spécialité : biologie moléculaire par : ghoma …cerbafaso.org/textes/dea_tese/dea_ghoma.pdf ·...

3678

THESETH

Mémoire

Présentée pour l‟obtention du

Diplôme d’Études Approfondies en Biochimie/Biologie Moléculaire

Spécialité : Biologie Moléculaire

Par : GHOMA LINGUISSI Laure Stella

Maître ès Sciences.

SUR LE THÈME :

Diagnostic Moléculaire du VIH par PCR au Centre Médical Saint

Camille de Ouagadougou et au CERBA/LABIOGENE

Soutenu le 04 Janvier 2012 devant le jury :

Président : Pr Odile Germaine NACOULMA, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Dr Christelle WM NADEMBEGA, Maître Assistante, Université de Ouagadougou

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU

Unité de Formation et de Recherche en

Sciences de la Vie et de la Terre (UFR/SVT)

Département de Biochimie-Microbiologie

et Bioinformatique (BAEBIB)

BURKINA FASO

UNITE - PROGRES - JUSTICE

CERBA/LABIOGENE

UFR/SVT ********************

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Mémoire de DEA – GHOMA LINGUISSI Laure Stella 2

Dédicace… A la mémoire de ma sœur.

Et Rose, elle a vécu ce que vivent les roses, l’espace d’un matin…

François de Malherbe.

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Remerciements…

Ce travail a été réalisé au laboratoire de Biologie Moléculaire du Centre Médical Saint Camille

et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA/LABIOGENE). Nous

exprimons nos profondes gratitudes.

Au Professeur Odile Germaine NACOULMA, responsable de l‟école doctorale (Département de

Biochimie/Microbiologie) pour avoir accepté de présider notre jury.

Je tiens tout d‟abord à adresser mes plus vifs remerciements au Prof. Jacques Simporé,

Professeur titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique moléculaire à l‟Université de

Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Saint Camille

CERBA/LABIOGENE et Recteur de l‟Université saint Thomas d‟Aquin (USTA). Il a encadré

avec bienveillance ce mémoire de DEA, financé entièrement sa réalisation et donné les moyens

nécessaires pour mener à bien cette étude, dans son centre de recherche. En plus, il m‟a aidé dans

le choix de ce thème. Je lui suis très reconnaissante de m‟avoir fait profiter de la richesse et de la

pertinence de ses connaissances scientifiques. Je suis également sensible à la confiance qu‟il m‟a

témoignée.

Mes sincères remerciements vont au Professeur Francine Ntoumi, Présidente de la Fondation

Congolaise pour la Recherche Médicale (FCRM) et Coordonatrice du projet CANTAM pour

m‟avoir octroyé la bourse qui m‟a permis de poursuivre mes études. Merci également pour avoir

accepté d‟évaluer notre travail et d‟avoir accepté d‟être membre du jury.

Au Dr. W.M. Christelle NADEMBEGA, Maître Assistante en Biochimie Microbiologie,

Université de Ouagadougou, pour avoir accepté d‟évaluer notre travail et d‟avoir accepté d‟être

membre du jury.

Au Professeur Jean-Baptiste NIKIEMA, Professeur Titulaire en Pharmacognosie, Université de

Ouagadougou, DGPML et président du conseil d‟administration du centre Muraz pour son appui

scientifique et technique.

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Au Docteur Charlemagne GNOULA, Maître Assistant en chimie thérapeutique et au Docteur

Djeneba OUERMI, Assistante à l‟Université de Ouagadougou pour leurs conseils et pour l‟aide

qu‟iles ont apporté dans la réalisation de ce travail.

A tous les enseignants-chercheurs du département de Biochimie/Biologie Moléculaire

Appliquée/ Substances Naturelles/ Plantes médicinales et Phytothérapie pour la qualité de la

formation reçue.

Je remercie la Conférence Episcopale Italienne (CEI), pour son soutien financier dans la

réalisation de nos travaux de mémoire de DEA.

Je remercie également le projet CANTAM et particulièrement Dr Odile OUWE MISSI OUKEM

pour le précieux appui financier, pour l‟inscription à l‟AEA, qui m‟a permis de continuer ma

formation en DEA.

Je remercie Docteur Cyrille BISSEYE pour l‟aide précieuse au laboratoire et notamment pour

l‟initiation à la RT-Real-time PCR.

Un immense Merci à l‟équipe de Saint Camille CERBA/LABOGIENE avec qui j‟ai partagé mon

quotidien dans la recherche : aux messieurs Bolni Marius Nagalo et Désiré Ilboudo ; aux dames

Florencia Djigma, Tani Sagna, Thérèse Kagoné et Zoenabo Douamba. Soyez rassurez de ma

profonde gratitude.

J‟aimerais remercier chaleureusement et ensuite exprimer ma profonde gratitude à la famille

Simporé (Monsieur François Simporé, sa femme et leurs enfants) pour m‟avoir accueillie comme

membre de leur famille. Je suis particulièrement sensible à la marque d‟hospitalité qu‟ils ont tous

fait montre à mon égard.

Enfin, je voudrais remercier mes parents, mes frères et sœurs qui m‟apportent un grand soutien

depuis plusieurs années. En espérant que le fruit de ce travail traduise en partie la récompense de

tous leurs efforts et leur dévouement.

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TABLES DE MATIERES

Tables de matieres........................................................................................................................... 5

Liste des acronymes ........................................................................................................................ 7

listes des Figures ............................................................................................................................. 8

Introduction ................................................................................................................................... 10

Enoncé du problème ..................................................................................................................... 14

Justification de l‟étude .................................................................................................................. 14

Objectifs de la recherche ............................................................................................................... 14

Objectif principal ...................................................................................................................... 14

Objectifs spécifiques ................................................................................................................. 14

Chapitre I. Généralités .................................................................................................................. 15

I.1 – Diversité génétique du VIH ............................................................................................. 15

I.1.1 – Origine du VIH et de sa diversité génétique.............................................................. 15

I.1.2 – Distribution géographique et prévalence des sous-types VIH-1 ............................... 16

I.2 – Structure du VIH .............................................................................................................. 17

I.2.1 – Particule virale ........................................................................................................... 17

I.2.2 – Génome du VIH-1 ..................................................................................................... 18

I.3 – Cellules cibles du VIH et Réservoirs cellulaires .............................................................. 21

I.3.1 – Cellules dendritiques ................................................................................................. 22

I.3.2 – Cellules de la lignée monocytaire .............................................................................. 23

I.3.3 – Lymphocytes T .......................................................................................................... 23

I.3.4 – Organes lymphoïdes : cibles précoces du VIH .......................................................... 23

I.4 – Mécanisme d‟infection par le VIH ................................................................................... 23

I.4.1 – Différents stades de l‟infection .................................................................................. 23

I.4.2 - Cycle de réplication virale......................................................................................... 25

I.5 – Réponse immunitaire de l‟hôte face à l‟infection à VIH .................................................. 29

I.5.1 – Réponse à médiation cellulaire .................................................................................. 29

I.5.2 – Réponse à médiation humorale.................................................................................. 30

I.6 – Mécanisme de transmission du VIH ................................................................................. 30

I.6.1 – Transmission Sexuelle ............................................................................................... 31

I.6.2 – Transmission Sanguine .............................................................................................. 31

I.6.3 – Mécanismes de la transmission mère-enfant du VIH-1............................................. 31

I.6.4 – Moment de la transmission ........................................................................................ 34

1.7 – Evolution des différentes populations cellulaires lors des phases de la maladie ............. 35

I.8 – Traitements ....................................................................................................................... 35

I.8.1 – Principes et définition ................................................................................................ 35

I.8.2 – Moyens de traitement ................................................................................................ 36

I.9 – Prise en charge de la grossesse chez la femme enceinte séropositive .............................. 37

II –Techniques de diagnostic des infections à VIH .................................................................. 38

II.1 – Diagnostic Indirect .......................................................................................................... 39

II.1.1- Tests ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)............................................. 39

II.1.2 – Tests de dépistage dits : « tests rapides » ................................................................. 39

II.1.3 – Méthode de Western blot ......................................................................................... 39

II.2 – Diagnostic direct ............................................................................................................. 40

II.2.1 – Antigène p24 ............................................................................................................ 40

II.2.2 – Techniques de biologie moléculaire ......................................................................... 40

III – Mesure des marqueurs viro-immunologiques ................................................................... 42

Chapitre II. Méthodologies .......................................................................................................... 43

II.1 – Cadre de l‟étude .............................................................................................................. 43

II.1.1 – Centre Médical Saint Camille .................................................................................. 43

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II.1.2 – Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) ... 44

II.2 – Protocole PTME au Centre Médical Saint Camille ........................................................ 45

II.3 – Déroulement de l'étude .................................................................................................... 46

II.3.1 – Période et type d‟étude ............................................................................................. 46

II.3.2 – Collecte des données et des échantillons de sang .................................................... 46

II.3.3 – Mode de recrutement ................................................................................................ 47

II.4 – Considération éthique ...................................................................................................... 48

II.5 – Matériel ........................................................................................................................... 48

II.5.1 – Appareils de diagnostic utilisés ................................................................................ 48

II.5.2 – ARV utilisés pour le PTME ..................................................................................... 51

II.6 – Méthodes pour les techniques utilisées ........................................................................... 53

II.6.1 – ELISA indirect ......................................................................................................... 53

II.6.2 – Extraction ................................................................................................................. 54

II.6.3 – PCR qualitative ........................................................................................................ 56

II.6.4 – Statistiques ............................................................................................................... 59

Chapitre III – Résultats et discussion............................................................................................ 60

III.1 – Résultats ......................................................................................................................... 60

III.1.1 – Caractéristiques sociodémographiques des mères, selon l‟âge et la profession ..... 60

III.1.2 – Analyse des tests PCR ............................................................................................ 61

III.1.3 – Analyse des tests pour le Real time-PCR des personnes à sérologie douteuse ...... 64

III.1.4 – Analyse des tests PCR par l‟ADN proviral en utilisant les DBS ........................... 64

III.2 – Discussion ...................................................................................................................... 66

Conclusion et perspectives ............................................................................................................ 71

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LISTE DES ACRONYMES

3TC : Lamivudine

AA : Allaitement artificiel

ADN: Acide Désoxyribonucléique

AM : Allaitement Maternel

ARN: Acide Ribonucléique

ARV : Antirétroviraux

AZT : Zidovudine

BET : Bromure d'éthidium

CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI

CMSC : Centre Médical Saint Camille

CPA : Cellules présentatrices d‟antigène

CREN : Centre de Récupération et d‟Education Nutritionnelle

CRF: Circulating Recombinant Form

DBS: Dried Blood Spot

DO: Densité optique

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment

IF : Inhibiteurs de Fusion

INNTI : Inhibiteurs non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse

INTI : Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse

IP : Inhibiteurs de Protéase

LABIOGENE : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire

LTR : Long terminal repeat

NSI : Non Sycintium Inducing

NVP : Névirapine

ONUSIDA : Organisation des Nations Unies pour la lutte contre le SIDA

PCR: Polymerase Chain Reaction

PTME : Prévention de la Transmission Mère-enfant

SI : Syncitium Inducing.

SMI : Santé Maternel et Infantile

TDR : Test de Diagnostic Rapide

TME: Transmission mère-enfant

URF: Unique Recombinant Form

VIH : Virus de l'Immunodéficience Humaine

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LISTES DES FIGURES

Figure 1 : Structure du virion VIH-1 ……………………………… ........................................... 18

Figure 2 : Représentation schématique du génome du VIH-1 . .................................................... 19

Figure 3 : Stade de l‟infection par le VIH …………………………............................................ 25

Figure 4 : Représentation schématique du cycle de réplication du VIH. ...................................... 26

Figure 5 : Schéma des étapes de fixation et de fusion du virus et de la cellule hôte . .................. 26

Figure 6 : Mécanismes de transmission du VIH in utero ............................................................. 32

Figure 7. Origine du VIH dans le lait maternel. .......................................................................... 34

Figure 8 : Evolution des marqueurs de la contamination par le VIH .......................................... 38

Figure 9 : PCR en temps réel. ....................................................................................................... 41

Figure 10: Photos de tests rapides VIH ........................................................................................ 48

Figure 11: Thermocycleur 9700 .................................................................................................. 49

Figure 12 : système d‟électrophorèse .......................................................................................... 49

Figure 13 : Appareil 7500 real time PCR ..................................................................................... 49

Figure 14 : Système photo doc. .................................................................................................... 50

Figure 15 : Centrifugeuse réfrigérée ........................................................................................... 50

Figure 16 : Représentation des résultats du Génie II HIV-1/HIV-2 SDBioline ........................... 54

Figure 17 : Electrophorèse sur gel d‟agarose à 2%. ...................................................................... 62

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LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Protocoles ARV de prévention de la transmission mère-enfant du VIH .................... 51

Tableau II : Mélange Réactionnel de la PCR................................................................................ 57

Tableau III : Programme d‟amplification de la PCR .................................................................... 57

Tableau IV : Mélange réactionnel de la DTT ............................................................................... 58

Tableau V : Mélange réactionnel de la RT ................................................................................... 58

Tableau VI : Programme d‟amplification de la RT-PCR en temps réel qualitative. .................... 59

Tableau VII : Répartition du statut sérologique en fonction des groupes d‟âge ........................... 60

Tableau VIII : Répartition du VIH en fonction des professions des mères .................................. 61

Tableau IX : Prévalence des tests PCR positifs en fonction des professions des mères ............. 62

Tableau X : Résultats des tests PCR des enfants en fonction du mode de traitement de leur mère

....................................................................................................................................................... 63

Tableau XI : Résultats des tests PCR des enfants en fonction de leur mode d‟allaitement. ......... 63

Tableau XII : Répartition de l‟allaitement selon les tests PCR. ................................................... 64

Tableau XIII : Résultats de la PCR des personnes au statut sérologique douteux à l‟ELISA ...... 65

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Résumé

Introduction

Cette étude fait le bilan de la prise en charge dans la prévention de la transmission mère-

enfant du VIH/SIDA (PTME) au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou et au

CERBA/LABIOGENE, deux centres de référence en PTME. L‟objectif de cette étude est

d‟effectuer le diagnostic moléculaire du VIH par PCR chez les enfants nés de mères VIH

séropositives et chez les femmes enceintes ayant un statut sérologique douteux.

Patients et Méthode

Une étude longitudinale était conduite sur 1300 femmes venant pour une consultation

prénatale entre septembre 2010 et juillet 2011. La sérologie VIH de ces femmes a été déterminée

par ELISA et les résultats douteux ont été confirmés par PCR en temps réel. Le Diagnostic

moléculaire du VIH par PCR a été effectué sur 378 enfants nés de mère séropositives, en

utilisant du sang séché sur papier Buvard (Dried Blood Spot : DBS).

Résultats

L‟incidence globale de la transmission mère-enfant du VIH était de 4,76% (18/378) :

0,00% (0/114) pour les mères sous HAART et 6,82% (18/264) pour celles sous NPP (AZT +

3TC + NVP). Les mères étaient essentiellement des ménagères (69,69%), leur moyenne d‟âge

était de 28,3± 0,2 ans et 41,5% des mères étaient du groupe d‟âge 26-31 ans. La différence

n‟était pas significative (p= 0,529) en comparant la PCR positive des enfants allaités avec le lait

maternel avec allaités avec le lait artificiel (6,5% versus 4,2%).Le taux de décès chez les enfants

durant le suivi médical était de 1,3%.

Par ailleurs, parmi les 16 échantillons identifiés indéterminés au test VIH par ELISA, chez les

femmes enceintes, la PCR en temps réel a confirmé 2 échantillons (12,5%) VIH positifs.

Conclusion

L‟efficacité de la stratégie nationale de la PTME repose sur le bon suivi de son protocole.

La thérapie antirétrovirale (HAART) des enfants pourraient réduire d‟une manière très

significative la transmission verticale du VIH. En plus, l‟utilisation d‟une technique de

diagnostic précoce du VIH chez les enfants nés de mères séropositives par PCR est nécessaire et

recommandable dans le cadre de la PTME au Burkina Faso. Chez les femmes enceintes, la PCR

est également essentielle pour confirmer leurs tests VIH douteux effectués par ELISA.

Mots clés : VIH – Nouveau né – ARN – DBS - ADN – PCR – PCR en temps réel – PTME –

Femmes enceintes

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Abstract

Aim of the study

The objective of this study was to evaluate the HIV Mother to child transmission and to confirm

by Real-Time PCR HIV infection in pregnant women with dubious serological status.

Patients and Methods

A longitudinal study was conducted among 1300 women attending the antenatal service at Saint

Camille Medical Centre from September 2010 to July 2011. HIV status of mothers was

determined by rapid tests and ELISA. Discordant results were confirmed by real-time PCR. PCR

was used to determine HIV status of children born from HIV-positive mothers.

Results

From 1300 pregnant women tested for HIV, 378 were seropositive. Mothers were predominantly

housewives (69.7%), and mean age was 28.3 ± 0.15 years. The overall prevalence of HIV

transmission from mother to child was 4.8% (18/378). This prevalence differed significantly

from 0.0% (0/114) to 6.8% (18/264) in children born from mothers under HAART and those

with mothers under NPP (AZT + 3TC + NVP), respectively (p = 0.009).

Children‟s mortality rate during the medical follow up was 1.3% (5 /378). Among 16 women

with HIV dubious status by ELISA, the Real Time PCR confirmed 2/16 (12.5%) as HIV

positive.

Conclusion

The protocol of prevention of mother to child HIV transmission (PMTCT) is effective.

The rate of HIV vertical transmission is significantly reduced. Early diagnosis determined by

PCR of children born from HIV- positive mother is necessary and recommended in the context

of PMTCT in Burkina Faso. We also found that PCR is a performant tool to confirm HIV status

in pregnant women.

Keywords: Pregnant women; child; HIV; PMTCT; Real Time PCR; DNA; DBS.

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INTRODUCTION

En 2010, selon ONUSIDA, le nombre de personnes nouvellement infectées par le VIH

dans le monde était estimé à 2,6 millions. Près de 33,3 millions de personnes vivent avec le VIH,

avec 15,9 millions de femmes et 2,5 millions d‟enfants de moins de 15 ans (ONUSIDA, 2010).

En effet, dans les pays en développement, le taux élevé de mortalité induit par le VIH a un

impact significatif sur la mortalité infantile globale. En 2009, trois cent soixante dix mille

(370 000) enfants ont été infectés par le VIH à travers la transmission mère enfant (ONUSIDA,

2010).

Un quart des femmes enceintes infectées découvrent leur séropositivité, dans le cadre de

la prévention de la transmission mère enfant du VIH (PTME). Le taux de transmission de la

mère à l'enfant est d'environ 15-20% en l'absence de prévention par traitement antirétroviral

(ARV) (GAY et al., 2010). En Afrique subsaharienne, ce taux peut être réduit de 10,4% à 1,4%

lorsque des mesures préventives sont combinées (SIMPORE et al., 2006; SIMPORE et al.,

2007). Malheureusement, en 2009, dans les pays en voie de développement, seul 53 % des

femmes enceintes vivant avec le VIH ont reçu un traitement antirétroviral pour prévenir la

transmission mère enfant (ONUSIDA, 2010).

Au Burkina Faso, la lutte contre le VIH/SIDA et les IST a commencé depuis une

vingtaine d‟années. Sur la base de la séro-surveillance sentinelle, la prévalence globale du VIH

chez les 15 à 49 ans était à 2,0% en 2008 (UNAIDS, 2010). Les stratégies nationales élaborées

depuis 2000 incluent un programme PTME et la mise en place des protocoles antirétroviraux

(ARV) plus efficaces (Rapport Direction de la Santé et de la Famille Burkina Faso, 2006).

Des progrès considérables ont été réalisés au niveau des programmes nationaux de

PTME/ VIH mis en place, mais, il existe un risque résiduel de transmission chez les enfants nés

de mères séropositives. Entre 14 et 16 mois, les enfants nés des mères VIH séropositives, portent

les anticorps de leur mère et sont toujours positifs au test ELISA bien qu‟ils peuvent ne pas être

infectés par le virus. Seuls les dosages de l‟antigène p24 et le diagnostic moléculaire par PCR

peuvent déterminer la séropositivité de l‟enfant dès la naissance. Ainsi donc, le diagnostic

moléculaire précoce demeure l‟outil incontournable pour mesurer les risques d‟infections durant

la vie intra-utérine, pendant l‟accouchement et durant l‟allaitement.

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L‟étude qui a été menée au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou (CMSC) en

2009 a confirmé la baisse de l‟incidence de la TME chez les enfants nés de mères séropositives

qui ont suivi le protocole de la PTME jusqu‟à leur accouchement. Il a été décelé un taux de

transmission verticale de 9,09 % (12/132) chez les mères sous Névirapine ; 4,55 % (4/88) chez

celles sous triprophylaxie (AZT+3TC+NVP) et 0,00 % (0/61) chez celles sous HAART

(SAGNA T. et al., 2008).

La PCR de l‟ADN viral intégré (ADN proviral) est la plus utilisée pour détecter

précocement le VIH chez le nouveau-né. Dans les pays en développement l‟utilisation de ce test

a été facilitée par la technique de « Dried Blood Spot » (DBS).

Le défi médical est d'identifier les enfants infectés par la transmission verticale du VIH

pour leur prise en charge thérapeutique par les ARV. Dans les pays à ressources limitées, il y a

beaucoup d‟avantages à utiliser les échantillons de DBS que le sang total pour la réalisation

d‟une PCR pour détecter l‟ADN (CASTRO et al., 2008). En effet, dans les centres médicaux

ruraux qui n‟ont ni électricité ni congélateur, il est impossible de conserver des échantillons de

sang total ou de sérum.

Le diagnostic précoce et l‟initiation des antirétroviraux chez les enfants infectés par le VIH

sont cruciaux pour diminuer la morbidité et la mortalité chez les enfants nés de mères

séropositives (IVERS et al., 2008). L‟utilisation de la PCR est donc bien indiquée pour le

diagnostic précoce chez les enfants nés des mères séropositives et pour la confirmation des tests

ELISA indéterminés effectués chez les adultes (NAGALO et al., 2011).

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Énoncé du problème

A cause de la présence des anticorps maternels chez l‟enfant jusqu‟à l‟âge de 14-16 mois,

les tests sérologiques semblent donc inefficaces dans le diagnostic précoce du VIH. En plus, il

existe des cas de tests ELISA indéterminés qui posent le problème de la positivité de l‟individu.

Dans ces situations, l‟usage de la PCR s‟avère être nécessaire.

Justification de l’étude

Le diagnostic précoce du VIH chez les enfants nés de mères séropositives est nécessaire

pour leur prise en charge médicale adéquate, il est aussi important chez les sujets adultes en

séroconversion qui n‟ont pas encore des taux d‟anticorps suffisants pour être détectés par ELISA.

Chez ces derniers, le diagnostic moléculaire par PCR du VIH pourrait s‟effectuer afin de

confirmer ou clarifier leur statut sérologique.

OBJECTIFS DE LA RECHERCHE

Objectif principal

L‟objectif de cette étude est d‟évaluer la transmission de la mère à l‟enfant du VIH et de

diagnostiquer l‟infection à VIH chez les femmes enceintes ayant un statut sérologique

indéterminé.

Objectifs spécifiques

Les objectifs spécifiques de cette recherche sont :

- Dépister par PCR au 4ème

mois de naissance les enfants nés de mères VIH séropositives ;

- Estimer l‟incidence de la TME chez les enfants sous allaitement maternel et ceux sous

allaitement artificiel.

- Déterminer la mortalité parmi les enfants allaités au sein et ceux allaités au lait artificiel.

- Confirmer par PCR le statut sérologique des femmes enceintes ayant à l‟inclusion dans la

PTME un test VIH indéterminé par ELISA.

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CHAPITRE I : GENERALITES

I.1 – Diversité génétique du VIH

I.1.1 – Origine du VIH et de sa diversité génétique

Le VIH présente une très grande diversité génétique. On distingue deux types de VIH :

Le VIH1 et le VIH2. Le VIH-2 est moins pathogène que le VIH-1 et il est confiné en l‟Afrique

de l‟Ouest (FANALES-BELASIO et al., 2010) .

Les études phylogénétiques du VIH-1 chez l‟homme et du SIVCPZ chez les primates suggèrent

qu‟au moins trois événements indépendants de transmission se sont produits entre les années

1910 et 1950 à partir de chimpanzés (KEELE et al., 2006). Ces événements ont conduit à

l‟apparition de trois groupes M (major), O (outlier) et N (non-major et non-outlier).

Plus de 90% des infections sont dues au VIH-1 du groupe M. En 2009, une nouvelle souche

relativement proche du virus de l‟immunodéficience simienne de gorilles a été découverte chez

une femme camerounaise. Il a été désigné par VIH-1 du groupe P (PLANTIER et al., 2009). En

2008, une étude a démontré que le VIH était déjà présent chez l‟homme en 1881 (WOROBEY et

al., 2008). Le groupe M est sous-divisé en 9 sous-types soit : A, B, C, D, F, G, H, J et K. La

variation génétique à l‟intérieur d‟un même sous-type se situe entre 15% et 20% alors qu‟elle

atteint 25 à 35% entre les sous-types.

De plus, certains sous types sont également sous divisés en sous sous-types. C‟est le cas

pour le sous-type A qui est divisé en quatre sous-sous types, A1, A2, A3 et A4 ainsi que pour le

sous-type F séparé en deux sous-sous types soit F1 et F2 (BUONAGURO et al., 2007).

D‟abord, la variabilité génétique découle des taux élevés de mutations

(approximativement 1 par 104 nucléotides) (ELENA et SANJUAN, 2005) et de recombinaison

génétique (3 par cycle de réplication) (ZHUANG et al., 2002) engendrées par la transcriptase

inverse dans le contexte d‟une réplication virale intense, estimée à 1010

virions produits par jour

chez un individu infecté non-traité (PERELSON et al., 1996).

Une telle variabilité rend difficile l'élaboration d'un vaccin. Ainsi, lorsque le système

immunitaire est encore efficace, on observe un grand nombre de variants dû aux mutations : le

virus déborde ainsi le système immunitaire, qui est alors détruit. La variabilité se réduit alors, le

variant le plus efficace prenant le dessus.

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Ensuite, l‟évolution se produit en réponse à la pression sélective exercée par le système

immunitaire, plus précisément les anticorps neutralisants, les lymphocytes T CD4+ auxiliaires et

les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (JONES et al., 2009) et par les agents antirétroviraux en

cas de traitement (CASAZZA et al., 2005). Ces facteurs génèrent une population virale

hautement hétérogène dont la diversité s‟intensifie au fur et à mesure de l‟évolution de

l‟infection (SIMON et HO, 2003) .

La recombinaison génétique est un autre processus contribuant à l‟apparition de la

diversité virale. Ce phénomène se produit lorsqu‟une personne est infectée par deux sous-types

différents et que ces deux virus se multiplient dans une même cellule, résultant en un virus

hybride représentant une mosaïque des deux virus présents. Lorsque cette forme recombinante

est retrouvée chez au moins trois autres personnes non épidémiologiquement liées, on la décrit

alors comme étant un CRF (Circulating Recombinant Form), alors que si elle n‟est retrouvée que

chez un seul individu on parle alors de URF (Unique Recombinant Form).

Récemment, l‟accès au séquençage complet des génomes viraux à partir d‟une seule

copie de virus (single genome sequencing) a permis de documenter une panoplie de nouveaux

CRF et URF ainsi que leur distribution géographique, illustrant bien la complexité et la diversité

de l‟épidémiologie du VIH à travers le monde (TAYLOR et al., 2008). À ce jour, plus de 43

CRF ont été décrits (Rapport du groupe d'experts, 2010).

I.1.2 – Distribution géographique et prévalence des sous-types VIH-1

Le sous-type A est présent en Afrique de l‟Est et Centrale ainsi qu‟en Asie de l‟Est et en

Europe occidentale et il est responsable d‟environ 12% des infections par le VIH dans le monde.

Bien que le sous-type B soit le plus répandu géographiquement, il est surtout retrouvé en

Amérique, en Europe ainsi qu‟en Australie et ne représente qu‟environ 10% des cas dans le

monde.

Au contraire, le sous-type C à lui seul, est responsable de la moitié des infections

(TAYLOR et al., 2008) et il se retrouve dans les régions du monde les plus touchées par

l‟épidémie, c‟est-à-dire, l‟Afrique de l‟Est, l‟Afrique du Sud et l‟Inde.

Le sous-type D se trouve principalement en Afrique de l‟Est et serait l‟ancêtre africain du

sous-type B, les deux clades étant génétiquement similaires. Le sous-type D est associé à une

progression rapide de la maladie et ce virus utiliserait le corécepteur CXCR4 très tôt au cours de

l‟infection (HUANG et al., 2007).

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Heureusement, la prévalence de ce sous-type serait à la baisse (RAINWATER et al., 2005).

Le sous-type E retrouvé surtout au sud-est de l‟Asie, a été reclassé comme étant plutôt une forme

recombinante AE et non un sous-type pur E après le séquençage complet de son génome. Ce

sous-type est maintenant identifié comme CRF01_AE (GAO et al., 1996). Cette forme

recombinante est relativement répandue et représente 5% des infections VIH dans le monde.

On retrouve le sous-type G en Afrique de l‟Ouest et il représente environ 6% des infections.

La forme recombinante CRF02_AG est également fréquente dans cette région (environ 5% des

cas). Finalement, les sous-types F-H-J-K sont peu répandus et représentent moins de 1% des cas,

alors que les autres formes recombinantes représentent moins de 0,1% des cas chacune.

I.2 – Structure du VIH

I.2.1 – Particule virale

Le VIH-1 est doté d‟un génome ARN simple brin en double copie de polarité positive de

9817 paires de bases protégé par une nucléocapside icosaédrique. C‟est un virus possédant une

enveloppe formée de trimères protéiques.

Le VIH se présente sous forme de particules sphériques d‟un diamètre de 90 à 120 nm. Il

comporte une enveloppe virale constituée d'une bicouche lipidique et de deux glycoprotéines :

gp120 et gp41. La molécule gp41 traverse la bicouche lipidique tandis que la molécule gp120

occupe une position plus périphérique. La gp120 joue le rôle de récepteur viral de la molécule

membranaire CD4 des cellules hôte. La gp41 est responsable de la fusion de l‟enveloppe avec la

membrane cellulaire. Ces deux glycoprotéines sont liées entre elles par des liaisons non

covalentes (PANCERA et al., 2010).

L'enveloppe virale dérive de la cellule hôte, elle contient donc quelques protéines

membranaires de cette dernière, y compris des molécules du Complexe Majeur

d‟Histocompatibilité (CMH) (ALCAMI et KOSZINOWSKI, 2000). A l‟intérieur, le core viral ou

nucléocapside inclut une couche de protéines de matrice p17 et une couche plus profonde de

protéines de capside p24.

La protéine p17 est une protéine renfermant la protéase virale. La polymérisation de p24 conduit

à la formation d‟un cône tronqué renfermant le génome viral (BARRE-SINOUSSI, 1996). Ce

génome est constitué de deux copies d'ARN simple brin associées à deux molécules de

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transcriptase inverse (p64) et à d'autres protéines enzymatiques (protéase p10 et intégrase p32)

(Figure 1).

Figure 1 : Structure du virion VIH-1 (BRIGGS et al., 2003)

I.2.2 – Génome du VIH-1

Le génome viral est transformé dans le cytoplasme de la cellule infectée en une seule

copie d‟ADN double brin grâce à la transcriptase inverse. Cette rétro transcription suit un

mécanisme très complexe qui aboutit à la création des LTR (Long terminal repeat) aux

extrémités de l‟ADN complémentaire (ADNc). Après circularisation ce dernier migre dans le

noyau et intègre le génome cellulaire. Les LTR constitués des régions U3, R, U5 permettent

l‟insertion du virus dans l‟ADN génomique de la cellule infectée. Les LTR contiennent aussi des

séquences nécessaires à la transcription du provirus. Bien que ces séquences soient identiques,

elles jouent différents rôles selon l‟extrémité où elles se retrouvent (5‟ ou 3‟).

- Au niveau de l‟extrémité 5‟, le LTR joue le rôle de promoteur fort de la transcription.

On y retrouve, le site d‟initiation de la transcription (CAAT box) et un « catalyseur »

(TATA box).

- Au niveau de l‟extrémité 3‟ le LTR est un promoteur non spécifique capable d‟activer

tout gène endogène ou non situé à sa proximité.

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Figure 2 : Représentation schématique du génome du VIH-1 (PETERLIN et TRONO, 2003).

Le génome du VIH est constitué uniquement de deux molécules d‟ARN monocaténaires de

9,2 kb et de polarité positive, disposant à chaque extrémité d‟une région R identique,

indispensable à la transcription inverse. Les ARN génomiques viraux ont une structure d‟ARNm

(ils possèdent une coiffe en 5‟ et sont polyadénylés en 3‟).

Le VIH possède 3 gènes rétroviraux: codant pour différentes protéines virales :

o Le gène gag (groupe antigène) code pour des protéines internes ("core") : p50 et p40 qui

se cliveront en p13, p18 et p24. Le gène gag est responsable de la synthèse des protéines

qui composeront la structure virale, comme la capside (p24), la nucléocapside (p6, p7)

ainsi que la matrice (p17).

o Le gène pol (polymérase) code pour des enzymes nécessaires à sa réplication :

notamment p68 (transcriptase inverse) et p34 (intégrase). Le gène pol code pour les

enzymes virales : la transcriptase inverse, l‟intégrase, la protéase ainsi que la

ribonucléase.

o Le gène env, (enveloppe) code pour des glycoprotéines (gp120 et gp 41 issues de gp

160), qui entrent dans la composition de l‟enveloppe virale (gp160) contenant les

déterminants interagissant avec le récepteur et le corécepteur, essentiels à l‟entrée dans la

cellule hôte. La gp41 est formée de trois domaines majeurs : l‟ectodomaine responsable

de la fusion, la région d‟ancrage transmembranaire et la queue cytoplasmique.

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A la différence des autres rétrovirus, le VIH-1 a une organisation beaucoup plus complexe.

En plus des trois gènes communs aux rétrovirus (gag, pol, env), son ARN code pour 6 autres

gènes permettant la synthèse de seize protéines dont 3 enzymes (transcriptase inverse, intégrase,

protéase) 7 protéines dites protéines structurales (gp41, gp120, matrice, nucléocapside, capside,

p7, p6) et 6 protéines accessoires soit : Rev, Nef, Vpu, Vpr, Tat, Vif (tat qui favorise

l'augmentation du niveau de la synthèse des protéines virales, rev qui favorise l'augmentation des

ARN messagers correspondant aux protéines de gag, pol et env ; ainsi que d'autres gènes tels que

vif qui permet d'augmenter l'infectiosité, nef, vpu ou vpr (vpx pour le VIH-2) (WANG et al.,

2011).

Les gènes tat, rev, vpu, vif, nef et vpr sont dits gènes régulateurs. Ces gènes sont en

charge de régulariser divers aspects de l‟infection virale. La protéine Tat est un activateur de la

transcription virale via le LTR alors que Rev joue un rôle de transport de l‟ARN viral du noyau

vers le cytoplasme. Vpu, Vpr, Nef et Vif sont des protéines dites accessoires et sont, par

conséquent, non essentielles à la réplication virale. Par contre l‟effet de ces protéines sur la

dynamique virale et sur l‟échappement au système immunitaire n‟est pas négligeable. Notons

également que le VIH-2 ne possède pas de protéine Vif.

A coté de ces trois gènes, nous avons un certain nombre d‟autres gènes codant pour les

protéines dites « accessoires ».

Le gène Tat code pour la protéine Tat (Transactivator of Transcription). Cette protéine

par sa fixation sur la séquence Tar va permettre l‟amplification de la transcription des

ARNm.

La protéine Rev issue du gène Rev (Regulatory of Virion Expression) permet la

régulation de l‟exportation du noyau des ARN viraux.

La protéine Nef (Negative regulatory Factor) codée par le gène du même nom a plusieurs

rôles :

o Elle induit une régulation négative de l‟expression des CD4 et du complexe majeur

d‟histocompatibilité de classe 1 (CMH-1) de la cellule infectée (CAI et al,. 2011). Cette

régulation contribue en partie à l‟augmentation de l‟infectivité virale (CAI et al., 2011).

Le gène Vif (Viral Infectivity Factor) codant pour la protéine Vif a été identifié par

FISHER et al.(1987). Vif sera intégré dans le virion et associée à la nucléocapside. A ce

stade elle va inhiber l‟intégration de la protéine APOBEC3G dans le virus (LAVENS et

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al., 2010). Puis Vif envoie la protéine APOBEC3G dans la voie d‟ubiquitination. Ceci

aura pour effet la dégradation d‟APOBEC3G par les protéasomes. APOBEC3G par son

activité antivirale constitue une défense naturelle très efficace contre les rétrovirus HIV-

1, HIV-2 et SIV. Vif est indispensable à l‟infectivité du virus.

Le gène Vpu (Viral Protein U) code pour la protéine Vpu. Cette protéine permet de

diminuer l‟expression des récepteurs CD4 à la surface des cellules infectées. Ce sont

essentiellement les CD4 néosynthétisés dans le réticulum endoplasmique, complexés

avec le gp160 qui sont la cible de Vpu (WILDUM et al., 2006). L‟interaction de Vpu se

fait directement avec la partie C-terminal du domaine cytoplasmique de CD4 (PTAK et

al., 2010).

La protéine Vpr (Viral Protein R) codée par le gène Vpr est indispensable à l‟infection de

cellules qui ne se divisent pas tels que les macrophages (KOGAN et RAPPAPORT,

2011). Dans ce cas, Vpr est étroitement reliée au PIC (viral Pré-Integration Complexe).

En effet, elle présente une affinité forte pour les pores nucléaires ce qui permettra au PIC

de passer le pore.

I.3 – Cellules cibles du VIH et Réservoirs cellulaires

Les cellules cibles du VIH sont caractérisées par la présence, à leur surface du récepteur

CD4, sur lequel viendra se fixer le virus. Deux groupes de cellules ont été répertoriés ; les

lymphocytes T CD4+ et les cellules présentatrices d‟antigène (CPA). La disparition progressive

des lymphocytes T CD4+ est la marque du syndrome de l‟immunodéficience acquise (SIDA).

La grande majorité de la réplication virale (99%) se passe dans ces cellules activées dans les

organes lymphoïdes et les autres tissus libérant dans le plasma des virions dont la demi-vie est

estimée à quelques heures. Les CPA sont les monocytes sanguins, les macrophages tissulaires et

les cellules dendritiques. Ces dernières sont présentes dans le thymus, la peau (cellules de

Langherans), les muqueuses, les organes lymphoïdes, le système nerveux central et le sang

périphérique.

La fixation du gp120 sur le récepteur CD4 entraîne un changement conformationnel qui

permet l‟accessibilité à des corécepteurs, appartenant à la famille des récepteurs chémochiniques.

Ces derniers coopèrent avec le CD4 pour permettre l‟entrée du virus dans la cellule.

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On distingue le CCR5 sur le macrophage, le CXCR4 sur les lymphocytes T. D‟autres

corécepteurs jouant un rôle mineur ont été mis en évidence, ce sont le CCR3, le CCR2 et le

CXCR1. Selon leur tropisme pour ces cellules et selon la nature et le type de chémokines, les

isolats viraux peuvent être classés en trois souches :

- les souches M-tropiques, dont le tropisme est restreint aux monocytes macrophages. Ils étaient

auparavant décrits comme des virus NSI : non sycintium inducing, du fait de la faible production

de syncitia in vitro ;

- les souches T-tropiques ou X4, autrefois appelées SI : syncitium inducing, qui reconnaissent la

lignée cellulaire T ;

- les souches M-T-tropiques ou R5X4 ont un double tropisme.

I.3.1 – Cellules dendritiques

Des populations cellulaires sont présentes dans les muqueuses et sont susceptibles à

l‟infection. C‟est le cas des cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques cutanées.

Ces cellules sont très nombreuses dans les muqueuses cervicales et vaginales et expriment un

fort niveau de récepteurs CD4 et de CCR5 (HLADIK et McELRATH, 2008).

Les cellules dendritiques, quant à elles, sont des cellules présentatrices d‟antigènes et le

VIH peut s‟y attacher via le récepteur cellulaire DC-SIGN (IZQUIERDO-USEROS et al., 2007).

Les cellules dendritiques sont de grandes voyageuses de par leurs fonctions de présentation

d‟antigène et, vont malencontreusement propager l‟infection vers d‟autres organes lymphatiques

comme les ganglions lymphatiques, le thymus et la rate. Suite à cette dissémination virale, la

virémie devient alors très importante au niveau sanguin et le sujet infecté est fortement

contagieux.

Ce sont des cellules présentatrices d‟antigènes, présentes dans le thymus, la peau (cellules

de Langerhans), les muqueuses ainsi que dans tous les organes lymphoïdes secondaires. Elles ont

un rôle majeur dans la reconnaissance de l‟antigène au cours de la réponse immune primaire

(VAN KOOYK, 2008). Ainsi, les cellules dendritiques des muqueuses génitales transportent le

virus aux organes lymphoïdes voisins où il serait transmis aux cellules CD4 dans lesquelles il se

réplique (PERESSIN et al., 2011).

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Les cellules dendritiques expriment la molécule CD4 et il a été montré qu‟elles sont

fréquemment infectées par le VIH in vivo (DUVALL et al., 2007) ; et de plus il semble que la

réplication du VIH dans ces cellules soit particulièrement efficace (PERESSIN et al., 2011).

I.3.2 – Cellules de la lignée monocytaire

Chez l‟homme, les cellules de la lignée monocytaire expriment la molécule CD4, et sont

présentes dans le sang circulant sous la forme de monocytes, et dans tous les tissus sous forme de

macrophages (REDEL et al., 2010). Elles sont chargées de la capture et de la dégradation de

l‟antigène, puis de sa présentation aux lymphocytes T (REUTER et al., 2010).

Dans le cerveau, les cellules microgliales d‟origine monocytaire représentent la principale

population cellulaire infectée par le VIH (POLUEKTOVA et al., 2004).

I.3.3 – Lymphocytes T

Parmi les lymphocytes T du sang périphérique, il existe deux populations : l‟une

exprimant la molécule CD4 et l‟autre la molécule CD8 (MORIS et al., 2006). La plupart des

cellules CD8+ sont des lymphocytes cytotoxiques, tandis que la plupart des lymphocytes CD4+

sécrètent des lymphokines. La réplication virale implique majoritairement les CD4+

(JOSEFSSON et al., 2011).

I.3.4 – Organes lymphoïdes : cibles précoces du VIH

Dès les stades précoces de l‟infection, les ganglions apparaissent contenir 5 à 10 fois plus

de virus associés aux cellules ganglionnaires que les cellules mononuclées circulantes. Les

ganglions ne sont pas les seuls organes lymphoïdes atteints par le VIH ; d‟autres tissus tels que,

la rate et le thymus sont également touchés (ZHANG et al., 2011).

I.4 – Mécanisme d’infection par le VIH

I.4.1 – Différents stades de l’infection

Un contact infectieux avec le VIH se produit généralement au niveau des muqueuses

gastro-intestinales ou génitales. Quoique les corécepteurs CXCR4 et CCR5 soient utilisés par le

VIH pour infecter une cellule, les virus utilisent presque exclusivement le récepteur CCR5 lors

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de l‟infection primaire (LEONARD et ROY, 2006). Au fil de la progression de la maladie,

l‟évolution d‟espèces virales utilisant le récepteur CXCR4 s‟observe chez environ la moitié des

individus (WILKIN et al., 2007). Or, la muqueuse gastro-intestinale est le plus grand organe

lymphoïde du corps humain et environ 70% de la population de lymphocytes s‟y trouve

(VOSSENKAMPER et al., 2011).

Ces cellules expriment fortement les récepteurs CD4 et CCR5 ainsi que les marqueurs

d‟activation HLA-DR et CD69 et sont donc très susceptibles à l‟infection par le VIH

(BIANCOTTO et al., 2008; DAI et al., 2009).

Ce sont les cellules de la muqueuse gastro-intestinale qui sont généralement les toutes

premières cellules qui vont rencontrer les virus transmis. Il va s‟ensuivre une infection massive

et une réplication virale importante et, plus de 50% des cellules exprimant CD4 et CCR5 seront

infectées et détruites dans les deux à trois premières semaines suivant l‟infection.

D‟autres populations cellulaires sont présentes dans les muqueuses et sont susceptibles à

l‟infection. C‟est le cas des cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques cutanées.

Ces cellules sont très nombreuses dans les muqueuses cervicales et vaginales et expriment un

fort niveau de récepteurs CD4 et CCR5 (HLADIK et McELRATH, 2008).

Toutefois, l‟infection primaire passe souvent inaperçue. Les symptômes sont souvent

discrets tels que : fièvre, adénopathies, maux de gorge, éruptions cutanées, douleurs musculaires,

diarrhée et maux de tête et se résorbent généralement en quelques semaines. Souvent ces

symptômes vont être associés à tort à une mononucléose ou à une grippe.

Selon la classification de Fiebig, la primo-infection peut-être divisée en six stades

(FANALES-BELASIO et al., 2010): D‟abord le stade I se caractérise par l‟apparition d‟une

charge virale supérieure à 100 copies d‟ARN par ml de plasma et se produit généralement dans

les 10 à 17 jours suivant la transmission. Durant cette période, le virus va se répliquer

massivement et le sujet est alors fortement infectieux. En quelques jours, la détection de

l‟antigène p24 va également être positive (stade II) et la charge virale est nettement supérieure

(parfois jusqu‟à 5-6 log d‟ARN viral). Puis les premières réponses immunitaires de type IgM

vont se produire et pourront être détectées à l‟aide des tests de nouvelle génération dont la

sensibilité est accrue : on parle alors de séroconversion (stade III).

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Environ 30 jours après l‟infection, le test western blot, qui met en évidence les protéines

virales, est indéterminé (stade IV). La charge virale est relativement stable durant les stades II à

IV, puis, approximativement 3 mois après l‟infection, on observe une diminution de la charge

virale ainsi qu‟un résultat du test western blot positif (stade V). Le dernier stade peut être

subdivisé en infection récente puis, ultérieurement, en infection chronique (figure 3).

Figure 3 : Stade de l‟infection par le VIH (KEELE et al., 2008).

Cette figure représente les différents stades de Fiebig (FIEBIG et al., 2003) en corrélation avec

les résultats de tests de laboratoire lors du suivi de l‟infection par le VIH.

I.4.2 - Cycle de réplication virale

Tout comme les autres virus, le VIH ne peut se répliquer qu‟en pénétrant dans une cellule

et en utilisant sa machinerie cellulaire. Le cycle de réplication du VIH se divise en deux phases :

une précoce et une tardive (DIDIERLAURENT et al., 2008).

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Figure 4 : Représentation schématique du cycle de réplication du VIH(HAN et al., 2007).

Le cycle de vie complexe du VIH-1 offre de multiples moyens d'intervention des ARV. La

thérapie actuelle dirigée contre la transcription inverse et l'assemblage viral induirait à la fois une

tendance à la résistance et une insuffisante de l'éradication du virus. Un troisième axe d‟attaque à

l‟entrée de ce dernier est nécessaire et pourrait provenir des agents ciblant l‟enveloppe virale-

CD4 ou l‟interaction des corécepteurs (CCR5 et CXCR4), R5 et X4 du VIH-1, en utilisant CCR5

et CXCR4 du VIH-1, respectivement (MICHAEL et MOORE, 1999).

I.4.2.1 – Phase précoce

Figure 5 : Schéma des étapes de fixation et de fusion du virus et de la cellule hôte (CLAPHAM

et WEISS, 1997).

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Lors de la phase précoce, le virus se fixe sur la cellule cible par reconnaissance entre la protéine

virale gp120 et la protéine CD4 du lymphocyte T ou d‟autres cellules phagocytaires

mononuclées, ainsi qu‟un corécepteur. Le récepteur CD4 est une glycoprotéine monomérique de

58 kDa. Le corécepteur est un membre de la famille des chimiokines à 7 passages

transmembranaires couplés aux protéines G (VENZKE et al., 2006). L‟interaction du cofacteur

au complexe gp120/CD4 induit un changement conformationnel qui permet le démasquage de

gp41 et la fusion des membranes (FENOUILLET et al., 2007).

Après fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmique de la cellule cible, la

nucléocapside (contenant le génome viral et les enzymes) peut pénétrer dans la cellule cible. Il y

a alors élimination des protéines de la nucléocapside, ce qui libère le génome viral et les

enzymes. La transcriptase inverse virale catalyse la transcription inverse de l'ARN, formant des

hybrides ADN-ARN.

La matrice d'ARN étant ensuite dégradée par une activité RNase de la transcriptase

inverse, il y a synthèse d'un second brin d'ADN. Cette étape est fortement régulée, et est sous le

contrôle des protéines Vif et NC (nucléocapside). Vif a pour rôle de contrôler l‟accrochage de

l‟amorce spécifique, un t-RNALys, qui permettra par la suite de reconnaître le progénome viral

et de l‟adresser au noyau de la cellule.

L‟ADN nouvellement synthétisé (ou pro-génome) migre vers le noyau, grâce à sa liaison

au complexe supramoléculaire protéique : le PIC ou complexe de pré-intégration qui contient

l‟intégrase, la protéine de matrice, la transcriptase inverse et le Vpr qui joue un rôle majeur dans

l‟import nucléaire (FRANCIS et al., 2011). Le pro-génome viral est ensuite intégré dans le

génome de la cellule hôte, grâce à l‟intégrase.

I.4.2.2 – Phase tardive

Cette phase correspond aux étapes permettant d‟obtenir des virions complets, qui seront

capables de bourgeonner et d‟arriver à maturation après leur libération dans le milieu

extracellulaire. Ce sont les enzymes cellulaires qui réalisent la transcription de l‟ADN proviral,

sous l‟influence de facteurs d‟activation environnementaux (cytokines, antigènes) et viraux

propres au VIH.

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Les fonctions cellulaires sont détournées au profit du virus. Des ARNs courts et épissés,

codant pour les protéines Tat, Rev et Nef (dites précoces), sont produits.

- Nef est une protéine accessoire.

- Tat est un activateur transcriptionnel qui se fixe sur l‟ARN en cours de synthèse au

niveau de la région TAR (Trans-Activating Response Element), et permet ainsi de

recruter différentes protéines cellulaires favorisant l‟élongation de la transcription.

- Rev permet l‟export des ARNm non épissés via sa fixation sur le RRE (Rev Responsive

Element) des transcrits primaires, et permet le recrutement de l‟exportine-1 (HOFMANN

et al., 2001) et du facteur Ran-GTP (ASKJAER et al., 1998).

Des ARNs non épissés ou simplement épissés, correspondant aux gènes gag, gag-pol

(protéines de structure), env (enveloppe), vif et vpr, sont ensuite produits pour donner des

protéines dites tardives. Une fois traduits, les différents composants viraux sont adressés à la

membrane cellulaire, s‟assemblent pour former un virion qui bourgeonne et finissent leur

maturation dans le milieu extracellulaire grâce à la protéase (DOOLITTLE et GOMEZ, 2011).

Dans les cellules quiescentes, l‟ADN proviral n‟est pas intégré dans le génome de la cellule hôte

(REDEL et al., 2010).

I.4.2.3 – Particularités sur l’évolution de l’infection vers le SIDA

Il n‟y a pas de progression vers le SIDA pour une certaine catégorie de personnes

infectées par le VIH-1. Ce sont des “non progresseurs sur le long terme” (Long Term Non-

Progressors), leur taux de LT CD4+ reste stable pendant de nombreuses années et leur charge

virale cellulaire et plasmatique demeure faible. Ces patients présentent une faible hyperplasie

lymphocytaire et ont de hauts niveaux de LT CD8+ cytotoxiques mémoires anti-VIH-1. Enfin,

l‟apoptose spontanée des LT est réduite chez ces patients.

Par ailleurs, un autre groupe est particulièrement étudié : les exposés non infectés. Il

s‟agit de personnes séronégatives qui sont hautement exposées au VIH-1 et qui demeurent

indemnes de l‟infection. Certaines de ces personnes ont des LT cytotoxiques (LTC) spécifiques

du VIH-1, confirmant que ces personnes ont bien été exposées au virus, et la présence de ces

LTC pourrait expliquer leur statut séronégatif. Elles possèdent également de nombreuses IgA

anti-VIH-1 (SHACKLETT, 2006).

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Ces données confortent le rôle protecteur important des LTC. Parmi ces personnes

exposées et non infectées, certaines portent une mutation défective (délétion de 32 paires de

bases) du gène codant pour le corécepteur CCR5. Cette mutation à l‟état homozygote confère

une résistance à l‟infection, au moins par voie sexuelle.

I.5 – Réponse immunitaire de l’hôte face à l’infection à VIH

Le système immunitaire détecte l‟infection par le VIH et réagir de plusieurs façons soit :

- par le système immunitaire inné constitué des phagocytes et des « natural killers (NK) »,

- par le système immunitaire adaptatif composé des lymphocytes T auxiliaires et des

lymphocytes T cytotoxiques.

L‟infection par le VIH-1 génère une réponse immunitaire qui contient le virus mais qui ne

l‟élimine jamais. Deux types de réponses sont mis en place pour le contrôle de l‟infection : la

réponse à médiation cellulaire et la réponse à médiation humorale.

I.5.1 – Réponse à médiation cellulaire

Réponse CD8

Les lymphocytes T cytotoxique (LTC) sont des effecteurs essentiels de la réponse

immunitaire antivirale. Des LTC spécifiques du VIH-1 ont été trouvés en grand nombre et dans

une multitude de compartiments anatomiques (sang, rate, ganglions lymphatiques, muqueuse

vaginale et gastro-intestinale, peau, espaces broncho-alvéolaires) chez des patients infectés par le

VIH-1. Ces LTC sont dirigés contre des épitopes de différentes protéines du VIH (Gag, Pol, Tat,

Nef, Vif ou Env).

Après l‟infection par le VIH-1 des populations oligo-clonales de LT CD8+ apparaissent

rapidement dans le sang périphérique des individus infectés et lysent les cellules infectées par le

VIH-1 (SIRCAR et al., 2010) avec comme corollaire le déclin de la charge virale en ARN

plasmatique durant la période de primo-infection.

Les LT CD8+ sont également importants lors de la phase asymptomatique (JIAO et al.,

2011). Ainsi, bien que la charge virale soit faible, les réponses LTC se maintiennent in vivo

durant cette phase. Lors d‟un rebond de la virémie ou lors d‟une interruption de la trithérapie

chez des patients infectés, de nouvelles cellules ou des cellules préexistantes T CD8+ spécifiques

du VIH-1 peuvent être activées et s‟épandre. Toutefois, il apparaît que cette réponse n‟est pas

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efficace tant sur le plan quantitatif que qualitatif, car elle ne permet pas l‟éradication du virus et

n‟empêche pas l‟évolution vers le stade SIDA.

Réponse CD4

Les LT CD4+ spécifiques du virus ont aussi un rôle important dans le contrôle de la

réplication du VIH-1 (ZHENG et al., 2009). En effet, l‟amplitude de la réponse lymphocytaire T

CD4+ et le contrôle de la virémie sont en corrélation chez des individus infectés et non

progresseurs.

Toutefois, l‟infection par le VIH-1 conduit à une déplétion sélective de la population

lymphocytaire T CD4+. Or, les LT CD4+ sont un élément essentiel du système immunitaire car

ils permettent le développement et le maintien de la réponse LTC et humoral. Leur déplétion

influe par conséquent sur la capacité d‟élimination du virus.

I.5.2 – Réponse à médiation humorale

La mise en place d‟une réponse à médiation cellulaire est suivie par une forte réponse

humorale (VAN MONTFORT et al., 2011). La séroconversion apparaît 3 à 6 semaines après

l‟infection, mais certaines séroconversions sont plus tardives (au-delà de six mois). Elle suit le

contrôle de la virémie plasmatique. Les anticorps neutralisants sont principalement dirigés contre

l‟enveloppe du VIH-1 et agissent soit en bloquant l‟infection avant l‟attachement du virion à la

cellule, soit en inhibant la fusion membranaire, voire l‟internalisation du virion.

Il existe également des anticorps dits facilitant׃ les virions recouverts de ces anticorps

pénètrent dans les cellules par le biais des récepteurs aux immunoglobulines exprimés à la

surface de ces cellules. Ainsi, bien que la réponse humorale ait un rôle central dans l‟élimination

de nombreuses infections virales, son rôle dans l‟infection par le VIH-1 est plus controversé.

I.6 – Mécanisme de transmission du VIH

Depuis le début de cette pandémie, trois principaux modes de transmission ont été

observés : la voie sexuelle, la voie sanguine et la transmission verticale.

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I.6.1 – Transmission Sexuelle

La majorité de la transmission par le VIH soit 75 à 85% s‟effectue par les rapports

sexuels non protégés (BUNNELL et al., 2006).

C‟est le mode de contamination le plus fréquent en Afrique. Les facteurs augmentant le risque de

transmission sexuelle sont les stades de primo-infection et SIDA qui sont les stades où la virémie

est élevée. Les autres facteurs de risque : un taux de CD4 <200/mm3, une antigénemie p24

positive, charge virale élevée non contrôlée ou multi résistance aux anti-rétroviraux. Le risque

est aussi augmenté en cas d'infections génitales, de rapports sexuels pendant les règles, de

violences sexuelles.

I.6.2 – Transmission Sanguine

Elle est observée chez les usagers de drogues par voie intraveineuse, lors de transfusion

sanguine, de transfusion d'extrait de sang à risque. Les contaminations professionnelles se

produisent au cours de piqûres ou de blessures accidentelles avec du matériel contaminé ou

projection de sang sur les muqueuses. Le risque est diminué par le dépistage systématique chez

les donneurs.

I.6.3 – Mécanismes de la transmission mère-enfant du VIH-1

I.6.3.1 – Durant la grossesse

I.6.3.1.1- Rôle du trophoblaste

Le trophoblaste correspond à la couche cellulaire continue formée de fibroblastes qui

limite l'œuf, devenu blastocyste au 6e jour après la fécondation. Tout au long de la grossesse, des

microlésions entaillent la barrière placentaire, qui est plus mince et vulnérable en fin de

grossesse. Il est donc possible que des cellules infectées, provenant de la circulation maternelle

ou de la décidue, ou bien les particules virales libres, puissent directement passer à travers les

brèches pour atteindre la circulation sanguine fœtale (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004).

L‟entrée du virus dans la cellule cible représente une étape cruciale du cycle de vie viral.

L‟expression de CD4 a été détectée dans les trophoblastes ce qui accrédite l‟idée que l‟entrée du

VIH dans les trophoblastes pourrait se faire via l‟interaction CD4/gp120, une glycoprotéine de

membrane. L‟expression du CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 dans les trophoblastes

http://fr.wikipedia.org/wiki/Cellule_%28biologie%29

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fibroblaste

http://fr.wikipedia.org/wiki/Blastocyste

http://fr.wikipedia.org/wiki/F%C3%A9condation

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demeurent une controverse. En fait il a été montré récemment que le VIH entrait massivement

dans ces cellules, non par fusion avec la membrane, comme c‟est le cas pour les lymphocytes T,

mais par endocytose (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004; CAVARELLI et SCARLATTI,

2011) (Figure 6).

I.6.3.1.2 – Rôle de l’environnement placentaire

Il semblerait aussi que les cytokines ou les facteurs de croissance, présents dans

l‟environnement placentaire et dont l‟expression est modulée dans le temps, pourraient favoriser

une infection productive par le VIH ou, au contraire, conférer une certaine protection contre

l‟infection. Dans cette optique, il est intéressant de noter que les cytokines IL-1 et TNF-alpha,

activatrices de l‟expression virale, sont exprimées par le placenta en début de grossesse puis au

moment de l‟accouchement, deux stades correspondant précisément aux périodes où les risques

de transmission mère-enfant sont les plus élevés (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004).

Figure 6 : Mécanisme de transmission du VIH in utero (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004).

A et B : des virions libres ou des cellules lymphocytaires infectées (voire des macrophages), présents dans la

circulation maternelle, viennent au contact des cellules trophoblastiques. C : le VIH entre alors dans les cellules

trophoblastiques, par le biais de mécanismes encore hypothétiques : fusion des virions avec la membrane ou

internalisation par endocytose. D : il s‟ensuit alors une réplication virale à l‟intérieur des cellules trophoblastiques et

un bourgeonnement de nouveaux virions au niveau du pôle basolatéral (circulation fœtale). E : le VIH pourrait

également pénétrer dans les trophoblastes par endocytose, et être directement transporté du pole apical vers le pole

basolatéral sans qu‟il y ait infection des cellules trophoblastiques : c‟est le processus de transcytose. F : dans les

deux cas (infection des cellules trophoblastiques ou transcytose), le VIH atteint les cellules sous-jacentes,

notamment les lymphocytes et les macrophages fœtaux pour les infecter (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004).

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I.6.3.2 – Durant l’accouchement

Au moment du passage dans le canal utérin, le nouveau-né serait exposé aux secrétions

vaginales et au sang maternel contaminé par le VIH : on observe ainsi une différence d‟infection

verticale entre le premier (taux de transmission plus élevé) et le second des jumeaux nés par voie

vaginale (ROUZIOUX et al., 2002).

Le virus est présent dans les secrétions génitales maternelles sous forme de lymphocytes

CD4 infectés et sous forme de particules virales libres. Le fœtus est donc exposé par voie

transplacentaire (échanges sanguins Foteo-maternels) ou digestive (du fait de contacts au

moment du passage de l‟enfant dans la filière génitale). Le virus peut être détecté dans les

aspirations gastriques des nouveau-nés, qu‟il s‟agisse d‟une exposition par voie ascendante ou

lors de l‟accouchement par voie basse.

Les principaux facteurs obstétricaux de risque de transmission virale sont les infections

génitales, l‟accouchement prématuré et surtout la rupture prématurée des membranes de plus de

4 heures. Ces facteurs sont liés à la problématique de la chorioamniotite et des infections

bactériennes latentes. Elles doivent faire l‟objet d‟un effort de prévention (VIDRICAIRE et

TREMBLAY, 2004).

Par ailleurs la probabilité de transmission est réduite de moitié, si l‟accouchement est

réalisé par une césarienne programmée pratiquée avant le début du travail. (VIDRICAIRE et

TREMBLAY, 2004).

I.6.3.3 – Pendant l’allaitement

Le risque de transmission est clairement lié à la durée de l‟allaitement, à la charge virale

dans le lait, et à l‟existence d‟une inflammation du tissu mammaire (mastite) ou de crevasse des

mamelons (ROUZIOUX et al., 2002).

Bien que le VIH ait été détecté dans la phase liquide à la fois du lait maternel et dans les

cellules du lait maternel (WILLUMSEN et al., 2003), l'origine du virus dans le lait maternel

reste controversée. Pendant l'allaitement, les nourrissons sont quotidiennement exposés à des

quantités élevées de cellules infectées et aux virus du VIH-1 libre via leur muqueuse buccale et

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gastro-intestinal. Cette exposition est estimée à plus de 700 000 particules virales par jour

(LEWIS et al., 1998).

Le virus libre dérive, au moins en partie, à partir du sang (soit à partir de plasma ou de

lymphocytes infectés / monocytes) et est ensuite libéré dans le lait maternel. Alternativement, les

virus peuvent être produits par une réplication locale dans les macrophages et dans les cellules

épithéliales mammaires (TONIOLO et al., 1995).

Figure 7. Origine du VIH dans le lait maternel. (VAN, 2007)

I.6.4 – Moment de la transmission

Il est proposé une définition distinguant les contaminations in utero où la PCR est

positive dès les 2 premiers jours de vie, des contaminations intrapartum où la PCR ne se positive

que secondairement, à partir de 7 jours de vie (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004).

La contamination in utero survient le plus souvent dans les dernières semaines précédant

l‟accouchement dans environ un tiers des cas d‟enfants infectés. Elle a lieu le jour de

l‟accouchement dans deux tiers des cas. Toutefois, elle peut intervenir durant les premières

semaines de grossesse. Elle est maximale (70%) à l‟accouchement (ROUZIOUX et al., 2002;

VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004).

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1.7 – Evolution des différentes populations cellulaires lors des phases de la maladie

Il y a une relation entre évolution de la maladie, populations cellulaires et charge virale.

Pendant la primo infection, les symptômes se limitent le plus souvent à ceux d‟une

maladie virale bénigne.

A la phase asymptomatique (deux semaines à quelques mois après la contamination), la

présence dans le sang de différents anticorps anti-VIH est décelée, le sujet est dit alors

“ séropositif pour le VIH”. Apparaissent en même temps dans le sang du sujet contaminé des

lymphocytes T cytotoxiques spécifiques dirigés contre les cellules infectées par le VIH. Pendant

cette période asymptomatique de plusieurs années, les défenses immunitaires restent actives mais

les virus continuent à se multiplier et le nombre de lymphocytes T4 à diminuer.

Enfin la phase SIDA ou phase symptomatique, où en absence de traitement, le nombre

des LT4 baisse. Le sida se caractérise alors par diverses maladies opportunistes.

I.8 – Traitements

I.8.1 – Principes et définition

Actuellement, l‟initiation aux antirétroviraux est fondée sur l‟évaluation du risque de

progression de la maladie (niveau et évolution de la charge virale), l‟intensité du déficit

immunitaire (taux et évolution du nombre de lymphocytes T CD4+) et l‟engagement du patient à

suivre son traitement.

En l‟absence de vaccin, la thérapie antirétrovirale constitue aujourd‟hui l‟unique moyen

de lutter contre le VIH. Si elle ne permet pas l‟éradication complète du virus présent dans

l‟organisme, elle diminue néanmoins la mortalité et la morbidité grâce à une prévention et/ou

une restauration du déficit immunitaire.

Ainsi, le commencement d‟un traitement est recommandé chez tous les patients

symptomatiques ou au stade SIDA, et/ou ayant un nombre de CD4+ inférieur à 200/mm3. Chez

les patients asymptomatiques, le traitement est généralement débuté lorsque le taux de CD4+ est

en dessous de 350/mm3.

La première molécule qui fut introduite sur le marché en 1987 fut l‟AZT (POMMIER et

al., 2005). Toutefois, avec son usage en monothérapie, une résistance a rapidement été observée

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(VAN MARLE et al., 2010). Depuis la monothérapie a été abandonnée et la thérapie consiste

maintenant en des associations de plusieurs molécules ce qui, a permis de diminuer

drastiquement la morbidité et la mortalité liées au VIH.

Toutefois, des mutations se produisant dans les gènes codant pour les protéines ciblées

par les médicaments, que ce soit la transcriptase inverse, la protéase, l‟intégrase ou l‟enveloppe

et sont responsables d‟échecs thérapeutiques (FLEXNER, 2007). Des profils de résistance ont été

décrits pour chacune de ces molécules et sont régulièrement mis à jour (JOHNSON et al., 2008).

Le traitement antiviral est maintenant disponible dans presque toutes les parties du monde

où prédomine l‟infection avec des sous-types non-B. Des mutations associées à de la résistance

ont été observées dans toutes ces régions mais les voies de résistance chez les sous-types non-B

sont moins connues. Le traitement vise donc, d‟une part à abaisser la charge virale globale, et

d‟autre part à stabiliser le nombre de lymphocytes T CD4+, favorisant ainsi un équilibre

immuno-virologique.

La stratégie des traitements antirétroviraux est d‟inhiber de façon ciblée les différentes

étapes du cycle de réplication du VIH afin de prévenir l‟infection de nouvelles cellules et la

production de virions. Des traitements complémentaires, dits adjuvants, peuvent s‟ajouter aux

premiers, incluant en particulier l‟immunothérapie.

I.8.2 – Moyens de traitement

Il existe actuellement 7 familles d‟antirétroviraux:

- Les inhibiteurs de la transcriptase inverse :

- Les inhibiteurs nucléosidiques (INTI) et nucléotidiques ;

- Les inhibiteurs non nucléosidiques (INNTI) de la transcriptase inverse ;

- Les inhibiteurs de protéase ;

- Les inhibiteurs de fusion ;

- Les inhibiteurs du corécepteur CCR5 ;

- Les inhibiteurs d‟entrée ;

- Les inhibiteurs de maturation;

- Les inhibiteurs d‟intégrase.

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Ces antirétroviraux inhibent la réplication virale à différentes étapes du cycle du VIH. Ils

sont virostatiques et ne permettent donc pas l‟éradication du virus (VIGET et

YAZDANPANAH, 2006).

Ces molécules doivent être utilisées en association pour obtenir un niveau suffisant

d‟efficacité et réduire le risque d‟émergence de mutants résistants (VIGET et YAZDANPANAH,

2006). Cette efficacité est cependant obtenue au prix d‟effets secondaires et de contraintes de

prise de médicaments rendant l‟observance du traitement difficile.

I.9 – Prise en charge de la grossesse chez la femme enceinte séropositive

La prise en charge est multidisciplinaire, elle nécessite les interventions de virologues,

d‟obstétriciens et de pédiatres. Les antirétroviraux utilisables doivent répondre à plusieurs

critères : absence de fœtotoxicité, de teratogénicité et de mutagénicité et avoir une bonne

tolérance à court et à long terme chez l‟enfant (VIGET et YAZDANPANAH, 2006).

Ceci impose une surveillance particulière de la grossesse chez la femme enceinte

séropositive. Ainsi, deux antirétroviraux (l‟efavirenz et la zalcitabine) sont interdits pendant la

grossesse pour leurs effets tératogènes. L‟association stavudine-didanosine est contre-indiquée à

cause du risque d‟acidose lactique chez la mère et doit être remplacée par une combinaison

d‟autres inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse.

I.10 – Cinétique des anticorps anti-VIH

Le virus est décelable après la contamination, sous la forme d'acide ribonucléique (ARN)

à partir du 10-12ème

jour et sous la forme d'antigène p24 représentant juste une fraction du virus,

vers le 12-14ème

jour. Puis apparaissent les anticorps dirigés contre les différentes protéines

structurales et non structurales du VIH.

Les premiers anticorps sont détectables en moyenne vers le 21ème

jour mais le délai

d‟apparition des anticorps après le contact infectant peut varier de 3 semaines à 3 mois. Cette

cinétique peut varier en fonction de chaque patient et aussi de la souche infectante. L'apparition

des anticorps, encore appelée séroconversion, conditionne donc la positivité des tests de

dépistage.

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L'utilisation de ces tests de dépistage raccourcit donc la période de « silence »

sérologique ou « fenêtre » immunologique (période pendant laquelle aucun marqueur

sérologique n‟est détectable) lors de la primo-infection.

Une fois produits par la réponse immune, les anticorps anti-VIH persisteront toute la vie

du patient mais sans avoir de rôle immunisant contre la maladie (PLANTIER et SIMON, 2002).

Figure 8 : Evolution des marqueurs de la contamination par le VIH (RESEAU VIH, 2005)

II –Techniques de diagnostic des infections à VIH

Ces tests sont utilisés de façon automatisée en routine dans les laboratoires

d‟analyses médicales.

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II.1 – Diagnostic Indirect

II.1.1- Tests ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Les antigènes viraux, constitués par des protéines virales purifiées du VIH sont fixés au

fond des puits d‟une plaque en matière plastique. Les sérums à tester, les contrôles positifs et

négatifs, sont déposés dans les puits.

Les anticorps anti-VIH éventuellement présents se fixent sur les antigènes viraux.

Après plusieurs lavages des puits pour éliminer tout ce qui n‟est pas fixé, est rajouté un

anticorps anti-immunoglobuline ou immunoconjugué. Celui-ci, reconnait et se fixe sur

l‟anticorps anti-VIH, préalablement marqué par une enzyme.

Les complexes antigènes/anticorps formés seront alors détectés par addition du substrat

de l‟enzyme (ou chromogène), qui donnera naissance à une réaction colorée.

La coloration est traduite en densité optique (DO) par lecture avec un spectrophotomètre.

II.1.2 – Tests de dépistage dits : « tests rapides »

De nombreux tests rapides de type qualitatif ont été mis en place pour la recherche

d‟anticorps anti-VIH-1 et 2. L‟Organisation Mondiale de la Santé recommande particulièrement

leur utilisation dans les pays en voie de développement.

Un test révélant un diagnostic positif pour le VIH devra systématiquement être vérifié par

l‟utilisation d‟un test différent du premier.

Ces tests permettent la détection d‟anticorps anti-VIH en moins de 30 min. Ils font appel

à une agglutination ou à une absorption du complexe anticorps-antigène sur une membrane puis

à une coloration visible à l‟œil nu. La sérologie VIH par la méthode ELISA a une très bonne

sensibilité ; en revanche elle présente un défaut de spécificité de l‟ordre de 0.5% et donc tout

résultat positif obtenu par ELISA doit être contrôlé par une autre méthode.

II.1.3 – Méthode de Western blot

C‟est une technique de transfert par capillarité des protéines. L‟immuno-empreinte qui

sert donc à confirmer les tests positifs en ELISA, utilise des antigènes du VIH purifiés

et séparés par électrophorèse. Elle permet ainsi de déterminer si les anticorps détectés par

ELISA sont spécifiques des antigènes du VIH ou s‟il s‟agit d‟une réaction croisée avec

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d'autres composants, non viraux, du système ELISA. Les antigènes utilisés sont des protéines ou

des glycoprotéines du VIH de poids moléculaire variable.

Pour l‟interprétation, on considère le test (VIH-1) positif uniquement s‟il y a

présence d‟anticorps dirigés contre les protéines d‟enveloppe (gp160, gp120 et gp41),

associés à au moins un anticorps dirigé contre une protéine du virus : gag ou pol. Pour

le test VIH-2 on utilise comme antigènes les protéines et glycoprotéines de VIH-2.

II.2 – Diagnostic direct

II.2.1 – Antigène p24

Le principe de ce test est la recherche de l'antigène de la capside du virus. On utilise un

anticorps primaire qui le reconnaît, puis on utilise un anticorps secondaire, qui reconnaît

l'anticorps primaire. L'anticorps secondaire étant couplé à une enzyme qui va réagir avec son

substrat, cela produit une coloration mesurée par la densité optique. Comme plusieurs anticorps

secondaires se fixent en même temps sur l'anticorps primaire on a une amplification du signal.

II.2.2 – Techniques de biologie moléculaire

Elles permettent la mise en évidence du génome viral. La virologie moléculaire a pris une

place de choix dans l‟arsenal des méthodes de diagnostic direct de l‟infection à VIH.

II.2.2.1 – Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou par RT-PCR

La réaction de polymérisation en chaine dite « PCR » est une méthode d‟amplification

génique in vitro particulièrement sensible, qui permet de mettre en évidence de très faibles

quantités d‟ADN proviral dans un prélèvement biologique. Les régions ciblées sont localisées

préférentiellement dans les gènes les plus stables à savoir gag, pol, env, voire dans les LTRs.

La séquence cible peut être soit une région intégrée (ADN proviral) soit de l‟ARN viral après

rétro transcription.

La technique de PCR-ADN spécifique du VIH est la technique de référence. Elle permet

la détection de l‟ADN pro-viral intégré au génome cellulaire, après amplification enzymatique à

partir de cellules sanguines.

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Il peut s‟avérer pertinent d‟extraire les ARNm pour générer ensuite des copies d‟ADNc.

C‟est la technique de RT-PCR (reverse transcriptase) classique de l‟ARN du VIH. Cette réaction

est catalysée par la transcriptase inverse des rétrovirus (reverse transcriptase) qui synthétise une

chaîne d‟ADN à partir d‟une matrice d‟ARN. À l‟issue de la transcription inverse, les ARNm

sont hydrolysés (traitement alcalin, RNase ou température). Les étapes suivantes sont réalisées

dans l‟enceinte du thermocycleur. Les ADNc monocaténaires sont alors répliqués par l‟ADN

polymérase au cours d‟un premier cycle de température. D‟autres cycles sont réitérés afin

d‟amplifier les ADNc bicaténaires en grande quantité.

II.2.2.2 – Diagnostic par PCR en temps réel : la méthode Taqman

La technique de charge virale par PCR-ARN quantitative permet la détection de l‟ARN

VIH plasmatique. La charge virale permet d'évaluer le nombre de copies d‟ARN viraux par

millitre de sérum, mais surtout d'avoir une véritable vue cinétique de la production des virus et,

par là même, d'en déduire la vitesse de destruction des lymphocytes T CD4.

Figure 9 : PCR en temps réel1.

1 http://www.ilm.pf/PCRtempsreel

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En ce qui concerne la méthode Taqman, les sondes sont marquées à leur extrémité 5‟ par

un fluorochrome émetteur (reporter), par exemple FAM, et à leur extrémité 3‟ par un

fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, par exemple TAMRA, qui inhibe

l‟émission du reporter lorsqu‟ils sont à proximité. Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée

sur sa cible, elle est hydrolysée par l‟ADN polymérase. Le reporter ainsi séparé du quencher

émet un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de

l‟élongation. La spécificité de la réaction est liée à la fois à celle des amorces et à celle de la

sonde réduisant significativement l‟émission de fluorescence non spécifique due à des

mésappariements ou des dimères d‟amorce.

III – Mesure des marqueurs viro-immunologiques

Pour ce qui est des marqueurs immunologique, on distingue donc les lymphocytes porteur de

marqueurs CD3 et CD4 (LT4) et les lymphocytes porteurs de marqueurs CD3 et CD8 (LT8).

L'expansion des lymphocytes CD8+ constitue une des caractéristiques majeures, avec la

déplétion en lymphocytes CD4, des anomalies immunologiques observées au cours de l'infection

à VIH.

Le nombre de lymphocytes T CD4 est le marqueur indirect le plus souvent utilisé en clinique

pour suivre d'une manière quantitative l'évolution de la maladie et le rétablissement de

l'immunité chez les patients vivant avec le VIH/SIDA. Les CD4+ sont utilisés pour mesurer la

capacité de l‟organisme à se défendre contre « l‟envahisseur » qui est le VIH. La numération des

sous-populations de lymphocytes T CD4, CD8 et CD3 permettent de suivre le rétablissement de

l'immunité et l'efficacité thérapeutique, comme la thérapie antirétrovirale hautement active

(HAART). Lorsque le ratio CD4/CD8 tend vers zéro, l‟infection du VIH évolue vers le stade

SIDA, alors que lorsque le ratio CD4/CD8 tend vers un, l‟infection reste latente.

On utilise la technique de cytofluorimétrie (Facs Count, Facs Caliburs, Apogée 40…), pour

leur mesure.

La quantification de la charge virale peut porter sur le virus libre plasmatique (antigénémie,

virémie plasmatique par culture, quantification moléculaire de l'ARN viral) ou sur le virus

intégré dans les cellules sanguines mononuclées (virémie cellulaire par culture, mesure de l'ADN

proviral). Elle est mesurée par une PCR quantitative.

http://www.ilm.pf/print/1989

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CHAPITRE II : MÉTHODOLOGIES

II.1 – Cadre de l’étude

II.1.1 – Centre Médical Saint Camille

Le Centre Médical Saint Camille est un centre situé à Ouagadougou dans la commune de

Bogodogo au secteur 14, sur l‟avenue Babangida. Ce centre a été crée en 1974 par l‟ordre des

religieux camilliens. C‟est un centre privé qui comporte :

une maternité où 7300 naissances en moyenne ont lieu chaque année ;

un centre de pathologie néonatale qui accueille environ 450 enfants par an ;

un dispensaire comportant une section adulte et une section pédiatrie qui reçoit environ

300 malades par jour ;

un dispensaire mobile qui sillonne deux villages (Boulbi et Kossiam) ;

un centre de Santé Maternel et Infantile (SMI) qui reçoit plus de 4000 femmes enceintes,

administre plus de 3000 doses de vaccins et effectue des milliers de pesées pendant

l‟année ;

un centre de suivi des personnes vivant avec le VIH (PvVIH) ;

un Centre de Récupération et d‟Education Nutritionnelle (CREN) qui fait partie

intégrante de la SMI ;

un laboratoire d‟analyse qui comporte des services de bactériologie, de parasitologie, de

biochimie, d‟hématologie, d‟immunologie et de biologie moléculaire et qui reçoit près de

150 à 200 prélèvements par jour ;

une serre pour la culture de la Spiruline.

Le CREN est un centre qui ne comporte pas de structure hospitalière mais se référant au

service de pédiatrie pour l‟hébergement des mères et enfants admis au CREN s‟ils habitent loin

du centre. Le CREN est une partie du service de soins maternels et infantiles (SMI).

Les activités du CREN sont :

la pesée quotidienne des enfants malnutris ;

l‟inscription de nouveaux cas avec prise de la taille, du poids, du tour brachial et crânien;

le remplissage des fiches du CREN et du registre ;

la pose de la sonde naso-gastrique pour les enfants gravement malnutris qui sont

incapables de s‟alimenter ;

une éducation nutritionnelle des mères sur la malnutrition et l‟hygiène ;

une démonstration culinaire des différents types de bouillies.

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Le CREN se réfère au service de pédiatrie du centre situé à quelque dizaine de mètres

pour la consultation et les soins des enfants malnutris. Il accueille en moyenne 700 enfants par an

et obtient un taux de guérison de 36% contre 57% d‟abandon et 6% de décès.

II.1.2 – Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE)

Le CERBA est un centre de recherche comprenant:

o un laboratoire de biologie et de génétique moléculaires (LABIOGENE) chargé de

l‟extraction de matériel nucléaire, de la PCR simple, de la PCR en temps réel, du

séquençage et du génotypage ;

o un laboratoire de biologie cellulaire chargé des cultures cellulaires et des bio-essais y

afférant notamment les tests de cytotoxicité, les tests anti-protozoaires et les tests

d‟immunomodulation;

o un laboratoire de microbiologie chargé des tests antimicrobiens;

o un laboratoire d‟enzymologie chargé de l‟extraction et de la purification des enzymes et

d‟activité enzymatique;

o un laboratoire de phytochimie chargé de l‟extraction et de la purification des principes

actifs des plantes;

o un laboratoire de biochimie clinique pour les analyses de routine;

o un laboratoire d‟hématologie pour les examens de routine;

o un laboratoire de parasitologie et de bactériologie;

o un laboratoire d‟immunologie et d‟endocrinologie.

Les principaux axes de recherche du CERBA se situent au niveau de la recherche

fondamentale et les sciences du génome, de la mise en valeur de la médecine traditionnelle et

l‟identification des composants actifs des produits naturels et au niveau de la recherche clinique,

notamment dans les essais pharmaco-cliniques. Les PCR et la lecture des résultats ont été

réalisées dans le laboratoire de biologie moléculaire.

Cette étude s‟inscrit dans un cadre global de recherche sur le VIH/SIDA dont les grands

axes sont la diversité génétique du virus, les interactions virus – cellules cibles de l‟hôte, la

génétique de la réponse immunitaire, la génétique de résistance aux ARV et la recherche

vaccinale. Le diagnostic moléculaire est l‟étape initiale d‟un ensemble d‟études qui à terme

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permettront l‟exploration de l‟ARN ou de l‟ADN impliqués significativement dans l‟infection à

VIH/SIDA.

II.2 – Protocole PTME au Centre Médical Saint Camille

Comme dans tous les autres pays africains, le Burkina Faso avait mis en place une

stratégie de lutte contre le VIH/SIDA et les IST de 2001 à 2005. Cette stratégie incluait un

programme national de Prévention de la Transmission Mère-Enfant du VIH (PTME) par

chimioprophylaxie à la Névirapine et allaitement artificiel ou limité aux trois (03) premiers mois

(OMS, 2004). A la période allant de 2006-2010 un autre protocole avait vu le jour, visant d‟une

part à combler les insuffisances constatées lors de la mise en œuvre du premier programme et

d‟autre part à introduire des protocoles ARV plus efficaces. L‟option prise dans ce protocole

était une triprophylaxie à partir de la 28ème

semaine de grossesse pour les femmes non éligibles

au traitement ARV et la trithérapie pour celles qui sont éligible (OMS, 2006).

Toutes les gestantes reçues en consultation prénatale bénéficient du Conseil Dépistage

Volontaire ; celles qui choisissent de se faire dépister sont reçues individuellement par la sage-

femme pour le conseil pré-test. Le dépistage est alors effectué, la sage-femme annonce le résultat

au bout d‟une vingtaine de minutes, au cours d‟un conseil post test. Les gestantes dépistées

négatives sont invitées à reprendre le test trois mois plus tard ; si le résultat est indéterminé, on

fait appel à une méthode spécifique.

Quant aux gestantes dépistées positives, elles bénéficient du bilan biologique standard et

un dossier est ouvert à la « file active » pour le suivi médical. En fonction du terme de la

grossesse, de l‟état clinique et biologique, les gestantes infectées reçoivent le traitement adéquat

pouvant être :

• la prévention des infections opportunistes par le cotrimoxazole (800/160 mg en

prise unique par jour) à partir du deuxième trimestre de grossesse ;

• un rendez-vous à partir de vingt huit semaines d‟aménorrhée pour la remise des

ARV selon le protocole PTME (OMS, 2006);

• la mise sous trithérapie.

Ces patientes poursuivent les consultations prénatales normalement ; elles sont revues

aux dates fixées ou en cas de besoin ; après un choix éclairé du mode d‟allaitement, elles peuvent

accoucher dans le centre de leur choix bien qu‟il soit souhaitable que l‟accouchement se déroule

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au Centre Médical Saint Camille ou au moins dans un centre qui dispose de NVP et d‟AZT pour

nouveau-né. Lors du dernier rendez-vous avant l‟accouchement, la future mère reçoit les ARV

nécessaires pour la PTME du VIH:

• une quantité suffisante d‟AZT comprimés 300 mg, 2x jour à partir de la 28ème

semaine jusqu‟à l‟accouchement ;

• une dose unique de 200 mg de NVP comprimés, 2x jour ;

• les comprimés d‟AZT/3TC 300 mg/150 mg (DUOVIR) en quantité suffisante : la

première prise est faite au moment du travail d‟accouchement et pendant 7 jours

post partum.

Après l‟accouchement, le nouveau-né est conduit au service de néonatologie du CMSC

(si l‟accouchement a lieu à la maternité du Centre Médical Saint Camille ou dans un centre ne

disposant pas de NVP et d‟AZT) où il reçoit la dose de NVP (2mg/Kg PU) et le sirop d‟AZT

(4mg/jour x2). Il est gardé pendant trois jours dans l‟unité de néonatologie (si l‟accouchement a

eu lieu au CMSC) puis il est revu deux fois le premier mois et une fois par mois jusqu‟au

douzième mois de vie.

Au cours du suivi, une PCR est réalisée entre quatre et six mois et la sérologie au

douzième mois. En cas d‟échec de la PTME (PCR ou sérologie positive), l‟enfant est suivi par la

section pédiatrique de la prise en charge des PvVIH au CMSC.

II.3 – Déroulement de l'étude

II.3.1 – Période et type d’étude

L‟étude qui s‟est déroulée sur une période de 11 mois, allant du 1er septembre 2010 au 29

juillet 2011 portait sur le suivi des grossesses et la prise en charge des enfants nés de mères

séropositives au VIH. Il s‟agit d‟une étude prospective à visée descriptive.

II.3.2 – Collecte des données et des échantillons de sang

Les échantillons de sang total de 1300 femmes enceintes de moins de 28 semaines d‟aménorrhée

ont été récoltés dans cette étude pour le dépistage du VIH. Les échantillons de sang séché sur

papier buvard de 378 enfants nés de mères séropositives ont été retenus pour le test de diagnostic

PCR.

--------------------------------------------------------------------


Deux étapes de collectes ont été importantes :

1. La sérologie VIH des mères a été effectuée par des tests rapides (Determine et

SDBioline). Le sang a été prélevé sur des tubes imprégnés d‟EDTA. Après détermination du

statut sérologique, le sang est ensuite centrifugé à 4000g pendant 5 mn le plasma a été collecté

dans des cryotubes de 1,5 ml et conservés à -20°C. Les échantillons ayant donnés un résultat

indéterminé (douteux) aux tests rapides (Determine et SDBioline) ont été conservés pour une

confirmation par PCR.

2. À partir de micro-prélèvements de sang veineux (piqûre au bout du doigt ou au talon

des nouveaux nés), des gouttes de sang ont été déposées sur du papier puis séchées. Ces

prélèvements se sont effectués du 1er septembre 2010 au 29 juillet 2011 dans le laboratoire du

Centre Médical Saint Camille. Après séchage, ces papiers imprégnés de sang ont été conservés à

température ambiante.

II.3.3 – Mode de recrutement

II.3.3.1 – Critères d’inclusion

o Femmes enceintes, séropositives au VIH-1, dépistées à l‟issue du Conseil de Dépistage

Volontaire Anonyme (CDVA) ou antérieurement suivies au CMSC;

o Femmes enceintes ayant un résultat VIH indéterminé par ELISA.

II.3.3.2 – Critères de non inclusion

o Femmes séropositives VIH-2 ou co-infectées VIH-1 et VIH2.

o Mères refusant que l‟on fasse le test à leur enfant.

o Femmes enceintes non consentantes.

II.3.3.3 – Recueil des données

Les informations ont été recueillies à l‟aide de fiches standardisées. La source

d‟information a été constituée à partir :

o des dossiers obstétricaux des mères ;

o des registres d‟accouchement du centre ;

o des registres d‟hospitalisation des services de pédiatrie;

--------------------------------------------------------------------


o des registres de consultations externes de pédiatrie des enfants séropositifs.

II.4 – Considération éthique

La réalisation de cette étude a été soumise au comité d‟éthique du Centre Médical Saint

Camille et du CERBA. La confidentialité était primordiale et de rigueur. Le sang des patients

était prélevé avec leur consentement éclairé, pour les adultes et le consentement des parents pour

les bébés. La participation à l‟étude était volontaire et individuelle.

Les parents ont été informés, dès la naissance de l‟enfant, de la consultation possible du

dossier de l‟enfant et de la mère pour réaliser des études à but scientifique. Les enfants nés de

mères séropositives sont suivis au Centre Médical Saint Camille pour une consultation

spécialisée jusqu‟à l‟âge de 18 mois (âge au-delà duquel seuls ceux dont la contamination est

confirmée sont spécifiquement surveillés). Les données recueillies étaient sous le couvert de

l‟anonymat.

II.5 – Matériel

II.5.1 – Appareils de diagnostic utilisés

Figure 10: Photos de tests rapides VIH (à gauche DetermineTM

VIH-1/2 Inverness et à droite SD

Bioline)

--------------------------------------------------------------------


Figure 11: Thermocycleur 9700 (Applied Biosystems) (Appareil- laboratoire CERBA)

Figure 12 : système d‟électrophorèse (Appareil- laboratoire CERBA)

Figure 13 : Appareil 7500 Fast Real Time PCR (Appareil- laboratoire CERBA)

--------------------------------------------------------------------


Figure 14 : Système photo gel doc. (Appareil- laboratoire CERBA)

Figure 15 : Centrifugeuse réfrigérée (Appareil- laboratoire CERBA)

--------------------------------------------------------------------


II.5.2 – ARV utilisés pour le PTME

BURKINA FASO - PROTOCOLES ARV DE PREVENTION DE LA TRANSMISSION MERE ENFANT DU VIH

Tableau I : Protocoles ARV de prévention de la transmission mère-enfant du VIH

Femme sans

indications pour

traitement ARV

Temps d’administration

Pendant la grossesse Pendant le travail En post-partum Pendant l’allaitement

Protocole en

vigueur

(inspiré aux

recommandations

OMS, 2006)

AZT 300 mg x 2/jour à

partir de la 28ème

semaine

de grossesse

NVP 200 mg pu*

+AZT/3TC

300mg/150mg pu

Mère : AZT/3TC 300/150mg x 2/jour

pendant 7 jours*

Enfant : NVP (2mg/kg pu à la

naissance)* + AZT 4mg/kg X 2 /jour

pendant 7jours

La mère choisie entre allaitement par

SLM et allaitement maternel exclusif

avec sevrage précoce entre 4e et 6

e

mois. Après le post-partum, aucune

administration d‟ARV n‟est prévue, ni

pour la mère ni pour l‟enfant.

Nouveau protocole

A (à partir de

janvier 2012 et

inspiré aux

recommandations

OMS, 2010)

AZT 300 mg x 2/j à partir

de la 14ème

semaine de

grossesse

NVP 200 mg pu*

+AZT/3TC

300 mg/ 150 mg pu

Mère: AZT/3TC 300/150mg x 2/jour

pendant 7 jours*

Enfant: commence NVP (4mg/kg

pu/jour) * ou en 2e intension AZT

(4mg/KgX2 jour)

Allaitement maternel exclusif

jusqu‟au 6e mois, suivi d‟allaitement

maternel + introduction de

compléments alimentaires, avec

sevrage à 12 mois**

Enfant: poursuit NVP * ou AZT

jusqu‟à 1 semaine après sevrage

Nouveau protocole

B (toujours inspiré

aux

recommandations

OMS 2010,

remplacera A à

partir de janvier

2014)

Triprophylaxie à partir de

la 14e semaine de

grossesse avec, en 1e

intention :

AZT/3TC 300/150mg x

2/jour + EFV (600 mg

pu/j) ***

Poursuivre

triprophylaxie

Mère : poursuivre tripropylaxie

Enfant: Pendant 6 semaines NVP

(4mg/kg pu/jour) * ou en 2e intension

AZT (4mg/KgX2 jour)

Allaitement maternel exclusif

jusqu‟au 6e mois, suivi d‟allaitement

maternel + introduction de

compléments alimentaires, avec

sevrage au 12e mois**

Mère : poursuivre triprophylaxie,

jusqu‟à 1 semaine après le sevrage

* à ne pas administrer si VIH2 en mono-infection

** si la mère peut financer l‟achat de SLM pendant au moins 12 mois, et si elle vit dans un contexte où les SLM sont acceptables, disponibles et surs, elle

pourra choisir l‟allaitement par SLM. Dans ce cas, administrer à l‟enfant NVP (4mg/kg pu/jour) pendant 6 semaines après naissance, sauf si VIH2 en mono-

infection

***2e intention : AZT+3TC+LPV/r ou AZT+3TC+ABC (notamment si VIH2 en mono-infection ou en infection mixte) ou TDF+3TC(ou FTC)+EFV

--------------------------------------------------------------------


Femme avec

indications pour

traitement ARV

Temps d‟administration

Pendant la grossesse Pendant le travail En post-partum Pendant l’allaitement

Protocole en vigueur

(inspiré aux

recommandations

OMS, 2006)

Trithérapie à partir de la

14ème

semaine de

grossesse : avec, en 1e

intention : AZT (300 mg

x 2/j) + 3TC (150 mg x

2/j) + NVP (200 mg x 2/j)

**

Poursuivre trithérapie Mère : Poursuivre trithérapie

Enfant : NVP (2mg/kg pu à la

naissance)* + AZT 4mg/kg X 2

/jour pendant 7jours

La mère choisie entre allaitement par

SLM et allaitement maternel exclusif avec

sevrage précoce entre 4 et 6 mois.

Mère : poursuivre trithérapie.

Nouveau protocole (à

partir de janvier 2012

et inspiré aux

recommandations

OMS, 2010)

Trithérapie à partir de la

14ème

semaine de

grossesse avec, en 1e

intention : AZT

(300 mg x 2/j) + 3TC

(150 mg x 2/j) + NVP

(200 mg x 2/j) ***

Poursuivre trithérapie Mère : Poursuivre trithérapie

Enfant : Pendant 6 semaines NVP

(4mg/kg pu/jour) * ou en 2e

intension AZT (4mg/KgX2 jour)

Allaitement maternel exclusif jusqu‟au 6e

mois, suivi d‟allaitement au maternel +

introduction de compléments alimentaires,

avec sevrage au 12e mois****

Mère : poursuivre trithérapie.

* à ne pas administrer si VIH2 en mono-infection

** 2e intention : d4t+3TC+NVP (ou EFV) ou AZT+3TC+EFV ou TDF+3TC(ou FTC)+NVP ou TDF+3TC(ou FTC)+EFV ; si VIH2, AZT (ou

D4T)+3TC+LPV/r ou AZT (ou D4T)+3TC+ABC

*** 2e intention : AZT+3TC+EFV ou TDF+3TC(ou FTC)+NVP ou TDF+3TC(ou FTC)+EFV ; si VIH2, AZT+3TC+LPV/r ou AZT+3TC+ABC. Sur

indications de l‟OMS, le D4T n‟est plus utilisé ni en prophylaxie ni en traitement à cause des ses effets secondaires (neuropathies)

**** si la mère peut financer l‟achat de SLM pendant au moins 12 mois, et si elle vit dans un contexte où les SLM sont acceptables, disponibles et surs, elle

pourra choisir l‟allaitement par SLM. Dans ce cas, administrer à l‟enfant NVP (4mg/kg pu/jour) pendant 6 semaines après naissance, sauf si VIH2 en mono-

infection

NB : si femme déjà sous trithérapie avant grossesse, poursuivre trithérapie. En cas de protocole incluant EFV, remplacer cette molécule

embriotoxique au cours du 1er

trimestre, par NVP ou LPV/r ou ABC

--------------------------------------------------------------------


II.6 – Méthodes pour les techniques utilisées

II.6.1 – ELISA indirect

II.6.1.1 – Procédure du test rapide “Determine HIV 1&2”

La technique consistait à :

1. Déposer la bandelette sur une surface plate et horizontale après avoir enlevé sa

protection plastique ;

2. Pipeter 60µl de sang à l‟aide d‟une micro pipette ;

3. Déposer dans la bandelette sur la zone de dépôt du plasma symbolisée par une

flèche ;

4. Attendre 20 minutes ;

5. Lire le résultat ;

6. Interprétation et validation des résultats.

Le résultat du test est validé et interprété de la manière suivante :

a- résultat positif

Apparition de bandes rouges dans la fenêtre-contrôle et dans la fenêtre-patient (une bande

par fenêtre).

b- Résultat négatif

Apparition d‟une bande rouge dans la fenêtre-contrôle.

c- Résultat non valide ou indéterminé

- Absence des bandes rouges dans la fenêtre-contrôle et dans la fenêtre-patient ;

- Absence de bande rouge dans la fenêtre-contrôle et présence de bande rouge dans la

fenêtre-patient.

- Enregistrement des résultats.

Les résultats ont ensuite été enregistrés dans le registre PTME.

II.6.1.2 – Procédure du test rapide “SDBioline HIV 1&2”

Ce deuxième test ne concerne que les échantillons jugés positifs et indéterminés au

premier test rapide. C‟est un test de discrimination qui permet de déterminer le type de VIH du

patient. Il a l‟avantage d‟être rapide et de spécifier les types de VIH. Il existe rarement de faux

positifs.

Le test ELISA Genie II HIV-1/HIV-2 Bioline est un test immunoenzymatique de double

reconnaissance car basée sur la détection spécifique des anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2. Le

support de réaction est constitué de deux puits: le premier puits «A» de forme circulaire est

--------------------------------------------------------------------


destiné au dépôt de l‟échantillon. Le deuxième puits «B» de forme rectangulaire elliptique est le

puits de réaction, pour le dépôt des réactifs. Ce dernier puits est sensibilisé en deux spots de

réaction séparés par les antigènes dérivés du VIH-1 et VIH-2. Il y a un troisième spot de contrôle

«contrôle interne» qui permet de valider ou non le test. Le test est résumé en cinq étapes, la

première se déroule seulement dans le puits «A» et les quatre dernières dans le second puits.

Le mélange de trois gouttes (150 microlitres) du diluant échantillon et de 20 microlitres

d‟échantillon de sang a été transféré dans le puits A du support de réaction. On a attendu

l‟absorption complète de la solution du puits A du support de réaction avant de passer à la lecture

visuelle. La figure montre des exemples de cas de résultat positif et négatif.

Contrôle interne Contrôle interne

VIH-2

VIH-1

Patient positif VIH-1 et VIH-2 Patient négatif

Figure 16 : Représentation des résultats du Génie II HIV-1/HIV-2 SDBioline

II.6.2 – Extraction

L‟ARN a été isolé du plasma selon le protocole décrit dans le kit d‟extraction d‟ARN, kit

Qiagen (Qiagen Hilden, Allemagne).

L‟ADN a été isolé à partir du sang total sur papier séché selon le protocole décrit dans le kit

d‟extraction d‟ADN, kit Qiagen (Qiagen Hilden, Allemagne).

B

A

●

●

●

B

A

●

--------------------------------------------------------------------


II.6.2.1 – Protocole d’extraction de l’ADN proviral en utilisant le DBS

Préchauffer les deux plaques chauffantes : l‟une à 85°C et l‟autre à 56°C.

1. Sortir les différents réactifs ;

2. Préparer les tampons AW1 et AW2 en suivant les instructions du fabricant ;

3. Couper des pastilles de 3 mm de diamètre à partir d‟une goutte de sang séché, à l‟aide de

ciseaux ;

4. Transférer les bouts de pastilles provenant du papier buvard contenant le sang séché dans

un tube de 1,5 ml et y ajouter 180 µl de tampon ATL ;

5. Incuber 10 min à 85°C. Centrifuger brièvement, afin de récupérer les gouttelettes

accumulées dans le capuchon ;

6. Ajouter 20 µl de solution de Protéinase K, mélanger en vortexant puis incuber 1h à 56°C.

Centrifuger brièvement afin de récupérer les gouttelettes accumulées dans le capuchon ;

7. Ajouter 200 µl de tampon AL à l‟échantillon, mélanger vigoureusement en vortexant puis

incuber 10 min à 70°C. Centrifuger brièvement;

8. Ajouter 200 µl d„éthanol absolu à l‟échantillon et mélanger vigoureusement en vortexant.

Centrifuger brièvement;

9. Déposer avec précaution le mélange obtenu à l‟étape 6 dans la colonne QIAmp sans en

mouiller le bord. Fermer le capuchon et centrifuger 1 min à 8000 rpm.

10. Transférer la colonne QIAmp dans un tube collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant

l‟effluent;

11. Ajouter 500 µl de tampon AW1. Centrifuger 1 min à 8000 rpm.

12. Transférer la colonne QIAmp dans un collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant

l‟effluent.

13. Ajouter 500 µl de tampon AW2. Fermer le capuchon et centrifuger 3 min à 14 000 rpm.

14. Mettre l colonne QIAMP dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et jeter l‟ancien tube

collecteur contenant l‟effluent. Centrifuger 1 min à 14000 rpm ;

15. Transférer la colonne QIAmp dans un tube propre de 1,5 ml. Jeter l‟ancien tube collecteur

contenant l‟effluent;

16. Ajouter 70µl de tampon d‟élution. Incuber 1 min à température ambiante puis centrifuger

pendant 1 min à 8000 rpm.

--------------------------------------------------------------------


II.6.2.2 – Protocole d’extraction de l’ARN viral dans le plasma

Pour augmenter la sensibilité de la PCR en temps réel, 300 µl de plasma recueilli pour

chaque échantillon ont été centrifugés à 24 000g à 4°C pendant une heure.

Nous avons prélevé 200 µl de surnageant et récupéré 100 µl de culot plasmatique pour faire

l‟extraction de l‟ARN.

1. Préparer le tampon ATL en suivant les instructions du fabricant ;

2. Préparer les tampons AW1 et AW2 en suivant les instructions du fabricant ;

3. Pipeter 560 µl de tampon ATL dans les tubes contenant les 100 µl de culot d‟ARN

plasmatique;

4. Incuber 10 min à température ambiante. Centrifuger brièvement;

5. Ajouter 630 µl d„éthanol absolu à l‟échantillon et mélanger vigoureusement en vortexant.

Centrifuger brièvement;

6. Déposer avec précaution le mélange obtenu dans la colonne QIAmp. Fermer le capuchon

et centrifuger 1 min à 8000 rpm ;

7. Transférer la colonne QIAmp dans un tube collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant

l‟effluent;

8. Ajouter 500 µl de tampon AW1. Centrifuger 1 min à 8000 rpm ;

9. Transférer la colonne QIAmp dans un collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant

l‟effluent ;

10. Ajouter 500 µl de tampon AW2. Fermer le capuchon et centrifuger 3 min à 14 000 rpm.

11. Mettre l colonne QIAMP dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et jeter l‟ancien tube

collecteur contenant l‟effluent. Centrifuger 1 min à 14000 rpm ;

12. Transférer la colonne QIAmp dans un tube propre de 1,5 ml. Jeter l‟ancien tube

collecteur contenant l‟effluent;

13. Ajouter 70µl de tampon d‟élution. Incuber 1 min à température ambiante puis centrifuger

pendant 1 min à 8000 rpm.

II.6.3 – PCR (Polymerase Chain Reaction)

Après avoir effectué les deux types d‟extraction : extraction d‟ADN par sang séché sur papier

et l‟extraction d‟ARN sur du plasma.

--------------------------------------------------------------------


a. PCR qualitative

Nous avons premièrement fait une PCR, en utilisant les échantillons d‟ADN. Nous avons

utilisé le kit Generic DNA cell (Biocentric, Bandol, France), tel que utilisé dans l‟étude mené par

AVETTAND-FENOEL et al. (AVETTAND-FENOEL et al., 2009).

Une deuxième PCR de l‟ADN sur spot DBS a été effectué pour confirmer les résultats de la

PCR en temps réel, pour les échantillons au statut sérologique indéterminé (douteux), qui se sont

révélés négatifs à la PCR en temps réel qualitative. Le mélange réactionnel de l‟amplification est

décrit dans le tableau II ci-dessous :

Tableau II : Mélange Réactionnel de la PCR

Constituants du MIX Volume μl

Mix qPCR avec platinum Taq 60U/ml + Rox 25

Amorce A 1

Amorce B 1

Sonde C 1

Eau stérile 2

Total 30 μl

La PCR a été faite dans un thermocycleur 9700 (Applied Biosystems, USA) dans un

volume réactionnel de 50 µl comprenant 30 µl de mixe et 20 µl d‟ADN selon le programme

d‟amplification décrit dans le tableau III.

Tableau III : Programme d‟amplification de la PCR

Etapes Temps Température

Dénaturation initiale

Activation de l‟enzyme

Dénaturation 50 cycles

2 min 50°C

10 min 95°c

15 s 95°C

Hybridation 1 min 60°C

--------------------------------------------------------------------


b. Détection du VIH-1 par PCR en temps réel qualitative

Le VIH-1 a été détecté dans les échantillons de plasmas en utilisant le kit HIV Real-TM

Qual (Sacace Biotechnologies, Como, Italie) qui combine Rétrotranscription et PCR en une seule

étape (RT-PCR one step). La RT-Real Time PCR a été faite dans un appareil 7500 Fast Real

time PCR (Applied Biosystems, USA).

Pour un volume de 25 réactions, nous avons mélangé, dans un tube DTT fourni dans le

kit, les mixes 1 et 2 (Tableau IV).

Tableau IV : Mélange réactionnel de la DTT

Tube Réactifs Volume

DTT

RT-PCR-mix-1 300 μl

RT-PCR-mix-2 200 μl

Le mélange réactionnel de chaque RT-PCR est résumé dans le tableau V ci-dessous :

Tableau V : Mélange réactionnel de la RT

Réactifs Volume

Mix DTT 8 μl

TaqF polymerase 0,5μl

M-MLV 0,25μl

La réaction est faite dans un volume final de 18 µl comprenant 8 µl de mélange réactionnel et 10

µl d‟extrait d‟ARN et de contrôles positifs et négatifs fourni avec le kit HIV Real-TM Qual.

Le programme d‟amplification de la RT-Real Time PCR est résumé dans le tableau VI ci-

dessous :

--------------------------------------------------------------------


Tableau VI : Programme d‟amplification de la RT-PCR en temps réel qualitative.

Etape Température Temps Répétition

(cycles)

RT (reverse

transcriptase)

Synthèse de l‟ADNc

50°C

30 min

1

Real time PCR

Synthèse de

l‟ADN

Activation de la Hot Start

Taq F polymerase

95°C

15 min

1

Dénaturation

Hybridation

Elongation

95°C

55°C

72°C

20 sec

40 sec

30 sec

45

II.6.4 – Statistiques

Nous avons utilisé le logiciel Microsoft Word version 2000 pour le traitement de texte,

des tableaux et des graphiques. La saisie des données a été faite sur le logiciel SPSS version

17.0, certaines analyses statistiques ont été faites en utilisant Epi info 6.4.

Les statistiques usuelles (moyenne, écart-type, proportion) ont été utilisées pour la

synthèse de nos données, selon le caractère quantitatif ou qualitatif. Les tests statistiques ont été

utilisés en vue de comparer les variables catégorielles (test chi2 de Pearson et le test exact de

Fisher) avec un seuil de signification ≤ 5%. Les variantes étudiées dans le modèle étaient celles

liées au paramètre d‟intérêt (PCR positif). Les résultats ont été présentés sous forme de tableaux.

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CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION

III.1 – Résultats

Du premier septembre 2010 au 29 juillet 2011, 1300 femmes âgées de 18 à 49 ans

enceintes ont accepté librement de suivre le programme de prévention de la transmission mère-

enfant du VIH (PTME) au Centre Saint Camille de Ouagadougou et au CERBA/LABIOGENE

qui prévoit : un counselling pré-test du VIH, un test VIH par ELISA, un counselling post-test,

une prise en charge thérapeutique pour les mères et leurs enfants par les antirétroviraux (ARV) et

enfin, au quatrième mois de la naissance de leurs enfants, un test PCR.

III.1.1 – Caractéristiques sociodémographiques des mères, selon l’âge et la profession

La moyenne d‟âge des femmes enceintes qui ont suivi le programme PTME étaient de 28,32

± 0,15 ans. Le tableau VII décrit la prévalence du VIH suivant les tranches d‟âge que nous avons

établit. Nous remarquons qu‟il y a une progression de la prévalence selon les classes d‟âge. Le

groupe d‟âge le plus représenté était celui des 32-37 ans composé de 115 femmes soit 43,7%.

Nous notons qu‟au niveau des classes d‟âge 1 à 3, nous avons une progression de la

prévalence : 16% (classe 1) ; 21,8% (classe 2) et 29% (classe 3). A partir de la classe 4, nous

avons une régression : 43,7% (classe 4) puis 34,1% (classe 5), tableau VII.

Tableau VII : Répartition du statut sérologique en fonction des groupes d‟âge

Classe Groupe

d‟âge (ans)

Total Test VIH Types de VIH

VIH- VIH+ VIH-1 VIH-2 VIH-1&2

1 <20 87 73 14 /87 (16%) 14 0 0

2 20-25 320 250 70/320 (21,8%) 70 0 0

3 26-31 551 391 160/551 (29%) 158 2 0

4 32-37 263 148 115/263 (43,7%) 111 3 1

5 >37 79 52 27/79 (34,1%) 25 2 0

Total 914 386/1300 (29,69%) 378 7 1

1300 386

p (1) → (2) < 0,001 ; p (1) → (3) < 0,001 ; p (1) → (4) < 0,001 ; p (1) → (5) = 0,004 ; p (2) → (3) < 0,001 ;

p (2) → (4) < 0,001 ; p (2) → (5) <0,001 ; p (3) → (4) < 0,001 ; p (3) → (5) < 0,001 ; p (4) → (5) < 0,001.

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Tableau VIII : Répartition du VIH en fonction des professions des mères

Classe Profession Total VIH- VIH+ VIH-1 VIH-2 VIH-1&2

1 Ménagères 767 498 269/767 (35,1%) 264/378

69,84%

4/7

57,14%

1

2 Secteur

informel

312 228 84/312 (26,9%) 82/378

21,69%

2/7

28,57%

0

3 Elèves-

étudiantes

119 110 9/119 (7,5%) 9/378

2,38%

0/7

0,00%

0

4 Fonctionnaires 102 78 24/102 (23,5%) 23/378

6,08%

1/7

14,29%

0

Total 1300 914 386 378 7 1

p (1) → (2) < 0,001 ; p (1) → (3) <0,001 ; p (1) → (4) <0,001; p (2) → (3) < 0,001; p (2) → (4) <0,001; p (3) → (4) = 0,008.

Le tableau VIII montre la répartition du VIH au sein des groupes cibles comme : ménagères,

élèves, commerçantes, artisanes (secteur informel), fonctionnaires de l‟état. Le groupe ayant la

prévalence la plus élevée du VIH est celui des ménagères (35,1%), viennent ensuite le groupe du

secteur informel (26,9%) puis les fonctionnaires (23,5%).

Parmi ces 1300 femmes enceintes, 378 femmes ont été dépisté VIH-1 séropositives, soit

une prévalence de 29,1% (378/1300). Cette prévalence ne reflète aucunement la prévalence du

VIH sur le plan national. En effet, les CMSC et le CERBA qui sont des centres de références du

VIH, reçoivent des femmes qui cachent leur séropositivité à leur dépend afin de pouvoir

bénéficier de la prise en charge gratuite dans ces deux structures sanitaires. Ces femmes ont eu

un suivi médical du temps de leur dépistage jusqu‟à leur accouchement et un diagnostic précoce

du VIH, par PCR, a été effectué sur leurs enfants.

III.1.2 – Analyse des tests PCR

La PCR terminée, les amplicons étaient séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 2,0%

et leur révélation était faite sous ultra violet (UV). La figure 17 montre le profil électrophorétique

des amplicons.

--------------------------------------------------------------------


PMPM

3

12

21

22 246

1

2

25

1614

10 000 pb

20

13

2000 pb

200 pb

100 pb

8

151197 17

10

19

18

235

200 pb

200 pb

200 pb

124 pb

Figure 17 : Electrophorèse sur gel d‟agarose à 2%.

Légende : PM = Marqueur de poids moléculaire (Fermentas: GeneRuler™ DNA Ladders

« GeneRuler™ DNA Ladder Mix », ready-to-use, ≠ SM 0333; 100-10,000 bp).

Puits 24 = contrôle positif ; Puits 25 = contrôle négatif

Au niveau des puits 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, nous avons des

bandes visibles: ces échantillons sont positifs à la PCR. Les puits 3, 6, 12, 21, 22, 23,

correspondent à des échantillons négatifs à la PCR. Les bandes d‟ADN attendues se sont formées

entre 100 et 200 paires de bases (pb) ; ce qui correspond à la taille du fragment attendu d‟environ

110 à 120pb. C‟est la région 5‟LTR du génome du VIH-1 qui a été amplifiée, en se basant sur

l‟étude d‟AVETTAND-FENOEL et al. (2009). Tous les échantillons qui ont montré des bandes

visibles sur le gel étaient donc infectés par le VIH-1 et les enfants correspondants ont été

déclarés VIH-1 positifs.

Tableau IX : Prévalence des tests PCR positifs en fonction des professions des mères

PCR Total

Total Négative Positive

Profession

Ménagère 264 249 15/264 (5,7%) 264

Secteur informel 82 79 3/82 (3,6%) 82

Fonctionnaire 23 23 0/23 (0,0%) 23

Élèves-étudiantes 9 9 0/9 (0,0%) 9

Total 378 360 18 (100,0%) 378

http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis/generuler-dna-ladders

--------------------------------------------------------------------


Le tableau IX nous indique les résultats des tests PCR des enfants en fonction de la

profession des mères. Nous avons identifié par PCR 18 enfants VIH positifs (18/378) soit une

prévalence de 4,76%. Nous avons trouvé la plus haute prévalence chez les enfants des mères

ménagères (5,7%), tableau IX.

Tableau X : Résultats des tests PCR des enfants en fonction du mode de traitement de leur mère

Total PCR

Négative Positive Total *p-value

HAART1 114 114 0 /114 (0,0%) 114/378 (30,16%)

NPP2

264 246 18/264 (6,82%) 264/378 (69,84%) 0,009

Total 378 360 18/378 (4,76%) 378

* p corrigé de Yates

1HAART : AZT/3TC+NVP ou D4T/3TC+NVP ou 2INTI+1INNTI ou 2INTI+1IP

2NPP = Nouveau protocole prophylactique (AZT+3TC+NVP)

Dans notre étude, 69,84% (264/378) des mères étaient sous le nouveau protocole

prophylactique (AZT+3TC+NVP). A la naissance, leurs enfants ont été mis sous ARV (NVP

prise unique (PU) + AZT pendant une semaine en prophylaxie).

Au niveau du traitement HAART, nous avions 114 mères soit 30,16% (114/378).

Comme décrit dans le tableau X, aucun enfant né du groupe des femmes sous HAART, n‟a été

positif au test de la PCR (0/114) soit 0,00%. La différence était très significative avec une p-

value < 0,01.

Tableau XI : Résultats des tests PCR des enfants en fonction de leur mode d‟allaitement.

Total PCR négative PCR positive p-value

Allaitement maternel 92 86 6/92 (6,52%)

Allaitement artificiel 286 274 12/286 (4,20%) 0,53

Total 378 360 18/378 (4,8%)

Le tableau XI nous présente la répartition des enfants diagnostiqués VIH positifs par PCR

en fonction de leur mode d‟allaitement. Nous observons que 6,52% des enfants positifs à la PCR

ont été nourris au sein contre 4,20% enfants allaités artificiellement (Tableau XI).

--------------------------------------------------------------------


Tableau XII : Répartition de l‟allaitement selon le nombre de décès.

Nombre de décès Total p-value

Oui Non

Allaitement au sein 3 280 283

Allaitement artificiel 2 93 95 0,8

Total 5 373 378

Même si la différence n‟est pas significative (p-value= 0,8), le tableau XII nous présente

5/378 (1,32%) enfants décédés au cours de leur suivi. Deux enfants avec test PCR positif étaient

allaités artificiellement contre deux autres enfants PCR négatifs allaités au sein (Tableau XII). Le

tableau XII montre que 98,68% (373/378) des enfants inclus dans le programme sont restés

vivants durant le suivi médical.

III.1.3 – Analyse des tests pour le Real time-PCR des femmes enceintes à sérologie douteuse

Après la PCR en temps réel (Real Time PCR), les courbes de fluorescence ont été

analysées en utilisant le logiciel 7500 Fast Sequence Detection Software Version 2.1.

Le tableau XIII nous présente les analyses sérologiques ELISA, confirmées par des tests

RT-PCR. Des tests positifs à l‟ELISA 5/5 ont tous été confirmés positifs par la RT-PCR. De

même, les échantillons négatifs à l‟ELISA 4/4 ont tous été confirmés négatifs à la RT-PCR. Par

contre les tests indéterminés à l‟ELISA ont donné des résultats suivant : 2/16 (12,5%) étaient

positifs à la RT-PCR et 14/16 (87,5%) étaient négatifs (Tableau XIII).

III.1.4 – Analyse des tests PCR par l’ADN proviral en utilisant les DBS

Les échantillons à sérologie indéterminée qui se sont révélés négatifs à l‟ELISA et à la

Real Time PCR ont ensuite été testés par PCR sur les échantillons de sang séché sur papier

Buvard (DBS). Ce qui a permis de lever définitivement tout équivoque sur les résultats des tests

des échantillons.

Parmi les échantillons indéterminé (douteux), 87,5% (14/16) qui étaient négatifs à la RT-

PCR en temps réel, ont été confirmés encore négatifs par la PCR (système DBS) 14/14

(100,0%). Tous les échantillons négatifs pour le VIH par ELISA (4/4) ont été tous confirmés

négatifs par RT-PCR en temps réel et par PCR (Tableau XIII).

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Tableau XIII : Résultats de la PCR des personnes au statut sérologique douteux à l‟ELISA

ELISA RT-Real-time-PCR

PCR

Négatif Positif Négatif Positif

Indéterminé 16/25

(64,0%)

14/16

(87,5%)

2/16

(12,5%)

14/14

(100,0%)

0/14 (0,0%)

Negatif 4/25 (16,0%) 4/4 (100,0%) 0/4 (0,0%) 4/4 (100%) 0/4 (0,0%)

Positif 5/25 (20,0%) 0/5 (0,0%) 5/5 (100,0%)

Total 25 18 7 18 0

--------------------------------------------------------------------


III.2 – Discussion

Notre travail de DEA avait pour objectif principal l‟usage des outils moléculaires (PCR

classique et PCR à temps réel) dans le diagnostic du VIH chez les enfants nés de mères VIH

séropositives et chez les femmes en visite prénatale ayant une sérologie indéterminée (douteuse).

Notre étude prospective portait sur 378 femmes enceintes VIH-1 séropositives. Parmi les

264 femmes sous NPP (AZT + 3TC + NVP), 6,82% (18/264) ont transmis le VIH à leurs enfants

contre une transmission de 0,0% (0/114) chez les 114 femmes sous HAART.

Le Centre Médical Saint Camille est situé dans un quartier populaire de Ouagadougou,

Secteur 14. La plupart des femmes fréquentant le centre sont prises en charge dans le cadre du

programme de la PTME mise en place depuis 2002 et appuyée par les recommandations de

l‟OMS au gouvernement burkinabé.

La plupart des patientes sont issues des zones indigentes de la ville où la promiscuité et le

manque d‟hygiène conduisent à la prolifération de toutes sortes d‟infection dont le VIH. La

prévalence du VIH chez les mères suivies dans cette étude était de 29,1% et ne reflète pas la

prévalence de 2% sur le plan national (Rapport Direction de la Santé et de la Famille Burkina

Faso, 2006). La problématique de l‟augmentation de la prévalence peut avoir une explication

socioéconomique. Dans le contexte de notre étude, le centre Saint Camille et le CERBA, sont des

centres de références, qui participent pleinement à l‟exécution des programmes de lutte contre le

VIH, mise en place par le gouvernement burkinabé. De ce fait, les femmes qui se présentent pour

la première fois au centre pour un premier dépistage, peuvent le faire en connaissant déjà leur

séropositivité. Du fait, de la prise en charge gratuite des mères séropositives, elles cachent leur

sérologie VIH et y viennent pour bénéficier du programme. Elles fournissent dans ce cas des

fausses informations qui peuvent conduire à un biais au niveau de la prévalence du VIH chez les

femmes enceintes.

En comparant à un autre pays africain, la Tanzanie ; où la prévalence globale du VIH est

d'environ 6%. Une prévalence du VIH chez les femmes enceintes de 14,5% a été trouvée dans

une étude menée dans un cadre sociodémographique identique à celui du centre médical et du

CERBA, portant sur 1395 femmes (KIRSTEN et al., 2011).

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De nos jours, la tendance de la transmission est à la baisse dans presque tous les pays. Ceci

est dû aux comportements sexuels à moindre risque, à la sécurité transfusionnelle et à

l‟introduction des trithérapies, les antirétroviraux de plus en plus puissants et très actifs, mais qui

font surgir un autre problème tout aussi important en santé publique qu‟est la résistance aux

ARV.

Les nouvelles stratégies de prévention contre le VIH préconisent un diagnostic précoce du

VIH chez l‟enfant né d‟une mère séropositive. La RT/PCR a été initialement standardisée

comme technique de diagnostique de l‟infection à VIH (SIMPORE et al., 2006). Le diagnostic

par RT/PCR a montré ces limites, avec l‟apparition de faux positifs à cause du temps de

destruction de l‟ARN messager par les phosphodiestérases. En 2005, une étude a montré que les

résultats de RT-PCR faite chez les enfants ont donné de faux négatifs au 45ème

et 90ème

jour de

vie, la RT-PCR s‟est avérée positive au 20ème

mois (COULIBALY et al., 2005).

Contrairement aux études menées précédemment, sur le diagnostic moléculaire par RT-PCR,

nous avons mené une étude de diagnostic précoce par PCR en utilisant l‟ADN proviral (en

utilisant le DBS). L'ADN intégré sert de modèle principal pour la transcription des gènes et la

réplication virale (AGOSTO, 2010). Cette caractéristique permet au provirus d‟être exprimé de

manière stable par les cellules hôtes et de persister dans la cellule infectée indéfiniment

(AGOSTO, 2010). Une mesure précise de l'ADN intégré du VIH est un meilleur indicateur de la

taille du réservoir que la mesure de l‟ADN total du virus (AGOSTO, 2010).

Le DBS est utilisé pour la détection du VIH-1 du génome par PCR avec une bonne sensibilité

et spécificité. La méthode d'extraction de l'ADN à partir des DBS permet un diagnostic fiable de

l'infection à VIH-1 (FISCHER et al., 2004). Nous avons identifié par PCR 18 enfants VIH

positifs (18/378) soit une prévalence de 4,8%. Cette prévalence est inférieure aux prévalences de

10,4% obtenue par RT-PCR chez les enfants âgés de 5 à 6 mois, dont les mères et les enfants

recevaient uniquement de la Névirapine (SIMPORE et al., 2006) ; et de 9,2% obtenue dans

l‟étude de DESCHAMPS et al. (2009), dont les mères avaient reçu soit de l‟AZT (73,3%), de la

Névirapine (2,9%) ou une trithérapie (10,1%).

Chez l‟enfant, le résultat n‟est pas définitif car il peut y avoir aussi des transmissions (5 à

20%) en cas d‟allaitement maternel (HORVATH et al., 2009). Nous observons une prévalence

de 6,52% parmi les enfants positifs à la PCR, qui ont été nourris au sein contre 4,20% enfants à

--------------------------------------------------------------------


l‟allaitement artificiel. Dans l‟étude de SIMPORE et al, des enfants séropositifs 5/53 (9,4%)

étaient en allaitement maternel pendant 4 mois, tandis que le reste 15/140 (10,7%) étaient en

allaitement artificiel (SIMPORE et al., 2006). Ces différences statistiques étaient dans les deux

cas, non significatives, probablement à cause de la taille réduite de l‟échantillon.

La différence n‟était pas significative (p= 0,8) en ce qui concerne la mortalité des enfants au

cours de leur suivi étaient de 1,32% (5/378). Deux enfants décédés infectés par le VIH étaient

allaités artificiellement contre deux autres enfants confirmés PCR négatif allaités au sein. Dans

l‟étude de SIMPORÉ et al, les bébés décédés, nourris artificiellement et ceux nourris aux seins

étaient respectivement de : 2,1% (3/140) et 1,9% (1/53) (SIMPORE et al., 2006). Les décès

semblaient tout aussi bien être dus à différentes pathologies infectieuses ou liées au VIH.

Comme l‟ont montrées les précédentes études menées au Centre Médical Saint Camille, le

protocole de la transmission mère-enfant du VIH, basé sous la monoprophylaxie à la Névirapine

a permis de réduire sensiblement le taux de transmission du VIH à 10,36% (SIMPORE et al.,

2006) et 9,09% (SAGNA et al., 2008). Une autre étude antérieure a montré un taux plus élevé de

transmission à la névirapine 15,0% (ROLLINS et al., 2007).

Parmi les mères de notre étude qui étaient sous le nouveau protocole prophylactique

(NPP) AZT+3TC+NVP, le taux de transmission verticale était de 6,82%, (18/264) tandis que

celui de l‟étude de SAGNA et al., 2008 étaient de 4,55%. Ainsi, l‟efficacité de la Zidovudine en

association avec la Lamivudine + Névirapine pour la prévention de la transmission mère enfant

du VIH a été démontrée également par SUKSOMBOON et al. (2007).

L'efficacité de la thérapie HAART dans la prévention de la transmission verticale du VIH a

été confirmée dans plusieurs études. Les HAART donnent des meilleurs résultats et le test de

RT-PCR pour le VIH a montré un taux de transmission verticale de 0,0% chez les enfants nés de

mères séropositives (SIMPORE et al., 2007; SAGNA et al., 2008; ILBOUDO et al., 2010).

Malheureusement, ce protocole est financièrement coûteux (SIMPORE et al., 2007).

Depuis 2010, une nouvelle recommandation révisée de l‟Organisation Mondiale de la Santé

(OMS) est appliquée dans les programmes de la PTME des pays en voie de développement, le

protocole de traitement antirétroviral hautement actif (HAART: Highly Active Antiretroviral

Treatment), la combinaison : Zidovudine-Lamivudine-Névirapine est la plus utilisée. Les lignes

--------------------------------------------------------------------


directrices nationales sur la PTME s‟inspirant du guide de l‟OMS 2010, sont progressivement en

train d‟être mises en place. Elles ramènent la prophylaxie de la mère de 28ème

semaine à la 23ème

semaine et propose de faire la PCR au 2ème

mois de naissance, où le calendrier de la PCR

correspondra avec le calendrier lié à la prise des vaccins. Le protocole suivant les directives de

l‟OMS sera introduit progressivement au Burkina Faso à partir de 2012 (Tableau XIV :

Protocoles ARV de prévention de la transmission mère-enfant du VIH).

.

Avec l‟évolution des ARV et la mise en place des différentes combinaisons, il est sans doute

admis que la prévention de la transmission mère-enfant connait un nouveau dénouement. Le taux

de transmission régresse concomitamment à l‟introduction de nouvelles combinaisons

thérapeutiques qui sont beaucoup plus efficaces contre les résistances aux ARV, mais surtout

limitent la transmission verticale. En 1997 l‟utilisation de l‟AZT comme monoprophylaxie

donnait déjà un taux de transmission de 7,6% ; l‟administration de la triprophylaxie dans l‟étude

de SAGNA et al. (2008), à donné un taux de transmission de 4,55%. La prise des HAART donne

un taux de 0.0% confirmé par plusieurs études récentes (SIMPORE et al., 2007; SAGNA et al.,

2008; ILBOUDO et al., 2010).

Dans notre étude, les tests de diagnostic ont été effectués à 4 mois de naissance. Les tests

devraient être offerts aux nourrissons exposés au VIH le plus tôt possible après l'âge de 6

semaines et devrait être répétée chaque trimestre tant que les enfants sont encore exposés via

l'allaitement.

L'utilisation systématique de tests de diagnostic par PCR lors du dépistage des femmes

enceintes contribuerait à accroître l‟efficacité du programme de TME. Les femmes qui sont

renvoyées pour un contrôle trois mois après leur premier test de diagnostic par ELISA devraient

très tôt être fixées sur leur séropositivité moyennant un test PCR. Ce qui augmenterait la qualité

de leur prise en charge.

Une étude menée pendant une longue période (2000 à 2006), sur 30 854 femmes enceintes a

donnée une prévalence de 0,44% (137) de femmes infectées par le VIH et le taux de transmission

verticale était de 9,7% (VIEIRA et al., 2011). Ces taux ont été associés à la qualité urbaine des

quartiers résidentiels. L‟étude a conclu que les quartiers avec une qualité urbaine plus faible

devrait être prioritaire dans les actions pour réduire la transmission verticale (VIEIRA et al.,

--------------------------------------------------------------------


2011). Une grande priorité devrait être donnée dans les centres qui reçoivent un nombre

important de femmes venant de quartiers défavorisés.

Il y a des preuves croissantes que le sevrage précoce ou l'absence d'allaitement au sein

augmenterait la morbidité et la mortalité des enfants nés de mères séropositives. Les nouvelles

recommandations de l‟OMS pour les mères séropositives sont d'allaiter exclusivement au sein

leurs enfants infectés ou non du VIH les 6 premiers mois de vie. L'introduction des aliments

complémentaires appropriés pourrait se faire par la suite, mais il faudrait poursuivre l'allaitement

pendant les 12 premiers mois de vie (VORA et al., 2010).

L‟un des objectifs de cette étude était de confirmer la sérologie indéterminée au VIH chez les

femmes enceintes par RT-PCR et PCR pour deux principales raisons : 1) garantir un risque

minimale de transmission ; 2) lutter contre le VIH/SIDA par la mise en place d‟une stratégie

efficace de diagnostic moléculaire de l‟infection chez les femmes enceintes au CMSC en vue de

leur prise en charge médicale rapide.

Les résultats de la Real Time-PCR, montre une confirmation du diagnostic pour tous les

échantillons dépistés positifs (100%) ou négatifs (100%) par tests rapides (Determine et

SDBioline). En ce qui concerne les échantillons à sérologie indéterminée (douteuse), 12,5%

(2/16) se sont avérés être des échantillons positifs au VIH. L‟étude faite précédemment par

NAGALO et al, avait montré que 1 sur 2 pools d‟échantillons indéterminés était positif à la RT-

PCR (NAGALO et al. 2011).

Généralement, lors du dépistage sérologique des femmes enceintes, quand un échantillon

est indéterminé après utilisation des deux tests utilisés, il est recommandé aux femmes de répéter

15 jours après un contrôle sérologique. En cas d‟un nouveau résultat indéterminé, il est

recommandé d‟acheminer le prélèvement au laboratoire de référence pour un western blot.

D‟où l‟importance de systématiser le diagnostic moléculaire par PCR chez les femmes

enceintes à sérologie indéterminée.

Comme dans l‟étude de Nagalo et al (NAGALO et al., 2011), la stratégie de tester

uniquement les échantillons dont le statut est indéterminé au VIH par ELISA, un effectif réduit

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sera obtenu, et les femmes pourraient être rapidement prises en charge. Le manque de ressources

technique à la réalisation de ce diagnostic constitue un frein à la vulgarisation de la PCR qui

actuellement est uniquement réservée au diagnostic précoce des enfants.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Cette étude nous a permis de diagnostiquer chez 1300 femmes enceintes, 386 individus

séropositifs au VIH, dont 29,07% (378/1300) de VIH-1 ; 0,54% (7/1300) VIH-2 et 0,08%

(1/1300) de VIH1/2. Par la technique de la PCR, 18 enfants positifs au VIH-1 ont été détectés sur

trois cent soixante dix huit (378) soit 4,76% de cas de transmission. La technique de la PCR en

temps réel (Real Time-PCR) nous a permis de détecter parmi les échantillons douteux par

ELISA, 12,5% (2/16) d‟échantillons positifs.

Les résultats de ce mémoire contribueront à vulgariser le diagnostic précoce chez les

enfants nés des mères VIH séropositives. Ils contribueront également à promouvoir le test PCR

chez les femmes enceintes ayant des résultats d‟examens douteux du VIH.

Un défi à relever : le diagnostic du VIH parmi les enfants est l'existence des différents sous-

types de VIH. Le sous type B étant le plus répandu, certaines analyses moléculaires virologiques

n‟ont été développées que pour la détection du virus VIH de ce sous type, qui n‟est pas le plus

répandu en Afrique.

Dans les perspectives, il serait intéressant de :

- Détecter les résistances aux ARV chez les mères et leurs enfants ;

- Identifier la diversité génétique du VIH circulant dans nos régions ;

- Rechercher chez les femmes VIH séropositives, celles qui sont co-infectées par

Mycobacterium tuberculosis afin de déterminer les multi résistances (MDR).

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Le Serment éthique pour les chercheurs en sciences de la vie, adapté et inspiré du Serment d'Hippocrate médical,

(Science Vol. 286, 19 Nov. 1999, p.1475).

"Je jure d'être fidèle à l'éthique du respect des personnes et des vies humaines et de contribuer au

développement de la connaissance et à la plus large diffusion du savoir.

Je respecterai toutes les espèces dans leur biodiversité : ce respect inspirera mes actes et mes

projets, notamment au cours de mes expérimentations sur les animaux ou les tissus humains.

Je m'efforcerai de soulager les souffrances de tous les êtres vivants.

Admis(e) à avoir accès à l'intimité tissulaire ou génétique des personnes, je tairai leur identité et

m'astreindrai au secret médical.

Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de

l'humanité.

Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission.

Je m'informerai et réfléchirai au sens de mes expérimentations et à leurs conséquences.

Je veillerai à ce que mes travaux et recherches ne soient pas utilisés à des fins de destruction ou

de manipulation.

Je respecterai les savoirs des ethnies et des sociétés traditionnelles.

Je n'aurai garde d'oublier mes responsabilités à l'égard des générations présentes et futures.

Je n'accepterai pas que des considérations de nationalité, de culture, de politique ou d'avantages

matériels me détournent de mes devoirs.

J'interviendrai pour défendre, s'il m'en est donné l'occasion, l'ensemble de ces règles.

Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses.

Que je sois déshonoré(e) et méprisé(e) si j'y manque."

spécialité : biologie moléculaire par : ghoma …cerbafaso.org/textes/dea_tese/dea_ghoma.pdf ·...

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