représentation tridimentionnelle de dnak représentation tridimentionnelle de dnaj 1 a.douet -...

Marquage fluorescent de protéines

Représentation tridimentionnelle de

DnaK

Représentation tridimentionnelle de

DnaJ

1A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

Représentation tridimentionnelle

Insuline

A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck

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Etude de la fonctionnalité de Dnak après marquage

• Choix du fluorophore

• Marquage

• Vérification de la fonctionnalité

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Le choix du fluorophore• Contraintes selon les groupements présents

chez les chaperones

– Groupement amine (lysine)– Groupement sulfhydryle (cystéine)


Groupement amine

Groupement sulfhydryle


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• Contraintes selon la structure tridimensionnelle de DnaK

Site de liaison de l’ATP

Emplacement de la Cystéine 15


5

Emplacement des Lysines

• Contraintes selon la structure tridimensionnelle de DnaK


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Le choix du fluorophore

Avantages -1 fluorophore pour 1 protéine- Endroit précis de fixation

-Plusieurs sites de fixation -> marquage sûr

Inconvénients - Diminution de la probabilité de fixation- Proche site de fixation de l’ATP -> DnaK toujours fonctionnelle ?

-Fixation au hasard sur les sites -> Inhibition de la protéine ?- Trop de fluorescence -> Inhibition de la fluo

Cys Lys


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Marquage fluorescent de protéines

• Protéine dénaturée : Insuline

• Chaperones : DnaK et DnaJ

• Fluorophore : ALEXA FLUOR 488 (λexcitation = 480 nm ; λémission = 540 nm)

• But : - Lier covalement un fluorophore à la chaperone. - Vérification de la fonctionnalité de Dnak après marquage - Déterminer les sites de liaison de la Dnak à l’insuline gràce à la

fluorescence( microscopie optique).


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Marquage de Dnak

- Préparation de DnaK (tampon)

- Fixation du dye avec DnaK

- Vérification du marquage


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Dnak50 L

28,6*10-6 mol/L

Dye11,6 L

3,11*10-5 mol/L

Attente d’une heure et demi

Tampon TRIS10,0 L

50*10-3 mol/L

Préparation de Dnak & fixation du dye

Vérification du marquage par absorbance

• d’absorbance de la protéine : 280 nm• d’absorbance du dye : 490 nm

- tampon- dye + tampon- dye + Dnak + tampn

CDnak = 23*10-6 mol/L (20,0*10-6 mol/L initial)Cdye = 1,1*10-6 mol/L (5,0*10-6 mol/L initial)


11

Vérification du marquage


12

Vérification du marquage


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Vérification de la fonctionnalité de DnaK après marquage

• Particularité de l’insuline : formation de fibres amyloides

• Fonction de DnaK : réguler la formation des fibres

AgrégatDnaK

Insuline en solution Agrégat Fibre amyloïde


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• Détection de la formation des fibres amyloides: deux méthodes

• Mesure de l’absorbance à 600 nanomètresReflete la turbidité de la solution

• Utilisation d’un fluorophore: la thioflavine TDeux longueurs d’onde d’excitation différentes suivant sa position


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Expériences :

- plaque 96 puits - insuline- insuline + colorant- insuline + DnaK non marquée- insuline + DnaK non marquée + DnaJ- insuline + DnaK marquée (1:4)- insuline + DnaK marquée (1:3)

- mesure de l’absorbance toutes les heures


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Résultats:


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Expériences futures

• Microscopie optique

• Marquage et étude de la fonctionnalité de DnaJ

• Etude cinétique

Double marquage du noyau des cellules (en bleu) et d’une protéine

(en vert)

Bibliography

A.Douet - C.Duquesne - T.Frachon - M.Jeanmaire - B.Sevenie - R.Schuck 18

http://www.pdb.org/pdb/home/home.do

http://expasy.org/

http://www.uniprot.org/

http://www.piercenet.com/

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_labelling

http://www.pdb.org/pdb/home/home.do

http://expasy.org/

http://www.uniprot.org/

http://www.piercenet.com/

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_labelling

représentation tridimentionnelle de dnak représentation tridimentionnelle de dnaj 1 a.douet -...

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