réponses d'acacia seyal à l'inoculation avec des souches...
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UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DAKAR 904Jfq
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
DtiP&EME~T DE BIOLOGIE &ETALE
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Mémoire de.
DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES
Présenté par
N’dèye Fatou Diaw GUENE Titulaire de 1’A. E. A. de Biologie Végétale P 5* y;--+ ,&, ‘$> PG..--ti.
Sujet : _ .._.-,_._. “. _ ,._.
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i Répenses d’Acacia seyal à l’inoculation avec -es 7 souches de Rhizobium ou de Bradyrhizobium
tolérantes au sel isolées au Sénéiral
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Soutenu le 22 Février 1997 devant la commission d’Examen
-. Président : Mme Marie-Madeleine S. BARRETO Maître de conférence UCAD I
l Membres : M. Nicolas DIALLO ILL. qz 2 ~c~d~j-tint UCAD
-, L M. Ibrahima NDOYE Maître assistant UCAD Mme Claudine NEF-CAMPA , Chercheur ORSTOM M. Mamadou GUEYE Chercheur ISRA
Fonds Documentaire ORSTOM
3 mes parents Pour li?ur affection et lkrs p&res
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A mon mari pour sa compréhension et son soutien sans faillé
. J4 ma soeur Tatou et son mari&nadou
pour Gintérêt qu”ils ont toujours porté à mes études
g ma soeur Wdapa et son mariseydina pour lëur soutien
J tozw mesJ?ères, soeurs et cousins
;4 tous Nerci
Fonds Documentaire ORSTOld
Cote: f#$???? Ex:
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Le wavaii qui est présenté dans’ce mémoire a été eiqtièrement effectué au laboratoire de microbiologie des sols ISRA-ORSTOM à Bel-Air.
Je remercie le Directeur Général de 1’ISRA et le Représentant de 1’ORSTOM à Dakar pour le cadre de travail qu’ils m’ont offert et au Chef du Département de Biologie Végétale de m’avoir autorisée 5 m’inscrire en DEA.
Au demeurant, je réserve mes remerciements particulièi-ement sincères à Monsieur Mamadou GUEYE Chercheur à 1’ISRA qui, malgré ses nombreuses responsabilités, a bien voulu diriger mes travaux avec toute la rigueur, la compétence et la détermination que recquiert un tel encadrement.
Par ailleurs, j’exprime ma profonde gratitude à Madame Claudine NEF-CAMPA pourlsa perspicacité et sa rigueur pointilleuse qui m’ont été d’un grand apport.
--. .l. _. Toute ma reconnaissance a Monsieur Ibrahima N’DOYE pour ses conseils
pratiques et l’intérêt qu’il a toujours porté h mon travail.
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Je remercie Monsieur Nicolas DLALLO dont j’ai fait mienne la pertinence des observations et remarques.
Mes remerciements vont également à Madame Marie Madeleine Spencer .. BARRETO dont la- débordante sympathie et les opportuns conseils ent eu un
effet certain dans ce travail et qui m’a fait l’honneur de présider le jury.
i Je remercie M. Bernard DREYFUS pour sa grande sympathie et son sens de 1. _ l’autorité.
Je confonds dans mes remecciemeuts, toute la chaleureuse écluipe de chercheurs du laboratoire de microbiologie des sols ISRA-ORSTOiVI de Bel Air : T. DIOP, S. SYLLA, J. LORQUIN, A. BA, R. DUPONNOIS, D. LESUEUR, A. BRAUMAN pour leurs conseils judicieux.
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Je remercie enfin tout le personnel technique du laboratoire pour l’efficacité et le dynamisme dont ils ont toujours fait preuve dans la collaboration. Un remerciement tout particulier ci Omar TOURE dont la disponibilité a beaucoup contribué au bon deroulement de mes travaux.
A mes camarades stagiaires Abdoulaye, Adama, Astou, Awa, Clémence,
-1 - i Diégane, Etiké, Flore, Hassna, N’dèye Khady, Rama, Salif. i: . . .,
Mention spéciale à Marie Claire Dasylva, Anna Marthe Koité, Henriette I Goudiaby, Aminata DTOP pour leur disponibilité et leur altruisme.
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LISTE DES FIGURES d ..... I
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LISTE DES TABLEAUX.. ................................................................................... 2 GLOSSAIRE ......................................................................................................... 2
INTRODUCTION ............................................................................................... 4
1 .GENERALITES ................................................................................................ 9 2. MATERIEL ET METHODES ....................................................................... 11
2.1. Les sols. 12 .................... ........................................................................... 2.2. Les souches bactériennes ..................................................................... 12
2.2.1. Souches de Rhizobium ............................................................. 12 2.2.2. Souche de Escherichia coli ..................................................... 12
2.3. Le matériel végétal .............................................................................. 14 2.4. Obtention des souches bactériennes .................................................... 14
2.4.1. Isolement des souches de Rhizobium ......................................... 14 2.4.2. Culture de la souche de E. coli.. ............................................... 15 : 2.4.3. Transformation de la souche de Rhizobium ISRA330 (cf 8 3.2.3) par E. coli ......................................................................... 15 2.4.4. Identification du transconjugant ............................................... 18 2.45. Vérification du pouvoir infectif du transconjugant.. ................. 18
2.5. Culture d’Acacia seyal ............................................................ ..A ......... 18 2.5.1. Prégermination des graines.. ..................................................... 18
.. 2.52. Culture en tube Gibson ............................................................. 18 2.5.3. Culture en pot et en gaine ......................................................... 18
2.6. Mise en évidence d’un effet du sel (NaCl) sur la performance symbiotique des rhizobiums ................................................................ 18 2.6.1. Croissance des rhizobiums en culture pure ............................... 19 2.6.2. Effectivité des rhizobiums ....................................................... 19
2.6.2.1. Cultures réalisées en tube Gibson .................................. 19 2.6.2.2. Cultures réalisées en gaine ............................................ 19
26.3. Compétitivité de la souche ISRA330 ....................................... 19 2.7. Méthodes analytiques ........................................................................... 20
2.7.1. Mise en évidence de l’effet du stress salin sur la plante .......... .20 2.7.1-l. Mesure du potentiel osmotique ...................................... 20 2.7.1.2. Dosage de proline .......................................................... 20
2.7.2. Evaluation de 1’Activité Réductrice d’Acétylène (ARA) méthode de Hardy et al., 1973 ................................................. 21
2.7.2.1. Principe et conditions expérimentales .......................... .2 1
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2.7.2.2. Calcul et expression de 1’ARA ....................................... 21 2.7.3. Dosage de l’azote total .............................................................. 22
3. RESULTATS ET~DISCUSSIONS .... . ....... A.:. .......................... . ............. jr..; ..... .23 3.1. Les réponses physiologiques de la plante au stress salin.. .................. .24 3.2. Sélection de souches de Rhizobium ..................................................... 26
3.2.1. Isolement des souches de Rhizobium ....................................... 26 3.2.2. Tolérance des rhizobiums d’A. seyal au sel : étude en milieu gélosé et en milieu liquide ....................................................... 26 3.2.3. Effectivité des rhizobiums ........................................................ 29 3.2.4. Cinétique de croissance des souches ISRA330 et ISRA345 en fonction de la concentration en sel ................................. 31
3.3. Effet de la salinité sur la croissance et la fixation biologique de l’azote chez A. seyal inoculé avec les souches ISRA330 et ISRA345 .................................................................................................... 32 3.4. Compétitivité de la souche ISRA330 ................................................... 41
3.4.1. Obtention et identification d’un transconjugant.. .............. . ...... .41 3.4.2. Compétitivité de ISRA330 vis-à-vis des souches indigènes du sol de Bel-Air ................................................................. 42
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................. 46 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................ 49 ANNEXE ............................................................................................................ 56
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En 1996, la collection de culture de microorganismes du MIRCEN dénommée collection MAO a été renommée collection ISRA.
En conséquence, toutes les souches bactériennes notées “MAO” sont renommées “souches ISRA”.
Exemple : “Rhizobium MAO330” devient “Rhizobium ISRA330”. . . . ,
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Nom : Guène née Diaw Prénoms : N’dèye Fatou
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Titre : Réponses d’Acacia seyal à l’inoculation avec des souches de Rhizobium / Bradyrhizobium tolérantes au sel isolées au Sénégal.
Mots clés : Acacia seyal, Activité Réductrice d’Acétylène, Bradyrhizobium, compétitivité, effectivité, fixation biologique d’azote, potentiel osmotique, Rhizobium, sel, Sénégal, teneur en eau, teneur en proline.
RESUME : Une étude physiologique de certains paramètres tels que la teneur en eau, le potentiel osmotique et la teneur en proline a été effectuée sur des plantes d’Acacia seyal âgées de 5 mois et soumises à un stress salin d’intensité .différente p.endant 8 et 12 jours. Cette étude montre qu’A, seyal, bien que. sensible aux fortes concentrations en NaCl, parvient à se maintenir en vie en gardant une teneur en eau constante et en réalisant un équilibre entre pression osmotique et teneur en proline. Dans le but d’améliorer l’adaptabilité d’A. seyal au sel, 3 1 souches de Rhizobium nodulant A. seyal ont été isolées à partir de 13 sols dont 9 ont été prélévés au Sénégal dans des zones salées et 3 dans des zones non salées. L’étude de la croissance de ces souches en milieu salé et de leur Activité Réductrice d’Acétylène (ARA) a permis de sélectionner deux souches très efficientes et dont la tolérance au sel est différente : ISRA330 qui se
. . ._: “. j développe jusqu’à 16 g NaCl/l et ISRA345 dont la croissance est inhibée à partir -. . . _’ ’ ;’ ., _ de-. 8 * g -;NaCl/l. L’inoculation d’A. seyal en conditions salines avec ces deux
” souches améliore la croissance et le développement d’A. seyal. Cet effet est plus marqué quand l’inoculation est faite avec la souche ISRA330. Une étude de la compétitivité de la souche ISRA330 vis-à-vis des souches natives du sol de la station de Bel-Air a été réalisée à différentes concentrations en NaCl en utilisant la souche transformée ISRA330gusA. La souche ISRA330 se révèle plus compétitive que les souches natives du sol provenant de la station de Bel-Air.
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? Figure 1. Localisation des sols salés et sulfatés salés au Sénégal (Daffé et Radio, 1989).
Figure 2. Impact de la salinité sur des peuplements d’A.cacia seyal dans 3 sites différents : un site faiblement affecté (A), un site moyennement affecté (B) et un site fortement affecté (C). Noter la ‘disparition totale en (C) (Diop, 1995).
Figure 3. Structure du plasmide ayant reçu la construction contenant le gène gusA et le gène de résistance à la spectinomycine
Figure 4. Réaction de clivage du X-gluc par la P-glucuronidase avec formation d’un dérivé indolique par dimérisation oxydative.
J?ignse 5. Représentation scb.ématique des différentes étapes de la conjugaison bactérienne.
Figure 6. Représentation schématique des différents évènements intervenant lors de la conjugaison entre la souche d’E. coli et la souche de Rhizobium et conduisant à l’obtention de la souche ISRA33O&sA.
Figure 7. Evaluation de la Teneur en eau des parties aériennes, du potentiel osmotique et de la teneur en proline de feuilles d’A. seyal âgées de 5 mois après 8 et 12 jours de traitement salin.
Figure 8. Evaluation de la croissance des souches ISRA330 et ISRA345 par la mesure de la dénsité optique.
Figure 9. Effet de l’interaction “sel x inoculation” sur la hauteur des plantes d’A. seyal, inoculées ou non avec les souches ISRA330 ou ISRA345 et cultivées dans des gaines contenant du sol stérile prélevé à la station de Bel-Air en présence de différentes concentration en sel.
Figure 10. Aspect des colonies de la souche ISRA330 après culture sur un milieu sélectif : colonies bleues (ISRA33OgusA ) et colonies blanchâtres (mutant de ISRA330)
Figure 11. Nodules “bleus” d’A. seyal induits par la souche ISRA33OgusA
Figure 12. Localisation histologique de l’expression du gène GUS dans des nodules formés sur A. seyal’ par les bactéries provenant de la souche
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ISRA33OgusA : coupe transversale de nodule (A), expression du gène dans les cellules médullaires (B et C) et expression au sein des cellules (D et E).
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Tableau 1. Superficie occupée par les sols sulfatés acides salés dans trois zones du Sine Saloum.
Tableau 2. Valeurs du pH des sols de différentes localités de la région de Fatick.
Tableau 3. Nomenclature, origines, coordonnées géographiques et aspect des souches de Rhizobium isolées d’A. seyal.
Tableau 4. Comparaison des potentialités de croissance en fonction de la concentrations en NaCl des différentes souches isolées sur A. seyal et cultivées en milieu YEM gélosé.
Tableag $. Comparaison des potentialités de croissance en fonction de..la concentration en NaCl des différentes souches isolées sur A. seyal et cultivées en milieu YEM liquide.
Tableau 6. Effectivité des souches isolées d’A. seyal et testées en tube.
Tableau 7. Analyse de variante des paramètres pour les cultures en tube Gibson
Tableau 8. Analyse de variante des paramètres pour les cultures en gaine
Tablea,u:oi Effet de.l’interaction “sel x inoculation” sur la hauteur, le poids sec des nodules et I’ARA des plantes d’A. seyal cultivées en tube Gibson
Tableau 10. Effet du sel sur le poids de matière sèche des parties aériennes des plantes d’A. seyal après 40 jours de culture en tubes Gibson et inoculées avec les souches ISRA330 et ISRA345
Tableau 11. Effet de l’inoculation sur le poids de matière sèche des parties aériennes des plantes d’A. seyal après 40 jours de culture en tube Gibson et inoculées avec les souches ISRA330 et ISRA345
Tableau 12. Effet de l’interaction sel x inoculation sur la hauteur, le poids de matière sèche des parties aériennes et des nodules des plantes d’A. seyal cultivées dans des gaines et inoculées avec les souches ISRA330 et ISRA345.
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Tableau 13. Effet principal du sel sur I’ARA par plante, la teneur en azote et l’azote total des parties aériennes des plantes d’A. seyal cultivées pendant 40 jours dansdes gaines. I ’ ’ . . ‘. :: ., .. i:
Tableau 14. Effet principal de l’inoculation avec les souches ISRA330 et ISRA345 sur l’ARA, la teneur en azote des plantes d’A. seyal cultivées pendant 40 jours dans des gaines.
Tableau 15. Evaluation du nombre de nodules chez A. seyal cultivé dans des pots contenant du sol de Bel-Air non stérile et inoculé avec la souche ISRA33OgusA en présence de sel (NaCl).
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~ i COMPET'TIVITE :, .aptitude d’un ,microorganisme à noduler une plante-hôte en i
I présence d’autres souches de rhizobium ayant la même spécificité ; une souche très compétitive forme par définition 100% des nodules sur une plante donnée.
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EFFECTIVITÉ (ou efficacité) : aptitude d’un microorganisme à fixer l’azote dans le nodule. II existe divers degrés dans l’effectivité, une souche de rhizobium sera classée ineffective, effective ou très effective selon le niveau de son activité
I nitrogènasique mesurée par 1’ARA.
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INFECTIVITE : aptitude d’un microorganisme à induire la formation de nodules. La notion d’infectivité n’implique pas que la souche considérée soit effective.
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._ NITROGENASE : complexe enzymatique responsable de la réduction de l’azote atmosphérique, formé de deux protéines : une ferromolybdo-protéine et une ferroprotéine.
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NODULATION : résultats de la succession d’évènements se traduisant par l’apparition d’un nodule (ou nodosité).
PERFORMANCES SYMBIOTIQUES : ensemble des deux principaux caractéres d’un microrganisme, à savoir l’aptitude à noduler et l’aptitude à fixer l’azote atmosphérique.
i . -, : : : ..i. ‘I. .< l : . . . '--: .TENEUR EN AZOTE TOTAL (ou azote total, Ntotal). : produit de la concentration
en azote (N%) par le poids sec de tissu végétal.
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Dans beaucoup de pays africains dont le Sénégal, on assiste à une dégradation des terres et à uge disparition des forêts, sous l’effet de différents facteurs. Ainsi, trente sept milli& d’hectares de ‘forêt disparaissent chaqüe année ( FAO, 1986). Une des principales causes de cette dégradation est la salinisation des terres, associée généralement à une acidification. Houchi et Courdret (1994) soulignent que plus de 15% des terres arides et semi-arides du monde sont naturellement salées ou subissent une salinisation secondaire. Boyer (1982), LeRudulier et al. (1984) et Skriver et Mundy (1990) rapportent que la salinité et la sècheresse sont les facteurs principaux qui limitent dramatiquement la croissance et la productivité des plantes.
Au Sénégal, les sols salés et sulfatés acides sont généralement localisés dans les différents domaines fluvio-marins et côtiers (Fig.1). Dans le bassin du Sine Saloum, la sursalure et Yacidification ont entrainé une extension des tannes (surfaces nues ou couvertes -de végétation caractéristique, affectées par une . salinité qui ne pern& pas leur‘ Utilisation agricole) aux dépens dès terres cultivables. Le Tableau 1 illustre à titre indicatif l’importance des tannes dans trois zones du bassin du Sine Saloum (Daffé et Sadio, 1988).
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Tableau 1. Superficie occupée par les sols sulfatés acides salés dans trois zones du Sine Saloum (Daffé et Sadio,
1988).
Superficie Superficie des sols Supeticie cartographiée Sulfatés acides salés Unités c~ographi&~ ‘.
Zones (ha) (ha) (ha) (3) : ,. .
13500 Zone 1: Djilor, Vélor et 4900 (36%) (l) 2082 (43%) c2) Tannes à végét&iqn herbacée S aloum peu dense et dégradée
Zone II : Tattaguine, 1.5000 7800 (52%) 7324 (94%) Tannes à végétation arbustive Djilass, Diofior, Faoye dense, peu dense et dégradée
Zone III : Sibassor, 13000 4300 (33%) 3652 (85%) Tannes localement couverts 4’ Gandiaye, Keur Alfa, de végétation Keur Bary Saloum
Tannes presque nus
Total 41500 17000 (41%) 13058 (77%)
(1) : Pourcentage par rapport à la superficie totale de la zone.
(2) : Pourcentage par rapport à la superficie cartographiée
(3) : La superficie de la zone comprend, en outre des unités cartographiées, des vasières,
des tannes nus sursalés, des terrains de culture (30-50%) et des forêts.
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Dans cette zone, la végétation herbacée et arbustive encore présente est très peu dense et peu diversifiée. Les espèces végétales qu’on y trouve sont
. Borreria verticillata, Tamarix senegaleyisis, Combretum glutinosum, l
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Conocarpus erectus (Sadio, 1988). Les forêts, particulièrement les forêts a alluviales à Acacia seyal, ont sensiblement disparu sous l’effet de la salinisation (Fig. 2, Diop, 1995). Une étude multidisciplinaire est nécessaire pour réhabiliter ces terres par de nouvelles introductions d’A. seyal.
Arbre de 6 à 11 m de haut, avec une cime aplatie, A. seyal appartient à la grande famille des Leguminosae. Dougall et Bogdan (1958) ont décrit A. seyal avec des fleurs jaunes qui sont en épis globuleux et des gousses en forme de faucille. Son écorce lisse, de couleur jaune-vert, vire souvent à l’orange lorsqu’elle est endommagée. C’est un arbre très adapté aux terres arides des zones sahéliennes. Son bois est dense et très prisé comme bois de chauffe, son feuillage très utilisé comme fourrage pour les petits animaux. Au Kenya par exem.ple, les animaux-consomment par jour jusqu’à 595 kg de feuilles qui. contiennent 4 à 10% d’azote, 4% de calcium et moins de 0,1% de phosphore. C’est une espèce native des zones sahéliennes présente du Sénégal au Soudan. On la rencontre aussi au nord (Egypte) et au sud de l’Afrique (Mozambique). Dans ces zones, on y distingue deux variétés : variété seyal en Afrique tropicale nord et en Egypte ; variété fistula en Afrique de l’Est, du Soudan au Mozambique.
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La régénération,des forêts alluviales à A. seyal du bassin dù Sine, Saloum est un des objectifs de .développement de la région de Kaolack. -Un programme’.
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de recherche a été initié au Centre de Ressources Microbiologiques (MIRCEN) pour améliorer l’adaptabilité d’A. seyal dans cette zone en l’associant avec des microorganismes (rhizobiums et/ou champignons mycorhiziens convenablement choisis). C’est dans ce cadre, qu’il faut inscrire les travaux de Diop (1995) sur la croissance d’A. seyal en association avec Glomus mosseae, champignon endomycorhizien à vésicules et à arbuscules et auquel notre travail fait immédiatement suite. Après une analyse de quelques paramètres physiologiques (teneur en eau, potentiel osmotique et teneur en proline), nous nous proposons dans notre étude de sélectionner des souches de Rhizobium ou de Bradyrhizobium tolérantes au sel et présentant des performances symbiotiques en association avec A. seyal, reconnu comme arbre à fort potentiel fixateur d’azote (Ndoye et al., 1995). Une technique de marquage génétique est utilisée pour étudier la compétitivité des souches séléctionnées.
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Sols salés
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Fig. 1. Localisation des sols salés et sulfatés acides au Sénégal (Daffé et Sadio, 1989).
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I Ces généralités décrivent brièvement l’action du sel sur les associations y b < symbiotiques entre une légumineuse et une so,ucheRhizobium o u _ ., .r
I deBradyrhizobium.
L’importance des légumineuses dans l’agriculture est particulièrement liée
i à leur habilité à fixer l’azote dans leurs nodosités. Cependant, des facteurs de l’environnement tels que la salinité peuvent avoir un effet négatif sur le rhizobium, sur la légumineuse hôte ou sur leur relation symbiotique.
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La croissance des rhizobiums et la fixation biologique de l’azote diminuent avec l’augmentation de la concentration en sel (Pillai et Sen, 1966 ; Steinborne et Roughley, 1975 ; Abdel-wahab et Zahran, 1979 ; Hamdi et Al-Taï, 198 1). Cependant, certains rhizobiums peuvent tolérer de fortes concentrations salines qui sont souvent inhibitrices de la croissance de la plupart des légumineuses (Singh et al., 1972 ; Car-r et Billard, 1979 ; Singleton et al., 1982). Dans le sol et dans la rhizosphère, la salinité réduit la survie et la multiplication des rhizobiums (Alexander, 1984). Aussi, l’effet dépressif du sel sur la nodulation a été décrit par plusieurs auteurs (Pillai et Sen, 1966 ; Singh et al.,
1972 ; Alaa El-Din, 1976 ; Bajpai et Gupta, 1979 ; Singleton et Bohlool, 1984). Ces auteurs expliquent cet effet par une sensibilité accrue des ‘sites d’infection racinaires au sel. D’autre part, Gibson (1969), en étudiant la fixation biologique d’azote chez le trèfle (Trifolium subterraneum) dans plusieurs localités, a conclu que le sel diminue l’activité nitrogénasique des populations indigènes de Rhizobium Zeguminosarum biovar trifolii. Plus récemment, d’autres ‘auteurs ont suggéré que, dans le cas du soja (Glycine max), l’activité nitrogénasique serait limitée par un manque d’oxygène (Hunt et Layzell, 1989 ; Godfroy et Drevon, 1991) et plus précisément à la baisse de diffusion de l’oxygène dans le nodule (Drevon et al., 1995). Il semble également que, l’inhibition de la fixation biologique de l’azote dans des conditions salines devrait être attribuée plus à la légumineuse hôte qu’au rhizobium. Rai et al. (1985), Bekki et al. (1987) et Craig et al. (199 1) pensent que la tolérance de la plante hôte est le facteur déterminant dans l’efficience de l’association d’une légumineuse avec un rhizobium. L’amélioration de l’effïcience de la symbiose fixatrice d’azote en conditions salines nécessiterait donc l’étude des deux partenaires.
l Peu de travaux ont été effectués sur l’action du sel sur les associations Acacia sp. .
L x Rhizobium. Nous citerons que la tolérance à la salinité des souches de Rhizobium isolées d’Acacia sp. a été étudiée par Basak et Goyal (1980) et que la présence des rhizobiums d’A. cyanophylla (Nasr et al;, 1986) et d’A. ampliceps
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(Dart et Zou, 1993) dans un sol salé semble dépendre de leur croissance et des propriétés physiques du. sol.
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2.1. Les sols.
’ .> Neuf sols ont été prélevés dans des zones salées du Sine Saloum et trois’ . dans des zones non salées pour le piégeage de souches de Rhizobium (cf $2.2). Le pH(KC1) de ces sols est indiqué dans le Tableau 2. Les caractéristiques physico-chimiques du sol de la station de Bel-Air, utilisé dans l’étude de la symbiose A. seyal x Rhizobium, sont : argile 3,8 % ; limon fin 1,4% ; limon grossier 0,7% ; sable fin 48,4% ; sable grossier 44,5%; pH(eau) 7,7; pH(KC1) 7,0; carbone 4% ; azote 0,26% ; phospore total 0,37% ; phosphore assimilable 0,28%.
Tableau 2. Valeurs du pH des sols mesurés dans différentes localités de la région de Fatick.
Localités PH
Salin de Fatick 4,99 1’ i :.’
Ngane sous A. sqal à tronc vert 5,76,. I. .,:
Ngane sous A. seyal à tronc orange 5,42
Kouyouré sous A. seyal à tronc vert 7,72
Kouyouré sous A. seyal à tronc orange 8,26
Birkilane 644 1 Village ha Ndour : peuplement d’A. seyai à tronc vert 6,27
1 Village Ibra Ndour : peuplement d’A. seyal à tronc orange 6,31 I Sortie de keur Bouki 5,87 ,’ -a--“.., -- ;
2.2. Les souches bactériennes.
2.2.1. Souches de Rhizobium
Des souches de Rhizobium ont été isolées à partir de nodules racinaires d’A. seyal cultivés pendant 38 jours dans des pots en terre cuite contenant les sols décrits plus haut .
2.2.2. Souche de Escherichia coli .
La souche bactérienne de E.coZi S17-l/ h qui a été utilisée pour la 1 i- transformation d’une souche de Rhizobium (cf. 0 2.4.3) a été fournie par le
1 laboratoire des sciences du sol de l’Agence Internationale sur 1’Energie Atomique (AIEA) de Seibersdorf (Vienne). Cette bactérie renferme le plasmide (pmTn5ssgusA 10) qui contient un gène noté pisA contigu au gène de la résistance à la spectinomycine (Fig. 3). Le gène gusA code pour l’enzyme p-
I- 15
s- Fig. 3. Structure du plasmide pmTn5SS ayant reçu la construction contenant le gène
>[- :;. ~USA et le gène de résistance à la spectinomycine.
. . ‘,~ : _< -, . 1..
OH
f Acide glucuronique -I Acide 5-bromo-khloro-3-indolyl glucuronique ,. . ‘. ._ ., . . . ~ ., _ _ : .:. (X-gluc) ‘?
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Dimérisation oxydative
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Br<~7cp-..-&Br
H H
5,5-bromo-4,~chlore-3,3-bis indigo (précipité bleue)
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Fig. 4. Réaction de clivage du X-gluc par la p-glucuronidase (GUS) avec formation d’un dérivé bis indolique (précipité bleue) par dimérisation oxydative.
16
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glucuronidase (GUS) qui gouverne le clivage de l’acide 5-bromo-4chloro-3- indolyl glucuronique (X-gluc) en acide glucuronique et 5,5-bromo-4,4chloro- 3,3-bis indigo (Fig. 4). Ce dernier produit apparaît .dans le milieu réactionnel sous forme de précipité de couleur bleue. Dans des conditions précises, la présence d’une bactérie renfermant le gène ~USA peut être détectée par cette coloration bleue, l’expression de ce gène se traduisant par la synthése du composé bleu.
2.3. Le matériel végétal
Les graines d’A. seyal ont été fournies par l’Institut Sénégalais de Recherches Agricoles (ISRA) : Unité de Recherches d’Appui aux Productions Forestières sous la référence 9415 117.
3 ,J.$- Lt Lz? C+L,%. 2- 2.4. Obtention des souches bactkiennes
/._.
2.4.1. Isolement des souches de Rhizobium ;” -.
Le milieu Yeast Extract Mannitol Agar (YEM gélosé) dont la composition est indiquée en annexe a été utilisé pour l’obtention des souches de Rhizobium . L’isolement des souches de Rhizobium a été effectué en conditions stériles selon la technique de Weaver et Frederick (1982) : les nodules racinaires prélevés sur des plantes d’A. seyal ont été trempés dans de l’alcool 70% pendant 5 min, rincés plusieurs fois av.ec l’eau distillée. stérile, puis trempés dans une solutionde <. .,. .’ chlorure mercurique à O,l% ‘pendant 3 min. Après plusieurs rinçages à l’eati -” distillée stérile, chaque nodule a été sectionné transversalement. Une portion de la zone centrale rouge indiquant la présence de leghémoglobine a été soigneusement prélevée et déposée dans une boîte de Petri contenant du milieu YEM gélosé. A partir de chaque dépôt, des stries d’épuisement ont été effectuées de façon à avoir, au bout de 3 à 5 jours d’incubation à 28OC, des colonies bien isolées. Chaque isolat obtenu a été purifié par des repiquages successifs à partir d’une colonie bien isolée.
Un test d’infection d’ A. seyal a été effectué pour contrôler l’aptitude de chaque isolat à noduler cette légumineuse : des plantules d’ A. Seyal cultivées en tubes Gibson ont été inoculées avec une culture liquide de chaque isolat et maintenues en chambre de culture régulée à 28°C. Enfin, toutes les souches ont été conservées à 4°C dans des tubes à vis contenant le milieu YEM gélosé incliné.
I L 17
2.4.2. Culture de la souche de E. cali
-
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1.
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.< .La souche bactérienne Ei coli S 17-U a kté cultivée sur milieu Luria . ’ Bertani (LB voir annexe) auquel on a ajouté de la spectinomycine. La solution de spectinomycine préalablement stérilisée par filtration a été ajoutée au milieu LB stérilisé à l’autoclave et refroidi, juste au moment de son utilisation : répartition en boîtes de Petri sur milieu gélosé ou en tubes sur milieu liquide. Dans les deux cas, les milieux ensemencés avec une culture de E. coli ont été incubés à 30°C pendant 24h.
2.4.3. Transformation de la souche de Rhizobium ISFU330 (cf : 0 3.2.3) par E. coli
La souche bactérienne E. coli S17-l/h et la souche de Rhizobium ISRA330 ont été mises en culture liquide respectivement dans le milieu LB pendant 24 h et dans le milieu YEM pendant 48 h (Fig. 5). Cinq millitres de chaque suspension cellulaire ont été ensuite centrifugés à 4000 tours/min, pendant 10 min dans une centrifugeuse Sorvall (rotor SS34). Les culots ont été repris dans 5 ml de milieu YEM et centrifugés à nouveau dans les mêmes conditions. Après cette seconde centrifugation, les culots de E.coZi et de ISRA330 ont été repris respectivement dans 1 ml et dans 0,25 ml de milieu YEM.
La conjugaison,des deux souches a été realisée en étalant stérilement 100 ~1 de chaque suspension bactérienne dans une même boîte de Petri contenant du milieu YEM gélosé. Après une incubation de 24 h à 28”C, 2 ml d’eau distillée stérile ont été déposés sur les colonies apparues dans la boîte de Petri de manière à avoir une suspension bactérienne très dense à partir de laquelle une série de dilution de 10 en 10 a été effectuée jusqu’à la dilution 10-3. Ensuite, 100 ~1 de chaque dilution ont été prélevés et étalés dans des boîtes de Petri contenant le milieu sélectif gélosé BD (voir annexe) en présence de spectinomycine. Ce milieu permet d’inhiber la croissance d’E. coli (à cause du saccharose que E. coli ne peut pas utiliser comme source de carbone) et de la souche d’origine ISRA330 (par la présence de la dose d’antibiotique utilisée). Les boîtes de Petri ont été immédiatement mises en incubation à 28°C pendant 48 h. Durant la conjugaison, le gène ~USA de E. coli est supposé transféré à la souche de Rhizobium ISRA330 (Fig. 6).
18
Aliquots de culture
5ml
1, J
@/ YEM
\
Or .’
centrifugeuse
0,25 ml YEM
\
Souche de E. coli
5mlYEM
J
1 0 YEM gélosé
incubation à 28°C pendant 24h
t /
2 ml d’eau distillée stérile
- BD + spectinomycine
Série de dilution incubation à 28°C pendant 48 h en 10
Fig. 5. Représentation schématique des différentes étapes de la conjugaison bactérienne
19
donneur : E.coZi récepteur : Rhizobium ISRA330 . *
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Rhizobitim ISRA330 contenant le plasmjde pmTn5SS.
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Rhizobium ISRA33OgusA
Fig. 6. Représentation schématique des évènements intervenant lors de la conjugaison entre la souche d’ E. coli et la souche de Rhizobium et conduisant à l’obtention de la souche ISFtA33OgusA.
20
2.4.4. Identification du transconjugant.
_ I- . . * t ,La dilution avec laquelle on.. a obtenu le maximum de. colonies isolées
/ dans les boîtes de Petri contenant le milieu séléctif a ék reprise pour identifier le transconjugant. Cent microlitres de cette dilution ont été déposés dans des boîtes de Petri contenant le milieu BD + spectinomycine + isopropyl-P-D- thiogalactoside (IPTG) + X-gluc. L’incubation a été faite à 30°C. Le transconjugant a été par la suite cultivé et conservé dans le milieu YEM.
2.4.5. Vérification du pouvoir infectif du transconjugant
l Des plantules d’ A. seyal cultivées en tube Gibson ont été inoculées avec 1 ml dune suspension du tranconjugant. Après 20 jours de croissance, les nodules
l ont été prélevés et trempés dans un bécher contenant 30 ml dune solution de X- gluc à 2% dans un milieu tamponné (voir annexe). Les béchers ont été placés
1.’ -. sous vide dans un dessicateur pendant 15 min pour permettre la pénétration du .I X-gluc à l’intérieur du cytoplasme des bactéroïdes des nodules avant d’être transférés dans un bain-marie à 37°C sous agitation pendant une nuit.
I
1:
2.5. Culture d’Acacia seyal
2.5.1. Prégermination des graines
i -. Pour lever l’inhibition tégumentaire, les graines d’A. seyal sont traitées à
<, : : : .‘l’acide sulfurique concentré (H2SO4) pendant ‘30 min et rincées plusieurs fois à ‘I ,’ _. /
l’eau distillée stérile, puis déposées. sterilement dans ‘-des boîtes de Petri contenant de l’eau gélosée stérile à 8 g/l. Après 48 h dans une étuve à 30°C et à l’obscurité, les graines germées ont servi pour la culture en tube Gibson, en pot ou en gaine.
I 2.5.2. Culture en tube Gibson.
l
/ . r
l .
Des jeunes plants d’ A. seyal obtenus après germination ont été repiqués dans des tubes Gibson (Gibson, 1963) de 220 x 22 mm contenant du milieu Jensen incliné dont la composition est indiquée en annexe. Deux orifices ont été percés sur le papier aluminium qui sert d’isolat : un orifice pour introduire la racine des plantules dans le tube et un orifice pour l’adduction d’eau distillée stérile et l’inoculation de la plantule avec une culture bactérienne.
i ._ 21
2.5.3. Culture en pot et en gaine
Des jeunes plants, d’ A. seyal ont été plantes dans des gaines.(ou des pots en terre cuite) contenant 2 kg de sol à raison d’une plante par pot ou par gaine.
2.6. Mise en évidence d’un effet du sel (NaCl) sur la performance symbiotique des rhizobiums
2.6.1. Croissance des rhizobiums en culture pure
L’expérience a été réalisée en milieu gélosé ou liquide. Les rhizobiums ont été cultivées sur des milieux YEM renfermant des teneurs croissantes en NaCl : 0, 1,5, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14 et 16 g NaCl/l. La croissance des rhizobiums est évaluée en milieu solide par l’apparition de colonies dans les boîtes de Petri ou par la turbidité du milieu liquide dans les tubes. D’autre part, une étude cinétique de croissance de deux souches de Rhizobium
- .A :&> I.i : -: sélectionnées a ..été effectuée par mesure de la densité optique a.u spectrophotomètre à la longueur d’onde de 550 nm pour une gamme de concentrations en sel plus restreinte : 0,8, 12, 16 g NaCl/l.
2.6.2. Effectivité des rhizobiums
2.6.2.1. Cultures réalisées en tube Gibson
Des plantules d’A. seyal ont -été mises en culture dans des tubes Gibson . . . ; .‘.
< .: -; 1 ‘.> .: < [ ! . ; “ .-Y. 1: - contenant.-unmilieu Jensen gélosemodifié :. sans -NaCl (voir annexe): Les tubes ..: 0’ ainsi préparés ont été répartis en quatre groupes correspondant aux quatre traitements (0, 8, 12 et 16 g NaCl/l). Chaque groupe a été redivisé en 3 lots de
G .c~wd,12 plante* Dans chaque tube Gibson, le sel a été ajouté à la solution nutritive F Jensen en respectant les concentrations. Ensuite, chaque plantule (à l’exception
des plantules témoins) a été inoculée avec 1 ml d’une suspension de rhizobium sélectionné (ISRA330 ou ISFU345) contenant 109 cellules/ml. L’effectivité des rhizobiums a été évaluée par la croissance des plantes, le nombre et le poids sec des nodules et par la mesure de l’activité nitrogénasique.
La croissance des plantes est évaluée par la mesure du poids de matière fraiche (PMF) et du poids de matière sèche (PMS) des parties aériennes. Le poids sec est mesuré après séchage à l’étuve de la partie aérienne à 70°C jusqu’à poids constant. La teneur en eau est calculée à partir de la différence entre le poids de matière fraiche et le poids de matière sèche, exprimée en pouLçent7 du poids frais. 2
22
‘Y . 2.6.2.2. Cultures réalisées en gaine
,= r _. Des plantules SA. seyal ont. été cultivées dans des gaines contenant du sol,, ‘prélevé à la station de’ Bel-Air.’ ‘Pour évaluer’l’effectivité des rhizobiums, un
1 dispositif expérimental non randomisé à deux facteurs répétés 6 fois a été adopté. Le premier facteur comprenait 3 niveaux : inoculation avec la souche
i I . ISRA330, inoculation avec la souche ISRA345 et un niveau sans inoculation. Le
second facteur comprenait 4 niveaux correspondant aux quatre concentrations
i en sel : 0, 8,12 et 16 g NaCKl.
L’inoculation des plantules a été faite au moment de leur repiquage avec une suspension de rhizobium contenant 109 cellules/ml. Compte tenu de la fraction sablonneuse assez élevée du sol de Bel-Air, la solution de sel est apportée 1 semaine après repiquage et pendant 3 jours successifs à raison de 100 m.l par gaine et par jour.
.,.,.” 2.6.3. Compétitivité’de la”souch&RA330 ’ :.._. -...
;r I<. . i
I -- I I
La compétitivité de la souche ISRA330 vis-à-vis des souches natives du sol de la station de Bel-Air a été étudiée en serre en présence ou en absence de sel. Pour cela, une expérience a été conduite dans des pots en terre cuite contenant 2 kg de sol prélevé à la station de Bel-Air non stérilisé avec des concentrations en sel croissantes (0, 8, 12 et 16 g NaWl). La souche dénommée ISRA33OgusA (vior 5 3.4.1) ayant.acquis le gène ~USA a été utilisée dans cette .-expérience. Les gr.aines. d’A> SeyaZ prétraitées ont été directement semées. dans. ‘.* ’ les pots.
+.
L’expérience était basée sur un dispositif factoriel non randomisé à 2 facteurs répétés 6 fois. Le premier facteur comprenait 2 niveaux : inoculation avec la souche ISRA33OgusA et un niveau sans inoculation. Le second facteur comprenait 4 niveaux correspondant aux quatre concentrations en sel : 0, 8, 12 et 16 g NaClZl. L’inoculation avec la souche de ISRA33OgusA a été faite le jour du repiquage avec 1 ml d’une culture bactérienne contenant 109 cellules/ml. Pour chaque concentration, le sel a été apporté une semaine après repiquage à raison de 100 ml par pot et par jour pendant 3 jours.
2.7. Méthodes analytiques
2.7.1. Mise en évidence de l’effet du stress salin sur la plante
23
2.7.1.1. Mesure du potentiel osmotique.
L’osmomètre type WESCOR 5500 VPO a été utilise pour déterminer la . . valeur du potentiel osmotique d’une feuille prélevée sur des plantes ayant subi ’ un stress court précédé d’un premier stress long de 5 mois. Lors du stress long, les plantules d’A. seyal ont été repiquées dans des pots en terre cuite contenant du sol de Ngane (dont la concentration initiale en sel est de 8 g NaCl/l) auquel on a ajouté des solutions salines de 4 et 8 g NaCl/l de. façon à avoir des concentrations finales de 12 et 16 g NaCl/l par pot. Au bout de 5 mois, un deuxième stress de 6 et 12 g NaCl/l a été réalisé sur les plantes ayant la même hauteur. Une feuille a été prélevée au niveau du sixième entre-noeud de chaque plante à partir de l’apex, placée dans un tube Eppendof et conservée à -80°C jusqu’au moment de l’extraction. Les extraits ont été obtenus en broyant les feuilles dans le tube. Pour la mesure du potentiel osmotique, 10 ~1 de chaque extrait ainsi obtenu ont été déposés sur un papier filtre maintenu dans une loge à l’intérieur de la chambre de mesure de l’appareil préalablement etalonné .et .‘--.,:,- :. placé dans des conditions fixes de température (27°C). La mesure est exprimée en mmole/kg et représente l’osmolalité de l’extrait (Cosm). Le potentiel osmotique peut alors être exprimée en bar ou en MPa par la formule : PO = R.T.cosm dans laquelle T est la température en degrés Kelvin, R la constante des gaz parfaits (R = 0,0831432 litre) et Cosm l’osmolalité.
/ 2.7.1.2. Dosage de proline
. - La méthodede dosage choisie est celle de Sing et aZ., (1973) “dont la’ ., technique d’extraction permet d’isoler la proline des autres acides aminés grâce à ses propriétés physico-chimiques. Dans un mortier maintenu dans la glace, la feuille fraîchement récoltée (400 mg) a été broyée dans 5 ml d’ethanol95% en présence de sable de Fontainebleau. Le surnageant a été versé dans un flacon muni d’un bouchon. Le résidu de feuille a été de nouveau broyé deux fois dans 5 ml d’ethanol75%. L’ensemble des sumageants a été collecté dans le flacon et agité. Cinq millilitres de ce surnageant ont été prélévés et auxquels on ajouté 2 ml de chloroforme et 3 ml d’eau distillée. Après agitation, le mélange a été conservé toute la nuit à 4°C. Dans un tube à essai, 1 ml de la phase supérieure ainsi obtenue a été déposé plus 1 ml de solution de ninhydrine (voir annexe) et 1 ml d’acide acétique glacial. Après agitation, le mélange a été placé pendant 45 mm au bain-marie à 100°C. Après refroidissement, 3 ml de benzène ont été ajoutés, le mélange a été laissé au repos pendant 30 min. La phase supérieure (benzénique) colorée contenant la
24
proline a été alors récupérée et sa densité optique mesurée au spectrophotomètre à la longueur d’onde de 515 nm. La gamme étalon aJeté établie à partir d’une solution de proline .à O,$ mM, les différentes concentrations en proline ont subi les mêmes traitements que précédemment.
2.7.2. Evaluation de 1’Activité Réductrice d’Acétylène (ARA) : méthode de Hardy et al., 1973
2.7.2.1. Principe et conditions expérimentales
La nitrogénase est l’enzyme qui catalyse la réduction biologique de l’azote atmosphérique selon la réaction :
N2 + 6H+ + 6e- + 2NH3
Cette enzyme-. peu spécifique ‘est capable d’accepter d’autres substrats caractérisés par la présence d’une triple liaison, tel que l’acétylène (C2H2) qu’elle réduit en éthylène (C2H4) :
C2H2 + 2H+ + 2e- e C2H4
Après séparation des parties aériennes et racinaires, les racines nodulées sont incubées dans des flacons de 15 ou 25 ml. Un volume d’acétylène correspondamà KY@ du. volume d’incubation, a été injecté à l’aide d’une seringue ,> . _a’, dans’ le flacon à.travers son bouchon en caoutchouc. Apres 30 min d’incubation, -‘ un prélévement gazeux de 0,5 ml a été effectué et injecté dans un chromatographe de type Varian Aerograph série 1400, équipé d’une colonne de spherosil XOB hydrogène 075 en acier inoxydable 120 cm x 0,02 cm .
2.7.2.2. Calcul et expression de 1’ARA
La détermination de L’ARA par chromatographie nécessite une référence d’éthylène (C2H4) étalon préparé au laboratoire en mettant 0,57 ml d’éthylène pur dans une fiole de 570 ml, soit un étalon d’éthylène dilué à 10-3. Rappelons que 1 mole de C$!!I4 = 22400 ml. Un prélévement de 0,5 ml correspond à :
1 x 0,5 22.400
x 2,23. 10m5 moles C2H.4
25
!‘ La quantité d’éthylène étalon injectée dans le chromatographe (soit 0,5 ml) contient : 2,23.10-5 x 10-3 = 2,23.10-s moles C2H4
: Si h ést la hauteur en cm du pic étalon obtenu, 1 cm de pic correspondra à :
,
Ï
2,23.16g h
moles C2H4
Soit h’ la hauteur du pic du prélévement (0,5 ml) gazeux de l’échantillon obtenu après l’incubation des racines sous acétylène, la quantité de C2H4 contenu dans 1 ce prélévement sera égale à :
I
2,23X1-* h
x h’ moles C,ti
Si V(m1) est le volume du flacon d’incubation, la quantité totale de C2H4 contenue dans le flacon sera égale à :
2,23 l# x h’ h
J-moles C2H4 x 0,5
L’AFM spécifique est la quantité de C~IQ/h&ramme de nodules secs.
l- 2.7.3. Dosage de l’azote total
l .- i I-
I
Le dosage a été réalisé au laboratoire de biochimie des sols de I’ISRA à ..: Bambey. selon la .methode de Kjelda.hl : 50 mg de la poudre végétale sont
minéralisés dans un tube à essai avec 1,5 ml de HQS 04 additionné à un catalyseur de sélénium. Les tubes sont placés dans un thermobloc ajusté à 350°C pendant 2 h environ, jusqu’à l’arrêt d’émission de fumées blanches. Le rninéralisat est distillé avec déplacement de l’azote ammoniacal par 5 ml de NaOH 10N. Le distillat est recueilli dans un bécher contenant une solution d’acide borique 2% dont le pH initial est connu. Cette opération fait augmenter le pH du milieu réactionnel contenu dans le bécher. Le dosage est effectué après la distillation par titration avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) N/28. L’acide chlorhydrique est apporté jusqu’au retour du pH initial de la solution d’acide borique.
La masse atomique de l’azote étant de 14, à 1 ml de. solution de HC1 N/28 ajouté correspond 14/28 = 0,5 mg d’azote, un calcul permet de déterminer la concentration en azote (%N) des parties aériennes.
c
i 26
r i Si X ml de HC1 N/28 sont nécessaires pour neutraliser l’azote ammoniacal
c provenant de 50 mg de poudre végétale, la concentration en azote est calculée
I7 * ,.commesuit:,, . i: . . . ‘. .J
I I 0,5x x 100 x%
1 50 =
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3.1. Les réponses physiologiques de la plante au stress saiin . .
Les tlravaux de Diop (1995) ont montS que le sel affecte la germination (faible taux de germination à 20 g NaCl/l) et la croissance d’A. seyal (diminution de la hauteur et du poids de matière sèche des parties aériennes), ce qui a été confirmé dans notre étude (cf. 8 3). Pour mieux mettre en évidence l’effet du sel sur A. seyal, la teneur en eau des parties aériennes, le potentiel osmotique des feuilles et leur teneur en proline ont été mesurés sur des plantes âgées de 5 mois et cultivées en présence de sel pendant 8 ou 12 jours.
L’analyse des figures 7A et 7B montre que l’hydratation des parties aériennes est peu modifiée par le sel. En effet, après 8 ou 12 jours de traitement, bien que dans la plupart des cas les plantes traitées présentent une teneur en eau inférieure à celle des témoins, les différences observées entre témoins et plantes stressées ne sont pas significatives. -::’ _. ‘ ‘;;.: ^1 =
Les figures 7C et 7D montrent les variations du potentiel osmotique des plantes témoins et des plantes stressées. On note une réponse plus marquée à 8 jours où, quel que soit le traitement (6 ou 12 g NaClIl), le potentiel des feuilles
WW.-V chute (environ -1 à -2 MPa) : il est deux fois moins important chez les plantes stressées. Par cx, cet effet n’est observable après 12 jours que chez les plantes ayant reçu 6 g NaCl/l, les plantes témoins présentant un potentiel osmotique plus faible (- 3.,8 MPa) que les plantes traitées à 12 g/l (-1,5 MPa). , :
‘. <* L’analyse de la teneur en proline des feuilles (fig.7E et 7F) montre une ,”
légère accumulation de la proline dès le 8eme jour pour les plantes traitées. Cette accumulation est d’autant plus grande que le traitement est fort. Une forte réponse est obtenue après 12 jours de traitement à 12 g/l (5 fois la teneur en moyenne). Cependant cette réponse n’est pas observée chez toutes les plantes et comme dans le cas de la mesure du potentiel osmotique, les plantes traitées à 6 g/l présentent après 12 jours des concentrations en proline inférieures au témoin.
L’analyse des figures (7C et 7E ensuite 7D et 7F) montre que la faible production de proline après 8 jours de traitement est corrélée à une baisse du potentiel osmotique ceci quel que soit le traitement. Par contre, si après 12 jours de traitement, cette corrélation est maintenue pour le stress à 6 g/l, elle disparait pour les plantes ayant reçu 12 g/l : chez ces plantes, la production importante de proline s’accompagne d’une augmentation du potentiel osmotique.
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(Après 8 jours de traitement) . .:
40 8
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10
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50
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10
0 C 0 E
près 12 jours de traitgme
Fig. 7. Evalution de la teneur en eau des parties aériennes (A et B), du potentiel osmotique (C et D) et de la teneur en proline des feuilles (E et F) che’z des plantes d’A. seyal âgées de 5 mois soumises ou non à un stress salin à 6 ou12 g NaCl/l pendant 8 ou 12 jours. MF : matière fraiche.
, 1 i 1 ’ --. -- - -, -- -- +-- :. I 1’ ‘!.-.J :. %,-.-..L .- _: ~ : b.--.-d _ ~-_.- _. -A --J
Ce maintien de la teneur en eau des parties aériennes chez les plantes subissant un stress salin a été montré par Lachall et al. (1994) chez deux espèces d’Hedysarum (H. coronaruim et p. camosum ). Cette réponse pourrait indiquer que 1’A. Se?ul, en présence de sel, présente une alimentation hydrique convenable. La diminution du potentiel osmotique ou l’apparition d’une production importante de proline dans les feuilles correspond à une réponse “classique”des plantes face à un stress salin (Schobert, 1977 ; Csonka et Hanson, 1991 ; Delauney et al., 1993 ; Levigneron et aZ.,1995). Cependant, toutes les plantes ne répondent pas avec la même sensibilité à l’application du stress et, dans cette expérience nous nous sommes heurtés à une forte variabilité de réponse. En fait, l’étude a été menée sur des graines non sélectionnées issues d’une même aire géographique non soumise à une contrainte saline. Ces graines n’ayant pas subi de pression de sélection pour la résistance au sel, elle devrait présenter une forte diversité génétique quant à leur réponse à l’action du sel.
La sensibilite.des plantes d’A, seyal, en partitiulier, au sel semble indiquer que, dans l’etude des effets des stress salins sur la fixation biologique, il serait plus judicieux d’étudier le partenaire bactérien et l’effet de l’association sur la tolérance des plantes au stress salin.
3.2. Sélection de souches de Rhizobium
3.2.1. Isolement des souches de Rhizobium
Trente. et-une souches de Rhizobium ont été isolées à partir de 13 sols. Après 48 h de culture dans des boîtes de Petri contenant du milieu YEM, 11 souches avaient présenté un aspect muqueux et 20 souches étaient des colonies blanchâtres et punctiformes (0 < .l mm ). Toutes les souches ont été cataloguées dans la collection du Centre de Ressources Microbiologiques (MIRCEN) de l’Institut Sénégalais de Recherches Agricoles (ISRA), (collection ISRA/MIRCEN) sous les numéros ISRA262 à ISRA271 et ISRA326 à ISRA346 (Tableau 3), sans tenir compte de leur appartenance au genre Rhizobium ou au genre Bradyrhizobium.
3.2.2. Tolérance des rhizobiums d’A. seyal au sel : étude en milieu gélosé et en milieu liquide
Une culture des souches en milieu gélosé contenant des teneurs croissantes en NaCl a été réalisée. Elle montre que la plupart capables de croître en présence de fortes concentrations en sel.
des souches sont
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Tableau 3. Nomenclature, origines, coordonnées géographiques et’aspect des souches deRhizobium isolées d’A.
seyal.
.J Numéio Aspect des C Otiginé Coordonnés .> .’
ISRA souches géographique géographiques
262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343
I 34 , 345 346
muqueuse Salin de Fatick colonies isolées Salin de Fatick colonies isolées Salin de Fatick colonies isolées Salin de Fatick muqueuse Kouyouré muqueuse Kouyouré muqueuse Entrée Birkilane colonies isolées Ngane muqueuse Rosso Sénégal colonies isolées Ngane colonies isolées Village Ibra Ndour colonies isolées Village Ibra Ndour colonies isolées Village Ibra Ndour colonies isolées Keur MBouki colonies isolées Ngane muqueuse Keur MBouki muquense Kouyouré colonies isolées Kouyouré colonies isolées Village Ibra Ndour colonies isolées Salin de Fatick colonies isolées Ngane colonies isolées Kouyouré colonies isolées Station ISR4 Fanaye muqueuse Kouyouré colonies isolées Kouyouré muqueuse Ngane muqueuse Ngane colonies isolées Birkilane colonies isolées Djibilor colonies isolées Samé (4 km de Bara) muqueuse Samé (4 km de Bara)
14”20 N-16’24 LW Al: 6 14’20 N-16’24 LW Al : 6 14’20 N-16”24 LW Al : 6 14”20 N-16”24 LW Al : 6 nd nd 14’08 N-15’45LW Al : 5 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 14”20 N-16”24 LW Al : 6 nd nd 16”23 N-15”13LW Al : 10 nd nd nd nd 14008 N-15’45LW Al : 5 12’33 N-16=96 1,W Al :26 nd nd
Al : Altitude LW : Longitude Ouest N : latitude Nord nd : non déterminé
Ainsi (Tableau 4), on constate que 21 souches se développent dans un milieu contenant 14 g NaCl/l (ISRA262, 265, 266, 267, 268, 270, 271, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 341 et 342). Parmi elles, 10 souches résistent à des concentrations supérieures à 14 g NaC/l (ISRA265,266, 271, 326, 328, 330, 336, 339, 341 et 342). On note également que, parmi les 31’ souches isolées, 3 sont moyennement résistantes avec un seuil de 8 g NaCM (ISRA263, 345 et 346) et 1 seule (ISRA338) est très peu résistante au sel : aucun développement n’est observable dès que le seuil de NaCl dépasse 3 g/l.
32
.:
L c Tableau 4. Etude de la croissance des souches sur YEM gélosé B différentes concentrations en NaCl
r . î ’ I .
l
i i- 1
Numéro Concentrations en NaCI @A)
ISti’ ! ” 0 1.5 3 4.’ ’ 6 7 8 10 ‘12 14 16
262 +
263 +
264 +
265 +
266 +
267 +
268 +
269 +
270 +
271 +
326 +
327 +
328 +
329 +
330 +
331 +
332 +
333 +
334 +
335 +
336 t
337 t
338 +
339 +
340 +
341 +
342 4
343 +
344 +
345 +
346 t
+ + + + + + + + t + + + + + + t + + t + + + + + + + + + + + t
t t t t t t + t + t + t t + t t t t t t t t t t + + t t t t t
t t t + t + t + t t t t + + + + t t t + t +
+ t t + t t t t
t t + t t + + + t + + + + t + t + + + + + t
+ + t + t + + +
t t + + t t t t t t + t + + t t + t t + t t
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t -
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t -
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+ +
t +
+ : croissance bonne - : croissance nulle
La même observation a été réalisée lorsque ces souches sont cultivées en milieu liquide. En milieu liquide, la tolérance des souches au sel a été sensiblement la même qu’en milieu gélosé. La moitié des souches peut croître dans les milieux dont les teneurs en sel sont inférieures ou égales à 14 g NaClA (15). Cependant, le seuil de tolérance a été différent pour quelques souches : 7 g NaCl/l pour ISRA 346 ; 12 g NaCl /l pour les souches ISRA263,264,267,327, 331,332,333,336 et 340 ; 16 g NaCl/l pour la souche ISRA337 (Tableau 5).
33
Tableau 5. Croissance des souches de Rhizobium en milieu YEM liquide à différentes concentrations en NaCl.
* ,
I
Numéro Concentrations en NaCl (g/l)
.: ., ISRA 0 1,5 3 4 6 i 8 10 12 ‘14 ;6
, 262
r . . 263 264 265 266 r 267 268 269 I 270
I 271 326
; 327 i 328
329
l .- . ‘: 330
‘331 332
l
-..
333 334 335
i 336 337 - 338
r 339 340 I
- 341 . 342
343 344 345
I , 346
t t t t t t + + + t t t t + t t t t t t + t t t + t + t t + t
+ + t + + t + t t t t t + t + ‘t + + + + t + t + t + + + + t +
t + t + + + + + + + + + + + + + + + t t + + + + + t + t + t t
t t t + + + + + + + + + + + t + + + t + + + + t + t t + + + t
t t + + + + + t + + t + + + + + + + + + + +
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t
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+
t +
+ : croissance bonne - : croissance nulle
Cette étude de la tolérance au sel des rhizobiums d’A. seyal a permis un premier criblage basé sur l’observation du développement de colonies des rhizobiums dans les boîtes de Petri ou sur l’observation de la turbidité du milieu de culture liquide dans les tubes à essai. Bien qu’approximatif, ce criblage a mis en évidence la diversité; soie=%: s@ïïde sensibilité au sel! ---_ --/ Que le milieu de culture soit liquide ou gélosé, les rhizobiums que nous avons isolées d’A. seyal ont tous présenté une tolérance au sel mais à des seuils différents. Dans les conditions de notre expérience, la souche ISRA 338 a été
L 34
/ .
1,: c
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plus sensible au sel (seuil de tolérance inférieur à 6 g/l), alors que dix souches tolèrent le sel apporté à des doses supérieures à 14 g NaCl/l.
. . ~ i J
Wilson et Norris (1970), puis Rai (1983) avaient aussi montré que les’
. . y .: .;.., . .
limites de tolérance au sel de différentes souches de Rhizobium varient considérablement (de 50 à 400 mM NaCl). Plus récemment, La1 et Khanna (1994) ont également montré cette variabilité sur 35 rhizobiums isolés d’Acacia nilotica. Cependant, le seuil de tolérance à NaCl pour la souche la plus sensible (300 rnMsoit 17,5 g NaCl/l) diffère de celui observé dans notre expérience (8 g NaCl/l). La variabilité des rhizobiums que nous avons observé dans la tolérance au sel a été également décrite par Grego et al. (1995) en comparant le comportement des isolats d’A. raddiana en provenance de sites du Sénégal et de Tunisie. Hua et al. (1982) ont également observé une croissance des souches de Rhizobium isolées de Prosopis sp. en présence de fortes concentrations de sel. De même Rhizobium meliloti est particulièrement résistant au sel (Subba Rao et aZ.,197-2 ; LeRudulier et ak., 1983 cet Sauvage et al.; 1983) et peuvent tolèrer jusqu’à 35 g NaCl/l (Steinborn et Roughley, 1975 et Abdel-wahab et Zahran, 1979).
3.2.3. Effectivité des rhizobiums
L’effectivité des 3 1 rhizobiums associés à A. seyal cultivés en tube Gibson a été très variable (Tableau 6). Parmi les 31 souches étudiées, 7 présentent une ARA inférieure ou égale à 50 nmoles C2H4 /plante/h ; 19 ont été moyennement
:.._ - .._ effectives (ARA moyenne : 636 nmoles-C$Q/plante/h) ; 5 ont été très effectives .’ (ARA moyenne : 1145 nmoles/plante/h).
Parmi les souches très effectives, nous en avons sélectionné deux d’origine et de tolérance au sel différentes afin de comparer leur cinétique de croissance à différentes concentrations salines : la souche ISRA330 isolée d’un sol salé de Ngane (ARA égale à 1263 nmoles C2H4/plante /h, seuil de tolérance supérieur ou égal à 16 g NaCl/l) et la souche ISRA345 isolée d’un sol non salé de Samé (ARA égale à 1024 nmoles QH4/plante/h, seuil de tolérance égal à 10 g NaCUl).
35
Tableau 6. Effectivité des souches de Rhizobium isolées d’A. seyal et testées en tube Gibson.
_ 1’ Numéro Activité~Réductrice Effectivité
ISRA d’Acétyléne (ARA) , en nmol
C2Hq/plante/h
- - : !,
f
c Il
262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 326 327 328 329 330
&$332 :, 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343
j’ 344 ‘-345 346
157 219 31 116 487 130 21 234 30 191 103 335 1148 131
1263 ‘.. ‘::j-j:: ..
335 347 326 130 352 153’ 47 188 746 335 526 49
1024 349
e e 1 e e e 1 e 1 e e
E
E 1 .:.. e e e e e e 1
E
E 1 E e
E : souche très effective e : souche effective i : souche ineffective
3.2.4. Cinétique de croissance des souches ISRA330 et ISRA345 en fonction de la concentration en sel
,:’ :
En ce qui concerne la souche ISRA330, les courbes de croissance obtenues (Fig. 8A) ont été conformes, quelle que soit la concentration en sel, aux courbes standard de croissance bactérienne. Les quatre courbes comportent une phase de latente de 5 h, une phase exponentielle entre 5 et 12 h et une phase stationnaire après 12 h d’incubation. La pente des courbes a été sensiblement identique, sauf pour la concentration de 16 g NaCWl pour laquelle la vitesse de croissance est légèrement plus faible. La densité des suspensions bactériennes en fin de culture a été identique pour les concentrations 0 et 12 g NaCl/l (DO =
36
1..
/--*
!-. . 1
i I -
s
i
.
i
i . _. 1’
0,37), plus élevée en présence de 8 g NaCl/l (DO = 0,45) et plus faible à 16 g NaCl/l (DO = 0,28). Cette observation sùggère qu’à partir de 8 g NaClil, le sel a
., une influence sur la croissance de la souche ISRA330, mais n’empêche pas le . développement de la souche. Les cinétiques de croissance de la souche ISRA330 présentent des similarités à celles d’isolats de Rhizobium meliloti provenant d’un sol salé, pour lesquels une meilleure croissance est obtenue dans un milieu contenant 150 mM NaCl (soit 8,8 g NaWl) comparé à un milieu sans NaCl (Kassem et al. 1985).
Par contre, en ce qui concerne la souche ISRA345, une courbe de croissance bactérienne exponentielle n’a pu être obtenue qu’en absence de sel (Fig. 8B). Cette souche présente une longue phase de latente de 20 h suivie d’une phase exponentielle entre 20 et 35 h de culture. La phase stationnaire est atteinte -au bout de 40 h et comporte, comme pour la souche ISRA330, une densité de population 6 fois plus importante. Cependant, en présence de sel, quelle que soitsa concentration, la croissance de la souche ISRA345 est inhibee,
Les souches ISRA330 et ISRA345 ont une croissance et un comportement très différents vis-à-vis de la salinité. En se référant aux travaux de Tu (1980) et de Beunard (1995), ces différences permettraient de classer les souches dans deux groupes différents : la souche ISRA330, plus tolérante, appartiendrait au genre de Rhizobium, par contre, la souche ISRA345, plus sensible, appartiendrait au genre des Bradyrhizobium. Des études complémentaires’ de caractérisati.on.fàisant..appel à des techniques plus fines telles que celles relatives à la biologie moléculaire ‘sont à envisager pour confirmer l’appartenances de chaque souche à l’un ou l’autre genre, les deux types de groupe de souches pouvant noduler A. seyal (Dreyfus et Dommergues, 1981).
3.3. Effet de la salinité sur la croissance et la fixation biologique de l’azote chez A. seyal inoculé avec les souches ISRA330 et ISRA345
Dans cette étude, réalisée en tube Gibson et en gaine, les paramètres mesurés ont été la hauteur des plantes, le poids de matière sèche des parties aériennes et des nodules, la teneur en azote et l’azote total des parties aériennes, la fixation biologique de l’azote exprimée par 1’ARA par plante @RAP) ou par unité de poids sec de nodules (ARA spécifique ou ARAS).
L 37
0,5 4
074
i 073
si
; 0,2
:.
0,20
0,15
A temps 0.4
‘.
temps (h)
0 g NaC111 - 8g NaClIl - 12 g NaClIl - 16 g NaClIl
Fig. 8. Evaluation de la croissance des souches ISRA330 (A) et ISRA345 (B) en fonction de la concentration en NaCl par mesure de la dénsité optique.
i _- 38
r 1 * l-. .i
l _.. i L L
Dans le cas de l’expérience en tube Gibson (Tableau 7), l’analyse de variante de tous ces paramètres. a montré une interaction significative (p = 0,05) du sel et de l’inoculation,. sur la hauteur des plantes, le poids. de matière sèche : des nodules et la fixation biologique de l’azote. En ce qui concerne le poids de matière sèche des parties aériennes, il n’y a pas eu d’interaction du sel avec l’inoculation : pour ce paramétre, il y a eu un effet principal significatif (p = 0,05) du sel et un effet significatif de l’inoculation avec la souche de Rhizobium ISRA330 ou la souche de Bradyrhizobium ISRA345
L’analyse détaillée de ces paramètres, montre que, en ce qui concerne la hauteur des plantes, l’inoculation d’A. seyal avec les souches ISRA330 et ISRA345 a un effet positif en absence de NaCl (Tableau 9) : la croissance des plantes est respectivement améliorée de 55% et 27% par rapport aux plantes non inoculées. Pour les deux souches, cet effet s’estompe avec l’apport croissant de sel. Ainsi, pour la souche ISRA330, cette augmentation a été de 42% à 8 g ??aCl/l et d.e 14% a 12 g NaCl/l. Pour la souche’ISRA345, l’effet positif est masqué dès le seuil de 8 g NaCUl. Toutefois, à chaque niveau d’apport de NaCl, l’inoculation d’A. seyal avec une quelconque des souches utilisées augmente la hauteur des plantes par rapport aux plantes non inoculées.
En ce qui concerne le poids de matière sèche des nodules, aucune différence significative n’a été observée entre les plantes n’ayant pas reçu de NaCl et inoculées avec les souches ISRA330 ou 345 d’une part, et les plantes ayant reçu 8 .g NaCM et inoculées avec la souche ISRA330: dtautre part. Cependant, il y a eu un effet très significatif du sel sur la faxation biologique de l’azote pour la souche ISRA330 : 1’ARAP a diminué avec l’accroissement de la concentration en sel de -72,2%, - 95,7% et -96,2% respectivement à 8, 12 et 16 g NaCl/l ; les diminutions correspondantes de l’ARAS ont été de -49%, -73% et -89% (Tableau 9). Après une réduction de -75% à 8 g NaCl/l, l’effectivité de la souche ISRA345 a été nulle aux concentrations supérieures à ce seuil (Tableau 9).
Le poids de matière sèche des parties aériennes a significativement diminué avec l’accroissement de la concentration en sel, si on analyse globalement les valeurs obtenues avec la souche ISRA330 et la souche ISRA345. Cette diminution a été de -20% et -55% respectivement pour les concentrations de 8 g NaCM, et 12- 16 g NaCl/l (Tableau 10). 3
39
i. ,. : balF 1 c Tableau 7. Analyse de variante de. la hauteur, du poids de matière sèche des parties aériennes et des, nodules, de t’. .<
i
l’activité réductrice d’acétylène (AR4) d’A. seyaf cultivé en tube Gibson pendant 40 j”ours en présence de sel et
inoculé avec les souches de Rhizobium ISFL4 330 et ISRA 345.
Poids de matière sèche ARA
i Source de variations ddl Hauteur PA Nod. par plante Spécifique
* * I Inoculation 2 35,3 * 9,9 21,9 545” * 38,7 **
Sel 3 44,6 ** 24,3 ** 10,6 29,4** 14,2 ** ,
l Inoculation x sel 6 3,8 * 12 3,7 * 24,3** 9,6*
C.V.(%) 12,8 28,3 99,0 86,4 93,0
* : significatif à p = 0,05
* * : très significatif à p = 0,05
ddl = degiè de liberté
t
tYQ$oh bl a eau 8. Analyse de variante de la hauteur, du poids de matière sèche des parties aériennes et des nodules, de
l’activité réductrice d’acétylène (AlU), de la teneur en azote et de l’azote total des parties aériennes d’A. seyd
I cultivé pendant 40 jours en serre, dans des gaines contenant 2 kg de sol stérile en présence de sel et inoculé avec
l .. I_
les souches de Rhizobium ISRA 330 et ISR4 345. .( : -,... I.
Poids de matière sèche
Source de variations ddl Hauteur PA Nod Dar ulante soéciflaue % N N total
Inoculation 2 678 299 10,9 * 7,7* 22,4 ** 5,2 * 4,2 * L.
Sel 3 109,9 ** 70 ** 17,9 ** 9,5* 135 7,8 ** 19,O **
Inoculation x sel 6 3,3* 4,6* 2,6 * 190 1,7* 1,8 2,2
C.V.(%) 15 20,5 94s 116,O 88,5 39,9 40,6
* : significatif à p = 0,05 .-
_1 * * : très significatif à p = 0,05
1.. - . i c .
i L-
I
L 40
l .-
i . . r. . i W-~+TQ .\ L Tableau 9. Effet de l’association sel x inoculation sur la hauteur, le poids sec des nodules et I’ARA des plantes
d’A. seyalçultivées en tube Gibson pendant 40 jours et inoculées avec les souches IS.RA 330 ou 345.. .I I :’
r [NaCI ] (!a
Inoculation Hauteur Poids mat.&. Nod. Al2AP AFCAS (cm/plante) (mg/plante) (nmole C2H&) (nmole C2H4/mg)
r 1
0 Témoin 6,6 de 070 090 070 ISRA 330 10,2 a 10,5 a 439,8 a 45,2 a ISIU 345 8,4 bc 6,5 a 27,5 c 5,8 b
8 Témoin 5,82 defg ao ao W-J ISRA 330 9,4 ab 8,5 a 122,3 b 14,9 b ISPA 345 6,05 def 1,o b 6,7 c 3,8 b
i .
I .- 12 Témoin 5 55
7:53 efg 090 090 090
ISRA 330 cd 2,3 b 19,0 c 8,4 b ISRA 345 6,05 def ao 090 090
16 Témoin 4,18 g w 090 090 1sR.A 330 4 8 efg 1,9b 15,7 c 4,9 b
,’ < 2 c ‘. .. ISRA 345... 4:5 fg 0,f-J ;, o,o;‘-~ .Y_<’ 0,o a:..
._ 1. Pour chaque colonne, les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de
5% d’après le test de Newmann et Keuls.
i I ;. Y C> y - a “’ > . ..I’ L’ ‘,: ‘k ” tube Gibson pendant 40 jours et inoculées avec les souches ISRA330 et ISRA345.
I : . .
b”p LT Tableau 10. Effet du sel sur le poids de matière sèche des parties aériennes des plantes d’A. seyal cultivées en
1 NaCIl ( d0
0
8
12
16
Poids mat.sec PA (mg/pl)
a 86,8
69,3 b
41,3 c
37,0 c
Les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d’après le test de
I Newmann et Keuls
41
l .
. ,.!
l .L__.
i .
i
@fl bfl 1 8’ Tableau 11. Effet de l’inoculation sur le poids de matière sèche des parties aériennes des plantes d’A. seyaf t
cultivées en tube Gibson pendant 40 jours et inoculées avec les souches ISRA330 et ISRA345. . . .s ! .,
Inoculation Poids mat. sec PA (mg/pl)
Témoin 49,6 b
.ISRA 330 73,6 a
ISRA 345 52,6 b
Les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d’après le test de
Newmann et Keuls
i:
Par contre, l’inoculation avec la souche de Rhizobium ISRA330 a augmenté le poids sec des parties aériennes de + 40%, alors que l’inoculation avec la souche de Bradyrhizobium ISRA345 a été sans effet toutes valeurs de traitement en sel confondues(Tableau 11).
.r Dans le cas où. A, seyaZ.a été cultivé-en gaine sur, du sol stérile, l’analyse , ..,,.:,. L ., de variante des différents paramètres montre que l’interaction du sel et de l’inoculation a été significative (p = 0,OS) sur de nombreux paramètres étudiés, à l’exception de l’ARAP, de la teneur en azote et de l’azote total des parties aériennes (Tableau 8). Pour ces paramètres, il y a eu un effet principal significatif (p = 0,05) du sel et un effet principal significatif (p = 0,OS) de l’inoculation.
Dans cette experience, il estapparu,des nodules sur les racines des plantes, 1, , .::.c ,,... .,,, . ..&.. ..; .,< . . . . -..;:iL..:: non inoculées et n’ayant. pasreçu du sel:’ Cela-peut être dû à une contamination.‘r ..‘: :: dont l’origine n’a pas été identifiée. Toutefois, les rhizobiums responsables de cette contamination seraient sensibles au NaCl car on a pas observé de nodules sur les racines des plantes non inoculées et ayant reçu du NaCl.
, L’effet de l’interaction sel x inoculation sur les paramètres mesurés est
indiqué au Tableau 12. La hauteur des plantes et le poids de matière sèche des parties aériennes ont significativement diminué avec l’accroissement du taux d’application de NaCl : à 12 g NaWl, cette diminution a été respectivement de -69% et -71%. Cependant, en absence de sel, il n’y a eu aucune différence significative entre les plantes inoculées et les plantes non inoculées sur la hauteur des plantes (Fig. 9). En présence de 8 a 0 NaCl/l, les plantes inoculées avec la souche ISRA330 ou la souche ISRA345 ont été significativement plus hautes (+29% en moyenne) que les plantes non inoculées. Aux concentrations salines plus élevées (12 et 16 g NaCl/l), la différence n’était significative que pour les plantes inoculkes avec la souche ISRA330 : -21% à 12 g NaCI/ et
42
I .-
i- r .- l-- 1.. .c 1..
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l - _ I t
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- 1 r I l I I i a ,,
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I
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l 1 - - F- i
-45% à 16 g NaCUl. Par contre les plantes non inoculées et celles inoculées avec la souche ISRA345 ne présentent pas de différence significative pour ces concentrations: .1 t. l .>
Le poids de matière sèche des parties aériennes a varié de facon similaire à la hauteur des plantes. Cependant à 16 g NaCM, il n’y a pas eu de différence significative entre les plantes non inoculées et les plantes inoculées avec la souche ISRA330 ou avec la souche ISRA345. Pour les plantes inoculées avec la souche ISRA330, il y a eu également un effet du NaCl sur le poids sec des nodules qui a diminué significativement de . . -64% et -87% respectivement à 8 g NaCl/l et 12-16 g NaCl/l. Dans le même sens, le poids sec des nodules des plantes inoculées avec la souche ISRA345 a diminué de -43% à 8 g NaCUl ; aux concentrations supérieures, il n’y avait pas eu de nodules.
Les effets principaux du sel et de l’inoculation avec les rhizobiums sont indiqués respectivement aux Tableaux 13 et 14. L’apport de: sel :d@inue très significativement I’ARAP, la teneur en azote et l’azote total des parties aériennes. L’effet inhibiteur du sel a été très marqué sur 1’ARAP à 8 g NaCl/l avec une réduction de -56%, atteignant -94% à 16 g NaCl/l (Tableau 13). L’effet inhibiteur du sel sur la teneur en azote n’a été perceptible qu’à 16 g NaCl/l (- 85%). Sur l’azote total des parties aériennes, l’inhibition par le sel a été observée à partir de 12 g NaCl/l (-40%) atteignant -78% à 16 g NaCl/l (Tableau 13). L’effet principal de l’inoculation a été particulièrement significatif dans le cas de lfutilisation de la souche ISRA330 avec laquelle il y a eu une aùgmentation de l’ARAP, de l’ARAS, de la teneur en azote et de l’azote total des parties aériennes. Cet effet positif est par contre plus faible avec l’utilisation de la souche ISRA345 (Tableau 14). Les valeurs observées chez les témoins résultent de la contamination à laquelle nous avons fait allusion plus haut.
i -
I c- 44
t- byp Tableau 12. Effet de l’intreaction sel x inoculation sur la hauteur, le poids de matière sèche des parties aériennes
I x et des nodules des plantes d’A. seyal cultivées en gaine pendant 40 jours et inoculées avec les souches ISBA 330 i ‘. t .. ‘. ,,
ou ISBA 345.
l [NaCl] Inoculation Hauteur Poids mat.sèc PA Poids mat.sèc Nod. km (cm/pl) (mg/pl) (mg/pl)
1 0 ISBA Témoin 330 29,0 30,2 a a 915 742 a a 11a 2c
ISBA 345 31,6 a 822 a 7b
l 8 Témoin 15,7 cd 430 bc 070 ISBA 330 22,8 b 527 b 4,0 lJc
1. ISBA 345 21,4 b 565 b 3,7 bc
I r 12 Témoin ISBA 330 ISBA 345
15,7 cd .19,4 bc 14,9 cd
255 cd 595 b 4()2,5 bcd
090
A:: ’
16 Témoin 8,2 e 210d 090 i- ‘. ,. .- ISR4 ISBA 330 345 13,4
6,6
e d 290 cd d I., .; 1,-J 08 c -.;- .1’ ., 217,5
Pour chaque effet principal, les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes au
seuil de 5% d’après le test de Newmann et Keuls.
1 :: ._-. Tableau 13. Effet principal du sel s,ur l’ARA par plante, la teneur en azote et l’azote total des parties aériennes
i. -.
des plantes dX seyal cultivées en serre dans des gaines contenant 2,Kg de sol stérilisé et prélevé à Bel-Air.
WA %N NTotal
1.. (fl) (nmole C2H4/h) (mg/plante)
0 59,3 a 2,5 a 20,3 a 8 26,3 b 3,2 a 16,0 ab !
I 12 8,8 b 2,9 a 12,0 b 16 3,5 b 1,3 b 4,5 c
i ._ Y Pour chaque colonne, les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement
1
différentes au seuil de 5% d’après le test de Newmann et Keuls.
, 1 .-
l - L 45
I r l
Tableau 14. Effet principal de l’inoculation avec les souches ISBA330 et ISBA345 sur l’AILA, la teneur en azote
. I
. et l’azote total des plantes d’A. seyal culttvées en serre‘ dans des gaines contenant 2 Kg de sol stérilisé et prélevé
à Bel-Air. . . i: .r 1
i I
1
f
Inoculation
Témoin
ISBA 330
ISRA 345
ARAP AlUS (nmole C2H4/h) (nmoleC2H4/mg)
6,0 b 1,l lJ
45,l a 13,0 a
22,3 b 3,8 b
%N
2,7 a
2,9 a
1,8 b
N Total (mg/plante)
12,l b
16,3 a
11,l b
l
Pour chaque colonne, les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d’après le test de Newmann et Keuls.
i
- Beaucoup d’auteurs ont rapporté l’effet inhibiteur du sel sur la croissance et la fixation biologique d’azote chez les légumineuses, en particulier les
-
1 . k légumineuses à graines : Glycine Wightii (Wilson, 1970), Vicia faba et __ /.
Phaseolus klgaris (Abdel - Ghaffar .et al., 1982);“‘&ycine ma;-(Grattan et
r
Maas, 1988), Vigna radiata (Hafeez et al., 1994). Par contre, très peu d’études ont été consacrées aux légumineuses pérennes chez qui le même effet inhibitenr ._ du sel a été observé : Prosopis sp. (Hua et al., 1985), Acacia nilotica (Lal et
II Khanna, 1994). Des résultats similaires ont été obtenus dans notre étude où un apport de 8g NaCl/l a réduit considérablement l’activité réductrice d’acétylène
1 (Tableau 9, 13). Cependant, l’effet inhibiteur du sel est plus marqué sur l’activité
. . ’ ,_< : nitrogénasique que sur le poids sec des nodules ou la croissance des plantes .. -
IV : (hauteur ou poids sec des parties akiennes). Ceci confirme l’effet direct du sel sur la nitrogénase antérieurement décrit par Burns et al. (1985) dans le cas de la nitrogénase purifiée à partir d’Az,otobacter et par Cordovilla et al. (1994) dans leur étude sur Vicia faba. Cependant, la réponse de la symbiose A. seyal x souche de Rhizobium (ou Bradyrhizobium) a varié en fonction de la souche : l’association A. seyal x souche ISRA330 a été plus tolérante au sel que l’association avec la souche ISRA345. Cela pourrait être expliqué par la différence de comportement des deux souches face à la salinité, bien que Craig et al. (199 1) aient montré que dans le cas d’Acacia redolens et Acacia cyclops, la tolérance au sel de la légumineuse hôte serait le facteur prépondérant dans l’induction d’une symbiose effective avec un rhizobium dans des conditions de salinité.
46
,
3.4. Compétitivité de la souche ISRA330
3.4.1. Obtention et identification d’un transconjugant , I s- ., .’
Après 48 h d’incubation des bactéries mises à conjuguer, des colonies bleues et blanches sont apparues dans les boîtes de Petri contenant le milieu sélectif BD + spectinomycine, IPTG et X-gluc (Fig. 10). Les colonies bleues correspondraient au transconjugant ayant acquis le gène @SA dont l’expression se traduit par une coloration bleue liée à la transformation du X-gluc en 5,5- bromo-4,4 chlore-3,3-bis indigo. Ce transconjugant est catalogué dans la collection ISRAMIRCEN sous le numéro : ISRA33OgusA.
La transformation de la souche ISRA330 en ISRA33OgusA n’a pas altéré son aptitude à noduler A. seyal. En effet, les nodules récoltés sur des plantes d’A. seyal cultivées en tubes Gibson et inoculées avec la souche ISRA33OgusA se colorent en bleu en présence dü tan$onX-gluc, ce qui’indique qu’ils ont bien -“‘- été induits par la souche ISRA33OgusA (Fig. 11). Le pouvoir infectif de la souche ISRA330 a bien été conservé. La figure 12 montre bien la localisation histologique de l’expression du gène GUS dans les nodules formés par la souche ISRA33OgusA.
3.4.2. Compétitivité de ISRA330 vis-à-vis des souches indigènes du sol de Bel-Air :
* ‘j,. - ‘:.‘-’ Pour étudier la compétitivité de la souche de Rhizobium ISRA330, nous < .y .’ .:
avons utilisé la souche génétiquement transformée ISRA33OgusA (cf : 8 2.4.3).
Quelle que soit la concentration saline considérée, la proportion de nodules occupés par la souche ISRA33OgusA est plus élevée que celle des nodules occupés par les souches natives. A 0 g NaCI& les plantes inoculées par la souche ISRA33OgusA ont donné des nodules dont 96% renferment cette souche. A 8, 12 et 16 g NaCl/l, les nodules renfermant la souches ISFUWOgusA
représentent respectivement 80, 83 et 88% des nodules récoltés (Tableau 15). Ces résultats montrent que le sel n’affecte pas la compétitivité intrinsèque de la souche ISRA330.
47
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Fig. 10. Aspect des colonies de la souche ISRA330 après cU.ze;sur un milieu.sélectif :
colonies bleues (ISRA330gusA) et colonies blanchâtres (mutant..d@lSRA33@) I
Fig. 11. Nodules “bleus” d’A. seyal induits par la souche ISR433O~tfsA. -
48
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49
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0 Tableau 15. Nombre de nodules (*) chez Acacia seyaf cultivé dans des pots contrenant 2 kg de sol non stérile
prélevé à Bel-Air et inoculé avec la souche de Rhizobuk ISRA 33OgusA en présence de sel (NaCl). v.
. <.
.I i Concentration NaCI (g/l)’ *’ ! ”
i’ - / Souches de Rhizobium 0 8 12 16
I ISKA 330gusA 22 (96) a 19 (80) a 10 (83) a 7 (88) a
Souches indigènes 1 (4) b 5 (20) b 2 (17) b 1 (12) b
s- (*) : les valeurs entre parenthèses indiquent le pourcentage d’occupation des nodules par la souche ISRA
, 330gusA ou par les souches indigènes.
i I I
Dans chaque colonne, les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes à p = 0,05
d’après le test de Newmann et Keuls.
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I I
Les facteurs qui affectent la compétition entre souches de Rhizobium (ou Bradyrhizobium) ou la préférence d’une souche de Rhizobium (ou Bradyrhizobium) pour une légumineuse revêtent une importance pratique . . .._ . considerable car ils déterminent le choix d’un inoculum. De nombreuses études ont rapporté la compétitivité des souches de Rhizobium sélectionnées et introduites dans un sol ( Obaton, 1973 ; Amarger, 1974 ; Pinto et al., 1974 ; Labandera et Vincent, 1975; Franco et Vincent, 1976 ; Hardarson et Jones, 1979 et El-Haloui et al., 1986) ou leur survie dans le sol ( Obaton, 197 1 et Danso et Alexandre, 1974). Par le passé, ‘plusieurs techniques ont été utilisées pour ce genre d’étude : la résistance à différents antibiotiques (Obaton, 1971 ; Danso et aE., 1973 ; Danso et Alexander, 1,974), l’immunofluorescence (Bohlool et Schmidt, 1980). Récemment, il est envisagé dans plusieurs laboratoires d’utiliser les techniques de biologie moléculaire parmi lesquelles celle du GUS que nous avons utilisée pour transformer génétiquement la souche de Rhizo bium ISRA330. Il s’agit d’une technique simple, ne nécessitant pas d’instruments sophistiqués et d’un coût très modeste (70 000 F CFA pour un kit renfermant la souche E. coli S 17- 1/X et les produits chimiques nécéssaires à la transformation d’une bactérie).
L’application de la technique du GUS nous a permis de mettre en évidence dans nos conditions expérimentales la grande aptitude de la souche de Rhizobium ISRA330 à occuper les nodules d’A. seyal en présence des souches indigènes présents dans le sol de la station de Bel-Air. Ces souches indigènes, d’origines diverses, provenant des innombrables expériences conduites sur les légumineuses à la station de Bel-Air où elles sont bien adaptées, peuvent être considérées comme de vraies souches natives. Malgré leur pouvoir compétitif
I
L 50
élevé chez l’arachide (Arachis hypogaea), (Diouf, 1993) elles ont été moins compétitives que la souche ISRA330 en association avec A. seyal.
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L’isolement et la sélection de souches de Rhizobium (ou Brad)rhizobium) tolérantes au sel pour l’inoculation d’A. seyal en conditions salines constituaient l’objectif de ce travail.. Une première, partie consistait à étudier la réponse physiologique d’A. seyal à 1’ apport de fortes concentrations salines. Chez les plantes cultivées en tubes Gibson, le sel a peu d’effet sur la croissance d’A. seyal (jusqu’à 16 g NaCl/l). En revanche lorsqu’on se rapproche des conditions naturelles (cultures en gaine et en pot) l’action inhibitrice du sel se manifeste dès que la concentration atteint 8 g NaCl/l. Il en est de même de la hauteur comme du poids de matière sèche des plantes. Toutefois, la teneur en eau des parties aériennes et le potentiel osmotique des feuilles tendent à rester stationnaires, montrant ainsi moins de perturbation dans l’alimentation en eau que dans la croissance.
D’autre part, l’isolement de souches de Rhizobium et de Bradyrhizobium tolérantes de fortes concentrations en sel a été effectué. Cet isolement a permis de constituer une collection de 3:1- souches. Les souches ISRA330 et ISRA34% “e ont été sélectionnées pour leur grande effectivité et leur différence de tolérance au sel. La croissance. de la souche ISRA 345 est inhibee à des concentrations salines supérieures à 8 g NaCl/l ; elle pourrait appartenir au genre Bradyrhizobium. Par contre, la souche ISRA330, serait du genre Rhizobium capable de croître jusqu’à 16 g NaCl/l.
La tolérance d’A. seyal au sel est améliorée par l’inoculation des plantes avec les souches ISRA330: ou ISRA345 : la productivité des plantes augmente..,avec ,. l’inoculation. Cette améliorationest plus marquée quand l’inoculation est faite avec ISRA330.
Par ce travail, nous avons isolé une souche de Rhizobium (ISRA330) effective, compétitive et tolérante à de fortes concentrations en sel. Elle pourrait être alors utilisée pour l’inoculation d’A. seyal dans les pépinières en vue de la reforestation des zones salées du Bassin du Sine Saloum.
La compétitivité de cette souche a été étudiée par la technique du GUS qui fait appel à une modification génétique des microorganismes. Elle a permis de montrer qu’elle est plus compétitive que les souches natives du sol de Bel-Air en présence de sel. Cependant, cette technique, disponible au laboratoire de Microbiologie du centre ISRA-ORSTOM, ne peut être utilisée que dans le cas d’expériences contrôlées au laboratoire ou en serre.
53
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Cette technique de marquage peut être utilisée à d’autres fins : études des processus de l’infection racinaire, de la formation des cordons d’infection et J’évolution des nodules [email protected] plante. i! ,,
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1 .
Milieu &Id et YEd &losé (Vincent; 1970 ).
Mannitol.. ...................................................................................... 10 g
Glutamate Na.. ............................................................................. 0,5 g
K2HPO4.. ..................................................................................... 0,5 g
NaCl (50 g/l) ................................................................................ .0,5 g
Solution à 10 g/l (MgS04.7H20 ) ............................................ 10 ml
Solution à 40 g/l (CaC12) .............................................................. 1IIl.l
Solution à 4 g/l (FeC13) ................................................................ lml
Extrait de levure .............................................................................. lg Eau Q.S.P. ............................................................................. 1000 ml
Agar.. .. . ......................................................................................... .20 g
pH ajusté à 6,8 et stérilisation à 120°C pendant 2Omn.
:
Milieu Jensen (Vincent, 1970)
K2HPO4 (20 g/l) ........................................................................... 1om.I
MgSO4,7H20 (20 g/-l) ................................................................ lOnIl
caHPo4 (50 g/l) ............................................................................. 2oml
FeC13,6H20 (4 g/l) ........................................................................ 1om.l
ou FeC13, 6H2O en solution.. .................................... _ .............. 11,ll ml
Oligo éléments d.e Jensen ................................................................. lml
Agar.. ................................................................. _._ ........................ .20 gA
Eau Q.S.P. ............................................................................... 1000 ml
pH ajusté à 6,7 avec Na.OH N et stérilisation à 120°C pendant 20 mn.
. .
Milieu BD
m2po4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0936 g
K2mQ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . wg MgS04,7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g CaC12,2H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0702 g NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g NH4Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,7 g
:. Sucrose (10 g/lOO ml) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1ooml
Eau Q.S.P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml
L 64
Milieu LB
Bacto-tryptone.. ................. ..i:..........:i .......................... . . . ................... loi?
Yeast ex?act.. .............................. . .................................................. , ..5 g <> Sodium Choride
.s ........................ ........................................... .......... .5 g
Eau Q.S.P.. ............................................................................. 1000 ml
Aw ............................................................................................... 15 g
Solution BD1
FeC13 ........................................................................................ .6,6 mg
EDTA ..................................................................................... 0,15 mg
Eau Q.S.P.. .................................................................................. 1m.l
Solution BD2
Thiamine HCI. . . . .I ..,.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 mg
Panthothénate de Calcium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..~............................. :.. : 2% ,’
Biotine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 l-e .
Solution de ninhydrine
Poudre de ninhydrine .............................................................. .0,125 g
H3P04 6M ................................................................................... 2 ml
CH3COOH glacial.. ..................................................................... 3 ml
Solution Tampon
NaHzP04,2H20 ......................................................................... 971 g
Na2HP04,2H20 ....................................................................... 1795 g
EDTA ....................................................................................... 0987 g
SDS ............................................................................................. 495 g
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