récupération motrice post-avc - inserm · mechanisms of action (2) 1. reduction of post-ischemic...
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Reacutecupeacuteration motrice post-AVC
Biotheacuterapie
Loubinoux Isabelle
1 Inserm Centre de NeuroImagerie de Toulouse Toulouse
2 Universiteacute UPS de Toulouse
3 CHU Toulouse Pocircle Neurosciences
Echelle neurologique globale
Echelle fonctionnelle
Echelle analytique motrice
NIH
Barthel
Fugl-Meyer (extreacutemiteacute supeacuterieure)
Fugl-Meyer (extreacutemiteacute infeacuterieure)
Reacutecupeacuteration rapide dans les 2 premiers mois plasticiteacute ceacutereacutebrale maximale
Reacutecupeacuteration des deacuteficits moteurs Deacutecours temporel
Introduction
Plasticiteacute ceacutereacutebrale bull Deacutemasquage de connections existantes
bull Renforcement de connections (LTP)
bull Neuritogenegravese
bull Synaptogenegravese
bull Neurogenegravese
bull Premiegravere cause de handicap
bull Patients lourdement invalideacutes
bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)
limiteacutee
bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation
limiteacutee (modaliteacutes )
bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les
deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)
Introduction
lrsquoAVC
Reacuteeacuteducation
stimulation meacutedicament et cellules souches
Laboratoire de TMS et tDCS
TMS Transcranial Magnetic Stimulation
and
tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau
Repetitive TMS +
Neuronavigation
tDCS TMS bistim Repetitive TMS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
-
0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
ase
lin
e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Echelle neurologique globale
Echelle fonctionnelle
Echelle analytique motrice
NIH
Barthel
Fugl-Meyer (extreacutemiteacute supeacuterieure)
Fugl-Meyer (extreacutemiteacute infeacuterieure)
Reacutecupeacuteration rapide dans les 2 premiers mois plasticiteacute ceacutereacutebrale maximale
Reacutecupeacuteration des deacuteficits moteurs Deacutecours temporel
Introduction
Plasticiteacute ceacutereacutebrale bull Deacutemasquage de connections existantes
bull Renforcement de connections (LTP)
bull Neuritogenegravese
bull Synaptogenegravese
bull Neurogenegravese
bull Premiegravere cause de handicap
bull Patients lourdement invalideacutes
bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)
limiteacutee
bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation
limiteacutee (modaliteacutes )
bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les
deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)
Introduction
lrsquoAVC
Reacuteeacuteducation
stimulation meacutedicament et cellules souches
Laboratoire de TMS et tDCS
TMS Transcranial Magnetic Stimulation
and
tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau
Repetitive TMS +
Neuronavigation
tDCS TMS bistim Repetitive TMS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
-
0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
ase
lin
e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Introduction
Plasticiteacute ceacutereacutebrale bull Deacutemasquage de connections existantes
bull Renforcement de connections (LTP)
bull Neuritogenegravese
bull Synaptogenegravese
bull Neurogenegravese
bull Premiegravere cause de handicap
bull Patients lourdement invalideacutes
bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)
limiteacutee
bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation
limiteacutee (modaliteacutes )
bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les
deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)
Introduction
lrsquoAVC
Reacuteeacuteducation
stimulation meacutedicament et cellules souches
Laboratoire de TMS et tDCS
TMS Transcranial Magnetic Stimulation
and
tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau
Repetitive TMS +
Neuronavigation
tDCS TMS bistim Repetitive TMS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
-
0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
ase
lin
e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
bull Premiegravere cause de handicap
bull Patients lourdement invalideacutes
bull Reacutecupeacuteration spontaneacutee (plasticiteacute reacutegeacuteneacuteration)
limiteacutee
bull Efficaciteacute de la reacuteeacuteducation
limiteacutee (modaliteacutes )
bull Pas de traitement pharmacologique valideacute lorsque les
deacuteficits sont constitueacutes (phase chronique)
Introduction
lrsquoAVC
Reacuteeacuteducation
stimulation meacutedicament et cellules souches
Laboratoire de TMS et tDCS
TMS Transcranial Magnetic Stimulation
and
tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau
Repetitive TMS +
Neuronavigation
tDCS TMS bistim Repetitive TMS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
-
0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
ase
lin
e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Reacuteeacuteducation
stimulation meacutedicament et cellules souches
Laboratoire de TMS et tDCS
TMS Transcranial Magnetic Stimulation
and
tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau
Repetitive TMS +
Neuronavigation
tDCS TMS bistim Repetitive TMS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
-
0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
ase
lin
e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Laboratoire de TMS et tDCS
TMS Transcranial Magnetic Stimulation
and
tDCS Transcranial Direct Current Stimulation Responsable Marion Simonetta-Moreau
Repetitive TMS +
Neuronavigation
tDCS TMS bistim Repetitive TMS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
Principe Restaurer lrsquoactiviteacute ipsileacutesionnelle
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
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0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
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e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Time course of the mean (plusmn SD) gain of motor performance at Jebsen Taylor
Hand Function Test with the paretic hand compared to baseline in each group
-
-
-
-
-
-
0
20
40
60
80
100
120
D1 D5 D15 D30
Dec
rease
in
tim
e to
per
form
JH
FT
b
ase
lin
e (s
ec)
Anodal tDCS + rPNS
Sham tDCS + rPNS
Neurorehabilitation and Neural Repair 2015
tDCS
Stimulations Non-invasives TOulouse NeuroImaging Centre
N=10
N=10
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
IRM fonctionnelle Critegraveres intermeacutediaires drsquoefficaciteacute de theacuterapeutiques
Le Prozac ameacuteliore la Motriciteacute
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
bull Ameacutelioration de la reacutecupeacuteration motrice
bull Ameacutelioration fonctionnelle indeacutependance
bull Patients lourdement deacuteficitaires
Reacutecupeacuteration motrice fugl-meyer
Lancet Neurol 2011
Essai clinique IIa Fluoxeacutetine 3 moisplacebo
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
5-HT Hypothegravese drsquoune fonction premiegravere du systegraveme seacuterotoninergique faciliter la motriciteacute (Jacobs amp Fornal 1997)
- Entraicircnement stimule le systegraveme 5-HT Associer + Meacutedicament
Apprentissage meacutemoire (Frisch 2000 Meneses 1999
Izquierdo 1998) consolidation (Meneses 1995)
Facilitation agrave court-terme augmentation de la libeacuteration de neurotransmetteur (Bailey Can J Physiol and Pharmacology 1999 PNAS 2000)
Facilitation agrave long-terme nouveaux contacts synaptiques entre les neurones sensitifs et moteurs augmente la force synaptique (Bailey 1999)
5-HT (et NE DA Ach) induisent LTP optimisent le reacute-apprentissage activiteacute-dpt post-AVC (Dinse et al Science 2003)
Mechanisms of action (1)
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Mechanisms of action (2)
1 Reduction of post-ischemic apoptosis (caspase-3)
2 Oxidative stress up-regulation enzyme antioxydant expression
bull catalase glutathione peroxidase (GPX) superoxide dismutase (SOD1)
3 Inflammation Microglia repression neutrophiles infiltration (NF-kB activity)
bull 4-hydroxy-2 nonenal
bull delayed neuronal death (penumbra)
4 Neurogenesis Increase stem cells survival and differentiation
bull in the dentate gyrus
bull of GABAergic interneurones I in the cortex
5 Up-regulation of BDNF VEGF FGF (Coppel 2003 Ivy 2003 Greene 2009 Lee 2009)
bull Improvement of declarative memory and hippocampal volume (Vermetten 2003
Santarelli Science 03)
5-HT
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Neurogenegravese en conditions pathologiques
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme et lrsquoanimal
Observeacutee dans des modegraveles animaux
ABC leacutesion modegravele ischeacutemie
D Maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives
(Scleacuterose en plaque)
Production limiteacutee de cellules souches endogegravenes
Quel beacuteneacutefice fonctionnel
Zone Sous-Ventriculaire
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Recrutement des progeacuteniteurs de la zone sous-ventriculaire amplification et migration
Diffeacuterentiation approprieacutee agrave la zone leacuteseacutee
Neurogenegravese en conditions pathologiques existante
Mais hellip entre 2 et 5 semaines ces neurones jeunes meurent
Seuls 02 des neurones morts sont remplaceacutes
Magavi et al Nature 2000
Arvidsson et al Nature Medecine 2002 Neurogenegravese efficace agrave remplacer quelques neurones
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Amplifier la neurogenegravese existante
1 Stimulation
02
2 Greffe
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Stimulation de la neurogenegravese endogegravene
- Par des composeacutes
Fluoxeacutetine granulocyte colony-stimulating factor basic Fibroblast Growth Factor
- Greffe de cellules non neurales Heacutematopoiumleacutetiques Meacutesenchymateuses
Strateacutegies les moins invasives
bull Isolation et amplification facile
bull Obtention agrave partir de la moelle osseuse tissus
adipeux placenta hellip
bull Greffe autologue bonne toleacuterance
bull Greffe heacuteteacuterologue (nrsquoexprime pas lrsquoantigegravene du
complexe majeur dhistocompatibiliteacute II)
bull Potentiel de multi-lineacuteage
bull Injection intraveineuse intraceacutereacutebrale migrent vers
la zone leacuteseacutee
Olfactory mucosa Mais hellip ne se diffeacuterentient pas en neurones
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Cellules souches olfactives issues de la crecircte neurale
Cellules engainantes et ecto-meacutesenchymateuses
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Meacutecanismes drsquoaction
bull Facteurs de croissance
bull Moleacutecules drsquoadheacutesion cellulaire
bull Guidage axonal
bull Proteacuteines matrice extracellulaire
(laminine fibronectine collagegravene IV)
Expriment des gegravenes de cellules neurales
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Faisabiliteacute deacutemontreacutee mais efficaciteacute agrave montrerhellip
Nombre de patients faible (lt13)
Les essais cliniques de greffe de cellules meacutesenchymateuses
Production GMP (Good Manufacturing Practices) des cellules
- Milieu de culture deacutefini pas de produits drsquoorigine animale
- Banque de cellules homogegravenes (stabiliteacute geacuteneacutetique et fonctionnelle)
- Tests de libeacuteration des lots viabiliteacute identiteacute steacuteriliteacute
Seacutecuriteacute Qualiteacute
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Strateacutegie invasive greffe intraceacutereacutebrale de cellules neurales
1 Stimulation
2 Greffe
La plus invasive
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Cellules capables de se diffeacuterencier
uniquement en
bull Neurones
bull Astrocytes
bull Oligodendrocytes
Strateacutegie de theacuterapie cellulaire greffe neuronale
Greffe de cellules souches neurales
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
2 Ligneacutees cellulaires deacuteriveacutees (geacuteneacutetiquement modifieacutees)
1 Teacuteratocarcinome hNT2 (Kondziolka 2000 essai clinique safe)
2 Neuroeacutepitheacutelium CTXOE03 (Reneuron essai clinique safe)
3 iPS (induced pluripotent stem) cells (geacuteneacutetiquement
modifieacutees)
Sources de cellules souches neurales
1 Cultures primaires
bull Cellules embryonnaires fœtales
Neuroeacutephitheacutelium (entoure futurs ventricules)
cortex ceacutereacutebral faible disponibiliteacute
problegravemes eacutethiques
Savitz 2005 essai clinique n=5 stables 1 aggravation
du deacuteficit
bull Cellules souches adultes
SVZ gyrus denteacute hippocampe faible disponibiliteacute
quantiteacute
faible pouvoir prolifeacuteratif
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
amygdalo-hippocampectomie
Zone retireacutee
pour acceacuteder
agrave lrsquohippocampe
(SVZ)
Lobe
temporal
Preacutelegravevement Reacutegion sous-eacutependymaire de la
corne temporale des ventricules lateacuteraux (SVZ) et
cortex
Origine Deacutechet opeacuteratoire suite agrave une chirurgie
pour eacutepilepsie pharmaco-reacutesistante (amygdalo-
hippocampectomie)
Patient Adultes de 18 agrave 65 ans
Autorisation du Ministegravere
DC-2009-903 Vaysse et al Brain injury 2012
Preacutelegravevement
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Biopsie
Dissociation
meacutecanique et enzymatique
Cellules non adheacuterentes
dissocieacutees
Amplification
Culture 3 semaines
en preacutesence de mitogegravenes
Neurosphegraveres
Clusters de
cellules souches
Neurosphere
Possibiliteacute drsquoamplifier (BrdU+) des cellules
souchesprogeacutenitrices neurales (GFAP+ Nestin+) agrave partir de
biopsies de la SVZ et du lobe temporal
Nestin GFAP BrdU
SVZ
Temporal lobe
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Mise en culture et Amplification
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
GFAP GFAP
J7 J25
MAP2
GFAPtuj-1
Possibiliteacute de diffeacuterenciation in vitro en
Neurones (30) Astrocytes (18) Oligodentrocytes (38)
J25
SMI312
MAP2 O4
O4GFAP
J25
Vaysse L et al Adult human progenitor cells from the temporal lobe another source of neuronal cells Brain injury 2012
100 microm GFAPtuj-1
Mise en culture et Diffeacuterenciation
Cellules Souches Adultes Neuronales Humaines
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Reacutecupeacuteration de la force
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules
neuronales
Reconstruction tissulaire
limiteacutee
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Cellules souches neurales humaines ligneacutee cellulaire CTX0E03 ou ReN001 (neuroeacutepitheacutelium) GMP
bull Immortalisation oncogegravene (geacuteneacutetiquement modifieacutee technologie c-mycERTAM reacutecepteur agrave lrsquooestradiol)
bull Croissance amplification 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)
bull Controcircle de la croissance neutralization de lrsquooncogegravene (arrecirct des facteurs de croissance et 4-OHT) arrecirct
de la division cellulaire induction de la diffeacuterentiation neurones et astrocytes (Stevanato BMC Neurosci 2009)
Rongeurs angiogenegravese (Hicks 2013) 20 astrocytes lt2 neurons
ameacutelioration sensorimotrice (Pollock 2006 Stroemer 2009 Smith 2012)
Essai clinique phase I 11 patients chroniques et stables gt 60 ans (6 mois ndash 5 ans)
Leacutesion des ganglions de la base handicap modeacutereacute seacutevegravere
2 5 10 20 millions cellules injecteacutees dans le putamen
Pas de groupe controcircle sans chirurgie
Suivi 1 an
Pas drsquoeffets secondaires
NIHSS Barthel mRS Ashworth score ameacutelioration minime de tous les scores
PISCES Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire CTXOE03
European Stroke Conference 2014
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Greffe de cellules souches seules est peu efficace
- mort cellulaire massive (5 de survie)
- pas adapteacutee aux leacutesions massives
- facteur limitant reacutegeacuteneacuterer des neurones
Greffe de cellules souches dans les pathologies ceacutereacutebrales
1 Stimuler la neurogenegravese
2 Remplacement neuronal
Faisabiliteacute deacutemontreacutee
mais beacuteneacutefice fonctionnel faible
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Tissue engineering
Mimer la matrice extracellulaire
Creacuteer un microenvironnement permissif
au niveau de la leacutesion
- Ameacuteliorer la survie cellulaire
- Aider agrave la diffeacuterentiation
- Aider agrave la vascularisation
- Diminuer lrsquoinflammation
- Permettre la recolonisation de la glie
par lrsquohocircte
Mateacuteriel biocompatible biodeacutegradable
Structure facilement implantable
La contribution drsquoun support aux cellules
C Montero-Menei Angers
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Park Teng amp Snyder Nature Biotechnol 2002
La contribution drsquoun support aux tissus
Supports en polymegraveres syntheacutetiques
poreux biodeacutegradables (PGA
Polyglycolic acid)
Cellules souches neurales
bull Remplissent la caviteacute
bull Milieu permissif pour la croissance
des neurites
bull Permettent drsquoeacutetablir des connections
avec lrsquohocircte jusque dans lrsquoheacutemisphegravere
controlateacuteral
bull Supportent la vascularisation
bull Reacuteduisent lrsquoinfiltration de cellules
mononucleacuteaires et la cicatrice gliale
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Matrice extracellulaire support est neacutecessaire
- diriger la croissance neuronale jusqursquoagrave la cible
- restaurer la connectique entre les tissus non leacuteseacutes
Question
Nanobiotechnologies
Verrou
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Cellules souches endogegravenes migrent et forment un tractus neuronal corticospinal
Neacutecessiteacute drsquoun environnement structureacute
Neurogenegravese en conditions pathologiques reconnection longue-distance
2004
Marqueurs de
bull reacuteplication de lrsquoADN (BrDU)
bull migration neuroblaste
bull Diffeacuterentiation neuronale (Dcx)
20ndash30 nouveaux neurones mm3
5 nvx neurones mm3 agrave 3 mois
Dont certains projettent sur la
moelle
2-3 neuronesmm3 survivent gt 56 j
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
DTI Faisceau corticospinal
(rouge)
Reacutegeacuteneacuteration du FCS
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Le Neuro-implant permet une reacutegeacuteneacuteration neuronale orienteacutee et longue distance
SMI 312
bull Implantation des neuroimplants comportant les cellules souches humaines adultes
preacutediffeacuterentieacutees
bull Les cellules humaines implanteacutees sont toujours en place sur la prothegravese (hMTCO2) dans la
leacutesion 4 mois apregraves
bull Les cellules se sont diffeacuterencieacutees en neurones matures
bull Les cellules greffeacutees attirent les cellules souches de lrsquohocircte
Neurones hocirctes + humains
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Isabelle LOUBINOUX
laquo Only action gives a person a dignified life raquo H von Helmholtz
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Introduction
MAG myelin-associated glycoprotein
Inhibiteur de croissance axonale
GSK249320 anti-MAG
2 iv 24h + 9 jours apregraves
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Responsable Robert Darmana (Equipe iDREAM)
Dynamomegravetre
manuel
Force des
extenseurs du
poignet
Test des
frappes
reacutepeacuteteacutees
de lindex
Test Jebsen amp Taylor
Flexion du poignet
9 chevilles
Dexteacuterimegravetre
Stimulateur eacutelectrique
TENS
Systegraveme danalyse cineacutematique 3D
Ergonomegravetre isocineacutetique
en projet
EMG
compatible IRM Capteur du poignet
compatible IRM EEG
2 dynamomegravetres
Reacutealiteacute virtuelle
Laboratoire du Mouvement Humain TOulouse NeuroImaging Centre
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Projections rares (Sorensen et al Exp Neurol 1996)
Vers la moelle spinale 1128 souris 20 neurones
corticospinaux moteur long prolongement (Gaillard
2007)
Projections longues distances rares
Suffisant pour avoir un reacuteel
beacuteneacutefice theacuterapeutique au niveau moteur
2007
Contact synaptique Pousse axonale
Axone myeacuteliniseacute
Leacutesion du cortex moteur primaire Greffe de cortex embryonnaire
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Peptide amphiphile PA + laminin epitope IKVAV
Descending CS motor axons
Ascending sensory axons
La contribution drsquoun support aux cellules
Reacutegeacuteneacuteration de la Moelle
Spinale ameacutelioreacutee par
lrsquoinjection de biomateacuteriaux
J Neurosci 2010
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Neurogenegravese dans le cerveau adulte chez lrsquohomme
SVZ et Hippocampe de patients avec des carcinomes de la sphegravere ORL
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Beacuteneacutefice fonctionnel des Neuro-implants
Vaysse et al Biomaterials 2015
41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
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UMR 1014
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41 6 Novembre 2014
Isabelle LOUBINOUX
Verrous technologiques
1 Preuve du succegraves de la greffe de cellules neurales humaines chez un animal
MicroPET non invasif
Immunohistologie
bull Greffe marqueur
bull Neurones marqueur
Double marquage ex vivo
Marqueur humain neuronal humain+neuronal
AXE 1 PROJETS theacuterapie AVC et Cellules Souches
2 Histologie des biomateacuteriaux
Tissu reacutegeacuteneacutereacute fragile
Coupes eacutepaisses (Axiozoom)
bull Neurones immatures
bull Astrocytes
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Histologie 1 Neuro-implants
B
ED1 GFAP A
GFAP C
Vaysse et al Biomaterials 2015
Pas de reacuteaction
astrocytaire et
inflammatoire
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
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Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Histologie 2
Neuro-
implants
A
B
hNu
Tuj-1 SMI312
Tuj-1 SMI312
Vaysse et al Biomaterials 2015
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
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Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Moulage du support en PDMS
(biocompatible)
PDMS avec rainures
de diffeacuterentes tailles
Adheacutesion cellulaire
Coating PolylysineLaminine
20 microm
Image MEB PDMS microstructureacute Polylysine ndashFITC NTC
1 Fabrication support silicone rainureacute
Salle blanche de microfabrication 2 Ensemencement des cellules
45cm
25
cm
Support PDMS adapteacute agrave la
culture cellulaire
20 mm
Image MEB
Publication ABeacuteduer LVaysse EFlahaut FSeichepine I Loubinoux C Vieu Microelectronic Engineering 2010
Eacutetape 1 Implant + Cellules souches = bioprothegravese
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Microsillons
PDMS plat
Cellules humaines ligneacutee Luhmes
Neurofilaments
Actine
Noyaux
45
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Ctrl plat
10 microm
20 microm 60 microm
X microm
5 microm Tuj-1 Dapi
Ctrl plat 20 microm
2 Alignement des neurites
1 Diffeacuterentiation neuronale
3 Nombre de neuritesneurone
1 neurite
2 neurites
3 neurites
5 microm 10 microm 20 microm
60 microm Ctrl
ABeacuteduer I Loubinoux C Vieu L Vaysse Engineering of human neural stem cells
differentiation through surface micropatterning Biomaterials 2012
60 microm
Pourcentage de cellules tuj-1
3
52
92 98 114
5 microm 10 microm 20 microm 60 microm Ctrl
Eacutetape 2 Etude de la croissance dirigeacutee des neurites sur implants
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Figure 5 Effects of NPCMatrigel culture transplants on behavioral function
after MCAO Rats underwent MCAO followed 3 weeks later by transplantation
of aCSF alone (vehicle) or NPCMatrigel cultures and 4 to 9 weeks later by
behavioral testing
Le beacuteneacutefice fonctionnel (1)
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Le beacuteneacutefice fonctionnel (2)
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Diminution de la taille de la leacutesion
Ameacutelioration de la survie cellulaire
Effet sur le comportement par rapport aux cellules seules
Delcroix et al Biomaterials 2011
MSC sur microbilles avec
laminine+NT3
Le beacuteneacutefice fonctionnel (3)
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Suivi des cellules
qui prolifegraverent
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
Centre de NeuroImagerie de Toulouse
Arvidsson et al Nature Medecine 2002
Migration de jeunes neurones de la zone sous-ventriculaire
vers les reacutegions leacuteseacutees
Les neurones neacuteoformeacutes expriment des marqueurs de neurones striataux
(Meis2 et DARPP32)
Lee et al Stem Cells 2010
Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
Equipe I Loubinoux
Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke
Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
Reacutegeacuteneacuterer des neurones
Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
Cellules souches Nanotechnologies
Diriger la croissance axonale
Dihneacute et al Stroke 2011
cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
CNRS-LAAS Vaysse et al Biomaterials 2012
Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
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Neurogenegravese en conditions pathologiques apregraves un AVC
SVZ Sub-Ventricular Zone
A stimuler
Rocircle fonctionnel de la neurogenegravese
Quantification hellip
Correacutelation avec le devenir fonctionnel
Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
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Leacutesion
4 mois post-leacutesion
Analyse histologique chez le rat
Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
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Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
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Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
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Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
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Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
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Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
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Bleu noyaux
Le tissu ne se reforme pas
Mort des neurones neacuteoformeacutes endogegravenes
Taille de la leacutesion neacutecessiteacute drsquoun environnement permissif
SMI312 neurones matures Tuj-1 neurones immatures
Neurogenegravese et leacutesion eacutetendue du cortex moteur primaire M1
Maturation neuronale
U825
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Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
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Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
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Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
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Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
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Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
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Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
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Projet Innov-in-stroke theacuterapeutique innovante
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cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
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Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
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AVC et thrombolyse thrombectomie
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UMR 1014
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Seacutecuritaires
Cellules sanguines
Cellules endotheacuteliales
6 essais cliniques (max 12 patients traiteacutes
Lee et al Stem Cells 2010)
Neurogenegravese
Transplantation allogeacutenique neurones
Transplantation allogeacutenique neurogenegravese
Efficaciteacute 12 essais cliniques termineacutes avec peu de patients 17 essais cliniques en cours
Cellules stromales meacutesenchymateuses MSCs
A B
C
Human Marker
Vaysse et al Behavioral Neurosci 2015
Effet de la greffe
de cellules seules
Plasticiteacute post-
leacutesionnelle
Cortex insulaire
Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
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Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
Elder EM McGrogan M Reitman MA Bynum L
Department of Neurological Surgery University of Pittsburgh Medical Center PA 15213 USA
Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
leacutesion Relier les cellules implanteacutees
au cortex et agrave la moelle
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Neurology 2000 Aug 2255(4)565-9
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Kondziolka D Wechsler L Goldstein S Meltzer C Thulborn KR Gebel J Jannetta P DeCesare S
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Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
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cadre
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taxique
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Chez le rat
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force
(Vaysse et al
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Essai clinique de theacuterapie cellulaire ligneacutee cellulaire neuronale hNT2
N = 14 patients stables 5 ou 10106 cellules n=4 controcircles sans chirurgie ESS NS seacutecuriteacute
Scheacutema anatomique vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle eacutepiniegravere
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au cortex et agrave la moelle
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Cellules souches Nanotechnologies
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cadre
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taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
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Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
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cadre
steacutereacuteo-
taxique
Implantation dans la leacutesion Neuro-implant cellules souches + biomateacuteriau
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Preuve de concept
Chez le rat
Ameacutelioration de la
force
(Vaysse et al
Biomaterials 2015)
Reacutegeacuteneacuterer un faisceau corticospinal pontage longue distance
AVC et thrombolyse thrombectomie
5 des patients
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UMR 1014
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AVC et thrombolyse thrombectomie
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TOulouse NeuroImaging Centre TONIC
UMR 1014
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