La conception biomoléculaireet la biotechnologieAujourd’hui nous avons plusieurs méthodes pour travailler àl’échelle atomique, les chimistes construisent atome paratome les molécules. Richard Feynman lors sa présentation deson exposé, a insisté que la chimie est un moyen puissant pourla conception moléculaire. Les physiciens utilisent desmicroscopes atomiques pour piéger les atomes et les moléculesavec des pinces optiques, les bionanotechnologues seront armésd’une collection de biomachinerie naturelle afin d’exécuterdes tâches spécifique à l’échelle du nano.

La bionanotechnologie est le domaine le plus performant quetout autre domaine en nanotechnologie. Les outils nécessairespour concevoir des bionanomachines peuvent être disponiblespartout avec un ordinateur et un plan, la porte est ouvertecontrairement à la nanotechnologie basée sur le silicium quicoute chère en matière de matériel et de matériau.

La modification des biomachines naturelles a ouvert la portedevant plusieurs préoccupations, en effet, en provoquant deschangements spécifiques sur des protéines naturelles, en liantentre des plans d’un ensemble de protéines, créant desmolécules hybrides à fonctions combinées. En utilisant cespropriétés, on peut machiner des bactéries pour produire unequantité considérable de mutants ou de chimères.

La conception des biomachines nouvelles est effectivement plusdifficile que leur modification, la flexibilité par exemple,est difficile à prévoir et concevoir. L’un des objetsessentiels des études actuelles en bionanotechnologie et detenter à fabriquer une néo-bionanomachine à partir de zéro.Une synthase de nanotubes peut être conçue à l’aide d’unordinateur qui calcule intégralement les mouvements et lesrotations, mais difficilement, car les connaissances actuelles

comprennent toujours des lacunes.

Aujourd’hui, nous pouvons prévoir sûrement la structure pliéed’une protéine à partir de l’ordre de sa structure chimique,mais ne pourrions pas prévoir son activité chimique.

Dans ce chapitre on va présenter une vue d’ensemble desnombreuses techniques qui sont employées aujourd’hui pour laconception, la synthèse, l’analyse des biomolécules.

La technologie de l’ADN recombinant[1] La technologie de l’ADN recombinant est le moyen capital,cette technologie permet de construire n’importe quelleprotéine, tout simplement par changement de la cartegénétique. Deux enzymes naturelles clés sont utilisées sontADN ligase et les enzymes de restriction qui permettent demoduler l’information génétique dans un seul brin d’ADN. Avantcette découverte, on avait recourt à des produits chimiques oude rayonnements ionisants qui réagissent de façon aléatoire,actuellement, on peut agir sur le code génétique précisémentet à l’échelle atomique.

[2] Les enzymes de restriction sont immensément utiles,certains poissons hébergent un grand nombre de bactéries pourlutter contre les infections virales. ?: les bactériesfabriquent des enzymes de restriction qui coupent l’ADN viralà un ordre spécifique, modifient bases en même temps, pour lesprotéger de l’action de la même enzyme.

[3] Beaucoup d’enzymes de restriction coupent les deux brinsd’ADN à la fois, au lieu de couper un seul. La biotechnologieintervient dans ce cas, les terminaisons du gène sontterminées par des extrémités adhésives à d’autres extrémitéssimilaires, donc les enzymes de restriction peuvent êtreutilisées pour couper et créer de nouvelles régions adhésivesau niveau des séquences cibles, qui sont ensuite colléesensemble selon les besoins.

[4] Aujourd’hui, la technologie de l’ADN recombinant adéveloppé, de nouvelles méthodes, nombreuses, ont étédécouvertes pour moduler les fonctions des bionanomachinescellulaires de façon continue. On peut extraire les gènescibles à partir d’une cellule, en reproduire une quantitéimportante de copies, provoquer des mutations, recombinaisons,épissage, afin de créer entièrement de nouveaux gènes. En finon peut remplacer des gènes cellulaires par ces gènes pourmodifier son information génétique.

Figure. La technologie d’ADN recombinant est basée sur deuxenzymes: E de restriction (EcoRI à gauche) et les ligases.

L’ADN peut être monté par desenzymes disponibles en commerce[5] plus de 100 enzymes de restriction sont disponibles,chacune coupe l’ADN à un ordre spécifique de base, une ligase,une DNA polymérase,

[6] il existe des méthodes automatisées qui permettent lasynthèse des brins d’ADN de 100 nucléotides de longueur. Une

fois qu’une copie soit réalisée, elle passerait à la phase dereproduction: par clonage et réaction en chaîne de lapolymérase, on emploie souvent ainsi les cellules bactériennesen raison de leur multiplication rapide, cette méthodeconsiste à incorporer la séquence voulue dans un bactériophagequi infecte la bactérie, la séquence génétique est insérée eton attend le résultat après de nombreuses divisions. Lesplasmides à côté du matériel génétique bactrien, sont les plusemployés. La PCR peut être employée aussi, elle tire profit dela polymérase pour produire plusieurs copies de la séquencegénétique.

[7] une fois que la séquence est réalisée, on a recourt à desvecteurs d’expression, les plasmides qui contiennent le gènecodant pour une protéine possèdent une séquence dite promoteurayant une grande spécificité. Le promoteur qui est souventpris d’un virus, provoque la création de grandes quantitésd’ARN messager, la cellule synthétiserait en l’occurrence,plusieurs protéines correspondantes. Les bactéries sont plusidéales à ces opérations, car peuvent créer un nombre plusimportant de ces protéines, et comprendre une quantitéimportante entre 1-10% de la totalité des protéinescellulaires. Il existe même des techniques de fermentation,peu coûteuses, permettant une croissance massive des bactériesavec des besoins nutritionnels minimes

[8] Les bactéries posent en fait quelques problèmes, elles nedisposent pas de matériel de maturation, cependant, denombreuses cellules végétales possèdent à leurs surfaces desgroupes d’hydrate de carbone, qui sont incorporées auxprotéines à la fin de leur synthèse, les bactéries n’enpossèdent pas (limitation sévère dans l’industriepharmaceutique). Le système immunitaire peut dans certains casréagir dangereusement avec les hydrates de carbone, attachéesaux protéines cellulaires (système ABO).

En outre, les protéines ont tendance, dans certains moment, deformer des agrégats spécifiques avec un arrangement

soigneusement calculé, facilement mis en évidence parmicroscopie. Le manque de certains groupements peut être àl’origine d’un réarrangement aléatoire, et la formation descorps durs, la solubilisation de ces corps se trouveradifficile.

Il est tout à fait possible de renaturer les protéines desinclusions dures, ils sont les plus lourdes, alors unecentrifugation des composants cellulaires peut aider à lesextraire,

[9] Les protéines peuvent être également construites sansavoir recourt à des cellules vivantes, cela est fait dans deséprouvettes spéciales. L’ARN qui se trouve dans lescytoplasmes cellulaires, et un excellent appui technique, eneffet, l’extraction des composés cytoplasmiques contenant desbionanomachines de synthèse protéique, mais avec peut dechances de réussir à accomplir parfaitement la tâche, car lestock énergétique limité et la présence des protéases et denucléase mettent rapidement fin à cette aventure. Des systèmescontinus sans cellule, ont surmonté ce problème. Destentatives de recréer des protéines avec des préparationspurifiées ont réussi, mais avec un rendement modeste dû à lacomplexité de ces systèmes. En gros le développent dessystèmes de production de protéines non dépendant del’activité cellulaire sont l’objet des recherches.

Figure. Le plasmide pBR322 est l’un des vecteurs les plusemployés pour machiner E. coli. Il contient 4361 paires debases d’ADN, et comprend des régions qui codent à diversesfonctions, ampR, telR. En provoquant des coupures dans desrégions spécifiques par les enzymes de restriction, onpourrait coller de nouveaux gènes, par exemple si le nouveaufragment d’ADN est ajouté à la région Pstl, à la position3607, il provoquerait des perturbations au niveau du gène de–ampR, la bactérie peut être facilement identifiée et séparée(sensibles à la tétracycline).

Figure. L’Action de la polymérase dans la PCR

La mutagénèse dirigée provoque des changements1.spécifiques au niveau du génome:

[10] Dans plusieurs cas, on devrait faire de petitschangements sur la protéine naturelle. La mutagénèse dirigéesert à modifier la séquence des acides aminés, par cetteméthode, nous pouvons provoquer des changements à l’échelleatomique sur la structure protéique, changement de lastructure et la fonction, certaines mutations provoquées sontd’une spécificité superbe.

[11] la mutation dirigée vers un emplacement spécifique arévolutionné la biologie moléculaire. C’est un outil puissantpour déterminer la fonction des acides aminés spécifiques oudes régions dans une protéine. Par exemple en provoquant des

mutations sur un groupe d’acides aminé un par un afin desavoir lequel est responsable d’une telle activité.de cettefaçon l’emplacement actif d’une enzyme sur un récepteurd’hormone peut être localisé. Elle peut être aussi employéedans le cadre d’amélioration de la stabilité protéique en lesajustant selon un ordre bien déterminé.

Les protéines de fusion combinent 2fonctions[12] Des techniques d’ADN recombinant sont également employéespour combiner des gènes entiers, formant une protéine plusgrande multifonctionnelle. Cette opération doit être faiteavec soin par sélection précise des emplacements de coupure,de sorte que les protéines fusionnées ne bloquent pas les unesles autres lorsqu’elles se plient, heureusement, beaucoup deprotéines naturelles sont très robustes et remplissent leursfonctions même à l’état fusionné.

Figure. Les mutagénèses dirigées

[13] Les protéines de fusion visent plusieurs cibles à lafois, elles portent un peptide signal employé comme poignépour identifier l’endroit approprié, ce peptide est attaché àla protéine par les techniques d’ADN recombinant.

[14] Dans la version naturelle du lysozyme, dans lesextrémités opposées deux acides aminés, quand la protéine seplie, ils s’approchent en haut et ferment la structure, dansla version modifiée, les deux acides aminés sont remplacés parla cystéine. Quand la protéine se plie les deux cystéinesétablissent un pont disulfure (en rouge) et stabilisent lastructure pliée.

Les anticorps monoclonaux[15] Le système immunitaire des anomaux est conçu pour bienremplir la fonction de connaître spécifiquement les structuresmoléculaires étrangères, de point de vue biotechnologique, lesstructures de base sont les anticorps, notre système

immunitaire est capable de générer 1015 types d’anticorps, encombinant ce paquet moléculaire avec les connaissancesmodernes de production d’anticorps, on pourra optimiserl’affinité de ces anticorps aux molécules cibles.

Figure. Les immunotoxines sont créées par combinaison d’uneprotéine toxique avec un anticorps, elles sont testées pour letraitement du cancer.

Figure. Les anticorps typiques sont constitués de deux brasd’accepteurs spécifiques, reliés par une liaison flexible audomaine central, un fragment Fc qui leur permet de se lier auxcellules/organites coopératrices de l’organisme. (Lysozyme enrose)

[16] en raison de leur forte liaison aux molécules cibles, lesanticorps purifiés constituent un bon moyen pour identifier

une cible donnée, (HIV), localisation des protéines dansl’organisme,

[17] des anticorps monoclonaux peuvent être fabriqués à partird’une série de cellules tumorales identiques de façonchronique.

La détermination de la structurebiomoléculaire[18] Comme noté par Richard Feymann, la clé de lacompréhension de la biologie est la possibilité de voir ce queles cellules font. Vers les années 50, John Kendrew et cescollègues ont résolu la structure de la myoglobine, enindiquant en détails, les arrangements des divers groupementsatomiques. Depuis lors, des milliers de structuresmoléculaires, de protéines, lipides, acides nucléiques,polysaccharides, ont pu être comprises. Une banque deprotéines a été mise à la disposition publique:http://www.pdb.org.

La détermination des structures des biomolécules, bien quesensiblement rationnelle, reste toujours le sujet deplusieurs efforts parfois coûteux. On va sonner certainesméthodes utilisées dans la détermination des structures desbiomolécules. Car connaître la structure moléculaire réelled’une molécule est le point de départ en bionanotechnologie.

La cristallographie avec les rayonsX fournit les structures atomiques[19] La cristallographie avec les rayons X fournitactuellement la plus part des informations détaillées sur lastructure atomique, ça coute en matières de ressourcesconsidérablement cher, et nécessite un labo spécialisé avecune bonne manœuvre.

[20] L’information expérimentale obtenue à partir d’uneanalyse cristallographique est une carte 3D représentant ladensité des électrons. La résolution de cette carte dépend del’emplacement des points auxquels la densité des électrons estrésolue, et de la charge, la qualité des cristaux. Lesmeilleurs cristaux des biomolécules sont parfaitement résolus.Les structures séparées de moins d’un angström sont facilementrésolues. Les études cristallographiques des protéines sontrelativement pauvres, dans la bande de 1,5 – 3 angströms; àla résolution de 1,5 Å différents atomes peuvent êtrefacilement distingués. Mais pour 3 Å, la connaissance de lastructure covalente sera indispensable pour interpréter lesmorceaux mal interprétés.

[21] Les facteurs thermiques (valeurs B) des positionsatomiques à l’intérieur du model est de très bonne indicationdans la détermination du niveau, auquel, les positions peuventêtre acceptées. Ça constitue en outre une méthode pour lamodulation du désordre de chaque position atomique. Des Atomesmodèles sont souvent traités comme une distributionGaussiennes autour du centre atomique, les valeurs B quicontrôlent la largeur de la courbe en cloche. Une dizaine devaleurs B représente les atomes avec des positions trèsclaires, tendis, une trentaine représente les atomes endésordre, ce qui doit être pris en précaution.

[22] La structure obtenue par cristallographie donne unereprésentation instantanée des conformations moléculaires.

Figure. Les structures d’une protéine donnée peuvent montrerdes différences une fois analysées à l’intérieur de diverscristaux. Deux structures du lysozyme sont superposées (noiret rose)

La spectroscopie NMR peut être utilisée pour conclure1.les structures atomiques:

[23] La spectroscopie à résonance magnétique nucléaire (NMR)est la base de la détermination de la structure moléculaire enchimie. Cette méthode dépend de l’environnement local desnoyaux atomiques qui possèdent chacun un moment magnétiqueintrinsèque lui alignant dans un fort champ magnétique. Cetalignement peut être perturbé par des pulsations à fréquencesradio de longueurs d’ondes appropriées, quand les noyauxrelâchent de leur alignement, ils émettent des rayonnementsqui dépendent des fréquences des ondes reçues ce qui reflètel’environnement local de l’atome.

[24] La spectroscopie NMR est intensivement employée en chimieafin de définir les liaisons covalentes ainsi que lesconformations des petites molécules organiques, les NMR 2Dpermettent l’étude des structures des petites protéines; laradiofréquence à pulsations multiples permet de perturber

plusieurs noyau à la fois, qui émettent simultanémentplusieurs rayonnements, mais si un noyau absorbe en premier lerayonnement, il va modifier la valeur d’émission du noyau àcoté, ce décalage permet d’établir une liste des noyaux quisont à proximité.

Des protéines de petite et de moyenne taille allant de 100-250aminoacides ont pu être mises en évidence par cette méthode depoint de vue structurel.

Figure. Les données de la spectroscopie RMN sont souventinterprétées pour tirer un ensemble de structures possibles.Dans ce schéma une dizaine de structures différentes delysozyme superposées, notant que la chaîne protéiqueprincipale est presque la même dans chaque cas.

[25] plus souvent les structures fournies par RMN diffèrent etla seule interprétation qui peut soulever les contraintes estl’existence de plusieurs conformations surtout à l’état libre.

Le microscope électronique révèle

la structure moléculaire[26] La microscopie électronique peut résoudre la structuresubatomique, avec une résolution maximale de 2 nm, ceci estsuffisant pour déterminer plusieurs détails structuraux.

[27] La microscopie électronique peut montrer la structureglobale d’une biomolécule (exemple l’actine et le moteur de myosine), l’ordinateur peut aider, à une grande part, dereconstituer l’image en recombinant beaucoup de morceauxperdus.

[28] La microscopie électronique fournit des informationsprécieuses, dont aucune des méthodes précédentes ne peut lesrévéler, ex: les molécules qui subissent des changementsstructuraux permanents.

La microscopie électronique combinée avec les informationsdonnées par la cristallographie à rayons X, spectroscopie,RMN, et la modélisation moléculaire, peut donner la structureatomique de grandes assemblées moléculaires. Par exemple: lastructure du ribosome, beaucoup de grands virus, l’interactionde l’actine avec la myosine. Ceux sont bien des moléculesimportantes qu’on a tiré profit de cette combinaison deméthodes pour mieux les connaître.

Les microscopes électroniques de transmission et de balayagesont employés pour la détermination des structures desbionanomachines. Le microscope à transmission est similaire aumicroscope photonique, en effet, un faisceau d’électrons qui‘illumine’ un échantillon mince, le contraste des imagesobtenues est faible, il faudrait ajouter les sels des métauxlourds tels que l’uranium, osmium, malheureusement, ce procédéde coloration présente des obstacles pendant le traitement etle séchage, la microscopie cryo-électronique soulève ceslimites mais diminue la force du contraste. L’échantillon estgelé dans la glace, le contraste entre la molécule et la glaceest faible. En établissant une moyenne de plusieurs images

afin de minimiser le bruit dû au contraste faible. Dans lesmeilleurs cas la tomographie électronique peut fournir desimages 3D de la molécule, ces images sont rassemblées et sontinclinées chacune d’un angle spécifique qui sert àreconstituer la molécule en 3D.

[29] La microscopie électronique à balayage donne une image3D, les électrons sont dispersés sur la surface del’échantillon qui est préparé par fixation et lavage etentouré d’une couche mince de métal, il est ensuite balayé parun faisceau étroit d’électrons pour visualiser l’image de lasurface. En raison de l’indispensabilité de la couchemétallique, la résolution ne peut pas dépasser les 10 nm(arrangement de l’actine et la myosine des les sarcomères àl’intérieur du muscle)

La microscopie à force atomiqueexamine les surfaces desbiomolécules[30] Cette méthode est la plus performante, elle établit uneliaison plus directe entre le monde macroscopique et le mondeatomique. Pour balayer la surface l’échantillon est déplacépar trame, il est monté et abaissé afin d’appliquer une forceconstante sur l’extrémité. Le balayage latéral et les changements de la hauteur de l’échantillon sont contrôlés pardes piezoscanners, les forces sur l’encorbellement sontdétectées par l’éclat d’un rayon laser sur le dos de celui-ci.L’échantillon peut être balayé en mode continu ce qui permetune mesure précise de la hauteur. Le tapement du balayagerésout les problèmes des forces de cisaillement en oscillantle bout. La résolution de l’image est dépendante de l’acuitédu bout (5-10 nm).

[31] L’analyse des échantillons en microscopie à forceatomique est faite dans l’eau, les échantillons secs

maintiennent une couche mince d’eau sur leurs surfaces, lesforces capillaires diminuent, masquent les force de répulsion,attraction exercées sur le bout définissant la forme.

[32] La microscopie à force atomique a prouvé un grand succèsdans le domaine biotechnologique, sa sensibilité pour mesurerdes forces le long de la trajectoire de l’attraction ou de larépulsion entre les atomes l’a rendu très utile dans lacompréhension du dynamisme du repliement des protéines etd’autres bionanomachines. (arrangement des atomes d’Ar pourcréer des corrals quantiques avec des caractéristiquesparticulières).

Figure. Chez IBM, la microscopie à force atomique a étéutilisée pour réarranger les atomes de Fer en corrals, ce quipermet d’étudier les propriétés mécanique quantiques inconnuesde cet arrangement. (Figure fromhttp://www.almaden.ibm.com/vis/stm/corral.html)

La modélisation moléculaire[31] Dans la conception des nouvelles biomachines,l’informatique travail main à main avec l’expérimentation.les

calculs permettent ainsi des explorations des systèmes quisont expérimentalement inaccessibles

[32] Les bionanomachines sont visualisées par des logicielsinformatiques; RASMOL, PROTEIN EXPLORER, CHIME,(http://www.rcsb.org/pdb/software-list.html).

Figure. Représentation graphique du lysozyme avec le programmeRasMol, à gauche en ruban, excellent outil pour comprendre latopologie et les pliements.

[33] La modélisation informatique des biomolécules peutprédire la structure et la fonction: optimisation, analyse enmode normal, dynamique moléculaire, perturbation d’énergielibre. Ceci est suffisant dans le cadre structurel etcatalytique, mais il ne permet pas de s’étendre à long échelleen temps réel (repliement des protéines: complexe)

[34] Le problème de repliement des protéines: il pose desdifficultés graves dues aux 2 raison: l’incapacité de définirun plan exact de conformations adoptées surtout pour lesrégions flexibles des protéines liées et composées d’une1OOaine d’aminoacides. La méthode employée pour estimer lastabilité de chaque conformation, les protéines pliéesrenferment plusieurs contacts internes (milliers) (l’entrée etla sortie de l’eau)

L’entropie (S) joue de sa part un rôle important contre lesénergies favorables de contact.

[35] Les algorithmes employés aujourd’hui pour la définitiondes structures protéiques sont basés sur l’ordre de laséquence et calibrés par utilisation des structures connues deplusieurs protéines.

Les simulations d’expansion prévoient le mode1.d’interaction des biomolécules:

[36] Des programmes informatiques peuvent être utilisés pourcalculer les interactions possibles entres les biomolécules,particulièrement les protéines, malheureusement, il n’est pastout à fait possible de les utiliser en cas de grossesmolécules. La majorité de ces programmes fonctionne commesuit: un algorithme qui se lance et calcule rapidement toutesles positions possibles des molécules dans l’environnement, ensecond lieu, un modèle énergétique aidera à déterminer lesmeilleures positions. Les méthodes populaires: AutoDock, Dock

Figure. Les médicaments peuvent être de même conçus par desprogrammes informatiques à Docking automatique, afin deprévoir le meilleur emplacement au niveau du site cible.(Exemple: médicament qui réagit contre la protéase virale(HIV))

Nouvelles fonctionnalités ont étédéveloppées avec les ordinateursassistés par des programmes deconception[37] Plusieurs succès récents en bionanotechnologie impliquantl’introduction d’une nouvelle fonctionnalité dans unebiomolécule naturelle. Le moteur de ces conceptions estl’informatisation de l’environnement moléculaire, cetteméthode permet au chercheur de concevoir une nouvellestructure, la réduire en minimum; cette approche combinée avecla dynamique moléculaire a incité une excitation précieusedans le monde de la nanotechnologie moléculaire. Elle a étéintensivement utilisée pour créer des scénarios de mutationsdirigées. Elle exige en fait, la créativité et l’expérience.

Quelques méthodes par exemple, commencent par combinaison demilliers de fragments de 5-10 atomes au niveau du site actif,les meilleurs sont choisis pour former petit à petit labiomolécule entière. Autres commencent par une molécule debase ou « brute » en ajoutant des groupements spécifiquesjusqu’à ce que le site soit parfaitement rempli, cela donned’excellents résultats.