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REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Pierre Brousset pour la confiance qu’il

m’a accordée pour mener à bien ce projet et pour l’intérêt qu’il porte à mon devenir

professionnel. Je vous remercie de m’avoir encouragée à réaliser cette thèse et de m’avoir

soutenue tout au long de ce parcours.

Je remercie le Professeur Georges Delsol de m’avoir accueillie dans son laboratoire

sept années auparavant et de m’avoir donnée son approbation et ses encouragements pour

effectuer cette thèse.

Je remercie les Professeurs Serge Romana, Nicolas Sirvent et Claude Preudhomme

d’avoir accepté et donné de leur temps pour juger ce travail. Je vous remercie aussi pour

toutes vos remarques qui ont permis d’améliorer ce manuscrit.

Je remercie le Professeur Eric Delabesse de m’avoir fait l’honneur de présider mon

jury. Je vous remercie également d’être toujours disponible et de très bon conseil.

Je remercie le Docteur Nicole Dastugue qui a accepté de me confier ce projet qu’elle

avait initié. Je vous suis très reconnaissante de m’avoir soutenue tout au long de ce travail et

de m’avoir consacrée de votre temps. Je suis aussi heureuse d’avoir pu finaliser cette étude

qui vous tenait à cœur.

Je remercie toutes les personnes ayant travaillé sur ce projet et notamment le Docteur

Eric Lippert et le Professeur François-Xavier Mahon qui ont permis de relancer cette étude et

le Docteur Gwendoline Soler qui l’avait débutée. Je tiens à remercier Stéphanie Struski qui a

pris beaucoup de son temps pour effectuer l’étude cytogénétique et surtout l’interpréter, chose

qui s’est avérée difficile. Je remercie aussi le Docteur Cécile Demur pour sa disponibilité et

son aide précieuse lors des analyses cytologiques. Je tiens à remercier Cyril Broccardo d’avoir

pensé à moi pour ce projet. Je te remercie aussi pour tous tes conseils et ton aide. Je remercie

enfin Nais Prade et Cindy Cavalier pour leur efficacité et leur aide lors des analyses

génomiques.

Je tiens à remercier globalement tous les membres de l’équipe qui, à un moment ou un

autre, m’ont apporté du soutien, des conseils ou de l’aide et aussi leur petite touche

personnelle permettant de passer de bons moments : Marie-Pierre et sa gentillesse, Emilie D

et sa décontraction, Julie et sa gaieté, , Charlotte et son franc parler, Céline et ses bons plans,

Cécile et sa douceur, Laure et son entrain, Julien et son humour décalé. Je remercie Estelle,

Fabienne, Laurence et Sylvie qui savent se rendre disponibles et toujours prêtes à donner de

bons conseils.

Je remercie plus personnellement, Jeannine, l’âme et la mémoire de cette équipe, qui

est toujours là quand on a besoin d’elle. Je vous remercie pour votre disponibilité et votre

bonne humeur quotidienne qui m’accompagne depuis mon arrivée au laboratoire. Etienne,

mon soutien sans faille pendant cette thèse qui as toujours répondu présent et trouvé les mots

pour me remonter le moral quand j’en avais besoin et cela même après une attaque frontale

par un tiroir. Merci pour les fous rires mais aussi les instants de culture générale. J’aurais

vraiment voulu que tu sois là pour la dernière ligne droite fichu pancake. Wilfried, monsieur

Sno, et son oreille attentive. Merci pour les instants partagés et pour la confiance que tu me

témoignes. Je suis admirative de ton parcours et je te souhaite beaucoup de réussite pour la

suite. Marina, avec qui tout a commencé et qui est revenue à temps pour le grand final. Je te

remercie pour toutes les années que nous avons passées ensemble à travailler avant cette

thèse. Je suis très touchée pour toute l’aide et le soutien que tu m’as apportés à la fin de cette

étape. J’espère que maintenant nos chemins professionnels resteront liés, pour le reste je ne

m’en fait pas.

Je remercie mes colocataires de bureau non citées précédemment qui sont Emilie L,

Pauline et Emilie-Fleur. Merci à vous trois pour votre gentillesse et votre disponibilité.

Je remercie aussi les anciens qui ont partagé avec moi un bout de vie au laboratoire et

de bons moments comme Jeff, Michèle, Ashraf et la Gilles’s dream team : Gilles, Alan,

Jérôme et Catherine.

Je remercie tous les membres des équipes de l’étage « jaune » qui sont les équipes

Fournié, Manenti et Payrastre avec qui j’ai pu interagir ou tout simplement discuter. Je

remercie Anne-Marie Benot, Nathalie Frances et Sébastien Guibert pour leur gestion au

quotidien et tous les membres des plateaux techniques pour leur disponibilité et leur

efficacité.

Je tiens à remercier toute ma famille et mes amis qui m’ont fait l’honneur d’être là

pour me soutenir et célébrer la fin de ma thèse. Enfin, Arnaud, je te remercie de m’avoir

épaulée et d’avoir réussit à me supporter tout au long de cette thèse. Je finis par un clin d’œil

à mon fils Arthur…

1

TABLE DES MATIERES LISTE DES ABBREVIATIONS............................................................................................. 3

INTRODUCTION.................................................................................................................... 5

I. INTRODUCTION GENERALE......................................................................................... 7

II. L’HEMATOPOÏESE.......................................................................................................... 9 A. LE MODELE CLASSIQUE....................................................................................................... 9

1. La cellule souche hématopoïétique .............................................................................. 11 2. Les progéniteurs hématopoiétiques.............................................................................. 13 3. Révision du modèle classique....................................................................................... 15

B. LA MYELOPOÏESE.............................................................................................................. 17 1. Les facteurs de régulation ............................................................................................ 17

a) Les facteurs extrinsèques ......................................................................................... 17 (1) Les cellules stromales......................................................................................... 19 (2) Les facteurs solubles........................................................................................... 19

b) Les facteurs intrinsèques.......................................................................................... 21 (1) GATA1 ............................................................................................................... 23 (2) MYB ................................................................................................................... 29 (3) PU.1 .................................................................................................................... 35 (4) C/EBPα ............................................................................................................... 35

C. ONTOGENESE DES GRANULOCYTES BASOPHILES............................................................... 37 1. Fonction des basophiles ............................................................................................... 37 2. Origine des basophiles humains .................................................................................. 39 3. Les basophiles murins .................................................................................................. 41

III. LES LEUCEMIES AIGUËS MYELOBLASTIQUES................................................. 43 A. CLASSIFICATION ............................................................................................................... 43 B. LES ALTERATIONS GENETIQUES ........................................................................................ 43

1. Les anomalies de structure........................................................................................... 43 a) Les translocations chromosomiques ........................................................................ 43

(1) Mécanismes de formation................................................................................... 45 (2) Types de translocation ........................................................................................ 49 (3) GATA1 et MYB dans les anomalies chromosomiques...................................... 57

2. Les anomalies de séquences......................................................................................... 57 a) Mutations des facteurs de transcription.................................................................... 59 b) Mutations fréquentes dans les LAM ........................................................................ 61 c) Mutations de MYB et GATA1 ................................................................................... 63

3. Les dérégulations épigénétiques .................................................................................. 63 C. LES LEUCEMIES AIGUËS MYELOBLASTIQUES PEDIATRIQUES ............................................. 67 D. LES LEUCEMIES AIGUËS A BASOPHILES DE NOVO .............................................................. 69

1. Généralités ................................................................................................................... 69 2. Diagnostic .................................................................................................................... 69

OBJECTIFS............................................................................................................................ 73

RESULTATS .......................................................................................................................... 77

DISCUSSION ET CONCLUSION....................................................................................... 91

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................... 103

3

LISTE DES ABBREVIATIONS AD : Domaine d’activation AMV : Avian Myeloblastosis virus ATRA: All-Trans Retinoic Acid Ba/Eo : Basophile/Eosinophile Ba/Mast : Basophile/Mastocyte Ba/Meg : Basophile/Mégacaryocyte CD : Cluster of Differentiation CFC : Colony Forming Cell CFU: Colony Forming Unit CFU-E : Colony Forming Unit–Erythroïde CFU-G : Colony Forming Unit–Granulocyte CFU-GEMM : Colony Forming Unit–Granulocyte Erythrocyte Monocyte Megacaryocyte CFU-GM : Colony Forming Unit–Granulocyte Monocyte CFU-M : Colony Forming Unit–Monocyte CFU-MC : Colony Forming Unit–Megacaryocyte CFU-S : Colony Forming Unit–Spleen ChIP-Seq : Chromatin ImmunoPrecipitation–Sequencing CSH : Cellule Souche Hématopoïétique CT-CSH : Court Terme–CSH C-term Znf : Doigt de Zinc C–terminal DBD : Domaine de liaison à l’ADN DMT : Désordre myéloprolifératif transitoire DNMT : DNA méthyltransférase DSB : Double-Strand Break EPO : Erythropoïétine HAT : Histone acétyltransférase HDAC : Histone désacétylase HDM : Histone Déméthylase HLA-DR : Human Leucocyte Antigen–DR HMT : Histone méthylase HR : Homologous Recombination IL : Interleukine KD : Knock–Down KDa : KiloDalton KO : Knock–Out

4

LAB : Leucémie Aiguë à Basophiles LAL : Leucémie Aiguë Lymphoblastique LAM : Leucémie Aiguë Myéloblastique LAMK : Leucémie Aiguë Mégacaryoblastique Lin–: lignage négatif LMC : Leucémie Myéloïde Chronique LSK : Lin–Sca1+Kit+ LTC–IC : Long Term Culture-Initiating Cell LT–CSH : Long Terme-Cellule souche hématopoïétique MBS : MYB Binding Site MGG : May-Grünwald-Giemsa NHEJ : Non-Homologous End Joining NOD/SCID : Non-Obese Diabetic/ Severe Combined ImmunoDeficiency NRD : Domaine de régulation négatif N-term Znf : Doigt de Zinc N-terminal OMS : Organisation Mondiale de la Santé PB : Progéniteur Lymphoïde B PCEM : Progéniteur Commun Erythro-Myéloïde PCL : Progéniteur Commun Lymphoïde PCML : Progéniteur commun myéloïde-lymphoïde PE : Progéniteur Erythroïde PG : Progéniteur Granulocytaire PGM : Progéniteur Granulo-Monocytaire PM : Progéniteur Monocytaire PMB : Progéniteur myéloide lymphocyte B PMC : Progéniteur MégaCaryocytaire PMP : Progéniteur MultiPotent PMT : Progéniteur Myéloide lymphocyte T PT : Progéniteur lymphoïde T RAG : Recombination-Activating Gene SCF : Stem Cell Factor SMD : Syndrome MyéloDysplasique SRC : SCID repopulating cells TAD : Domaine de transactivation TCR : T cell receptor TK : Tyrosine kinase

5

INTRODUCTION

7

I. Introduction générale

L’hématopoïèse est un processus physiologique complexe et finement régulé qui

aboutit à la formation de divers types cellulaires formant le tissu hématopoïétique.

Schématiquement, on distingue deux lignées : la lignée lymphoïde et la lignée myéloïde.

L’équilibre entre ces différentes populations cellulaires est obtenu par une fine régulation des

processus de prolifération et de différenciation. La dérégulation d’un de ces deux ou de ces

deux paramètres fondamentaux conduit au développement d’hémopathies malignes. On

distingue par exemple les hémopathies chroniques, caractérisées par l’augmentation de la

prolifération d’un ou plusieurs types cellulaires, des hémopathies aiguës, durant lesquelles les

cellules bloquées à un stade précoce de la différenciation prolifèrent de manière excessive. Au

cours de l’introduction, nous nous intéresserons à l’hématopoïèse normale et notamment aux

acteurs de ce processus. Nous présenterons également des données de la littérature qui ont

permis de réviser le modèle classique de l’hématopoïèse. Par la suite, la myélopoïèse sera

présentée, et notamment les facteurs régulant ce processus parmi lesquels les facteurs

intrinsèques et extrinsèques. Une troisième partie s’intéressera aux granulocytes basophiles

qui sont touchés lors de la pathologie présentée ici. Ensuite, l’hématopoïèse pathologique et

en particulier la leucémie aiguë myéloblastique (LAM) sera présentée. Nous développerons

les causes moléculaires des LAM telles que les dérégulations suite aux translocations

chromosomiques. Enfin, nous présenterons en détail une sous-classe de LAM, la leucémie

aiguë à basophiles (LAB), qui forment un groupe hétérogène de part la diversité des

translocations associées et des phénotypes observés.

Notre laboratoire s’intéresse à la caractérisation des réarrangements chromosomiques.

D’un point de vue clinique, nos travaux ont pour objectif d’améliorer la prise en charge du

patient. Sur un plan scientifique, nous cherchons à mettre en évidence des gènes importants

dans l’ontogénèse des cellules sanguines. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à

quatre cas de nourrissons porteurs de la même translocation, la t(X;6)(p11;q23), et atteints de

LAB avec une présentation clinique similaire. Par des analyses cytogénétiques, nous avons pu

vérifier le réarrangement du gène MYB situé sur le chromosome 6 au niveau de la bande q23.

Les étapes suivantes ont permis de cloner un nouveau transcrit de fusion MYB–GATA1 et

d’étudier son rôle dans la myélopoïèse. Nos travaux in vitro ont prouvé que MYB–GATA1

peut être à l’origine de l’apparition d’une LAM par ses capacités à bloquer la différenciation

et à transformer les cellules exprimant cette protéine chimérique. Sur un plan clinique, cette

étude a permis de définir une nouvelle entité clinico-biologique.

8

CSH

PMP

PCEM PCL

PB PTPE PMCPGM

PGPM

Erythrocyte Monocyte Granulocyte Plaquette Lymphocyte B Lymphocyte T

Prol

iféra

tion

Diff

éren

ciat

ion

Moe

lle o

sseu

seSa

ng

LT-CSH

CT-CSH

Progéniteurs

Précurseurs

Lignée myéloïde Lignée lymphoïde

CSH

PMP

PCEM PCL

PB PTPE PMCPGM

PGPM

Erythrocyte Monocyte Granulocyte Plaquette Lymphocyte B Lymphocyte T

Prol

iféra

tion

Diff

éren

ciat

ion

Moe

lle o

sseu

seSa

ng

LT-CSH

CT-CSH

Progéniteurs

Précurseurs

Lignée myéloïde Lignée lymphoïde

Figure 1 : Schéma de l’hématopoïèse classique. Le modèle classique de l’hématopoïèse repose sur un système pyramidal. La cellule souche hématopoïétique en haut de cette structure est capable de générer par des étapes de différenciation successives toutes les cellules matures du tissu sanguin. CSH : Cellule Souche Hématopoïétique, PMP : Progéniteur MultiPotent, PCEM : Progéniteur Commun Erythroïde Myéloïde, PCL : Progéniteur Commun Lymphoïde, PE : Progéniteur Erythroïde, PGM : Progéniteur Granulo-Monocytaire, PMC : Progéniteur MégaCaryocytaire, PB : Progéniteur lymphoide B, PT : Progéniteur lymphoïde T, PM : Progéniteur Monocytaire, PG : Progéniteur Granulocytaire. * Les lymphocytes T maturent dans le thymus.

*

9

II. L’hématopoïèse

A. Le modèle classique

L’hématopoïèse est un processus physiologique hiérarchisé qui assure la production de

cellules sanguines matures qui sont les érythrocytes, les plaquettes et les leucocytes

comprenant les granulocytes, les monocytes, les lymphocytes B et T. Les cellules

hématopoïétiques jouent un rôle dans l’hémostase, le transport de gaz, l’immunité innée et

l’immunité adaptative.

L’hématopoïèse est initiée par les cellules souches hématopoïétiques (CSH) qui

donnent naissance progressivement à des progéniteurs engagés dans des voies de

différenciation permettant d’obtenir in fine les cellules sanguines matures (Figure 1). Les CSH

génèrent le progéniteur multipotent (PMP) qui se différencie en progéniteur commun érythro-

myéloïde (PCEM) ou en progéniteur commun lymphoïde (PCL)1 à l’origine des cellules

myéloïdes ou érythroïdes et des lymphocytes B ou T, respectivement. Ces progéniteurs

prolifèrent et se différencient en progéniteurs unipotents puis en précurseurs de chaque cellule

sanguine reconnaissable morphologiquement.

Au cours du développement, l’hématopoïèse humaine se déroule dans différents

organes. Elle commence dans le sac vitellin (hématopoïèse primitive), puis dans le foie fœtal,

la rate et la moelle osseuse (hématopoïèse définitive). Chez l’adulte, l’hématopoïèse n’a lieu

que dans la moelle osseuse. Dans cet organe, le devenir des CSH est soumis à des régulations

orchestrées par des facteurs intrinsèques ainsi que par des facteurs extrinsèques provenant du

microenvironnement.

Le modèle classique de l’hématopoïèse, repose sur la dichotomie entre la lignée

lymphoïde et myéloïde qui trouve son fondement dans les observations histologiques. La

lignée myéloïde regroupe les érythrocytes, les plaquettes, les granulocytes ainsi que les

monocytes et a été définie comme telle car les précurseurs de ces cellules sont observés dans

la moelle osseuse. Les lymphocytes T et B forment la lignée lymphoïde nommée ainsi car les

lymphocytes ont tout d’abord été identifiés dans la lymphe.

10

Figure 2 : Schématisation de la division asymétrique d’une cellule souche hématopoïétique. D’après Wilson et al. 2

CSH CSH

Cellule différenciée

Cellule différenciée

A B

11

1. La cellule souche hématopoïétique

Les CSH de la moelle osseuse sont des cellules quiescentes, rares, indifférenciées et

caractérisées par leur capacité à s’auto-renouveler, c'est-à-dire à se diviser en une cellule

identique, et par leur pluripotence, c'est-à-dire à se différencier en plusieurs types cellulaires

constituant le tissu sanguin. La CSH s’engage dans la différenciation après division

asymétrique. Deux mécanismes sont proposés : - une cellule fille conserve sa capacité d’auto-

renouvellement contrairement à l’autre qui se différencie sous l’influence de facteurs

cellulaires répartis inégalement lors de la division ; - une des deux cellules filles sort de la

niche hématopoïétique afin de se relocaliser dans un microenvironnement induisant la

différenciation (Figure 2).

La première mise en évidence de l’existence d’une CSH a été réalisée par Till et

McCulloch par transplantation de moelle osseuse dans une souris irradiée à une dose létale.

L’existence dans la moelle osseuse de cellules capables de la reconstituer a été démontrée par

la présence de colonies dans la rate. Chacune d’entre elle, appelées CFU-S (Colony Forming

Unit-Spleen) 3, correspondait à une cellule souche pluripotente injectée capable de générer

plusieurs lignées cellulaires.

Les CSH sont définies comme des cellules médullaires exprimant le marqueur

membranaire CD34+. Néanmoins, sur la base de ce seul marqueur, cette population est

hétérogène, c’est pourquoi de nombreux travaux tendent à préciser leur phénotype afin de

mieux étudier chaque sous-population. Ce type de caractérisation fine du compartiment des

CSH est permis, entre autres, par un test de clonogénicité en méthylcellulose après plusieurs

semaines de culture sur des cellules stromales (Long Term Culture-Initiating Cell : LTC-IC).

Ainsi, nous pouvons distinguer les cellules CD34+ HLA-DR+ capables de former des colonies

en méthylcellulose, de celles négatives ou exprimant faiblement HLA-DR, capables d’initier

une hématopoïèse complète et à long terme in vitro. Sur la base du marqueur CD38, les

cellules CD34+CD38−ont pu être isolées et correspondent à une sous-population enrichie en

CSH primitives 4.

Bien que ces expériences in vitro apportent d’importantes informations sur le potentiel

des CSH à se différencier en progéniteurs et à s’auto-renouveler, ces fonctionnalités doivent

être vérifiées in vivo. En effet, les conditions de culture lors de ces expériences ne permettent

pas de tester le développement de toutes les cellules sanguines ni de prédire si la population

isolée est capable de reproduire in vivo la reconstitution à long terme. C’est pourquoi une

13

technique de transplantation a été développée. Cette technique repose sur un modèle de

xénogreffe des CSH humaines dans des souris NOD/SCID (Non-Obese Diabetic/ Severe

Combined ImmunoDeficiency) irradiées 5. Les cellules capables de reconstituer le

compartiment myéloïde et lymphoïde dans ce type de souris sont appelées SCID repopulating

cells (SRC) et il semblerait qu’elles soient plus primitives que les LTC-IC 6. Les

transplantations successives permettent d’évaluer le potentiel de reconstitution à long terme.

Ainsi l’étude des marqueurs CD45RA et CD90 ont permis de discriminer dans la population

des CSH, deux sous-populations contenant les cellules dites long terme-CSH (LT-CSH :

CD34+CD38−CD45RA−CD90+) et court terme-CSH (CT-CSH :

CD34+CD38−CD45RA−CD90−) 7. La différence entre ces deux populations repose sur leur

capacité ou non à reconstituer dans le temps une moelle osseuse complète chez des souris

irradiées.

Récemment, une équipe a mis en évidence l’existence d’un nouveau marqueur

pouvant discriminer plus précisément les CSH, des PMP. Ce besoin de les différencier

s’expliquait par l’observation que la population décrite comme celle des PMP était capable de

reconstituer des souris à long terme (20 semaines) et de manière successive. Ce résultat

démontre que des cellules de cette fraction conservent un potentiel d’auto-renouvellement.

D’autre part, l’expression de plusieurs intégrines, protéines membranaires notamment

impliquées dans les interactions des cellules avec leur microenvironnement, a été testée et il

s’est avéré que l’intégrine α6 (CD49f) est différentiellement exprimée. En étudiant, le

potentiel des différentes sous-populations à reconstituer la moelle osseuse des souris

NOD/SCID, Notta et al. ont démontré que les CSH qui avaient le potentiel de reconstitution à

plus long terme étaient contenues dans la population CD34+CD38−CD45RA−CD90+CD49f+ 8.

2. Les progéniteurs hématopoiétiques

Les progéniteurs hématopoïétiques sont les cellules engagées dans les processus de

différenciation et ayant perdu une partie de leurs pouvoirs d’auto-renouvellement et de

multipotence. Leur potentiel de différenciation peut être étudié par un test de clonogénicité en

méthylcellulose (Colony Forming Cell assay : CFC assay). Cette technique est basée sur la

capacité des progéniteurs hématopoïétiques à proliférer et à se différencier dans un milieu

semi-solide en présence de cytokines. Elle permet d’étudier le degré de pluripotence de

cellules progénitrices triées. De plus, elle peut être envisagée pour tester les effets de

cytokines particulières ou de combinaisons de cytokines 9 ainsi que pour tester des drogues 10.

14

PCEM

PCL

PCEM

PCML

PMB

PMT

Modèle classique « Myeloid based » modèle

PMP PMP

Figure 3 : Comparaison entre le modèle classique et le modèle révisé d’après Kawamoto et Katsura 11. METB : progéniteur commun Myéloïde-Erythroïde-lymphocyte T-lymphocyte B ; PMP : Progéniteur MultiPotent, PCEM : Progéniteur Commun Erythroïde Myéloïde, PCL : Progéniteur Commun Lymphoïde, PMT : Progéniteur myéloïde-lymphoïde T, PMB : Progéniteur myéloïde-lymphoïde B, M : myéloïde (granulocyte, monocyte), E : Erythroïde (plaquette, érythrocyte), T : lympocyte T, B : lymphocyte B.

15

Cette analyse par CFC assay a permis d’identifier la fraction cellulaire

Lin−CD34+CD38+IL-3RαloCD45RA− , capable de générer tous les types de progéniteurs

myéloïdes, qui correspond au PCEM 12. Par la suite, le progéniteur des granulocytes

éosinophiles a été isolé à partir d’une sous-population des PCEM exprimant le récepteur à

l’interleukine-5 (IL-5) et qui, en culture en méthylcellulose, est capable de générer des

colonies de précurseurs éosinophiles 13. Cette étude invalide l’existence d’un progéniteur

commun à tous les granulocytes. Ainsi, ce type de travail permet de mieux caractériser les

progéniteurs hématopoïétiques et les étapes de la différenciation hématopoïétique, apportant

des arguments pour compléter ou modifier le modèle classique de l’hématopoïèse.

3. Révision du modèle classique

Le modèle classique de l’hématopoïèse repose sur la dichotomie entre la lignée

myéloïde et lymphoïde. Au cours des années, plusieurs équipes ont proposé des révisions de

ce modèle. Nous nous intéresserons au modèle de l’équipe de Katsura appelé « myeloid

based » modèle 14 (Figure 3). Ce modèle correspondrait plus à une dichotomie basée sur la

fonction des cellules, d’une part les cellules non immunitaires ou cellules érythroïdes

(plaquettes et érythrocytes) et d’autre part les cellules immunitaires comprenant les cellules

lymphoïdes (lymphocytes T et B) et myéloïdes (granulocytes et monocytes).

Cette équipe a développé un test in vitro permettant la différenciation des progéniteurs

hématopoïétiques murins en cellules érythroïdes, myéloïdes et lymphoïdes (multi-lineage

progenitor assay). En cultivant une cellule de la fraction Lin–c-Kit+Sca1+ (LSK : cellules

souches et progéniteurs) par puits dans un milieu adapté, ils ont pu analyser les cellules issues

de la différenciation du progéniteur originel. Ces expériences ont démontré qu’il existe un

progéniteur commun myéloïde-lymphoïde (PCML), érythroïde-myéloïde (PCEM), un

progéniteur bipotent myéloïde-lymphoïde T (PMT) et myéloïde-lymphoïde B (PMB).

Contrairement au modèle classique qui propose l’existence d’un PCL, ce type de progéniteur

n’a pas été observé lors de leurs expériences 11,15. De plus, l’étude de la population LSK Gfp+

issue de souris exprimant la gfp sous le contrôle du promoteur de Rag1 (expression restreinte

aux lymphocytes) a confirmé qu’une fraction de ces cellules se différenciait en cellules

myéloïdes 16.

16

Cellule souche pluripotente

CFU-E Globules rouges

EPO

CFU-MK PlaquettesTPO

Progéniteur multipotent

CFU-

GEMM

CFU-GM

Granulocytes

CFU-M

CFU-G

G-CSF

GM-CSF

M-CSF

Monocytes

Précurseurs Cellules maturesProgéniteursCellules souches Figure 4 : Schéma de la myélopoïèse. Les facteurs solubles spécifiques de chaque type cellulaire sont indiqués.

Cellule de la niche spécialiséeCellule stromale

Microenvironnement hors niche NicheInterface

CSH quiescenteSignaux extrinsèques de différenciation

Figure 5 : Principe de la niche hématopoïétique. Les CSH sont maintenues en quiescence dans la niche. Après division asymétrique, les cellules quittent la niche et sont soumis à des signaux extrinsèques qui influencent leur engagement dans la différenciation. D’après Wilson et al. 2

17

Comme chez la souris, l’hématopoïèse humaine ne suit pas strictement le schéma

classique. Plus récemment, Doulatov et al. ont démontré que les cellules caractérisées par le

phénotype : CD34+CD38−CD90neg–loCD45RA+ correspondaient à des progéniteurs capables

de se différencier en cellules lymphoïdes B et T ainsi qu’en monocytes et macrophages 17.

B. La myélopoïèse

La myélopoïèse est l’ensemble des processus de prolifération et différenciation qui

permettent d’aboutir à l’obtention des cellules hématopoïétiques matures à l’exception des

lymphocytes. Ces processus nécessitent une régulation fine de l’expression de facteurs de

transcription majeurs, faisant intervenir des cytokines spécifiques de l’engagement dans

chaque lignage ou communes pour la prolifération des cellules.

La différenciation myéloïde est bien caractérisée car elle ne nécessite pas l’utilisation

d’un stroma et ainsi peut être facilement étudiée in vitro grâce au CFC assay. Lors de ce test,

les progéniteurs sont capables de former des colonies (Colony Forming Cell : CFU) de

morphologie particulière suivant le lignage. Les cellules les plus progénitrices forment les

CFU-Granulocyte Erythrocyte Monocyte Megacaryocyte (CFU-GEMM) qui sont des

colonies mixtes multipotentes correspondant au progéniteur commun myéloïde. Au fur et à

mesure de la différenciation, ces cellules perdent leur multipotence et s’orientent vers un type

cellulaire défini. Ainsi, les CFU-GEMM se différencient en CFU-Erythrocyte (CFU-E),

CFU-Mégacaryocyte (CFU-MK) et CFU-Granulocyte Monocyte (CFU-GM) à l’origine des

CFU-Granulocyte (CFU-G) et CFU-Monocyte (CFU-M) (Figure 4). Ces différents

progéniteurs unipotents se différencient en précurseurs par des étapes de maturation

successives faisant intervenir un réseau de facteurs de transcription et de facteurs solubles.

1. Les facteurs de régulation

a) Les facteurs extrinsèques

Les facteurs extrinsèques qui régulent l’hématopoïèse sont retrouvés dans le

microenvironnement médullaire formant la niche hématopoïétique (Figure 5). Cette dernière

est constituée de divers types cellulaires qui procurent aux CSH des chimiokines, permettant

de les attirer vers cet environnement ainsi que des cytokines, impliquées dans la survie, la

prolifération et la différenciation. De plus, les CSH établissent des interactions cellulaires

avec cette niche via des molécules d’adhésion spécifiques.

18

Figure 6 : Facteurs solubles impliquées dans la différenciation. IL : Interleukine, GM-CSF : Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, M-CSF : Macrophage- colony stimulating factor , G-CSF : Granulocyte - colony stimulating factor , Tpo : Thrombopoïétine, Epo : Erythrpoïétine. D’après Brown et al.18

19

(1) Les cellules stromales

La moelle osseuse est constituée de cellules hématopoïétiques et de cellules stromales

qui peuvent être des fibroblastes, des adipocytes, des cellules endothéliales et des

ostéoblastes. Parmi les composants critiques de la niche hématopoïétique, nous pouvons citer

les ostéoblastes qui forment la niche endostéale. En effet, la déplétion de ces cellules chez la

souris entraîne une diminution des CSH dans la moelle osseuse 19. Le rôle des ostéoblastes

passe par l’expression de molécules d’adhésion comme la N-cadhérine 20, et par leur capacité

à secréter des facteurs solubles tels que l’angiopoïétine et Jagged-1 qui sont respectivement

associés à la quiescence et au blocage de différenciation des CSH 21,22.

De plus, la présence d’un grand nombre de CSH au contact des cellules endothéliales

formant les sinusoïdes de la moelle osseuse suggère l’existence d’une niche hématopoïétique

dite vasculaire 23. En effet, ces cellules permettent in vitro de cultiver des CSH 24. Dans cette

niche, les CSH seraient moins quiescentes que celle retrouvées dans la niche endostéale et

serviraient à une reconstitution rapide du tissu hématopoïétique si nécessaire.

(2) Les facteurs solubles

Les facteurs solubles impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse regroupent les

cytokines, telles que les interleukines, les chimiokines et les Colony Stimulating Factors

(CSF) ainsi que les hormones comme l’érythropoïétine. Les cytokines sont des protéines

sécrétées qui régulent l’hématopoïèse, la réponse immunitaire et l’inflammation. Les

cytokines hématopoïétiques, après fixation sur leurs récepteurs spécifiques, activent des voies

de signalisation régulant la quiescence des CSH, leur auto-renouvellement, la différenciation

(Figure 6) et l’apoptose. Bien que certaines cytokines possèdent une ou plusieurs de ces

propriétés, la plupart d’entre elles montrent des effets additifs ou synergiques en combinaison

avec d’autres cytokines. Les facteurs solubles peuvent être sécrétés par les cellules stromales

de la moelle osseuse mais aussi par d’autres organes tels que le rein pour l’érythropoïétine.

La question soulevée par les cytokines est la suivante : sont-elles à l’origine de

l’engagement des cellules vers un type cellulaire ou régulent-elles la prolifération de cellules

déjà engagées ? Cette question trouve son origine dans l’interaction qui existe entre les

cytokines et les facteurs de transcription. En effet, ces derniers régulent la transcription des

récepteurs aux cytokines et donc la possibilité des cellules à répondre aux signaux

extracellulaires tandis que les cytokines peuvent induire des voies de signalisation aboutissant

à la transcription de facteurs de transcription. Il existe donc une boucle de régulation entre ces

21

deux types de molécules. A titre d’exemple, PU.1 est impliqué dans la différenciation

monocytaire et régule la transcription du récepteur au M-CSF 25.

b) Les facteurs intrinsèques

Les facteurs de transcription sont des protéines capables, via leur domaine de liaison à

l’ADN, de se fixer dans les régions régulatrices (promoteur, enhancer et silencer) de gènes

dont ils modulent la transcription. Cette régulation peut être positive et/ou négative, et passer

par les mécanismes suivants: stabiliser ou bloquer la liaison de l’ARN polymérase à l’ADN,

réguler directement ou via d’autres protéines l’acétylation ou la désacétylation des histones et

enfin, recruter des co-activateurs ou des co-répresseurs sur les complexes de transcription.

Tous ces facteurs sont composés de plusieurs domaines fonctionnels : les domaines de

liaison à l’ADN qui sont de divers types tels que le domaine leucine zipper, hélice-boucle-

hélice, hélice-tour-hélice et doigt de zinc; le domaine de trans-activation et/ou de répression

qui recrute des co-facteurs ou qui interagit directement avec la machinerie transcriptionnelle

pour réguler la transcription.

Durant la myélopoïèse, la balance entre les différents facteurs de transcription va

permettre l’engagement vers une lignée définie. Leur expression doit être finement régulée

dans le temps. En effet, il a été démontré en modèle murin que leur ordre d’expression est

déterminant pour l’engagement et la maturation des cellules 26. L’engagement dans un lignage

implique l’activation de gènes spécifiques concomitants à une inhibition d’un ensemble de

gènes intervenant dans les autres lignages. Ce phénomène est contrôlé en partie par un

nombre restreint de facteurs de transcription qui se régulent entre eux.

GATA1, MYB, PU.1 et C/EBPα sont ces facteurs de transcription impliqués dans la

myélopoïèse. Leur importance est démontrée par l’effet de leur invalidation par

recombinaison homologue dans des souris (Knock-out ou KO). Ils sont également liés à une

myélopoïèse pathologique lorsqu’ils sont mutés. Nous reviendrons sur ces mutations plus loin

dans ce manuscrit. Un éclairage particulier sera apporté sur les facteurs de transcription MYB

et GATA1 car ils sont impliqués dans la translocation étudiée lors de cette thèse.

22

1 413

GATA1 ZnF

ZnF

AD

Figure 7 : Structure de la protéine GATA1. AD: domaine d’activation, ZnF : doigt de zinc.

23

(1) GATA1

Structure

La protéine GATA1 fait partie d’une famille composée de 6 facteurs de transcription

de GATA1 à GATA6. Leur caractéristique commune est la reconnaissance d’une séquence

consensus (A/T)GATA(A/G) par leur domaine de liaison à l’ADN en doigt de zinc. Cette

famille est subdivisée en deux sous-familles sur la base de leur profil d’expression. La

première est la sous-famille hématopoïétique qui comprend GATA1, GATA2 et GATA3.

GATA2 régule la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques ainsi que la différenciation

des mastocytes 27 et GATA3 intervient pour sa part dans le développement des lymphocytes T 28. La seconde est la sous-famille non-hématopoïétique qui regroupe GATA4, GATA5 et

GATA6 qui sont exprimés dans divers tissus dont le cœur et les organes digestifs.

Le gène GATA1, situé au niveau de la bande p11.23 du chromosome X, est composé

de 5 exons codant la protéine et deux premiers exons alternatifs correspondants à la région 5’

non traduite. L’exon distal est utilisé dans les testicules 29 tandis que l’exon proximal est

utilisé dans les cellules hématopoïétiques 30.

GATA1 code une protéine de 413 acides aminés constituée d’un domaine d’activation,

d’un doigt de zinc N-terminal (N-term ZnF) et d’un doigt de zinc C-terminal (C-term ZnF)

(Figure 7).

Le domaine d’activation de GATA1, codé par l’exon 2, module le pouvoir de

transactivation de GATA1 sur ses cibles. In vitro dans des cellules non hématopoïétiques, la

délétion de ce domaine diminue le pouvoir de transactivation du mutant comparé à la forme

sauvage de GATA1 31. Toutefois, dans la lignée érythroïde Gata1- (G1E) bloquée en

différenciation, la transfection de la protéine Gata1 tronquée lève le blocage de la même

manière que la forme sauvage, ce qui suggère que ce domaine n’est pas indispensable à son

rôle dans la différenciation érythroïde 32. En pathologie humaine, la délétion de ce domaine

suite à une mutation dans l’exon 2, est associée au développement d’hémopathies. Ces

mutations seront développées dans la partie traitant des mutations de facteurs de transcription

dans le développement de leucémies aiguës myéloïdes.

Le C-term ZnF constitue le domaine de liaison à l’ADN et assure la reconnaissance et

la fixation des facteurs GATA à leur séquence consensus. Le N-term ZnF permet quant à lui

de moduler l’activité de GATA1 et de stabiliser l’interaction de GATA1 avec l’ADN 33. Il est

capable de se lier à l’ADN sur des sites GATA palindromiques et également de médier

l’association de GATA1 avec le co-facteur Friend of GATA1 (FOG-1). Ce co-facteur est

24

GATA1

Différenciation érythroïde

Prolifération cellulaire

Apoptose

p16CDK6MYB

BcL‐xL

GlobineEPO‐R

Synthèse de l’hème

GATA1GATA1





ApoptoseApoptose

p16CDK6MYB

p16CDK6MYB

BcL‐xL

GlobineEPO‐R

Synthèse de l’hèmeGlobineEPO‐R

Synthèse de l’hème

Figure 8 : Fonctions de GATA1. Schéma de l’effet de GATA1 sur les processus de différenciation, de prolifération et d’apoptose via la régulation de l’expression de gènes cibles.

25

essentiel à l’activité régulatrice de GATA1 lors de l’érythropoïèse et la mégacaryopoïèse

puisque la mutation V205M inhibant leur interaction est à l’origine de thrombocytopénies et

d’anémies 34.

Fonctions

La protéine GATA1 est exprimée dans divers types cellulaires du système

hématopoïétique et notamment dans les cellules érythroïdes primitives et définitives, les

mégacaryocytes, les éosinophiles, les mastocytes mais aussi dans les testicules au niveau des

cellules de Sertoli. Durant l’hématopoïèse, GATA1 est impliquée dans la régulation des

processus de différenciation, de prolifération et de survie de certaines sous-populations

cellulaires (Figure 8).

Tout d’abord, GATA1 a été identifiée dans la lignée érythroïde comme une protéine

se fixant à l’enhancer de la β-globine humaine 35. Par la suite, des invalidations ciblées du

gène Gata1 ont permis de mettre en évidence son rôle crucial dans l’érythropoïèse. En effet,

les embryons de souris Gata1null meurent au jour E10.5-11.5 d’une anémie sévère par défaut

d’érythropoïèse primitive. Les cellules de cette lignée sont bloquées au stade précoce de

proérythroblaste 36. Le même phénotype est observé chez des souris mâles homozygotes

Gata1G105Y où l’invalidation de Gata1 partielle (Knock-down ou KD) induit une expression de

Gata1 équivalente à 5 % de l’expression normale 37. L’étude in vitro des cellules souches

embryonnaires (cellules ES) ES Gatanull et Gata1G105Y en co-culture avec des cellules

stromales OP9, qui permettent la différenciation primitive et définitive, a mis en évidence les

fonctions de Gata1 dans les cellules érythroïdes. En effet, en l’absence de Gata1, les cellules

sont bloquées au stade de proérythroblastes et un taux élevé d’apoptose est observé. A

contrario, en présence d’un faible taux de Gata1 (5%) les cellules bloquées au même stade

ont une prolifération accrue 38. Ces effets sont notamment dus à des modulations de l’activité

des protéines p16INK4A et Bcl-xL, régulateurs bien décrits des mécanismes de prolifération et

d’apoptose.

GATA1 joue donc un rôle essentiel durant l’érythropoïèse et notamment sur la

différenciation. Il permet l’engagement des progéniteurs vers la lignée érythroïde en régulant

l’action de PU.1. Effectivement, GATA1 et PU.1 se lient, ce qui entraine une régulation

négative mutuelle par séquestration réciproque : PU.1 inhibe la fixation de GATA1 sur les

promoteurs de ces gènes cibles 39 et GATA1 empêche l’interaction de PU.1 avec son co-

activateur c-Jun 40. Cette régulation permet d’engager les cellules vers une différenciation soit

27

érythro-mégacaryocytaire, soit granulo-monocytaire en fonction des taux d’expression de

chacun.

D’autre part, GATA1 contrôle également la différenciation terminale des érythrocytes.

Cet effet passe par la régulation de la transcription de gènes spécifiques de la lignée

érythroïde tels que les enzymes permettant de produire l’hémoglobine ou encore le gène de la

globine 41. De plus, il régule l’expression de GATA2 dans les progéniteurs hématopoïétiques

en se fixant sur des sites GATA présents dans sa région 5’ ce qui entraine une diminution de

sa transcription 42. Durant toutes ces étapes, GATA1 est capable de s’auto-réguler afin de

maintenir son expression en se fixant sur des sites GATA situés dans son promoteur après

dimérisation via son N-term ZnF 43,44. De plus, son activité transcriptionnelle peut être

modulée par des interactions avec des co-facteurs comme CBP (CREB Binding Protein)/P300 45.

En parallèle, GATA1 module la prolifération et la survie. Tout d’abord, GATA1

régule l’expression du gène codant le récepteur à l’EPO, un facteur de croissance majeur des

cellules érythroïdes impliqué dans leur survie 46. GATA1 influence la prolifération en régulant

négativement la transcription de gènes impliqués dans le cycle cellulaire comme CDK6 ou de

gènes mitogènes comme MYB 47. Enfin, l’apoptose est inhibée par GATA1 via l’induction de

l’expression du facteur anti-apoptotique BcL-xL.

Une étude par Chromatin Immuno Precipitation-Sequencing (ChIP-Seq) 48 sur une

lignée murine d’érythroleucémie a permis de mettre en évidence le nombre important de

gènes régulés par Gata1. Cette étude a confirmé que les gènes régulés positivement par Gata1

participent, entre autre, à la biosynthèse de l’hémoglobine ou font partie de la voie de

signalisation Ras/GTPase. Les gènes associés au cycle cellulaire quant à eux font partie des

gènes régulés négativement par Gata1. Enfin, Gata1 régulerait négativement certaines cibles

durant l’érythropoïèse par induction de l’expression de deux microARN : miR-144 et miR-

451 49.

D’autre part, GATA1 joue un rôle important dans la mégacaryopoïèse. En effet,

l’invalidation ciblée de Gata1 dans la lignée mégacaryocytaire entraîne une diminution de la

production de plaquettes liée à un défaut de différenciation associé à une prolifération accrue

de mégacaryocytes immatures 50. L’activité de GATA1 n’est pas seulement requise pour la

différenciation érythro-mégacaryocytaire. Par exemple, lors du développement des

éosinophiles, la délétion d’un site GATA dans le promoteur Gata1 chez des souris provoque

une incapacité à produire des éosinophiles matures et fonctionnels 51. De plus, dans un modèle

de progéniteurs hématopoïétiques de poulet transformés en myéloblastes par l’oncogène Myb-

28

Figure 9 : Structure du gène MYB. La séquence d’atténuation est représentée par une étoile. Les exons alternatifs sont représentés en gris. D’après Zhou et al. 52

29

Ets, l’expression forcée de Gata1 à un niveau intermédiaire entraîne une reprogrammation des

cellules en éosinophiles et en mégacaryocytes lorsqu’il est plus fortement exprimé 53.

Concernant les mastocytes, Gata1 interviendrait dans leur différenciation terminale étant

donné que les souris Gata1low (20 % de l’expression normale) présentent des mastocytes

anormaux 54,55. GATA1 apparaît donc requis pour le bon développement de différentes

lignées myéloïdes.

(2) MYB

Structure

Le gène MYB a été identifié comme l’analogue cellulaire du gène v-myb des virus

AMV (Avian Myeloblastosis Virus) et E26 capable d’induire chez le poulet des leucémies

myéloblastiques et érythroblastiques respectivement. MYB fait partie d’une famille de

facteurs de transcription comprenant, MYB, AMYB et BMYB, et partageant une forte

homologie de séquence, notamment au niveau du domaine de liaison à l’ADN. Néanmoins, ils

diffèrent par leurs profils d’expression tissulaire. Ce gène, hautement conservé au long de

l’évolution 56, est majoritairement exprimé dans les cellules hématopoïétiques immatures.

Le gène MYB est situé sur le chromosome 6 au niveau de la bande q23. Le premier

intron comprend une séquence permettant l’atténuation du niveau de transcription qui apparait

critique dans la mesure où elle est mutée dans les cancers colorectaux associés à une forte

expression de MYB 57. Ce gène est composé de 15 exons avec 6 exons alternatifs (Figure 9).

L’expression et l’activité transcriptionnelle de ces 6 variants d’épissage ont été étudiés 58. Ils

possèdent le même site de liaison à l’ADN mais diffèrent par leur domaine carboxy-terminal.

Cette différence est à l’origine d’un pouvoir de transactivation différent pour chaque variant.

De plus, leur expression varie suivant le lignage mais aussi suivant le contexte pathologique

(LAM ou LAL-T). Il semblerait alors que ces variants aient un rôle dans les processus de

différenciation physiologique mais aussi lors de phénomènes de leucémogénèse. Avant cette

étude, des différences fonctionnelles entre Myb (p75) et le variant p89 avaient été mise en

évidence. En effet, les 2 isoformes p75 et p89 n’ont pas le même impact sur l’apoptose induite

par privation en IL-3 dans une lignée myéloïde murine (32Dcl3). La forme p89 retarde

l’apoptose par l’activation transcriptionnelle du glutathion-s-transférase µ contrairement à p75

qui accélère l’apoptose par blocage de l’expression de cette enzyme 59. De plus, l’isoforme

p89 n’est pas indispensable à une hématopoïèse normale contrairement à MYB 60. Une étude

30

NRDTAD1 640

MYB NRDTADDBD

L Z

acid

ic

R1 R2 R3

Figure 10 : Structure de la protéine MYB. DBD : domaine de liaison à l’ADN ; R1, R2, R3 : répétitions ; TAD : domaine de transactivation ; acidic : domaine acide ; NRD : domaine de régulation négative ; LZ : domaine leucine zipper.

31

récente sur des cas de LAL-B pédiatriques suggère la possible utilisation de ces variants

d’épissage comme biomarqueurs 52.

La protéine MYB de 75 KDa, est soumise à des modifications post-traductionnelles

telles que la phosphorylation 61 ou l’acétylation qui modifient son activité transcriptionnelle 62. De plus, MYB s’auto-regule grâce à la présence dans son promoteur de sites de

reconnaissance spécifiques 63.

Cette protéine est composée de trois grands domaines fonctionnels : un domaine de

liaison à l’ADN (DBD), un domaine de transactivation (TAD) et un domaine répresseur

(NRD) 64 (Figure 10).

Le premier situé en N-terminal est constitué de 3 répétitions imparfaites d’environ 50

acides aminés formant une structure hélice-tour-hélice qui reconnaît le motif t/cAACt/gG

appelé Myb Binding Site (MBS)65. Les répétitions R2 et R3 sont impliquées dans la

reconnaissance de ces sites et dans la liaison à l’ADN stabilisée par R1 66.

Le domaine central correspond au domaine de transactivation 67 et contient un

domaine acide, conservé entre espèces, qui contribue au bon fonctionnement de MYB

puisqu’une mutation dans ce domaine diminue son pouvoir transcriptionnel 68. Le domaine de

transactivation assure les interactions entre MYB et ses co-facteurs, notamment le

recrutement de CBP/P300. L’insertion d’une mutation (M303V) au sein du domaine de

transactivation empêche cette liaison et annule le pouvoir transformant de MYB dans la lignée

myéloïde murine FDB–169.

Le domaine répresseur situé en C-terminal comprend un domaine « leucine zipper »

(LZ) intervenant dans la régulation transcriptionnelle négative par MYB de ces gènes cibles 70. Ce domaine LZ permet l’homodimérisation de MYB, mécanisme qui empêche la fixation à

l’ADN des dimères et induit des phénomènes de compétition avec les monomères de MYB à

travers le recrutement des mêmes co-facteurs 71. L’importance du domaine de régulation

négative dans la protéine MYB a été largement étudiée par l’intermédiaire d’analyses

fonctionnelles de formes tronquées de MYB. Tout d’abord, la délétion de ce domaine entraîne

une augmentation de l’activité transcriptionnelle 72, ce qui est aussi observée pour le variant

d’épissage MYB 9A 58. De plus, ces formes tronquées artificiellement ont un pouvoir

transformant 73-74. Cet effet se rapproche de celui obtenu par l’expression de v-myb qui ne

possède pas ce domaine de régulation négative.

32

MYB

Différenciation myéloïde


ApoptoseBcl2

MYBMYB





ApoptoseBcl2

Figure 11 : Fonctions de MYB. Schématisation de l’effet de MYB sur les processus de différenciation, de prolifération et d’apoptose via la régulation de l’expression de gènes cibles.

33

Fonctions

MYB est décrit comme un régulateur de l’hématopoïèse physiologique par son

implication dans la prolifération, la survie et la différenciation des cellules hématopoïétiques

(Figure 11). Son rôle essentiel dans l’hématopoïèse définitive a été démontré par

l’invalidation de Myb provoquant la mort in utero au jour E15.5 par défaut de développement

de la lignée érythroïde et myéloïde 75.

Son expression doit diminuer afin de permettre la différenciation des cellules

hématopoïétiques en cellules matures. En effet, l’induction de la différenciation, par des

agents chimiques, dans la lignée d’érythroleucémie murine (MEL) et de leucémie

promyélocytaire humaine HL60, entraine une diminution de l’expression de MYB 76,77.

L’expression constitutive de Myb dans la lignée MEL ainsi que dans les lignées myéloïdes

M1 et 32Dcl3 bloque la différenciation 78,79 et est associée à un maintien de la prolifération

dans le cas de la lignée M1 80. Dans la lignée promyélocytaire HL-60, l’utilisation d’un ARN

anti-sens dirigé contre l’ARNm de MYB diminue leur prolifération et ces cellules se

retrouvent dans l’incapacité de se différencier en granulocytes 81. Le blocage de

différenciation dans la lignée MEL peut se faire par une forme tronquée ne comprenant pas le

NRD 82.

Il semblerait que cette capacité de MYB à bloquer la différenciation soit spécifique du

lignage puisque dans la lignée K562, la différenciation érythroïde est bloquée tandis que la

différenciation mégacaryocytaire n’est pas affectée 83. Enfin, la délétion conditionnelle de

Myb dans des souris a permis de mettre en évidence son implication dans la différenciation

des lymphocytes B et T 84,85.

Le facteur de transcription MYB régule la prolifération par l’intermédiaire de ses

gènes cibles comme MYC, KIT et Cycline B1 (CCNB1) 86. De plus, il est impliqué dans l’auto-

renouvellement des cellules souches multipotentes et des progéniteurs communs lymphoïdes

et myéloïdes. Cet effet a été validé par modèle murin d’invalidation conditionnelle de Myb qui

montre une diminution de l’auto-renouvellement des cellules souches accompagnée d’une

accélération de la différenciation 87.

Une étude récente par ChIP-Seq dirigée contre Myb a permis de montrer l’importance

de ce facteur de transcription à travers la mise en évidence du nombre important de facteurs

de transcription qu’il est capable de réguler. Certaines cibles identifiées ou confirmées lors de

ces travaux permettent de mieux comprendre les fonctions précédemment évoquées de MYB

lors de l’hématopoïèse. En effet, Myb régule positivement les gènes Cited2 et Gfi1, tous deux

34

Figure 12 : Structure de la protéine PU.1. TAD : domaine de transactivation, PEST : Proline (P), acide glutamique (E), sérine (S), thréonine (T); DBD : domaine de liaison à l’ADN ; β3/β4 : région impliquée dans les interactions avec des co-facteurs.

Figure 13 : Structure de la protéine C/EBPα. TAD : domaine de transactivation ; DBD : domaine de liaison à l’ADN.

DBD

1 272

TAD β3/PEST

β4PU.1

1 358

TAD1 TAD2C/EBPα DBD

35

importants dans le maintien de l’auto-renouvellement des CSH 88-89. En outre, Myb réprime

des régulateurs de la différenciation hématopoïétique tels que PU.1 et Aml1, expliquant le

blocage de différenciation observé lors d’un maintien de l’expression de Myb 90.

(3) PU.1

Cette protéine codée par le gène SPI1 fait partie de la famille des facteurs de

transcription à domaine de liaison à l’ADN de type ets (Figure 12). Elle est activée par

phosphorylation et interagit avec des co-facteurs tels que c-Jun et AML1.

Ce facteur de transcription intervient dans le développement des monocytes et des

lymphocytes. Le choix d’une voie par rapport à l’autre dépendrait du taux d’expression de

PU.1. En effet, une forte expression dans des cellules Lin– murines PU.1-/- favorise la

différenciation en monocytes 91. Le KO de PU.1 92 affecte le développement des granulocytes,

des macrophages, et des lymphocytes B et T, entraînant la mort par septicémie des souris en 2

jours après la naissance. Lors du maintien en vie prolongée de ces souris par traitement

antibiotique, les lymphocytes T et les granulocytes commencent à se différencier

contrairement aux lymphocytes B et aux macrophages. Ceci démontre le rôle majeur de PU.1

dans l’engagement vers ces lignages. L’importance du niveau d’expression de PU.1 a été

démontrée par invalidation partielle dans un modèle murin (20 % de l’expression normale)

qui induit le développement de LAM touchant la lignée granulocytaire qui est favorisée au

détriment des monocytes. Ce phénomène s’explique par la perte d’expression des récepteurs

spécifiques aux facteurs de croissance de la lignée monocytaire : M-CSF et GM-CSF 93. Au

contraire une haploinsuffisance n’a pas d’effet sur l’expression des récepteurs aux cytokines

G-CSF, M-CSF et GM-CSF. Néanmoins, à l’état adulte l’inactivation de PU.1 favorise le

développement de LAM 94. Le rôle de PU.1 dans la myélopoïèse est donc fortement lié à son

action régulatrice sur les récepteurs aux cytokines spécifiques des granulocytes et des

monocytes. Lors des expériences d’invalidation partielle ou totale, l’expression de ces

récepteurs a été étudiée démontrant que le phénotype observé était lié à cette expression.

(4) C/EBPα

Ce facteur de transcription fait partie de la famille des CCAAT/enhancer Binding

Protein qui sont des facteurs comprenant un domaine de liaison à l’ADN de type leucine-

zipper (Figure 13).

36

A B CA B C

Figure 14 : Images des granulocytes matures. A : Granulocyte neutrophile, B : Granulocyte éosinophile, C : Granulocyte basophile.

37

Dans un modèle non hématopoïétique, il a été montré qu’il était capable d’inhiber la

prolifération 95. Cette protéine exprimée dans les progéniteurs myéloïdes précoces voit son

expression augmentée lors de la différenciation en granulocytes et diminuée lors de la

différenciation monocytaire 96. Le KO de C/EBPα entraîne un blocage dans la maturation des

granulocytes sans affecter les autres lignées. Son caractère indispensable pour la

différenciation des granulocytes est dû à sa capacité de réguler un gène cible clé dans ce

processus : le récepteur au G-CSF 97. En effet, l’invalidation de ce gène provoque un blocage

précoce des cellules qui ne répondent pas au G-CSF du fait d’une absence de récepteur à cette

cytokine.

C. Ontogénèse des granulocytes basophiles

1. Fonction des basophiles

Ces cellules appartiennent au groupe des granulocytes, comprenant les neutrophiles,

éosinophiles et basophiles (Figure 14). Les neutrophiles sont les granulocytes majoritaires et

sont capables de phagocyter les cellules. Les éosinophiles sont principalement impliqués dans

la réaction anti-parasitaire. Morphologiquement, les granulocytes basophiles sont des cellules

mononuclées de 10 à 14 µm de diamètre, avec un noyau en « brioche » et un cytoplasme

rempli de granules d’allure sombres et violacées à la coloration May-Grünwald-Giemsa

(MGG) et recouvrant partiellement le noyau. La caractéristique principale d’un granulocyte

basophile est la présence de granules cytoplasmiques contenant des médiateurs tels que

l’histamine. Ces médiateurs chimiques peuvent être sécrétés rapidement lors de la stimulation

ligand/ récepteur, de type IgE/ récepteur du fragment constant des IgE (FcεRI) ou IgG/

récepteur du fragment constant des IgG (FcγRII). Tout d’abord, ils interviennent dans les

réactions allergiques. En particulier, ils sont capables d’initier des allergies chroniques

médiées par les IgE 98 et des chocs anaphylactiques médiés par les IgG 99. Les basophiles

jouent un rôle dans la régulation immunitaire en sécrétant des interleukines, l’IL-4 pour la

différenciation des lymphocytes T en lymphocytes T helper de type 2 100 ainsi que l’IL-4 et

l’IL-6 ensemble pour stimuler la production d’anticorps par les lymphocytes B 101. Malgré la

très faible représentation des basophiles, moins de 1% des globules blancs circulants, ils

jouent donc des rôles importants dans différents processus immunitaires.

39

2. Origine des basophiles humains

Comme toutes les cellules hématopoïétiques, les basophiles sont générés à partir de

CSH, néanmoins les progéniteurs basophiles humains ne sont pas bien définis. Plusieurs

hypothèses ont été émises les concernant, et notamment l’existence de progéniteurs communs

basophile/éosinophile (Ba/Eo), basophile/mégacaryocyte (Ba/Meg) et basophile/mastocyte

(Ba/Mast). La première hypothèse d’un progéniteur Ba/Eo est étayée par l’observation lors de

tests clonogéniques de colonies mixtes 9, par l’augmentation du nombre de granulocytes

basophiles et éosinophiles sans le sang après traitement par l’IL-3 102 ou encore par la

présence de cellule hybride Ba/Eo lors de leucémies 103. L’existence d’un progéniteur Ba/Meg

a été suggérée par l’observation de production d’histamine par des lignées

mégacaryoblastiques telle que UT7 104. La lignée UT7 a d’ailleurs permis d’obtenir

l’anticorps spécifique des basophiles et des mastocytes, 97A6 105. Enfin, du fait de certaines

analogies phénotypiques telles que l’expression du récepteur FcεRI, la présence de granules

métachromatiques ainsi que l’implication dans les réactions allergiques par sécrétion de

médiateurs, l’hypothèse d’un progéniteur commun entre les basophiles et les mastocytes a été

émise. L’un des arguments majeur en faveur de l’existence de ce progéniteur commun est que

la lignée basophile KU812 mais aussi les basophiles de patients atteints d’asthme ou

d’allergies expriment un marqueur de mastocytes : la tryptase 106-107. De plus, la production

d’un anticorps spécifique des basophiles et des mastocytes a permis de mettre en évidence que

les cellules CD34+97A6+ pouvaient donner des basophiles ou des mastocytes, en présence

d’IL-3 ou de SCF respectivement 105. Néanmoins, un argument va à l’encontre de cette

hypothèse. En effet, lors de l’augmentation du nombre de basophiles associée à des leucémies

myéloïdes chroniques, le contingent de mastocytes n’est pas affecté 108.

Sur le plan des stimulations cytokiniques, il ressort que l’IL-3 est centrale pour assurer

le bon déroulement de la différenciation des basophiles 109. Cependant, contrairement au M-

CSF pour les monocytes ou à l’EPO pour les érythrocytes, l’IL-3 ne semble pas avoir un

spectre d’action très spécifique dans la mesure où elle assure d’autres rôles tels que la

régulation de la prolifération des cellules souches hématopoïétiques. Une autre étude sur la

lignée myéloïde HL60 a proposé que l’IL-5 soit une cytokine spécifique des basophiles chez

l’homme 9. Enfin, les gènes spécifiques impliqués dans le processus de différenciation des

basophiles humains ne sont pas connus.

40

Figure 15 : Contrôle de la différenciation basophile par C/EBPα et Gata2. La différenciation des basophiles fait intervenir l’expression ordonnée des facteurs de transcription C/EBPα et Gata2 et le niveau d’expression de C/EBPα. PGM : Progéniteur granulocyte monocyte ; PBa/Mast : Progéniteur Basophile mastocyte ; PEo : Progéniteur Eosinophile ; PBa : Progéniteur basophile ; PMast : Progéniteur mastocytaire. D’après Arinobu et al.110

PGM

PEo

PBa

PMast

PBa/Mast

Ordre d’expression

Dosage de c/ebpα

41

3. Les basophiles murins

Dans les modèles murins, la démonstration de l’existence d’un progéniteur basophile

et Ba/Mast a été faite 111. Le progéniteur basophile retrouvé dans la moelle osseuse

correspond à la population cellulaire Lin–CD34+FcεRI+c-Kit–. Lors de ces travaux, les auteurs

ont identifié le progéniteur bipotent Ba/Mast dans la rate sur le critère d’expression élevée de

l’intégrine β7 dans la fraction Lin–c-Kit+FcγRII/III+. Ces travaux ont permis de mettre en

évidence le rôle important du facteur de transcription C/EBPα dans la différenciation des

basophiles. En effet, sa surexpression dans le progéniteur bipotent Ba/Mast induit une

différenciation en basophile tandis que son extinction induit une différenciation mastocytaire.

Cette même équipe a démontré que l’ordre et le niveau d’expression des facteurs de

transcription Gata2 et C/EBPα était critique dans l’engagement des progéniteurs vers la lignée

basophile, éosinophile ou mastocytaire (Figure 15). La surexpression de Gata2 dirige les

PGM vers la différenciation soit en éosinophiles, en basophiles ou en mastocytes. A ce niveau

d’expression de Gata2, si les PGM maintiennent le taux d’expression initial de C/EBPα, ils se

différencient en progéniteurs éosinophiles tandis que si l’expression de C/EBPα est diminuée,

ils se différencient en progéniteur commun Ba/Mast. Une fois le stade de progéniteur Ba/Mast

atteint, C/EBPα doit être ré-augmenté pour permettre la différenciation en progéniteur

basophile 26.

42

LAM avec anomalies cytogénétiques récurrentes LAM avec t(8;21) (q22;q22) ; AML1‐ETO

LAM avec t(15;17) (q22;q12) ; PML‐RARA

LAM avec inv(16)(p13.1q22) ou t(16 ;16)(p13.1q22) ; CBFB‐MYH11

LAM avec t(9;11)(p22;q23) ; MLLT3‐MLL

LAM avec t(6;9)(p23;q34) ; DEK‐NUP214

LAM avec inv(3)(q21q26.2) ou t(3;3)(q21;q26.2) ; RPN1‐EVI1

LAM (mégacaryoblastique) avec t(1;22)(p13;q13) ; RBM15‐MKL1

Entités provisoires : LAM avec mutation NPM1LAM avec mutation CEBPA

LAM avec anomalies associées aux myélodysplasies

Faisant suite à un syndrome myélodysplasique ou un syndrome myéloprolifératif/dysplasique Ou présentant des anomalies cytogénétiques identiques à celles des myélodysplasies Ou présentant une dysplasie sur > 50% des cellules d’au moins 2 lignées myéloïdes

LAM post chimiothérapie

LAM sans spécification particulière

LAM avec différenciation minime

LAM sans maturation

LAM avec maturation

LA myélomonocytaire

LA monoblastique / monocytaire

LA érythroïde : LA érythroïde pure

LA mégacaryoblastique

LA à basophile

Panmyélose aiguë avec myélofibrose

Sarcome granulocytaire

Proliférations myéloïdes associées à la trisomie 21 constitutionnelle

Myélopoïèse anormale transitoire

LAM associée à la trisomie 21 constitutionnelle

Néoplasie dendritique plasmocytoïde blastique

Tableau 1 : Classification OMS des leucémies aiguës myéloblastiques et hémopathies apparentées (2008). D’après Vardiman et al.112

Figure 16 : Types d’anomalies chromosomiques. (http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaEng.html)

43

III. Les leucémies aiguës myéloblastiques

A. Classification

Au cours des étapes de différenciation et de prolifération nécessaires à la constitution

d’un tissu sanguin fonctionnel, peuvent survenir des mutations au sein d’une cellule. Elles

pourront être à l’origine d’une hémopathie maligne. Ces pathologies très hétérogènes sont

caractérisées par l’émergence d’une ou plusieurs populations de cellules immatures et/ou par

leur représentation anormale. Les leucémies aiguës correspondent à la prolifération d’une

cellule immature bloquée à un stade précoce de la différenciation. Elles sont classées en

fonction de la lignée cellulaire atteinte en leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) ou

myéloblastiques (LAM). L’OMS a reparti les LAM en 7 groupes selon des critères

cytogénétiques, moléculaires et morphologiques (Tableau 1).

B. Les altérations génétiques

1. Les anomalies de structure

La mise en évidence des anomalies de structure se fait par étude cytogénétique sur

chromosomes métaphasiques. Il existe beaucoup d’anomalies structurales du chromosome

répertoriées dont la translocation chromosomique fait partie (Figure 16).

a) Les translocations chromosomiques

Les translocations chromosomiques impliquent des recombinaisons illégitimes et des

juxtapositions de gènes normalement physiquement séparés. On distingue les translocations

inter-chromosomiques quand les deux fragments joints appartiennent à deux chromosomes

distincts, des remaniements intra-chromosomiques lorsqu’ils sont issus du même chromosome

(inversion, délétion). Les anomalies sont dites équilibrées lorsque qu’aucun gain ni perte de

matériel chromosomique n’est observé.

Pour qu’elles soient fonctionnelles et leucémogènes, elles doivent répondre à divers

critères tels que l’apparition de cassures double brin simultanées sur deux chromosomes dans

une même cellule et une proximité spatiale entre les régions chromosomiques impliquées. Le

contexte cellulaire dans lequel se produit la translocation doit également être pris en compte.

En effet, il est possible qu’un réarrangement dans un progéniteur lymphoïde ne donne pas lieu

à un avantage prolifératif comme il y donnerait lieu s’il était apparu dans un progéniteur

myéloïde.

45

L’effet d’un réarrangement chromosomique est, soit assez important pour conférer un

avantage à la cellule, soit il nécessite des évènements secondaires, additionnels, tels que des

mutations touchant un gène codant une kinase ou un facteur de transcription, c’est la théorie

des deux évènements (« two hits »). La progression de syndromes myélodysplasiques (SMD)

en LAM peut être liée à l’acquisition de mutations au niveau des gènes FLT3 et RAS dans 1/3

des cas 113. Un autre exemple est la transformation d’une leucémie myéloïde chronique

(LMC) en LAM. En effet, le premier évènement à l’origine de la LMC peut être l’expression

de BCR-ABL, et le second évènement conduisant à l’acutisation de la maladie par blocage de

la différenciation des cellules peut être l’apparition de la translocation t(7;11)(p15;p15)

(NUP98-HOXA9)114 par exemple.

Dans ces deux cas, les gènes impliqués dans ces réarrangements sont importants dans

la régulation de processus biologiques tels que la prolifération, la survie ou le cycle cellulaire.

Ils peuvent donc les moduler afin de conférer un avantage sélectif à la cellule et conduire à la

formation d’un clone leucémique. Ces gènes sont alors appelés des oncogènes. En parallèle de

ces translocations, le réarrangement conduit à une inactivation d’une copie du gène, et donc

une haplo-insuffisance, qui peut agir en coopération avec le transcrit de fusion dans les

processus de leucémogénèse. Cet effet a été démontré dans la leucémie aiguë promyélocytaire

au cours de laquelle la translocation t(15;17)(q22;q21) aboutit à la formation d’une protéine

chimérique, PML-RARα. L’haplo-insuffisance de Pml combiné à l’expression de Pml-Rarα

augmente la fréquence et diminue le temps d’apparition de la maladie in vivo115.

(1) Mécanismes de formation

Les étapes d’une translocation sont la formation de deux cassures double brin

(Double-Strand Break : DSB) sur deux chromosomes suivie d’un ré-appariement illégitime

lors du processus de réparation. L’apparition de DSB peut être observée lors des

recombinaisons V(D)J (Variable, Diversité, Jonction) qui sont des réarrangements somatiques

permettant de générer un vaste répertoire d’immunoglobulines et de récepteurs des

lymphocytes T (TCR) exprimés respectivement par les lymphocytes B et T. Ce mécanisme

fait intervenir les enzymes RAG1 et RAG2 (Recombination-Activating Gene 1 et 2). Des

accidents de recombinaison somatique peuvent être à l’origine de translocations

chromosomiques telle que la translocation t(14;18)(q32;q21) qui juxtapose le gène anti-

apoptotique BCL2 à l’enhancer des immunoglobulines conduisant à la surexpression de BCL2

dans les lymphomes folliculaires 116 .

47

Le rôle de la topoisomérase II dans l’apparition de DSB a été mis en évidence lors de

l’observation du développement de leucémies secondaires aux traitements ciblant cette

enzyme par des inhibiteurs 117, les plus courants étant l’étoposide, la daunorubicine et la

doxorubicine. La topoisomérase II, fortement exprimée dans les cellules cancéreuses, relâche

les boucles de l’ADN en créant des cassures temporaires qu’elle re-ligue et ainsi joue un rôle

important au cours de la réplication. Lors de l’utilisation des inhibiteurs de cette enzyme, les

cassures sont maintenues par stabilisation de l’enzyme sur les brins clivés, induisant ainsi une

entrée en apoptose des cellules cancéreuses. Néanmoins, ces molécules agissent sur toutes les

cellules, c’est pourquoi, l’apparition de translocations est observée post-traitement car les

brins clivés se retrouvent libres pour participer à la formation de translocations

chromosomiques. Ce mécanisme est confirmé par la présence des séquences consensus de

fixation de la topoisomérase II au niveau des points de cassure retrouvés dans le gène MLL

(Mixed Lineage Leukemia), gène le plus fréquemment réarrangé lors de l’apparition de

leucémies post-traitement 118.

De plus, il existe sur le génome des séquences définies comme des « hot-spots » de

recombinaison, c’est à dire, des sites fragiles plus favorables à subir des translocations. Elles

se définissent par des séquences particulières comme des sites de clivage à la topoisomérase II 118, des régions comprenant des répétitions purine/pyrimidine 119 ou des séquences Alu 120.

Néanmoins, l’étape critique après formation de ces deux DSB est leur réparation. En

effet, on estime à 50 le nombre de DSB par cellule lors d’une division 121. Pour réparer ces

cassures, il existe deux systèmes opérant à différents stades du cycle qui sont la

recombinaison homologue (Homologous recombination : HR) et le principal mécanisme à

l’origine des translocations, la liaison des extrémités non homologues (Non-homologous end-

joining : NHEJ). Un défaut de ces systèmes peut expliquer l’apparition de translocations. La

HR, ayant lieu durant la phase S et G2/M, utilise des séquences répétées homologues pour

réparer les cassures. Or, il existe dans certaines régions chromosomiques des séquences

répétées de type Alu qui sembleraient être impliquées dans les translocations entre le gène

BCR et ABL 122 ainsi que dans les réarrangements MLL 123. Le processus de NHEJ, opérant

durant la phase G0 et G1 du cycle, est réalisé à l’aide de deux complexes multi-protéiques,

l’un prenant en charge les brins clivés et les positionnant (l’ADN-protéine kinase et

l’hétérodimère Ku70/Ku86) pour que le deuxième effectue la re-ligation (ligase IV/XRCC4).

L’implication du NHEJ dans la recombinaison illégitime de deux chromosomes est révélée

par la présence au niveau du point de cassure de courtes séquences homologues 124.

48

Gène A Gène B

Gène B

Gène A Gène BGène B

Gène B

Figure 17 : Principe d’une anomalie quantitative. Après réarrangement, le gène B peu ou pas exprimé dans la cellule est sous dépendance transcriptionnelle des éléments régulateurs R d’un gène A fortement exprimé dans cette même cellule. D’après Look 125.

Gene A Gène B

Gène AB

Gene A Gène B

Gène AB

Gene A Gène BGène B

Gène AB

Figure 18 : Principe d’une anomalie qualitative. Après le réarrangement chromosomique, le gène A et B fusionne pour donner un nouveau gène chimérique en phase sous dépendance transcriptionnelle des éléments régulateurs R du gène situé en 5’. D’après Look 125.

49

(2) Types de translocation

(a) Celles qui génèrent une activation transcriptionnelle

Dans ce cas, les translocations conduisent à la dérégulation de l’expression d’un gène

mis sous la dépendance d’un nouvel élément de régulation comme un promoteur fort ou

constitutivement actif ainsi qu’un enhancer (Figure 17). Ce type d’anomalie est quantitatif et

entraîne une expression ectopique ou une surexpression d’une protéine normale. Ce type de

translocation est rarement observé dans les pathologies myéloïdes, hormis l’activation du

gène EVI1 dans les translocations impliquant la région chromosomique 3q26 126, et sont

fréquentes dans les pathologies lymphoïdes. Citons pour exemple, la translocation

t(14;18)(q32;q21) retrouvée dans les lymphomes folliculaires qui juxtapose la région

régulatrice comprenant l’enhancer des immunoglobulines avec le gène anti-apoptotique BCL2

conférant ainsi aux cellules une protection accrue contre l’apoptose. Sur le même modèle, la

translocation t(8;14)(q24;q32) est à l’origine d’une surexpression du gène MYC induisant une

forte prolifération des lymphocytes B dans les lymphomes de Burkitt.

Enfin, cette anomalie n’est pas restreinte aux gènes codant des protéines, elle peut

aussi s’appliquer aux microARN. Dans notre équipe, nous avons mis en évidence la

surexpression de mir125b (x10 à x90) suite à la translocation t(2 ;11)(p21 ;q23) chez des

patients atteints de LAM et SMD. Nous avons ensuite démontré in vitro qu’une surexpression

de ce microARN dans des lignées myéloblastiques et des cellules souches humaines CD34+

était capable de bloquer la différenciation myéloïde 127.

(b) Celles qui sont à l’origine d’un gène chimérique

La deuxième conséquence d’une translocation peut être la création d’un nouveau gène,

appelé gène de fusion ou chimérique, dans le cas de la juxtaposition de deux gènes

« critiques » dans la même orientation et conservant un cadre de lecture ouvert (Figure 18).

Cette anomalie est alors qualitative. Lors de translocations réciproques et équilibrées, deux

gènes de fusion sont générés mais en règle générale, un seul est impliqué dans le processus

tumoral. La protéine chimérique correspondante peut être soit activée constitutivement dans le

cas d’une kinase, ou avoir une activité transcriptionnelle modifiée lorsqu’un facteur de

transcription est réarrangé.

50

p210

ABLBCR

Figure 19 : Structure de la forme p210 de la protéine de fusion BCR-ABL. SH : domaine d’homologie Src, DBL : domaine d’homologie avec la protéine DBL, TK : Domaine tyrosine kinase, Pxxp : domaine riche en proline, SLN : séquence de localisation nucléaire, DB : domaine de liaison à l’ADN. La flèche rouge indique la jonction entre les deux protéines. D’après www.imgt.org.

Figure 20 : Structure de la protéine PCM1-JAK2. CC: domaine coiled-coiled; JH2: domaine pseudokinase; TK: domaine tyrosine kinase. La flèche rouge indique la jonction entre les deux protéines.

PCM1‐JAK2JAK2PCM1

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CCPCM1‐JAK2

JAK2PCM1

PCM1‐JAK2PCM1‐JAK2JAK2PCM1

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

51

Réarrangement de gène codant une kinase

La translocation la plus connue aboutissant à l’activation constitutive d’une kinase est

la t(9;22)(q34;p11) retrouvée dans plus de 90 % des cas de leucémie myéloïde chronique

(LMC) et dans environ 30 % des LAL-B de l’adulte. Cette translocation aboutit à la formation

d’un chromosome communément appelé chromosome de Philadelphie, décrit par Nowell et

Hungerford en 1960. Ce réarrangement est à l’origine de la création d’une protéine de fusion

BCR-ABL1 128. Le point de cassure au niveau du gène BCR peut être différent et générer trois

formes de protéine de fusion nommées p190, p230 et p210 majoritaire dans les LMC (Figure

19). La partie comprenant BCR permet, par l’intermédiaire des domaines coiled-coiled, la

dimérisation de la protéine, ce qui provoque l’activation constitutive des domaines kinases

présents sur ABL1. Cette activité kinase incontrôlée va aboutir à une dérégulation du cycle

cellulaire et une diminution de l’apoptose par l’intermédiaire des Rac-GTPases 129. Un

inhibiteur spécifique, l’imatinib mesylate (Glivec®) 130, agissant comme un inhibiteur de

l’activité tyrosine kinase en occupant la poche à ATP d’ABL, a permis d’améliorer la survie

des patients.

Un autre exemple, décrit dans le laboratoire, est la protéine de fusion PCM1-JAK2

retrouvée dans deux cas de LMC atypique 131 et associée à la translocation t(8;9)(p22;p24)

(Figure 20). Cette protéine est basée sur le même modèle, c’est à dire la fusion de la partie N-

terminale de PCM1 (pericentriolar material 1) impliqué dans l’assemblage des protéines du

centrosome et contenant des domaines coiled-coiled avec la tyrosine kinase JAK2. Ces

domaines coiled-coiled sont probablement à l’origine de la capacité de cette protéine à se

dimériser et à activer le domaine tyrosine kinase de JAK2 auquel elle est fusionnée.

Réarrangement de gène codant un facteur de transcription

Ce type de réarrangement est à l’origine de la formation de facteurs de transcription

chimériques ayant des propriétés modifiées. Ils peuvent être classés en deux familles, ceux

ayant un effet de dominant négatif ou ceux ayant un effet d’activateur transcriptionnel.

52

AML1‐ETO

AML1 ETO

Figure 21 : Structure de la protéine de fusion AML1-ETO. La flèche rouge indique la jonction entre AML1 et ETO. Le domaine Runt d’AML1 correspond au domaine de liaison à l’ADN. ETO est composé de trois domaines riche en proline et de deux doigts de zinc. La flèche rouge indique la jonction entre les deux protéines. D’après www.imgt.org.

PML‐RARαRARαPML

Figure 22 : Structure de la protéine PML-RARα. La partie PML est constituée d’un domaine riche en proline, de trois doigts de zinc et d’un motif coiled-coil. La flèche rouge indique la jonction entre les deux protéines. D’après www.imgt.org.

53

Facteur de transcription chimérique dominant négatif

- AML1–ETO

La translocation t(8;21)(q22;q22), retrouvée dans 10 % des cas de LAM, génère un

gène de fusion AML1–ETO 132 (Figure 21). En condition physiologique, le facteur de

transcription hétérodimérique Core Binding Factor (CBF) est composé d’une sous unité α,

AML1, AML2 ou AML3 et d’une sous unité β, CBFβ. La liaison à l’ADN ainsi qu’à CBFβ

est assuré par l’intermédiaire du domaine Runt porté par AML. Lors de ce réarrangement, le

domaine de liaison à l’ADN d’AML1 est fusionné au répresseur transcriptionnel, ETO. La

protéine correspondante conserve la capacité de former le complexe CBF et de se lier à ces

gènes cibles, pouvant ainsi entraîner une répression transcriptionnelle 133. De plus, AML1–

ETO peut agir directement sur des protéines en s’y liant, comme à PU.1 par exemple, ce qui

entraîne dans ce cas le déplacement du co-activateur c-Jun et ce qui diminue ainsi son activité

transcriptionnelle. Elle peut aussi se lier à C/EBPα bloquant par ce biais son auto-régulation et

par conséquent limitant son taux d’expression 134-135. Ces mécanismes d’action d’AML1–ETO

concourent au développement des LAM. Néanmoins, l’expression d’AML1–ETO dans des

souris adultes n’est pas suffisante pour générer une leucémie aiguë 136.

- PML–RARα

La protéine de fusion PML–RARα (Figure 22) est exprimée dans 95 % des cas de

leucémies aiguës promyélocytaires associées à la translocation t(15;17)(q22;q12). PML, pour

promyelocytic leukemia, code une protéine localisée au niveau de corps nucléaires et ayant un

effet suppresseur de tumeur, par son implication dans les processus d’apoptose 137. Le gène

RARα (récepteur à l’acide rétinoïque) code un récepteur nucléaire dépendant de la présence

d’acide rétinoïque (ATRA). En absence d’ATRA, il est associé à des co-répresseurs

transcriptionnels alors qu’en sa présence, il s’associe avec des co-activateurs

transcriptionnels138.

La protéine chimère PML–RARα bloque la fonction de RARα comme celle de PML.

Effectivement, PML–RARα agit comme un dominant négatif sur RARα, en bloquant la

différenciation des cellules hématopoïétiques au stade de promyélocyte 139. L'expression de

PML–RARα conduit à la perte de la localisation de PML au niveau des corps nucléaires par la

formation d'hétérodimères PML–RARα–PML. La perte cette localisation spécifique de PML

au sein du noyau serait associée à une incapacité à bloquer la prolifération. Ainsi, la maladie

aurait deux facettes : l’inhibition de la différenciation (liée à un effet dominant négatif sur

RARα) et l’induction de la prolifération (liée à une perte du contrôle assuré par PML sur la

54

Figure 23 : Structure de la protéine PAX5–ELN. PBD : domaine Paired box; OCT :octapeptide ; NLS : signal de localisation nucléaire ; HD : homéodomaine. La flèche rouge indique la jonction entre les deux protéines. D’après Bousquet et al.140.

NUP98‐HOXA9 HDFG FG FG FG FG

HOXA9NUP98

NUP98‐HOXA9 HDFG FG FG FG FGNUP98‐HOXA9 HDNUP98‐HOXA9 HDHDHDFG FG FG FG FG

HOXA9NUP98

Figure 24 : Structure de la protéine NUP98–HOXA9. FG : FG domaine ; HD : homéodomaine. La flèche rouge indique la jonction entre les deux protéines.

55

croissance cellulaire). Le traitement par l'acide rétinoïque induit la différenciation des cellules

leucémiques et provoque la dégradation de PML-RARα 141. Cette dégradation est associée à la

reformation des corps nucléaires PML. En association avec la chimiothérapie, l’acide

rétinoïque permet de guérir environ 93 % des leucémies aiguës promyélocytaires 142.

- PAX5–ELN

Notre laboratoire a caractérisé, dans 2 cas de LAL-B adultes, la translocation

t(7;9)(q11;p13) 140. Cette translocation isolée, équilibrée et récurrente, fusionne l’exon 7 du

gène PAX5 à l’exon 2 du gène de l’élastine (ELN) conduisant à la juxtaposition du domaine

de liaison à l’ADN de PAX5 avec la quasi-totalité de ELN (Figure 23). Le gène ELN localisé

en 7q11.2 code une protéine insoluble de la matrice extracellulaire de 72kDa qui constitue le

composant principal des fibres élastiques. PAX5–ELN a un rôle de transdominant négatif sur

la fonction de PAX5 sauvage, et interfère en particulier dans la transcription de gènes

nécessaires à la différenciation et au contrôle de la prolifération des lymphocytes B précoces.

Facteur de transcription chimérique activateur transcriptionnel

- NUP98–HOXA9

La translocation t(7;11)(p15;p15) fusionne le gène NUP98 (codant une nucléoporine),

un composant du complexe du pore nucléaire qui permet le transport bi-directionnel des

protéines et de l'ARN entre le noyau et le cytoplasme au gène HOXA9 codant un facteur de

transcription à homéodomaine. Le domaine N-terminal de NUP98, impliqué dans les

interactions protéine-protéine au pore nucléaire, et le domaine C-terminal de HOXA9,

contenant l’homéodomaine impliqué dans la fixation à l’ADN, sont conservés dans la protéine

chimère (Figure 24).

In vitro, NUP98–HOXA9 transduit dans des CD34+ induit un blocage de la

différenciation myéloïde associé à une prolifération des cellules immatures 143. Dans la lignée

myéloïde K562, NUP98–HOXA9 agit comme un facteur de transcription aberrant en activant

la transcription des gènes cibles de HOXA9 144. De plus, la transplantation de moelle osseuse

transduite par NUP98–HOXA9 dans des souris induit une LAM 145.

57

(3) GATA1 et MYB dans les anomalies chromosomiques

Tout d’abord, le gène GATA1 n’a jamais été retrouvé impliqué dans une translocation.

Concernant le gène MYB, peu d’anomalies chromosomiques, caractérisées d’un point de vue

moléculaire, font état de son implication. La première description, au cours d’une étude

portant sur des cas de LAL-T, a permis de mettre en évidence l’existence de duplication du

gène MYB et de caractériser la translocation t(6;7)(q23;q34) associée à des LAL-T

pédiatriques 146.

Au niveau moléculaire, ce réarrangement juxtapose les séquences régulatrices du

TCRB au locus de MYB entrainant une dérégulation de son expression. Cette translocation

n’étant pas retrouvée associée à d’autres réarrangements récurrents des LAL-T, contrairement

à la duplication de MYB, suggère que c’est un événement princeps du développement de cette

pathologie. D’après une étude sur une plus grande cohorte de patients (107), 8,4% des sujets

sont porteurs d’une duplication acquise de MYB impliquée dans le blocage de différenciation

des lymphocytes T 147. En effet, l’utilisation d’un siRNA dirigé contre MYB entraîne une

levée de ce blocage.

Le gène MYB a été retrouvé récemment impliqué dans une translocation

chromosomique générant un gène de fusion. Avant la description de Persson et al., aucune

anomalie qualitative de MYB n’avait été rapportée. Ces travaux portent sur des cas de

carcinome adénoïde kystique dont 6 d’entre eux présentent la translocation t(6;9)(q22-23;p23-

24) 148. Lors de ce réarrangement chromosomique, 11 transcrits différents ont été identifiés

dont le majoritaire est issu de la fusion de l’exon 14 de MYB avec le dernier exon du gène du

facteur de transcription Nuclear Factor IB (NFIB). Dans tous les cas, une surexpression de

MYB–NFIB est retrouvée et est associée à la surexpression des gènes cibles de MYB testés.

Cet effet serait dû à la perte du 3’UTR de MYB contenant des sites de fixation de microARNs,

tels que mir-150 149 et mir-15a/16-1 150, suggérant une perte de régulation post-

transcriptionnelle négative de MYB.

2. Les anomalies de séquences

Les LAM sont fréquemment associées à des mutations de gènes qui sont soit isolées

ou associées à des translocations. Les gènes mutés peuvent être des proto-oncogènes ou des

gènes suppresseur de tumeurs. En effet, 40 à 50 % des patients atteints de LAM n’ont pas

d’anomalies caryotypiques visibles, le développement de ce type de leucémie peut être dû à

59

des mutations touchant des gènes codant des facteurs de transcription intervenant dans la

différenciation des cellules myéloïdes et/ou des gènes impliqués dans des processus plus

généraux tels que la prolifération ou la survie cellulaire. Dans ce dernier cas, il semblerait que

ces mutations soient le deuxième événement moléculaire nécessaire au développement de la

leucémie aiguë. La caractérisation de telles mutations est importante pour définir des groupes

de pronostic qui aideront à la prise en charge du patient.

a) Mutations des facteurs de transcription

Une étude portant sur 137 patients atteints de LAM a permis de mettre en évidence

pour la première fois l’existence de mutations dans le gène codant C/EBPα 151. Ces mutations

(5 délétions, 2 insertions et 4 mutations ponctuelles) retrouvées chez 10 de ces patients sont

hétérozygotes et associées à un caryotype normal pour 7 d’entre elles. Lors de cette étude, les

auteurs se sont intéressés aux patients porteurs de mutations dans la partie N-terminale de

C/EBPα. En effet, dans tous ces cas, une protéine tronquée de 30 KDa, au lieu de 42 KDa, est

produite par transcription alternative. Cette protéine tronquée conservant les domaines de

liaison à l’ADN et de dimérisation, est un dominant négatif sur la forme sauvage avec un

pouvoir transcriptionnel diminué. Enfin, l’expression de cette protéine tronquée dans la lignée

myéloïde U937 n’entraîne pas la différenciation en granulocytes matures contrairement à la

forme sauvage. C/EBPα muté peut être associé à une mutation de FLT3-ITD décrit ci après.

Un travail identique réalisé sur une cohorte de 126 patients, s’est intéressé à l’autre

gène clé dans les processus de différenciation myéloïde, PU.1 152. Dans cette cohorte, ils ont

mis en évidence la présence de 9 patients porteurs majoritairement de mutations ponctuelles

ou de délétions hétérozygotes. Ces mutations sont retrouvées préférentiellement dans des

patients atteints de LAM-MO ou M4/5 sans association avec des anomalies chromosomiques.

Les auteurs se sont principalement intéressés aux mutations entrainant des délétions dans le

domaine de liaison à l’ADN de PU.1 dont notamment celles affectant une région spécifique,

β3β4, impliquée dans les interactions avec des régulateurs tels que c-Jun et AML1 153-154. Ces

mutations diminuent la capacité de liaison de PU.1 à l’ADN ainsi que son potentiel

d’activation sur le promoteur du gène cible du récepteur au M-CSF en présence ou non de c-

Jun et AML1. Toutefois, PU.1 aussi impliqué dans la différenciation des lymphocytes B, n’a

pas été retrouvé muté dans une étude de 64 cas de LAL-B 155.

61

b) Mutations fréquentes dans les LAM

Le gène le plus fréquemment muté dans les cas de LAM avec un caryotype normal est

NPM1 (50 à 60 %) 156. Il code la nucléophosmine1, une protéine ubiquitaire nucléaire faisant

la navette entre le noyau et le cytoplasme. Elle est impliquée dans l’assemblage et le transport

des protéines ribosomales ainsi que dans le contrôle de la duplication du centrosome 157. La

forme mutée de NPM1 ou NPMc se retrouve délocalisée dans le cytoplasme ainsi que la

forme non mutée par hétérodimérisation 158. La forme NPMc est préférentiellement retrouvée

associée à la mutation FLT3-ITD décrit ci-après 156. L’expression de NPMc dans des souris

transgéniques est à l’origine du développement d’une myéloprolifération 159. Néanmoins, les

mécanismes d’action moléculaires expliquant le développement de LAM chez l’homme ne

sont pas connus.

Le gène FLT3, codant un récepteur à activité tyrosine kinase, est un des plus

fréquemment touchés par des mutations dans les cas de LAM (30 à 35 %). Elles

correspondent à une duplication en tandem du domaine juxta-membranaire (FLT3-internal

domain : FLT3-ITD) 160 ou une mutation ponctuelle dans la boucle d’activation située dans le

domaine tyrosine kinase (FLT3-tyrosine kinase domain : FLT3-TKD) 161. La plus fréquente et

la mieux étudiée, FLT3-ITD est associée à un mauvais pronostic 162. Elle entraîne une

activation constitutive du récepteur tyrosine kinase 163 qui active les voies de signalisation en

aval 164 (STAT5 et MAP kinase) et conduit à une prolifération accrue associée à une

protection contre l’apoptose 165.Un autre exemple de mutation activatrice est celle qui touche

les gènes de la famille RAS. Ces gènes codent des enzymes de la famille des GTPases qui

interviennent dans la transduction des signaux cellulaires permettant de moduler la

prolifération, la différenciation ainsi que la survie. Une mutation au niveau des ces enzymes

entraîne une perte de l’activité GTPase associée à une activation constitutive des voies de

signalisation en aval.

Le séquençage du génome entier d’un cas de LAM a permis de mettre en évidence la

présence d’une mutation au niveau du gène IDH1 (isocitrate deshydrogénase) 166. Ce dernier

comme IDH2 a été tout d’abord retrouvé muté dans les gliomes 167. IDH1 muté est

majoritairement associé à un caryotype normal. La mutation ponctuelle retrouvée sur ces

deux gènes entraine une modification de leur activité enzymatique résultant en une

augmentation du taux de 2- hydroxyglutarate 168. De plus, elle est associée à une

hyperméthylation de l’ADN et un blocage in vitro de la différenciation myéloïde 169.

62

A BA B

Figure 25 : Mutations dans le gène GATA1 et formation de GATA1 et GATA1s. A : La

position des mutations est représentée par des flèches. En haut, les insertions ou délétions et

en bas les mutations ponctuelles. B : Les deux sites de traductions de GATA1 et GATA1s

sont représentés sur l’ARNm. La structure des protéines correspondantes aux deux formes

traduites, GATA1 et GATA1s sont représentées. D’après Rainis et al. 170

63

Enfin, des mutations affectant le gène suppresseur de tumeur Wilm’s tumor 1 (WT1)

codant un facteur de transcription à doigt de zinc ont été détectées 171. Les formes mutées de

WT1 prédites correspondent à des formes tronquées de la forme sauvage ayant perdues

complètement ou en partie leur domaine à doigt de zinc.

c) Mutations de MYB et GATA1

Aucune mutation somatique dans le gène MYB n’a été rapportée dans la littérature. Le

gène GATA1, localisé sur le chromosome X, est muté dans la majorité des cas de leucémies

aiguës mégacaryoblastiques (LAMK) développées chez des patients atteints de trisomie 21

(syndrome de Down). Ces mutations de différents types se situent majoritairement dans

l’exon 2 du gène GATA1 créant un codon stop précoce 172 ou à la jonction exon2/intron2

créant des mutants d’épissage 170 (Figure 25A). Les conséquences sont la perte d’expression

de la protéine GATA1 sauvage et la traduction, à partir d’un site alternatif situé à la

méthionine 84 (exon 3) ou par épissage alternatif, d’une protéine GATA1 courte ou short

(GATA1s) ayant perdue son domaine d’activation N-terminal (Figure 25B). Cette forme

tronquée est aussi présente dans les cellules hématopoïétiques normales 173. GATA1s

conserve sa capacité à lier l’ADN et à fixer le co-facteur FOG1 mais son potentiel de

transactivation est réduit 172. Son implication dans le développement de la maladie est précoce

puisque cette forme est retrouvée dans les désordres myéloprolifératifs transitoires (DMT)

précédant la LAMK. De plus, son importance dans la leucémogénèse serait associée à la

trisomie 21 puisque l’expression de GATA1s seule, suite à une mutation dans l’exon 2, chez

des hommes en l’absence d’un chromosome 21 surnuméraire n’induit ni de DMT ni de

LAMK 174. Toutefois, ils sont anémiés et leurs mégacaryocytes ont une morphologie

anormale démontrant l’importance de l’expression de GATA1 pour assurer une érythropoïèse

et mégacaryopoïèse normale.

3. Les dérégulations épigénétiques

Les mécanismes de régulations épigénétiques permettent de contrôler l’expression des

gènes. Ce contrôle s’effectue à l’aide de modifications de l’ADN transmissibles et réversibles

sans changement de la séquence nucléotidique. Ces modifications sont principalement la

méthylation des cytosines, et les modifications post-traductionnelles des histones.

La méthylation des cytosines contenues dans les ilots CpG est catalysée par le groupe

des DNA méthyltransférases (DNMT). Ce groupe comporte DNMT1 qui maintient le profil

64

Figure 26 : Principe d’activation et de répression de l’expression génique par les histones acétyltransférases (HAT) et les histones désacétylases (HDAC).

Ilot CpGhypométhylé

GST

HyperméthylationHypométhylation

Séquences répétées

hyperméthylées

Instabilité génomique

RépressiontranscriptionnelleRégion répétée

Méthylé

Non méthylé

Figure 27 : Implication de la régulation épigénétique dans la leucémogénèse. GST : gène suppresseur de tumeur

65

de méthylation préexistant, ainsi que DNMT3A et DNMT3B qui ciblent les régions de l’ADN

non méthylées. La méthylation de l’ADN permet d’éteindre l’expression de gènes et de région

non codantes. La dérégulation de la méthylation de l’ADN peut donc jouer un rôle critique

dans la leucémogénèse. En effet, la diminution de l’expression par hyperméthylation de gènes

suppresseurs de tumeurs comme p15 (CDKN2B) 175, un inhibiteur de l’entrée dans le cycle

cellulaire, associée à l’hypométhylation de régions non codantes ou répétées créant de

l’instabilité génomique sont deux processus majeurs retrouvés dans le développement de

cancers 176 (Figure 26). L’analyse du profil de méthylation de l’ADN d’une cohorte de 344

patients atteints de LAM a permis de mettre en évidence une hyperméthylation de leur ADN

comparé à celui de cellules CD34+ de moelle osseuse saine. De plus, les auteurs ont souligné

l’association entre des profils de méthylation spécifiques et l’expression de protéines de

fusion telles que PML–RARα ou AML1–ETO 177. Effectivement, ces protéines oncogéniques

sont capables de recruter des DNMT afin de réprimer l’expression génique 178,179.

En parallèle, les changements post-traductionnels des histones modifient la structure

de la chromatine afin d’activer ou réprimer l’expression génique (Figure 27). Les enzymes

impliquées dans ce processus sont les histones acétyltransférases (HAT) et désacétylases

(HDAC) ainsi que les histones méthyltransférases (HMT) et déméthylases (HDM).

L’acétylation des histones conduit à l’activation de l’expression des gènes par relâchement de

la chromatine tandis que la méthylation des histones peut conduire soit à une activation soit à

une répression suivant les histones et les résidus méthylés. Dans certains cas, les acteurs de la

régulation positive de l’expression génique par modification des histones, comme le gène

MLL ou CBP, sont impliqués dans des translocations chromosomiques récurrentes. En effet,

MLL code une HMT spécifique de la lysine 4 de l’histone 3 180 et CBP code une HAT. Ainsi

les translocations chromosomiques les impliquant contribuent à la leucemogénèse par

l’expression anormale de HMT et HAT modifiant la chromatine et permettant l’expression de

gènes oncogéniques. L’importance des modifications épigénétiques observées chez les patients atteints de

leucémies aiguës, explique pourquoi la thérapeutique s’intéresse à l’utilisation d’inhibiteurs

de HDAC et de DNMT (5-azacytidine) qui sont les deux types d’enzymes clés de la

régulation de l’expression contrôlée par les modifications épigénétiques. Ces molécules sont

utilisées seules ou associées aux thérapies classiques afin de restaurer l’expression de gènes

suppresseur de tumeurs.

66

Figure 28 : Distribution des anomalies chromosomiques suivant l’âge des patients. La répartition des réarrangements du gène MLL (MLL), de la translocation AML1-ETO (t(8;21)), des caryotypes normaux (normal), des inversions du chromosome 16 impliquant le gène CBFβ (inv(16)) et des autres réarrangements chromosomiques (autres) est indiquée par groupe d’âge. D’après le Dr. Dastugue.

67

C. Les leucémies aiguës myéloblastiques pédiatriques

Les LAM pédiatriques sont rares par rapport à celle de l’adulte, leur incidence est 5

fois plus faible que celle des leucémies aiguës lymphoblastiques (15-20% des leucémies

aiguës de l'enfant)181. La proportion de patients porteurs d’anomalies chromosomiques (70-85

%) est plus importante que chez les adultes (40-47 %). Les mutations de mauvais pronostic

associées au caryotype normal sont principalement FLT3-ITD (20-25 %) et la duplication du

gène MLL, tandis que les mutations de bon pronostic touchant NPM1 sont observées dans 20

à 30 % des cas. Chez les enfants, les mêmes translocations récurrentes que chez l’adulte sont

détectées avec toutefois une distribution différente. La translocation t(8;21) est plus fréquente

que la t(15;17) et l’inv(16), tandis que les réarrangements MLL ont une plus grande fréquence,

surtout chez les enfants de moins de 2 ans où elles représentent plus de 50 % des cas de LAM

(Figure 28).

Les translocations chromosomiques à l’origine des leucémies pédiatriques

apparaissent principalement durant l’hématopoïèse fœtale. Elles peuvent initier une leucémie

mais parfois nécessitent des évènements secondaires tels que l’exposition durant la vie fœtale

à des agents cancérigènes. Les premières démonstrations de l’origine prénatale des

translocations a été faite par l’étude de jumeaux atteints de la même leucémie et porteurs du

même réarrangement chromosomique impliquant soit le gène MLL soit la translocation TEL-

AML1 dans les cellules leucémiques 182,183. L’origine prénatale des translocations peut être

vérifiée par PCR sur les cellules sanguines récoltées lors des tests de Guthrie à la naissance.

La première vérification a été faite sur deux cas d’enfants âgés de 5 mois et 2 ans atteints de

LAL associée à la protéine de fusion MLL–AF4 pour lesquels le gène de fusion dans les

cellules sanguines à la naissance a été amplifié 184. Par la suite, cette origine prénatale a été

vérifiée chez des patients porteurs de la translocation t(8;21)185.

68

Auteurs cas sexe Age Formule chromosomiqueAlvarez et al. 1 M 15 mois t(3;6)(p21;q23),+8Bernini et al. 1 F 9 mois normaleDastugue et al. 1 M 2,5 mois t(X;6)(p11;q23)

2 M 6 mois t(X;6)(p11;q23)Giagounidis et al. 1 M 67 normale

2 M 63 t(2,6)(q23?4;p22?3), del (12)(p11)Ghosh et al. 1 M 7 mois normaleKritharis et al. 1 F 82 t(6;12)(q13;p13.3),+der(12)t(6;12), +21Kurosawa et al. 1 M nouveau né normalePeterson et al. 1 F 9 NR

2 M 13 47,XY+21 (aq)3 M 82 NR4 M 28 NR5 M 51 del 76 M 35 47,XY, +8, t(9;22)7 F 26 complexe + t(9;22)8 F 31 complexe + t(9;22)

Scolyer et al. 1 M 47 complexeShin et al. 1 M 72 45,XY,–7Shvidel et al. 1 F 55 46 XX, polymorphisme chromosomique

2 F 23 normale3 F 31 45 XX, del 84 M 23 47, XY, +19, t(10;11)(p13;q21)5 F 17 46 XX, del(16)(q22)6 F 14 NR7 M 1 47 XY, t(16;17)(q22;q21)8 F 72 NR

Staal-viliare et al. 1 M 73 t(9;22)(q34;q11)Wick et al. 1 M 72 47,XY(2 cellules)

2 F 43 normale3 M 57 normale4 M 13 normale

Yokohama et al. 1 M 64 complexe Tableau 2 : Récapitulatif des anomalies chromosomiques associées aux cas de LAB de novo répertoriées dans la littérature. D’après Alvarez et al.186, Bernini et al.187, Dastugue et al.188, Giagounidis et al.189, Ghosh et al.190, Kritharis et al.191, Kurosawa et al. 192, Peterson et al.193, Scolyer et al.194, Shin et al.195, Shvidel et al.196, Staal-viliare et al.197, Wick et al.198.

69

D. Les leucémies aiguës à basophiles de novo

1. Généralités

La première description de LAB a été faite en 1906 par Joachim et al. Depuis 1999,

l’Organisation Mondiale de la Santé l’a reconnue comme une entité clinique. Cette

hémopathie rare (<1 % des cas de leucémies aiguës) est caractérisée par la présence d’un

contingent de blastes indifférenciés et de blastes basophiles appelés aussi basophiloblastes

dont les proportions respectives sont très variables d’un cas à l’autre 188 (0 à 70 % de

basophiloblastes dans la mœlle osseuse), en général inférieur à 20 %.

D’autre part, les LAB sont distinctes par leurs origines. Il faut distinguer les LAB de

novo, des leucémies myéloïdes accompagnées d’un contingent de basophiles constitué pour la

plupart de basophiles matures. Ces dernières incluent principalement les LAM avec une

augmentation du contingent de granulocytes basophiles associées aux t(6;9)(DEK–CAN),

t(8 ;21)(AML1–ETO) ou del(12p11-13). Des leucémies myéloïdes chroniques (LMC) en

phase d’acutisation peuvent également correspondre à ce sous-groupe. Les LAB peuvent

présenter un caryotype normal ou des réarrangements chromosomiques tels que la

translocation qui fait l’objet de cette thèse, la t(X;6)(p11;q23)188, ou une monosomie 7195

(Tableau 2).

Compte-tenu du faible nombre de cas rapportés et des divers traitements appliqués, il

est difficile de conclure quant au pronostic de cette maladie. Cependant, la tendance générale

se dégageant de la littérature est plutôt celle d’une leucémie aiguë d’assez mauvais pronostic.

Concernant l’incidence dans la population, il est difficile de tirer des conclusions étant donné

le nombre de patients. D’après les cas de LAB de novo répertoriés dans la littérature, la

médiane d’âge chez les adultes serait de 53 ans. Concernant les LAB pédiatriques, elles

semblent plus fréquentes chez les nourrissons âgés de moins de 1 an.

2. Diagnostic

La LAB est une hémopathie difficile à diagnostiquer et qui, de fait, pourrait être sous

évaluée 196. Le diagnostic repose, tout d’abord, sur l’observation des cellules leucémiques en

coloration MGG. Les basophiloblastes sont des cellules d’allure immature, de taille variable

avec un cytoplasme faiblement basophile et contenant de gros grains violets foncés (Figure

29A). Dans beaucoup de cas, ces cellules peuvent avoir une allure indifférenciée et orienter le

70

A

B

A

B

Figure 29 : Images de basophiloblastes. A : coloration au MGG ; B : coloration au bleu de toluidine (Staal-Viliaire et al.197).

Auteurs cas Marqueurs positifs Marqueurs negatifs

Alvarez et al. 1 CD13, CD34Bernini et al. 1 CD45, CD33Dastugue et al. 1 CD24, CD13, CD33

2 CD117 marqueurs lymphoïdes

Ghosh et al. 1 CD13, CD15, CD3, CD64, CD123, CD45

CD25, CD34, CD117, CD14, HLA-DR, marqueurs lymphoides

Giagounidis et al. 12 CD33, CD34, CD38, HLA-DR CD13, CD14, CD15, CD19, CD7

Kritharis et al. 1CD13, CD33, HLA-DR, CD117, CD15, CD34

Shin et al. 1 CD33, CD13, CD34 TdT, HLA-DR, CD10, CD19Shvidel et al. 1 HLA-DR, CD34, CD11 CD13, CD33, CD2, CD5, CD10,

2 HLA-DR, CD2, CD34 CD3, CD10, CD19, CD33, CD13

3 HLA-DR CD2, CD3, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD41

4 HLA-DR, CD33, CD34, CD7, CD4, CD8, CD13, CD19, CD10, 5 CD45 CD20, CD79a, CD3, CD43, CD68

6 HLA-DR, CD34, CD33, CD19 CD4, CD8, CD10, CD14

7 HLA-DR, CD34, CD33, CD41, CD61, CD7, CD8, CD56 CD13, CD19

8 HLA-DR, CD34 CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD41

Staal-viliare et al. 1 CD13, CD33, CD11c, CD7, CD203c

CD65, CD117, CD34, HLA-DR, tdT, marqueurs lymphoides

Tableau 3 : Récapitulatif du phénotype des cellules de patients décrits.

Figure 30 : Ultrastructure d’un

basophiloblaste. (Shvidel et al. 196)

71

diagnostic vers une LAM avec différenciation minimale ou sans maturation. Le diagnostic

complet repose sur la morphologie, la cytochimie, l’immunophénotype et l’observation de

l’ultrastructure des cellules leucémiques en microscopie électronique199. Les signes clinico-

biologiques peuvent aider au diagnostic. En effet, les patients peuvent présenter au diagnostic

des prurits, rash cutané ou hyperpigmentation de la peau liés à un syndrome

d’hyperhistaminémie due à la dégranulation massive des blastes basophiles.

D’un point de vue morphologique, les blastes contiennent d’amples granules mises en

évidence par la coloration métachromatique au bleu de toluidine (Figure 29B). Mais, dans de

nombreux cas, les granules basophiles des cellules leucémiques ne sont pas visibles en

microscopie optique. Les cellules sont négatives aux tests de la myéloperoxydase, spécifique

des cellules myéloïdes granulocytaires, et du naphtol AS acétate estérase, spécifique de la

lignée monocytaire. Cependant, la cytochimie ne contribue pas toujours au diagnostic, car

certains de ces résultats peuvent être équivoques, et des diagnostics de LAB ont été

répertoriés avec des résultats de coloration au bleu de toluidine négatifs et des tests

myéloperoxydase positifs.

Sur un plan immunophénotypique, les études ont montré que le phénotype des cellules

leucémiques n’est pas homogène (Tableau 3). En général, elles sont porteuses des marqueurs

myéloïdes tels que CD13 et CD33. Les marqueurs étant hétérogènes, il semblerait pertinent de

réaliser le marquage CD203c spécifique des basophiles.

Enfin, lorsque que les techniques précédentes ne permettent pas de poser le diagnostic

de LAB, l’utilisation de la microscopie électronique peut être une bonne approche. L’étude de

Shvidel et al.196 a montré que dans une cohorte de 184 patients atteints de LAM avec

différenciation minimale, la microscopie électronique avait permis de mettre en évidence 8

cas de LAB non suspectés au diagnostic.

Les basophiloblastes sont composés de nombreux organites intra-cytoplasmiques,

reflet d’une importante activité métabolique. Il est possible de discerner la nature des granules

contenus dans les blastes 200. Les basophiloblastes sont composés, entre autres, de granules

théta, communes aux basophiles et mastocytes, mais ne contiennent pas de granules en

rouleaux (Figure 30).

73

OBJECTIFS

75

Les travaux antérieurs sur les LAB de novo portent essentiellement sur la description

de cas cliniques et sur les méthodes de diagnostic de la maladie. Au début de cette étude, les

événements moléculaires aboutissant au développement de cette pathologie n’étaient pas

connus. Aucune altération génétique n’avait été identifiée comme impliquée dans les

translocations chromosomiques associées aux LAB. Or, la caractérisation moléculaire des

réarrangements chromosomiques permet d’améliorer la compréhension des fonctions des

gènes impliqués. En effet, en condition pathologique le rôle crucial d’un gène est souvent

souligné. Lorsqu’un gène est réarrangé ou muté, les dérèglements associés mettent en

évidence ses fonctions régulatrices sur des processus impliqués dans la leucémogénèse. De

surcroit, les travaux portant sur l’identification des gènes réarrangés dans les translocations

chromosomiques ont permis d’améliorer le diagnostic, de préciser le pronostic ainsi que

d’orienter le traitement. Dans ce cas, la caractérisation moléculaire de nouvelles translocations

pourrait servir à améliorer la prise en charge du patient. Par ailleurs, l’ontogénèse de

basophiles étant peu connue, et notamment le ou les gènes spécifiquement impliqués dans

l’engagement des cellules dans ce type cellulaire, l’identification des gènes réarrangés dans

cette pathologie pourrait contribuer à une meilleure compréhension des voies de

différenciation de la lignée basophile.

Ce projet de thèse avait pour objectif d’étudier quatre cas de LAB de novo porteurs

d’une même translocation t(X;6)(p11;q23). Deux cas, inclus dans notre étude, avaient été

décrits il y a quelques années par le Dr. Dastugue, sans étude moléculaire des réarrangements

chromosomiques. C’est l’ajout de deux nouveaux cas présentant la même translocation et le

même tableau clinique qui a relancé cette étude. En effet, notre projet permet de décrire pour

la première fois une translocation récurrente dans cette pathologie rare qu’est la LAB et ainsi

définir une nouvelle entité clinico-pathologique. Par ailleurs, la détermination des gènes

impliqués dans ce réarrangement pourrait mettre en évidence leur importance dans

l’ontogénie des basophiles. Enfin, à travers l’étude de ce réarrangement dans des LAB, nous

pourrions proposer un modèle des mécanismes oncogéniques impliqués dans cette pathologie.

77

RESULTATS

79

Identification of a transforming MYB-GATA1 fusion

gene in acute basophilic leukemia:

a new entity in male infants

Cathy Quelen, Eric Lippert, Stephanie Struski, Cécile Demur, Gwendoline

Soler, Nais Prade, Eric Delabesse, Cyril Broccardo, Nicole Dastugue,

François-Xavier Mahon et Pierre Brousset.

Blood. 2011;117(21):5719-5722

SUPPLEMENTAL DATA

Supplemental Materials and Methods

Case reports.

Patients P1 and P2: Both patients presented at diagnosis with similar clinical signs consistent

with a hyperhistaminemia syndrome and acute basophilic leukemia associated with a

chromosomal translocation t(X;6)(p11;q23). We reported both cases previously1.

Patient P3: A three-month-old boy was admitted to hospital with diarrhea, vomiting and fever.

Examination revealed diffuse erythema, hepatomegaly and splenomegaly. The cerebrospinal

fluid was normal. Analyses of the blood showed anemia (hemoglobin: 6g/100mL),

thrombocytopenia (42 000/mm3) and hyperleukocytosis (53 000/mm

3) due to the presence of

77% blast cells (indicative of acute leukemia). Bone marrow smear confirmed this diagnosis

of acute leukemia; the nucleated cells were large blasts with a high nucleocytoplasmic ratio,

intensely basophilic cytoplasm (sometimes containing vacuoles), and, often, large purple

granulations revealed by May-Grunwald-Giemsa (MGG) staining and metachromatic with

toluidine blue staining. The blasts were negative for the myeloperoxidase reaction but positive

for the markers of myeloid lineage, CD13, CD33 and CD117 (CD34-). The karyotype at

diagnosis, showed a rearrangement between chromosomes X, 6 and 12:

46,Y,der(X)t(X;12)(p21;q23)t(X;6)(q28;q23),der(6)t(X;6)(q28;q23),del(12)(q23)[18]/46,XY[

6]. Rapid treatment first with corticoids followed by a combination of aracytin and

anthracyclin according to the ELAM02 protocol (aracytine, mitoxantrone and methotrexate)

produced prompt regression of the symptoms and complete remission has been obtained. The

remission persists after 2 years of follow-up.

Patient P4: A 5-week-old boy was admitted to hospital with fever and vomiting. Physical

examination revealed generalized erythema and substantial hepatosplenomegaly. Blood

analysis revealed anemia (8.3g/100mL), thrombocytopenia (84 000/mm3) and

hyperleukocytosis (125 000/mm3) with 87% blast cells. The bone marrow smear showed 84%

blast cells with a high nucleocytoplasmic ratio, fine and nucleolated chromatin, and a small

ring of intensely basophilic cytoplasm. A quarter of the blasts displayed fine granulations.

None of these was positive for myeloperoxidase activity. The immunophenotype confirmed

the myeloid nature of the blasts (CD33+) with positive CD24. The karyotype showed 46,XY

t(X;6)(p11;q23). After aracytin–daunorubicin based chemotherapy, complete remission was

achieved and, after intrafamilial hematopoietic stem cell transplantation (from a brother), has

persisted during 12 years of follow-up.

Fresh and frozen samples from patients P1 and P2 have been obtained after informed consent

and stored at the HIMIP collection. According to the French law, HIMIP collection has been

registered by the Ministry of Higher Education and Research (DC 2008-307 collection 1) and

obtained a transfer agreement (AC 2008-129) after approval by the “Comité de Protection des

Personnes Sud-Ouest et Outremer II” (ethical committee). Clinical and biological annotations

of the samples have been approved by the CNIL (Comité National Informatique et Libertés

i.e. Data processing and Liberties National Committee). Samples from patient 3 and 4 have

been obtained from the tumor bank of the Centre Hospitalier Universitaire Bordeaux

(Declared to the Ministry of Higher Education and Research).

FISH. Cytogenetic analysis of diagnostic bone marrow samples was performed by standard

methods as previously described 2. As probes for the MYB and GATA1 genes, we selected the

BAC and fosmids clones (Supplemental Figure 1) by using the Human Genome Browser

Gateway (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway/). The probes were labeled by nick

translation with dUTP-SpectrumOrange or dUTP-SpectrumGreen (Abbott). We mapped the

breakpoints on chromosome X and 6 by using high-resolution multicolour banding (mBAND)

FISH according to the manufacturer’s instructions (Metasystems).

RACE. Total RNA was extracted according to the Trizol method (Invitrogen). One

microgram of total RNA from each patient (P2, P3 and P4) was reverse-transcribed into

cDNA by using an oligo dT-anchor primer (5’/3’ RACE Kit, 2nd

Generation; Roche). This

cDNA product was used as a template for PCR by using the BD Advantage 2 PCR Enzyme

System (BD Biosciences), the PCR anchor primer and a MYB-specific forward primer,

MYB1F (Supplemental Table 2). PCR was carried out in a GeneAmp PCR system 9600

(Perkin Elmer) with the following cycling parameters: 94°C initial denaturation for 1 min, 1

cycle of 94°C for 30 s, 64°C for 30 s, 68°C for 40 min, 35 cycles of 94°C for 30 s, 64°C for

30 s, 68°C for 5 min and a final extension of 68°C for 10 min. The PCR product was purified

by using the QIAquick Gel Purification Kit (Qiagen) and sequenced with the ABI Prism Dye

Terminator Kit (Perkin-Elmer, Applied Biosystems).

Screening of mutations. The mutational status of eight genes (FLT3, NPM1, WT1, CEBPa,

K-RAS, N-RAS, IDH1, IDH2) was analyzed by high-resolution melting (HRM) PCR. DNA

mutation screening of FLT3-TKD exon 20, IDH1 and IDH2 exon 4, N-RAS and K-RAS exons

2 and 3, WT1 exons 7 and 9 was performed by HRM with the use of LightCycler 480 (Roche

Applied Science) in High Melting Resolution Master Mix 1X (Roche Applied Science) with

10 ng of genomic DNA, 0.1 µmol/L of each primer (Supplemental Table 2), and 25 mmol/L

MgCl2. High-resolution melting–PCR cycling conditions were: initial denaturation at 95°C for

10 min, followed by 50 cycles at 95°C for 10 s, 63°C for 15 s, and

72°C for 25 s. The melting

curve was measured from 72°C to 95°C with 25 acquisitions per degree centigrade. FLT3

exon 13, ITD and NPM1c mutation screening was performed by multiplex PCR using Gold

Taq DNA polymerase (Applied Biosystems). PCR products were analyzed on a sequencer by

using sizing fragment analysis. CEBPA screening was performed according to Pabst et al.3.

Cloning of MYB-GATA1. Full-length MYB-GATA1 cDNA was amplified with Advantage 2

Polymerase Mix (Clontech) by using MYB-8F and GATA1-2R primers (Supplemental Table

2) and cloned in the pCR®

2.1 vector (TA cloning kit, Dual Promoter, Invitrogen). After

cleavage of the PCR product with EcoRI or BstXI, MYB-GATA1 was cloned into the

pMSCVIresEGFP (pMIE) retroviral vector (pMIE-MG) and pcDNA3 (pcDNA3-MG)

respectively.

Preparation of lin- cells. Bone marrow cells were harvested from C57BL/6 mice aged 6–12

weeks by flushing their femurs, tibias and hips with IMDM (Invitrogen), 2% Fetal Bovine

Serum (FBS) (PAN Biotech). After lysis of red blood cells with ammonium chloride–

potassium (ACK) buffer and filtration through a 0.70 µm filter, the cells were washed and

counted. Lin- cells were obtained after two rounds of separation using the Lineage Cell

Depletion Kit (Miltenyi Biotec) to remove mature hematopoietic cells and their committed

precursor, according to the manufacturer’s instructions. Cells obtained were seeded 24 h

before transduction in untreated plates at a density of 5 x 105 cells/mL in Stemspan (StemCell

technologies), 10% FBS supplemented with 10 ng/mL of IL3, 20ng/mL of IL6 and 40 ng/mL

of SCF (Peprotech).

Retrovirus production and transduction. Cells of the packaging cell line Phoenix-Eco were

seeded at a density of 1.6 x 106

cells/6 cm plate the day before transfection. The cells were

transiently transfected with 6 µg of retroviral expression vector by using Lipofectamine 2000

Transfection Reagent (Invitrogen). The next day, cells were treated for 6 h with 10 mM

sodium butyrate and then incubated for 24 h at 32°C in IMDM containing 10% FBS. The

virus-containing supernatant was collected and filtered through a 0.45µm filter and incubated

for 15 min with 8 µg/mL of polybrene (Sigma Aldrich). Lin- cells were re-suspended in this

supernatant supplemented with 10 ng/mL of IL3, 20ng/mL of IL6 and 40 ng/mL of SCF at a

final density of 106 cells/mL. The cells were plated and centrifuged for 2 h at 3000 rpm and

32°C and the medium was replaced by Stemspan, 10% FBS supplemented with 10 ng/mL of

IL3, 20ng/mL of IL6 and 40 ng/mL of SCF. The next day, the cells were transduced a second

time.

Colony-forming cell assays. Lin- cells were transduced with: pMIE or pMIE-MG. The

transduced cells were then seeded at a density of 1.5 x 104 cells in 3mL of methylcellulose

(M3434; StemCell Technologies) and 1mL of this mixture was plated in 35 mm dishes (n=3).

Twelve days later, the colonies were counted. For in vitro transforming assays described

previously 4, cells were plated at the same density as previously reported. Colonies were

scored and cells were harvested and re-plated at the same density every 7 days. Cell samples

were also harvested for further analyses (FACS analysis and MGG staining).

Cloning of the genomic breakpoints. DNA from two patients (P2 and P3) was used as a

template for PCR by using PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix (Agilent Technologies),

MYB-1130F primer (located at the end of exon 8) and GATA1-810R primer (located at the

beginning of exon 5) (Supplemental Table 2). PCR was carried out in a GeneAmp PCR

system 9600 (Perkin Elmer) with the following cycling parameters: 95°C initial denaturation

for 2 min, 30 cycles of 95°C for 20 s, 56°C for 20 s, 72°C for 45 s and a final extension of 5

min at 72°C . The PCR product was purified by using the QIAquick PCR Purification Kit

(Qiagen) and sequenced with the ABI Prism Dye Terminator Kit (Perkin-Elmer, Applied

Biosystems).

Western blotting. Cells of patient P2, or HeLa cells transfected with pcDNA3 or pcDNA3-

MG by using Lipofectamine 2000, were lysed with RIPA buffer and sonicated. Total proteins

were separated by 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-

PAGE) and then electrotransferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were

blocked with a solution of 10% milk in PBST (0.1% Tween 20 in PBS) and probed with anti-

GATA1 antibody (sc-1234, Santa Cruz) or anti -actin antibody (Sigma Aldrich) and

secondary antibodies diluted in PBST 1 %. The immunoreactive bands were visualized using

the enhanced chemiluminescence (ECL) system (Perkin Elmer).

Immunolocalization. Twenty-four hours post-transfection with pcDNA3-MG, HeLa cells

were fixed with 3% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature. Cells were

permeabilized for 10 minutes with 0.2% Triton X-100 in phosphate-buffer saline

(PBS)

containing 10 mM HEPES, 3% bovine serum albumin (BSA).

Nonspecific sites were

saturated with 3% BSA and 3% FBS in the same buffer for 1 hour. The cells were incubated

for 1 hour at room temperature with anti-GATA1 antibody (sc-1234, Santa Cruz). After three

washings with PBS containing 10 mM HEPES and 3% BSA, cells were incubated with Alexa

Fluor 546 labeled anti-goat antibody (Invitrogen) for 1 hour at a dilution of 1:300 in the same

buffer. Samples were mounted

in ProLong® Gold antifade reagent containing DAPI

(Invitrogen).

Quantitative RT-PCR. cDNAs were synthesized using M-MLV reverse transcriptase

(Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Quantitative PCR was performed on

an ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) using qPCR MasterMix Plus for SYBR green

(Eurogentec). Primers were designed based on the 5’ part of MYB (exons 3–5) to detect MYB

and MYB-GATA1; on the 3’ part of MYB (exons 13–15) to detect MYB; on the 5’ part of

GATA1 (exons 2–3) to detect GATA1 and on the 3’ part of GATA1 (exons 5–6) to detect

GATA1 and MYB-GATA1. The presented data correspond to the mean of 2- Ct

in three

independent reactions for the three patients (P2, P3 and P4), normalized to the human actin

gene and calibrated with two normal bone marrows.

1. Dastugue N, Duchayne E, Kuhlein E, et al. Acute basophilic leukaemia and

translocation t(X;6)(p11;q23). Br J Haematol. 1997;98(1):170-176.

2. Coyaud E, Struski S, Prade N, et al. Wide diversity of PAX5 alterations in B-ALL: a

Groupe Francophone de Cytogenetique Hematologique study. Blood;115(15):3089-3097.

3. Pabst T, Mueller BU, Zhang P, et al. Dominant-negative mutations of CEBPA,

encoding CCAAT/enhancer binding protein-alpha (C/EBPalpha), in acute myeloid leukemia.

Nat Genet. 2001;27(3):263-270.

4. Lavau C, Szilvassy SJ, Slany R, Cleary ML. Immortalization and leukemic

transformation of a myelomonocytic precursor by retrovirally transduced HRX-ENL. Embo J.

1997;16(14):4226-4237.

Table S1 Characteristics of ABL patients with t(X;6)(p11;q23) translocation

Patient Sex Age

(wks)

%

blastKaryotype at diagnosis /

Karyotype revised after FISH analysis (BACs, Fosmids and mBAND)

Mutation

P1 M 10 80 46,Y,t(X;6)(p11;q23)[40]/46,XY[1] ND

der(X)(6qter 6q24::6q23::Xp11 Xq13::6q22q23::Xp11 Xp22::Xq24::Xp22 Xpter),

der(6)(6pter 6q22::Xq28 Xq25::Xq23 Xq13::Xqter)

P2 M 24 89 46,Y,t(X;6)(p11;q23)[29]/46,XY[1] K-RAS

(G12S)

no material available

P3 M 12 77 46,Y,der(X)t(X;12)(p21;q23)t(X;6)(q28;q23), der(6)t(X;6)(q28;q23),

del(12)(q23)[18]/46,XY[6]

No mutation

der(X)(12qter 12q23::6q22 6q23::Xp11 Xq28::Xp11 Xpter),

del(6)(q21q23),del(12)(q23)

P4 M 5 87 46,Y,t(X;6)(p11;q23)[16]/46,XY[13] ND

der(X)(6qter 6q24::6q23::Xp11 Xq23::Xq25 Xqter),

der(6)(6pter 6q23::Xp11 Xp21::Xq24::Xp21 Xpter) Biological characteristics of the patients. Revised karyotypes were established according to

the FISH results. ND, not determined. The presence of a fusion gene involving MYB was

investigated by RACE on three patients for whom nucleic acids were available (P2, P3 and

P4). For P1, the chimeric gene was determined by FISH.

Table S2 List of the primers used for screening mutations, cloning of MYB-GATA1, cloning of genomic breakpoint and quantitative PCR.

Name Sequence (5’ 3’)

FLT3_X20_F2 TCACAGAGACCTGGCCGC

FLT3_X20_R1 TGCCCCTGACAACATAGTTGG

IDH1_X4_F1 GGCTTGTGAGTGGATGGGTAA

IDH1_X4_R2 GCATTTCTCAATTTCATACCTTGCTTA

IDH2_X4_F1 GAAAGATGGCGGCTGCAGT

IDH2_X4_R3 TGTTTTTGCAGATGATGGGC

NRAS_X2_F2 CTGATTACTGGTTTCCAACAGGTTCT

NRAS_X2_R2 TGGGTAAAGATGATCCGACAAGT

NRAS_X3_F1 TTGTTGGACATACTGGATACAGCTG

NRAS_X3_R1 CATTTCCCCATAAAGATTCAGAACAC

KRAS_X2_F4 GGCCTGCTGAAAATGACTGAA

KRAS_X2_R4 AATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC

KRAS_X3_F2 TCCCTTCTCAGGATTCCTACAGG

KRAS_X3_R2 ACAGGGATATTACCTACCTCATAAACATT

WT1_X7_F2 CCCTCAAGACCTACGTGAATGTT

WT1_X7_R2 GGAGCTCTTGAACCATGTTTGC

WT1_X9_F1 TAGGGCCGAGGCTAGACCTT

WT1_X9_R1

TCTCATCACAATTTCATTCCACAATA

HsNPM1_X12_F1 5’-GAAGTGTTGTGGTTCCTTAAC

HsNPM1_X12_R1FAM 5’(FAM) TGGACAACACATTCTTGGCA

FLT3_NEM_E TGGTGTTTGTCTCCTCTTCATTGT

FLT3_NEM_Qned 5’(NED) GTTGCGTTCATCACTTTTCCAA

PCR anchor primer GACCACGCGTATCGATGTCGAC

MYB-1F TAGCATGTACGAGGATGATGAGG

MYB-8F GCCATGGCCCGAAGACCCC

GATA1-2R TGTCCAGAATTCTGGCTACAAG

MYB 5’-ex 3F TATCTCCCGAATCGAACAGATG

MYB 5’-ex 5R CAAGCTCTATCACTCTCTGATC

MYB 3’-ex 13F GTGGCAGATGCACCGAATATTC

MYB 3’-ex 15R GTACTGCTACAAGGCTGCAAG

GATA1 5’- ex 2F CCAGTCTTTCAGGTGTACCCA

GATA1 5’- ex 3R TTCCATCCAGATCTTCCACGG

GATA1 3’- ex 5F AGCTACACCAGGTGAACCGG

GATA1 3’- ex 6R ACCACCATAAAGCCACCAGCT

Actin-F TCCCTGGAGAAGAGCTACGA

Actin-R AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG

MYB-1130F GGACAGCAGGTGCTACCAG

GATA1-810R GAGTACCTGCCCGTTTACTG

100 Kb

RP11-104D9

RP11-905P20

G248P84467F3

G248P8806E9

50 Kb

RP11-416B14

G248P85531H11

G248P87328H10

Figure S1: Fosmids and BACs used to refine the karyotype of the patients.

Figure S2: Cloning of the breakpoint at the genomic level. We confirmed the rearrangement

of the two genes for patient P2 and P3 for whom DNA was available. These breakpoints

were distinct for P2 and P3. The shade box corresponds to an overlapping sequence

between MYB and GATA1 respective introns.

135,515,673 48,651,018

Patient 2

135,516,674 48,651,387

Patient 3

MYB exon 8 GATA1 exon 5

Breakpoint site

at genomic level

MYB intron 8-9 GATA1 intron 4-5 MYB intron 8-9 GATA1 intron 4-5Position on

chromosome : 135,515,673 48,651,018

Patient 2

135,516,674 48,651,387

Patient 3

MYB exon 8 GATA1 exon 5

Breakpoint site

at genomic level

MYB intron 8-9 GATA1 intron 4-5 MYB intron 8-9 GATA1 intron 4-5Position on

chromosome :

Figure S3: Expression and location of MYB-GATA1. (A) Western blotting with anti-GATA1

antibody confirmed the expression of MYB-GATA1 (53 kDa) in patient 2 (P2) compared with

HeLa cells transfected with pcDNA3 empty vector as negative control and pcDNA3 MYB-

GATA1 as positive control. (B) HeLa cells transfected with pcDNA3 MYB-GATA1 were

immunostained with anti-GATA1 antibody to show the nuclear localization of the protein. (C)

DAPI staining. Magnification x 630.

A

- +P 2

MYB-GATA1

-ACTIN

B C

Ader(X)

Xp11.23 GATA1

6q23.3 MYB

der(6)

Chr X

Chr(6)

6q23

6q23.3 Xp11.23

Xq13

Xp11.3

Xp22.1

Xq24

Xp22.1

Xpter

6q24

6qter

6pter

Xq28

Xq25

Xq23

Xq13

6q22.1

Xqter

6q22

PATIENT 1

B

MYB

GATA1

6

No signal

on der(6)

der(X)

20kb

RP11-104D9

RP11-416B14

LOSS

MYB-GATA1

MYB

G248P84467F3

G248P8806E9

6

der(X)

No signal

on der(6)

G248P87328H10

G248P85531H11

GATA1

der(X)

LOSS

C

20kb

Dder(X)

Xp11.23 GATA1

6q23.3 MYB

der(6)

Chr X

Chr(6)

Xq28

6q23.3 Xp11.23

Xp11.23

Xpter

6q22

Chr 12

6q216q23.3

6pter

6qter

PATIENT 3

E

MYB

GATA1

6

20kb

RP11-104D9

RP11-416B14

MYB-GATA1

Der (6)

der(X)

MYB

G248P84467F3

G248P8806E9

der(6)

G248P87328H10

G248P85531H11

GATA1

der(X)

F

20kb

der(X)

6

Gder(X)

Xp11.23 GATA1

6q23.3 MYB

der(6)

Chr X

Chr(6) 6pter

6q23.2

Xp21.3

Xp11.23

Xq24Xp21.3

Xpter

Xp11.23

Xq23Xq25

Xqter

6q23.36q24

6qter

PATIENT 4

H

MYB

GATA1

6

20kb

RP11-104D9

RP11-416B14

MYB-GATA1

Der (6)

der(X)

MYB

G248P84467F3

G248P8806E9

G248P87328H10

G248P85531H11

GATA1

der(X)

I

20kb

der(X)

6

No signal

on der(6)

der(6)

Figure S4: FISH results in 3 patients (P1, P3 and P4): (A, D, G) Interpretation of mBAND

results. On the left, colored bars show the location of region specific paints on normal

chromosomes X and 6; breakpoints are represented by lines. On the right, the resulting

derivative chromosomes, der(X) and der(6), are schematized. (B, E, H) Results of BAC

hybridization on metaphasic chromosomes. The der(X) showed colocalization of the probes

for GATA1 (green) and MYB (red). No signal was present on the der(6) suggesting a loss of

5’ GATA1 for Patient 1. (C, F, I) Hybridization of fosmids providing further details on the

mechanism of translocation.

Figure S5: Phenotype of lin- cells transduced with MYB-GATA1. (A-B) Toluidine blue

staining of mouse mast cells as a positive control on the left and lin- cells transduced with

MYB-GATA1 on the right. (C) FACS analysis of cells transduced with MYB-GATA1, collected

from methylcellulose at each plating and stained with anti-Fc RIa (PE) and anti-c-Kit (PE-

Cy7). Cells remained Fc RIa -/ c-Kit -. FACS analysis of lin- cells transduced with empty

vector at plating 1 is presented as a positive control (D-E). Myeloperoxidase staining of HL60

cells as a positive control on the left and of lin- cells transduced with MYB-GATA1 on the

right. Magnification x 630.

C

A B

D E

ex 3-5 ex 13-15 ex 2-3 ex 5-6

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Relative m

RNA expression

Figure S6: Expression of MYB-GATA1. Expression levels of MYB, GATA1 and MYB-GATA1

in patient cells (P2, P3 and P4) compared to expression in healthy bone marrow (n=2)

arbitrarily set as 1 for each condition. The data are normalized against actin expression.

MYB GATA1

91

DISCUSSION ET CONCLUSION

93

Ce travail a permis de cloner et d’étudier les effets de la nouvelle protéine de fusion

MYB-GATA1 associée à la LAB. Néanmoins, nous n’avons pas pu associer cette nouvelle

translocation à une atteinte préférentielle des granulocytes basophiles in vitro. Certaines

questions soulevées par ce travail nécessitent quelques développements :

• L’expression de la protéine de fusion MYB-GATA1 est-elle restreinte aux cas de

LAB ?

L’origine de cette question se trouve dans la littérature où trois cas de translocation

t(X;6)(p11;q23) ont été rapportés. Un cas, décrit par Chessels et al., correspond à un

nourrisson de sexe masculin âgé de 4 mois et atteint d’une LAM sans maturation 201. Deux

des quatre cas inclus dans notre étude (Patient 1 et 2) ont été décrits par le Dr Nicole

Dastugue 177. Une autre étude rapporte le cas de jumelles âgées de 4 mois, atteintes de LAM

avec maturation (25ième Réunion de l'Association Cytogénétique du Québec, 25 avril 2008 et

The Great Lakes Chromosome Conference, 2008). Leur caryotype montre une insertion de la

bande 6q21 à 6q23 dans la bande Xp11.23 soit ins(X;6)(p11.2;q21q23). Les auteurs ont

rapporté une division du signal de la sonde marquant MYB démontrant son implication dans

ce réarrangement chromosomique. Sachant que l’insertion de MYB se fait dans la bande

Xp11.23 contenant le gène GATA1, il est raisonnable d’envisager que cette insertion conduit à

la formation du gène de fusion MYB-GATA1. Récemment, Belloni et al.202 ont caractérisé le

même gène de fusion MYB-GATA1, chez un nourrisson de sexe masculin (6 mois) porteur de

la translocation t(X;6)(p11;q23) et atteint de leucémie aiguë monocytaire (LAM5).

Ces patients sont tous porteurs d’un réarrangement chromosomique impliquant les

mêmes loci et expriment probablement le même gène de fusion, mais le diagnostic de LAB

n’a été documenté que dans nos deux cas. Compte tenu de la difficulté d’établir le diagnostic

morphologique de LAB, il n’est pas exclu que les autres patients aient présenté une LAB. En

effet, plusieurs éléments sont compatibles avec le diagnostic de LAB dans le cas étudié par

Belloni et al. Ce dernier, diagnostiqué comme une LAM5, présentait un pourcentage élevé de

basophiles dans le sang périphérique (38%). Cette donnée biologique est exceptionnellement

observée dans les LAM autres que les LAB et est donc compatible avec une leucémie

impliquant la lignée basophile. Concernant les autres cas de la littérature, les données

biologiques sont peu détaillées. En effet, le cas rapporté par Chesssels et al. fait partie d’une

série de 180 leucémies aiguës du nourrisson pour lequel les seules données disponibles sont

l’âge, le sexe, le nombre de globules blancs, le caryotype et la classification en LAM sans

94

maturation (LAM1). Les deux derniers cas porteurs d’une insertion ins(X;6), pour lequel le

réarrangement de MYB a été confirmé, ont été classés en LAM avec maturation (LAM2).

Les diagnostics de LAM5, LAM1 ou LAM2, établis avec les seuls critères de la

microscopie optique standard, ont pu être des LAB mal diagnostiquées. En effet, le diagnostic

de LAB est difficile à établir avec les outils classiquement utilisés que sont la coloration des

myélogrammes et frottis sanguin au MGG et le test cytochimique de la myéloperoxydase. La

population de basophiloblastes (blastes avec grosses granulations basophiles) peut être très

minoritaire dans des LAB de novo, et coexister avec des basophiloblastes sans granulations.

Cette dernière population ne peut pas être rattachée à la lignée basophile sur la base de

critères morphologiques car les cellules ont l’aspect des blastes sans grains communément

observés dans les LAM. De plus, même en présence de blastes à grains, seule la coloration

cytochimique au bleu de toluidine permet de révéler la nature métachromatique des

granulations caractéristiques des basophiles. Or cette coloration n’est pas un test réalisé

systématiquement lors des diagnostics de LAM. Pour ces raisons, des LAB peuvent être

classées, à tort, dans d’autres sous-groupes de LAM. Cette hypothèse est d’autant plus

crédible que les cellules leucémiques présentent un immunophénotype de type myéloïde

(CD13, CD33, CD117 etc…) qui n’est pas spécifique des LAB car les marquages spécifiques

de la lignée basophile ne sont pas réalisés en routine.

Au niveau clinique, le diagnostic de LAB peut être établi à partir d’un tableau clinique

d’hyperhistaminémie, comparable aux réactions allergiques, dont l’intensité varie en fonction

de la charge histaminique. Les quatre cas de notre série ont tous présenté ce syndrome

d’hyperhistaminémie qui regroupent des signes cutanés avec rash, prurit, érythrodermie

(contrastant avec la pâleur des zones non atteintes liée à l’anémie), des troubles gastro-

intestinaux (vomissement, ballonnement abdominal et diarrhée), des signes cardiaques

(tachycardie..), des signes pulmonaires avec toux liée à l’œdème pouvant aller jusqu’au choc

anaphylactique. Or ce tableau, exceptionnellement observé au diagnostic d’une LAM, doit

orienter vers le diagnostic de LAB. Le cas rapporté par Belloni et al. présente plusieurs de ces

symptômes, notamment la fièvre, la toux, la tachycardie, les vomissements et la distension de

l’abdomen. Aucune précision clinique n’est disponible pour les autres cas de la littérature.

Pour conclure, il existe une conjonction d’éléments cliniques et biologiques qui

permettent de penser que le patient porteur de le translocation t(X;6)(p11;q23) rapporté par

Belloni et al. présentait une LAB. Il est donc permis de conclure que la protéine MYB-

GATA1 est à l’heure actuelle vraisemblablement associée au développement de leucémies

aiguës à basophiles chez des nourrissons (de 2,5 à 6 mois).

95

• La perte de l’expression de GATA1 est-elle indispensable au développement de la

leucémie associée à la translocation t(X ;6) ?

En effet, les patients étudiés sont tous de sexe masculin, ce qui implique que le

réarrangement de GATA1, situé sur le chromosome X, entraîne la perte d’expression de sa

forme sauvage. Pour répondre à cette question, nous pouvons nous baser sur les résultats

obtenus par Belloni et al. Lors de cette étude, des cellulles Lin– isolées à partir de souris

sauvage ou p53-/- et transduites avec MYB-GATA1 ont été injectées à des souris irradiées à une

dose létale afin d’évaluer leurs caractéristiques de reconstitution hématopoïétique. Etant

donné qu’aucune souris ne développait d’hémopathies, ils ont effectué la même expérience à

partir de souris Gata1-low 50(≤ 10 % de l’expression sauvage). Les souris reconstituées ont

toutes été atteintes de syndromes myélodysplasiques. L’une d’entre elles, après une longue

latence (13-15 mois), a développé une leucémie aiguë laissant envisager l’apparition d’une

mutation ponctuelle jouant le rôle de second « hit » ou soulignant le faible pouvoir

oncogénique de MYB-GATA1 in vivo. Toutefois, il apparait important de noter que les

phénotypes oncogéniques rapportés dans les travaux de Belloni sont obtenus à partir de

cellules Lin– exprimant faiblement Gata1. Cette observation est importante car des modèles

murins ont permis de distinguer l’effet de la diminution du niveau d’expression de Gata1 par

rapport à son invalidation. Des souris transgéniques ont été crées afin d’obtenir une

expression correspondant à 5% de l’expression normale par KD (Gata1G105). Le KO de Gata1

(Gata1null) ainsi que le KD dans des souris mâles engendre une létalité due à un défaut de

l’érythropoïèse primitive 36. Chez des souris femelles, l’inactivation du chromosome X permet

d’obtenir une population cellulaire exprimant soit l’allèle sauvage soit l’allèle Gata105. Chez

ces souris, on observe une forte incidence de leucémies touchant la lignée érythroïde ou la

lignée lymphocytaire B. De plus ces leucémies sont transplantables dans des souris nude 203.

Par opposition, dans les souris femelles gata1null/+, les progéniteurs érythroïdes mourant par

apoptose, aucune leucémie ne se développe. Dans l’étude de Belloni, les auteurs ont eu pour

objectif de faire émerger un phénotype leucémique associé à MYB-GATA1. Pour y parvenir,

ils ont adopté une stratégie favorisant le développement de leucémies et ne reproduisant pas

une des conséquences moléculaires de la translocation t(X ;6) chez des patients de sexe

masculin, c’est à dire, la perte totale d’expression de GATA1 sauvage. C’est pourquoi, leurs

travaux ne permettent pas de conclure sur le rôle joué par la perte de GATA1 dans le

développement de LAB.

96

Néanmoins, en mettant en parallèle ces résultats et le développement de LAM chez les

patients exprimant MYB-GATA1, on peut supposer que la perte d’expression de GATA1 joue

un rôle dans le développement de la maladie. En effet, les souris ne souffrent pas

d’hémopathies lorsque Gata1 est normalement exprimé. Toutefois, lors de mon étude, les

cellules Lin– transduites par MYB-GATA1 provenaient de souris normales et, malgré cela,

des effets sur la différenciation comparables à ceux retrouvés dans les LAM, ont été observés.

Comme MYB-GATA1, AML1-ETO est une protéine de fusion capable in vitro de bloquer la

différenciation granulocytaire 204 et de prolonger l’auto-renouvellement de progéniteurs 205.

Cependant, AML1-ETO seule est incapable de reproduire une LAM in vivo sans l’induction

complémentaire de mutations par un agent mutagène 206. Il est possible d’expliquer cette

différence entre les expériences in vivo et in vitro par les conditions expérimentales. En effet,

lors des tests in vitro de CFC assay, les cellules transduites par MYB-GATA1 sont dans des

conditions de culture artificielles, c’est à dire, avec un cocktail simple de cytokines choisies,

induisant une différenciation myéloïde tandis que, in vivo, les cellules sont soumises à un

environnement plus complexe.

Dans le contexte pathologique qui nous concerne, nous pouvons envisager que la perte

d’expression de GATA1 pourrait provoquer la levée de deux freins. Nous pouvons d’abord

envisager la levée de l’inhibition de la transcription de gènes cibles tels que MYB et donc de

MYB-GATA1 207. En effet, les niveaux d’expression des transcrits MYB, MYB-GATA1 et

GATA1 chez les patients comparés à ceux de moelle osseuse saine ont été évalués. Cette

analyse a montrée que MYB sauvage est sur-exprimé chez les patients étudiés (~2 fois) et que

MYB-GATA1 est fortement exprimé par rapport à MYB et GATA1. Cette sur-expression de

MYB participe positivement au processus de leucémogénèse. En effet, son inactivation dans

des lignées cellulaires de LAM entraîne une diminution de la prolifération cellulaire 208.

D’autre part, la perte de GATA1 pourrait provoquer la levée d’un frein au niveau de la

différenciation en déverrouillant l’engagement des cellules dans d’autres voies et notamment

celle la lignée granulocytaire.

97

• La translocation t(X ;6) est-elle restreinte aux patients de sexe masculin ?

Les patients porteurs de la translocation t(X;6) décrits dans la littérature sont tous de

sexe masculin. Néanmoins, si l’hypothèse de la formation du gène MYB-GATA1 lors de

l’insertion ins(X;6)(p11.2;q21q23) chez les jumelles décrites précédemment s’avérait vraie,

alors ce réarrangement ne serait pas exclusivement associé au sexe masculin. Toutefois, la

fréquence de survenue de ce réarrangement serait inférieure chez les patients de sexe féminin.

Pourquoi cette différence de fréquence dans les deux sexes ?

Chez le garçon, le chromosome X étant en simple copie, l’ensemble des gènes portés

par l’X sont exprimés. Un réarrangement MYB-GATA1 ne peut donc se produire qu’avec un

chromosome X activé (et des gènes potentiellement fonctionnels). Si un gène hybride MYB-

GATA1 est généré par translocation ou insertion, il sera fonctionnel et pourra être à l’origine

du développement d’une leucémie.

Chez la fille, deux copies du chromosome X sont présents et une des deux est

inactivée au hasard dans les différentes cellules par le phénomène dit de lyonisation. Si un

réarrangement MYB-GATA1 se produit avec le gène GATA1 d’un chromosome X inactivé, la

fusion ne sera pas fonctionnelle et la cellule porteuse du remaniement disparaitra sans

développer un clone leucémique. Au contraire, si la fusion se fait avec un gène GATA1 porté

par un chromosome X actif, la protéine MYB-GATA1 pourra être exprimée et donner lieu au

développement d’un clone leucémique, comme chez les garçons. De ce fait, le réarrangement

ne pourrait initier une leucémie qu’une fois sur deux chez les patients de sexe féminin.

Le mécanisme d’inactivation de l’X observé chez les filles pourrait donc expliquer la

plus faible probabilité de survenue des LAB chez les patients de sexe féminin et donc pourrait

expliquer pourquoi MYB-GATA1 est préférentiellement (mais non exclusivement) observé

chez les garçons.

• Pourquoi MYB-GATA1 n’induit pas un blocage des granulocytes basophiles?

Au début de ce travail, nous pensions trouver des gènes clés impliqués dans

l’ontogénie des basophiles. En effet, à l’heure actuelle, la différenciation des basophiles

humains est peu connue. Des facteurs de transcription ou des cytokines clés et spécifiques de

ce processus ne sont pas déterminés comme pour la différenciation des lymphocytes B pour

laquelle PAX5 et l’IL-7 sont par exemple des éléments majeurs. Aux vues des caractéristiques

fonctionnelles de MYB et de GATA1, l’hypothèse d’une implication spécifique de l’un ou de

l’autre dans la différenciation des basophiles n’était pas des plus probables.

98

Dans le cadre de la pathologie étudiée, j’ai réalisé des expériences permettant

d’étudier la différenciation myéloïde, en utilisant des tests de CFC assay sur des progéniteurs

hématopoïétiques murins transduits par MYB-GATA1. Cette expérience permet d’analyser les

paramètres de prolifération, par rapport aux nombres de colonies totales obtenues et de

différenciation, par rapport aux proportions respectives de chaque type de CFU entre les

progéniteurs de la moelle contrôle et ceux transduits par MYB-GATA1. Ces expériences ont

mis en évidence l’effet de MYB-GATA1 sur l’engagement des cellules dans la lignée

granulocytaire. En effet, nous avons observé que lorsque les progéniteurs expriment la

protéine chimérique, le nombre de CFU-G augmente et en parallèle ceux des CFU-GM et des

CFU-M diminuent. Ceci montre que MYB-GATA1 oriente préférentiellement la

différenciation des progéniteurs vers la lignée granulocytaire. Ce résultat a été confirmé par

coloration des cellules récoltées au MGG. De plus, cette approche a permis de faire apparaître

que l’augmentation des précurseurs immatures granulocytaires (myéloblastes et

promyélocytes) se faisait au détriment de la différenciation monocytaire. Enfin, MYB-

GATA1 bloque les cellules à un stade de précurseurs granulocytaires immatures, puisqu’elles

conservent la morphologie et le phénotype membranaire caractéristiques de ce stade

(CD11b+Gr1+). Cependant, ces cellules se sont révélées négatives pour deux tests spécifiques

des granulocytes basophiles (expression membranaire du FcεRI, coloration métachromatique

au bleu de toluidine).

Dans les cellules leucémiques des patients étudiés, le gène GATA1 est invalidé ce qui

pourrait les mettre dans un contexte cellulaire favorable à l’engagement vers la différenciation

en granulocytes basophiles. Les résultats obtenus par Belloni et al., abordés précédemment,

ne supportent pas cette hypothèse puisque des blastes atypiques sont observés lors de leurs

tests de reconstitution de souris par des cellules Lin–Gata1-low. Toutefois, comme nous

l’avons discuté auparavant, le modèle utilisé lors de cette étude ne reconstitue pas fidèlement

le contexte pathologique.

Pour cette étude, je me suis placé dans un modèle murin, pertinent au regard de la forte

homologie des protéines MYB et GATA1 humaines et murines. Il est pourtant possible que

les mécanismes moléculaires conduisant à l’engagement des cellules vers la lignée basophile

soient différents entre les deux espèces et que les cytokines requises pour une différenciation

basophile soient spécifiques d’une espèce à l’autre. Les tests ont été effectués dans des

conditions expérimentales permettant la différenciation myéloïde, associées donc à un

cocktail de cytokines défini. Ces cytokines, et notamment leurs concentrations relatives, sont

99

susceptibles d’introduire un biais. En effet, le microenvironnement et les stimulations

cytokiniques qui s’y rattachent sont certainement décisifs pour que la cellule choisisse de

s’orienter vers la production de basophiles. En outre, il est possible que MYB-GATA1 régule

l’expression de récepteurs à certaines cytokines spécifiques de la différenciation basophile,

présentes dans le microenvironnement mais absentes dans notre test. Les progéniteurs que

nous avons étudiés pourraient alors s’être engagés par défaut vers la lignée des granulocytes

neutrophiles.

Lors de la description des cas cliniques réalisée par le Dr. Dastugue 188 , elle fait état

de la présence d’un contingent de cellules leucémiques dont la majorité est composée de

cellules immatures sans pour autant présenter les caractéristiques spécifiques des

basophiloblastes. A partir de cette observation, nous pouvons émettre les hypothèses que tous

les blastes sont à l’origine des progéniteurs de la lignée granulocytaire, et qu’une sous-

population clonale a émergé suite à une mutation additionnelle qui oriente les cellules vers un

phénotype basophile. En effet, il est courant d’observer des mutations additionnelles

susceptibles de faire évoluer le phénotype dans les leucémies aiguës myéloblastiques. Nous

avons entrepris la recherche de mutations dans les gènes FLT3, NPM1, WT1, CEBPa, K-RAS,

N-RAS, IDH1 et IDH2 chez deux de nos patients (#2 et #3). Le patient 2 est porteur d’une

mutation secondaire dans l’exon 2 du gène K-RAS (G12S). Cette mutation peut correspondre

à la sous-population clonale des basophiloblastes leucémiques qui représente 20 % des blastes

totaux chez ce patient. Si cette hypothèse est juste, il serait plus probable que la mutation de

K-RAS soit à l’origine de l’augmentation de la proportion des basophiloblastes (20% contre 2

% pour le patient 1) par un effet prolifératif, plutôt qu’à la base de l’orientation des cellules

vers la lignée basophile puisque l’autre patient testé est négatif pour les mutations choisies.

Une autre mutation, commune aux patients, pourrait avoir eu lieu dans un gène

spécifiquement impliqué dans l’engagement des progéniteurs vers la lignée basophile. Cette

explication serait un argument en faveur de l’existence d’un progéniteur commun

neutrophile/basophile chez l’homme. Une autre hypothèse serait de considérer que les cellules

touchées par cette translocation sont dès l’origine des progéniteurs basophiles et que toutes les

cellules n’ont pas encore acquis leurs caractéristiques phénotypiques.

Enfin, aux vues des réarrangements complexes mis en évidence chez nos patients, il

est possible qu’un désordre moléculaire ait été créé au niveau d’un autre point de cassure que

ceux situés en Xp11 et 6q23. En effet, la translocation de MYB sur le chromosome X nécessite

une autre cassure sur le chromosome 6 et deux des patients présentent plusieurs points de

100

cassure différents sur le chromosome X. Cependant, cette hypothèse est moins probable étant

donné que les autres points de cassures ne sont pas identiques entre les patients.

• Quels sont les mécanismes moléculaires aboutissant aux effets observés par

l’expression de MYB-GATA1 ?

Lors de ce travail, j’ai décris le phénotype engendré par l’expression de la protéine de

fusion MYB-GATA1. La caractérisation des mécanismes moléculaires associés aux

phénotypes conférés par l’expression de MYB-GATA1 devra faire l’objet de travaux

complémentaires. MYB-GATA1 est une protéine singulière car elle comporte deux domaines

de liaison potentiels avec des motifs nucléotidiques différents, l’un hélice-tour-hélice, et

l’autre en doigt de zinc. Lors de translocations fusionnant deux facteurs de transcription, il est

peu courant d’observer deux sites de liaison à l’ADN. En règle générale, lors de ce type de

translocation, un partenaire apporte son domaine de liaison à l’ADN et l’autre des éléments

régulateurs négatifs ou positifs. Il existe cependant d’autres cas comparables tel que PAX5-

ETV6 qui conserve les sites de liaison à l’ADN à la fois de PAX5 et de ETV6 209. Toutefois

cette protéine de fusion agit comme un dominant négatif sur l’activité de la protéine PAX5

sauvage car le domaine de transactivation de PAX5 est perdu dans la chimère 210. Cette

propriété semble moins probable dans le cas de MYB-GATA1 dans la mesure où MYB

conserve également son domaine de transactivation. Des tests complémentaires sont en tous

cas nécessaires pour déterminer l’impact de la fusion MYB-GATA1 par rapport au

fonctionnement normal de MYB.

Une hypothèse serait que cette protéine chimérique corresponde à une protéine MYB

activée suite à la délétion du domaine NRD. En effet, les formes tronquées de MYB sont

capables de transformer les cellules, ce qui correspondrait dans notre cas à une augmentation

du potentiel clonogènique in vitro. De plus, MYB est capable de s’auto-réguler grâce à la

présence dans son promoteur de site de liaison de MYB. Les augmentations de l’expression

de MYB-GATA1 et de MYB observées chez les patients pourraient être dues à ce mécanisme

d’auto-régulation par MYB sauvage sur son propre promoteur ou par MYB-GATA1. En

parallèle, la forte expression de MYB-GATA1 pourrait s’expliquer par la perte des sites de

fixation des microARN situés au niveau de la région 3’ non traduite de MYB. Le maintien

d’un fort niveau d’expression de ces deux formes induirait un blocage de la différenciation.

Pour répondre à ces questions, des expériences de transactivation du gène luciférase

sous dépendance de promoteurs de gènes cibles spécifiques de MYB permettraient de tester

101

les hypothèses d’une formation d’une forme activée de MYB. En parallèle, une étude par

ChIP-Seq apporterait des réponses quant aux cibles de cette nouvelle protéine de fusion.

L’analyse de l’impact de l’expression de MYB-GATA1 sur le niveau d’expression des cibles

déterminées par les expériences de ChIP-seq pourrait apporter une vue globale des

dérégulations induites par MYB-GATA1.

• La découverte de MYB-GATA1 peut-elle aider à la prise en charge des patients ?

La découverte de translocations peut améliorer la prise en charge du patient à plusieurs

titres. Ces translocations, quand elles sont retrouvées dans un grand nombre de patients,

peuvent être liées à des valeurs pronostique et prédictive et aider à la mise en place d’une

thérapie adaptée. Pour le moment, MYB-GATA1 ne peut être associé à de telles valeurs étant

donné le faible nombre de cas. Au regard du profil des patients porteurs de cette translocation,

une recherche systématique de la présence du transcrit de fusion chez des patients âgés de

moins de 1 an et atteints de LAM sans anomalie récurrente pourrait être envisagée. En effet, il

est possible que cette translocation, difficile à caractériser par les techniques de cytogénétique

conventionnelles du fait de sa complexité, soit sous-diagnostiquée.

En pratique médicale, l’identification de MYB-GATA1 peut permettre la recherche

par PCR du transcrit au diagnostic et par RT-PCR quantitative des cellules leucémiques

résiduelles chez les patients après traitement. En effet, la recherche de la maladie résiduelle

permet d’évaluer le risque de rechute. Cette approche est couramment utilisée lors des

traitements de patients atteints de LAL. Elle permet de déterminer le pourcentage de cellules

leucémiques présentes après traitement dans environ 90 % des cas par recherche de

l’expression de récepteurs antigéniques spécifiques du clone leucémique (immunoglobulines

ou TCR)211. De part l’hétérogénéité des désordres moléculaires associés aux LAM, cette

approche est peu développée dans ce type de leucémies aiguës comparativement aux LAL.

Néanmoins, des études récentes portent sur la valeur pronostique du pourcentage de cellules

leucémiques résiduelles chez des patients atteints de LAM exprimant les protéines de fusion

récurrentes telles que AML1–ETO et CBFβ–MYH11 212-213.

D’un point de vue thérapeutique, l’utilisation de molécules ciblant les transcrits MYB

et MYB-GATA1 pourrait être envisagé en parallèle de la chimiothérapie. En effet, chez les

patients, les gènes MYB et MYB-GATA1 sont fortement exprimés. C’est pourquoi l’utilisation

d’un oligonucléotide antisens ciblant la partie commune des deux transcrits respectifs pourrait

être une bonne approche. Un oligonucléotide anti-sens de l’ARNm de MYB modifié

chimiquement afin d’augmenter sa stabilité a été développé. Ce dernier a été utilisé lors

102

d’essais cliniques sur des patients atteints de LMC. Malgré la démonstration que l’injection de

cet oligonucléotide modifié n’était pas toxique, les conclusions quant au bénéfice clinique

n’étaient pas certaines 214.

Pour conclure, ce travail associe pour la première fois une translocation récurrente

identifiée au développement d’une leucémie aiguë à basophile. De plus, cette étude a abouti

au clonage d’une nouvelle protéine de fusion capable de bloquer la différenciation et de

transformer des progéniteurs hématopoïétiques murins. Enfin, cette translocation touchant

quatre enfants de sexe masculin et atteints de la même maladie définit une nouvelle entité

clinico-pathologique.

103

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AUTHOR: Cathy QUELEN TITLE: The t(X;6)(p11;q23) chromosomal translocation involved in acute basophilic leukaemia Childhood acute myeloblastic leukemias are haematological malignancies frequently

associated with chromosomal translocations. The molecular characterization of these

chromosomal rearrangements highlights genes important in haematopoietic differentiation.

Furthermore, the discovery of recurrent chromosomal translocation is essential for the

detection of residual disease, establishment of prognostic value and therapeutic choices. Acute

basophilic leukemia is a rare sub-type of acute myeloblastic leukaemia. Despite rare cases of

t(X;6)(p11;q23) translocation reported for this pathology, no molecular characterization was

available until recently.

The aim of our work was to characterize genes rearrangement in four cases of male

infants carrying t(X;6). Because of its location on chromosome 6q23, MYB was a good

candidate gene. Our molecular investigations, based on fluorescence in situ hybridization and

rapid amplification of cDNA ends, revealed a complex chromosomal rearrangement leading

to the creation of a MYB–GATA1 fusion gene. Moreover, this translocation is associated with

an invalidation of the GATA1 gene located on chromosome X. These two proteins are master

regulators of haematopoiesis. GATA1 is essential for normal erythropoiesis and MYB is

involved in hematopoietic stem cell renewal and myeloid differentiation. Expression of MYB–

GATA1 in mouse lineage-negative cells committed them to the granulocyte lineage and

blocked them at an early stage of differentiation. Moreover, this protein increased clonogenic

potential. Taken together, these results establish, for the first time, a link between a recurrent

chromosomal translocation and the development of this particular subtype of infant leukemia

KEYWORDS: chromosomal translocation, acute basophilic leukaemia, MYB, GATA1,

hematopoietic differentiation.

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