence de deux bandes seulement.

Le profil du lot témoin pendant les croissances des neuf jours, montre la synthèse de 5 bandes

peroxydasiques : deux bandes sont synthétisées pendant les différents stades de croissance

(PER-1 et PER-3), alors que les trois autres sont spécifiques à des stades différents (PER-2,

PER-4 PER-5).

La bande PER-2 est synthétisée seulement au niveau du 7eme, et 8eme jour, et semble être

inhibée durant les autres jours de croissance. Les bandes PER-4 et PER-5 quant à elles, elles

sont synthétisées à partir du 6 eme jour.

En présence du sel, la bande PER-1 est synthétisée avec un retard de 5 jour au niveau du lot

traité T1. L’augmentation de la concentration a accéléré l’activation de cette bande ; en effet,

elle a été révélée à partir du 2eme jour au niveau du traitement T2 et à partir du 1er jour au

niveau du traitement T3 (Figure 14, 15,16 et 17).



63

a) b)

a) b)

: Flèche indiquant des iso enzymes de stress (PER-3, PER-5, PER-6).


PER-1(0.10) PER-2(0.12) PER-3 (0.17)

PER-4 (0.30)

PER-1 (0.05) PER-2 (0.12)

PER-3(0.32)


ZI ZI

ZII

ZII

Figure 12: Zymogramme et Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype Acu

209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour,

3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3).

Figure 13: phénotypes électrophorétiques du Rfs des différentes Peroxydases,

chez l’écotype 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de

croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3).

PER-5(0.40)

PER-6 (0.45)

PER-4 (0.39)

+

-



64

1j 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j 9j 1j 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j 9j

1j 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j 9j 1j 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j 9j

Fleche indiquant des bandes peroxydasique.

Fig 14. Profile électrophorétiques des PERs, systèmes PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicago. Puits 1 à 9 témoins : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement.

Fig 15. Profile électro phorétiques des PERs, système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicago.Puits 1 à 9 traités (T1 86.6mMol/l) : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement.

Fig 16. Profile électro phorétique des PERs, système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicaco. Puits 1 à 9 traités, T2 (102.9 mMol/l) : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement.

Fig 17. Profile électro phorétique des PERs, système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicago. Puits 1 à 9 traités, T3 (137.2 mMol/l). : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement.

PER-1 PER-2

PER-3

PER-4

PER-5

PER-6



65

VI. Discussion.

Les mécanismes de résistance des plantes aux stress abiotiques sont extrêmement compliqués,

cette résistance est quantitativement contrôlée par plusieurs gènes codant, par l’activité des iso

enzymes. Les études sur les iso enzymes ont été appliquées dans les recherches de génétique

et d'écophysiologie. Beaucoup de chercheurs ont conclu que ces iso enzymes jouent un rôle

considérable dans la taxinomie, la phylogénétique et la variabilité des populations (Shannon,

1968 ; Gottlieb, 1982 ; Schmitz et al., 1986). Les isoenzymes ont été examinés aussi par

rapport au stress environnementaux. Ces chercheurs ont rapporté aussi que les modifications

de l’activité des isozymes chez les plantes étaient considérablement liées à la tolérance et à la

sensibilité au stress salin. Donc, les isozymes pourraient être considérées ; comme un

marqueur biochimique pour la tolérance au stress salin chez les plantes ( Foolad et al., 1993 .;

Basu et al., 1997 ) .

VI. 1. Modifications des estérases sous un stress salin :

L’électrophorèse des isoenzymes représente un bon outil pour établir des marqueurs

génétiques utiles dans l’évaluation des ressources génétiques et l’amélioration des plantes.

Leurs variabilités intra et inter spécifiques ont été étudiées par plusieurs chercheurs, Bingham

et Yeh (1971), chez Medicago sativa, Frankel et Garber (1965), chez Pisum sativa, et

Desborough et Peloquin (1968), chez Solanum tuberosum.

La plupart des estérases ont, en général, une gamme de substrats, et elle n’ont aucune

sans une fonction biologique spécifique connue. Car, depuis longtemps elles ont été utilisés

comme des marqueurs enzymatiques d'embryogenèses et organogenèses somatiques (Chibbar

et al., 1988, Coppens et al., 1990). Les estérases ont été associées aussi à la résistance, chez

l’orge vis-à-vis du mildiou (Hwang et al. 1982), ainsi que dans la symbiose et la fixation de

l’azote (Pringle et al., 2004). Ces auteurs montrent que le gène codant pour l’activité des



66

'estérase s’exprimé tôt dans le développement du nodule. Dans la paroi cellulaire la pectine-

methylesterases est responsable de la démethylation de la polygalacturonase. Cette réaction

affecte le pH d'apoplast et la concentration ionique réglant ainsi plusieurs enzymes

hydrolytiques et la rigidité des parois cellulaires (Micheli, 2001). De même, Bordenave et al.,

1995, ont rapporté que l'acétyle estérase joue un rôle important dans les modifications de la

paroi cellulaire. En outre, leur rapport avec le développement des plantes en fait un marqueur

convenable de développement. Plusieurs auteurs utilisent le système des estérases pour

l’identification des espèces (Krulíková et al., 2002 ; Tsanev et al., 2004 ; Stoilova et al.,

2006).

Plusieurs travaux effectués sur différentes espèces ont montré l’existence d’une forte

relation entre la réponse enzymatique et le stress salin (waked ferreira, 2002; Amal, 2005) et

dans le but de mieux quantifier cette relation, nous avons entrepris l’étude du polymorphisme

enzymatique en relation avec le stress salin chez quatre populations de Medicago appartenant

à deux espèces différentes (M. truncatula et M. aculeata ).

A partir de l’ensemble des données obtenues en analysant les différentes espèces annuelle

de Medicago, nous avons pu mettre en évidence une importante variabilité intra et inter

population. En effet, pour différentes concentrations de NaCl, la réponse électrophoretique de

l’activité des estérases diffère d’une espèce à une autre et à l’intérieur même de la même

espèce. Les écotypes des 2 espèces étudiées montrent une richesse allozymique.

Les profils électrophorétiques du système estérase chez les écotypes tolérants (Tru 32 et

Acu 209), et les écotypes sensibles (Tru 40 et Acu 80), montrent une activité d’expression

variable pendant les neuf jours de développement en condition normal et sous stress salin. En

effet, ces profils ne se répètent pas de la même façon entre les écotypes. Certaines bandes sont

synthétisées pendant les premiers jours de croissance pour qu’elles se voient inhibées lors des



67

stades les plus avancés, contrairement à d’autres qui ne sont synthétisées qu’à des stades

avancés.

Une étude envisagée chez les graines oléagineuses sur l’activité amylasique a permis de

penser que durant la phase de repos et dans les premières heures de germination de la

plantule, les graines oléagineuses tirent leurs réserves énergétiques de l’action première de

cette amylase (Jridi et al., 1999), après l’hydrolyse des lipides par des estérases. (Heller et al.,

1993). Cela laisse penser que les mêmes mécanismes peuvent se produire chez les

protéagineuses.

Ram et al., (1977) ont travaillé sur la germination des graines de Lettuce (Lactuca sativa.

L), et ont trouvés que l’activité des estérases est stimulée après 24h de germination et que

cette activité augmente jusqu'à 3 fois au bout de 48h de germination.

Chez le Maïs, Godman et al., (1983) cité par ( Fyad-Lameche, 1999) ont démontré qu’ il

existe des estérases présentes à tous les stades de développement et d’autres qui sont

spécifiques de certains stades de développement .

Yurenkova et al., (1995) montrent bien que l’activité des estérases est en fonction du stade

de développement de la plante. Ces auteurs montrent que les premières heures de germination

sont accompagnées par la formation de nouvelles estérases qui étaient inhibée pendant la

phase dormante de la graine. Ils en concluent que la transition entre la phase d’imbibition de

la graine et la phase post-germinative est suivie par un rapide réarrangement du système

enzymatique. Au bout de 24h seulement de germination, de nouvelles estérases sont formées

au niveau plantule, et celles qui étaient synthétisées pendant la phase d’imbibition de la graine

(levée de dormance) se sont considérablement réduites en intensité ou inhibées complètement.

En analysant l’activité des estérases sur 5 génotypes de bananier, soumis à différentes

concentration de sel, waked Ferreira Gomes et al., (2002) montrent que les profils des

estérases ne présentaient pas de bandes consistantes pour aucun traitement. Par contre, Reyes



68

et al., (1998) avaient détecté un total de 14 bandes réparties en 5 zones d’activité

enzymatique, en analysant les feuilles de 15 clones du genre Musa provenant de culture in

vitro, ce qui indiquerait que ces bandes pourraient être activées au cours d’autres phases de

développement de la plante.

Zou et al., (2007) présentent une étude sur le système d’estérase en relation avec un stress

de froid, montrant que chez deux variétés de Brassica napus L, l’une tolérante AS-3 et l’autre

sensible CON, l’activité des estérases s’accroit sous l’effet de stress chez les deux variétés.

Mais cette suractivité est plus importante chez la variété tolérante que chez la variété sensible.

Les mêmes résultats ont été trouvés par Puneva et al., (1995) qui ont constaté que

l’augmentation de l’activité des estérases dans les cellules du tabac traité est liée à un stress de

basse température (froid et gèl) relativement à 4°C et 10°C.

Tamas et al., (2005) étudiant les effets d’un stress par l’Aluminium, au niveau de

système racinaire de l’orge, ont montré que des concentrations de 2 et 4 mM d’Aluminium

engendrent une augmentation de l’activité estérasique en comparaison avec le témoin. Ces

mêmes auteurs stipulent aussi que sous stress deux isoenzymes d’estérase sont synthétisées

avec une augmentation considérable de cette activité par rapport au témoin.

D’autre part, ils ont conclu que la variation des estérases constitue un marqueur potentiel pour

étudier la pollution par l’Aluminium.

Par ailleurs, l’effet du sel sur l’activité enzymatique des estérases apparait plus nettement

lorsqu’on compare l’intensité des bandes des lots traités avec celles des témoins (Moulai,

2009).

Dans notre étude, L’expression des estérases durant 9 jours de germination des écotypes

d’Aculéata est similaire à celle de l’écotype de Truncatula avec une différence dans les Rf, du

nombre de bandes et de leur intensité. Cette différence est due aux polymorphismes

génotypiques des espèces annuelles de Medicago. Des études de diversité réalisées à l’aide



69

des isozymes ont révélé un polymorphisme très élevé chez la canne à sucre, fournissant une

méthode d’identification des variétés cultivées (Eksomtramage et al., 1991). L’analyse des

différentes espèces a suggéré que l’essentiel du polymorphisme existant entre les clones

cultivés, est dû à des bandes caractéristiques que l’on pourrait suivre à l’aide d’un petit

nombre de marqueurs spécifiques (Seguin, 1993).

L’expression de l’activité des estérases est lié au stade de développement de la plante

certaines bandes ont été révélées dans le premier jour de germination et disparaissent dans les

jours suivants telle que les deux bande de troisième jour (EST-1 et EST-2) de l’écotype Tru

32, EST-1 chez l’écotype Tru 40, EST-3 chez l’écotype Acu 209 et l’écotype Acu 80. Ce sont

des bandes spécifiques qui caractérisent ce jour, ou ce stade de ces écotypes par rapport aux

autres jours. Ce résultat est similaire à celui de Yurenkova et al., (1995) Ram et al., (1977).

Par contre, on trouve des bandes constitutive qui apparaissent pendant tous les jours de

croissance et même sous le stress salin tel que EST-8, EST-9, EST-10, chez l’écotype Tru 32

Figure (6(a), 7 (a) ) et EST-7 , EST-8 chez Tru 40 ( Figure 6 (b), 7 (b) ).

La comparaison intrapopulation des profils traités aux profils témoins des écotypes âgés

de 9 jours, montre des différences qualitatives et quantitatives. Ces différences sont

résumées dans un retard de croissance en fonction de la concentration, en fonction de la

tolérance et de la sensibilité des écotypes étudiés. En effet l’écotype Tru 32 présente un

nombre élevé d’activité enzymatique (11 bandes) par rapport à l’écotype Tru 40 (9 bandes).

Sous un régime de stress salin de 86 mM /l (T1), Tru 32 a révélé 3 bandes esterasiques, donc

l’augmentation de stress a entraîné une augmentation de l’activité esterasique. En

conséquence, les lots traités (T2 et T3) ont exhibé deux bandes en plus (Est-3et Est-4)

respectivement les mêmes bandes ont été trouvées dans le lot du 9eme jour avec des variations

quantitatives seulement. Par contre, l’écotype sensible a révélé l’existence de trois bandes



70

(Est-7, Est-8 et Est-9) quelle que soit la concentration de stress ; les mêmes résultats ont été

trouvés par Tamas et al., (2005).

L’écotype tolérant Aculeata 209 a montré l’existence de 2 zones d’activité estérasique

sous une concentration de 86Mm/ l le même phénomène est remarqué chez Tru 32. Cette

activité est accrue par l’augmentation de la concentration de NaCl avec l’existence de 3 zones

d’activité des estérases similaire à celle du 1er jour témoin, et par conséquent nous

remarquons un retard de 9 jours. Pour l’écotype sensible Acu 80 nous notons l’existence de 2

zones d’activités seulement. Les profils observés chez les plantules traitées par T2 et T3

durant 9 jours, montrent une intensité des bandes légèrement plus importante que celles

observées chez les plantules témoins avec la disparition EST-1, EST-2, EST-3 et EST-4. Cette

observation nous permet de suggérer qu’il est possible que des modifications quantitatives

soient survenues comme réponse à ces niveaux sévères de stress salin. Ces résultats sont

similaires à ceux d’Amal, (2005) qui a conclus qu’une forte activité des isoformes estérases

est liée à une concentration élevé de NaCl. Au contraire, les résultats trouvés par Hassanein,

(2004), lors de la régénération des cals de L.esculentum, sous un stress salin, montrent que

l’activité des estérases diminue sous l’effet de sel, et cette diminution est accompagnée aussi

d’une disparition des autres bandes estérasiques.

Si l’on considère une comparaison inter population entre les quatre écotypes étudiés

sous le terme de la quantité d’estérases révélée après les trois traitements par le stress salin on

remarque que l’activité des estérases est plus élevée chez Tru 32 que chez Acu 209 et cette

même activité est plus élevée chez Acu 80 que chez Tru 40. Par conséquent, Tru 32 est plus

tolérante qu’Acu 209, Tru 40 est plus sensible qu’Acu80. Nous n’avons pas trouvé de travaux

similaires aux nôtres, de sorte que, nous ne pouvons les comparer aux résultats d’autres

auteurs qui ne concernent que l’apparition ou/et la disparition des estérases chez d’autres

variétés de plantes.



71

Les résultats obtenus à l’aide de ce système, montrent d’une part, la possibilité de

l’identification phénotypique entre les deux écotypes extrêmes âgés de 9 jours, d’autre part

d’évaluer l’effet du stress salin sur l’activité enzymatique durant 9 jours d’extraction. Ainsi,

l’étude des Rfs permet de déceler des bandes discriminantes en fonction de l’écotype, des

traitements et du stade de prélèvement pour l’extraction qui correspond à l’âge des plantules.

Finalement, on peut conclure que les profils observés chez les plantules traitées durant 9

jours par les concentrations T1, T2 et T3, montrent une intensité plus importante que celle

observée chez les plantules des lots témoins avec une disparition des bandes d’estérases de Rf

0.12, 0.16, 0.37, 0.43 et 0.89 les même résultats obtenus par Hassanien, 1999 qui a trouvé que

l’ activité des estérases augmente par l’augmentation de stress salin . Cette observation permet

de supposer qu’il est possible d’avoir des changements quantitatif (par rapport à l’intensité de

bandes) qui surviennent comme réponse lors du stress.

VI. 2. Modifications des peroxydases sous un stress salin.

Les peroxydases sont des enzymes hémoprotéiques très répandues chez les être vivants.

Chez les plantes, elles catalysent l’oxydation de différents substrats (des amines aromatique

des phénols,…….), elles interviennent ainsi dans différents phénomènes physiologiques tels

que l’enracinement, la lignification, et la résistance aux stress biotiques et abiotiques (Gaspar

et al., 1991. ; Aouad et al., 1997).

La méthode d’extraction par solubilisation permet d’avoir accès à la totalité des

peroxydases (PER) contenues dans le matériel végétal et renseigne mieux sur la diversité de

ces oxydoréductases, tout en concervant leur propriétés physico-chimiques (Bazziz, 1990 et

Majourhat, 2002).

Waked.E et al., 2002 ont établi trois types de traitements en faisant varier les

concentrations du NaCl additionné à la solution nutritive: 0 ; 50 et 100 mol/m3 ;il en a résulté

degré de polymorphisme plus élevé, soit 15 bandes au total chez des variétés de bananier.



72

D’autres chercheurs (Jarret et al., 1986 ; Bhat et al., 1992), en travaillant sur d’autres

génotypes, ont enregistré diverses zones d’activité très polymorphique chez le bananier.

Irié Z et al., 1999 ont affiché l’existence de quatre à six bandes d’activité peroxidasique

chez la variété haricot de L’ima, et ont conclu qu’au moins deux gènes contrôlent cette

isoenzyme.

Abdel-Baki et al., 2003 ont trouvé l’existence d’une seule bande d’activité

peroxydasique chez trois variétés d’oignon ( Allium ceba L.) La densité et l’intensité de cette

bande sont plus fortes sous des concentrations élevées (2000, 4000, 6000 ppm) du sel, ils ont

conclu que le stress salin a augmenté l'accumulation de la peroxydase et que le gène codant

pour cette isoenzyme a accéléré son expression en réponse à ce stress.

L’électrophorèse des peroxydases chez le Maïs (Zea mays L) soumise à des concentrations

différentes de NaCl, a montré quatre zones d’activité peroxydasique (Amel, 2005). Les

résultats contrastés entre les génotypes étudiés sont en relation avec leur capacité d’adaptation

et de croissance en milieu salin, laquelle, à son tour, est contrôlée par des facteurs génétiques.

Errabii (2006) a également étudié l’effet de NaCl sur l’activité enzymatique à l’échelle

cellulaire d’une variété de canne à sucre. Ses résultats ont montré une réduction importante de

l’activité catalase et peroxydases solubles.

Karray-Bouraoui, 2008 a étudiée les réponses physiologiques et biochimiques de deux

provenances de la Mentha. pulegium L. (Lamiaceae) « Soliman et Takelsa » vis-à-vis du

stress salin. Les deux provenances du nord tunisien ont été traitées par le NaCl (0 et 35 mM)

Après deux semaines de traitement, le sel a entraîné une réduction de la croissance, de 16 %

par rapport à celle du témoin chez la première provenance, et de 25 % chez la seconde.

L’activité de la Gaïacol peroxydase n’est pas modifiée par le traitement salin de courte durée

(15 jours) dans les feuilles, et elle est même diminuée à plus long terme, chez les deux

provenances. Par contre, une stimulation de cette activité par le traitement salin est notée dans



73

les racines, et elle est légèrement plus marquée chez la provenance « Soliman » surtout après

une longue durée de traitement (45 jours).

Chakroun et al., 2007 ont constaté que l’activité peroxydasique n’est détectable qu’en

présence de NH4NO3 (agent de stress aux doses de 500, 1000 et 1500 mg.l-1) ajouté au

milieu nutritife de deux variétés de fraisier « Chandler » et « Sweet Charlee » respectivement

sensible et tolérante). L’activité chute toutefois de plus de la moitié de sa valeur lorsque la

quantité de sel passe de 500 mg.l-1 à 1500 mg.l-1 dans le milieu de culture, la supériorité de

l’activité peroxydasique chez la variété « Sweet Charlee » est plus évidente. L’analyse du

profil électrophorétique de cette activité peroxydasique montre que l’addition de nitrate

d’ammonium dans le milieu de culture induit l’apparition d’isoformes anodiques non

détectables en l’absence de nitrate d’ammonium.

L’extraction par solubilisation progressive des peroxydase des 5 écotype d’O.f.i(

Opuntia Ficus Indica L.) traités par le stress salin, menée par Bazziz, 2006, a permis de

révéler que le stress salin provoque une augmentation des peroxydases dans les fractions

solubles et ioniques préparées à partir d’écotypes tolérants. Ces changements sont reflétés au

niveau des profils électrophorétiques par l’apparition d’isoformes acides et basiques chez les

écotypes dont la croissance n’est pas affectée par le sel. Ce même auteur a enregistré des

changements quantitatifs dans l’activité des peroxydases. L’augmentation significative de

l’activité de cette isoenzyme est enregistrée chez tous les écotypes, tolérants et sensibles, en

condition de stress. Le degré d’augmentation de cette activité dépend de la sévérité et de la

durée du stress.

Des travaux de Rodrigué et al., (2000) ont rapporté que l’augmentation du niveau d’une

isoperoxydase anionique induite par la salinité peut-être reliée à l’augmentation de la fermeté

du melon, en conditions salines.



74

Les travaux de Zou et al., (2007) ont montré que l’activité des peroxydases, s’accroit

sous l’effet de stress froid chez les deux variétés étudiées. Mais cette augmentation est plus

importante chez la variété tolérante que shez la variété sensible.

Amal, 2005 a trouvé aussi une forte activité des peroxydases chez des variétés tolérantes

de maïs soumis à une concentration de 150 mM de NaCl.

En examinant l’effet du stress salins modéré (50, 100, 150,200 Mm) sur l’activité des

peroxydases chez des variétés de blé durant leur stade de développement (96h, 168h, 240h)

Lacramioar et al., (2008), ont trouvé que l’activité des peroxydases est faible dans des

concentrations faible de NaCl, et forte sous des concentrations forte de NaCl. Ils ont conclus

que le stress salin a modifié l’activité des peroxydases, cette modification dépend des variétés

du blé, de l’âge des plantules et de la concentration de NaCl.

Chez le coton, le stress salin a causé une augmentation considérable dans l’activité de

peroxidase chez les variétés tolérants, alors qu’ elle est faible, ou reste inchangeable chez les

variétés sensibles( Gossett et al., 1996). Dans une autre étude, Mitova et al., 2002 ont

comparés le comportement de quelque variétés de tomate vis-à-vis le stress salin, ont trouvés

que la variétés ( L.pennelli) présente la meilleure vigueur de tolérance avec une augmentation

de l’activité peroxydasique par apport au variétés sensibles. En contraste Dionososese et al.,

(1998) ont rapporté une augmentation dans l’ activités peroxydasique sous un regime de stress

salin, chez les variétés sensibles du riz que les variétés tolérantes.

Les résultats des électrophorèses des peroxydases n’apparaissant pas bien nets malgré

plusieurs tentatives, nous exposons dans cette partie les meilleurs résultats obtenus que nous

tenterons d’interpréter. 19 bandes au total ont été révélées (4 bandes chez les variétés Tru 32

et 5 bandes chez Tru 40, 4 bandes chez Acu209 et 6 bandes chez Acu 80).

D’après les figures (10, 11, 12 et 13), les profils électrophorétiques du système

Peroxydase, chez les écotypes tolérants (Tru 32 et Acu 209), et les écotypes sensibles (Tru 40,



75

et Acu 80), nous remarquerons une activité d’expression variable pendant les neuf jours de

développement. Cette activité différera dans le temps, certains bandes apparaissent pendant

les premiers jours et disparaissent par la suite pour que d’autres prennent le relai.

Le nombre de bandes varie chez le génotype Tru 32 de 1 à 2 bandes par profil. La bande

PER-3 du le 1er jour de germination a disparu au cours des autres jours et réapparait le 5eme

jour avec une faible intensité. Le lot 3j, celui des plantules âgées de 3 jours, montre la

présence d’une nouvelle bande PER-1 d’une faible intensité. Les deux bandes précédentes

apparaissent dans le 5eme jour de croissance ce qui fait un total de 2 bandes dans cette zone.

La bande correspondant au PER-1 persiste jusqu’au 9eme jour.

Parmi les bandes de peroxydase détectées, trois (PER-1, PER-4 et PER-3) ont été

respectivement observées chez Tru40 et Tru32 et des bandes du Rf 0.05, 0.32 et 0.10,

respectivement chez Acu209 et Acu80 indépendamment du traitement auquel avaient été

soumises les plantes. C’est seulement dans le traitement par le sel que s’est révélée la bande

PER-4 chez Tru 32 et PER-3, PER-5 chez Tru 40, elles sont peut être dues à une enzyme

marqueur de stress.

Chez Acu 209 ne présente pas des bandes nouvellement synthétisées, par contre chez Acu 80

nous avons la révélation de nouvelles bandes (PER-3, PER-5 et PER-6), donc d’une part, le sel

a induit l’activation de ces bandes et d’autre part, il a entrainé un retard dans l’expression de

cet enzyme ; en effet, chaque profil traité des quatre écotypes ne correspond pas au profil du

neuvième jour du témoin.

Le stress salin a induit l’activation de nouvelles bandes sous des concentrations de 68.6

mMol/l, 102.9 mMol/l chez les écotypes sensibles (Tru 40 et Acu 80) contrairement aux

écotypes tolérantes, ces résultats sont similaire aux résultats de Dionososese et al., 1998

pressedament décrite, et sont contraste aux résultats des autres chercheurs qui ont trouvé que

l’élévations des activités des peroxydases est plus importante chez les écotypes tolérants.



76

Les résultas de l’extraction journalière des peroxydases durant les neuf jours de

germination des graines traitées et témoins, chez l’écotype sauvage de Medicago nous a

amené à suggérer que d’une part l’augmentation de l’intensité des bandes peroxydasiques est

liée à l’augmentation de la concentration du sel (T1, T2 et T3).

D’autre part, nous avons observé que le neuvième jour traité des trois concentrations (T1,

T2, T3) ressemble beaucoup au 6eme jour témoin, ce qui nous permet de conclure que le stress

a entraînée un retard d’activité enzymatique de 3jours.

Par ailleurs, la bande PER-2 qui a été révélée au 7eme jour témoin montre une plus forte

intensité dans les trois lots traités (T1, T2, T3) ainsi qu’une accélération précoce de son

expression par rapport aux jours des lots témoins. En fonction de la concentration de sel, elle

a été révélée au 5eme jour de T1, au 3eme jour de T2 et T3. Alors elle est peut être due à une

enzyme liée au stress salin. (abdel-baki et al., 2003). Le stress a accéléré aussi l’activation de

la bande PER-1.


Conclusion

77

Conclusion et Perspective :

La résistance au sel apparaît comme un caractère polygénique contrôlé à différents

niveaux d’organisation, de la cellule à la plante entière. La grande variabilité manifestée par

les espèces et les variétés pour ce caractère, permet d’envisager la sélection de génotypes

particulièrement bien adaptés au stress salin. Par ailleurs, la diversité des effets du sel offre

une gamme étendue de critères physiologiques et biochimiques qui peuvent être à la base de

tests rapides, utilisables pour un tri à grande échelle.

En effectuant un grand nombre de techniques d’électrophorèse, sur les deux espèces, M.

truncatula et M. aculeata, des différences interpopulation et intrapopulation importantes sont

relevées, ce qui offre des possibilités de sélection de certaines populations pour une meilleure

adaptation à la salinité. Il serait peut-être intéressant d‘utiliser des techniques basées sur la

description du comportement, l‘analyse génétique des caractères et la recherche des

marqueurs moléculaires pour une amélioration de la tolérance au stress salin.

La présente étude, basée sur les données recueillies au cours de plusieurs années, est réalisée

dans le but de rechercher des marqueurs génétiques liés à la tolérance à la salinité chez des

espèces annuelles de Medicago, et de déterminer s’il existe une différence d’activité

enzymatique entre les plantes témoin et traitée, sensible et tolérants.

Au terme des résultats trouvés, nous pouvons conclure que la présence du stress salin

semble altérer le métabolisme normal des deux isoenzymes (estérases et peroxydases) en

retardant leur activité. D’une part le stress a induit l’activation de nouvelles peroxydases, chez

les écotypes sensibles par rapport aux tolérants (changements qualitatifs et quantitatifs) et à

accéléré la synthèse des autres ; d’autre part, les profils des estérases présentent des variations

d’ordre qualitatif se traduisant par une forte intensité des bandes chez les individus traités.

En général, les aspects quantitatifs et qualitatifs des peroxydases et des estérases peuvent être

utilisé comme des marqueurs de résistance des plantes à plusieurs contraintes biotiques et


Conclusion

78

abiotiques. Leurs activités peuvent être un bon indicateur pour la sélection des génotypes

tolérants au stress. Au-delà de ces résultats, le rôle exact joué par ces enzymes demande

encore plus d’investigations.

Enfin, la recherche des marqueurs iso enzymatiques liés à la tolérance à la salinité peut être

exploitée dans la sélection de nouvelles lignées tolérantes au stress salin. En repérant ces

marqueurs de tolérance, il est possible de remonter au niveau des gènes correspondants afin

de localiser les zones du génome impliquées dans la variation de ce caractère de tolérance au

stress salin.


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