présentation de la biotechnologie à merck serono ... · 100 gr ! 47 6 mois dans le département...

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L‘utilisation des gazomètres en Biotechnologie

C. Prier, Merck-Serono Aubonne

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Agenda

• Présentation de la biotechnologie à Merck Serono

• Importance des gazomètres pour la biotechnologie

• 1 an dans le département biotechnologie

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Agenda




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Qu’est ce que la biotechnologie ?

• Biotechnologie = ensemble de méthodes et techniques qui utilisent des organismes vivants pour des applications dans de multiples domaines : alimentation, agriculture, pharmacie, médecine.

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Utilisation de la biotechnologie à MSA

• Merck Serono Aubonne : site de production de protéines recombinantes pour des médicaments injectables

• Technologie : Culture de cellules animales transfectées avec un vecteur d'expression contenant le gène humain de la protéine d’intérêt

Noyau cellulaire

Vecteur d’expression Gène de la protéine d’intérêt

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• Processus de production

Etape d’amplification

Etape de production

Etape de purification

Bouteilles roulantes, T-flask, wave-bag,

bioréacteur…

Bioréacteurs

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• Objectifs de l’entreprise : Garantir la qualité du médicament et son innocuité. Produire la protéine d’intérêt en quantité significative.

• Cela implique d’avoir la protéine adéquate (repliement, glycosylation, non-antigénique, biologiquement active) à de grands volumes, identique de lot à lot.

L’élément-clé : la culture cellulaire

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• Conditions requises pour le succès de la culture cellulaire


• Règles applicables quel que soit le mode de culture en bioréacteur

– Maintien d’un environnement physiologique optimal: Fixer des paramètres opérationnels selon les étapes du procédé, Définir les limites de contrôles des paramètres critiques Réguler le procédé pour éviter les dérives

– Mettre à disposition les nutriments essentiels

– Offrir une surface / un volume de culture adéquat

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• Les modes de culture en bioréacteur que nous utilisons


Fed-Batch Culture Continue (perfusion)

Volume variable Système « ouvert »

T°C

P

Air

pH Apport milieu

gaz

Volume constant Système « ouvert »

T°C

P

Air

pH Milieu NaOH

gaz

Débit

Tout dépend du type de cellules et le la fragilité de la molécule

NaOH

Surnageant de culture


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• Offrir une surface de culture


Air

Milieu NaOH

Unité de contrôle

Cellules en suspension


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• Offrir une surface de culture


Air

Milieu NaOH

Unité de contrôle

Lit fluidisé

Cellules + microporteurs


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Agenda




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• Pourquoi des analyseurs de gaz du sang ? – Nos cultures se font avec des cellules de mammifères

– Pour des raisons historiques : • Premiers analyseurs de gaz du sang vers les années 60 • Premiers analyseurs pour la biotechnologie vers les années 90

– Pour des raisons de gain de temps

– Pour des raisons techniques

Importance des gazomètres pour la biotechnologie

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Les gazomètres

• Gazomètres utilisés pour le suivi des productions commerciales en bioréacteur

• Gazomètres mesurent les paramètres du gaz du sang + pH et selon les modèles, mesurent de paramètres supplémentaires – ABL5 (gaz) – EML105 (glucose, lactate) – ABL805 (gaz, glucose, lactate)

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Importance des paramètres : le pH

• Procédé avec pH fixe (pH régulé à ± 0,1 unité) • pH constamment suivi par une sonde interne • pH suivi quotidiennement par une mesure externe

contrôle de la dérive de la sonde interne

• Important en phase de croissance pour : – Une multiplication cellulaire rapide – Atteindre la densité cellulaire souhaitée

• Important en phase de production pour : – Obtenir une molécule conforme – Produire la quantité souhaitée de molécule d’intérêt

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Importance des paramètres : la pCO2

• pCO2 varie selon les étapes en bioréacteur

• Limites de contrôle haute : 120 mmHg

• pCO2 suivie quotidiennement par une mesure externe (Pas de sonde pCO2 sur le bioréacteur)

• Mesure externe difficile (dégazage rapide de l’échantillon)

• Important pour : – Contrôler l’efficacité de l’aération de surface

– prédire une bonne productivité spécifique

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Importance des paramètres : le glucose et le lactate

• Les métabolites sont apportés de manière dis/continue dans le bioréacteur (fed batch/perfusion)

• Paramètres critiques selon le procédé

• Concentrations des métabolites suivies quotidiennement par dosage externe uniquement

• Important pour : – Piloter la croissance des cellules – Piloter la production de molécule d’intérêt

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• Piloter la croissance des cellules à partir du glucose résiduel

Croissance Production

Limite : 0,25g/L

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• Piloter la croissance des cellules à partir du lactate produit


Action

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• Piloter la production à partir du « glucose consommation rate specific » ou « lactate production rate specific »

Constant

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Importance des gazomètres en biotechnologie

• Utilisation stricte pour être en adéquation avec les GMP – Qualification/documentation pour

introduire l’appareil

– Avant utilisation : • Vérification de l’état du système

• Vérification de la bonne calibration de l’appareil avec un contrôle

– Suivi des appareils consigné dans les logbooks

– Consignation des résultats dans les dossiers de production

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Agenda



• 6 mois dans le département biotechnologie

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6 mois dans le département biotechnologie : Jeu de l’oie

Présentation d’évènements liés à la culture cellulaire et aux gazomètres au travers d’un jeu de l’oie :

– Vous êtes chef d’équipe de l’unité de production qui pilote les bioréacteurs

– Votre but : produire 100 g d’hormone humaine recombinante conforme en 1 an

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T°Ccroissance : 37°C; T°Cproduction : 33°C P=1bar pH=7 Vitesse agitation : 15rpm

6 mois dans le département biotechnologie : Jeu de l‘oie

Durée du procédé : Etape de croissance : 6 jours Etape de production : 32 jours

Milieu (débit variable) 3g/L de glucose 0g/L de lactate

Prélèvement pour analyses off-line

Récolte de surnageant de culture

Observation visuelle pH, pCO2, Glc, Lac, Comptage des cellules

Contrôle qualité molécule

Air : 45% O2

Sortie Air

NaOH Anti-mousse

[cellules inoculation] =30 milliard/ml Vculture = 200 L

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6 mois dans le département biotechnologie

100 gr !

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• Phase de croissance : réglage du débit de milieu

Références de la précédente campagne Run 1

Suivi de la production de lactate

Suivi du débit de milieu

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100 gr !

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• La phase de croissance s’est bien déroulée


Courbe de la croissance cellulaire

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• La phase de croissance s’est bien déroulée


Suivi du glucose résiduel

0,45 g/L

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100 gr !

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• Phase de production : quelques interventions pour la régulation du pH

Régulation du pH

D > 0,05

pH ABL5 7,06

pH Sonde 7,00

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100 gr !

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• La phase de production s’est bien déroulée


Suivi de la consommation spécifique en glucose

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• Félicitation ! Vous avez produit 9,41g Production cumulée de la protéine d’intérêt

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100 gr !

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• Félicitation ! Vous avez produit 29,5 g en 3 runs Run 1 Run 2 Run 3 Mais

Beaucoup d’intervention sur l’EML105 Mesures préventives nécessaires

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100 gr !

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• Panne grave sur un EML105

• Mesure préventive pour l’EML105 : Les appareils sont vieux Remplacement par une nouvelle

génération d’analyseur Glucose/Lactate Quelle stratégie et quels besoins? Business Case

• Votre choix :

+ =

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• Introduction de l’ABL805 : Documentation du remplacement – URS pour le service des achats, CCP dans TrackWise

• Il faut nous assurer que l’appareil répond bien à nos besoins – Protocole de qualification d’installation et qualification opérationnelle

– Protocole de qualification des performances • Précision, répétabilité

• Équivalence des paramètres avec les appareils qu’il remplace selon la norme DIN38402-71 (important pour garder la protéine adéquate)

Démonstration de l’équivalence de mesure En cas de non équivalence, calcul d’un facteur de correction

– Exécution des tests et rédaction des rapports

– Procédure d’utilisation de l’appareil

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6 mois dans le département biotechnologie • Pendant ce temps…Vous avez conduit 2 runs supplémentaires

… et produit 49,59 g

Run1 Run2 Run3 Run4 Run5

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100 gr !

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Attention déviations!

Action : Confirmation ou non par un prélèvement Action corrective Investigation

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• Félicitation ! Vous avez produit 69,17 g

Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8

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100 gr !

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pH < 6 [Glucose] : 0,2 g/L

Et les autres paramètres… [lactate] : 2,5 g/L pCO2 > 120 mmHg

Etat frais

• Alarme pH! Glucose très bas! • Vous avez contaminé le bioréacteur du run 6!

Investigation sur le germe et la cause

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100 gr !

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• Vous avez trouvé les causes de la contamination

Germe : Bacillus subtilis Origine de la contamination : filtre à air mouillé

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Félicitation ! Vous avez produit 89,29g

Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 Run9 Run10

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100 gr !

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Analyse multivariée des tous les paramètres des campagnes de production

Runs : production > 10g ; Runs : 10g > production > 9g ; Runs : production < 9g

Recommandations

Suivi de la pCO2

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100 gr !

Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 Run9 Run10 Run11

100,48 g !

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Conclusions

• Les gazomètres nous permettent d’être à l’écoute des cellules

• Ils font partie intégrante de nos procédés

• Ils participent à la production d’une molécule de qualité et à la reproductibilité de cette molécule d’un lot à un autre

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Conclusions

Merci de votre attention !

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