Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de l’axe longitudinal du

cordon spinal.

Dimitris Bourikas et toute son équipe.

INTRODUCTION

• Durant le développement des circuits neuronaux les axones en croissance se dirigent vers des cellules cibles,en réponse a des signaux de guidage répulsifs et/ou attractifs.

• Un des modèles de guidage axonal très étudié est celui des axones commissuraux situés dans le tube neural.

Rappel sur le développement du système nerveux

A la partie la plus antérieur (rostrale) du Tube Neural, on a les vésicules céphaliques

qui se forment.

A la partie la plus postérieur (caudale) du Tube Neural, on a une segmentation

des somites.

• Dans TN, on a des progéniteurs pour différentes structures cellulaires.

• Certains vont donner des neurones commissuraux.

• Leur axones entrent en contact étroit avec la surface de la pp, traversent la ligne médiane et tournent rostralement le long de l’axe longitudinal du cordon spinal.

Mise en évidence du guidage axonal par la technique de « Open–Book » :

BUT :

Mettre en évidence des molécules intervenant dans le

guidage des axones commissuraux

• Model: Embryon de poulet• Partie lombo-sacrale• Stade du développement:

Stade 23

Stade 25/26 Stade 24

Découverte de Shh par hybridation soustractive :

Hybridation soustractive :

Stade 20 Stade 26

ARNm de PP

A B C D ABCD E F G

Comparaison

E F G

ADNc Séquençage et lignage Bio Info

SHH

Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux (1):

Perte de fonction de shh par RNAi in ovo:

• Pas de modification sur la croissance des

axones.

+RNAi

Wt

Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux :

• Absence d’orientation rostrale.

• Les axones restent au niveau des bordure de la PP et dans la plupart des cas ils tournent caudalement…

• …mais sembleraient rétablir leur trajectoire en formant des boucles (fig d)

• La perte de fonction de SHH montre un blocage dans l’orientation rostrale des axones commissuraux.

• Ceci a été confirmé par l’utilisation d’AC bloquant la fonction de SHH.

SHH est donc nécessaire pour le l’orientation rostrale des axones commissuraux…des

expériences complémentaires ont révélés une action directe

de SHH.

Les récepteurs de Shh :

• Pour savoir si Ptc et Smo sont associés aux effets de Shh sur les axones commissuraux, on analyse leur patron expression au stade 23-24.

Stade 23

• Patched (Ptc) et Smoothened (Smo) = co-recepteur de Shh médiant ses activités inductibles.

Stade 24

Patron expression de Ax1,Smo,Ptc

Axonin-1(Ax1)=molécule d’adhésion exprimée par les axones commissuraux (AC).

Pas d’expression de Smo et Ptc par AC.

Ceci suggère qu’ils ne sont pas requis pour l’action de SHH.

Hybridation in situ

Autre expérience: utilisation de cyclopamine, inhibiteur de Smo ne modifie pas l’orientation rostrale

• Proteine transmembranaire liant directement les proteines Hedgehog (Indian, Desert, Sonic)

• Patron expression de Hip au stade 23,24,26

Les récepteurs de Shh :Hip

Hybridation in situ

• Stade 23: pas d’expression de Hip.

• Stade 24 : expression de Hip.

• Stade 26 : peu d’expression de Hip.

Conclusion :

Hip est exprimé par quelques neurones pendant un temps bref

Expression temporellement et transitoire

Perte de fonction de Hip: RNAi

Lors d’une perturbation des fonctions Hip:

Phénotype identique à celui observé lors du

RNAi de SHH.

Hip est le récepteur médiant l’effet de Shh.

• Hip et SHH permettent d’orienter les AC au niveau rostral du cordon spinal.

• Questions :

• Pourquoi au niveau rostral et non caudal ?

• Quelle est la différence entre ces deux niveaux ?

Gradient de SHH le long de l’axe longitudinal du cordon spinal :Hybridation in situ de shh au stade 25

• Forte expression de

SHH au niveau Caudal.

• Faible expression au niveau rostral.

Gradient d’expression de SHH tout le long le l’axe longitudinal du cordon spinal.

Ce gradient suggère un mécanisme de répulsion de SHH sur les AC

Expérience de gain de fonction de SHH :

Electroporation in ovo permettant d’exprimer Shh sélectivement :

Thoracique Niveau supérieur lumbo-sacral Niveau caudal lumbo-sacral

Les AC ne quittent pas la PP en présence de

concentration élevé de SHH.

Les AC se dirigent en évitant les

concentration de SHH élevé soit

caudalement soit rostralement.

Ce modèle d’étude permet de confirmer l’effet répulsif de SHH quand les neurones doivent tourner rostralement c’est-à-dire au

moment oú ils expriment Hip à leur surface.

Confirmation de l’effet répulsif de SHH par un modèle in vitro :

Explant d’embryon de stade 24-25

Culture dans gel collagène

Bille-SHH Bille-BSA

Marquage des NC avec une molécule fluorescente

Résultat :

Pas de prologement d’axone en direction de la bille-SHH

Présence de prolongement d’axone en direction de la bille-BSA.

Effet répulsif de shh sur les AC du cordon spinal.

Conclusion et Discussion :

• Au début de la formation du TN, Shh a un effet attractant et permet la croissance des AC vers la PP du cordon spinal. Ces effets sont permis par les co-récepteurs Smo et Ptc exprimés par les AC.

• Puis Shh dirige les AC le long de l’axe longitudinal du cordon spinal en direction rostral oú on trouve des régions pauvres en Shh. Cet effet répulsif est permis par l’expression de Hip par les AC.

Grâce au technique de RNAi in ovo, on a identifié le rôle de shh dans le guidage axonal.

Quelques mécanismes incompris :

• Hip protéine membranaire de type I :– Pas de domaine intracellulaire.– La partie C(ter) est hydrophobe donc transmembranaire.

• Prb : Comment Hip transmet le signal pour la migration des AC au niveau rostral ?

• Réponse : Hip pourrait être un composant d’un récepteur complexe composé d’une unité liant SHH (Hip) et d’une unité transmettant le signal qui n’ pas été encore identifié.