soutenance de thèse de biologie

Soutenance de thèse de Biologie

Cécile Lestrat

Directeur de Thèse: Cécile CaronInstitut Albert BonniotOntogenèse et Oncogenèse Moléculaire

Université Joseph FourierGrenoble

Financé par La Région Rhône-AlpesEt l’ARC

Identification et caractérisation de la protéine Atad2

Un facteur impliqué dans le remodelage de la chromatine acétylée au cours de la

spermiogenèse

16 Octobre 2008

SommaireIntroduction

La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche

Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse: résultats de

l’équipe

Conclusion et Perspectives



Résultats


ADN double brin (2 nm)

’’collier’’ de nucléosome (11 nm)

Fibre de chromatine (30 nm)

Section chromosomique sous sa forme étendue (300 nm)

Section condensée de la chromatine (700 nm)

Chromosome mitotique entier (1400 nm)

Les différents degrés de l’organisation de la chromatinienne

Felsenfeld & Groudine, 2003

La structure chromatinienne

H2B

H2A H

2B

H2AH3

H3H4

H4

Nucléosome

Epigénétique et code histone

H2B N- PEPVKSAPVPKKGSKKAINK…..VKYTSSK….

N- SGRGKQGGKARA…..AVLLPKKTESHHK….H2A

N- ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP…..H3

N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT….H4

Ub

Me

P

Ac

Structure fermée(Transcription réprimée)

HDAC(Histones

déacétylases)

HAT(Histones

acétytransférases)CH3-CO-SCoA

CoA

Structure ouverte(Transcription activée)

Exemple de l’acétylation

Machinerie de remodelage



Résultats


Les bromodomaines: Conservation et structures N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...

H4

Bromo

:Ac

Zeng & Zhou, 2002

Les bromodomaines: reconnaissance des histones acétylées

N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...

H4

Bromo

:Ac

Reconnaissance des lysines acétylées

Spécificité de la reconnaissance: chaque bromodomaine ne reconnait pas toutes les lysines acétylées

Affinité expliquée par l’environnement du site de liaison (au niveau des acides aminées non conservés, de la conformation de la protéine)



Résultats


Les protéines à bromodomaines

De la Serna, Ohkawa & Imbalzano, 2006.

Famille SWI/SNF

Facteurs de remodelage dépendantes à l’ATP

Les Histones AcetylTransferases (HAT)

HAT, reconnaissance des histones acétylées et extension du signal au nucléosome suivant


La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-

ATPases Problématique de recherche

Résultats


Les AAA-ATPasesVCP AAAATPases Associated with a wide variety of cellular Activities

Anneaux hexa/heptamériquesImplication dans le désassemblage de complexes multiprotéiques

Walker AWalker BSRH

Boucle Pore

Hanson and Whiteheart, 2005; Lenzen et al.,1998

Homologue d’Atad2

Sous-unités Rpt du protéasome

Homologues de VCP

Conservation des AAA-ATPases

VCP AAA

Les AAA-ATPasesVCP AAA

VCP

sous-unités du protéasome (dégradation des protéines)Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader

Particule 20S

Particule 19S

Particule 19S

protéasomeRpt

Hexamérisation en anneaux, dépliement des protéines neo-synthétisées mal repliées..

AAA: Le protéasome

Dégradation des protéines

Rechsteiner & Hill, 2005

19 S : reconnaissance du substrat, dépliement et insertion dans la chambre catalytique

19 S

20 S: chambre catalytique, site de coupure des séquences peptidiques

Les AAA et l’activité génomique

Helicases mcm2-mcm7 (minichromosome maintenance 2-7)Initiation et élongation de la réplication de l ’ADN

RptCoactivatrice traductionnelles (GAL)Dégradation des facteurs de transcription et modifications post-traductionnelles des histonesEtapes de la transcription



Résultats


Remodelage chromatinien et spermatogenèse

Arrêt de la transcription

Compaction

Méiose

H2B

H2A H

2B

H2AH3

H3H4

H4

Nucléosome

protamines

Enlèvement des histones

? ?

Axes de recherche de l’équipe

Organisation finale du génome spermatique

Mécanismes moléculaires du remodelage

Recherche fondamentale

Exploitation des connaissances en physiopathologie humaine (procréation)Exploitation des connaissances en oncologie

- Département de Génétique et procréation/CECOS -

Transfert au niveau médical

Mécanismes moléculaires du remodelage

Identification?

Criblage bio-informatique d’ une banque d’ADNc :

Spermiogenèse•Banque testiculaire

•Candidat liant la chromatine

•Candidat ayant une possible activité enzymatique

BRDTCDYL Atad2

Caron, Pivot-Pajot, van Grunsven, Col, Lestrat, Rousseaux, Khochbin; EMBO Rep 2003

Pivot-Pajot, Caron, Govin, Vion, Rousseaux, Khochbin; MCB 2003


Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:

résultats de l’équipe



Résultats Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:



Atad2 AAATPase Bromodomaine

Reconnaissance des histones acétylées ?


H4

Bromo:Ac

Remodelage?

1 114 255 631 743 1040

Atad2 & conservation

mAtad2-l

A.thaliana2

C. elegans

humainAtad2

ratAtad2

S. Cerevisiae

A.thaliana1

mAtad2-s


Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:



Hypothèse de travailSpermiogenèse

protamines

Dégradation des histones?

Enlèvement des histones?

SommaireRésultats

Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse

Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase

Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe

Existence d’Atad2,profil d’expression

court

longRT-PCR

Gla

nde

saliv

aire

Atad2

GAPDH

Sans

ARN

7 11 15 17 Cerv

eau

Oei

lCo

eur

Rein

Foie

Poum

on

Rate

Testi

cule

Ute

rus

Embryon

Les deux formes d’Atad2 existent chez la sourisLa forme courte est strictement testiculaire

Existence d’Atad2,profil d’expression

court

long

Western-blotM

uscl

e

180

130

100

73

Poum

on

Coeu

r

Testi

cule

Cerv

eau

Rein

Rate

Foie

PM (K

da)

Spermiogenèse

180

130

PM (K

da)

Les deux formes d’Atad2 sont présentes au cours des phases tardives de la spermiogenèse

SommaireRésultats




Les bromodomainesCBP bromodomain

Motifs de reconnaissance des histones acétylées

AAATPase BromodomaineAtad2


H4

Bromo:Ac

Localisation subcellulaire

Atat2 dans la fraction chromatinienneAffinité différente des deux formes pour la chromatine

Cyto

plas

me

Nuc

léop

lasm

e

Chro

mati

ne

long

court

Histones de coeur

180

130

PM (K

da)

200

Sol Son C Sol Son C Sol Son C Sol Son C

350 500 750

long

court

Histones de coeur

[KCl] (mM)

Extraction saline

180

130

PM (K

da)

Liaison à la chromatine

H2A

H2B

H3

H4

?

SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV


ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC

ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC

PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC

PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC

SGLGKQGGKARAC

SGLGKQGGKARAC

Quelle affinité avec les histones?

Tests de pull down sur la protéine endogène utilisant des peptides mimant les queues N-Terminales des histones

- + - + - + - + - +No

tat

input Acetylation

Peptides pull down d'extraits nucléoplasmiques testiculaires

peptidesH2A H2B H3 H4

Résultats

court

contrôlesK5 K8 K12 K16+ -inputH4

court

Acetylation spécifique

Le bromodomaine d’Atad2 lie l’histone H4 acétylée, majoritairement sur la lysine K5

Liaison à la chromatine


-

IP HA Atad2

162535

Histones de coeur

PM+ - HA mAtad2

TSA+ + +

HA mAtad2

10

HA mAtad2- - +-

IP HA Atad2

162535

Histones de coeur

PM+ + HA mAtad2

TSA- - +

HA Atad2

10

Implication du bromodomaineTests d’immunoprécipitation de différentes constructions d’Atad2 court

Affinité d’Atad2 avec la chromatine quand celle-ci est acétyléeLe bromodomaine est responsable de cette interaction

SommaireRésultats




Hypothèses

Atad2 Hexamère

• Complexe de remodelage• Extraction des nucléosomes acétylés

Atad2 sous unité du protéasome

• S’insère dans l’anneau Rpt• Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée• Dégradation des nucléosomes acétylés

Domaine AAA

AAATPase Bromodomaine

ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities

Anneaux hexamériquesChaperonnes: désassemblage de complexes multiprotéiques

sous-unités du protéasome (dégradation des protéines)Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader

RptComplexe 20S

Complexe 19S

Complexe 19S

protéasomeRpt

Interaction avec les Rpt


3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol

1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV

2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes

Pull down des Rpt traduites in vitro sur des bille GST / GST-Atad2, domaine ATPase

Input Rpt1 2 3 4 5 6- + - + - + - + - + - +

1 2 3 4 5 6

Pull down

Tests in Vitro

Interactions in vitro

Rpt1

Input Rpt1

Rpt1IP

Rpt3

Input Rpt3

Rpt3IP

Atad2 c

Rpt1

-Input 5% +

Rpt6

Rpt

Co-immunoprécipitation

Rpt

Avec des Rpt surexprimées de façon transitoire Avec des Rpt endogènes

Interaction entre les Rpt et Atad2 via son domaine AAA

Méthodes de séparation

testicule

1 - Noyaux

2 - Extrait soluble

3 - Centrifugation sur gradient de densité Glycerol

20%

40%


4 - AcH4 peptide pulldown

Ultracentrifugation

Atad2Fraction

Atad2Pull down

Rpt1

Rpt1

?

UltracentrifugationRésultats

Colocalisation de la population d’Atad2 en complexe et des Rpt

Hypothèses

Atad2 Hexamère

• Complexe de remodelage• Extraction des nucléosomes acétylés

Atad2 sous-unité du protéasome

• S’insère dans l’anneau Rpt• Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée• Dégradation des nucléosomes acétylés

Domaine AAA

Multimérisation

1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions Atad2

2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2

3ème Stratégie- Degrés de multimérisation

Multimérisation

Test in vitro: Pull down d’Atad2 traduit in vitro sur des bille GST / GST-Atad2 AAA

Input Atad2Pull down

WT AAA - + - +WT AAA

Dimérisation possible grâce au domaine AAA

Multimérisation

1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions ATad2



Implication du domaine AAA

Double transfection: domaine ATPase responsable de la multimérisation?

Flag Ata2:

Ha-Atad2 wt: - + - +1-822 1-822292-822 292-822

- + - +

WB anti-flag

WB anti-Ha

Input IP anti-Ha

Dimérisation possible grâce au domaine AAAHypothèse de la multimérisation plus probable que l’interaction avec les Rpt

Multimérisation

1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions ATad2



Proteine recombinante sur gel électrophorèse natif

669440

232

140

KDa

Fla

g-V

CP

Ata

d2

?

Multimérisation

Proteine recombinante en HPLC

Multimérisation possible en hexamère

Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine


?


H4

Bromo:Ac


H4

Bromo:Ac


1ère stratégie- liaison à la chromatine avec un domaine AAA muté?

2ème stratégie-Approche indirecte: Quelle population d’Atad2 a une affinité avec la chromatine acétylée?

Régulation de l’affinité à la chromatine

Pull down H4 acétylée avec des constructions d’Atad2 dont certains domaines sont mutés

- -FL mtBd mtAAA FL mtBd mtATP

HA - Atad2

input pull-down H4 tetra-Ac

L’altération du domaine AAA affaiblit la capacité d’Atad2 à lier H4 acétylée


1ère stratégie- liaison à la chromatine avec un domaine AAA muté?

2ème stratégie-Approche indirecte: Quelle population d’Atad2 a une affinité avec la chromatine acétylée?

Fractions

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

AcH4 pull down

? ??

20 % 40 %

UltracentrifugationRésultats

La population en complexe/hexamérique peut interagir avec la chromatine acétylée

Rôle au cours de la spermiogenèse

Spermiogenèse

protamines

Enlèvement des histones

protamines

19S Dégradation des histones

Enlèvement des histones ?

AcK5

Multimérisation-affinité

SommaireRésultats

Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:


SommaireRésultats

Atad2 hors spermiogenèse:

Cellules somatiques

Expression d’Atad2

Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A

Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et

cancersInfluence sur l’apoptose

Atad2 & conservation

mAtad2-l

A.thaliana2

C. elegans

humainAtad2

ratAtad2

S. Cerevisiae

A.thaliana1

mAtad2-s

Profil d’expression

court

longRT-PCR

Gla

nde

saliv

aire

Atad2

GAPDH

Sans

ARN

7 11 15 17 Cerv

eau

Oei

lCo

eur

Rein

Foie

Poum

on

Rate

Testi

cule

Ute

rus

Embryon

La forme longue est retrouvée dans plusieurs tissus

Présence de la forme longue dans des lignées de cellules en culture

Testiculemurin COS Daudi Jurkat Molt HL60 A549 H12

180

130

PM (K

da)

long

Profil d’expression

SommaireRésultats


Cellules somatiques


Influence sur l’activité transcriptionnelle

Influence sur la dynamique de H2A




Motifs de reconnaissance des histones acétylées


H4

Bromo:Ac

Dépliement/Extraction des histones?

Influence d’Atad2 sur l’activité transcriptionnelle?

Influence d’Atad2 sur l’activité transcriptionnelle?

Atad2 a une activité de répression de la transcription

par RT-qPCR

Expériences de mesure de l’activité transcriptionnelle par puce

Le Knock Down d’Atad2 active globalement l’activité transcriptionnelle

244 gènes affectés2/3 montre une transcription plus élevée

SommaireRésultats


Cellules somatiques





Influence sur la dynamique de H2A sur la chromatine

Le Knock Down d’Atad2 déstabilise globalement la structure chromatinienne

Atad2 figerait/organiserait certains domaines de la chromatine en structures stables

Expériences de FRAP: visualisation de H2A

Atad2 dans les cellules somatiques

Relâchement de la structure chromatinienne, transcription, dynamique

Domaines maintenus en structure figées

SommaireRésultats


Cellules somatiques



Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales

et cancersInfluence sur l’apoptose

RT-qPCR (Edwige Col)

S. RousseauM. CallananS. Gazzeri

Projet EpiMed

Atad2 dans les tumeurs du poumon

Criblage de tumeurs du poumon

Atad2 est exprimé de façon anormale dans les cancers du poumon

SommaireRésultats


Cellules somatiques


Influence sur la rapidité du turn-over de H2A

Influence sur l’activité transcriptionnelle



Influence d’Atad2 sur l’apoptose

Expériences de FACS: mesures d’un marqueur apoptotique (caspase3)

mesures du marqueur d’apoptose caspase 3 en présence d’actynomycine D sur des cellules traitées ou non avec des ARN si d’Atad2

Atad2 agit comme un anti-apoptotique

Atad2 éliminé précocement lors de l’apoptose des cellules

Le Knock Down d’Atad2 augmente l’apoptose

Atad2 dans les cellules somatiques

Dynamique de la chromatine, apoptose

Domaines maintenus en structure figées,Empêche la désorganisation de domainesEffet anti-apoptotique


Résultats


Rôles d’Atad2: Conclusion

Atad2-court

Atad2-long

Spermiogenèse

Cellules somatiques / Cancéreuses

Atad2 corrélé à une forte dynamique de la chromatineImplication dans l’enlèvement des histones?

Atad2 corrélé à une baisse de la dynamique chromatinienneEffet: baisse de la transcription

baisse de l’apoptose

Les deux formes d’Atad2

Atad2-court

Atad2-longRôle de régulation de l’activité?Site d’interaction de partenaires particuliersSite de reconnaissance d’un substrat?

Pourquoi continuer à étudier Atad2

Les facteurs épigénétiques tels qu’Atad2 semblent avoir un impact fort sur la spermatogenèse

L’étude d’Atad2 en tant que pseudo-C/TA pourrait déboucher sur de nouveaux marqueurs de diagnostic de cancers

Une meilleure compréhension d’Atad2 et des facteurs épigénétiques pourraient être un jour exploitée dans le développement de nouvelles molécules thérapeutiques

Remerciements

Les membres du jury

Cécile CaronSaadi Khochbin

L’équipe

La Région Rhône-Alpes et l’ARC

Mon entourage

Exemple de développement thérapeutiques

Les inhibiteurs d’HDAC

15 molécules en développement

Les inhibiteurs d’Aurora K

1 molécule en développement(réduction de

phosphorylation D’H3)

Les Histones H1 recombinants

3 molécules en développement

Cancers, psoriasis….

Multimérisation ATP-dépendante

Co-immunoprécipitation de constructions d’Atad2. Certaines ont un domaine AAA altéré

La formation du multimère est dépendante de l’ATP.

soutenance de thèse de biologie

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