Probiotiques et barrière intestinale:

Mécanismes d’action

Theodorou Vassilia, PhDTheodorou Vassilia, PhD

Unité de Neuro-Gastroentérologie et Nutrition (NGN)Unité de Neuro-Gastroentérologie et Nutrition (NGN)

UMR 1054 INRA/EI-PurpanUMR 1054 INRA/EI-Purpan

vtheodor@toulouse.inra.fr

Elie Metchnikoff (1845-1916)

Longévité des populations caucasiennes et consommation des produits fermentés (bactéries lactiques)…..

Un certain début de l’histoire…

Probiotiques: définitions

« Probiotiques » terme proposé par Lilly et Stillwell (Science, 1965) : substances secrétées par un micro-organisme stimulant la croissance d’un autre.

Micro-organismes et substances issues de micro-organismes contribuant à l’équilibre de la microflore intestinale (Parker et al., 1974).

« Micro-organismes vivants exerçant un effet bénéfique vis-à-vis de l’hôte par maintien de l’équilibre de la microflore intestinale (Fuller et al., 1989).

«  Micro-organismes vivants qui, ingérés en quantité suffisante exercent un effet positif sur la santé (FAO/WHO)

Probiotiques entité en évolution :

De l’ingrédient d’aliment fonctionnel vers l’agent bio thérapeutique…

Bactéries

Levures

• Lactobacilles (différentes souches )• Bifidobactéries…..E. Coli non-pathogène (E. Coli Nissle 1917)Enterocoques

• Saccharomyces boulardii

Qui sont-ils?

microbiote

mucus

épithélium

GALTSNE

La barrière intestinale

Microbiotelumière

Barrière intestinale

Immuno-modulation

probiotiques

Probiotiques: comment agissent-ils?

Probiotiques et pathologies gastro-intestinales

• Intolérance au lactose

• Gastroentérites infectieuses

• Diarrhée associée à l’antibiothérapie

• Maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)

• Syndrome de l’intestin irritable (IBS)

- Changements du milieu intraluminal (flore, proteases…)

- Reponse immune au microbiote inappropriée

- Barrière intestinale altérée

- Changements du milieu intraluminal (flore, proteases…)

- Activation immune locale et systémique

- Barrière intestinale altérée

Probiotiques / MICI / IBS: rationnel d’utilisation

MICI

(inflammation)

IBS

(micro-inflammation)

Changements qualitatifs et quantitatifs de la microflore

↓du nombre de bifidobactéries et lactobacilles

Favier et al., 1997 ; Balsari et al., 1982 ; Malinen et al., 2005 ; Matto et al., 2005)

MICI

(inflammation)

IBS

(micro-inflammation)

Intraluminal serine-proteases changes

Roka et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2007

Critical features of the mucosal immune response in normal vs Crohn disease intestine

Strober et al., JCI 2007

Plasma cytokine levels changes in IBS

Dinan et al., Gastroenterology 2006

Crohn and Ileo-Colonic paracellular permeability

SSööderholm et al. Gut 2002derholm et al. Gut 2002

Su

bje

c ts

(%)

Su

bj e

cts

(%)

00

2020

4040

6060

8080

100100

Control (n=86)Control (n=86)

IBS (n=132)IBS (n=132)

**

Su

bje

c ts

(%)

Su

bj e

cts

(%)

Lactulose-Mannitol ratioLactulose-Mannitol ratio

> 0.02> 0.02

All subjects Rome IAll subjects Rome I

00

2020

4040

6060

8080

100100

No IBS (n=43)No IBS (n=43)

IBS (n=67)IBS (n=67)

**

Lactulose-Mannitol ratioLactulose-Mannitol ratio

> 0.02> 0.02

Post-infectionPost-infection(acute diarrhea)(acute diarrhea)

IBS and increased gut permeability

Marshall et al. Gastroenterology 2006Marshall et al. Gastroenterology 2006

Probiotiques et mécanismes d’action:

1) Interactions avec des pathogènes et des facteurs endoluminaux

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 1999

Probiotiques/pathogènes

Expression du peptide antimicrobien human beta-defensin-2 (hBD-2)

Caco-2 hBD-2NF-kB, AP-1

E.coli Nissle 1917

L. paracasei, L plantarum, L frementum,

L. gasseri…

Wehkamp et al., Infect Immun, 2004

Probiotiques/pathogènes

Inhibition of H pylori by bacteriocins

Lactobacilli (Kim et al., 2003)

Nisin A, pediocin PO2, leucocin K, lacticins..

L. johnsonii La1, L.Acidophilus LB supernatant (Dalmau et al., 2002 ; Coconnier et al., 1998)

Nisin, lactacin F, autolysin…x

x urease

Probiotiques/pathogènes

Fecal serine-protease activity in IBS-D: a lumenal factor impairing permeability and sensitivity

0.000.020.040.060.080.100.120

25

50

75

100

125

150

175

Volume of distension (ml)

Inte

nsit

y d

of

con

tracti

on

s

(m

V/s

)

NaCl 0,9%po + IBS-D ic

L. farc. po + IBS-D ic

NaCl 0,9% po + HC ic

L. farc. po + HC ic

**

L farciminis decreases visceral hypersensitivity induced by luminal application of IBS-D fecal

supernatants

Probiotiques/facteurs endoluminaux

MRS

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Pro

teoly

tic

act

ivit

yU

A/m

g p

rote

in

L. farc MCa MRS L. farc MCa

+ véhicule (Tris-HCl 0,2 mM)

+ IBS-D supernatant

* *

L farciminis decreases fecal

serine-protease activity of IBS-D fecal supernatants

Probiotiques/facteurs endoluminaux

Probiotiques et mécanismes d’action:

2) Interactions avec la barrière épithéliale

Toll-like receptors (TLRs) in bacteria- intestinal epithelial cell (IEC) communication

TLR2TLR2

TLR4TLR4

BacteriaBacteriaGram +Gram +

BacteriaBacteriaGram -Gram -

Tollip

TLR5TLR5

LTALTA

LPSLPS

HyporesponsivenessHyporesponsiveness(tolerance)(tolerance)

HyperresponsivenessHyperresponsiveness(inflammation)(inflammation)

Tollip

CytokinesCytokines

From Otte et al., Gastroenterology 2004

L.casei and L. helveticus induce IEC responsivness via a TLR -2 independent pathway

Anti-TLR2Anti-TLR2

Anti-TLR4Anti-TLR4

L caseiL casei CRL431 CRL431L helveticusL helveticus R389 R389

From Vinderola et al., 2005

Primary culture of colon IEC

?

MaintainedIL-6 release

x

x

Probiotiques/barrière épithéliale

Facteurs solubles

VSL#3

proteasome

NF-kB

XHsp

VSL3 inhibits nuclear factor-κB and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through

proteasome inhibition

Petrof et al., Gastroenterology 2004 Probiotiques/barrière épithéliale

% 51

Cr-

ED

TA

, 24

h

0

2

4

6

Log

10 U

FC

/g

MLN Liver Spleen

**

*

TNBS

TNBS + L. farciminis

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

*

*

+

Control L. farc. TNBS TNBS+Lfarc

Colonic permeability Bacterial translocation

L. farciminisL. farciminis reduces the severity of experimental reduces the severity of experimental colitis : role of intestinal barrier integrity colitis : role of intestinal barrier integrity

Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2004 Probiotiques/barrière épithéliale

saline

STRESS (45 min)

saline L. farciminis L. farciminis

SHAM

+p<0.05 vs stress 45 min

*p<0.05 vs sham

Ait Belgnaoui et al., Gut 2006

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Mea

n A

era

Den

sity

*

+

p-MLC

L. farciminisL. farciminis suppresses the increase of colonic suppresses the increase of colonic permeability induced by an acute stress in rats: interaction permeability induced by an acute stress in rats: interaction

with epithelial cells cytoskeleton contractionwith epithelial cells cytoskeleton contraction

Probiotiques/barrière épithéliale

0 15 30 45 600

20

40

60

sham stress stress + L.farciminis

***++

+

Pressure (mm Hg)

Nu

mbe

r of

abd

omin

al

con

trac

tion

s/5

min

.

0 15 30 45 600

1

2

3

4

Pressure (mm Hg)

Vol

ume

(ml)

ComplianceComplianceColorectal sensitivityColorectal sensitivity

*

+

L. farciminis suppresses stress-induced visceral hypersensitivity through interaction with epithelial cell

cytoskeleton contraction

Ait Belgnaoui et al., Gut 2006Probiotiques/barrière épithéliale

Effect of a Tight Junction blocker on stress-induced increasedcolonic paracellular permeability and sensitivity to distension

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 0,4 0,8 1,2

Volume of distension (ml)

Nu

mb

er o

f ab

dom

inal

co

ntr

acti

ons/

5min

.

TrisTris + StressTAP + stress

*

*

* +

+

+

* : p< from control (Tris)

+: p< from Stress +Tris)

0

1

2

3

4

Basal 0 - 6 6 - 24 hours

sham

stress

*

*: p<0.05 from sham

% 51-CrEDTA

( Ait-Belgnaoui et al. 2005)( Ait-Belgnaoui et al. 2005)

*

TAP: 2, 4, 6, triaminopyrimidineTAP: 2, 4, 6, triaminopyrimidine

stress +TAP

3) Interactions avec les cellules immunitaires

Probiotiques et mécanismes d’action:

Link between physical and funcionnal barrier

- immunocyte attractionimmunocyte attraction- increased MPOincreased MPO- increased cytokine - increased cytokine expression (IL-1ßexpression (IL-1ß TNF-TNF-, IFN-, IFN-…)…)- bacterial translocation- bacterial translocation

IncreasedIncreasedpermeabilitypermeability

BasalBasalpermeabilitypermeability

CpG-DNACpG-DNA(ISS-DNA)(ISS-DNA)

ororISS-ODNISS-ODN

TLR 9TLR 9

Dendritic cellDendritic cellMacrophagesMacrophages

chloroquinechloroquine

Anti-inflammatory effectsAnti-inflammatory effects(DSS - TNBS)(DSS - TNBS)

VSL#3

IL-6, IL-12IL-6, IL-12

TLR-9 signaling mediates anti-inflammatory effects of VSL#3 in experimental colitis

Rachmilewitz et al. Gastroenterology 2004Rachmilewitz et al. Gastroenterology 2004 Probiotiques/immunomodulation

L. reuteri and L. casei effects through DC-SIGN binding

Unknown Unknown carbohydrate motifcarbohydrate motif

Dendritic cellDendritic cell

Anti-inflammatory effectsAnti-inflammatory effects

L. reuteri, L. caseiL. reuteri, L. casei

IL-10IL-10

Smits et al., J Allergy Clin Immunol. 2005 Smits et al., J Allergy Clin Immunol. 2005

DC-SIGNTreg

Inhibition of bystander T cellsAnti-DC-SIGN

Probiotiques/immunomodulation

0

250

500

750

**

* #pmol

/mg

mat

. séc

he/h

)

Témoin L. farc.SNP SNP + Hb L. farc. + Hb

* °

NO intraluminalNO intraluminal

Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2004 Probiotiques/immunomodulation

L. farciminisL. farciminis releases NO in vivo releases NO in vivo

Scores Lésionnels Scores Lésionnels MacroscopiquesMacroscopiques

Activité MPOActivité MPO

00

11

22

33

44

55

66

77

SLM

++

TNBSTNBS TNBS + TNBS + L. farciminisL. farciminis TNBS + TNBS + L. farciminisL. farciminis + Hb + Hb

L. farciminisL. farciminisTémoinsTémoins

00

10001000

20002000

30003000

40004000

U/g

pro

tèin

esU

/g p

rotè

ines

*

++

*

L. farciminisL. farciminis reduces TNBS-induced reduces TNBS-induced colitis: NO involvementcolitis: NO involvement

Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2004 Probiotiques/immunomodulation

IL-1

p

g/m

g of

pro

tein

0

1.5

3

4.5

6

7.5 *

+

IL-1

0p

g/m

g of

pro

tein

0

1

2

3

*

*

+

Control L. farc. TNBS TNBS + L. farc.

Control L. farc. TNBS TNBS + L. farc.

Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2005

Effect of Effect of L. farciminisL. farciminis on mucosal on mucosal cytokine levels in TNBS colitic ratscytokine levels in TNBS colitic rats

Probiotiques/immunomodulation

L casei attenuates the severity of TNBS-induced colitis (prevents the upregulation of ICAM-1 expression and

leukocyte recruitement)

Angulo et al Am J Physiol 2006Angulo et al Am J Physiol 2006 Probiotiques/immunomodulation

Bifidobacterium infantis normalizes PBMC IL10/IL-12 ratio in IBS patients

O’Mahony et al., Gastroenterology. 2005 Probiotiques/immunomodulation

L. salivariusL. salivarius, , B. infantisB. infantis in IBS in IBSComposite score of IBS symptomsComposite score of IBS symptoms

O’MahonyO’Mahony et al., et al., GastroGastroenterologyenterology 2005 2005

Dose 1010 CFU, for 2 months

Probiotiques/immunomodulation

NFk-B

Hsp

X

DC-SIGNTLR-2

MLC

MLCK

MLCPXX

TregIL-10

Hypo CD4+Cytokines pro-infl

(1) (2) (5)

TLR-9

hBD2

NFk-B, AP-1

(6)

Inhibiteurs proteases

PARs

(8)

Putative pathways involved in probiotic effects

Serine protéases

X

Facteurs solubles

X

LTA

CpG-DNA

(3)

NO

(4)

Facteurs gluc.

ICAM-1 (recrut. leuc.)

(7)

SartorSartor B, B, Gastroenterology 2004 Gastroenterology 2004

Probiotics in IBDProbiotics in IBD Clinical evidenceClinical evidence

Floch GC et al., J. Clin. Gastroenterol 2005Floch GC et al., J. Clin. Gastroenterol 2005

Probiotics in IBS Probiotics in IBS Clinical evidenceClinical evidence

Conclusion

Mécanismes d’action de probiotiques: (i) plusieurs voies impliqués dans l’action d’une souche (ii) toutefois ces voies sont espèce-spécifiques (iii) des nouvelles pistes d’investigation dans le dialogue hôte-probiotique: interactions avec le contenu luminal.

Des clarifications nécessaires: (i) définition de la sélection des souches de la dose et de la durée des traitements (ii) de la fraction active (bactéries vivantes versus fractions bactériennes ou métabolites (iii) synergies entre souches? (préparations mono versus pluri-souches).

Remerciements

UMR1054 INRA-EI-Purpan

F. Lamine

A. Ait-Belgnaoui

H. Eutamene

L. Ferrier

E. Houdeau

M. Leveque

C. Cartier

L. Bueno

J. Fioramonti

Universitéy P Sabatier Toulouse III

F. Nepveu

C: Roques

Institut Rosell– Lallemand, Toulouse

H. Durand

V. Delahaye

P. Malard