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Modifications chimiques et semi-synthèses des protéines
● 2 Cours– 16 septembre (10H-12H) et 18 septembre (10H-12H)
Présentations d'articles
● Lundi 29 septembre à 14 h– articles à récupérer sur le serveur Biointeractif :
● http://biologie.univ-mrs.fr/view-data.php?id=70● Utilisateur=***** mot de passe=****
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Introduction
● Génome humain : 30-40000 gènes– 70 à 90 % contiennent 1 ou plusieurs exons– Epissage alternatif des pre- mARNs
● Protéome : – Modifications post-traductionnelles
● ex: Phosphorylation : 1/3 des protéines des mammifères
Nbre astronomique de combinaisons de protéines
Modifications chimiques et semi-synthèses des protéines
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Introduction
● Inventaire ?– expression-modifications
● Tissu● Type cellulaire● Temps
– minute : transduction du signal– années : développement
– 10aines-100aines de milliers de type protéiques● Dans notre corps● Au cours d'une vie
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Comprendre ces modifications : échelle Protéomique ?
● Très long terme● But (influence sur les fonctions) très stimulant
– Essor de nouvelles technologies– En provenance des domaines d'investigation les plus
dynamique● Protéomique● Bioinformatique● Génomique structurale● Et Chimie Biologique
=> Champs d'action largement multidisciplinaires
Introduction
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La chimie et l'étude des processus biologiques
● Compréhension des fonction propre– Ex : catalyse enzymatique
● Maîtrise des fonctions pour des application non-biologiques– Ex : réactions de catalyse non physiologique
Introduction
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Voies de préparation non Ribosomal
● Protéine avec résidus non naturels ou modifiés● Protéine avec modification post-traductionnelle
Purification à homogénéité très difficile– Ex PDB : 20000 structure / 150 avec 1 phosphorylation– Moins encore avec lipidation/glycosylation
Introduction
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Besoins de protéines spécifiquement marquées
● Utilisation de méthode d'ingénierie des protéines– Technique classique de marquage in vitro– Mutagenèse à suppression de non sens / frame shift– Ligation des Proteines Exprimées (EPL)
● Les 2 dernières approches:– Élimination de la plupart des difficultés propres au marquage– Interdisciplinarité Chimie-Biologie
Combinaison de la puissance de la synthèse organique et des technologies de l'ADN recombinant
Introduction
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Non-sens suppression mutagenesis
● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon ambre– Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement
par l'Aa non naturel– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in
vitro
Mutagenèse à suppression de non sens
Synthèse in vitro de la protéine modifiée
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Non-sens suppression mutagenesis
● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon ambre– UAG, codon stop le moins utilisé– Souches Coli avec des mutations suppresseurs naturelle
n'empêchent pas la croissance (t-RNAsynthase mutée)
Mutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon
ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus
Mutagenèse à suppression de non sens
Synthèse in vivo de la protéine modifiée
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Non-sens suppression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon
ambre (UAG) – Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement
par l'Aa non naturel– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in
vitro
Mutagenèse à suppression de non sens
Améliorations
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Non-sens suppression mutagenesis● Codon frameshift (codons à 4 bases)
– Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement par l'Aa non naturel
Mutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon
ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus
● ex :
Mutagenèse à suppression de non sens
Synthèse in vivo de la protéine modifiée
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Non-sens suppression mutagenesis
● Difficultés– Préparation (chimie )
– Adressage du tRNA préchargé● Solution : E. coli modifiée
– Système de traduction natif– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des
Aa non naturels Science. 2001 Apr 20;292(5516):498-500.
Mutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesis
● Solution : E. coli modifiée– Système de traduction natif– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des
Aa non naturels– Stratégies d'évolution dirigée : génération d'un nouveau t-RNA
Mutagenèse à suppression de non sens
N'est reconnu que par la tRNAsyntase de M. jannaschii
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Non-sens suppression mutagenesis
● Solution : E. coli modifiée– Système de traduction natif– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des
Aa non naturels– Stratégies d'évolution dirigée :
● génération d'un nouveau t-RNA● permettre le chargement d'autres résidus
Mutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesis● Solution : E. coli modifiée
● permettre le chargement d'autres résidus
Mutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesis
● Solution : E. coli modifiée● permettre le chargement d'autres résidus
Mutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesisMutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesisMutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesisMutagenèse à suppression de non sens
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Non-sens suppression mutagenesisMutagenèse à suppression de non sens
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Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids
Mutagenèse à suppression de non sens
● Approches in vitro.– Screening : tRNA + tRNA synthétase + spectro de masse – Quelles molécules chargeables ?
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Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids
Mutagenèse à suppression de non sens
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Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids
Mutagenèse à suppression de non sens
Très grosse diversité ...
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Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesMutagenèse à suppression de non sens
● Approches in vitro.– Chargement chimique des AAnon naturels– selon un code génétique modifié
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Expressed Protein Ligation
● Résumé : Liaisons entre differents segments/blocs– Synthétiques– Recombinants– Recupération d'un produit avec des propriété inédite
● Principe énoncé in vitro– Retrouvé in vivo (intéines)– Incorporation de 'velcros moléculaires' chimiques à l'extrémité
des fragments
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Expressed Protein Ligation
● INTRODUCTION
● ORIGINS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION
– Protein Semisynthesis
– Chemical Ligation of Unprotected Peptides
– Native Chemical Ligation
– Protein Splicing and Trans-Splicing
– Expressed Protein Ligation
● MISE EN PRATIQUE DE l'EPL
– Résumé
– Production des fragments
– Un kit commercial
● APPLICATIONS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION
– Introduction of Fluorescent Probes
– Introduction of Posttranslational Modifications
– Introduction of Stable Isotopes.
– Introduction of Unnatural Amino Acids
– Topology Engineering of Proteins
● FUTURE OUTLOOK AND SUMMARY
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Manipulations Chimiques des Protéines
● Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation. Annu Rev Biochem. 2003;72:249-89. TW Muir– Expressed protein ligation. Eur. J. Biochem 2004;271:663-77
R David, MPO Ritcher AG Beck-Sickinger– Manipulating proteins with chemistry: a cross-section of
chemical biology Trends Biochem Sci. 2005;30,26-34 ME Hahn and TW Muir
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Développement de la ligation des Protéines Exprimées « EPL »
●Semi-synthèse des protéines●Ligation Chimique des peptides non-protégés●Ligation Chimique Native (NCL)●Epissage des protéines et Trans-épissage●Ligation des Protéines Exprimées (EPL)
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Semi-synthèse des protéines● Historiquement :
– Blocs : fragments de protéines (clivage)● Clivage Chimique (CNBr)● Clivage Protéolytique
● Obervation ancienne (Dyckes Nature 1974)
– Clivage chimique (CNBr) : Pancreatic Trypsine inhibitor / Cytochrome c
– Repliement coopératif– Proximité des extrémités : Homosérine lactone /Amine Term Libre
– Réaction chimique spontanée, recondensation spontanée, liaison native
● => Incorporation d'Aa non naturels dans le cytochrome C– (Wallace Biochemistry 1997)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
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Semi-synthèse des protéinesSemi-synthese : Tout processus spécifique de modification d'une
protéine naturelle (# bioconjugaison : pas suffisamment spécifique)
● I - Marquages : modérément à hautement spécifique
– Exemples 1● Introduction d'une Cys (Mutagenèse standard)● Dérivation du thiol / réactif – sonde chimique
– Incorporation d'un « Cross linker photoactivable– Inc. Fluorophores– Préparation d'enzymes «photocagées »– Optimisation de l'affinité de la Maltose Binding Protéin
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
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Semi-synthèse des protéines● I -Marquages : modérement à hautement spécifique
– Exemples 1– Exemple 2
● Marquage modérément spécifique de l'amine Nterm vs amines Lys/Arg– 'pKa différents– Réaction d'un groupement activé sous condition légerement acide (Wetzel
Bioconjugate Chem. 1990)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
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Semi-synthèse des protéines● I -Marquages :
– Exemple 3 (Zou JACS 2002)
● ATPγS + Enzyme kinase (Thr197-ThioPhosphate)
● S-alkylation du ThioPhosphate (4-hydroxyphenacyl bromide)
Version photocagée de la kinase A– Liberation par UV
– Cofilin (mobilité cellulaire) Ghosh 2002, 2004 JACS
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
HO
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Semi-synthèse des protéines● II - Stratégie de Protéolyse inverse :
– Enz protéolytique– Altération des conditions de réaction : favoriser l'aminolyse vs hydrolyse
– Hte C° de solvant organique : Glycérol, DMF, Acétonitryl
– Blocage de l'intermédiaire peptyl-Enz– Aminolyse avec Pep2 – Résultats probants : Subtilisine, Trypsine, Papaïne
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
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Semi-synthèse des protéines● II - Stratégie de Protéolyse inverse :
– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B (Witte K, JACS 1997)
● Réac enz. Oligosaccaride / ligation peptidique Introduction de l'oligosaccaride Sialyl Lewis X/ 1 site spécifique
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
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Semi-synthèse des protéines● II - Stratégie de Protéolyse inverse :
– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B
– Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin (Borodovski EMBO J 2001)
● Approche Chimio-Enz.● Estérification médiée/ Trypsine
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
hydrazine
Ac Nitreuxglycine vinyl sulfone
(20 %PEG 20000)
![Page 38: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/38.jpg)
Semi-synthèse des protéines● II - Stratégie de Protéolyse inverse :
– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B
– Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin (Borodovski EMBO J 2001)
● Approche Chimo-Enz.● Estérification médiée/ TrypsineCaractérisation d'enzymes impliquée dans l'ubiquitination
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
(20 %PEG 20000)
Table 1: Deubiquitylating enzymes of S.cerevisiaeGene Mol. wt (kDa) UbVS labeling CharacterizationUbp1 93 ++ known UbpUbp2 146 ++ known UbpUbp3 110 - known UbpUbp4/Doa4 105 - known UbpUbp5 92 - known UbpUbp6 57 ++ known UbpUbp7 123 - putativeUbp8 54 - putativeUbp9 86 - putativeUbp10/Dot4 88 - known UbpUbp11 83 - known UbpUbp12 143 + putativeUbp13 77 ND putativeUbp14 91 - known UbpUbp15 143 ++ known UbpUbp16 57 ND putativeYuh1 26 ++ known Uch
I125
![Page 39: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/39.jpg)
Semi-synthèse des protéines● III - Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi-
synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytique
● Exemple Historique (Nakatsuka JACS 1987) : la trypsine– Ser (triade catalytique) -> Cys– Activité d'acétylation +++
● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »– Ser->Cys : Acétylation de l'Enz / substrat Pep1-Cterm-Phenylalanylglycolate– Pro->Ala : suppression de l'encombrement stérique local : aminolyse efficace par
Nterm- Pep2– Reconstitution de Pep1-Pep2– Synthèse chimique de protéines entières – Prep de pep cycliques– Prep de protéines semi-synthetiques ...
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 40: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/40.jpg)
Semi-synthèse des protéines● III - Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi-
synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytiques
● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
● 6 peptides de synthese 12 à 30 résidus
Protection-Déprotection
Synthèse totale de la Ribonucléase A + variants avec résidu(s) catalytique 4-fluorohistidine (153 Aa).
Décalage de l'activité vers les pH acide (4 vs 7)
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Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Réaction de type hydrazone-oxime
● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating
Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)– VALIDATION– Mutagénèse : insertion d'une séquence unique -Lys-Ser-– Protéolyse spécifique– Oxidation périodique du N-term Frag2 en aldéhyde– Formation d'un hydrazide C-term Fragm1 par protéolyse inverse– Mélange Frag1 et Frag2 : religation en protéine native – EXTENTION– Définition d'un fragment central– Remplacé par un pep de synthèse : « synthetic cassette mutagenesis »
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
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Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Réaction type hydrazone-oxime
● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating
Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Aldéhyde : réaction d'oxidation periodique
Fragment : digestion spécifique -K-S- par protease de Achromobacter
![Page 43: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/43.jpg)
Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Réaction type hydrazone-oxime
● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating
Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Insert
Hydrazide : réaction enzymatique (protease de Achromobacter)
![Page 44: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/44.jpg)
Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Réaction type hydrazone-oxime
● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating
Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Insert
(Augmentation de la flexibilité)
(hydrazone)
![Page 45: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/45.jpg)
Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Réaction type hydrazone-oxime
● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating
Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Insert
![Page 46: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/46.jpg)
Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Réaction type hydrazone-oxime
● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating
Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
+
Insert
![Page 47: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/47.jpg)
Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 48: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/48.jpg)
Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse
enzymatique– Extension à d'autres réactions basées sur les oximes– Incorporation de résidus non naturels (Simmons Science 1997)
● Exemple : Inhibiteur potentiel du HIV-1– Cible : β-Chemokine RANTES– ligand du corécepteur CCR-5 de HIV-1– RANTES : inhibiteur compétitif de l'infection par HIV-1 in vitro– RANTES : très pro-inflamatoire– Couplage de l'AminoOxyPentane sur RANTES-N-term (oxidation periodique
->Ser Nterm : groupe glyoxyl)– AOP-RANTES :
● inhibiteur sur Cell. Immunitaires● Pas d'effet inflamatoire
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
O-NH2
![Page 49: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/49.jpg)
Semi-synthèse des protéines● Approches pour la synthèse chimique totale des protéines
– Utilisation de blocs non protégés (synthétiques) puis ligations● Exemple historique : synthèse totale de la HIV-1 Protéase (Schnölzer 1992
Sciences)
– 2 x 50 résidus ( syntétiques)– Liaison thioester : solution aqueuse, pH 7
● Autres Chimie :– Thioether (1994)– oxime/hydrazone (1992-1994)– Thiazolidine (1994)– Dérivé amide (1994-2000)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 50: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/50.jpg)
Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Mécanisme 1 bimoléculaire (optimisation de la réactivité)– Mécanisme 2 réarangement monomoléculaire
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 51: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/51.jpg)
Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Kemp «prior thiol capture» (Kemp J Org Chem 1993)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
4-hydroxy-6-mercaptodibenzofuran
Cys protégée
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Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Kemp «prior thiol capture» (Kemp J Org Chem 1993)
● Temps de transfert (t1/2) : 0,1 à 50 h● Pas de racémisation
– Cterm BPTI (29 résidus – 4 blocs, sans protection)– 39 résidus et 25 résidus -synthèse à haut rendement)-1993-
– Ligation totalement native (Dawson 1994 science)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 53: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/53.jpg)
Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Kemp «prior thiol capture»– Ligation totalement native (Dawson 1994 science)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
N-terminal Cys
C-terminal α-thioesther● Améliorations
– Nterm # cys– Cofacteur thiol catalitique– Solution et phase solide– Ligation séquentielle
Énormément de développement ...
![Page 54: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/54.jpg)
Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Kemp «prior thiol capture» – Ligation totalement native (Dawson 1994 science)
● Ex de protéines complètes– human matrix Gla protein (84 residues) (Hackeng Protein Science 2001)
– anticoagulant microprotein S (116 residues) (Hackeng PNAS 2000)
– human neutrophil pro α-defensin-1 (75 residues) (Wu J Pept Res
2003).● Protéines avec modifications post-traductionnelles
– glycoproteins diptericin (58 residues) (Shin JACS 1999) – lymphotactin (93 residues) (Marcaurelle Chem Eur J 2001). – La proteine prion avec un mimétique de
glycosylphosphatidylinositol (Ball J Pep Res 2001).
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 55: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/55.jpg)
Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Kemp «prior thiol capture» )
– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications post-traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)
– Le protooncogène H-Ras (166 residus) avec un Ras-binding domain (81 residus) + incorporation d'une étiquette fluorescente => suivi de l'interaction (Becker Chem Biol 2001, PNAS 2003).
– Une protéine d'erythropoïèse modifiée par un polyéthylène glycol(166 residues) (Kochendoerfer Science 2003)
● Prolongation de demi-vie , ● Amélioration de l'activité biologique
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 56: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/56.jpg)
Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Kemp «prior thiol capture» – Ligation totalement native
● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications post-traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)● Crambin (46 résidu) (Bang Angew Chem Int 2004)
– En 1 pot– 3 peptides séquentiellement– Pas de purification intermédiaire– Haut rendement– Repliement dans le mélange de réaction– Native
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 57: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/57.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● Formation d'une véritable liaison peptidique
– Idem : Ligation totalement native (Dawson 1994 science)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Protéine recombinante avec Cys en Nterm
+
Peptide de synthèse comprenant l'α-thioesther
Peut-ont obtenir l'α-thioesther par protéine recombinate ?
=> Oui, grâce aux intéines ...
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Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique (Paulus Annu Rev Biochem 2000)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Modification postraductionnelle naturelle (description : cooper EMBO J 1993)
– 444 intéines (02/08) (http://www.neb.com/neb/inteins.html)
● Eukarya (Levures, Algues, champignons)
● Eubacteria, Archaea– Pas de contraintes de séquence sur les
Exteine sauf ...
– Motifs conservés dans les Inteines
! Présence d'une Cys à la jonction des Extéines(ou S ou T ...)
![Page 59: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/59.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Motifs concervés dans les Inteines
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Intein Block C Block D Block E Block H Consensus LhG..hhaG .K.IP..h .L.GhFahDG p.S..hh..h..LL..hGI
![Page 60: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/60.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
succinimide
![Page 61: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/61.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Thermodynamiquement défavorable● Torsion de liaison peptidique induit
par la stucture 3D
![Page 62: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/62.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme
– Transfert de la C-Exteine
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
Intermédiaire branché
![Page 63: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/63.jpg)
succinimide
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme
– Réaction de cyclisation (Asn conservée en Cterm de l'Intéine)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
(i) Excision de l'intéine (succinimide)(ii) Formation de la liaison peptidique Même réaction chimique que dans la
Ligation Chimique Native (S->N acyl transfert)
![Page 64: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/64.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : construction recombinante ● Extéine N-term : séquence protéique d'intérêt● Extéine C-term pour une chromato d'affinité● Une mutation de l'Asn conservée -> Ala de l'intéine
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
![Page 65: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/65.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● mutation de l'Asn conservée de l'intéine :
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Blocage à la première étape ...– Substitution de la cyclisation
monomoléculaire par une Thiolyse bimoléculaire (ajout d'un thiol en eccès)
=> Préparation d'un dérivé α-thioesterOK pour ligation chimique natives
+ peptide synthétiqueProduit semi-synthétique
![Page 66: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/66.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● Trans-epissage :
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Intéine en 2 morceaux inactifs– Reconstitution intéine active
● Affinity tag sur l'intéine découpé● Synthèse chimique d'un morceau ● Splicing in vivo (2 prot
recombinantes)● Dénaturation-renaturation des 2
nécessaire in vitro ...● ... non ! Intéine DnaE (Synechocytis)
naturellement en 2 morceaux– Plus de dénaturation
Purification
Reconstitution
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Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● Trans-epissage :
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Intéine en 2 morceaux inactifs● Génération de Prot semisynt.
(Lew J Mol Biol 1998)● Marquage isotopique dans des
segments spécifiques (RMN) (Yamasaki JACS 1998; Xu PNAS 1999; Otomo Biochemistry 1999; Romanelli PNAS 2004)
● Interaction in vivo (Paulmurugan PNAS 2002; Kim PNAS 2004; Yang PNAS 2003; Chin PNAS 2003)
![Page 68: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/68.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● Application récente :
– Formation de puces à protéines (Tan Bioor Med Chem Lett 2004; Lue Methods Mol Biol 2004; Sydor Bioconj Chem 2002; Sun Biotechniques 2004)
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
=> Epitope scanning, kinase assays : sensibilité de la puce x 10000
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Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique● Applications récentes :
– Imagerie cellulaire (Kim PNAS 2004)
– Système de screening in vitro :● Intéine + GFP (Gangopadhyay Anal chem 2003)
– Plantes transgéniques (Chin PNAS 2003) : ● résistance au Glyphosphate (herbicide)
● splitting entre noyaux et chloroplaste
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
=> Pas de transmission du gène fonctionnel au pollen
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Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● Applications récentes :
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Processing normal
– Complémentation induite
– Self complémentation (mutant sans processing)
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Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● Applications récentes : Molecular switches
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)
– Ligand (rapamycin) induces trans-splicing (Mootz JACS 2003)
– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)
![Page 72: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/72.jpg)
Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique
– Exploitation Biotechnologique : ● Applications récentes : Molecular switches
Développement de la ligation des Protéines Exprimées
– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)
– Ligand (rapamycin) induces trans-splicing (Mootz JACS 2003)
– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)
![Page 73: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/73.jpg)
Expressed Protein Ligation (EPL)
● INTRODUCTION
● ORIGINS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION
– Protein Semisynthesis
– Chemical Ligation of Unprotected Peptides
– Native Chemical Ligation
– Expressed Protein Ligation
– Protein Splicing and Trans-Splicing
● MISE EN PRATIQUE DE l'EPL
– Résumé
– Production des fragments
– Un kit commercial
● APPLICATIONS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION
– Introduction of Fluorescent Probes
– Introduction of Posttranslational Modifications
– Introduction of Stable Isotopes.
– Introduction of Unnatural Amino Acids
– Topology Engineering of Proteins
● FUTURE OUTLOOK AND SUMMARY
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RésuméMise en pratique de l'EPL
●Prot recombinante Cys N-term + Pep de synthèse α thio-Esther
ProtéineCys-Peptide-COSR
●Prot recombinante α thio-Esther + Pep de synthèse Cys Nterm
Cys-Peptide
●Pep de synthèse Cys N-term + Pep de synthèse α thio-Esther
●Prot recombinante α thio-Esther + Prot recombinane Cys Nterm
Peptide-COSR
Protéine -COSR Cys-Peptide
ProtéineCys-Protéine -COSR
- Synthèse chimique totale100 aA/bloc)
- In vitro ou in vivo
- Introduction de propriétés non natives / 100 aA C-term
- Introduction de propriétés non natives / 100 aA N-term
![Page 75: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/75.jpg)
Autres possibilitésMise en pratique de l'EPL
ProtéineCys-Protéine -COSR Cys-Peptide-COSR
-COSR Cys-
RSOC--Cys
● Stratégie d'EPL séquentielle– Insertion
– Cyclisation
– ...=> Production des fragments + ligation
(in vitro ou in vivo)
![Page 76: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/76.jpg)
Production des fragments (protéines recombinantes)● Passage de l'extrait cellulaire sur la colonne d'affinité● Formation du dérivé α-thioesther :
– Petites molécules nucléophiles– Pénétration de la poche catalytique– Stabilité du α -thioester– Réactivité suffisante pour la ligation
● Alkyl-thioester stable mais peu réactif● Additifs Alkylthiols + thiophenol● Acide 2-mercaptoethansulfonique (MESNA)
Mise en pratique de l'EPL
![Page 77: Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin](https://reader034.vdocuments.fr/reader034/viewer/2022042410/5f288e1f1b0f4c19d0344cdc/html5/thumbnails/77.jpg)
Production des fragments (protéines recombinantes)
● Production de la Cys N-term– Expression directe avec Met-Cys-Prot
● Met aminopeptidase (mauvais rendements– Protéolyse
● Facteur Xa (Cterm de Ile-Glu-Gly-Arg, Ile-Asp-Gly-Arg et Ala-Glu-Gly-Arg. )
● TEV (protéase du tobacco etch virus Glu-X-X-Tyr-X-Gln- -Ser/Cys.)
– Intéines modifiées autoclivables● pH-température● Risque de clivages intempestifs ...
Mise en pratique de l'EPL
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Un kit commercial● Le système IMPACT® (New England Biolabs)
Mise en pratique de l'EPL
– Basé sur une intéine mutante (Asn/Gln->Ala)
● pas d'autocatalyse● Scission induite (Thioysel)● Production de l'α-thioester ou de
la Cys therminal– Vecteurs
– Colonne de Chitine