Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi EgyetemTermészettudományi Kar

DIPLOMAMUNKA

Impedancia jelek fluktuációanalízise:

Sejtek mikromigrációjának matematikai ésbiológiai karakterizálása ECIS

(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)készülékben

KészítetteSchrempf Dóra

TémavezetőDr. Láng Orsolya

Semmelweis Egyetem,Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

KonzulensDr. Farkas Lóránt

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem,Analízis Tanszék

2018.

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke 3

1. Bevezetés 4

2. Irodalmi áttekintés 62.1. ECIS készülék és teória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.2. Zajanalitikai módszerek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2.1. Variancia számítás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.2.2. Standard deviáció számítás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.2.3. Inkrement számítás . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.2.4. Teljesítménysűrűség-spektrum . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.2.5. Hurst-analízis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.3. A Hurst exponens története . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.4. A Hurst exponens alkalmazásai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.4.1. Pénzügyben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.4.2. Szívverés és érzelmi minőség kapcsolatában . . . . . . . . . . . 142.4.3. Csapadék mennyiségének mérésében . . . . . . . . . . . . . . 152.4.4. Geomagnetikus mezőben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.4.5. Egyéb alkalmazásai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.5. A Hurst exponens kiszámítási módszerei . . . . . . . . . . . . . . . . 162.5.1. R/S-analízis algoritmusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162.5.2. Anis és Lloyd módszere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.5.3. GM1 módszer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.5.4. GM2 módszer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3. Célkitűzés 20

4. Anyag és módszer 214.1. Adatsorok előállítása . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.1.1. Generált adatsorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214.1.2. Biológiai adatsorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.1.2.1. Sejtek és tenyésztésük . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1

4.1.2.2. Mikromigráció mérés ECIS készülékben . . . . . . . 224.1.2.3. Kezelés és vizsgált vegyületek . . . . . . . . . . . . . 23

4.2. Software-es rutinok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234.2.1. Variancia, inkrement kiszámolására . . . . . . . . . . . . . . . 244.2.2. Teljesítménysűrűség-spektrum kiszámolására . . . . . . . . . . 254.2.3. Hurst exponens meghatározására . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.3. Statisztika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.3.1. Normalitás teszt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4.3.1.1. Shapiro-Wilk teszt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274.3.2. F-próba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284.3.3. Kétmintás t-próba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5. Eredmények 305.1. Számítógéppel generált adatsorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305.2. Biológiai adatsorok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345.3. Sejtmentes minták . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.3.1. Sejtes minták . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365.4. Sejtes és sejtmentes adatsorok statisztikai összehasonlítása . . . . . . 375.5. Tumorellenes szerekkel kezelt sejtek mikromigrációja . . . . . . . . . 38

6. Megbeszélés 39

7. Következtetések 41

8. Összefoglalás 43

Függelék 45

Irodalomjegyzék 56

2

Rövidítések jegyzéke

ECIS - Electric Cell-Substrate Impedance SensingH - Hurst exponensZ - ImpedanciaR - RezisztanciaC - Kapacitív ellenállásEKG - ElektrokardiográfiaVfazis - Fázis feszültségeVellenfazis - Ellenfázis feszültségeI - ÁramerősségD - FraktáldimenzióFFT - Gyors Fourier-transzformációDFT - Diszkrét Fourier-transzformációRR - Újraskálázott terjedelem-analízis, Rescaled Range AnalysisMRS - Módosított újraskálázott terjedelem-analízisMLE - Maximum Likelihood becslésAVT - Aggregált eltérési idő módszerGM1 - Első geometriai módszer a Hurst exponens kiszámításáraGM2 - Második geometriai módszer a Hurst exponens kiszámítására

3

1. fejezet

Bevezetés

Gimnáziumi tanulmányaim során a matematika mellett az egyik kedvenc tan-tárgyam a biológia volt. Már akkor is nagyon érdekesnek találtam az emberi testfelépítését és működését. Sajnos, mint oly sokan mások, én is megtapasztaltamközvetlen környezetemben, hogy milyen nagy baj, ha egy betegség megtámadja azemberi test tökéletes rendszerét. Így nem volt kérdés, hogy amennyiben lehetőségemadódik, tanulmányaimat az orvostudomány segítésére használjam.

Diplomamunkám egy három szemeszteres kutató munka eredménye, rengeteg sej-tes kísérlettel, melyek kiértékelésében és az eredmények értelmezésében nagy se-gítségünkre volt a matematika tudománya. A tumor-sejtek vizsgálatára ebben akutatásban a legfontosabb eszközünk az úgynevezett ECIS (Electric Cell-SubstrateImpedance Sensing) készülék volt, amely az idő függvényében, váltóáram alkalmazá-sa mellett képes a sejtek rezisztencia értékét detektálni szigetelő tulajdonságuknakköszönhetően. Ezen értékek tulajdonságai szerint kerestünk magyarázatot a gra-fikonban jól látható fluktuációra, a grafikon "szöszösségére", azaz az adatok zajjalvaló terhelésére, hiszen a zaj tartalmazhat információt a biológiai jelenségekről, melyösszefüggésben van az ECIS készülék elektródáját borító sejtek mozgásával, az ún.mikromigrációval. Lo és munkatársai kimutatták, hogy I. Giaver és C. R. Keeseáltal a XX. században megalkotott ún. Electric Cell-Substrate Impedance Sensing(ECIS) készülék által mért fluktuáció, nagy különbséget mutat daganatos és egész-séges sejtek között. A mérés során a gépben található arany elektródok felületénkitapadó sejtek morfológiai változásai, adhéziója és migrációja is valós időben nyo-mon követhető. A készülékben külön mérhető az impedancia (Z), a rezisztencia (R)és a kapacitív ellenállás (C), mely értékeket az idő függvényében kapunk meg.

A kutató munka legfőbb célja a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immun-biológiai Intézet kutatócsoportja segítségével végzett mérések során kapott idősorokjellemzésére alkalmas fontos paraméterek vizsgálata volt, úgy, mint a szórás, vari-

4

ancia, inkrement (növekmény), teljesítménysűrűség-spektrum és a Hurst exponens.Ezek közül számunkra a Hurst exponens volt a legérdekesebb, mivel korábbi vizs-gálatok nem tudták egyértelműen bizonyítani az alkalmazhatóságát mikromigrációeredmények értékelésében, illetve a sejtes és sejtmentes minták elkülönítésében. An-nak ellenére, hogy számos területen, például a kardiológiában (EKG), hidrológiában,pénzügyben és a meteorológiában is hasznos paraméternek bizonyult. Az irodalom-ban megtalálható a Hurst exponens kiszámítására alkalmas módszerek közül ötötvizsgáltunk, és hasonlítottunk össze, majd ezek MATLAB-ban való beprogramo-zása után EXCEL fájlban gyűjtöttük össze a kapott eredményeket. Az egyes szá-mítási módszerek alkalmazásakor akadályokba ütköztünk, míg végül megtaláltuk aszámunkra legmegfelelőbb módszert a Hurst exponens becslésére: az általunk GM2-nek nevezett módszert. Feladatom a sejtmentes és sejtes minták vizsgálatán túl, atumor ellenes vegyülettel kezelt sejt mintákból származó eredmények elemzése és ta-nulmányozása is volt. Végül nem volt más dolgunk, mint a matematikai statisztikasegítségével megvizsgálni, hogy a GM2 módszerrel meghatározott Hurst exponensismeretében eldönthető-e egy adatsorról, hogy az sejtes vagy sejtmentes mintábólszármazik-e, illetve, hogy a kezelt minták esetén milyen változás figyelhető meg azadatsorokban.

5

2. fejezet

Irodalmi áttekintés

2.1. ECIS készülék és teória

Az ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) egy valós idejű, elektromosimpedancia mérésen alapuló bioszenzor, amely képes folyamatosan követni a hozzácsatlakozó arany elektródok felszínén lévő sejtek viselkedését, tevékenységeit. Ezutóbbi közé tartozik a sejtek morfológiai változásai, illetve a sejtek vertikális irányúmozgásai. A mérés elvét, illetve az első készüléket Ivar Giaever és Charles R. Keese[1] alkották meg (2.1 ábra).

2.1. ábra. ECIS készülékAz ECIS készülék impedancia spektroszkópia elvén működik. Az áramkör táplálásá-ról egy váltóáramú generátor gondoskodik, mely különböző frekvenciájú (25 Hz-tól100 kHz), 1V feszültség amplitúdójú jelet szolgáltat [2]. A váltóáram amplitúdójaelég kicsi ahhoz, hogy a sejtekben ne hozzon létre detektálható biológiai változá-sokat. A készülék lelke egy olyan speciális plate, melynek alját arany elektródákborítják. Ebbe pipettázzuk a sejteket, és amikor a sejtek letapadnak, és elterülnekaz elektródákon, akkor a váltóáram ellenállása megváltozik, hiszen a sejtek hidrofóbsejtmembránjuknak köszönhetően szigetelő részecskékként viselkednek elektromostérben. Az impedancia érték változása fontos információt mond el a sejtek számá-

6

ról, méretéről, alakjáról és mozgásáról. A sejtek borította elektródákon az áramáthaladása a különböző frekvenciákon eltérő módon történik. Viszonylag alacsonyfrekvencia esetén (< 2000 Hz) az áram nagy része a szomszédos sejtek alatt ésközött folyik. Míg magasabb frekvencia esetén (> 40000 Hz) az áram nagy részeközvetlenül a szigetelő sejt membránokon keresztül folyik [3].

2.2. ábra. Alacsony frekvencián 2.3. ábra. Magas frekvencián

Az impedancia értékeken túl a gép képes meghatározni az áramkör két feszültség-komponensét, az Ohmikus (R) és a kapacitív (C) ellenállását:

R =VfazisI

, C =Vellenfazis

I

Ahol Vfazis jelöli a fázis feszültségét, Vellenfazis az ellenfázis feszültségét, és I azáramerősséget. Az újabb, ECIS Z Θ készülékkel már ellenállást (R) és kapacitást(C) is tudunk mérni különböző váltóáram frekvencia értékek mellett az időfüggvényében [2]. Az egyes paraméterek eltérő biológia jelenségek jellemzésérehasználhatók, például 4 kHz frekvencia érték mellet az Ohmikus ellenállás értékekorrelál az elektród lefedettségével, így a sejtek adhéziójával, míg alacsonyabbfrekvenciánál (pl. 400 Hz) inkább a barrier funkcióról, sejt-sejt kapcsolatokrólnyújt információt. A 2.4 ábrán egy sematikus görbe mutatja be az impedanciaérték változását egy kísérlet során. A sejtek kitapadásával párhuzamosan az értékenövekszik. Miután a sejtek teljesen elterültek, a mért impedancia elkezd fluktuálni.Ebben az esetben a fluktuáció a sejtek vertikális mozgásából, a mikromigrációbólered [1]. Feladatunk, hogy egy olyan matematikai paramétert keressünk, ami segíta jel fluktuációjának, azaz a görbe "szöszösségének" leírásában. Hiszen a fluktuációegyedi a különböző sejttípusokra, azaz úgy határozza meg, mint egy embert azujjlenyomata [4].

7

2.4. ábra. Az impedancia érték időfüggése, és változásának lehetséges okaiNapjainkban az ECIS készüléket a biológia számos területén alkalmazzák. Többekközött megfigyelhetjük a sejtek viselkedését, kémiai vegyületek hatását, mérhetjüka sejtek pusztulását, illetve a daganatos sejtek invazív jellegét [4],[5], valamint al-kalmazható az endothel sejtek barrier funkciójának vizsgálatára is [6], [7]. Mivel asejtek mozgási és morfológiai változásai nagy mértékben befolyásolják a készülékbenmérhető impedancia értékét.

2.2. Zajanalitikai módszerek

Hosszú biológiai adatsorok vizsgálatára több különböző zajanalitikai módszer is is-mert. A következő fejezetekben pár rutinszerűen alkalmazott módszert mutatunkbe, és kitérünk ezek biológiai alkalmazhatóságára.

2.2.1. Variancia számítás

Különböző eloszlások megkülönböztetésére, valamint a matematikában az elméletiszámításoknál gyakran használják a varianciát (más néven szórásnégyzetet). Azaz avariancia a valószínűségszámításban az eloszlásokat jellemző egyik fontos paraméter,illetve az elméleti statisztikában a szétszóródást megadó mérték [8]. A valószínű-ségszámításban is használt abszolút eltérésnél jobban jellemző paraméter, hiszenérzékenyebb a nagy eltérésekre, mely a definíciójából adódik:

V ar(X) = Cov(X,X) = E[(X − µ)(X − µ)] = E[(X − µ)2]

ahol X egy valószínűségi változó, E(X) = µ ezen változó várható értéke ésCov(X,X) a változó önmagával vett kovarianciája. Ebből

V ar(X) = E(XX)− E(X)E(X) = E(X2)− (E(X))2

8

azaz a szórásnégyzet nem más, mint a változó négyzetének várható értéke és aváltozó várható értékének négyzete közötti különbség.

A statisztikában a variancia torzítatlan becslése a következő:

V ar(X) =

n∑i=1

(xi − x)2

n− 1

aholX egy valószínűségi változó, xi ennek elemei, x az átlaga, n pedig az elemszáma.

A varianciaanalízis eljárások a biológiában a legszélesebb körben alkalmazotttechnikák közé tartoznak az adatok elemzésére. Széleskörű felhasználása mind akísérleti, mind a mintavételi tanulmányokban, azt mutatja, hogy a varianciaanalízisbizonyítottan könnyen érthető, értelmezhető módszertan. Mégis az irodalomban akutatók véleménykülönbsége jelentős a felhasználásáról és az értelmezéséről [9].

2.2.2. Standard deviáció számítás

A statisztikában az adatok változékonyságának általánosan használt mérőszáma astandard deviáció, vagy más néven a minta szórása. Az előző fejezetben említettvariancia másik megnevezése nem hiába szórásnégyzet, hiszen értéke megegyezik aszórás négyzetével. Azaz a szórás nem más, mint a variancia négyzetgyöke:

S(X) =√V ar(X) =

√√√√√ n∑i=1

(xi − x)2

n− 1

2.2.3. Inkrement számítás

Az inkrement szintén az elméleti statisztikában egy valószínűségi változó vizsgálatáraalkalmas paraméter. A paramétervektor egyes értékeit úgy kapjuk, hogy a változóvektorban az előtte és utána levő értékek különbségét képezzük.

Ii = Ri+1 −Ri−1 i = 2, . . . , n− 1

ahol n a változó vektor hossza. Az inkrement vektor első és utolsó eleme a definíciójamiatt megegyezik a változó vektor első és utolsó elemével.

I1 = R1 In = Rn

9

Az inkrement standard deviációja alkalmas a mikromigráció karakterizálására, azazarra, hogy mérjük vele a sejtek motilitását, és a rezisztencia jelek zaját. Lángés munkatársai [4] tanulmányukban megmutatták, hogy emelkedett érték a sejteknagyobb motilitását jelenti.

2.2.4. Teljesítménysűrűség-spektrum

Egy jel teljesítménysűrűség-spektrumán (más néven autospektrumán) a teljesítményfrekvenciák szerinti eloszlását értjük [10]. Azaz a fluktuáló idősor autospektrumamegadja a harmonikus összetevők hozzájárulását a jel teljesítményében. Egyperiodikus viselkedés a teljesítménysűrűség-spektrumban csúcsként jelenik meg.Ha az autospektrumban egy bizonyos frekvencián jelentős csúcsot tapasztalunk,akkor ez azt jelenti, hogy a megfelelő összetevőnek nagy az amplitúdója, azaz ezaz összetevő jelentős súlyt képvisel a jel teljesítményében. Amennyiben egyálta-lán nem tartalmaz csúcsot, az a periodikus viselkedés hiányát jelenti az idősorban [2].

A vizsgált adatsor autospektrumát a következőképp tudjuk kiszámolni a Fourier-transzformáció segítségével:

S(0) =1

N2|C0|2

S(k) =1

N2(|Ck|2 + |CN−k|2) k = 1, 2, . . . ,

N

2− 1

S(N

2) =

1

N2|CN/2|2

A fenti képletekben N jelöli a minta hosszát és Ck (k = 0, 1, . . . , N−1) pedig a min-ta Fourier-transzformáltját. Esetünkben a minta diszkrét Fourier-transzformáltját(DFT) a következő módon lehet meghatározni:

Ck =N−1∑j=0

cj exp2πijk

Nk = 0, 1, . . . , N − 1

ahol a cj (j = 0, 1, . . . , N/2) értékek a mintavételezett jel időtartománybeli értékei.Ezt az algoritmust arra használjuk, hogy az időtartománybeli mintavételezettjel értékeket frekvencia tartományba transzformáljuk. Abban az esetben, ha aminta hossza kettő hatvány, akkor gyors Fourier-transzformáltat (FFT) lehethasználni. Esetünkben a lehetséges mintahosszok miatt érdemesebb volt a diszkrétFourier-transzformáltat használni.

10

Végül az S(i) (i = 0, 1, . . . , N/2) értékeket osztjuk a mintavételi frekvenciával ésszorozzuk a minta hosszával. Így megkapjuk a vizsgált adatsor teljesítménysűrűség-spektrumát [2].

A fluktuáló jelek teljesítménysűrűség-spektrumának segítségével jól vizsgálha-tó a görbe "szöszössége". Ha azt látjuk, hogy a jel amplitúdója hosszú idő alattnagyot változik és kicsi a fluktuáció, akkor az autospektrum alacsony frekvenciásösszetevői nagyok. Ellenkező esetben az alacsony frekvenciás összetevők kicsik.

2.2.5. Hurst-analízis

A Hurst exponens egy numerikus becslést ad az idősor megjósolhatóságára. Azidősorok statisztikai elemzésének egyik célja, hogy a múltbeli adatokból követ-keztetni tudjunk ezen adatok jövőbeli változására. A módszer alapja, hogyfeltételezzük, a múltban tapasztalt trend várhatóértékben a jövőben is folytatódnifog. Jelöljük a vizsgált paramétert H-val, melynek értéke 0 és 1 közé esik. AHurst exponens matematikai definíciójának tekinthetjük, hogy H = 2−D, ahol Djelöli a fraktáldimenziót. Az értékek különböző jelentésekkel bírnak. Amennyiben0 < H < 0, 5, akkor a görbe viselkedését antiperzisztens viselkedésnek nevezzük,másnéven negatív autokorrelációnak. Ami számunkra azt jelenti, hogy ha ti−1

és ti időpillanatok között a görbén növekedés történt, akkor annak nagyobb avalószínűsége, hogy a következő időpillanatban ti és ti+1 között csökkenés lesz,és fordítva, ha a múltban csökkent, akkor a jövőben növekedni fog. A H = 0, 5

véletlen bolyongást jelöl. Ekkor nincs korreláció az idősor jelenlegi és jövőbeliértékei között, azaz nulla az autokorreláció. Amennyiben a paraméter értéke 0, 5

és 1 közé esik, a görbe úgynevezett perzisztens viselkedést követ, másnéven eztpozitív autokorrelációnak nevezzük. Ennek jelentése ellentétes a 0 és 0, 5 közöttiviselkedéssel, vagyis a görbe növekedését nagy valószínűséggel növekedés fogjakövetni, és csökkenés esetén hasonló viselkedés figyelhető meg [2], [11].

Az eddig felsorolt paraméterek mellett dolgozatomban a Hurst exponens fon-tosságát, alkalmazhatóságát vizsgáltuk biológiai minták esetén.

11

2.3. A Hurst exponens története

A Hurst exponens az alkalmazott matematika számos területén használt paraméter,úgy, mint a fraktálok, a káosz elmélet, a hosszú távú folyamatok, illetve a spektrálanalízis. A Hurst exponens becslését a matematikusokon kívül a biofizikusok, me-teorológusok, pénzügyi szakemberek és az informatikusok is használják. Azonbaneredete a hidrológiához kötődik, mégpedig az egyiptomi Nílus gátszabályozásához[12].Edwin Harald Hurst britt hivatalnok 1906-ban került Kairóba, majd ott tartózko-dása alatt beleszeretett a Nílusba, melynek tanulmányozásával, vizsgálatával telteknapjai. Látta, hogy az alsó gát nem tölti be a kívánt szerepét és szükség van egyvíztárolóval kombinált nagyobb gátra. Számításaihoz szüksége volt az előző évi víz-állásokra, ami hatalmas kutató munkát eredményezett. Megfigyelte, hogy a nagyobbáradásokat nagyobb valószínűséggel követnek nagyobb áradások és fordítva, kiseb-beket pedig kisebb áradások. Tehát nem optimális a csapadék mennyiség átlagátvenni és ez alapján kiszámítani a gát, illetve víztároló szükséges kapacitását, hanemnagyobb gátat kell építeni, mint ahogy azt a normális eloszlás adná. Ez a megfigyelésvezetett a róla elnevezett Hurst módszerhez [13].

2.5. ábra. Nílus 2.6. ábra. Edwin Harald Hurst

Később egy újfajta geometriai objektumnál, a fraktáloknál játszott fontos szerepet aHurst exponens modern technikákkal való becslése. Ezen objektumok népszerűsítéseegy amerikai matematikus, Benoit Mandelbrot nevéhez fűződik. A fraktál geometriaa tudomány szinte minden területén fellelhető, amely segít a körülöttünk lévő világmás szemszögből való szemlélésében. Fraktáloknak két csoportját különböztetjükmeg, úgy, mint a szabályos és a véletlen fraktálok. Utóbbi csoportba tartoznaka természetben fellelhető fraktálok, melyekkel már mindenki találkozhatott. Ilyenfraktál például a páfrány levél és a Sierpinski piramis.

12

2.7. ábra. Páfrány 2.8. ábra. Sierpinski piramis

Ezek fő tulajdonsága az önhasonlóság, melynek jelentése, hogy az adott objektumegy része hasonló magához az egész objektumhoz. Egy új, úgynevezett fraktáldi-menzió bevezetésére volt szükség, ami a következő összefüggésben áll az általunkvizsgált Hurst exponensel: D = 2 − H, ahol H jelöli a Hurst exponenst, D pediga fraktáldimenziót. Miszerint egy nagyobb Hurst exponenssel rendelkező idősor ki-sebb fraktáldimenzióval, azaz simább felszínnel rendelkezik. Míg egy kisebb Hurstexponenssel rendelkező idősor nagyobb fraktáldimenzióval, azaz érdesebb felszínnelrendelkezik [14], [2].

2.4. A Hurst exponens alkalmazásai

Nem meglepő, hogy a Hurst exponens kiszámítására több módszer is ismert, hi-szen a biológián és orvostudományon túl számos területen használják ezt a para-métert. Ilyen területek például a pénzügy, kardiológia, hidrológia, geomagnetika,fizika, meteorológia. A következő fejezetekben ezek közül néhányról részletesebbenis olvashatunk.

2.4.1. Pénzügyben

A Hurst exponens pénzügyi, tőzsdei vonatkozásban alkalmas annak vizsgálatára,hogy a mérsékelt kockázatú befektetési alapok, pénzpiaci-, hosszú kötvény-, ésingatlanalapok árfolyamának változása rendelkezik-e hosszú emlékezettel egy adottidőszakban.Annak ismerete, hogy az adott alap rövid- vagy hosszú emlékezettel rendelkezikolyan információt biztosít a befektetők számára, mely segíthet a jó befektetésistratégia kialakításában, illetve a megfelelő belépési pont megtalálásában [15].A Hurst exponens segítségével egyfajta mérőszámot kapunk a memóriáról: 1

jelöli, hogy teljesen emlékszik a múltra, 0, 5 a véletlen bolyongást, azaz csak arraemlékszik, hogy most hol van. 0 pedig, hogy még a mostani pozíciójára sememlékszik.

13

Az idősorok statisztikai elemzésének egyik célja, hogy a múltbéli adatokbóltudjunk következtetni az adatok jövőbeli alakulására. Így valamilyen mintázatbeazonosításából, és e mintázatnak a jövőre történő kiterjesztéséből áll. Vagyis aza feltételezésünk, hogy a múltban felismert trend a jövőben is folytatódni fog.A Hurst exponens becslésére az első ismert módszer az R/S-analízis volt. Az R/S-analízis különböző időperiódusokra kiszámolja a kumulált adatok átlag körüli inga-dozásainak R terjedelmét, majd ezt az adatok S szórásával elosztva standardizál-ja, ezért is nevezik újraskálázott terjedelem-analízisnek (angolul: Rescaled RangeAnalysis, röviden R/S-analízis). Feltevésünk szerint R

S(l) ∼ lH [11], ahol l jelöli az

egyes időperiódusok hosszát.

2.4.2. Szívverés és érzelmi minőség kapcsolatában

Tommaso Costa és munkatársai [16] megvizsgálták a pulzus idősorának Hurst ex-ponensét, és összefüggését az érzelmi minőséggel és az izgatottság mértékével. Akülönböző érzelmi filmingerek (boldogság, szomorúság, düh, félelem) hatása alattelektrokardiogrammot (EKG) készítettek. Az EKG görbe alapján számított pulzusidősorok Hurst exponense különbséget mutatott boldog és szomorú érzelmi állapo-tok között, de a negatív érzelmek esetén (szomorúság, düh, félelem) nincs különbség.Ami számunkra azt jelzi, hogy a Hurst exponens a szubjektív érzelmi minőség in-dikátora. Azaz a Hurst exponens ismeretében a boldogság és szomorúság érzéseketmeg tudjuk különböztetni, még negatív érzelmi állapotok esetén nincs különbség aHurst exponens értékében. Ez azt jelzi, hogy a strukturális változások a fiziológiaijelekben kapcsolatban vannak az érzelmi élmények szubjektív érzelmi minőségével.Az eredmények alátámasztják azt a feltételezést, mi szerint a szív jeleinek szerkezetifelépítése egy diszkrét tulajdonság, amely vált a negatív és pozitív érzelmek között.Pontosabban, nagy fraktáldimenzió esetén (ekkor az ismert H = 2 − D összefüg-gés miatt a Hurst exponens kicsi) a pozitív érzelmek dominálnak, míg a negatívérzelmek nagy Hurst értéket adnak. Larsen, Diener és Russel [17] [18] szerint a féle-lem és a düh jellemezhető hasonló érzelmi minőséggel, míg ez a minőség különbözőboldogság és szomorúság esetén. Ez a megállapítás összhangban van Barrett és Rus-sel [19] eredményeivel, akik megmutatták, hogy az izgatottság független az érzelmiminőségtől. Továbbá, Barrett [20] megmutatta, hogy az érzelmi minőség alapvető,invariáns építőköve az emberi elme képességéből eredő érzelmi életnek. Ezek az ered-mények azt sugallják, hogy a vegetatív folyamatok hozzájárulhatnak a kódoláshozés az érzelmi ingerek kitapasztalásához. Costa, Galati és Rognoni tanulmányábanelfogadott mérték a Hurst exponens, amely látszólag képes érzékelni az érzelmi fo-lyamatokban előforduló változásokat. Így a Hurst exponens kapcsolatot teremt akardiológiai folyamatok és az érzelmi élmények között. Ezért több vizsgálatot kell

14

végezni az érzelmi állapotok fiziológiai jeleiről új elemzési módszereket alkalmazva.És nem utólsó sorban ebben a tanulmányban megmutatták, hogy a Hurst exponensvizsgálata az ún. wavelet transzformációs módszerrel képes volt feltárni a kardioló-giai jelek sajátos tulajdonságait az érzelmi minőséggel kapcsolatban.

2.4.3. Csapadék mennyiségének mérésében

A Hurst hatás a hidrológiában jól megalapozott és általánosan elismert, mint egyfontos tulajdonsága a természet működésének [21], [22]. A csapadék Hurst exponen-sének vizsgálatát az motiválja, hogy az aszályok és árvizek ciklusai magyarázhatóka Hurst jelenség véletlen hatásaival [23], [24]. Jamal Munshi [25] tanulmányábanelemzi Anglia és Wales 1766 és 2016 közötti havi csapadékmennyiségét éves időskálánmind a 12 naptári hónapban. Eredményeiben nem található bizonyíték függőségre,hosszú távú memóriára vagy perzisztenciára. A tanulmányban azt kapta, hogy minda 12 vizsgált hónap csapadékmennyiségének Hurst exponense 0, 5-höz közeli, melyGauss véletlenszerűségre utal. Tehát a havi átlagos csapadékmennyiség idősorra úgytekinthetünk, mint ha Gauss sorozat lenne, és feltehető, hogy teljesül a függetlenségifeltétel.

2.4.4. Geomagnetikus mezőben

Paola De Michelis és Giuseppe Consolini [26] tanulmányukban megpróbálták jel-lemezni az északi félteken elhelyezett 45 földi geomágneses megfigyelő rendszerbőlszármazó rövid időskálájú mágneses tér ingadozások skálázási jellemzőinek térbelieloszlását. A geomagnetikus mező fluktuációjának skálázási tulajdonságainak vál-tozásait vizsgálták a lokális Hurst exponens becslésével és rekonstruálták ezt azindexet, mint a geomagnetikus aktivitási szint függvénye. Ez a leképezés lehetővétette számukra, hogy lokalizálják a zavarokért felelős és az ionoszférikus áramrend-szerekhez kapcsolódó különböző szélességi struktúrákat. Megállapították, hogy akülönböző ionoszférikus áramrendszerekhez kapcsolódó geomágneses tér fluktuáció-inak különböző méretezési jellemzői vannak, amit a lokális Hurst exponens bizonyít.Azt is belátták, hogy a lokális Hurst exponens általában csendes magnetoszférikusperiódusokra nagyobb, mint az aktívabb időszakaszokban, ami arra utal, hogy amegzavart periódusok folyamán aktivált dinamikai folyamatok felelősek a geomág-neses tér fluktuációjának változásaiért a természetben.

2.4.5. Egyéb alkalmazásai

A hidrológiai vizsgálatokban gyakran használják a Hurst analízist, ezért a Hurst ex-ponens kiszámítására számos különböző becslési módszer ismert. Byung-Sik Kim,

15

Hung-Soo Kim és Sun-Hong Min [27] tanulmányában hét különböző módszert hasz-nálnak erre a becslésre, úgy mint, a korrigált terjedelem analízist, az újraskálázottterjedelem analízist (RR), a módosított újraskálázott terjedelem analízist (MRR), az1fautospektrum analízist, a maximum Likelihood becslést (MLE), a DFA módszert,

és az aggregált eltérési idő módszert (AVT). Megállapították, hogy a DFA módszera legmegfelelőbb a Hurst exponens becslésére, mind a rövidtávú memória, mind ahosszútávú memória esetén. Azt találták, hogy a SOI (déli oszcillátorok indexe)sorozatok -melyek nem lineáris idősorok, és hosszútávú memóriával rendelkeznek-Hurst exponense 0, 92, míg a hasonló tulajdonságú fa gyűrű sorozatok Hurst expo-nense 0, 97.

2.5. A Hurst exponens kiszámítási módszerei

A Hurst exponens kiszámítására több módszer is ismert, melyek a következő alfeje-zetekben olvashatók időrendi sorrendben.

2.5.1. R/S-analízis algoritmusa

A Hurst exponens kiszámítására alkalmazott első és legnépszerűbb módszer azR/S-analízis volt, mely Mandelbrot és Wallis [28] nevéhez fűződik, és Hurst [29]tanulmányán alapszik. Az R/S módszer -melyet először Mandelbrot [30],[31]vezetett be a közgazdaságtanban- különböző időperiódusokra kiszámolja a ku-mulált adatok átlag körüli ingadozásainak R terjedelmét, majd ezt az adatok S

szórásával elosztva standardizálja, ezért is nevezik újraskálázott terjedelemnek(Rescaled Range, RR). Feltehető, hogy a feldolgozandó idősorunk n darab adatottartalmaz. Ezt az adatsort szeretnénk felosztani különböző hosszúságú szakaszokra.Jelölje l a szakaszok hosszát és s a szakaszok számát. Egy lépésben a szakaszokhossza legyen azonos és legalább 10-20 adatot tartalmazzon egy szakasz, azaz ahosszuk legyen minimum 10-20. A j-edik szakaszon a következőképp számoljukki RR-t. Jelöljük Ei-vel az ezen a szakaszon mért ellenállások értékeit (i = 1, 2, ..., l).

1. lépés: Szükségünk van a rezisztencia értékek átlagára: m = E1+E2+...+Ell

.2. lépés: Számoljuk ki az értékek eltérését a kapott átlagtól: Di = |Ei −m|.3. lépés: Képezzük a következő összegeket: (t = 1, 2, ..., l)

Pt =t∑i=1

Di

4. lépés: Ezen Pt értékek maximumának és minimumának különbsége adja idősor

16

R-rel jelölt terjedelmét: R(l) = max(P1, ..., Pl)−min(P1, ..., Pl).5. lépés: A standardizáláshoz határozzuk meg az S-sel jelölt Ei értékek szórását,más néven a standard deviációját:

S(l) =

√√√√1

l·

l∑i=1

(Ei −m)2

6. lépés: Az úgynevezett Rescaled Range-t pedig úgy kapjuk meg, hogy az R-etelosztjuk a standard deviációval: R

S= R(l)

S(l).

7. lépés: Számoljuk ki az összes szakaszra az R/S értéket és vegyük átlagukat.

Mivel a következő összefüggés teljesül: (R/S)l ≈ c · lH , ezért a H-val jelöltHurst exponens lineáris regresszióval megkapható: log (R/S)l = log c + H · log l ⇒H = log (R/S)l−log c

log l[2], [32].

Sanchez Granero és munkatársai az R/S analízist tesztelték több Brown mozgásbólszármazó adatsorra, és azt figyelték meg, hogy az l érték, azaz a szakaszokhosszának a megválasztása nagy mértékben hatással van a kapott átlagok, illetvestandard deviációk értékeire [32]. Amennyiben l elég nagy, az átlag közelebb kerül avalós 0, 5 értékhez. Kis l értékek esetén az átlag nő. Tehát ahhoz, hogy megfelelőenhasználjuk az R/S analízist, nagy l értéket kell választanunk, ez azonban nemlehetséges rövid adatsorok esetén. Így az R/S analízis használatakor problémábaütközhetünk, ha nem elég hosszú az adatsorunk. Továbbá még egy probléma, hogykvantált adatokkal dolgozunk, ezért kis l értékre előfordulhat, hogy a standarddeviáció nulla, illetve a standard deviáció miatt a módszer érzékeny a kerekítésre.

2.5.2. Anis és Lloyd módszere

A Nílus gátszabályozásakor működő R/S módszer sajnos a gyakorlatban, más időso-rok esetén nem adott mindig pontos, értelmezhető értékeket. Ezért más módszerekis születtek H kiszámítására. Például Anis és Lloyd [33] egy új módszerrel állt elő.Először a következő formulával kiszámítjuk az E(R/S)l értéket:

E(R/S)l =

l− 1

2

l· Γ( l−1

2)

√π·Γ( l

2)·l−1∑i=1

√l−ii

ha l ≤ 340

l− 12

l· 1√

l·π2

·l−1∑i=1

√l−ii

ha l ≥ 340

Majd a H-val jelölt Hurst exponenst úgy kapjuk, hogy 0, 5-höz hozzáadjuk az(R/S)l − E(R/S)l görbe meredekségét. Azonban ekkor Sanchez Granero és mun-katársainak [32] cikkében (és nálunk is) a kapott H érték negatív lehet, aminek

17

nincs értelme. Ezt a problémát elkerülve E(R/S)l meghatározása után a következőszámítást javasolják cikkükben:

logHl = log (R/S)l − log (E(R/S)l) + log (l)/2

Végül lineáris regresszióval meghatározzuk a Hurst exponenst:

logHl = log c+H · log l

Ez a módszer abból indul ki, hogy normális eloszlású a zaj. Amennyiben ez nemteljesül (nálunk ez a kvantálás miatt vitatható), akkor nem garantált, hogy helyesH értéket kapunk.

2.5.3. GM1 módszer

A Hurst exponens becslésére a geometriában a következő formula [32] is ismert:

∆B α lH

ahol ∆B = |B(t+ l)−B(t)| , l jelöli a szakaszok hosszát, H a Hurst exponenst, ésα egy arányszám. Először felosztjuk az n hosszú adatsort s szakaszra, melyek hosszal és minden m = 1, ..., s -re végezzük el a következő számításokat:

1. Sm = Xml −X(m−1)l+1

2. Hl = mean{Sm : m = 1, ..., s}.

Ekkor lineáris regresszióval a Hurst exponens kiszámítható:

logHl = log c+H log l

2.5.4. GM2 módszer

Az előző módszer már helyes H értéket ad eredményül, azonban a GM1 módosítá-sával kapott GM2 módszer pontosabb megoldást adhat:

range(B) α lH

ahol range(B) = max{B(S) : t ≤ S ≤ t+ l} −min{B(S) : t ≤ S ≤ t+ l}.

Több véletlen bolyongásból származó adatsorra tesztelve a GM1 módszert ésennek módosítását, a GM2 módszert, Sanchez Granero és munkatársainak [32]cikke alapján azt állíthatjuk, hogy mindkettő megfelelően működik, hiszen Brown

18

mozgásra mindkettő 0, 5-höz közeli Hurst exponenst ad eredményül. A cikk [32]szerint a standard deviáció kisebb volt a GM2 módszernél, mint a GM1-nél. Ezért,amennyiben lehetőségünk van a GM2 módszert alkalmazni, ez a módszer pontosabbértéket ad.

19

3. fejezet

Célkitűzés

A diplomamunka készítése során az alábbi célokat tűztük ki:

1. A Hurst exponens biológiai fontossága, alkalmazhatósága és az irodalombanmegtalálható számítási módszerek beprogramozása, illetve összehasonlítása.

(a) Minta adatsorok generálása különböző Hurst értékekre és ezek teszteléseaz irodalomban található módszerekkel.

(b) Biológiai mintából származó adatok vizsgálata a módszerekkel.

(c) Sejtek kezelésének hatásai a Hurst exponensre.

2. Egyéb zajanalízisre alkalmas paraméterek alkalmazása és összevetése.

3. Az eredmények elemzése és a Hurst exponens számításának korlátai.

20

4. fejezet

Anyag és módszer

4.1. Adatsorok előállítása

4.1.1. Generált adatsorok

Először különböző H értékekre generáltunk adatsorokat az R programban beépítettfüggvény segítségével. A függvény két bemeneti paramétere n, azaz a minta elem-száma (ami a mi esetünkben 3600, mivel ennyi a biológiai minták hossza), és H, aHurst exponens (H = 0; 0, 1; 0, 2; 0, 3; 0, 4; 0, 5; 0, 6; 0, 7; 0, 8; 0, 9; 1).

4.1.2. Biológiai adatsorok

Majd a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet kutató cso-portja által, az ECIS készülék segítségével generált adatokat teszteltük. Ezen ada-tok egy része sejtmentes mintából, míg másik része sejtes mintából származott. Astatisztikai elemzés során legfőbb célunk, hogy a két minta a Hurst exponens isme-retében szignifikánsan megkülönböztethető legyen.

4.1.2.1. Sejtek és tenyésztésük

A biológiai kísérletekhez egy 56 éves hasnyálmirigy tumoros betegből izolált,PANC1 sejtvonalat használtunk, amelyet standard sejttenyészeti körülményekközött tenyésztettünk. A sejteket steril környezetben, 37 Celsius fokon, 5% CO2tartalom mellett növesztettük, DMEM médiumban, amit kiegészítettünk 2mg/mlglutaminnal, 10% FBS-sel és 1% penicillin-Streptomicin komplexszel. A tenyésze-teket 3 naponta, 90%-os konfluenciánál passzáltuk a 4.1.2.2. fejezetben említettlépéseknek megfelelően.

21

4.1. ábra. PANC1 sejtek morfológiája fáziskontraszt mikroszkópban ([34])

4.1.2.2. Mikromigráció mérés ECIS készülékben

A mérés előkészületeit a steril munkavégzést lehetővé tevő, úgynevezett laminárisboxban végeztük. A biológiai kísérlet menete röviden a következő volt.

Először csak a sejttenyésztésre használt médiumot teszteltük az ECIS készü-lékben. Ehhez az arany elektródokat tartalmazó ECIS 96W1E típusú platewell-jeibe 200µl sejttenyésztő oldatot pipettáztunk. Ezután a plate-et belehelyeztüka gép mérőegységébe, amely az inkubátorban volt található, így biztosítva a sejtekszámára a megfelelő közeget, ami 37 Celsius fokot és 5% szén-dioxidot jelent. Egyrövid ekvilibrációt (kb. 1 h) követően az impedancia mérésre az alábbi beállításokmellett került sor:

1. AC frekvencia = 4000Hz

2. Mintavételi frekvencia 2 minta másodpercenként

3. Mérés időtartama fél óra (így 3600 hosszú adatsorokat kaptunk).

Az alapvonal vagy sejtmentes minta mérését követően sejteket adtunk a rendszerhez.A sejtoldat előkészítése passzálás során történt, melynek főbb lépései a következők.Először a sejtekről leöntöttük a kondicionált médiumot, majd foszfát pufferben (pH7, 4) mostuk őket, így eltávolítva a halott sejteket, illetve a sejttörmelékeket. Ahhoz,hogy megszüntessük a sejtek kitapadását a tenyésztésre használt flaskában, úgyne-vezett trypszin enzimet pipettáztunk a sejtekre. A sejtek leválását mikroszkópbanellenőriztük, majd a reakciót friss médiummal leállítottuk. A sejtoldatot lecentri-fugáltuk 200g-vel majd médiumot cseréltünk a sejteken. Neubauer hemocytometersegítségével, mikroszkópban megszámoltuk a sejteket majd higítottuk 105 sejt/mlvégkoncentrációra. Végül a plate-et kivettük az ECIS készülék mérőfejéből és sterilkörülmények között a well-ekbe pipettáztuk. Az alkalmazott sejtdenzitás 104 sejt/-well volt. A korábban beállított paraméterek mellett folytattuk a mérést. A sejtek

22

kiültetését követő 24 órában csak a kitapadást monitoroztuk, majd a kívánt adhé-zió beállta után a korábban említett beállítások mellett elvégeztük a mikromigrációmérését. A kapott adatok közül (Z,C,R) a valós ellenállás értékeket használtuk amatematikai elemzésnél.

4.1.2.3. Kezelés és vizsgált vegyületek

Végeztünk olyan méréseket is, ahol a korábban bemutatott mikromigráció méréseketkövetően (24− 26h-nál), a sejteket tumor ellenes szerekkel megkezelve is monitoroz-tuk a mikromigrációt (5.6).

4.2. Software-es rutinok

Ahhoz, hogy a generált és a biológiai adatsorokat az előző fejezetekben bemuta-tott zajanalitikai módszerek segítségével elemezni tudjuk, MATLAB-ban rutinokatírtunk ezek meghatározására.

23

4.2.1. Variancia, inkrement kiszámolására

A variancia, inkrement és ennek standard deviációjának kiszámolására MATLABrutint írtunk, melynek bemenete egy R vektor, mely tartalmazza a mért rezisztenciaadatokat (R értékek), és az adatsor hossza, azaz a vektor elemszáma.

1 f unc t i on [ Rstd , Rvar , Rincrement , Rincsd ]= va r i an c i a (R, hossz )2

3 f o r i =1: hossz : l ength (R)−hossz4 Ratlag ( c e i l ( i / hossz ) )=mean(R( i : i+hossz −1) ) ;5 end6

7 Rstd=std ( Ratlag ) ;8 Rvar=var ( Ratlag ) ;9

10 Rstd11 Rvar12

13 f o r i =2: l ength ( Ratlag )−114 Rincrement ( i )=Ratlag ( i +1)−Ratlag ( i −1) ;15 end16

17 Rincrement (1 )=Ratlag (1 ) ;18 Rincrement ( l ength ( Ratlag ) )=Ratlag ( l ength ( Ratlag ) ) ;19

20 Rincsd=std ( Rincrement ) ;21

22 Rincsd23

24 end

MATLAB rutin - Variancia és inkrement számítás

24

4.2.2. Teljesítménysűrűség-spektrum kiszámolására

Az irodalmi áttekintésben leírt számítás alapján, a Fourier-transzformáció beépítettfüggvényének segítségével egy idősor autospektrumának kiszámítására írt rutin akövetkező. A függvény bemenetként a vizsgált rezisztencia értékeket kapja. Ahhoz,hogy meghatározza az autospektrum vektor egyes elemeit, szüksége van az adatsorhosszára (N), és az adatsor Fourier-transzformáltjára (C). Végül kiszámolja agörbére illesztett egyenes meredekségét.

1 f unc t i on [ p , Aspec ]= autospec (X)2

3 N=length (X) ;4 C=f f t (X) ;5 C=C(1 :N) ;6 C;7

8 S (1) =(1/N^2) ∗( abs (C(1) ) ) ^2;9 f o r k=2:N/2−1

10 S(k )=(1/N^2) ∗ ( ( abs (C(k ) ) )^2+(abs (C(N−k ) ) ) ^2) ;11 end12 S(N/2)=(1/N^2) ∗( abs (C(N/2) ) ) ^2;13

14 f o r i =1:N/215 Aspec ( i )=(S( i ) /2) ∗N;16 end17

18 p = p o l y f i t (1 :1800 ,10∗ l og10 ( Aspec ) ,1 ) ;19 x1 = l i n s p a c e (0 ,1800) ;20 f 1 = po lyva l (p , x1 ) ;21 p lo t (1 :1800 ,10∗ l og10 ( Aspec ) )22 hold on23 p lo t ( x1 , f1 , ’ r−− ’ )24

25 Aspec26

27 end

MATLAB rutin - Teljesítménysűrűség-spektrum számítás

25

4.2.3. Hurst exponens meghatározására

A Hurst exponens kiszámítására alkalmas, előző fejezetekben bemutatott öt mód-szerre írt MATLAB rutin a következő. A rutin bemenetként kap egyX vektort, melytartalmazza a mért rezisztencia adatokat (R értékek), majd eredményül megadja azöt különböző módszerrel meghatározottH értéket (Hcl,Hal1, Hal2, Hgeo1, Hgeo2).

1 rangek =200: f l o o r ( l ength (X) /5) ;2 [ rs , e r s ]=RSana(X, rangek , ’ Hurst ’ ) ;3 F i l t e r=~isnan ( r s ) ;4 l r s=log10 ( r s ( F i l t e r ) ) ;5 l r angek=log10 ( rangek ( F i l t e r ) ) ;6 Hcl=p o l y f i t ( l rangek , l r s , 1 )7 f i g u r e (1 ) ;8 p lo t ( l rangek , l r s , l rangek , l rangek ∗Hcl (1 ) ) ;9 lH=l r s−l og10 ( e r s ( F i l t e r ) )+l rangek /2 ;

10 Hal2=p o l y f i t ( l rangek , lH , 1 )11 f i g u r e (2 ) ;12 p lo t ( l rangek , lH , l rangek , l rangek ∗Hal2 (1 ) ) ;13 Hal1=p o l y f i t ( rangek ( F i l t e r ) , r s ( F i l t e r )−e r s ( F i l t e r ) , 1 )14 f i g u r e (3 ) ;15 p lo t ( l rangek , lH , l rangek , l rangek ∗Hal1 (1 ) ) ;16 r s=RSana2 (X, rangek , ’Geo1 ’ ) ;17 lH=log10 ( r s ) ;18 l r angek=log10 ( rangek ) ;19 Hgeo1=p o l y f i t ( l rangek , lH , 1 )20 f i g u r e (4 ) ;21 p lo t ( l rangek , lH , l rangek , l rangek ∗Hgeo1 (1 ) ) ;22 r s=RSana2 (X, rangek , ’Geo2 ’ ) ;23 lH=log10 ( r s ) ;24 l r angek=log10 ( rangek ) ;25 Hgeo2=p o l y f i t ( l rangek , lH , 1 )26 f i g u r e (5 ) ;27 p lo t ( l rangek , lH , l rangek , l rangek ∗Hgeo2 (1 ) ) ;

MATLAB rutin - Hurst exponens kiszámításai

Ez a rutin az RSana2 függvényt használja, ami a függelékben megtalálható.

4.3. Statisztika

A matematikai statisztika segítségével megvizsgáltuk, hogy az előbbiekbenmeghatározott (GM2 módszerrel számolt) Hurst exponens ismeretében egy adatsor-ról szignifikánsan eldönthető-e, hogy az sejtmentes vagy sejtes mintából származik-e.

26

Feladatunk, hogy a H0-lal jelölt nullhipotézis és a H1-gyel jelölt alternatívhipotézis (ellenhipotézis) között döntsünk. Esetünkben a hipotézisek:

H0 : Hurst exponens nem megfelelő paraméterversus

H1 : Hurst exponens megfelelő paraméter

ahol azt mondjuk, hogy a Hurst exponens akkor megfelelő, ha a sejtmentes adatokesetén számolt H érték nem azonos a sejtes adatok esetén számolt H értékkel. Hamegegyezik a kettő, akkor a Hurst exponens nem megfelelő.

Ezután csak egy számunkra megfelelő statisztikai próbát kellett találnunk,melynek feltételei teljesülnek és így használni is tudjuk. Olyan statisztikára voltszükségünk, amely azt vizsgálja, hogy két külön mintában egy-egy valószínűségiváltozó átlagai egymástól szignifikánsan különböznek-e. Ez nem más mint a két-mintás t-próba. Azonban mielőtt használtuk a tesztet, le kellett ellenőriznünk, hogyfeltételei teljesülnek-e a vizsgált adatsorokra, azaz, hogy normális eloszlásúak-e,illetve, hogy szórásuk megegyezik-e.

4.3.1. Normalitás teszt

A statisztikában a normalitás tesztet arra használják, hogy eldöntsék egy adatsorról,hogy az normális eloszlású-e. Több erre alkalmas tesztet ismerünk. Razali és Wah[35] tanulmánya szerint a legnagyobb ereje a Shapiro-Wilk tesztnek van.

4.3.1.1. Shapiro-Wilk teszt

Shapiro-Wilk [36] teszt esetén adott egy n hosszú adatsor, melyről el szeretnénkdönteni, hogy normális eloszlást követ-e.

1. lépés: Rendezzük növekvő sorrendbe az adatokat: x1 ≤ x2 ≤ · · · ≤ xn

2. lépés: Számoljuk ki a következő összeget:

SS =n∑i=1

(xi − x)2

ahol x jelöli az adatok átlagát.3. lépés: Ha n páros , akkor m = n

2. Ha n páratlan, akkor m = n−1

2.

4. lépés: Számoljuk ki b-t a következőképp:

b =m∑i=1

ai(xn+1−i − xi)

27

ahol az ai értékeket a Shapiro-Wilk 1. táblából (8.1) olvashatjuk le. Megjegyezzük,hogy ha n páratlan, akkor a medián értékét nem használjuk b kiszámításában.5. lépés: Számoljuk ki a teszt statisztikát:

W = b2/SS

6. lépés: A kapott W érték és n ismeretében a Shapiro-Wilk 2. táblából (8.2)leolvasható a teszt p értéke.

Amennyiben a kapott p érték > 0, 05, akkor a nullhipotézist fogadjuk el,miszerint az adatsor normális eloszlású.

4.3.2. F-próba

A kétmintás t-próba másik feltétele, két normális eloszlású változó szórásánakegyenlősége F-próbával ellenőrizhető.

Legyen X ∼ N (µ1, σ21) és Y ∼ N (µ2, σ

22) két ismeretlen paraméterű, normá-

lis eloszlású háttérváltozó. A szórások egyenlőségének tesztelésére vonatkozóhipotézis vizsgálat a következő:

H0 : σ1 = σ2 versus H1 : σ1 6= σ2

Az n1 elemű X1, . . . , Xn1 ∼ N (µ1, σ2) független, azonos eloszlású és az Y1, . . . , Yn2 ∼

N (µ2, σ2) független, azonos eloszlású, egymástól is független minták alapján vizsgá-

lódunk. Tudjuk, hogy (n1− 1)S∗X2/σ2

1 ∼ χ2(n1− 1) és (n2− 1)S∗Y2/σ2

2 ∼ χ2(n2− 1)

függetlenek. Leosztva őket külön-külön a saját szabadságfokukkal, majd a hányado-sukat véve F(n1 − 1, n2 − 1)-eloszlású valószínűségi változót kapunk. H0 fennállásaesetén a hányados:

F (X,Y) =S∗X

2

S∗Y2

így ezt a próbastatisztikát vezetjük be. Ezután 1 − ε szinten elutasítjuk H0-t, haF (X,Y) ≥ Fε/2(n1− 1, n2− 1), ahol a megfelelő szabadságfokú F-eloszlás (1− ε/2)-kvantilise a kritikus érték [37].

4.3.3. Kétmintás t-próba

A kétmintás t-próbát [37] kis mintákra szokták alkalmazni, melyek szükségképpennormális eloszlásúak, és szórásuk megegyezik. A próbát normális eloszlás várha-tó értékének tesztelésére vagy két normális várható érték összehasonlítására hasz-

28

nálják. A kétmintás jelző arra utal, hogy két tetszőleges várható értékű, de azo-nos szórású háttérváltozót vizsgálunk. (Két normális eloszlású változó szórásánakösszehasonlítására az F-próbát használhatjuk.) Legyenek ezek: X ∼ N (µ1, σ

2) ésY ∼ N (µ2, σ

2). Ezen belül megkülönböztetünk egyoldali és kétoldali alternatívát.Nekünk most az utóbbira volt szükségünk. A hipotézis vizsgálat ekkor:

H0 : µ1 = µ2 versus H1 : µ1 6= µ2

Az n1 elemű X1, X2, . . . , Xn1 ∼ N (µ1, σ2) független, azonos eloszlású és az n2 ele-

mű Y1, Y2, . . . , Yn2 ∼ N (µ2, σ2) független, azonos eloszlású, egymástól is független

mintákból konstruált próbastatisztika:

t(X,Y) =X − Y√

(n1 − 1)(S∗X)2 + (n2 − 1)(S∗Y )2·

√n1n2(n1 + n2 − 2)

n1 + n2

és az 1− ε szignifikanciaszinthez konstruált kritikus tartomány:

Xk = {(x,y) : |t(x,y)| ≥ tε/2(n1 + n2 − 2)}

ahol (n1−1)(S∗X)2+(n2−1)(S∗

Y )2

σ2 ∼ χ2(n1 + n2 − 2).

Tehát a nullhipotézisünket 1 − ε szinten elfogadjuk, ha a mintarealizációbólszámolt |t(x,y)| < tε/2(n1 + n2 − 2), különben pedig elutasítjuk.

29

5. fejezet

Eredmények

5.1. Számítógéppel generált adatsorok

Az R program egy beépített függvénye (fbmSim) segítségével több különböző Hurstexponenssel rendelkező adatsort generáltunk, megadva az elemszámot (3600) és aH értéket (0; 0, 1; 0, 2; 0, 3; 0, 4; 0, 5; 0, 6; 0, 7; 0, 8; 0, 9; 1).

5.1. ábra. H = 0 - fehér zaj

5.2. ábra. H = 0, 1

30

5.3. ábra. H = 0, 2

5.4. ábra. H = 0, 3

5.5. ábra. H = 0, 4

5.6. ábra. H = 0, 5 - véletlen bolyongás

31

5.7. ábra. H = 0, 6

5.8. ábra. H = 0, 7

5.9. ábra. H = 0, 8

32

5.10. ábra. H = 0, 9

5.11. ábra. H = 1 - lineáris görbe

Ezen adatsorok eredményeit tartalmazó táblázat a következő:

5.1. táblázat. Generált adatsorokHcl Hal1 Hal2 Hgm1 Hgm2

H = 0 0,6092 -0,7572 0,1084 -0,0813 0,0921H = 0, 1 1,0009 -0,4831 0,5001 -0,1365 0,2410H = 0, 2 0,9666 -0,5004 0,4658 0,2876 0,3203H = 0, 3 1,0226 -0,4129 0,5218 0,1660 0,4361H = 0, 4 0,9332 -0,4767 0,4324 0,4252 0,3522H = 0, 5 1,0030 -0,4362 0,5022 0,5754 0,5582H = 0, 6 0,9913 -0,4061 0,4905 0,7281 0,7006H = 0, 7 0,9849 -0,3978 0,4841 0,5889 0,6970H = 0, 8 0,9640 -0,3951 0,4632 0,8489 0,8061H = 0, 9 1,0478 -0,3465 0,5470 0,9565 0,9294H = 1 0,9975 -0,3742 0,4967 0,9941 0,9606

A táblázatról leolvasható, hogy generált adatsorok esetén a klasszikus, az első Anis-Lloyd és a GM1 módszerrel kapott H értékek több esetben tartományon kívül estek,míg a GM2 módszerrel nem kaptunk rossz H értéket, ez a módszer adta a legjobbanközelítő Hurst értéket.

33

5.2. Biológiai adatsorok

Az ECIS készülékkel mért sejtes és sejtmentes minták különböző zajanalitikai mód-szerekkel kapott eredményeit tartalmazó EXCEL táblázatokat (8.4, 8.6) a következőfejezetekben kiértékeltük, elemeztük. Illetve mindkét esetben egy-egy konkrét pél-dán keresztül szemléltettük, vizsgáltuk a kapott eredményeket.

5.3. Sejtmentes minták

A sejtmentes minták huszonegy mérése közül (8.4) első lépésben kizártuk azokat,amelyek alkalmatlanok voltak a statisztikai elemzésre. Ebben az esetben két méréstkellett kizárnunk. Az első a hetedik mérés, hiszen ebben az esetben negatív GM1módszerrel számolt Hurst exponenst kaptunk, amely érték nem felel meg a Hurstexponens definíciójának, miszerint 0 < H < 1. Ennek oka a módszer érzékenységea mesterséges rezgésre, hiszen nagy a variabilitás, azaz növelve az ablakot csökkena range (értékkészlet, bejárt tartomány). Míg a GM2 módszer ebben az esetbenis jó H értéket ad, mivel kiszámításában range helyett a maximum és minimumkülönbsége szerepel, amely nem érzékeny erre. A tizenharmadik mérés kizárásánakoka pedig az 1-nél nagyobb GM1 és GM2 módszerrel számolt Hurst exponens volt.Ez annak köszönhető, hogy a kapott rezisztencia értékek görbéje konvex. A va-rianciát és az inkrement standard deviációját különböző (4, 16, 64, 256 másodperc)időintervallumokra számoltuk ki. A táblázatból leolvasható, hogy sejtmentes adat-sorok esetén a variancia csak legfeljebb tízes nagyságrendű, az inkrement szórásamindig ezernél kisebb minden időintervallumra. Míg az autospektrum −0, 001 és−0, 01 közötti érték. A különböző módszerekkel számolt H értékeket összehasonlít-va jól látható, hogy a klasszikus (Hcl) és az első Anis-Lloyd (Hal1) módszer rosszH értékeket adnak, hiszen nem felelnek meg a definíciónak, tartományon kívüli ér-téket adnak. Előbbinél majdnem minden esetben 1-nél nagyobb Hurst exponensadódik, míg utóbbinál minden érték negatív. A másik három módszerrel számoltHurst értékek (Hal2, Hgeo1, Hgeo2) eleget tesznek az előbbi feltételnek.

34

5.3.1. Példa. Egy kiválasztott sejtmentes mérés eredményei:

5.12. ábra. Rezisztencia értékekA mért rezisztencia (R) értékek 1865 és 1870 között mozogtak.

5.13. ábra. Teljesítménysűrűség-spektrumAz autospekrtum görbéjére illesztett egyenes meredeksége −0, 0037.Ennél a példánál a variancia és az inkrement szórásának értékei:

5.2. táblázat. Variancia és inkrement szórása4 16 64 256

Var 0,7816 0,7803 0,7863 0,8103Inc sd 88,0209 176,0431 349,6402 677,9757

Látható, hogy az időintervallumok növekedésével a variancia és az inkrement szórásais növekszik.És végül a különböző módszerekkel számolt Hurst exponensek:

5.3. táblázat. Hurst exponensHcl Hal1 Hal2 Hgm1 Hgm21,2620 -0,4491 0,7612 0,8169 0,4953

Ennél a példánál is azt tapasztaltuk, hogy a klasszikus és az első Anis-Lloyd módszertartományon kívüli H értéket adott. Egy sejtmentes idősortól azt várjuk, hogy annakHurst exponense 0, 5-höz közeli, amit legpontosabban a GM2 módszer közelít.

35

5.3.1. Sejtes minták

A sejtes minták húsz mérése közül (8.6) az előbbi szempontok szerint haladva mostelőször kizártuk azokat, amelyek alkalmatlanok voltak az általunk vizsgált zajana-litikai módszerekre. Ebben az esetben csak egy mérést kellett kizárnunk, mert azadatsor kevesebb R értéket tartalmazott, mint a többi. Ennek oka a mérési időrövidsége lehetett. A varianciát és az inkrement standard deviációját ebben azesetben is különböző (4, 16, 64, 256 másodperc) időintervallumokra számoltuk ki.A sejtes adatsorok esetén, a sejtmentes mintáktól eltérően a variancia értékek ésaz inkrement szórása százas-ezres nagyságrendűek minden időintervallumra, és ateljesítménysűrűség-spektrum −0, 010 és −0, 015 közötti érték. Ebben az esetben isvizsgáltuk a különböző módszerekkel számolt H értékeket, és hasonlóan az előzőhözitt is rossz értékek adódtak a klasszikus és az első Anis-Lloyd módszerrel, míg amásik három módszerrel látszólag helyes értékek adódtak.

5.3.2. Példa. Egy kiválasztott sejtes mérés eredményei:

5.14. ábra. Rezisztencia értékekA mért rezisztencia (R) értékek 6900 és 7300 között mozogtak.

5.15. ábra. Teljesítménysűrűség-spektrumAz autospekrtum görbéjére illesztett egyenes meredeksége −0, 0137.Ennél a példánál a variancia és az inkrement szórásának értékei:

36

5.4. táblázat. Variancia és inkrement szórása4 16 64 256

Var 6,32E+03 6,35E+03 6,39E+03 6,43E+03Inc sd 336,6570 673,4113 1,3389e+03 2,6043e+03

Látható, hogy az időintervallumok növekedésével a variancia és az inkrement szórásais növekszik.És végül a különböző módszerekkel számolt Hurst exponensek:

5.5. táblázat. Hurst exponensHcl Hal1 Hal2 Hgm1 Hgm20,97 -0,42 0,47 0,51 0,6236

Ennél a példánál is azt tapasztaltuk, hogy az első Anis-Lloyd módszer tartományonkívüli H értéket adott.

5.4. Sejtes és sejtmentes adatsorok statisztikai össze-

hasonlítása

A két táblázatot (8.4, 8.6) összehasonlítva szembetűnő, hogy sejtes és sejtmentesminták esetén a variancia és az inkrement szórása nagyságrendben eltér egymástól.A Hurst értékeknél már szemmel nem látható a különbség, így ezek összehasonlí-tásában a matematikai statisztika volt segítségünkre. Mivel az irodalomban és azáltalunk generált adatsorok esetén is a GM2 módszer bizonyult a legalkalmasabbmódszernek a Hurst exponens kiszámítására, ezért az így számolt értékek alapjánhasonlítottuk össze a sejtes és sejtmentes adatsorokat.

Az R programban beépített függvények segítségével hajtottuk végre a statisz-tikai elemzést.Elsőként a normalitás eldöntésére a sejtmentes és a sejtes adatsorok esetén kapott,GM2 módszerrel számolt Hurst exponensekre alkalmaztuk a Shapiro-Wilk tesztet(shapiro.test(x)). A sejtmentes esetben 0, 825 lett a p értéke, ami lényegesen na-gyobb, mint 0, 05, így a nullhipotézist fogadjuk el, miszerint az adatsor normáliseloszlást követ. A sejtes esetben pedig a kapott p érték 0, 5061, azaz ebben azesetben is normális eloszlású az adatsor.Ezután F-próbával (var.test(x, y, alternative = "two.sided")) vizsgáltuk, hogy a kétadatsor szórása megegyezik-e. Mivel a kapott p érték ebben az esetben is jóvalmeghaladta a 0, 05 értéket (0, 6334), ezért szórásuk ugyanannyinak tekinthető. Afeltételek teljesülése után már csak a kétmintás t-próbát kellett alkalmaznunk.

37

A tesztet (t.test(x,y, var.equal=TRUE)) elvégezve eredményül p = 1, 63e−11 értéketkaptunk, azaz a H1 hipotézist fogadjuk el. Tehát a Hurst exponens 99, 999999999%-os szignifikancia szint mellett jó paraméter annak eldöntésére, hogy az adatsor sejtesvagy sejtmentes mintából származik-e.

5.5. Tumorellenes szerekkel kezelt sejtek mikromig-

rációja

Az irodalomból ismert, hogy egyes kémiai szerek, például a citotoxikus gyógyszerekalacsony koncentrációban befolyásolják a sejtek mikromigrációját. Az ilyen, eny-he fokú toxicitásnál, az átlag impedancia, vagy ohmikus ellenállás értékben nemdetektálható változás, csak a jel fluktuációjának csökkenése utal a sejtek enyhe ká-rosodására. Kíváncsiak voltunk, hogy egy enyhe toxikus kezelés hatással van-e aHurst exponensre, ezért felvettük a sejtek mikromigrációját közvetlenül a kezeléselőtt, a kezelés után egy-két órával, és 24 óra elteltével is. Mivel a kezelés optimáliskoncentrációja nehezen határozható meg és több mérés sem volt alkalmas analízisre,mert vagy a túlzott toxikus hatás miatt a sejtek elpusztultak, vagy kis koncentráció-ban nem befolyásolta a kezelés a mikromigrációt, ezért a 16 minta adataiból csak egyreprezentatív példán keresztül vizsgáltuk a paraméterek változását a kezelés előtti,és utáni időpontokban. A sejteket az egyik mérésnél tumorellenes szerrel kezeltük,míg a másik mérésnél csak médiumot alkalmaztunk kontrollként.

5.6. táblázat. Kezelt mikromigrációt Hcl Hal1 Hal2 Hgeo1 Hgeo2 Incsd(4) Incsd(16) Incsd(64) Incsd(256)0. kezelt 1,07 -0,36 0,57 0,47 0,58 325,46 650,81 1,29E+03 2,51E+030. kontroll 0,91 -0,44 0,41 0,67 0,59 322,94 646,13 1,28E+03 2,49E+031. kezelt 1,02 -0,36 0,52 1,01 1,01 3,66E+02 7,32E+02 1,46E+03 2,84E+031. kontroll 1,01 -0,40 0,51 0,49 0,58 317,80 635,65 1,26E+03 2,45E+0324. kezelt 1,14 -0,34 0,64 1,03 0,87 102,36 204,71 406,67 789,1024. kontroll 0,95 -0,42 0,45 0,37 0,55 376,77 753,63 1,50E+03 2,90E+03

A nulladik időpontban, azaz a kezelés előtt az inkrement standard deviációja meg-egyezett a kezelést követő egy-két órában mért értékével, ami arra utal hogy ilyenrövid távon nem hatott a szer. A 24 óra elteltével újramért értékek inkrementjénekszórásában viszont jelentős csökkenés figyelhető meg, ami enyhe citotoxicitást jelent.Habár enyhe toxicitás mellett van értelme mérni a Hurst exponenst, rossz H értékekadódtak, még a GM2 módszerrel is. Így egyelőre a kezelés hatásának vizsgálatánálnem tudtuk egyértelműen igazolni a Hurst változását. Azonban érdemes továbbiméréseket, vizsgálatokat végezni a kezelt mikromigrációról.

38

6. fejezet

Megbeszélés

Az előző fejezetekben leírtak alapján megállapítottuk, hogy az ismertetett Hurstexponens kiszámítására alkalmas módszerek közül úgy, mint az irodalomban, szá-munkra is a legpontosabban közelítő értéket adó módszer a GM2. Nem csak aszámítógéppel generált adatsoroknál (5.1) bizonyult a legalkalmasabbnak, hanem asejtmentes és sejtes idősorok (8.4, 8.6) esetén is. Majd az is kiderült számunkra,hogy az ezen módszerrel számolt H értékek ismeretében egy ECIS készülékben fel-vett ohmikus ellenállás idősorról szignifikánsan eldönthető, hogy az sejtmentes vagysejtes mintából származik-e. Ennek bizonyítására a matematikai statisztika volt se-gítségünkre, és az erre használható R program. A statisztikai elemzésből azonbantöbb adatsort is ki kellet zárnunk, melynek okait a következő táblázatban foglaltukössze:

39

6.1. táblázat. Rossz H értékekTáblázatban Matematikai ok Biológiai magyarázat

Negatív GM1 módszerrelkapott H érték.

- Nagy a variabilitás,- Növelve az ablakot,csökken a range,- GM1 módszer érzékenya mesterséges rezgésre

- Pl.:Valaki kinyitottaaz inkubátortVAGY- Az inkubátorbalevegő befúvatástörtént

1-nél nagyobb GM1 ésGM2 módszerrel kapottH érték

- Semmi sztochasztikusság,- Majdnem lineáris görbezajjal,- Növelve az ablakotlineárisan nő a rangeVAGY- Konvex a függvény

- Túl erős toxikus hatásátlag impedanciacsökkenést okoz,- Nem marad meg amikromigráció

1-nél nagyobb GM1módszerrel kapott Hérték, a GM2módszerrel kapott Hérték 1-hez közeli

- Majdnem lineáris görbezajjal,- Növelve az ablakotlineárisan nő a range,- Átlagban a range várhatóértékei a két módszerrelazonosak,de GM2 pontosabb

- Túl erős toxikus hatás,- Nem marad meg amikromigrációVAGY- Sejtmentes médium

Minden Hcl érték1 feletti

Nem alkalmas amódszer

Minden első Anis-Lloyd módszerrelkapott H értéknegatív

Nem alkalmas amódszer

Habár a második Anis-Lloyd módszer a definíciónak megfelelő értéket ad, isme-retében mégsem tudunk különbséget tenni a sejtmentes és sejtes minták közt. Asejtmentes adatsorok H értékeiről azt vártuk, hogy 0, 5 körüliek legyenek, ezzelszemben ez a módszer ettől eltérő értékeket adott.

A kezelt minták esetén azt mondhatjuk, hogy a kezelés hatékony, ha enyhéntoxikus. Ellenkező esetben, nagy toxikusság esetén a sejtek elpusztulnak. A táblá-zatot (5.6) tekintve ez úgy dönthető el, hogy az inkrement standard deviációjánakváltozását figyeljük. Amennyiben a kezelést követően (24 óra elteltével) ez az értékjelentősen lecsökken, akkor hatékonynak mondható a kezelés, van értelme a H-katösszehasonlítani. Mivel, sajnos több számításnál is (köztük az előző fejezetbenbemutatott példa esetén is) rossz H értéket kaptunk, ezért a kezelés hatásátegyelőre nem tudjuk ilyen módon mérni.

40

7. fejezet

Következtetések

Diplomamunkámban a hosszú adatsorok elemzésére használható különböző zaj-analitikai módszerek alkalmazhatóságát vizsgáltuk, mind az irodalomban, mindesetünkben, az ECIS készülék által generált biológiai adatsorok esetén. UtóbbihozMATLAB rutinokat írtunk, melyek eredményeit összefoglaló EXCEL táblázatok(8.4, 8.6) alapján összehasonlítottuk az általunk vizsgált módszereket (variancia,inkrement, teljesítménysűrűség-spektrum és Hurst exponens számítást). Legfőbbcélunk az volt, hogy egy olyan paramétert találjunk, melynek ismeretében a sejt-mentes és sejtes minták megkülönböztethetőek legyenek. Azt sejtettük, hogy errea legalkalmasabb paraméter a Hurs exponens, mely számos területen (kardiológia,hidrológia, meteorológia, stb.) használt fontos érték.

Először számítógépen, az R program segítségével generált különböző Hurstexponenssel rendelkező adatsorokat (5.1 - 5.11 ábra) teszteltünk az általunk írtH értékek kiszámítására alkalmas rutinokkal (5.1). Ezek az irodalomban találtkülönböző módszerek úgy, mint a klasszikus R/S-analízis, Anis és Lloyd nevéhezfűződő módszer és ennek módosítása, és két geometriai módszer (GM1, GM2).Generált adatsorok esetén láttuk, hogy a klasszikus és az első Anis-Lloyd módszermegbukott, mivel az általuk kiszámolt H értékek tartományon kívül estek. Amásodik Anis-Lloyd nem tudott különbséget tenni a sejtmentes és sejtes mintákközt. A két geometriai módszer közül pedig a második adta a legjobban közelítőértéket.

Ezután már a biológiai mintákat vizsgáltuk a fenti öt különböző módszerrel(8.4, 8.6). Eredményeink megegyeztek az irodalomban és a generált adatsorokesetén tapasztaltakkal. Ekkor is a GM2 bizonyult a legalkalmasabb Hurst ex-ponens kiszámítási módszernek, ezért később erre végeztük el a statisztikai elemzést.

Dolgozatomban, az előbbieken kívül, citotoxikus vegyülettel kezelt sejtes adatsoro-

41

kat is vizsgáltunk a Hurst exponens tekintetéből (5.6). Azonban hatékony kezelésesetén sok esetben hibás H értékeket kaptunk, amelyből arra következtetünk, hogya kezelés hatását nem tudjuk mérni a Hurst exponenssel. Azonban érdemes továbbiméréseket, vizsgálatokat végezni a kezelt mikromigrációról.

Legfőbb célunkat, miszerint a sejtmentes és sejtes minták megkülönböztethe-tőek (H ismeretében) statisztikai elemzéssel bizonyítottuk. Pár hibás méréskizárása után (melyeket a 6.1 táblázatban rögzítettünk), a megmaradt mintákelemzése azt mutatta, hogy a Hurst exponens 99, 999999999%-os szignifikancia szintmellett jó paraméter ennek eldöntésére.

42

8. fejezet

Összefoglalás

Diplomamunkám fő célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljuk, egy ECIS készülékbenkapott impedancia adatsorról valamilyen matematikai paraméter ismeretébeneldönthető-e, hogy az sejtmenetes vagy sejtes mintából származik-e.

A Hurst exponens egy olyan matematikai paraméter, melyet számos területenalkalmaznak, úgy, mint a pénzügyben, kardiológiában, hidrológiában, meteo-rológiában. Azt sejtettük, hogy a különböző zajanalitikai módszerek, példáula Hurst-analízis alkalmas lesz a sejtmentes és sejtes minták elkülönítésére. Azirodalomban talált, a Hurst exponens kiszámítására alkalmas módszereket összeha-sonlítva vizsgáltuk, hogy melyik adja a legjobban közelítő H értéket.

Sejtésünk igazolásához először a számítógép, és azon belül is az R programsegítségével adatsorokat generáltunk (lásd 5.1 - 5.11 ábra), majd a SemmelweisEgyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet kutatócsoportja segítségévelbiológiai adatsorokat vettünk fel impedancia mérésen alapuló ECIS készülékben.Ez az idő függvényében, váltóáram alkalmazása mellett képes a sejtek különbözőrezisztencia értékeit mérni. A konfluens sejtréteg jelének fluktuációjára kerestünkmagyarázatot, vizsgáltuk mennyire sejtspecifikus a görbe "szöszössége". Hiszena zaj tartalmazhat információt a biológiai jelenségekről, ami összefüggésben vanaz ECIS készülék elektródáját borító sejtek mozgásával. Ahhoz, hogy a gene-rált és a biológiai adatsorokat a különböző zajanalitikai módszerekkel vizsgálnitudjuk, MATLAB rutinokat írtunk ezek kiszámolására. A számunkra legfon-tosabb Hurst rutin eredménye az öt különböző módszerrel számolt H érték,melyeket összehasonlítva, mind a generált (5.1), mind a biológiai adatsorok (8.4,8.6) esetén azt tapasztaltuk, hogy a klasszikus és az első Anis-Lloyd módszermegbukott, mivel az általuk kiszámolt H értékek tartományon kívül estek, amásodik Anis-Lloyd nem tudott különbséget tenni a sejtmentes és sejtes mintákközt. A két geometriai módszer közül pedig a második (GM2) adta a legjobban

43

közelítő értéket. Azonban ahhoz, hogy eldöntsük, az ezen módszerrel számoltparaméter ismeretében a sejtes és sejtmentes minták megkülönböztethetőek-e,statisztikai elemzést végeztünk. Az elemzést is az R programban hajtottuk végre.A normalitási feltétel és a szórások egyezésének feltétele után kétoldali t-próbáthasználtunk az adatsorok tesztelésére. Mivel eredményül 0, 05-nél jóval kisebb p

értéket kaptunk, ezért megállapítottuk, hogy a GM2 módszerrel számolt H értékismeretében a sejtmentes és a sejtes minták szignifikánsan elkülöníthetők egymástól.

Végül a sejteket tumorellenes vegyülettel kezeltük és így is elvégeztük méré-seinket (5.6). Sajnos azt tapasztaltuk, hogy hatékony kezelés esetén is sokszor rosszH értéket kapunk, és a kezelés hatását nem tudjuk jellemezni a Hurst exponensváltozásával.

Tehát a fő célkitűzésünket sikerült elérnünk, bebizonyítottuk, hogy a Hurstexponens 99, 999999999%-os szignifikancia szint mellett jó paraméter annakeldöntésére, hogy az adatsor sejtes vagy sejtmentes mintából származik-e.

44

Függelék

Az RSana2 MATLAB rutint Sanchez Granero és munkatársai [32] cikke alapjánírtuk meg.

1 f unc t i on [RS,ERS]=RSana2 (x , n , method )2

3 i f nargin <1 | isempty (x )==14 e r r o r ( ’You should prov ide a time s e r i e s . ’ ) ;5 e l s e6 % x must be a vec to r7 i f min ( s i z e ( x ) )>18 e r r o r ( ’ I nva l i d time s e r i e s . ’ ) ;9 end

10 x=x ( : ) ;11 % N i s the time s e r i e s l ength12 N=length (x ) ;13 end14

15 i f nargin <2 | isempty (n)==116 n=1;17 e l s e18 % n must be e i t h e r a s c a l a r or a vec to r19 i f min ( s i z e (n) )>120 e r r o r ( ’n must be e i t h e r a s c a l a r or a vec to r . ’ ) ;21 end22 % n must be i n t e g e r23 i f n−round (n)~=024 e r r o r ( ’n must be i n t e g e r . ’ ) ;25 end26 % n must be p o s i t i v e27 i f n<=028 e r r o r ( ’n must be p o s i t i v e . ’ ) ;29 end30 end31

32

33 f o r i =1: l ength (n)34

35 % Calcu la te the sub−pe r i od s

45

36 a=f l o o r (N/n( i ) ) ;37

38 % Make the sub−pe r i od s matrix39 X=reshape (x ( 1 : a∗n( i ) ) ,n ( i ) , a ) ;40

41 switch method42 case ’ Hurst ’43 % Hurst−Mandelbrot v a r i a t i o n44 % Estimate the mean o f each sub−per iod45 ave=mean(X) ;46 % Remove the mean from each sub−per iod47 cumdev=X−ones (n( i ) , 1 ) ∗ave ;48 % Estimate the cumulat ive dev i a t i on from the mean49 cumdev=cumsum(cumdev ) ;50 % Estimate the standard dev i a t i on51 stdev=std (X) ;52 % Estiamte the r e s c a l e d range53 r s=(max( cumdev )−min( cumdev ) ) . / stdev ;54 c l e a r stdev55 % Take the logar i thm of the mean R/S56 RS(1 , i )=mean( r s ) ;57

58 case ’Geo1 ’59 % Fi r s t Geometric Implementation60 RS(1 , i )=mean( abs (X(n( i ) , : )−X( 1 , : ) ) ) ;61 case ’Geo2 ’62 % Second Geometric Implementation63 RS(1 , i )=mean(max(X)−min(X) ) ;64 otherwi se65 e r r o r ( ’You should prov ide another va lue f o r "method " . ’ ) ;66 end67

68

69 i f nargout>170 vect =1:n( i )−1;71 i f n ( i )<=34072 ERS(1 , i )=(n−1/2)/n∗gamma( ( n( i )−1)/2) /( sq r t ( p i ) ∗gamma(n( i )

↪→ /2) ) ∗sum( sq r t ( ones (1 , n( i )−1)∗n( i )−vect . / vect ) ) ;73 e l s e74 ERS(1 , i )=(n−1/2)/n∗1/ sq r t (n( i ) ∗ pi /2) ∗sum( sq r t ( ones (1 , n ( i )

↪→ −1)∗n( i )−vect . / vect ) ) ;75 end76 end77

78 end

MATLAB rutin - RSana2

46

8.1. ábra. Shapiro-Wilk 1. tábla - W értékek

47

48

8.2. ábra. Shapiro-Wilk 2. tábla - p értékek

49

8.1.

táblázat.Összeha

sonlítótáblázat

(R/S

analízis,A

nisés

Lloy

d1.,A

nisés

Lloy

d2.)

R/S

anal

ízis

Anis

ésLlo

yd1.

Anis

ésLlo

yd2.

Kiszámítása

lszakaszokho

ssza,

sszakaszokszám

a,Eimértrezisztencia

értékek,

m=

E1+E

2+...+El

l,

Di

=Ei−m,

Pt

=∑ t i=

1Di

(t=

1,2,...,l),

R(l

)=max

(P1,...,P

l)−min

(P1,...,P

l),

S(l

)=

√ 1 l·

l ∑ i=1

(Ei−m

)2,

H=

log

(R/S

) l−

logc

logl

lszakaszokho

ssza,

sszakaszokszám

a,Eimértrezisztencia

értékek,

m=

E1+E

2+...+El

l,

Di

=Ei−m,

Pt

=∑ t i=

1Di

(t=

1,2,...,l),

R(l

)=max

(P1,...,P

l)−min

(P1,...,P

l),

S(l

)=

√ 1 l·

l ∑ i=1

(Ei−m

)2,

E(R/S

) l=

l−1 2

l·

Γ(l−

12

)√π·Γ

(l 2)·l−

1 ∑ i=1

√ l−ii

hal≤

340

l−1 2

l·

1√l·π 2

·l−1 ∑ i=1

√ l−ii

hal≥

340

H=

0,5

+((R/S

) l−

E(R/S

) l)gö

rbemeredeksége

lszakaszokho

ssza,

sszakaszokszám

a,Eimértrezisztencia

értékek,

m=

E1+E

2+...+El

l,

Di

=Ei−m,

Pt

=∑ t i=

1Di

(t=

1,2,...,l),

R(l

)=max

(P1,...,P

l)−min

(P1,...,P

l),

S(l

)=

√ 1 l·

l ∑ i=1

(Ei−m

)2,

E(R/S

) l=

l−1 2

l·

Γ(l−

12

)√π·Γ

(l 2)·l−

1 ∑ i=1

√ l−ii

hal≤

340

l−1 2

l·

1√l·π 2

·l−1 ∑ i=1

√ l−ii

hal≥

340

logHl=

log

(R/S

) l−

log

(E(R/S

) l)

+lo

g(l

)/2,

H=

logHl−

logc

logl

Hátrány

a

1.Brownmozgá

sesetén

kicsi

lérték(szakaszho

ssz)

esetén

rosszH

értéketad

.2.

Kislértékreelőfordu

lhat,

hogy

astan

dard

deviáció

nulla

lesz.

3.Érzékenyakerekítésrea

stan

dard

deviáció

miatt.

Hértéke

nega

tívlehet.

Haazajn

emno

rmális

eloszlású

(nálun

knem

norm

ális

eloszlású),

akko

rnem

garantált,ho

gyhelyes

Hértéketkapu

nk.

50

8.2.

táblázat.Összeha

sonlítótáblázat

(GM1és

GM2mód

szer)

GM

1m

ódsz

erG

M2

mód

szer

Kiszámítása

lszakaszokho

ssza,

sszakaszokszám

a,

∆BαlH

,∆B

=|B

(t+l)−B

(t)|,

αarán

yszám,

∀m

=1,···,s-re

Sm

=xml−x

(m−

1)l

+1

Hl=mean{S

m:m

=1.···,s}

logHl=

logc

+H

logl

H=

logHl−

logc

logl

lszakaszokho

ssza,

sszakaszokszám

a,

range(B

)αlH

,range(B

)=

max{B

(S)

:t≤S≤t

+l}

−min{B

(S)

:t≤S≤t

+l},

αarán

yszám

Hátrány

aHelyesH

értéketad

,denem

alegp

ontosabb

at.

Enn

élamód

szernéla

stan

dard

deviáció

kisebb

,mintaGM1mód

szernél,

ezértpo

ntosab

beredményt

ad.

51

8.3.

táblázat.Sejtmentesad

atsorokelső

része

Szórás

(4)

Szórás

(16)

Szórás

(64)

Szórás

(256

)Hcl

Hal1

Hal2

Hgeo1

Hgeo2

1.0.42

080.41

230.40

930.41

041.15

91-0.553

80.65

830.45

410.31

262.

0.47

680.46

820.46

820.47

311.17

20-0.553

30.67

130.39

910.31

553.

0.63

030.62

700.62

940.64

031.27

66-0.384

40.77

580.54

720.45

774.

0.37

260.36

620.36

600.37

281.19

18-0.611

90.69

090.68

670.23

315.

0.88

410.88

330.88

680.90

021.26

2-0.449

10.76

110.81

680.49

536.

0.79

340.78

970.79

390.81

121.24

61-0.478

80.74

520.76

970.46

517.

0.40

280.39

520.39

450.39

171.15

66-0.513

80.65

56-0.205

10.24

978.

0.41

240.40

620.40

570.41

131.13

53-0.534

30.63

440.62

300.35

639.

0.26

610.25

990.25

920.26

121.29

39-0.519

10.79

310.47

330.39

6710

.0.43

530.43

120.43

090.43

481.15

49-0.554

30.65

410.46

420.32

6011

.0.39

170.38

290.38

060.38

211.19

51-0.532

60.69

430.54

670.38

6612

.0.40

510.40

270.40

330.40

961.17

11-0.511

70.67

030.23

980.38

3113

.41

.745

341

.799

842

.071

443

.064

01.02

17-0.360

30.52

091.03

361.01

0114

.1.45

051.43

141.43

541.46

301.39

79-0.383

90.89

710.63

890.35

4915

.4.00

504.00

124.02

544.11

471.23

15-0.351

30.73

070.94

330.64

6116

.0.16

220.15

270.14

340.11

580.95

92-0.636

20.45

830.54

460.52

0617

.3.47

123.46

593.48

673.56

961.26

56-0.363

30.76

480.93

130.65

4618

.2.22

662.22

562.23

802.28

391.30

08-0.360

30.80

000.70

600.60

7319

.1.91

821.90

961.91

811.94

851.36

89-0.360

40.86

810.46

550.45

3220

.1.38

801.38

491.39

141.42

261.16

85-0.511

10.66

770.98

170.48

0621

.1.97

221.96

391.97

302.01

891.16

62-0.389

40.66

540.93

450.58

58átlag

1.20

45-0.472

10.70

370.61

880.46

15szórás

0.10

170.09

160.10

170.28

840.17

48

52

8.4.

táblázat.Sejtmentesad

atsorokmásod

ikrésze

Var

(4)

Var

(16)

Var

(64)

Var

(256

)Incsd

(4)

Incsd

(16)

Incsd

(64)

Incsd

(256

)Autospe

ktrum

1.0.17

710.17

000.16

760.16

8581

.207

716

2.40

9232

2.60

0562

5.65

59-0.001

92.

0.22

740.21

930.21

920.22

3995

.683

519

1.35

4438

0.07

6073

7.10

07-0.002

23.

0.39

750.39

330.39

620.41

0177

.189

115

4.37

4830

6.62

4859

4.69

59-0.003

04.

0.13

890.13

410.13

410.13

9087

.929

817

5.86

1034

9.28

5467

7.32

86-0.001

95.

0.78

160.78

030.78

630.81

0388

.020

917

6.04

311

349.64

0267

7.97

57-0.003

76.

0.62

960.62

370.63

030.65

8076

.339

515

2.67

9330

3.27

0458

8.21

97-0.004

17.

0.16

240.15

620.15

570.15

3597

.388

119

4.77

6238

6.86

7475

0.32

27-0.002

58.

0.17

020.16

510.16

460.16

9179

.672

815

9.34

0931

6.48

5361

3.79

40-0.002

79.

0.07

080.06

760.06

720.06

8383

.629

616

7.27

1533

2.24

7764

4.31

57-0.002

410

.0.18

950.18

600.18

570.18

9176

.669

415

3.36

5630

4.62

8459

0.76

05-0.003

711

.0.15

350.14

660.14

490.14

6080

.165

416

0.32

7831

8.44

9661

7.61

46-0.003

712

.0.16

410.16

220.16

270.16

7884

.768

616

9.54

5133

6.77

5665

3.14

90-0.002

813

.1.74

E+03

1.75

E+03

1.77

E+03

1.85

E+03

125.52

9025

1.15

4049

9.31

4197

1.64

29-0.012

314

.2.10

412.04

892.06

032.14

0211

6.36

4623

2.74

4646

2.30

4989

6.75

45-0.002

515

.16

.039

916

.009

416

.203

516

.931

111

6.13

5623

2.26

7746

1.37

3189

5.19

26-0.007

616

.0.02

630.02

330.02

060.01

3411

3.10

8622

6.20

5344

9.31

2387

1.43

00-0.003

317

.12

.048

912

.012

412

.157

212

.742

311

1.15

9022

2.31

8944

1.62

3085

6.81

43-0.007

118

.4.95

764.95

325.00

845.21

6111

2.08

5622

4.17

1444

5.30

2686

3.73

28-0.005

319

.3.67

963.64

673.67

923.79

6711

0.47

4622

0.95

9843

8.89

0185

1.29

94-0.005

120

.1.92

651.91

791.93

602.02

3810

9.15

3621

8.29

8743

3.59

4184

1.04

60-0.003

221

.3.88

983.85

683.89

284.07

6110

7.19

9521

4.41

3642

5.90

2082

6.16

34-0.006

4

53

8.5.

táblázat.Sejtes

adatsorokelső

rész

Szórás

(4)

Szórás

(16)

Szórás

(64)

Szórás

(256

)Hcl

Hal1

Hal2

Hgeo1

Hgeo2

1.18

.898

9118

.918

118

.967

018

.695

31.00

63-0.392

60.50

540.54

020.72

282.

120.57

5412

0.44

7912

1.16

612

3.89

440.97

00-0.404

30.46

920.81

390.78

063.

88.837

689

.037

089

.430

190

.950

11.04

11-0.377

50.54

030.73

040.69

814.

73.573

973

.736

973

.715

972

.955

60.97

50-0.412

30.47

430.30

800.60

215.

74.136

674

.294

774

.343

971

.674

70.95

56-0.419

40.45

470.44

100.63

076.

56.655

056

.613

156

.348

954

.669

10.98

39-0.389

50.48

290.32

350.52

817.

98.582

798

.735

699

.215

110

0.86

820.94

97-0.413

10.44

900.78

830.72

488.

79.471

679

.677

979

.944

480

.190

50.97

28-0.415

90.47

210.50

790.62

369.

64.220

564

.154

863

.989

862

.791

80.99

11-0.402

70.49

040.41

080.53

4410

.24

.260

824

.221

23.837

922

.129

40.99

03-0.407

80.48

950.17

360.54

7411

.12

1.19

1512

1.16

5712

1.64

3712

2.59

980.94

04-0.434

90.43

950.55

920.63

6612

.73

.862

373

.944

873

.774

172

.501

00.97

71-0.412

30.47

630.65

740.67

5313

.17

6.08

0117

6.31

9017

7.23

2318

0.20

621.01

29-0.375

0.51

210.52

250.71

5314

.40

.483

440

.456

240

.696

341

.647

30.95

72-0.416

10.45

630.80

250.73

0615

.56

.203

455

.992

156

.302

357

.418

10.98

02-0.413

90.47

940.89

380.75

2416

.43

.144

343

.261

843

.428

844

.104

10.94

91-0.422

30.44

820.72

300.63

2917

.24

.913

24.575

324

.640

424

.733

10.90

55-0.451

70.40

470.61

090.58

5818

.28

.684

228

.643

128

.700

928

.599

11.10

69-0.337

10.60

600.56

550.71

4719

.34

.348

534

.386

834

.498

834

.984

40.99

79-0.399

20.49

700.51

930.64

9120

.31

.828

331

.911

631

.969

731

.809

60.99

80-0.386

90.49

710.76

990.67

77átlag

0.98

31-0.404

30.48

230.58

310.65

82szórás

0.04

140.02

420.04

140.19

180.07

35

54

8.6.

táblázat.Sejtes

adatsorokmásod

ikrész

Var

(4)

Var

(16)

Var

(64)

Var

(256

)Incsd

(4)

Incsd

(16)

Incsd

(64)

Incsd

(256

)Autospe

ktrum

1.3.57

E+02

3.58

E+02

3.60

E+02

3.50

E+02

196.57

6639

3.21

217.81

E+02

1.52

E+03

-0.011

72.

1.45

E+04

1.45

E+04

1.47

E+04

1.54

E+04

265.56

4953

1.29

251.06

E+03

2.06

E+03

-0.012

43.

7.93

E+03

7.93

E+03

8.00

E+03

8.27

E+03

326.31

1665

2.27

681.29

E+03

2.50

E+03

-0.012

54.

5.41

E+03

5.44

E+03

5.43

E+03

5.32

E+03

425.27

8584

9.73

611.69

E+03

3.26

E+03

-0.014

15.

5.50

E+03

5.52

E+03

5.53

E+03

5.14

E+03

398.64

2379

6.69

701.58

E+03

3.06

E+03

-0.013

66.

3.21

E+03

3.21

E+03

3.18

E+03

2.99

E+03

445.67

9289

0.79

121.77

E+03

3.45

E+03

-0.012

97.

9.72

E+03

9.75

E+03

9.84

E+03

1.02

E+04

379.27

4175

8.37

811.51

E+03

2.91

E+03

-0.012

48.

6.32

E+03

6.35

E+03

6.39

E+03

6.43

E+03

336.65

7067

3.41

131.34

E+03

2.60

E+03

-0.013

79.

4.12

E+03

4.12

E+03

4.09

E+03

3.94

E+03

435.86

6787

2.17

881.73

E+03

3.38

E+03

-0.013

510

.5.89

E+02

5.87

E+02

5.68

E+02

4.90

E+02

301.17

4760

2.75

101.20

E+03

2.32

E+03

-0.012

411

.1.47

E+04

1.47

E+04

1.48

E+04

1.50

E+04

422.64

5684

4.72

131.68

E+03

3.24

E+03

-0.012

612

.5.46

E+03

5.47

E+03

5.44

E+03

5.26

E+03

423.00

4184

6.08

501.68

E+03

3.26

E+03

-0.012

913

.3.10

E+04

3.11

E+04

3.14

E+04

3.25

E+04

406.02

0281

1.63

541.61

E+03

3.15

E+03

-0.012

414

.1.64

E+03

1.64

E+03

1.66

E+03

1.73

E+03

299.58

1859

9.14

161.19

E+03

2.30

E+03

15.

3.16

E+03

3.14

E+03

3.17

E+03

3.30

E+03

395.49

2279

1.11

821.57

E+03

3.04

E+03

-0.012

316

.1.86

E+03

1.87

E+03

1.89

E+03

1.95

E+03

387.32

2377

4.36

081.54

E+03

2.98

E+03

-0.012

417

.6.21

E+02

6.04

E+02

6.07

E+02

6.12

E+02

402.71

3080

5.29

701.60

E+03

3.10

E+03

-0.012

318

.8.23

E+02

8.20

E+02

8.24

E+02

8.18

E+02

395.23

1679

0.37

401.57

E+03

3.05

E+03

-0.011

719

.1.18

E+03

1.18

E+03

1.19

E+03

1.22

E+03

375.92

7875

1.84

981.49

E+03

2.90

E+03

-0.011

420

.1.01

E+03

1.02

E+03

1.02

E+03

1.01

E+03

360.13

4272

0.21

911.43

E+03

2.78

E+03

-0.011

9

55

Irodalomjegyzék

[1] Giaever and Keese: A morphological biosensor for mammalian cells, Nature366(1993)591-2

[2] Dávid Gergely, Tumorsejtek elektromos jelének vizsgálata ECIS készülékben,Szakdolgozat (2011.)

[3] Az ECIS készülék hivatalos honlapja,http://www.biophysics.com/ecis-theory.php

[4] Láng, Orsolya, László Kőhidai, and Joachim Wegener. Label-free profiling ofcell dynamics: A sequence of impedance-based assays to estimate tumor cellinvasiveness in vitro. Experimental cell research 359.1 (2017): 243-250.

[5] C.M. Lo, C.R. Keese, I. Giaever, pH changes in pulsed CO2 incubators causeperiodic changes in cell morphology, Exp. Cell Res. 213 (1994) 391?397.

[6] D.C. Lovelady, J. Friedman, S. Patel, D.A. Rabson, C.M. Lo, Detecting effectsof low levels of cytochalasin B in 3T3 fibroblast cultures by analysis of electri-cal noise obtained from cellular micromotion, Biosens. Bioelectron. 24 (2009)2250?2254

[7] C.-M. Lo, C.R. Keese, I. Giaever, Monitoring motion of confluent cells in tissueculture, Exp. Cell Res. 204 (1993) 102?109.

[8] Montgomery, D.C. and Runger, G.C. (1994) Applied statistics and probabilityfor engineers

[9] Williams, Byron K. "The use of analysis of variance procedures in biologicalstudies." Applied Stochastic Models in Business and Industry 3.4 (1987): 207-226.

[10] Autospektrum,https://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop412A/2010-0013-merestechnika/9-4-autospektrum.html

[11] Gombos Kitti Kata, Fraktálok a tőzsdén, Szakdolgozat, Szegedi Tudományegye-tem (2010.)

[12] Estimating the Hurst Exponent,http://www.bearcave.com/misl/misltech/wavelets/hurst/index.html

[13] Herpai Nándor Nílusról szóló blogja,https://herpainandor.com/2013/06/22/nilus-es-a-tozsde/

56

[14] Fraktálok, a fraktáldimenzió,http://www.geo.u-szeged.hu/ joe/pub/Tamop/Jegyzet/ch09s03.html

[15] Somogyi Balázs István Mérsékelt kockázatú befektetési alapok vagyonának és ár-folyamának stabilitása és hosszú emlékezete OTDK, Debreceni Egyetem Gaz-dálkodástudományi és Vidékfejlesztési Kar

[16] Costa, Tommaso, Dario Galati, and Elena Rognoni. The Hurst exponent ofcardiac response to positive and negative emotional film stimuli using wavelet.Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 151.2 (2009): 183-185.

[17] Larsen, R.J., Diener, E., 1992. Problems and promises with the circumplex modelof emotion. Rev. Person. Soc. Psychol. 13, 25?59.

[18] Russell, J.A., 1980. A circumplex model of affect. J. Personal. Soc. Psychol. 39,1161?1178.

[19] Barrett, L.F., Russell, J.A., 1998. Independence and bipolarity in the structureof current affect. J. Personal. Soc. Psychol. 74 (4), 967?984.

[20] Barrett, L.F., 2006. Valence as a basic building block of emotional life. J. Res.Pers. 40, 35?55.

[21] Hurst, E. (1951). Long-term storage capacity of reservoirs. Trans. Amer. Soc.Civil Eng. , 116 (1951): 770- 808.

[22] Koutsoyiannis, D. (2003). Climate change, the Hurst phenomenon, and hydro-logical statistics. Hydrological Sciences Journal , 48.1 (2003): 3-24.

[23] Dimitriadis, P. (2010). Three dimensional Hurst-Kolmogorov process for mo-deling rainfall. EGU General Assembly Vienna Austria May 2010 (p. SessionHS: 5.5). Vienna: EGU.

[24] Papalexiou, S. (2008). Probabilistic description of rainfall intensity at multipletime scales. Role of Hydrology in Water Resource Management. Isle of Capri,Italy: UNESCO.

[25] Munshi, Jamal. The Hurst Exponent of Precipitation: England and Wales 1766-2016. (2017).

[26] Michelis, Paola De, and Giuseppe Consolini. On the local Hurst exponent ofgeomagnetic field fluctuations: Spatial distribution for different geomagneticactivity levels. Journal of Geophysical Research: Space Physics 120.4 (2015):2691-2701.

[27] Kim, Byung-Sik, Hung-Soo Kim, and Sun-Hong Min. Hurst’s Memory for Cha-otic, Tree Ring, and SOI Series. Applied Mathematics 5.1 (2014): 175.

[28] Mandelbrot, Benoit B., and James R. Wallis. Robustness of the rescaled rangeR/S in the measurement of noncyclic long run statistical dependence. WaterResources Research 5.5 (1969): 967-988.

[29] H. Hurst, Long term storage capacity of reservoirs, Transactions of the Ameri-can Society of Civil Engineers 6 (1951) 770?799.

57

[30] Mandelbrot, Benoit B. When can price be arbitraged efficiently? A limit to thevalidity of the random walk and martingale models. The Review of Economicsand Statistics (1971): 225-236.

[31] Mandelbrot, Benoit. Statistical methodology for nonperiodic cycles: from thecovariance to R/S analysis. Annals of Economic and Social Measurement, Vo-lume 1, number 3. NBER, 1972. 259-290.

[32] M. A. Sánchez Granero, J. E. Trinidad Segovia, J. García Pérez, Some com-ments on Hurst exponent and the long memory processes on capital markets

[33] Annis, A. A., and E. H. Lloyd. The expected value of the adjusted rescaled Hurstrange of independent normal summands. Biometrika 63.1 (1976): 111-116.

[34] PANC1 sejtek morfológiája fáziskontraszt mikroszkópbanhttps://www.pheculturecollections.org.uk/products/celllines/generalcell/detail

[35] Razali, Nornadiah Mohd, and Yap Bee Wah. Power comparisons of shapiro-wilk, kolmogorov-smirnov, lilliefors and anderson-darling tests. Journal of sta-tistical modeling and analytics 2.1 (2011): 21-33.

[36] Shapiro, Samuel Sanford, and Martin B. Wilk. An analysis of variance test fornormality (complete samples). Biometrika 52.3/4 (1965): 591-611.

[37] Marianna, Bolla. Statisztikai következtetések elmélete. Typotex Kft, 2005.

58