BIOCHIMIE, 1976, ~8, 1401-1403.

Purification de la catdchol-O-m6thyhransfdrase (EC. 2.1.1.6) du placenta humain et 6tude de quelques propri6tds c)(").

P a t r i c k DARMENTON, L u c i e n CRONENBERGER ~ et H e n r i PACHECO.

5eruice de Chimie Biologique, B~t iment ~06, Inst i lut National des Sciences Appliqades, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne Cddex.

(5-5-1976).

INTRODUCTION.

La catdchol-O-mfi thyl t ransf~rase (COMT) (EC 2.1.1.6) ca ta lyse le t r an s f e r t d ' un g roupemen t m~thyle de la S -ad6nosy lm~th ion ine (SAM) sur un accepteur de s t ruc ture or thodiphdnol ique ou 6he diol [1]. Large- men t r6pandue dans l ' o rgan i sme [2, 3], elle est auss i prdsente darts le ,placenta [4]. Pour Lisalo et coll. [41 la COMT in te rv iendra i t darts le ca tabol i sme des catd- cho lamines dont la presence en quant i t6 excessive serai t dangereuse pour le fcetus. Gulger et coll. sont les seuls h avoir tent~ la purif icat ion et l '6tude de la COMT du placenta h u m a i n [5].

En ce qui nous coneerne, ec t rava i l s ' int6gre dans le cadre d 'une dtude des enzymes placeuta i res pouvan t poss~der u n int~r~t th6rapeut ique . II fa i l sui te h la purif icat ion de l ' h i s t a m i n a s e ou d i a m i n e : oxyg6ne oxydo-rdductase [6].

Produits. Nous avons pr~par$ la SAM h par t i r de cul ture de

levure de boulanger ie , sur un mi l ieu enrichi en m(~- th ion ine [7] en s ' i n sp i r an t du brevet prdsent5 par Haiti et coll. [8]. La gaiacolphta l6ine (GP) a 6t6 synthdt is~e au laboratoi re (par A. M. Malaweille) d 'apr6s les l ra- vaux anc ieas de Baeyer et Kochendor fe r [9]. Pour l '61ectrofocalisation, les ampho l ine s sont fourn ies par LKB et tes au t res p rodu i t s sont des produi t s Merck extra purs . Enfin les diverses prot6ines ~talons ut i - lisdes pour la d~ te rmina t ion du poids mol$culai re sont les s u i v a n t e s : lysozyme du b lanc d'ceuf (Sigma), myoglob ine de cheval (NBC), pepsine cristal l isde (NBC), h6moglobine h u m a i n e cristal l is~e (NBC), cala- lase de foie de bceuf (NBC), thyrog lobu l ine dc porc (Mann Research Laborator ies) .

Solution et tampons.

Solut ion A : solut ion de saccharose (0,25 M) + mer- capto6thanol (10-3 M) ; t a m p o n B : pH 7,4 ; t a m p o n C : pH 6,2. Ces deux derniers sont des t a m p o n s phospha te s de p o t a s s iu m (KH._,POJK~HPO~.3H_oO) 2.10-2 M - f o r c e ionique : I = 0,120 4- mercap tod thano l (10-3 M).

Pr~cisions concernant la purification.

Tontes les m a n i p u l a t i o n s sont fai tes & 4°C et les cen t r i fuga t ions rdalisdes h 20 000 g pendan t 15 m i n u t e s

4°C (centr i fugeuse MSE). Les pourcentages de sa tu-

(*) Ce m~moire cons t i tue une par t ie de la th6se de Doctorat-6s-Sciences Phys iques que dolt sou ten i r P. Darmenton .

(**) Ce t rava i l a ~t~ r~alis~ darts le cadre d 'un con- t ra t de recherche entre l ' I n s t i t u t Mdrieux (69 Marcy l 'Etoile) et I'INSA.

A qui route correspondance doit ~tre adressde.

r a t ion an su l fa te d ' a m m o n i u m cit6s sont calcu16s en sachan t qu 'une so lu t ion saturde de (NHD~SO~ cont ient 4,1 M h 25°C [10]. Lor sque la technique de chromato- graphie sur $changeur d ' ions (CM- Sephadex C 50) est uti l isde cu bain, la rdcupdrat ion du fil trat et de l '~luat est facilitde par l 'emploi de panicrs de cen t r i fuga t ion con~us selon le mod61e propos6 par De te rman [;11]. Vitesse d 'essorage : 3 000 t / m i n .

Mesure de l'activitd COMT. C'est la technique color im6tr ique d 'Anderson et

d 'Iorio [!12] h la pyrocatdcholphta l6 ine (CP) modifi~e par Gugler et coll. [5] que nous avons employee.

Dosage des prot~ines. Los protdines des ext ra i t s peu purifi6s ont ~t~ dos6es

avec la t echnique de W a rbu rg et Chr i s t i an [13]. Pour les ex t ra i t s p r~sen tan t une faible t eneur en prot6ines, nous avons employ6 le dosage de Lowry et coll. [14] dont les courbes d '~ta lonnage ont 5l~ r6alis6es en pre- sence de mercap to6 thanol pu i sqne ce dernier in terfere dans le dosage [15].

Electrofocalisation el ddtermination du phi . La technique est celle d6velopp~e par O. Vesterberg

[!1~6], pou r u n gradient de pH s 'd tendant de 3,5 h 9,5. L 'apparei l (LKB 2117 Multiphor) est r~frig~r~ par un cryos ta t qui m a i n t i e n t une t empera tu re de 2°C. Apr~s migra t ion , le gel est d6coup5 en bandes de 5 m m de la rgeur qne l 'on homogdn6ise dans 2 ml d 'eau d~sioni- s6e. Sur chaque fract ion, le pH est mesur~ e t l a d6tec- l ion de l 'activit~ COMT at t r ibue h l ' enzyme comme ph i , lc pH de la f rac t ion off elle est prSsente.

PURIFICATION DE LA COMT PLACENTAIRE.

Extraction de l'enzyme. 300 h 400 g de placenta f ra i s d6pourvu de m e m b r a -

nes et de cordon ombil ical sont broy~s h l ' u l t r a t u r r a x dans la solut ion saccharosge A dans la proport ion de 70 ml pour 30 g de poids f ra is d 'organe. La ceutri- fuga t ion permet d 'obteni r un su rna ge a n t l impide (extrai t S).

Prdcipitation au sulfate d 'ammonium. Sur l ' ex t ra i t S (500 ml), on effectue une double pr6-

c ipi ta t ion qui laisse sddimenter les prot6ines insoln- bles dans les l imi tes de 40-55 p. cent de sa tu ra t ion ell sel. Nous avons vdrifi6 que ]e r e n d e m e n t d'activit6 COMT dtait m a x i m u m pour une dur~e de precipi ta t ion d 'une heure.

Chromatographie sur CM Sephadex C 50. Le cnlot protdique est repris dans un vo lume min i -

m u m de t a m p o n B, puts d~ssal6 avan t d 'etre ch roma-

1 4 0 2 P . D a r m e n t o n . L . C r o n e n b e r g e r e t H . P a c h e c o .

t o g r a p h i 6 s u r d c h a n g e u r d ' ions . Cet te o p 6 r a t i o n a 5td r~al is~e p a r u n e f i l t r a t i on s u r gel S e p h a d e x G 25. Le f i l t ra t o b t e n u : e x t r a i t G 25 (4 lo i s le v o l u m e in i t i a l ) es t acidifi6 h pH 6,2 ( + CH~COOH-M), p u t s pas s6 s u r u n e co lonne (H : 16 cm, d i a m 6 t r e : %5 cm) de CM 8 e p h a d e x C 50 p r 6 e d d e m m e n t gonfl6 e t dqu i l ib r6 h ce m 6 m e pH. On o b t i e n t a i n s i u n e x t r a i t CM C 50, r e n f e r m a n t u n e f a ib l e t e n e u r en h 6 m o g l o b i n e .

Chrornatographie d 'exc lus ion-d i f fus ion sur Biogel A 0,5 m. Les p r o t d i n e s de l ' e x t r a i t CM C 50 son t p rdc ip i tdes

a u s u l f a t e d ' a m m o n i u m (70 p. cen t de s a t u r a t i o n en sel) , i so l6es p a r c e n t r i f u g a t i o n p u i s r e m i s e s en so lu - t i on d a n s u n v o l u m e m i n i m u m de t a m p o n B. A ins i 300 m g e n v i r o n de p r o t 6 i n e s (soi t la m o i t i 6 de l ' e x t r a i t CM C 50) s o n t d~posds s u r la co l onne (H : 92 em, d i a m 6 t r e 2,5 cm) . L '61ut ion es t r6a l i s~e avcc | e t a m p o n B avec u n e v i t e s s e d ' 6 c o u l e m e n t de 10,2 m I / h e u r c / c m 2 .

Chromatographie sur Biogel P 100. De mSme , ap rbs p r 6 c i p i t a t i o n a u s u l f a t e d ' a m m o -

n i u m et r e d i s s o l u t i o n d a n s le m i n i m u m de t a m p o n B, les p ro td ines (20 m g e n v i r o n ) i so l6es de l a p r6c6den te 6 tape s o n t d6pos6es s u r l a co l onne de gel (H : 88 cm, d i a m 6 t r e : 2,5 cm) . La c h r o m a t o g r a p h i e es t d6ve lop- p6e s o u s u n e p r e s s i o n m a x i m a l e de 45 cm d ' e a u (d6bit a s s u r 6 6,5 ml /heure /cm2) .

R E S U L T A T S .

Bilan des di f fdrentes dtapes de la pur i f ica t ion de la COMT du placenta h u m a i n ( t a b l e a u I).

Instabi l i td de la COMT placentaire. Sur Ies e x t r a i t s S et CM C 50 o b t e n u s ap r6s pur i f i -

c a t i o n de l ' e n z y m e , en l ' a b s e n c e de t o u t c o n s e r v a t e u r , n o u s a v o n s 6 tud i6 la s t ab i l i t 6 de ]a COMT conse rv6e h 4 ° . La d u r 6 e de d e m i - v i e es t de 10 h e u r e s p o u r l ' e x t r a i t S et de 18 h e u r e s e n v i r o n ~pour l ' e x t r a i t CM C 5.0. P a r c o n t r e ce d e r n i e r e x t r a i t , u n e fo i s l y o p h i - l is6 et conse rv6 h - - 2 0 °, s e m b l e s tab le , p u i s q u ' i l f a u t 9 m o i s e n v i r o n p o u r que l ' e n z y m e pc rde 50 p. c en t de son ac t iv i t6 in i t i a%.

Recherche d'un agent s tabil isant . Subs tra ts de la rdaction enzymat ique .

L '~ tude de la p r o t e c t i o n de l ' e n z y m e p a r ]es diff6- r e n t s c o n s t i t u a n t s de la r 6ac t i on e n z y m a t i q u e , et s e lon t o u t e s les c o m b i n a i s o n s pos s ib l e s , a 6t6 f a i t e s u r u n e x t r a i t S rda l i s6 a v e r du t a m p o n p h o s p h a t e 0,5 M pH 7,4.

La c o m b i n a i s o n des d e u x s u b s t r a t s avec l ' i on act i - v a t e u r p r 6 s e n t e le m e i l l e u r p o u v o i r p ro t ee t eu r . Le CP r e t a r d e 16g~rement la d 6 n a t u r a t i o n , q u a n t h l a SAM et a u Mg2~, e m p l o y ~ e n s e m b l e ou s 6 p a r 6 m e n t , l e u r p re - sence s ' av6 re n6 fas t e .

Le saccharose.

N o u s a v o n s no t6 l ' i n t e r f 6 r e n c c d u s a c c h a r o s e d a n s le dosag.c de l ' a c t iv i td COMT et 6 tab l i l es c o r r e c t i o n s qu i s ' im .posa ien t . N 6 a n m o i n s r o u t e s les exp6 r i ences r6a l i s6es s o n t en f a v e u r d ' u n p o u v o i r p r o t e c t e u r de ce d ios ide .

Poin t isodlectrique.

La t e c h n i q u e d ' 61ec t ro foca l i s a t i on n o u s a p e r m i s de d 6 t c r m i n e r le p o i n t i so61eet r ique de l ' e n z y m e . Aprbs d6coupage d u gel en u n e v ing ta ine , de b a n d e s , la

TABLEAU I.

Puri f ica t ion de la COMT placentaire : t aux de puri f icat ion, dtude de rendement .

Etapes considdr~es

S u r n a g e a n t de cen t r i fuga t ion ( E x t r a i t S)

P r6c ip i t a t ion an (NH4)o_ SO 4 40-: 55 p. cen t -J- p a s s a g e su r Sepha- dex G 25 (ex t ra i t G 25)

CM S e p h a d e x C 50 (colonne) ex- t r a i t (CM C 50)

Taux de protdines

m g / m l

35 ,25

8 , 3 0

Hb p. cent / taux de prot6ines

totales

4 6 , 2

18 ,8

Activitd spdcifique m U / m g

de prot~ines

0 ,019

0 ,078

Taux de

purification

3 , 9

Rendement de

}'6tape

100

34 ,6

Rendement l 'extrai t

S

100

3 4 , 6

3 ,18 4 , 0 0 ,125 6 , 3 69 ,1 2 3 , 9

B i o g d A 0 , 5 m (ex t r a i t Biogel 0 , 5 m ) 0 ,29 < 4 , 0 1 ,055 53 69 ,4 16 ,6

Blogel P 100 (ex t ra i t P 100) 0 , 05 < ~ 4 , 0 4 , 3 5 0 218 8 0 , 8 13 ,4

L ' h 6 m o g l o b i n e (Hb) e s t e x p r i m 6 e en p. c en t p a r r a p p o r t a u x p r o t d i n e s t o t a l e s [r6f. 17], E n t r e p a r e n - t h 6 s e s : la d d s i g n a t i o n de l ' e x t r a i t .

La COMT p~acen ta i re a 6t6 o b t e n u e pur i f i6e 200 fo i s e n v i r o n , p a r r a p p o r t a u s u r n a g e a n t de c e n t r i f u g a t i o n et avec u n r e n d e m e n t de l ' o rd r e de 10 p. cent . De p lus , l ' ~ l e c t r o f o c a l i s a t i o n p r a t i q u 6 e s u r les d i f f6 ren t s e x t r a i t s o b t e n u s ap r6s c h a q u e 6 tape et a m e n d s / t u n taux de p r o t 6 i n e s c o n s t a n t (3,6 m g / m ] ) p e r m e t de j u g e r de l eu r s 5 ta t s de pure t6 .

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

m e s u r e du pH ap rbs h o m o g 6 n d l s a t i o n p e r m e t de t r a c e r la c o u r b e de pH = f ( d i s t a n e e / h l ' anode ) . La COMT p l a c e n t a i r e es t foca l i sde a u pH~ = 5,0.

Poids mol~culaire (f igure 1).

Cette d d t e r m i n a t i o n a dr6 effectude e n u t i l i s a n t la m d t h o d e de f i l t r a t i on s u r gel El7]. La eo lonne de gel

Pm'ification de la catdchol-O-mdthyltransfdrase (EC. 2.1.1.6). 1403

est p r 6 a l a b l e m e n t 6 t a l onn4e avec 6 p r o t 6 i n e s p u r e s et V,.

de po ids m o l 6 c u l a i r e d6fini. La r e l a t i o n ~ o = f (log

poids mo l6cu l a i r e ) p e r m e t d ' a t t r i b u e r h la COMT du p l a c e n t a h u m a i n le po ids m o l 6 e u l a i r e de 49 000 da l - tons .

Volume d" dlut ion re la t i f Ve/ Vo .2.5

LYSOZYME

MYOGLOBINE

• 2 0 ~ i l e s l ~ E . . . . . . . . . . . . . . . -o---,~. COMT

= ~HEMOG£OBINE

1,5 L , 4 T , 4 Z A S e

THYRoGLOBULINE

t o

' ' & . . . . ~ . . . . . . . . . 5 , o . , o ~

Poids mol~culaire.

Fro. 1. - - Ddtermination du poids moldculaire de la COMT du placenta humain.

C h r o m a t o g r a p h i e d e s c e n d a n t e su r Biogel A 1,5 m - 5 0 - 1 0 0 m e s h (98 × 2,5 em) K ~ = 0,59.

T h y r o g l o b u l i n e (6,5.10~) - - Ga t a l a se (2,3.105) - - H 6 m o g l o b i n e (6,5.104) - - P e p s i n e (3,5.104). T a m p o n d '61ul ion : B + s a c c h a r o s e 0,5 M, pH = 7,4 - - v i t e s se d ' 6 c o u l e m e n t : 5,7 m l / h / c m 2 - - Ve : v o l u m e d '61ut ion de la p ro t6 ine - - V o : v o l u m e m o r t de la co lonne (184 ml ) .

DISCUSSION.

L ' 6 tude de l ' ae t iv i t6 r6 s idne l l e de l ' e x t r a i t S e n fonc - t i on d~ t e m p s a m i s en 6v idence q u ' a p r 6 s 10 h e u r e s de c o n s e r v a t i o n h 4°C, il n e r e s t a i t p l u s qt~e 50 p. c en t de l ' ac t iv i t6 COMT in i t i a l e . Ce r 6 s u l t a t s o u l i g n e l ' i n s t a - b i l i t6 de la COMT du p l a c e n t a h u m a i n c o m p a r a t i v e - m e n t h cel le d u r e i n [18] p a r e x e m p l e . Les s u b s t r a t s s t a b i l i s e n t l ' e n z y m e darts la m e s u r e off i ls f i gu ren t s i m u l t a n 6 m e n t d a n s le m i l i e u et en p r6sence de Mg *+. Le s a e c h a r o s e poss6de u n b o n p o u v o i r c o n s e r v a t e u r qu i s e m b l e li6 h sa c o n c e n t r a t i o n d a n s le m i l i eu . P o u r e x p l i q u e r cet te p r o t e c t i o n on p e u t p e n s e r h u n e m o d i - f ica t ion du s o l v a n t a q u e u x , h m o i n s q u ' i l n e se f o r m e u n c o m p l e x e p r o t 6 i n e - s u c r e , e o m m e le p ropose Yon [19] p o u r le eas de ia ~ l a c t o g i o b u l i n e . Sur le p l a n p r a t i q u e ces d e u x pos s i b i l i t 6 s f u r e n t en f a i l d ' u n emp lo i diffiei le. E n effe t ]a SA'M et le CP a b s o r b e n t 260-280 n m , ce qu i r e n d la d6 tec t ion UV des p r o t 6 i n e s p r e s q u e i m p o s s i b l e . P o u r ce t te m 6 m e r a i s o n le dosage

des p r o t 6 i n e s p a r la m 6 t h o d e de W a r b u r g es t d f l a i s s G a lo r s qne le CP i n t e r f b r e d a n s la m 6 t h o d e de Lo'wry. Q u a n t h la SAM elle se d6grade en m i l i e u 16g6rement b a s i q u e [8]. L ' i n t e r f 6 r e n c e du s a c c h a r o s e d a n s la m e - su r e de l ' ac t iv i t6 e n z y m a t i q u e es t f a c i l e m e n t s u r m o n - table . P a r cont re , h la c o n c e n t r a t i o n de 0,5 M il r a l e n t i t les f i l t r a t i ons s u r gel et r end diff ic i le la p r 6 c i p i t a t i o n des e x t r a i t s e n z y m a t i q u e s a u s u l f a t e d ' a m m o n i u m . C 'es t donc en p r6sence de m e r c a p t o 6 t h a n o l (10-3 M) que n o u s a v o n s pur i f i6 200 fo is e n v i r o n la COMT du p l a c e n t a h u m a i n .

Q u a n t a n po ids mo l6cu l a i r e , s eu le la COMT du p la - c en t a h u m a i n s e m b l e a v o i r u n po id s m o l 6 c u l a i r e d o u b l e de celui des a u t r e s COMT d6jh 6 tud i6es [18, 20, 21]. P o u r 61ucider ce t te q u e s t i o n , u n e 6 tude des s o u s - u n i t 6 s s e r a i t & e n v i s a g e r .

N o u s c o n c l u r o n s cet te c o n t r i b u t i o n h l ' 6 tude de la COMT p l a c e n t a i r e en p o s a n t la q u e s t i o n : qu i es t r e s p o n s a b l e de cet te ac t iv i t6 COMT ? Es t -ce le s a n g avec ses g lobu l e s r o u g e s ou le t i s s u p l a c e n t a i r e lu i - m 4 m e ? Sans a v o i r pu p e r f u s e r u n p l a c e n t a d a n s les p l u s b r e f s d61ais, les r 6 s u l t a t s de Gr i f f i ths et L i n k l a t e r [22] c h i f f r a n t l ' a c t iv i t6 COMT des g l o b u l e s r o u g e s du s a n g h u m a i n (20 h 58.10-4 U / m l de s a n g to ta l ) pe r - m e t t e n t de pense r , darts u n e p r e m i 6 r e a p p r o x i m a t i o n , que le t i s s u p l a c e n t a i r e es t dou6 d ' u n e ac t iv i t6 COMT i n t r i n s 6 q u e .

B IBLIOGRAPHIE .

1. Axe l rod , J. (1957) Science, !126, 400. 2. Axe l rod , J. a T h o m c h i c k , R. (1958) J. Biol. Chem.,

233 (1), 702-705. 3. P e y r i n , L. ~ Fav re , J. M. (1973) Lyon Pharmaceu-

tique, 24 (3), 303-340. 4. L i sa lo , E. a Cas t r en , O. (1967) Ann. Med. Exp.

Fenn., 45, 253. 5. Gugler , R., K n u p p e n , R. ~ Breue r , H. (1970) Bio-

chim. Biophys. Acta, 220, 10-21. 6. Pao lucc i , F. (1972) Th4se de D o e t o r a t 4s -Sc iences ,

Lyon . 7. Sch lenk , F., Zydek , C. R., E h i n g e r , D. J. ~ Da inko ,

J. L. (1965) EnzymoIogia, 29, 283-298. 8. Ha id , E. z~ N e l b o e c k - H o s c h s t e t t e , M. ( B o e h r i n g e r -

M a n n h e i m ) Ger. Often. 1,803,978 (C1. C. 07 d) 27 May 1970, App l 18 Oc t . 1968, 15 pp.

9. Baeyer , A. ~ K o c h e n d o r r e r , S. P. (1889) Ber., 22, 2199.

10. Colowiek, S. P. z, K a p l a n , N. O. (1955) Methods in Enzymology, Aead. P re s s . Vol. 1, 75-78.

I1. D e t e r m a n n , ~t. (I968) Gel Chromatography, S p r i n - ger Ver lag New-York .

12. A n d e r s o n , P. J. ~ D ' ior io , A. (1966) Can. J. of Bio- chem., 44, 347-354.

13. W a r b u r g , O. ~ C h r i s t i a n , "W. (1942) Biochem. Z., 3~10, 384.

14. Lowry , O. H., R o s e b r o u g h , N. J., Fa r r , A. L. R a n d a l l , R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265- 275.

15. Geiger , P. J. e~ B e s s m a n , S. P. (1972) Anal. Bio- chem., 49 (2), 467-473.

16. Ves te rbe rg , O. (1973) Science Tools, 20 (2-3), 22-28. 17. Pao lucc i , F., C r o n e n b e r g e r , L., P l a n , R. ~ Pach6co ,

H. (1971) Biochimie, 53, 735-749. 18. D a r m e n t o n , P., C r o n e n b e r g e r , L. ~ Pach~co , H.,

(19.76) Biochimie, 58, 1031-1045. 19. Yon, J. (1969) << Structure el dynamique conforma-

tionnel/e des protdines 7), 6d i t eu r H e r m a n n , Pa r i s .

20. Assicot , M. a B o h u o n , C. (1970) Eur. J. Biochem., 12 (3), 490-495.

21. W h i t e , H. L. & ~Vu, J. C. (1975) Biochem. J., 145, 135-143.

22. Gr i f f i ths , J. a L i n k l a t e r , H. (1972) Clin. Chim. Acia, 39, 383-389.

BIOCHIMIE, 1976, 58, I1 ° 11-12.